Механизмы регуляции катионных каналов в эукариотической клетке

Морачевская, Елена Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы регуляции катионных каналов в эукариотической клетке
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции катионных каналов в эукариотической клетке"

003473072 На правах рукописи

МОРАЧЕВСКАЯ СП^-^ , Елена Алексеевна

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ КАТИОННЫХ КАНАЛОВ В ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ КЛЕТКЕ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

- 8 ОКТ ?009

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2009

003479072

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Зоя Иринарховна Крутецкая

Санкт-Петербургский государственный университет

доктор биологических наук Сергей Михайлович Антонов

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук Людмила Владимировна Щагина

Институт цитологии РАН, Санюг-Петербург

Ведущая организация: Институт физиологии им. И.П.Павлова

РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится «30» октября 2009 года в часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д .4

Сайт института: www.cytspb.rssi.ru

Адрес электронной почты института: се11Ью@таМ. cytspb.rssi.ru Факс института (812)297-03-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Реферат разослан « ¿22. » сентября 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук /

Е.В.Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Поступление катионов в цитоплазму из внеклеточной среды играет важную роль в поддержании водно-солевого баланса, в запуске и осуществлении процессов передачи сигнала в нативной клетке. В различных клетках, как возбудимых, так и невозбудимых, быстрые изменения проницаемости и пассивного транспорта катионов связаны, в первую очередь, с активацией и инактивацией ионных каналов клеточных мембран. В исследованиях возбудимых мембран определена роль ионных каналов в генерации и распространении нервного импульса, рецепции, синаптической передаче [1]. Значительно менее понятны ионные механизмы клеточной сигнализации в электроневозбудимых клетках. До недавнего времени усилия исследователей были, в основном, сосредоточены на поиске высокоселективных кальциевых каналов как вероятных участников кальциевого ответа [2,3]. К настоящему моменту круг интересов значительно расширился, и в центре внимания оказались катионные каналы различной селективности. Этому во многом способствовали результаты исследования белков семейства TRP [4,5], предположительно формирующих каналы катионного входа в клеточной мембране.

К концу 80-х годов были установлены основные свойства и принципы организации потенциал-управляемых каналов в нервных и мышечных клетках. Надо отметить, что электрофизиологические исследования ионной проницаемости возбудимых мембран с использованием метода фиксации потенциала (voltage clamp) оказали решающее влияние на формирование концептуальных схем и биофизических моделей работы каналов [1,6-8]. Не будет преувеличением сказать, что развитие новых экспериментальных методов, в первую очередь патч-кламп технологий [9,10] и молекулярного клонирования, фактически привело к смене парадигм, стремительно расширив представления о ионных каналах клеточных мембран. Как оказалось, регулирумый перенос ионов через гидрофильные поры, формируемые интегральными мембранными белками — ионными каналами, является важнейшим свойством живых клеток, как электровозбудимых, так и невозбудимых. Показано, что пассивный транспорт катионов вовлечен в важнейшие регуляторные процессы в клетке, включая апоптоз и опухолевую транформацию [5,11,12]. Возрастает интерес к выяснению путей поступления натрия в цитозоль из внеклеточной среды. До недавнего времени наши знания о механизмах трансмембранного переноса натрия в электроневозбудимых клетках ограничивались результатами исследований эпителиальных натриевых каналов (ENaC) [13,14]. Благодаря применению метода патч-кламп натрий-селективные каналы, не имеющие потенциал-зависимых воротных структур, идентифицированы в клетках и тканях различной

специализации (Ведерникова* и др., 1999). Сформировались представления о суперсемействе потенциал-независимых катионных каналов ОЕС/Е№С, характеризующихся общностью функциональных характеристик и молекулярной организации [15].

Таким образом, в основном, завершен «описательный» период в изучении многообразия катион-транспортирующих каналов в клетках эукариот. На первый план выходят проблемы регуляции каналов, их участия в реакциях живой клетки на изменения микроокружения. В этом отношении особый интерес представляют ионные каналы, связанные с механочувствительностью мембраны и (или) клетки в целом. Такие каналы, названные механочувствительными, были обнаружены не только в специализированных механорецепторных структурах, но также и в самых разных клетках и тканях [16]. Они были идентифицированы в мембранах бактерий, грибов, растений, позвоночных и беспозвоночных животных [17]. Можно полагать, что механочувствительные каналы принадлежат к наиболее ранним в филогенетическом отношении клеточным сигнальным системам. Детально исследованы бактериальные каналы Мбс!., представляющие большие поры экстремально высокой проводимости (около 1000 пСм) [16]. В клетках эукариот ионные каналы, связанные с клеточной механочувствительностью, имеют значительно более низкую проводимость и, по-видимому, совершенно иную молекулярную природу. В настоящее время это один из наименее изученных классов ионных каналов. Эта область чрезвычайно интенсивно разрабатывается, поскольку представляет интерес с точки зрения как фундаментальных проблем клеточной биологии, так и новых направлений клеточной медицины. Выяснение физиологических путей активации каналов и природы механочувствительности эукариотической клетки предполагает изучение возможного участия липидных компонентов мембраны и структур кортикального цитоскелета.

В настоящее время одной из актуальных проблем биологии и физиологии клетки становится выяснение роли мембранных липидов в процессах клеточной сигнализации. Согласно современным представлениям о латеральной гетерогенности липидного бислоя, важное значение для связи плазматической мембраны и цитоскелета имеют богатые холестерином липидные микродомены (рафты) [18-21]. Ряд данных свидетельствует, что ассоциация с рафтами может быть решающим фактором, определяющим активность интегральных мембранных белков, в том числе ионных каналов [22,23]. Сообщается, что нарушения структуры и целостности рафтов, обусловленные снижением уровня мембранного холестерина, препятствуют реализации клеточных функций, включающих перестройки актиновой сети [21, 24]. Есть основания полагать, что анализ функциональных взаимосвязей

* с 2001 г. - Морачевская.

ионных каналов с липидным окружением и организацией цитоскелета будет способствовать пониманию фундаментальных основ клеточной регуляции и передачи сигнала.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в выяснении механизмов регуляции катион-транспортирующих каналов в плазматической мембране эукариотической клетки. Основное внимание сосредоточено на исследовании двух крупных классов потенциал-независимых (non-voltage-gated) катионных каналов — механочувствительных и натрий-селективных.

В связи с этим поставлены следующие задачи:

1. Выявить физиологические вне- и внутриклеточные факторы, модулирующие активность каналов катионного входа в плазматической мембране электроневозбудимых клеток. Оценить возможность механозависимой регуляции каналов.

2. Исследовать механизмы активации и инактивации потенциал-независимых катионных каналов, связанные с реорганизацией структур цитоскелета.

3. Выяснить возможную роль ГТФ-связывающих белков в регуляции потенциал-независимых натриевых каналов.

4. Проанализировать особенности функционирования натриевых каналов и их связь с динамикой актина в условиях деструкции богатых холестерином мембранных микродоменов.

5. Исследовать функциональные свойства механочувствительных катионных каналов, реагирующих на локальное растяжение (stretch) клеточной мембраны.

6. С использованием адекватной экспериментальной модели определить степень участия аппарата микротрубочек и микрофиламентов в регуляции стретч-активируемых механочувствительных каналов.

7. Исследовать возможное участие мембранного холестерина и липидных микродоменов в механозависимой активации каналов и организации актинового цитоскелета.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Основные механизмы регуляции потенциал-независимых катионных каналов в плазматической мембране эукариотической клетки связаны с организацией и динамикой примембранного актинового цитоскелета. Существенную роль в модуляции активности каналов играют актин-связывающие кэпирующие белки и мембранный холестерин.

2. В различных электроневозбудимых клетках разборка кортикальной актиновой сети вызывает активацию потенциал-независимых натриевых каналов, не обладающих, однако, прямой механочувствительностью - реакцией на растяжение мембраны.

3. Функциональные характеристики механочувствительных катионных каналов в клетках эукариот зависят, в большей степени от

взаимосвязей с микрофиламентами и свойств комплекса мембрана-цитоскелет, чем от физических параметров липидного бислоя.

4. Реорганизация примембранного цитоскелета с участием актин-связывающих белков — необходимое промежуточное звено, опосредующее влияние на активность каналов ряда физиологически значимых вне- и внутриклеточных факторов, таких как двухвалентные катионы, малые С-белки, мембранный холестерин и структура бислоя.

Научная новизна работы. Впервые проведено исследование внутриклеточных и мембранных путей регуляции потенциал-независимых катионных каналов — важной составляющей систем транспорта ионов и передачи сигнала в клетках эукариот. Получены приоритетные результаты, раскрывающие универсальные физиологические механизмы активации и инактивации ионных каналов в электроневозбудимых клетках, связанные с липидным окружением и организацией актинового цитоскелета.

Продемонстрирована функциональная связь потенциал-независимых натриевых каналов и механочувствительных каналов с динамикой примембранного актина. Впервые показаны изменения унитарной проводимости стретч-активируемых каналов, сопряженные с разборкой кортикальных микрофиламентов.

Впервые показано влияние малых С-белков на активность натриевых каналов. Установлены кальций-зависимые и ГТФ-зависимые механизмы регуляции каналов, опосредованные реорганизацией микрофиламентов с участием актин-связывающих белков. Обоснованы представления о важной роли кэпирующих белков цитоскелета и процессов декапирования в модуляции активности каналов.

Впервые выявлены особенности поведения каналов в зависимости от содержания холестерина, обязательного липидного компонента эукариотической клетки. Обнаружено подавление активности механочувствительных каналов в культивируемых клетках лейкемии человека при частичной экстракции мембранного холестерина и выяснен механизм эффекта. Предложены гипотезы относительно механизмов реорганизации Я-актина, вызванной нарушением целостности рафтов.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в представленной работе данные имеют принципиальное значение для понимания фундаментальных основ клеточной регуляции и транспорта катионов в эукариотической клетке. Результаты работы демонстрируют многообразие взаимосвязей мембранных структур и актинового цитоскелета, открывают перспективы дальнейшего изучения этого круга проблем клеточной биологии. Проведенные исследования дают теоретическую базу и адекватную экспериментальную модель для исследования цитоскелет-зависимой регуляции различных типов ионных каналов. Полученные результаты расширяют представления о роли мембранных липидов в процессах передачи сигнала, способствуют

решению проблем клеточной механочувствительности. Общебиологическая значимость результатов определяется также тем, что исследованы механозависимые ионные каналы, структуры, относящиеся к наиболее ранним в филогенетическом отношении сигнальным системам.

Итоги работы представляют несомненный интерес для современной фармакологии и практической медицины. Данные о механизмах действия различных агентов, в том числе, циклодекстринов, на функции клеток могут быть применены при разработке и тестировании фармакологических препаратов. Продемонстрировано, что снижение содержания холестерина в клетках может приводить к существенным модуляциям, возможно, нарушениям процессов клеточной регуляции и передачи сигнала. Эти результаты заслуживают особого внимания в связи с развитием терапевтических методик, направленных на коррекцию липидного профиля, в частности, уровня холестерина в плазме крови.

Полученные результаты и сформированные на их основе теоретические представления используются в курсах лекций для студентов биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета и факультета медицинской физики и биоинженерии Санкт-Петербургского государственного

политехнического университета.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции "Мембранный транспорт и функции клетки" (Санкт-Петербург, 1994), симпозиумах "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1995, 1998, 2001, 2006), 40-м (Балтимор, 1996), 46-м (Сан-Франциско, 2002) и 48-м (Балтимор, 2004) Съездах Американского Биофизического общества, Международном физиологическом конгрессе (Санкт-Петербург, 1997), 2-м съезде Биохимического общества (Москва, 1997), Всероссийской конференции «Цитоскелет и клеточная регуляция» (Пущино, 2000), Всероссийском совещании «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000), Международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004), конференции Британского физиологического общества (Лондон, 2006), I и II Съездах Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003, 2007), Международной конференции «Ионные каналы: структура и функции» (Санкт-Петербург, 2009), на семинарах ИНЦ РАН.

Публикации. Список основных публикаций по теме диссертации включает 37 работ, в том числе 9 тезисов и 28 статей в ведущих отечественных (11) и зарубежных (17) рецензируемых изданиях.

автора являлся определяющим на всех этапах работы и заключался в постановке задач исследования, участии в проведении экспериментов и обработке данных, анализе, обобщении и изложении результатов. Работа выполнена при финансовой поддержке, полученной автором от Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 99-04-49652а, 02-04-48251 а, 05-04-48209а, 08-04-00574а).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клетки. Основными объектами исследования служили клетки, пролиферирующие в культуре, — постоянные клеточные линии Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН). Клетки миелоидной лейкемии человека К562 и гистиоцитарной лимфомы U937 культивировали на среде RPMI-1640 с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки и, в части работы, антибиотиков. Эмбриональные фибробласты мыши ЗТЗ Balb и ЗТЗ Balb SV40, клетки эпидермоидной карциномы А431, клетки почек эмбрионов человека НЕК293 культивировали на среде DMEM с добавлением сыворотки. Использовали также леритонеальные макрофаги и нейроны слинальных ганглиев крыс.

Регистрация ионных токов. Функциональные свойства ионных каналов исследовали с использованием электрофизиологических подходов — различных вариантов метода локальной фиксации потенциала (patch clamp, [9,10]). Трансмембранные токи регистрировали с помощью высокоомного операционного усилителя (ЕРС-7, List Electronics; НЕКА ЕРС 8) при отведении от участка мембраны нативной клетки (cell-attached вариант) или в изолированных мембранных фрагментах (варианты inside-out и outside-out). При отведении сигнала "от целой клетки" (whole-cell recording), как правило, измеряли интегральные токи. Аналогичный подход использовали при исследовании потенциал-управляемых каналов нервной клетки в условиях фиксации напряжения (voltage clamp). При отведении токов в режиме outside-out фрагмент мембраны обращен внешней поверхностью в камеру, что позволяет варьировать состав наружного раствора. В режиме inside-out цитоплазматическая сторона мембраны доступна для смены раствора, что позволяет исследовать пути регуляции каналов с участием потенциальных цитоплазматических эффекторов. Сопротивление микропипеток, заполненных стандартным раствором, составляло около 2-4 мОм (whole-cell вариант) и 5-15 мОм в остальных режимах. Мембранный потенциал (Е) задавали как потенциал раствора с внутренней стороны мембраны относительно наружного раствора. Для оценки механочувствительности использовали известный способ механической стимуляции участка мембраны -локальное растяжение посредством уменьшения (ДР<0) или увеличения (ДР>0) гидростатического давления в регистрирующей пипетке [25].

Обработка данных. Значения проводимости одиночного канала определяли по линейному участку вольт-амперной характеристики, как правило, в области отрицательных потенциалов. Уровень активности каналов оценивали по значению вероятности открытого состояния канала (Р0): P0=l/Ni, где N - число элементарных уровней проводимости, I - средний ток для заданного временного интервала (рассчитывался из амплитудных гистограмм), i - амплитуда одиночного открывания. Результаты представлены в виде: среднее±средняя ошибка. Фильтрация сигнала 100 или 200 Гц.

Для оценки селективности каналов по отношению проницаемостей использовали уравнения электродиффузионной теории Гольдмана-Ходжкина-Катца (GHK equations, см. [1]). Для моновалентных ионов, например, Na+ и К+, оно имеет простейший вид:

EpeB=(RT/zF)ln(PNa[Na+]cut/PK[K+]in), где Ерев - потенциал реверсии, R - универсальная газовая постоянная, F - константа Фарадея, z - заряд иона, PNa(K) - проницаемость для данного иона и [Na(K)+] - активность иона. В случае, когда два проникающих иона имеют разную величину заряда, например, Мд+ снаружи и К+ внутри клетки, отношение проницаемостей в соответствии с теорией GHK может быть определено следующим образом:

Рмд/Рк ={[К ] in /4[Mg2+]0Ut}exp(EpeBF/RT){exp(EpeBF/RT)+1} При обсуждении результатов рассматриваются ограничения данных подходов, постулирующих независимость движения ионов в канале. Коэффициенты активности рассчитывали с помощью расширенного уравнения Дебая-Хюккеля.

Основные растворы. Стандартный наружный раствор содержал (мМ): 145 NaCI, 2 CaCI2, 1 MgCI2, 10 HEPES/TrisOH. При отведении cell-attached использовали калиевый внеклеточный раствор, содержащий (мМ): 145 KCI, 2 CaCI2, 1 MgCI2, 10 HEPES/KOH; в этих условиях потенциал покоя приближался к нулевому значению. В конфигурации inside-out стандартный раствор в камере, контактирующий с внутриклеточной стороной мембранного фрагмента (cytosol-like solution), содержал (мМ): 140 K-Aspartate (или 145 K-Glutamate, 145 KCI, 70 K2S04), 5 NaCI, 2 EGTA, 1 MgCI2, 20 HEPES/TrisOH и соответствующее количество CaCI2 (0.176 мМ) для поддержания свободной концентрации ионов кальция на уровне 0.01 мкМ (рСа=8). рН растворов поддерживали на уровне 7.3. Опыты проводили при температуре 22-23° С.

Актин и актин-связывающие белки. Гельзолин и кэпирующий белок CapZ были любезно предоставлены профессором Хинссеном (Билефельд, Германия). CapZ, выделенный из грудной мышцы цыпленка [26], и гельзолин, выделенный из желудка свиньи [27], хранили в виде осадков в сульфате аммония при -70° С; перед использованием суспендировали и диализовали против буферного раствора, содержащего (мМ): 0.2 EGTA, 0.2 DTT, 0.2 PMSF, 10 Tris-HCI, рН=7.0-7.5. G-актин, выделенный из скелетных мышц кролика [28], хранили в

растворе низкой ионной силы, содержащем (мМ): 2 Tris-HCI, 0.1 CaCI2, 0.2 АТР, рН=7.5, с добавлением 0.02 % NaN3; использовали в течение 5 суток. Полимеризацию актина in vitro регистрировали как увеличение светорассеяния раствора при 350 нМ под углом 90° или как увеличение вязкости раствора при помощи капиллярного вискозиметра Оствальда.

Флуоресцентная микроскопия. Для визуализации F-актина применяли стандартные методики фиксации и окраски клеток с помощью родамин-фаллоидина (TRITC-phalloidin, 2 мкМ). Для визуализации изменений клеточной поверхности использовали филипин (10 мкг/мл) и FITC-конъюгированную В-субъединицу холерного токсина (СТВ, 2.5 мкг/мл); окрашивание проводили без пермеабилизации клеток.

Модификация липидного состава. Для частичной экстракции холестерина клетки инкубировали (37° С, С02) в среде без сыворотки в присутствии метил-бета-циклодекстрина (МбЦД, 2.5 или 5 мМ), циклического олигосахарида, селективно связывающего стеролы [29]. Обработка клеток МбЦД является наиболее эффективным методом модификации стерольного состава мембран, в частности, снижения уровня холестерина. С помощью газожидкостной хроматографии показано, что в норме уровень холестерина в клетках К562 составлял около 20 мкг/мг белка, после 2-часовой инкубации с 2.5 и 5 мМ МбЦД содержание холестерина снижалось до 11 и 5 мкг/мг, соответственно. В качестве дополнительного контроля использовали альфа-циклодекстрин, структурный аналог, не связывающий холестерин.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ОБСУЖДЕНИЕ.

Потенциал-управляемые натриевые каналы и роль карбоксильных групп в их активации.

Потенциал-управляемые ионные каналы, экспрессирующиеся преимущественно в возбудимых тканях, обладают двумя ключевыми свойствами — способностью к избирательному пропусканию ионов и к переходу из закрытого состояния в открытое в ответ на сдвиг мембранного потенциала. Натриевые каналы (Nav) определяют генерацию и проведение нервного импульса, интеграционные процессы кодирования информации в сенсорных нейронах. В наших экспериментах на нейронах спинальных ганглиев крыс и культивируемых клетках нейробластомы (линия Neuro 2А) получены данные о молекулярной организации ионофорной структуры и воротного механизма тетродотоксин-чувствительных натриевых каналов (Negulyaev, Vedernikova, 1985). Регистрация интегральных ионных токов в условиях фиксации потенциала (voltage clamp) представляла основной метод исследования потенциал-активируемых натриевых каналов. Характеристики натриевых токов в контроле и при химической модификации анализировали с применением имеющегося арсенала биофизических подходов, развитых в классических работах Алмерса [7],

Армстронга [6,30], Можаевой и Наумова [8], Хилле [1]. Обнаружено, что обработка мембраны сомы нейрона специфическими реагентами на карбоксильные группы — водорастворимыми карбодиимидами, реагентом Вудварда К — ведет к существенным изменениям в работе электрочувствительного механизма натриевых каналов, в том числе двукратному снижению эффективного заряда активационной системы (Негуляев, Наумов, Ведерникова, 1986; Наумов, Негуляев, Ведерникова, 1987). Эти данные указывают на важную роль отрицательно заряженных карбоксильных групп внешней поверхности мембраны как компонентов подвижного воротного заряда натриевых каналов нервной клетки.

В дальнейшем эффекты блокирования и модуляции натриевых каналов нервной клетки при понижении рН и действии избирательных модификаторов были детально изучены с помощью метода локальной фиксации потенциала (патч-кламп) (Негуляев, Ведерникова, 1989). Подтверждены предположения об изменениях селективности и воротных свойств канала при действии алкалоида аконитина (Negulyaev, Vedernikova et al., 1990). Важно отметить, что как при химической, так и при фармакологической модификации сохраняется основной механизм активации и инактивации каналов в ответ на сдвиг мембранного потенциала, что и определяет быстрые изменения катионной проницаемости возбудимых мембран. Следующий этап наших исследований включал анализ мембранных путей пассивного переноса катионов через каналы клеточной мембраны в эукариотических клетках различной специализации и уровня дифференцировки.

Потенциал-независимые натриевые каналы.

Применение различных вариантов метода патч-кламп позволило обратиться к выяснению механизмов регуляции ионных каналов в различных типах электроневозбудимых клеток, включая первичные культуры и постоянные клеточные линии. В экспериментах на нативных клетках (cell-attached) после достижения плотного контакта регистрирующей пипетки с поверхностью клетки (о чем судили по увеличению сопротивления) регистрировали электрическую активность клеточной мембраны на уровне элементарных событий — ионных токов через одиночные каналы. Идентификация каналов катионного входа осуществлялась, в первую очередь, на основании вольт-амперных характеристик и экспериментов на изолированных фрагментах мембран (outside-out, inside-out) с заменой катионов или анионов (Negulyaev, Savokhina, Vedernikova, 1993). В плазматических мембранах перитонеальных макрофагов крыс (Negulyaev, Vedernikova, 1994), клеток эпидермальной карциномы человека А431 (Negulyaev, Vedernikova et al., 1994), гистиоцитарной лимфомы U937 и хронической миелоидной лейкемии К562 (Negulyaev, Maximov, Vedernikova et al., 1997) были идентифицированы несколько типов натрий-проводящих каналов, различающихся избирательностью для моновалентных катионов.

Наиболее типичны высокоселективные и низкоселективные каналы, отношение проницаемостей Рма/Рк составляло 10 и 3, соответственно (\/ес1еггйкоуа е{ а!., 1997). Величина проводимости составляла 12 пС. Уровень мембранного потенциала оказывал некоторое модулирующее влияние на активность каналов: в области отрицательных потенциалов значения вероятности открытого состояния были несколько ниже, чем в области положительных значений и вблизи нуля. Такая модуляция совершенно отлична от потенциал-чувствительного воротного механизма, управляющего открыванием и закрыванием каналов в нервной клетке.

Таким образом, можно заключить, что в различных электроневозбудимых клетках присутствуют катионные каналы, характеризующиеся преимущественной проницаемостью для натрия (№+) и отсутствием потенциал-зависимой активации и инактивации. При физиологических условиях данные каналы могут обеспечивать поступление натрия в цитоплазму из внеклеточной среды. Показано, что потенциал-независимые (поп-УоИаде-да1ес!) натриевые каналы нечувствительны к тетродотоксину (Ведерникова, Негуляев, 1995), известному блокатору потенциал-активируемых натриевых каналов. По своим фармакологическим характеристикам — низкой чувствительности к амилориду и его производным — обнаруженные каналы отличаются и от известных натриевых каналов апикальной мембраны почечного эпителия (ЕЫаС). Как известно, эпителиальные каналы (Е№С) ингибируются амилорилом в микромолярных и субмикромолярных концентрациях, что используется как маркерный признак в электрофизиологических измерениях ионных токов [13,14]. В то же время по проводящим и кинетическим свойствам потенциал-независимые (поп-уоКаде-да1ес!) натриевые каналы, обнаруженные в наших исследованиях, близки к каналам семейства Е№С. Надо отметить, что основные пути активации и тех, и других очевидным образом отличаются как от потенциал-активируемых, так и от типичных рецептор-акгивируемых каналов. В настоящее время есть основания относить их к одному классу (или семейству) потенциал-независимых катионных каналов (Ведерникова и др., 1999), что служит отправной точкой и находит подтверждения при выяснении механизмов их регуляции. Предполагаемая близость к эпителиальным каналам почки послужила основанием для поиска активаторов каналов среди известных гормонов и физиологически активных веществ. Действительно, мы обнаружили, что минералокортикоид альдостерон может стимулировать №+ токи в культивируемых клетках миелоидной лейкемии, влияя как на плотность натриевых каналов в плазматической мембране, так и на уровень их активности (Негуляев, Ведерникова и др., 1996). Были также получены данные, свидетельствующие о вероятном участии в-белков и актинового цитоскелета в регуляции натриевых каналов.

Активация и инактивация потенциал-независимых натриевых каналов: роль актинового цитоскелета.

Разборка микрофиламентов вызывает активацию натриевых каналов. В экспериментах с применением известных модификаторов аппарата микротрубочек и микрофиламентов обнаружено, что уровень активности натриевых каналов зависит от состояния актиновой сети. Показано, что цитохалазины Б и Д (ЦБ, ЦД), агенты, избирательно разрушающие F-актин, вызывают активацию Na-проводящих каналов с проводимостью 12 пСм в клетках К562, U937, НЕК293. Значительный рост активности и соответствующее повышение вероятности открытого состояния каналов (Р0) при действии деструкторов F-актина обнаружены в различных условиях регистрации ионных токов, при использовании различных вариантов метода локальной фиксации потенциала (Negulyaev, Vedernikova et al., 1996b). Следует отметить единообразие эффектов цитохалазинов, как в опытах на интактной клетке, так и после отделения фрагмента мембраны. Это позволило в дальнейшем детально исследовать цитоскелет-зависимые механизмы регуляции каналов в опытах на мембранных фрагментах (inside-out вариант) с применением экзогенных белков цитоскелета.

В большинстве экспериментов фоновая активность натриевых каналов была низка, вероятность их открытого состояния (Ро) приближалась к нулевому значению. Добавление ЦД или ЦБ (10 мкг/мл) к цитоплазматической стороне мембраны вызывало, через 2-3 мин, активацию натриевых каналов (рис. 1). Так, в клетках К562 активацию каналов наблюдали в 42 % экспериментов на фрагментах мембран (п=114), в большинстве опытов наблюдалась активность двух и более каналов. Вольт-амперная характеристика дает значение проводимости 11.9±0.5 пСм и потенциал реверсии 22.8±1.3 мВ, что соответствует отношению проницаемостей Рма/Рк около 3 (Ведерникова и др., 1997).

В экспериментах на мембранных фрагментах обнаружена активация натриевых каналов с близкими характеристиками при действии гельзолина, кальций-зависимого актин-связывающего белка, фрагментирующего микрофиламенты (Maximov, Vedernikova et al., 1997b). Добавление экзогенного гельзолина (25 мкг/мл) в раствор, содержащий 1 мкМ ионизированного кальция [Са2+],, приводит к значительному увеличению канальной активности (рис. 1 А). При этом важно отметить, что, во-первых, добавление гельзолина при 0.01 мкМ [Ca2+]i не имеет эффекта. Во-вторых, варьирование концентрации кальция ([Са2+]0 в растворе, имитирующем внутриклеточный, не влияет на вероятность открытого состояния натриевых каналов; в частности, повышение [Са2+], до 1 мкМ не изменяет уровень их активности. Таким образом, гельзолин вызывает активацию каналов Са-зависимым образом, и, следовательно, этот эффект обусловлен фрагментацией актиновых филаментов, ассоциированных с плазматической мембраной.

lHw'wlt'Ffr^'WM^'flM««* Контроль

Гепьзолин

H> G-актин

[0,5 пА "

400 мс

Контроль Цитохалазин Д

Ц| Ift i jJ___kunlui I

' 10,5 nA

G-акгин

),5nA 400 мс

viWWwJ^

1,5 мин 2 мин 2,5 мин

Рис. 1. Активация и инактивация потенциал-независимых натриевых каналов. Записи токов показывают активность каналов в ответ на подачу (А) гельзолина (25 мкг/мл) при 1 мкм свободного [Ca2+]i, или (Б) цитохалазина Д (10 мкг/мл) к цитоплазматической стороне мембраны. Регистрация inside-out при потенциале -30 мВ. Последующее добавление глобулярного актина (300 мкг/мл) в присутствии 1 мМ магния в растворе ингибирует натриевые токи. (В) Временной ход инактивации токов после подачи G-актина. Мембранный потенциал -20 мВ. Фильтр 200 Гц.

0,5 пА 400 мс

Параллельно с нашим исследованием в литературе появились первые работы, в которых исследовали связь различных типов каналов (калиевых, хлорных) с кортикальными микрофиламентами в экспериментах на изолированных мембранных фрагментах [31,32]. Существование в них фибриллярных внутриклеточных структур было также показано с помощью сканирующего силового микроскопа [33]. В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что некоторые белки цитоскелета чрезвычайно прочно связаны с мембраной, характеризуясь повышенной устойчивостью к действию детергентов при биохимической экстракции [20,21]. Выявленный в наших опытах эффект гельзолина подтвердил обоснованность и физиологический смысл экспериментов на фрагментах клеточной мембраны для анализа взаимосвязи ионных каналов с динамикой примембранного актина. Совокупность полученных нами данных доказывает, что разборка примембранных микрофиламентов приводит к активации потенциал-независимых натриевых каналов.

Инактивация каналов при полимеризации актина. Как было показано, высокий уровень активности натриевых каналов сохранялся и после удаления цитохалазинов или гельзолина из раствора, контактирующего с внутриклеточной стороной мембранного фрагмента, что свидетельствует о необратимости эффекта. Подавление активности каналов было обнаружено при добавлении в камеру глобулярного (G) актина (300 мкг/мл), который при повышении ионной силы среды способен к быстрой полимеризации (Ведерникова и др., 1997). Процесс инактивации развивался в течение 2-3 мин (рис. 1 В). Для проверки предположений о возможных механизмах ингибирования каналов были проведены эксперименты с использованием различных форм актина, полимеризующихся с различной скоростью. Известно, что способность мономерного актина к полимеризации зависит от присутствия в растворе ионов магния [34]. В наших экспериментах in vitro было также продемонстрировано, что G-актин, содержащий Мд2+ в качестве связанного катиона (Мд-актин), полимеризуется существенно быстрее, чем актин, содержащий Са2+ (Са-актин). Скорость образования филаментов в растворе была оценена по интенсивности светорассеяния. После инициации полимеризации добавлением 0.1 М KCI интактный Mg-актин полимеризуется быстро, за 2 мин. В случае Са-актина наблюдали лишь небольшое увеличение интенсивности светорассеяния в течение 8-10 мин. Использовали также актин, инактивированный нагреванием, который не способен к полимеризации [35], и модифицированный актин, полученный путем расщепления специфической бактериальной протеазой [36]. Протеолитически расщепленный актин полимеризуется медленно, и критическая концентрация для его полимеризации высока по сравнению с интактной формой.

В электрофизиологических экспериментах активность натриевых каналов индуцировали приложением ЦД или ЦБ к цитоплазматической стороне мембраны. Тестирование различных форм актина (300 мкг/мл) показало, что только интактный G-актин в присутствии 1 мМ Мд2+ быстро (2-3 мин) ингибирует натриевые токи (Negulyaev, Khaitlina, Hinssen, Shumilina, Vedernikova, 2000). Во всех остальных случаях введение актина не приводило к инактивации каналов. Сопоставление результатов патч-кпамп опытов с кинетикой полимеризации актина in vitro свидетельствует, что ингибирующее действие актина на натриевые каналы коррелирует с эффективностью образования филаментов. Было также показано, что предварительно сформированные филаменты, независимо от их длины, не приводят к подавлению активности каналов (Ведерникова и др., 2000). Таким образом, можно заключить, что полимеризация актина на цитоплазматической стороне мембраны является критическим фактором инактивации каналов.

Регуляция активности натриевых каналов при участии кэпирующего белка.

Среди белков, контролирующих сборку актиновых нитей в примембранной части клетки, важное место принадлежит копирующим белкам [26,37], связывающимся с плюс-концами актиновых филаментов, что препятствует дальнейшей полимеризации. Задачей следующего этапа работы было исследование возможного участия кэпирующего белка в регуляции натриевых каналов. Использовали экзогенный копирующий белок Сарг, типичный для г-дисков мышечных клеток

Как показывают данные полимеризации актина в присутствии кэпирующего белка, Сарг уменьшает вязкость раствора актина, и это уменьшение определяется соотношением Сарг/актин (рис. 2). Поскольку Сарг связывается только с плюс-концом филаментов, уменьшение вязкости отражает уменьшение средней длины филаментов. Когда актин полимеризовался в присутствии Сарг при низком молярном соотношении Сар2Уактин (1:50-1:100), вязкость уменьшалась только на 20 % по сравнению с контролем, что указывает на то, что в этих условиях формируется достаточно большое количество длинных филаментов. При высоком молярном соотношении Сарг/актин (1:7-1:15) вязкость раствора уменьшалась на 70-80 %, что свидетельствует о том, что в растворе преобладают короткие актиновые филаменты (рис. 2).

Влияние кэпирующего белка на активность натриевых каналов в клетках К562, вызванную приложением цитохалазина, исследовали, одновременно добавляя Сарг и актин в различных молярных соотношениях, варьирующих в широких пределах (1:5-1:100). Исходя из гипотезы «коротких филаментов», предложенной для каналов ЕЫаС [38], мы полагали, что активность каналов может зависеть от длины формирующихся филаментов, и таким образом, ингибирующий эффект актина может быть различным при различных соотношениях Сарг/актин.

0,40

10 15 20 25 30

Время, мин

без Сарг

Рис. 2. Образование актиновых филаментов в растворе в присутствии кэпирующего белка СарИ, оцененное на основании измерений вязкости; указаны молярные отношения Сар2/актин. Полимеризацию актина инициировали добавлением раствора, имитирующего внутриклеточный. Конечная концентрация актина 300 мкг/мл

а ЦБ

б Сар2:С-ак™н=1:30

Сарг:С-акгин=1:100

г Э-актин

0.5 пА| 500 мс

Рис. 3. Натриевые каналы не могут быть инактивированы комплексами актин/Сар 2.

Записи токов показывают активацию натриевых каналов ЦБ (10 мкг/мл) (а), отсутствие инактивации при подаче смеси в-актина и Сар2 при молярном соотношении Сар2Уактин 1:30 (б) и 1:100 (в) и инактивацию при подаче в-актина (300 мкг/мл) (г). Поддерживаемый потенциал на мембране -20 мВ.

Однако мы обнаружили, что при всех использованных соотношениях Сар27актин в-актин не ингибировал активность каналов в присутствии кэпирующего белка (рис. 3). Последующая отмывка и подача в раствор в-актина (300 мкг/мл) в тех же ионных условиях приводили к полному подавлению натриевых токов в течение 1-2 мин. Таким образом, Сарг препятствует инактивации каналов под действием полимеризующегося актина (БЬитИта, №ди1уаеу, МогасЬеУБкауа е1 а!., 2001).

Неспособность О-актина ингибировать активность натриевых каналов в присутствии кэпирующего белка могла быть вызвана специфическим связыванием Сар2 с сайтом на мембране, что может изменять свойства канала и предотвращать полимеризацию актина на цитоплазматической стороне мембраны. Чтобы проверить это предположение, после активации каналов цитохалазином белки подавали последовательно. Сарг добавляли в камеру в концентрации 30 мкг/мл (что соответствует молярному соотношению 1:5 в комплексах Сар27актин). Оказалось, что проводимость одиночного канала, Ыа+/К+ селективность, значения Р0, измеренные до и после добавления Сарг, практически совпадали. Кроме того, каналы могли быть инактивированы актином после отмывки кэпирующего белка. Следовательно, Сар2 не связывается необратимо с плазматической мембраной и не влияет на свойства каналов. По-видимому, эффект кэпирующего белка заключается в его способности модулировать процессы сборки-разборки микрофиламентов.

Для дальнейшего анализа эффектов кэпирующего белка мы добавляли С-актин к мембранному фрагменту до подачи Сарг. Были проведены две серии таких экспериментов. Обнаружено, что при добавлении на ранней стадии полимеризации актина Сарг может

остановить процесс инактивации и восстановить активность каналов (рис. 4, вИитШпа, Меди1уаеу, МогасИеузкауа а1., 2003).

Однако Сарг восстанавливал активность натриевых каналов только в том случае, когда инактивация была частичной. Во второй серии опытов кэпирующий белок добавляли на более поздних стадиях полимеризации. Когда актин находился в камере более 60 с, мы наблюдали полное подавление токов через натриевые каналы. В этом случае последующее добавление Сар! не восстанавливало активности каналов, значение Р0 оставалось близким к нулевому уровню.

Ро

1,0 -. 0,5 -

0,0

/СВ\ в-актин, 7 с <3-актин, 14 сС-актин, 30 с Сар2, 50 с ,Сар7, 90 с

1 пА

И^ч^ДС

500 мс

Рис. 4. Активность натриевых каналов может быть восстановлена при добавлении кэпирующего белка на ранней стадии полимеризации актина. Значения вероятности открытого состояния (Р0) отражают уровень активности каналов после подачи цитохалазина Б (СВ), а затем после подачи в-актина и последующего добавления в камеру СарТ (молярное соотношение Сар2/актин 1:50). Сар2 добавляли через 30 с после подачи актина; временные интервалы указаны. Показаны фрагменты записей токов при потенциале -20 мВ. зио- закрытое и открытое состояние канала.

Эффект кэпирующего белка, вероятно, обусловлен тем, что он связывается с плюс-концами растущих филаментов, препятствуя дальнейшему присоединению мономеров актина. Таким образом, дальнейшая элонгация будет возможна только на минус-конце, что приведет к повышению критической концентрации полимеризации и к снижению скорости сборки филаментов. Кроме того, Сар2 обладает нуклеирующей активностью и, следовательно, ускоряет полимеризацию актина в растворе, омывающем фрагмент мембраны. Вследствие этого уменьшится пул мономеров, необходимых для элонгации филаментов, ассоциированных с плазматической мембраной. В результате этих процессов, по-видимому, происходит ингибирование дальнейшей элонгации и частичная разборка филаментов, ассоциированных с мембраной, что, в свою очередь, останавливает инактивацию канала и частично восстанавливает его активность. Результаты экспериментов с

CapZ демонстрируют, что именно динамические процессы сборки-разборки примембранных филаментов контролируют активность натриевых каналов. Дальнейшие исследования подтвердили, что кэпирующие белки могут модулировать поведение каналов, регулируя полимеризацию кортикального актина.

Данные, полученные в опытах с цитохалаз.инами, актин-связывающими белками (гельзолином и CapZ), различными формами глобулярного актина свидетельствуют о том, что организация и динамика примембранных микрофиламентов существенным образом влияет на функционирование потенциал-независимых натриевых каналов в плазматической мембране, по-видимому, являясь одним из главных факторов, определяющих уровень их активности.

Активация натриевых каналов в нативных клетках при повышении уровня внутриклеточного кальция.

Для проверки возможной кальций-зависимой регуляции натриевых каналов использовали ионофор А23187-4Вг, который индуцирует повышение концентрации свободного кальция в цитозоле за счет электронейтрального обмена Са2+ на протоны или магний [39]. В экспериментах на нативных клетках (cell-attached) показано, что добавление 10 мкМ А23187-Вг во внеклеточный раствор приводит к активации натриевых каналов (Maximov, Vedernikova et al., 1997b). Индуцированную ионофором активность (Ро=0.13±0.04, п=12) натриевых каналов в клетках К562 наблюдали в 15 (39 %) из 38 стабильных патчей. Развитие токов входящего направления характеризовалось задержкой, 60+12 с (п=12), в то время как Са-зависимые калиевые каналы, регистрируемые в части экспериментов, активировались через 17±9 с (п=5) после добавления ионофора в наружный раствор. Удаление А23187-4Вг и отделение изолированного фрагмента не приводили к подавлению натриевых токов. Активность натриевых каналов сохранялась после отделения мембранного фрагмента (переход в конфигурацию inside-out) при регистрации в безкальциевом растворе, содержащем 2 мМ EGTA (Ро=0.13±0.07, п=5). Эти данные подтверждают, что ионы кальция не влияют непосредственно на исследуемые каналы (Maximov, Vedernikova et al., 1997a). Результаты опытов с гельзолином (см. рис. 1) свидетельствуют о возможной Са-зависимой регуляции натриевых каналов, опосредованной фрагментацией микрофиламентов. Действительно, последующее добавление во внутриклеточный раствор 300 мкг/мл глобулярного актина приводило к подавлению активности, вызванной А23187-4Вг (Ро=0.04±0.03, п=3), что подтверждает предположение об участии актинового цитоскелета в процессе кальций-зависимой активации натриевых каналов. Предполагаемая «актин-опосредованная» кальциевая регуляция совершенно отлична от обнаруженной нами

"быстрой" активации и инактивации хлорных (Савохина, Негуляев, Ведерникова, 1991) и калиевых каналов (ЙедШуаеу, \Zedernikova е1 а1., 1996а), когда ионы кальция, по-видимому, непосредственно взаимодействуют с канальными молекулами.

-100 -75 -50 -25

• Контроль

□ CD

▼ Гельэолин

О А23187-4ВГ

-¡С-""' MB

J пА

Рис. 5. Вольт-амперные характеристики натриевых каналов в клетках К562 в нормальных условиях (контроль) и после активации, вызванной цитохалазином Д (СО), экзогенным гельзолином и ионофором А23187-4Вг.

Сопоставление характеристик, полученных при анализе ионных токов в различных условиях (рис. 5) — при активации цитохалазином, гельзолином, кальциевым ионофором, а также регистрируемых в контрольных опытах на клетках К562 — демонстрирует хорошее совпадение параметров одиночных каналов, в частности, значений проводимости (12 пСм). Показано, что натриевые каналы, активация которых сопряжена с динамикой примембранного актина, не обладают чувствительностью к механической стимуляции — локальному растяжению мембраны (Ведерникова и др., 2000). При этом в различных типах клеток (К562, U937, Jurkat, Balb3T3) обнаружена механозависимая активация каналов, явно отличающихся по проводящим и воротным свойствам от натриевых каналов, активирующихся при разборке цитоскелета.

Участие ГТФ-связывающих белков в регуляции натриевых каналов.

Для изучения возможного участия G-белков в регуляции потенциал-независимых натриевых каналов использовали гуанозин 5'-0-(3-тиотрифосфат) (GTPyS), негидролизуемый аналог GTP, известный активатор как гетеротримерных, так и мономерных G-белков [40] и фторид алюминия (AIF4"), активатор гетеротримерных G-белков [41]. В экспериментах inside-out на клетках К562 наблюдали активацию натриевых каналов после добавления GTPyS (100 мкМ) к цитоплазматической стороне мембраны (рис. 6, Shumilina, Khaitlina, Morachevskaya et al., 2003). Характеристики каналов, включая проводимость (12 пСм) и селективность (Р^а/Рк около 3), были близки к полученным ранее в опытах на культивируемых клетках К562. Фторид алюминия был неэффективен, что указывает на вероятное участие малых G-белков. Повышение Р0 происходило с существенной задержкой

(6-10 мин), что не соответствует традиционному описанию в рамках простой модели «активированный С-белок -> ионный канал» [42]. Скорее всего, действие негидролизуемого аналога вТР включает дополнительные звенья в цепи передачи сигнала. Поскольку мы наблюдали активацию натриевых каналов с теми же характеристиками при разрушении цитоскелета (см. рис. 2 и 5), логично предположить, что ОТРуБ-индуцированное повышение активности также связано с разборкой примембранных микрофиламентов. Это нашло подтверждение в нескольких сериях экспериментов с использованием модификаторов цитоскелета и различных видов актина.

GTPvS

..■л Д. -.ьТГгНиц. .

ff** W1 fwwflfll WfT^ffT

.ii -30 MB _hm. UiMkiiU L—_

nWp^f 7 w Т^ГтгТпЛ

-40 MB

■50 MB

ЩшФЩ N Г

[О^па ^vfwmV

200 мс

Рис. 6. Влияние негидролизуемого аналога GTP (GTPyS) на активность одиночных каналов. А. Записи токов (inside-out) при различных значениях мембранного потенциала и соответствующие амплитудные гистограммы показывают активацию натриевых каналов через в мин после добавления GTPyS (100 мкМ) в раствор с цитоплазматической стороны мембраны. Б. Вольт-амперная характеристика натриевых каналов, активирующихся при подаче GTPyS. Проводимость 11.1±0.6 пСм (п=15).

S0 -10

Влияние в-актина на активность натриевых каналов, индуцированную вТР/Б. В первой серии опытов на фрагментах мембран активность натриевых каналов индуцировали ЭТРуБ (100 мкМ), после чего добавляли в камеру глобулярный (в) актин (300 мкг/мл). Так же, как в опытах с цитохалазинами, в-актин вызывал быструю, в течение 1-3

мин, инактивацию натриевых каналов (рис. 7). Ингибирующее действие актина обусловлено именно его полимеризацией на цитоплазматической стороне мембраны, поскольку в-актин в отсутствие ионов магния, а также предварительно сформированные филаменты (Р-актин), независимо от их длины, не приводили к подавлению активности каналов (рис. 8). В следующей серии опытов использовали фаллоидин, известный агент, стабилизирующий актиновые филаменты и препятствующий их разборке. Показано, что предварительное добавление в камеру фаллоидина (12 мкМ, экспозиция 1 мин) препятствует развитию активности каналов в ответ на подачу СТРув. Эти результаты подтверждают, что действие негидролизуемого аналога вТР связано с разборкой актиновых филаментов, ассоциированных с мембраной (МогасМеуэкауа е1 а!., 2004).

Юс

100 мкМ вТРуЭ

-40 мВ

300 мкг/мл в-актин

-40 мВ

120 с 10.5 пА

-60 мВ

500 мс

Рис. 7. Инактивация натриевых каналов, активированных СТРуБ, при добавлении в-актина в раствор с цитоплазматической стороны

мембраны.

А. Записи токов через 10 мин после подачи вТР/Б, а затем добавления глобулярного актина (300 мкг/мл, при 1мМ магния в растворе). Указаны значения мембранного потенциала и интервалы времени после подачи актина, о - открытое состояние канала.

Б. Значения вероятности открытого состояния (Р0).

СГРдЭ 10 мл! С-акгин10с С-акгин60с С-актт 120с

Механизм ГТФ-зависимой регуляции натриевых каналов: роль динамики актина. Как известно из данных литературы, малые О-белки семейства ^о регулируют перестройки актинового цитоскелета в клетках [43] и, в частности, могут запускать ряд процессов, приводящих к диссоциации кэпирующих белков от плюс-концов микрофиламентов [44]. В клетке высвобождение плюс-концов актиновых филаментов, как правило, приводит к взрывной полимеризации, поскольку в цитоплазме содержится значительное количество мономерного актина, который

быстро присоединяется к свободным концам филаментов. Однако, в отсутствие G-актина, «декапирование» микрофиламентов, связанных с мембраной, будет приводить к обратному эффекту, а именно к их разборке. Такая ситуация реализуется в типичном эксперименте inside-out при подаче активатора G-белка.

F-актин,

CTPYS короткие филаменты

-30 мВ

13 3

-50 MB

G-актин

1 мин .70 мВ

-60 мВ

2 мин -60 мВ

10.5 пА

500 мс

Рис. 8. Предварительно сформированные филаменты (F-актин) не влияют на активность натриевых каналов, индуцированную GTPyS, тогда как полимеризация актина на цитоплазматической стороне мембраны ингибирует натриевые токи. Записи токов, активированных GTPyS до (слева) и после (в середине) подачи F-актина к цитоплазматической стороне мембранного фрагмента, затем - после добавления G-актина (справа) в присутствии 1мМ магния в растворе. Указаны значения потенциала и интервалы времени после подачи G-актина. з и о -закрытое и открытое состояние канала.

Для проверки наших предположений о роли кэпирующих белков и стадии «декапирования» в ГТФ-зависимой регуляции каналов мы использовали Са-актин, который, как мы показали ранее, полимеризуется медленно и не способен ингибировать активность каналов, но эффективно присоединяется к свободным концам имеющихся филаментов и препятствует их разборке. После отделения фрагмента мембраны (конфигурация inside-out) в камеру добавляли GTPyS (100 мкМ) и Са-актин (300 мкг/мл). Согласно нашей рабочей гипотезе, активация малого G-белка при действии GTPyS приведет к диссоциации кэпирующего белка от концов филаментов; однако в присутствии Са-актина равновесие не будет смещаться в сторону разборки филаментов и, соответственно, каналы не будут активироваться. Действительно, мы не наблюдали открываний каналов в течение 10 мин после добавления в раствор GTPyS и Са-актина. Отсутствие активации было обусловлено наличием в камере мономерного Са-актина, а не отсутствием каналов во фрагменте мембраны. Это было проверено в опытах, когда смесь актина и GTPyS отмывали и добавляли стандартный внутренний раствор, содержащий цитохалазин Б (ЦБ, 10 мкг/мл). В 2 экспериментах из 4. через 1-2 мин после подачи ЦБ наблюдали типичную активацию натриевых каналов.

Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют, что СТРуЭ действительно вызывает активацию С-белка, запускающего сигнальный каскад реакций, в результате которых происходит высвобождение концов актиновых филаментов, что инициирует процессы сборки-разборки кортикального актина. Направление реакций «полимеризация деполимеризация» будет определяться

концентрацией С-актина в цитоплазме. Таким образом, показано, что малые в-белки могут регулировать натриевые каналы в клетках К562 посредством модификации примембранного актинового цитоскелета.

Функциональная связь натриевых каналов с динамикой актина в клетках с пониженным содержанием холестерина.

Как показали проведенные исследования, активность натриевых каналов в невозбудимых клетках критически зависит от состояния актинового цитоскелета. Задачей следующего этапа работы было выяснение роли липидного окружения в регуляции натриевых каналов Согласно современным представлениям о латеральной гетерогенности клеточных мембран, важное значение для связи кортикального актина и интегральных белков имеют богатые холестерином липидные микродомены (рафты) [18-21]. Нарушения структуры и целостности липидных рафтов, обусловленные снижением уровня мембранного холестерина, могут препятствовать реализации цитоскелет-зависимых функций клетки.

В электрофизиологических экспериментах с использованием различных вариантов патч-кламп метода исследовали функциональные свойства натриевых каналов в клетках с пониженным уровнем холестерина. С использованием ранее апробированных подходов оценивали характеристики каналов, уровень их активности и частоту встречаемости, действие модификаторов цитоскелета. Центральный вопрос данного раздела работы - каким образом реализуется функциональная связь каналов с состоянием примембранного актина в условиях экстракции холестерина и предполагаемой деструкции рафтов. В частности, необходимо было выяснить, имеет ли место активация каналов при разборке микрофиламентов. Для частичной экстракции холестерина клетки инкубировали с метил-бета-циклодекстрином (МбЦД), олигосахаридом, избирательно связывающим стеролы. После инкубации с МбЦД (2.5 или 5 мМ) наблюдали активацию натриевых каналов при действии цитохалазина Б или Д, как в целых клетках, так и в мембранных фрагментах (рис. 9, Сударикова, Чубинский-Надеждин, Негуляев, Морачевская, 2009). Как видно из сопоставления характеристик, биофизические свойства натриевых каналов в клетках с пониженным содержанием холестерина были близки к таковым в контроле, проводимость составляла 12 пСм (табл.1).

Таблица 1. Характеристики натриевых каналов в клетках К562 в норме и после инкубации с метил-бета-циклодекстрином (МбЦД, 2.5 и 5 мМ, 60 мин)

Режим регистрации Конт роль МбЦД

Проводимость, пСм Частота встречаемости, % Проводимость, пСм Частота встречаемости, %

Cell-attached 12.1±0.7 14 (п=142) 12.1 ±0.6 13 (п=133)

Inside-out 10.8±0.8 15 (п=97) 11.1 ±0.7 16 (п=101)

Inside-out, цитохалазин 11.9±0.7 18 (п=39) 11.6±0.1 13 (п=53)

В опытах cell-attached обнаружено, что после инкубации клеток с МбЦД (5мМ, 1ч) развитие активности каналов в ответ на подачу цитохалазина (20 мг/мл) было несколько замедлено по сравнению с типичной кинетикой для нормальных клеток; при этом регистрировали открывания каналов меньшей проводимости. В опытах с глобулярным актином показано, что сборка филаментов на цитоплазматической стороне мембраны приводит к инактивации натриевых каналов в модифицированных клетках (рис. 9).

Контроль ^ ЦЦ ^ актин

»WW^IN

1 пА 300 мс

0,4

0,2

0,0

Контр. ЦД актин

Рис. 9. Активация и инактивация натриевых каналов в клетках с пониженным содержанием холестерина. Регистрация токов (inside-out) до (контроль) и после подачи цитохалазина (ЦД, 20 мкг/мл), затем после подачи G-актина (300 мкг/мл, в присутствии 1 мМ магния в растворе). Мембранный потенциал -30 мВ. Справа показаны значения вероятности открытого состояния (Р0).

Суммируя результаты, полученные на целых клетках и мембранных фрагментах, можно заключить, что в клетках с пониженным содержанием холестерина сохраняется основной механизм регуляции натриевых каналов, сопряженный с разборкой и сборкой примембранного актинового цитоскелета. Судя по имеющимся данным, натриевые каналы в клетках К562 не ассоциированы с богатыми холестерином мембранными микродоменами. Изменения кинетики активации, по-видимому, связаны именно с реорганизацией цитоскелета, вызванной деструкцией рафтов. Это подтверждает визуализация F-актина с помощью флуоресцентного окрашивания в клетках К562 и в других типах клеток после частичной экстракции холестерина.

Идентификация механочувствительных катионных каналов плазматической мембраны.

Механозависимая активация ионных токов. Согласно распространенной в литературе точке зрения, разрушение актиновой сети должно индуцировать активность механочувствительных каналов плазматической мембраны; цитохалазины даже рассматривались как потенциальные активаторы данных каналов [45]. Однако, как было показано в наших экспериментах, натриевые каналы, активирующиеся при разборке цитоскелета, не обладают чувствительностью к механической стимуляции — локальному растяжению (stretch) клеточной мембраны (Maximov, Vedernikova et al., 1996).

Рис. 10. Активация механочувствительных каналов плазматической мембраны. А. Регистрация тока в режиме cell-attached. Потенциал на мембране -30 мВ, фильтр 200 Гц. Стрелками показаны подача и снятие стимула — давления в пипетке (20-30 мм рт. ст., АР<0). Б. Амплитудная гистограмма; расстояние между пиками соответствует амплитуде одиночного открывания канала В. Вольт-амперная характеристика.

Как показали дальнейшие исследования, в культивируемых клетках крови (К562, U937, Jurkat) присутствуют механочувствительные катионные каналы, характерные для клеток эукариот. Для регистрации механозависимых ионных токов и идентификации каналов мы использовали метод патч-кпамп в режиме cell-attached и inside-out. В ответ на подачу стимула (ДР<0, suction) наблюдали быструю активацию ионных токов, отражающую резкое увеличение вероятности открытого состояния каналов, реагирующих на деформацию (или растяжение) мембраны, - механочувствительных каналов (рис. 10, Staruschenko, Negulyaev, Vedernikova, 2000). Во многих случаях наблюдали несколько кратных уровней тока, очевидно, отражающих одновременные открывания нескольких каналов в участке мембраны. Эффект развивался без видимой задержки и, как правило, был полностью

обратим. Вероятность открытого состояния возрастала с увеличением натяжения мембраны, в то время как амплитуда одиночных открываний и, соответственно, проводимость канала не изменялись. Таким образом, по своим воротным характеристикам обнаруженные каналы могут быть отнесены к типичным стретч-активируемым (stretch-activated).

Проводимость и селективность механочувствительных каналов. Механозависимую активацию каналов в клетках К562 наблюдали в 55 % опытов (п=441). Проводимость одиночного канала рассчитывали по значениям токов в области отрицательных потенциалов, где вольт-амперная характеристика могла быть аппроксимирована линейной зависимостью. В ионных условиях, близких к физиологическим, токи в области положительных потенциалов имели выходящее направление, потенциал реверсии был близок к 0 мВ (Старущенко, Мамин, Негуляев, Ведерникова. 2000). Анализ данных выявил присутствие нескольких популяций стретч-акгивируемых каналов, различающихся по уровню проводимости. Характерные значения проводимости - 17.2±0.3 пСм (п=37) и 24.5±0.5 пСм (п=34). Селективные свойства механочувствительных каналов определены в сериях экспериментов на изолированном мембранном фрагменте (inside-out). Установлено, что замена анионов (СГ, аспартат, глутамат или S042") не влияет на амплитуду токов, что указывает на их катионную природу. Сдвиг вольт-амперных характеристик в сторону положительных потенциалов на 20 мВ при замене 50 % электролита в растворе на сахарозу доказывает катионную селективность механочувствительных каналов. (Ведерникова и др., 2001). Измерения токов в широком диапазоне потенциала при варьировании катионного состава растворов показали, что большие органические катионы, в частности TRIS+ и NMDG+, не проникают через исследуемые каналы. Полученные результаты подтверждают, что механочувствительные каналы клеток К562 проницаемы для моновалентных неорганических катионов, но не для анионов, и не дискриминируют Na+ и К+. Эти данные использованы в дальнейших исследованиях проницаемости каналов для двухвалентных катионов (Staruschenko, Vedernikova, 2002).

Действие потенциальных блокаторов и активаторов каналов. Показано ингибирование механочувствительных каналов при действии трехвалентного катиона гадолиния (Gd3+) в микромолярных концентрациях (Старущенко, Негуляев, Ведерникова, 2002). Обнаружено также ингибирование исследуемых каналов при действии амилорида (1 мМ). Таким образом, по фармакологическим свойствам механочувствительные каналы в клетках К562 близки к стретч-активируемым катионным (SAC) каналам, обнаруженным в ооцитах лягушки [46], волосковых клетках мыши [47] и морской свинки [48]. Как следует из собственных и литературных данных, блокирование гадолинием отмечено для механочувствительных каналов, имеющих различные проводящие свойства, что предполагает разную структуру и

потенциальный профиль поры. Опираясь на имеющиеся данные о взаимодействии Gd3+ с модельными липидными мембранами [49], можно полагать, что для функций механочувствительных каналов существенно липидное окружение, в частности, фосфатидилсерин, присутствие которого во внешнем монослое липидов считается характерной особенностью апоптозных клеток.

Кальциевая проницаемость и блокирование механочувствительных каналов.

До нашей работы в литературе имелись разрозненные сведения о влиянии двухвалентных катионов на механочувствительные катионные каналы в клетках эукариот; в частности, сообщалось об ингибирующем действии кальция в концентрационном диапазоне 0-2 мМ на стретч-активируемые токи [50,51]. В наших экспериментах на клетках К562 показано, что ионы Са2+ и Мд2+ в физиологических концентрациях (1-2 мМ) не препятствуют активации механочувствительных каналов. Специальное внимание было уделено изучению возможной проницаемости исследуемых каналов для двухвалентных катионов. Механозависимые токи регистрировали при различных концентрациях кальция с наружной стороны мембраны (cell-attached вариант) и замене остальных катионов на непроникающие (TRIS+, NMDG+).

..........................^W^^r^Fr ''1 ''' l1 Г"»« 1

+30 MB <100MB

1,0 ЦпА)

0,5

V/mB)

-«у 0 50

-0,5 -10'

1 +30 MB -100 MB

|1 rA

500 мс

•0,5 -1.0

l(nA)

VJMB)

Рис. 11. Записи токов (cell-attached) через механочувствительные каналы и соответствующие вольт-амперные характеристики при различных концентрациях кальция в растворе с внешней стороны мембраны: (А) 2 мМ, (Б) 20 мМ СаСЬ; для поддержания осмотичности и рН растворов использовали NMDGCI и Hepes-Tris.

Удалось измерить токи входящего направления, переносимые ионами Са2+, и определить проводимость одиночного канала (8 пСм) при физиологической концентрации кальция (2 мМ) (рис. 11, ^агивсЬепко, \/ес1епгйкоуа, 2002). При повышении концентрации наружного кальция наблюдалось частичное (при 10 мМ СаС12) или полное (при 20 мМ СаС12) блокирование входящих токов при сохранении токов выходящего направления (рис. 11 Б), переносимых внутриклеточными моновалентными катионами. Полное подавление механочувствительных каналов наблюдалось в присутствии 90 мМ СаС12.

Таким образом, с помощью прямых измерений ионных токов впервые показано, что механочувствительные каналы могут проводить ионы Са2* при физиологической внеклеточной концентрации (1-2 мМ). Повышение уровня внеклеточного Са2+ приводит к ингибированию токов по типу выходящего выпрямления, что может быть обусловлено сильным связыванием ионов Са2+ у наружного устья поры.

Проницаемость механочувствительных каналов для ионов магния.

С помощью аналогичных подходов исследовали влияние внеклеточных ионов магния (Мд2+) на активность механочувствительных каналов, в частности, как потенциального блокатора и (или) проникающего катиона. В литературе приводятся многочисленные данные об ингибирующем действии ионов Мд2+ на различные типы ионных каналов, в том числе и механочувствительных [52,53]. В то же время сведения о проницаемости каналов для магния крайне ограничены. В наших опытах механозависимые токи, переносимые ионами Мд2+, были зарегистрированы в 53 % (п=80) стабильных патчей при различных концентрациях магния в растворе с наружной стороны мембраны (рис. 12, 31агизсЬепко, Зис1апкоуа, ЫедШуаву, МогасЬеУвкауа, 2006). Во всем диапазоне исследуемых потенциалов наблюдали токи как входящего, так и выходящего направления. Входящие токи были обусловлены переносом ионов Мд2+, а выходящие - переносом моновалентных внутриклеточных катионов, скорее всего калия. В присутствии МдС12 в концентрациях 1-2 мМ проводимость для входящих токов составила около 5 пСм. При увеличении концентрации магния в растворе с наружной стороны мембраны до 20 или 90 мМ мы наблюдали лишь незначительное повышение проводимости: при 90 мМ МдС12 проводимость составляла 5.8±0.3 пСм. Таким образом, для токов, переносимых ионами Мд2+, имеет место выраженный эффект насыщения, по-видимому, обусловленный связыванием этих ионов с анионным локусом, характеризующимся константой диссоциации для Мд2+ около 1 мМ. Насыщение токов, вероятно, связано с известной, относительно медленной, реакцией гидратации-дегидратации ионов магния.

- s о v н

"•Y*r"Y""*" -ЪМт-. 8 о м В

-7 " м 1)

-70м В

.......................-60мВ К . 1 ОмВ

ЗОмВ

40мВ

ЗОмВ

20 м В

|l м А

0,5 с

VI»В)

Рис.12. Записи токов (cell-attached) через механочувствительные каналы при разных уровнях поддерживаемого потенциала. Раствор с наружной стороны мембраны содержал (А) 90 мМ MgCI2. (Б) 2 мМ MgCI2, 137 мМ NMDGCI. Ниже -вольт-амперные характеристики.

Из вольт-амперных характеристик были определены значения потенциала реверсии при различном содержании магния во внеклеточном растворе: -5.2±1.1 мВ (90 мМ MgCI2), -16.0±1.9 (20 мМ MgCI2), -27.4±2.6 (2 мМ MgCI2) и -33±1 мВ (1 мМ MgCI2). Отношение проницаемости Рмд/Рк> оцененное для 2 мМ MgCI2, равнялось 18, что подразумевает довольно высокую селективность канала для магния. Однако применимость электродиффузионной теории, основанной на принципе независимости, в данном случае весьма ограничена. Наиболее важный итог этих экспериментов — это прямые измерения магниевых токов через одиночные каналы. Природу токов подтверждает и наблюдаемое смещение потенциала реверсии при повышении концентрации магния. Проведенные исследования позволяют утверждать, что механочувствительные каналы проницаемы для ионов магния, причем как при физиологических, так и при более высоких концентрациях MgCI2 во внеклеточном растворе.

Влияние модификаторов цитоскелета на характеристики механочувствительных каналов.

Согласно современным представлениям, одной из важнейших клеточных систем, структурно и функционально связанных с механочувствительными каналами в клетках эукариот, может быть кортикальный цитоскелет [16,32,45]. Для изучения взаимосвязей

каналов с системой микрофиламентов и микротрубочек мы использовали в качестве основного объекта культивируемые клетки К562 — оптимальную экспериментальную модель, адекватность которой была обоснована в ходе предшествующих исследований. Были проведены серии экспериментов с использованием избирательных модификаторов, при различных вариантах обработки клеток. Специальное внимание было уделено проверке предположений об активирующем действии деструкторов F-актина на стретч-активируемыые каналы.

В экспериментах на нативной клетке (конфигурация cell-attached) и на изолированном фрагменте мембраны (inside-out) показано, что добавление в камеру цитохалазина Д или Б (20 мкг/мл) не вызывало повышения первоначального уровня активности каналов. Кинетические свойства каналов не претерпевали существенных изменений, в то же время снижалась амплитуда одиночных открываний (Staruschenko, Negulyaev, Morachevskaya, 2002). Обнаружено, что разборка актинового цитоскелета при действии цитохалазина Д или латрункулина Б приводит к существенному снижению проводимости механочувствительных каналов. Как показывают записи токов и вольт-амперные характеристики, эффект носил градуальный характер.

-0,84 пА

-0,66 пА

-0,35 пА It пА

0.5- НпА) •" V(MB)

-60 -40 -20 . -0,5' ■ т' м -1.0. 0.5- 0 20 40 60 18 пСм 1(п А) т.Я' , V (м В )

60 -40 -20 -я ' -0.5-1,0' 0,5 ) 20 40 60 14 пСм ЦпА) V(MB)

-60 -40 ¿0 • ' . ' -0,5 -1.0 ) 20 40 60 8 пСм

Рис. 13. Снижение проводимости механочувствительных каналов при разборке микрофиламентов.

Записи токов (cell-attached, -40 мВ) в контроле (А), через 7 мин (Б) и через 13 мин (В) добавления цитохалазина Б (20 мкг/мл) во внеклеточный раствор. Справа приведены соответствующие вольт-амперные характеристики.

В типичном эксперименте через 7 мин после добавления во внеклеточный раствор цитохалазина наблюдали изменение проводимости с 18 до 14 пСм (рис. 13, Staruschenko, Negulyaev, Morachevskaya, 2005); спустя еще 6 мин уровень проводимости одиночного канала уменьшился более чем в два раза по сравнению с исходным и составил 8 пСм. В среднем, после действия цитохалазина «окончательный» уровень проводимости в этих опытах составил 8.9±0.5 пСм (п=9). При этом не было обнаружено какого-либо активирующего действия деструкторов F-актина на механочувствительные каналы. Некоторое повышение уровня активности каналов, оцененного как Р0, выявлено после предварительной инкубации клеток с латрункулином Б (10 мкМ, 30 мин).

После действия колхицина (500 мкМ) или нокодазола (20 мкг/мл), агентов, вызывающих деполимеризацию микротрубочек, наблюдали типичную механозависимую активацию каналов, характеристики которых не отличались от контроля (Staruschenko, Negulyaev, Morachevskaya, 2005). Суммируя полученные данные, можно заключить, что функциональные свойства механочувствительных каналов в клетках К562 зависят от состояния микрофиламентов и, по-видимому, не зависят от перестроек в системе микротрубочек. Результаты свидетельствуют, что целостность актиновой сети - это непременное условие функционирования стретч-активируемых каналов клеточной мембраны. Однако связь механочувствительных стретч-активируемых каналов с микрофиламентами имеет сложный характер, затрагивая, в том числе, и ионофорные свойства поры.

Участие мембранного холестерина в регуляции механочувствительных каналов и актинового цитоскелета.

Присутствие стеринов является характерной особенностью мембран клеток эукариот. Холестерин - один из основных липидных компонентов плазматической мембраны клеток млекопитающих. Известно, что холестерин влияет на физические свойства и динамику мембран. В модельных системах он регулирует текучесть и повышает жесткость (stiffness) липидного бислоя [54]. Значительно менее понятны изменения мембранных функций в зависимости от уровня холестерина в нативных клетках [55]. Предполагается, что в клеточных мембранах, так же как и в модельных, присутствуют липидные микродомены (рафты) — участки, характеризующиеся более плотной упаковкой и повышенным содержанием холестерина и сфинголипидов [19,21]. Одним из основных подходов для выявления роли рафтов в функциях мембранных белков являются эксперименты в условиях частичной экстракции холестерина.

В опытах cell-attached наблюдали активацию механочувствительных каналов в клетках К562 после инкубации с метил-бета-циклодекстрином (МбЦД, рис. 14) и альфа-циклодекстрином. В клетках с пониженным уровнем холестерина (обработка МбЦД)

обнаружено повышение порога активации и снижение вероятности открытого состояния (Р0) механочувствительных каналов; проводимость одиночного канала оставалась без изменений. Таким образом, частичная экстракция (depletion) холестерина приводит к подавлению механозависимой активации каналов (рис. 15, Morachevskaya et al., 2007). Наблюдаемые эффекты не могут быть объяснены изменением механических свойств липидного бислоя клеточной мембраны. Возможно, влияние экстракции холестерина связано с нарушением целостности рафтов и обусловлено участием внутриклеточных структур, в первую очередь, актинового цитоскелета.

А контроль МбЦД

| | -40 мВ | |

^^^ffif^^jWfflkr^ г .............ipipf"1

Рис. 14. Активация механочувствительных катионных каналов в клетках К562 в норме и после инкубации с метил-бета-циклодекстрином (МбЦД, 2.5 мМ, 60 мин). А. Записи токов при потенциале -40 мВ. Стрелками показаны подача и снятие механического стимула (suction): 25 мм рт. ст. в контроле и 70 мм рт. ст. после экстракции холестерина. Б. Усредненные вольт-амперные характеристики.

С использованием флуоресцентной микроскопии оценено состояние и перестройки цитоскелета в культивируемых клетках К562 при частичной экстракции холестерина, т.е. в условиях деструкции рафтов. В контрольных препаратах при окрашивании родамин-фаллоидином наблюдали типичный для суспензионных клеток кортикальный актиновый слой в виде четкого кольца под мембраной. После обработки клеток МбЦД обнаружены явные изменения актиновых элементов цитоскелета, вероятно, отражающие развитие фибриллярной сети (Sudarikova, Negulyaev, Morachevskaya, 2006).

Итак, полученные данные позволяют предполагать, что ингибирование каналов в условиях экстракции холестерина опосредовано реорганизацией кортикального цитоскелета, вызванной деструкцией мембранных микродоменов (Morachevskaya et al., 2007).

А контроль

МбЦЦ

^^ - I ^ сг» «»О

П.-........ -Л.мв

пи мВ а^мм^аХмиУс'ммкмм!

30 мВ ................................................

600 мс Ь °-20 Р

0.10 0.05 0.00

0.15

контроль МбЦД

Рис. 15. Частичная экстракция холестерина приводит к подавлению активности механочувствительных каналов.

А. Записи токов при различных значениях мембранного потенциала. Уровень «отрицательного» давления составлял около 30 мм рт. ст. в контроле и 60 мм рт. ст. после инкубации клеток с метил-бета-циклодекстрином (МбЦЦ). Б. Значения вероятности открытого состояния (Р0) для потенциала -40мВ.

Для проверки этой гипотезы в патч-кламп опытах проведено сопоставление характеристик механочувствительных (стретч-активируемых) каналов в контроле, при снижении уровня холестерина и при одновременной или последующей разборке Р-актина (рис. 16). Действительно, после обработки клеток МбЦД и цитохалазином Д (или латрункулином Б) минимальный уровень давления, необходимый для активации каналов, возвращался к уровню 25-35 мм рт. ст. Это близко к контролю и существенно ниже порогового значения при пониженном уровне холестерина до обработки деструкторами цитоскелета (50-60 мм рт. ст.). Вероятность открытого состояния (Р0) в контроле и после обработки МбЦД составляла 0.35 и 0.095, соответственно. Действие цитохалазина Д (10 мкг/мл) или латрункулина Б (10 мкМ) приводило к обратному повышению активности механочувствительных каналов: значения Р0 варьировали в диапазоне 0.3-0.4, что практически соответствует или даже превышает уровень активности в норме (Ефремова, Чубинский-Надеждин, Негуляев, Хайтлина, Морачевская, 2009). Таким образом, разборка Р-актина полностью устраняет эффект подавления активации механочувствительных катионных каналов,

наблюдаемый при частичной экстракции мембранного холестерина. Проводимость одиночного канала составляла около 17 пСм, потенциал реверсии близок к нулю, что типично для исследуемых каналов в физиологических ионных условиях.

Полученные данные дают возможность объяснить казавшиеся ранее противоречивыми сведения [16,45] о влиянии модификаторов цитоскелета на стретч-активируемые каналы в клетках различных типов. Как видно, в зависимости от степени развития актиновой сети ее разборка может влиять на уровень активности данных каналов в большей или меньшей степени.

Результаты наших электрофизиологических экспериментов и визуализация Р-актина с помощью родамин-фаллоидина в клетках К562 указывают на то, что нарушение целостности рафтов при снижении уровня холестерина приводит к формированию филаментов на базе имеющегося в суспензионных клетках пула глобулярного актина. Мы полагаем, что реорганизация примембранных микрофиламентов вследствие деструкции рафтов зависит, в первую очередь, от соотношения глобулярного (С) и фибриллярного (Я) актина в клетке. Для проверки этой гипотезы в качестве экспериментальной модели выбраны линии клеток млекопитающих с развитой в различной степени системой микрофиламентов: эмбриональные фибробласты мыши линий ЗТЗ Ва1Ь и ЗТЗ Ва1Ь Б\/40. Результаты микроскопирования показали, что инкубация нормальных фибробластов ЗТЗ с МбЦД (5 мМ) приводит к разборке Р-актина (рис. 17). Напротив, в трансформированных фибробластах ЗТЗ Э\/40 после экстракции холестерина наблюдали развитие актиновой сети и образование стресс-фибрилл, аналогично процессам, происходящим в клетках линии К-562 (рис. 18). Эти данные подтверждают предположения о механизмах реорганизации Р-актина, сопряженной с модификацией структуры микродоменов. Перестройки цитоскелета, вызванные экстракцией мембранного холестерина, по-видимому, включают декэпирование микрофиламентов и зависят, в первую очередь, от баланса в- и Р-актина в клетке.

Контроль

Рис.16. Активация механочувствительных каналов в контроле, при частичной экстракции холестерина (МбЦД) и при разборке Р-актина цитохалазином Д (МбЦД+Цит.Д) или латрункулином Б (МбЦД+Лат.Б). Мембранный потенциал-50 мВ. Стрелкой показана подача стимула.

Рис. 17. Реорганизация актинового цитоскелета эмбриональных фибробластов мыши линии ЗТЗ Ва1Ь. А - контроль. Б - обработка МбЦД (5 тМ, 60 мин).

Рис. 18. Реорганизация актинового цитоскелета эмбриональных фибробластов мыши линии ЗТЗ Ва1Ь Б\/40. А - контроль. Б - обработка МбЦД (5 тМ, 60 мин).

Это соотношение определяет направление обратимой реакции полимеризации-деполимеризации на свободных концах актиновых нитей. Таким образом, нарушение целостности рафтов может приводить как к разборке, так и к сборке микрофиламентов, в зависимости от состояния актинового цитоскелета в данном типе клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В наших исследованиях определены функциональные свойства и основные пути регуляции потенциал-независимых катионных каналов — натриевых и механочувствительных, характерных для клеток эукариот. Обнаруженные феномены и закономерности способствуют выявлению универсальных механизмов активации и инактивации ионных каналов в электроневозбудимых клетках. В значительной степени это связано с тем, что в центре внимания — структурные компоненты, обязательные для эукариотической клетки: актин, один из основных белков цитоскелета. и холестерин, один из основных мембранных липидов. Совокупность полученных данных свидетельствует о значении для функционирования каналов липидного окружения и примембранного цитскелета, в их взаимосвязи и при доминирующей роли последнего. Именно перестройки микрофиламентов, по-видимому, представляют «точку» конвергенции различных сигнальных путей, модулирующих активность каналов в клеточной мембране. Влияние холестерина и мембранных микродоменов на активацию каналов в нативных клетках может быть опосредовано реорганизацией актиновой сети.

управляемые (voltage-gated) каналы возбудимых мембран. Эти названия, отражающие селективность каналов, остаются общепринятыми до сих пор, будучи дополненными номенклатурой на основе установленной аминокислотной последовательности и гомологии генов. Потенциал-управляемые натриевые каналы (Nav1.1-1.9) менее вариабельны по сравнению с калиевыми или кальциевыми каналами [1]. В наших исследованиях выявлена важная роль карбоксильных групп как компонентов подвижного воротного заряда - главного функционального элемента активационной системы натриевых каналов нервной клетки.

Как следует из наших данных и работ других авторов, в различных электроневозбудимых клетках экспрессируются катионные каналы, характеризующиеся натриевой селективностью и отсутствием потенциал-управляемой активации и инактивации. В отличие от известных потенциал-зависимых (voltage-gated) каналов нервных и мышечных клеток они были названы потенциал-независимыми (non-voltage-gated) натриевыми каналами. Более точен англоязычный термин, поскольку уровень мембранного потенциала может оказывать некоторое модулирующее влияние на их активность. По биофизическим характеристикам исследуемые натриевые каналы близки к эпителиальным каналам (ENaC), за исключением чувствительности к амилориду и его производным. Анализ собственных и литературных данных позволяет полагать, что потенциал-независимые натриевые каналы, идентифицированные в клетках различной специализации, относятся к одному семейству катионных каналов DEG/ENaC, включающему также белки-дегенерины [15]. Фармакологическая чувствительность, в частности, блокирование амилоридом, по-видимому, не может рассматриваться как необходимый и достаточный аргумент, доказывающий принадлежность каналов к этому семейству. Полное описание функциональных свойств исследуемых каналов позволяет ставить вопрос об их молекулярной идентификации с применением методов избирательной инактивации генов.

Благодаря применению метода локальной фиксации потенциала (patch clamp) в сочетании с биохимическими подходами в наших исследованиях выяснены детальные механизмы взаимосвязи ионных каналов и цитоскелета. Обобщая полученные результаты, можно заключить, что актиновые структуры, ассоциированные с мембраной, играют центральную роль в регуляции катионных каналов в электроневозбудимых клетках. Активность потенциал-независимых натриевых каналов непосредственно контролируется процессами сборки-разборки примембранного цитоскелета. Роль динамики актина в активации и инактивации каналов демонстрируют и результаты опытов с использованием копирующего белка. Актиновые структуры, вероятно, могут рассматриваться как часть потенциал-независимого воротного (gating) механизма. Следуя традициям мембранологии, исследуемые

натриевые каналы можно также назвать актин-регулируемыми или актин-управляемыми (actin-regulated или actin-gated channels).

На сегодняшний день остаются неясными вопросы, касающиеся участия микрофиламентов в функционировании эпителиальных натриевых каналов почки (ENaC), несмотря на известную молекулярную структуру и усилия исследователей. Прогрессу в этом направлении могло бы способствовать применение корректных экспериментальных подходов с использованием белков цитоскелета. Весьма вероятно, что реорганизация актина играет существенную роль в регуляции ENaC малыми G-белками, в частности Rho-белками [56]. При анализе действия фосфоинозитидов на активность ENaC также резонно было бы учитывать возможное участие актина и актин-связывающих белков [32].

Достаточно давно дискутируются проблемы предполагаемой механочувствительности каналов семейства DEG/ENaC. Показана механозависимая активация эпителиальных каналов почки при стимуляции клеточной поверхности протоком жидкости [57], что может вносить вклад в обеспечение ионного гомеостаза на уровне организма. В этой связи в современной физиологии рассматриваются возможные механизмы «негормональной» регуляции каналов и вероятное участие цитоскелета в этих процессах.

Итоги нашей работы согласуются с представлениями о латеральной гетерогенности липидного бислоя [19,21,24]. На основании полученных нами данных можно судить о структурной и функциональной взаимосвязи ионных каналов, кортикальных микрофиламентов и липидных микродоменов в клеточной мембране. Натриевые каналы, активность которых сопряжена с динамикой актина, по-видимому, не ассоциированы с богатыми холестерином мембранными микродоменами (рафтами). Однако, как показывают наши результаты, возможное участие холестерина и рафтов в работе каналов и других сигнальных молекул может определяться не только их непосредственной ассоциацией с рафтами. Так, реорганизация актинового цитоскелета, инициированная нарушением целостности рафтов, может представлять промежуточное звено в регуляции функций ионных каналов и других мембранных белков. Данные, полученные на различных типах клеток, позволяют полагать, что перестройки микрофиламентов включают стадию декэпирования и поэтому зависят от соотношения глобулярного и фибриллярного актина. Специального внимания заслуживает тот факт, что снижение содержания холестерина в нативных клетках может существенным образом модулировать процессы клеточной регуляции, связанные с ионными каналами и динамикой цитоскелета.

ВЫВОДЫ

1. Активация и инактивация потенциал-зависимых натриевых (№„) каналов нервной клетки управляется электрочувствитепьным воротным механизмом, в структуру которого входят отрицательно заряженные карбоксильные группы. В электроневозбудимых клетках активация и инактивация потенциал-независимых натриевых каналов контролируется процессами разборки-сборки примембранных микрофиламентов с участием актин-связывающих белков. Актиновые элементы цитоскелета, по-видимому, представляют важнейшую часть потенциал-независимого воротного механизма, управляющего открыванием и закрыванием каналов.

2. Активность потенциал-независимых натриевых каналов модулируется копирующими белками цитоскелета. Экзогенный кэпирующий белок Сарг повышает вероятность открытого состояния каналов за счет ограничения роста актиновой нити. Эти результаты, а также данные о влиянии различных видов актина на ионные токи доказывают, что именно сборка микрофиламентов на цитоппазматической стороне мембраны приводит к инактивации каналов.

3. В регуляции потенциал-независимых натриевых каналов принимают участие малые ГТФ-азы. При этом ключевым звеном в цепи передачи сигнала «в-белок-канал» являются перестройки цитоскелета, вероятно, включающие декапирование микрофиламентов. Сопоставление эффектов негидролизуемого аналога ГТФ (СТРуЭ), фаллоидина и различных видов актина подтверждает, что влияние малых С-белков на активность натриевых каналов в клетке опосредовано реорганизацией примембранных микрофиламентов.

4. В клетках с пониженным содержанием холестерина натриевые каналы также активируются в ответ на разборку Р-актина. Добавление глобулярного (6) актина к цитоппазматической стороне мембраны приводит к быстрой инактивации каналов. Как в норме, так и после частичной экстракции холестерина ингибирующее действие С-актина на натриевые токи коррелировало с эффективностью сборки филаментов. Таким образом, связь натриевых каналов с динамикой актина сохраняется в условиях деструкции богатых холестерином мембранных микродоменов (рафтов).

5. Активация натриевых каналов в нативных клетках может быть индуцирована входом ионов кальция (Са2+) в цитозоль из внеклеточной среды. В то же время уровень свободного ионизированного Са2+ не влияет непосредственно на свойства данных каналов. Действие Са2+ на активность каналов в клетке, по-видимому, обусловлено фрагментацией микрофиламентов при участии гельзолина, кальций-зависимого актин-связывающего белка.

6. Натриевые каналы, активирующиеся при разборке микрофиламентов, не проявляют прямой механочувствительности. Локальное растяжение (stretch) мембраны вызывает активацию механочувствительных катионных каналов, типичных для клеток эукариот. Показана проницаемость механочувствительных каналов для внеклеточных двухвалентных катионов - кальция и магния - в физиологическом диапазоне концентраций (1-2 мМ).

7. Характеристики механочувствительных (стретч-активируемых) каналов зависят от состояния актиновой сети. Связь механочувствительных каналов с кортикальным цитоскелетом имеет сложный характер, затрагивая как ионофорные свойства, так и воротный механизм. Разборка примембранных микрофиламентов приводит к существенному снижению проводимости механочувствительных каналов и в некоторых случаях может повышать уровень их активности.

8. Частичная экстракция мембранного холестерина ингибирует механозависимую активацию каналов в клетках эритролейкемии человека К562. В клетках с пониженным содержанием холестерина наблюдается повышение порога активации и снижение вероятности открытого состояния каналов. Измерения механозависимых токов в различных условиях и комплементарные данные флуоресцентной микроскопии свидетельствуют, что подавление активности механочувствительных каналов опосредовано реорганизацией актина, инициированной, вероятно, нарушением целостности рафтов при снижении уровня мембранного холестерина.

9. Таким образом, ключевым звеном в регуляции различных типов катионных каналов в клетках эукариот являются динамические перестройки примембранного актинового цитоскелета, которые выступают в качестве универсального и необходимого посредника в реализации ассоциированных с мембраной процессов внутриклеточной передачи сигнала.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Negulyaev Yu.A., Vedernikova* Е.А. 1985. Effect of pH on fast sodium channels in neurons of the rat dorsal root ganglion. Gen. Physiol. Biophys. 4:359-365.

2. Негуляев Ю.А., Наумов А.П., Ведерникова Е.А. 1986. Влияние реагента Вудварда К на тетродотоксин-чувствительные натриевые каналы нейронов спинальных ганглиев крысы. Нейрофизиология. 18 (6): 839-842.

3. Наумов А.П., Негуляев Ю.А., Ведерникова Е.А. 1987. Влияние водорастворимого карбодиимида на воротный механизм "быстрых" натриевых каналов мембраны сенсорных нейронов крысы. Нейрофизиология. 19 (1): 46-53.

4. Негуляев Ю.А., Ведерникова Е.А. 1989. Блокирование ионами водорода одиночных натриевых каналов клеток нейробластомы. Нейрофизиология. 21 (1): 101-105.

5. Negulyaev Yu.A., Vedernikova Е.А. Savokhina G.A. 1990. Aconitine-induced modification of single sodium channels in neuroblasoma cell membrane. Gen. Physiol. Biophys. 9:167-176.

6. Савохина Г.А., Негуляев Ю.А., Ведерникова Е.А. 1991. Са2+-чувствительные хлорные каналы малой проводимости клеток HeLa. Биол. мембраны. 8 (9): 953-958.

7. Negulyaev Yu.A., Savokhina G.A., Vedernikova E.A. 1993. Calcium-permeable channels in HeLa cells. Gen. Physiol. Biophys. 12:19-25.

8. Negulyaev Yu.A., Vedernikova E.A. 1994. Sodium-selective channels in membranes of rat macrophages. J. Membr. Biol. 138: 37-45.

9. Negulyaev Y.A., Vedernikova E.A., Mozhayeva G.N. 1994. Several types of sodium-conducting channels in human carcinoma A-431 cells. Biochim. Biophys. Acta. 1194:171-175.

10. Ведерникова E.A., Негуляев, Ю.А. 1995. Новый тип натрий-селективных каналов в плазматической мембране невозбудимых клеток. Цитология. 37 (4): 364-365.

11. Негуляев Ю.А., Ведерникова Е.А., Максимов А.В. 1996. Альдостерон повышает уровень активности Na-проводящих каналов в клетках хронической миелоидной лейкемии К562. ДАН РАН. 349 (5): 701-703.

12. Negulyaev Yu.A., Vedernikova Е.А., Kinev A.V. Voronin A.P. 1996a. Exogenous heat shock protein hsp70 activates potassium channels in U937 cells. Biochim. Biophys. Acta. 1282: 156-162.

13. Negulyaev Yu.A., Vedernikova E.A., Maximov A.V. 1996b. Disruption of actin filaments increases the activity of Na-conducting channels in human myeloid leukemia cells. Mol. Biol. Cell. 7:1857-1864

* с 2001г. - Морачевская.

14. Maximov A.V., Vedernikova E.A., Negulyaev Yu.A. 1997a. F-Actin network regulates the activity of Na+-selective channels in human myeloid leukemia cells. The role of plasma gelsolin and intracellular calcium. Biophys. J. 72: 266a.

15. Vedernikova E.A., Maximov A.V., Negulyaev Yu.A. 1997. Two types of Na+ -selective channels in human leukemia cells. XXXIII Int. Congr. Physiol. Sci. St. Petersburg. P002.43.

16. Maximov A. V., Vedernikova E. A. , Hinssen H. , Khaitlina S. Y. Negulyaev Yu. A. 1997b. Ca-dependent regulation of Na+- selective channels via actin cytoskeleton modification in leukemia cells. FEBS Letters. 412: 94-96.

17. Ведерникова E. А., Максимов А. В., Негуляев Ю. A. 1997. Функциональные свойства и цитоскелет-зависимая регуляция натриевых каналов в плазматической мембране лейкозных клеток. Цитология. 39 (12): 1142-1151.

18. Negulyaev Yu.A., Maximov A.V., Vedernikova E.A., Katina I.E. 1997. Voltage-insensitive Na channels of different selectivity in human leukemic cells. Gen. Physiol. Biophys. 16:163-173.

19. Ведерникова E. А., Максимов А. В., Негуляев Ю.А. 1999. Функциональная характеристика и молекулярная топология потенциал-независимых натриевых каналов. /Обзор/ Цитология. 41 (8): 658-666.

20. Negulyaev Y.A., Khaitlina S.Y., Hinssen Н., Shumilina E.V., Vedernikova E.A. 2000. Sodium channel activity in leukemia cells is directly controlled by actin polymerization. J. Biol. Chem. 275: 40933-40937.

21. Старущенко A.B., Мамин А.Г., Негуляев Ю.А., Ведерникова Е.А. 2000. Активация механочувствительных ионных каналов в плазматической мембране клеток К562. Цитология. 42 (7): 669-674.

22. Ведерникова Е.А., Хайтлина С.Ю., Негуляев Ю.А. 2000. Роль актинового цитоскелета в регуляции потенциалнезависимых натриевых каналов. «Цитоскелет и клеточная регуляция». Пущино. 8.

23. Staruschenko A.V., Negulyaev Y.A., Vedernikova E.A. 2000. Stretch-activated ion channels in human leukemia cells. Neurophysiology. 32: 180-181.

24. Ведерникова E.A., Старущенко A.B., Негуляев Ю.А. 2001. Идентификация механо-активируемых каналов клеток лейкемии человека. Цитология. 43 (4): 326-327.

25. Shumilina Е., Khaitlina S., Morachevskaya Е., Negulyaev Y. 2001. Role of actin cytoskeleton dynamics in the regulation of non-voltage-gated sodium channels. Mol. Biol. Cell. 12: 467a.

26. Staruschenko A.V., Vedernikova E.A. 2002. Mechanosensitive cation channels in human leukemia cells: calcium permeation and blocking effect. J. Physiol. 541: 81-90.

27. Staruschenko A.V., Negulyaev Y.A., Morachevskaya E.A. 2002. Actin disassembly affects the conductive properties of mechanosensitive channels in leukemia cells. Biophys. J. 82: 270A.

28. Старущенко A.B., Негуляев Ю.А., Морачевская E.A. 2002. Ингибирующее и стимулирующее действие амилорида на потенциал-независимые катионные каналы в клетках К562. Цитология. 44 (7): 675-680.

29. Shumilina E.V., Negulyaev Y..A., Morachevskaya Е.А., Hinssen H., Khaitlina. S.Y. 2003a. Regulation of sodium channel activity by capping of actin filaments. Mol. Biol. Cell. 14:1709-1716.

30. Shumilina E.V., Khaitlina S.Y., Morachevskaya E.A., Negulyaev Y.A.

2003. Non-hydrolyzable analog of GTP induces activity of Na+ channels via disassembly of cortical actin cytoskeleton. FEBS Lett. 547: 27-31.

31. Morachevskaya E.A., Shumilina E.V., Y.A. Negulyaev, S.Y. Khaitlina.

2004. Rearrangement of submembranous actin filaments mediates G-protein-dependent regulation of Na channels in human leukaemia cells. Biophys. J. 86: 231a.

32. Staruschenko A., Negulyaev Y.A., Morachevskaya E.A. 2005. Actin cytoskeleton disassembly affects conductive properties of stretch-activated cation channels in leukaemia cells. Biochim. Biophys. Acta. 1669:53-60.

33. Sudarikova A.V., Negulyaev Y.A., Morachevskaya E.A. 2006. Cholesterol depletion affects mechanosensitive channel gating coupled with F-actin rearrangement. Proc. Physiol. Soc. 95-96.

34. Staruschenko A.V., Sudarikova A.V., Negulyaev Y.A., Morachevskaya E.A. 2006. Magnesium permeation through mechanosensitive channels: single-current measurements.. Cell Res. 16: 723-730.

35. Morachevskaya E.A., Sudarikova A.V., Negulyaev Y.A. 2007. Mechanosensitive channel activity and F-actin organization in cholesterol-depleted human leukaemia cells. Cell Biol. Int. 31: 374-381.

36. Сударикова A.B., Чубинский-Надеждин В.И., Негуляев Ю.А., Морачевская Е.А. 2009. Функциональные свойства натриевых каналов в клетках К562 после экстракции холестерина. Цитология. 51 (8): 676-683.

37. Ефремова Т.Н., Чубинский-Надеждин В.И., Негуляев Ю.А., Хайтлина С.10., Морачевская Е.А. 2009. Влияние экстракции мембранного холестерина на характеристики механочувствительных каналов и актиновый цитоскелет. Сб. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 42-45.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Hille В. 2001. Ionic channels of excitable membranes. Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA, USA. 814p. 2. Parekh A.B., Penner R. 1997. Physiol. Rev. 77: 901-30. 3. Vig M„ Kinet J.P. 2007. Cell Calcium. 42: 157-62. 4. Clapham D.E. 2003. Nature. 426: 517-24. 5. Nilius B.et al. 2007. Physiol. Rev. 87: 165-217. 6. Armstrong C.M., Bezanilla F. 1973. Nature (Lond). 242: 459-61. 7. Aimers W. 1978. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 82: 96-190. 8. Mozhayeva G. N. et al., 1981. Biochim. Biophys. Acta. 643: 251-5. 9. Hamill O.P. et al. 1981. Pflugers Arch. 391: 85-100.10. Sakmann В., Neher E. 1995. Single-Channel Recording. Plenum Press, New York. 700p. 11. Kunzelmann K. 2005. J. Membr. Biol. 205: 159-73. 12. Prevarskaya N. et al. 2007. Biochim. Biophys. Acta. 1772: 937-46. 13. Benos D.J. et al. 1995. J. Membr. Biol. 143: 1-18. 14. Garty H., Palmer LG. 1997. Physiol Rev. 77: 359-96. 15. Kellenberger S., Schild L. 2002. Physiol. Rev. 82: 735-67. 16. Hamill O.P., Martinac B. 2001. Physiol. Rev. 81: 685-740. 17. Sachs F„ Morris C.E. 1998. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 132: 1-77. 18. Harder Т., Simons K. 1999. Eur. J. Immunol. 29: 556-62. 19. Brown D. A., London E. 2000. J. Biol. Chem. 275: 17221-4. 20. Nebl T. et al. 2002. J. Biol. Chem. 277: 43399-409. 21. Brown D. A. 2006. Am. J. Physiol. 21: 430-9. 22. Levitan I. et al. 2000. J. Gen. Physiol. 115: 405-16. 23. Shlyonsky V. G. et al. 2003. Am. J. Physiol. 284: 182-8. 24. Edidin M. 2003. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32: 257-83. 25. Guharay F., Sachs F. 1984. J. Physiol. 352: 685-701. 26. Remmert K. et al. 2000. Protein Expr. Purif. 18: 11-9. 27. Hinssen et al. 1984. FEBS Lett. 166: 90-5. 28. Spudich J.A., Watt S. 1971. J. Biol. Chem. 246: 4866-71. 29. Zidovetzki R„ Levitan I. 2007. Biochim. Biophys. Acta. 1768: 1311-24. 30. Armstrong C.M. 1981. Physiol. Rev. 61: 644-83. 31. Tenzic, A., Kurachi., Y. 1996. J. Physiol. 492.2: 395-404. 32. Janmey P.A. 1998. Physiol. Rev. 78: 763-81. 33. Horber J.K. et al. 1995. Biophys J. 68: 1687-93. 34. Selden LA. et al. 1983. Biochem. Biophys. Res. Commun. 116: 478-85. 35. Turoverov K.K. et al. 1976. FEBS Lett. 62: 4-6. 36. Khaitlina S.Yu. et al. 1991. FEBS Lett. 279: 49-51. 37. Borisy G.G., Svitkina T.M. 2000. Cur. Opin. Cell Biol. 12: 104-12. 38. Berdiev B.K. et al. 1996. J. Biol. Chem. 271: 17704-10. 39. Erdahi, W.L et al. 1994. Biophys.J. 66: 1678-93. 40. Barritt G.J., Gregory R.B. 1997. Cell Signal. 9: 207-18. 41. Gilman A. G. 1987. Annu. Rev. Biochem. 56: 61549. 42. Codina J. et al. 1987. Science. 236: 442-5. 43. Takai Y. et al. 2001. Physiol. Rev. 81: 153-208. 44. Schafer D.A. et al. 1996. J. Cell Biol. 135: 169-79. 45. O.P. Hamill, Jr.D.W. McBride. 1996. Pharmacol. Rev. 48: 231-52. 46. Lane J.W. et al. 1991. J. Physiol. 441: 347-66. 47. Rusch A. et al. 1994. J. Physiol. 474: 75-86. 48. Yeh Т.Н. et al. 1998. Am. J. Physiol. 274: 566-76. 49. Ermakov Y.A. et al. 2001. Biophys. J. 80: 185162. 50. Taglietti V., Toselli M. 1988. J. Physiol. 407: 311-28. 51. Yang X.C., Sachs F. 1989. Science. 243: 1068-71. 52. Small D.L., Morris C.E. 1995. J. Exp. Biol. 198: 191929. 53. Maingret F. et al. 2002. Bioch. Biophis. Res. Comm. 292: 339-46. 54. Needham D„ Nunn R.S. 1990. Biophys. J. 58: 997-1009. 55. Byfield F.J., et al. 2004. Biophys. J. 87: 3336-43. 56. Pochynyuk O. etal. 2007. Exp. Biol. Med. 232:1258-65. 57. Fronius M., Clauss W.G. 2008. Eur. J. Physiol. 455:775-785.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 02.09.2009. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 2,0. Уч.-изд. л. 2,0. Тираж 100. Заказ 4791Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812)550-40-14 Тел./факс: (812)297-57-76

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Морачевская, Елена Алексеевна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРУКТУРНО- 12 ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН: КОНЦЕПЦИЯ ЛИПИДНЫХ МИКРОДОМЕНОВ

1.1. Латеральная гетерогенность липидного бислоя

1.2. Мембранный холестерин и липидные микродомены (рафты)

1.3. «Детергент-устойчивые мембраны» и концепция липидных рафтов

1.4. Возможности визуализации липидных рафтов

1.5. Роль липидных рафтов в процессах клеточной сигнализации

1.6. Взаимосвязь рафтов и актинового цитоскелета

1.7. Возможное участие холестерина и рафтов в регуляции ионных 31 каналов клеточных мембран

Глава 2. МЕХАНОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ИОННЫЕ КАНАЛЫ.

2.1. Функциональные свойства и принципы классификации

2.2. Воротные характеристики

2.3. Фармакологические свойства

2.4. Транспорт двухвалентных катионов

2.5. Потенциальные активаторы механочувствительных каналов

2.6. Роль цитоскелета в функционировании каналов

2.7. Молекулярная структура и модели активации

Глава 3. НАТРИЙ-СЕЛЕКТИВНЫЕ КАНАЛЫ:

ПОТЕНЦИАЛ-УПРАВЛЯЕМЫЕ И ПОТЕНЦИАЛ-НЕЗАВИСИМЫЕ

3.1. Транспорт натрия и актиновый цитоскелет

3.1.1. Локализация транспортных белков

3.1.2. Модуляция активности ионных каналов

Глава 4. КАТИОННЫЕ КАНАЛЫ СЕМЕЙСТВА ОЕС/ЕМаС И

МЕХАНОТРАНСДУКЦИЯ

4.1. Оценка механочувствительности каналов ЕМаС с помощью различных экспериментальных моделей.

4.2. Активация ЕМаС при стимуляции потоком жидкости

4.3. Возможные механизмы механочувствительности Е№С

4.4. Механосенсорные функции в различных тканях: 87 возможное участие каналов ОЕС/ЕМаС

Глава 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

5.1. Клетки

5.2. Регистрация ионных токов

5.3. Механическая стимуляция

5.4. Обработка данных

5.5. Растворы

5.6. Актин и актин-связывающие белки

5.7. Флуоресцентная микроскопия

5.8. Модификация липидного состава

Глава 6. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

6.1. Потенциал-управляемые натриевые каналы 99 и роль карбоксильных групп в их активации

6.2. Потенциал-независимые натриевые каналы

6.3. Активация и инактивация потенциал-независимых 101 натриевых каналов

6.3.1. Разборка микрофиламентов вызывает активацию каналов

6.3.2. Инактивация каналов при полимеризации актина

6.4. Регуляция активности натриевых каналов при участии 108 кэпирующего белка

6.5. Активация каналов в нативных клетках при повышении 114 уровня внутриклеточного кальция

6.6. ГТФ-зависимая регуляция натриевых каналов

6.6.1. Активация каналов при действии негидролизуемого аналога ГТФ

6.6.2. Влияние G-актина на активность каналов, индуцированную GTPyS

6.6.3. Механизм ГТФ-зависимой модуляции активности каналов

6.7. Функциональные свойства натриевых каналов в клетках 122 с пониженным содержанием холестерина

6.7.1. Характеристики каналов в клетках К562 после 125 частичной экстракции холестерина

6.7.2. Активация и инактивация каналов в модифицированных клетках

6.8. Идентификация механочувствительных катионных каналов 133 плазматической мембраны

6.8.1. Механозависимая активация ионных токов

6.8.2. Проводимость и селективность механочувствительных каналов

6.8.3. Действие ингибиторов

6.9. Кальциевая проницаемость и блокирование 142 механочувствительных каналов

6.10. Проницаемость механочувствительных каналов 144 для ионов магния

6.11. Влияние осмотичности среды на активность ионных каналов

6.12. Влияние модификаторов цитоскелета на характеристики 152 механочувствительных каналов в клетках К

6.12.1. Анализ эффектов деструкторов F-актина

6.12.2. Исследование действия колхицина и нокодазола

6.13. Участие мембранного холестерина в регуляции 162 механочувствительных каналов и актинового цитоскелета

Глава 7. ОБСУЖДЕНИЕ

7.1. Роль актинового цитоскелета в регуляции 175 потенциал-независимых натриевых каналов.

7.1.1. Кэпирование микрофиламентов модулирует активность каналов

7.1.2. Реорганизация цитоскелета опосредует ГТФ-зависимую 183 регуляцию каналов

7.1.3. Функциональная связь каналов с динамикой актина 187 в условиях деструкции рафтов

7.2. Механозависимая регуляция катионных каналов 191 в клетках эукариот

7.2.1. Механочувствительные каналы и двухвалентные катионы

7.2.2. Роль цитоскелета и липидного бислоя в функционировании 199 механочувствительных каналов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы регуляции катионных каналов в эукариотической клетке"

Актуальность темы. Поступление катионов в цитоплазму из внеклеточной среды играет важную роль в поддержании водно-солевого баланса, в запуске и осуществлении процессов передачи сигнала в нативной клетке. В различных клетках, как возбудимых так и невозбудимых, быстрые изменения проницаемости и пассивного транспорта катионов связаны, в первую очередь, с активацией и инактивацией ионных каналов клеточных мембран. В исследованиях возбудимых мембран определена роль ионных каналов в генерации и распространении нервного импульса, рецепции, синаптической передаче (Hille, 2001). Значительно менее понятны ионные механизмы клеточной сигнализации в электроневозбудимых клетках. До недавнего времени усилия исследователей были, в основном, сосредоточены на поиске высокоселективных кальциевых каналов как вероятных участников кальциевого ответа (Parekh, Penner, 1997; Vig, Kinet, 2007). К настоящему моменту круг интересов значительно расширился, и в центре внимания оказались катионные каналы различной селективности. Этому во многом способствовали результаты исследования белков семейства TRP (Clapham, 2003; Nilius, et al., 2007), предположительно формирующих каналы катионного входа в клеточной мембране.

К концу 80-х годов были установлены основные свойства и принципы организации потенциал-управляемых каналов в нервных и мышечных клетках. Надо отметить, что электрофизиологические исследования ионной проницаемости возбудимых мембран с использованием метода фиксации потенциала (voltage clamp) оказали решающее влияние на формирование концептуальных схем и биофизических моделей работы каналов (Hille, 2001; Armstrong, Bezanilla, 1973; Almers, 1978; Mozhayeva et al., 1981). Не будет преувеличением сказать, что развитие новых экспериментальных методов, в первую очередь патч-кламп технологий (Hamill et al., 1981; Sakmann, Neher, 1995) и молекулярного клонирования, фактически привело к смене парадигм, стремительно расширив представления о ионных каналах клеточных мембран. Как оказалось, регулирумый перенос ионов через гидрофильные поры, формируемые интегральными мембранными белками - ионными каналами, является важнейшим свойством живых клеток, как элекгровозбудимых, так и невозбудимых. Показано, что пассивный транспорт катионов вовлечен в важнейшие регуляторные процессы в клетке, включая апоптоз и опухолевую транформацию (Kunzelmann, 2005; Nilius.et al., 2007; Prevarskaya et al., 2007).

Возрастает интерес к выяснению путей поступления натрия в цитозоль из внеклеточной среды. До недавнего времени наши знания о механизмах трансмембранного переноса натрия в электроневозбудимых клетках ограничивались результатами исследований эпителиальных натриевых каналов (ENaC) (Beños et al., 1995; Garty, Palmer, 1997) . Благодаря применению метода патч-кламп натрий-селективные каналы, не имеющие потенциал-зависимых воротных структур, идентифицированы в клетках и тканях различной специализации (Ведерникова* и др., 1999). Сформировались представления о суперсемействе потенциал-независимых катионных каналов DEG/ENaC, характеризующихся общностью функциональных характеристик и молекулярной организации (Kellenberger, Schild, 2002).

Таким образом, в основном, завершен «описательный» период в изучении многообразия катион-транспортирующих каналов в клетках эукариот. На первый план выходят проблемы регуляции каналов, их участия в реакциях живой клетки на изменения микроокружения. В этом отношении особый интерес представляют ионные каналы, связанные с механочувствительностью мембраны и (или) клетки в целом. Такие каналы, названные механочувствительными, были обнаружены не только в специализированных механорецепторных структурах, но также и в самых разных клетках и тканях (Sachs, Morris, 1998). Они были идентифицированы в мембранах бактерий, грибов, растений, позвоночных и беспозвоночных животных. Можно полагать, что механочувствительные каналы принадлежат к наиболее ранним в филогенетическом отношении клеточным сигнальным системам. Детально исследованы бактериальные каналы MscL, представляющие большие поры экстремально высокой проводимости (около 1000 пСм) (Hamill, Martinac, 2001). В клетках эукариот ионные каналы, связанные с клеточной механочувствительностью, имеют значительно более низкую проводимость и, по-видимому, совершенно иную молекулярную природу. В настоящее время это один из наименее изученных классов ионных каналов. Эта область чрезвычайно интенсивно разрабатывается, поскольку представляет интерес с точки зрения как фундаментальных проблем клеточной биологии, так и новых направлений клеточной медицины. Выяснение физиологических путей активации каналов и природы механочувствительности эукариотической клетки предполагает изучение возможного участия липидных компонентов мембраны и структур кортикального цитоскелета. с 2001г. - Морачевская.

В настоящее время одной из актуальных проблем биологии и физиологии клетки становится выяснение роли мембранных липидов в процессах клеточной сигнализации. Согласно современным представлениям о латеральной гетерогенности липидного бислоя, важное значение для связи плазматической мембраны и цитоскелета имеют богатые холестерином липидные микродомены (рафты) (Harder, Simons, 1999; Brown, London, 2000; Nebl et al, 2002; Brown, 2006; Ряд данных свидетельствует, что ассоциация с рафтами может быть решающим фактором, определяющим активность интегральных мембранных белков, в том числе ионных каналов. Сообщается, что нарушения структуры и целостности рафтов, обусловленные снижением уровня мембранного холестерина, препятствуют реализации клеточных функций, включающих перестройки актиновой сети (Edidin, 2003; Brown, 2006). Есть все основания полагать, что анализ функциональных взаимосвязей ионных каналов с липидным окружением и организацией цитоскелета будет способствовать пониманию фундаментальных основ клеточной регуляции и передачи сигнала.

В связи с этим поставлены следующие задачи:

3. Выяснить возможную роль ГТФ-связывающих белков в регуляции потенциал-независимых натриевых каналов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Основные механизмы регуляции потенциал-независимых катионных каналов в плазматической мембране эукариотической клетки связаны с организацией и динамикой примембранного актинового цитоскелета. Существенную роль в модуляции активности каналов играют актин-связывающие копирующие белки и мембранный холестерин.

3. Функциональные характеристики механочувствительных катионных каналов в клетках эукариот зависят, в большей степени от взаимосвязей с микрофиламентами и свойств комплекса мембрана-цитоскелет, чем от физических параметров липидного бислоя.

4. Реорганизация примембранного цитоскелета с участием актин-связывающих белков — необходимое промежуточное звено, опосредующее влияние на активность каналов ряда физиологически значимых вне- и внутриклеточных факторов, таких как двухвалентные катионы, малые G-белки, мембранный холестерин и структура бислоя.

Впервые выявлены особенности поведения каналов в зависимости от содержания холестерина, обязательного липидного компонента эукариотической клетки. Обнаружено подавление активности механочувствительных каналов в культивируемых клетках лейкемии человека при частичной экстракции мембранного холестерина и выяснен механизм эффекта. Предложены гипотезы относительно механизмов реорганизации Р-актина, вызванной нарушением целостности рафтов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции "Мембранный транспорт и функции клетки" (Санкт-Петербург, 1994), симпозиумах "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1995, 1998, 2001, 2006), 40-м (Балтимор, 1996), 46-м (Сан-Франциско, 2002) и 48-м (Балтимор, 2004) Съездах Американского Биофизического общества, Международном физиологическом конгрессе (Санкт-Петербург, 1997), 2-м съезде Биохимического общества (Москва, 1997), Всероссийской конференции «Цитоскелет и клеточная регуляция» (Пущино, 2000), Всероссийском совещании «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000), Международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004); конференции Британского физиологического общества (Лондон, 2006), I и II Съездах Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003, 2007), Международной конференции «Ионные каналы: структура и функции» (Санкт-Петербург, 2009), на семинарах ИНЦ РАН.

Объем и структура диссертации. Диссертация объемом 243 страницы включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и обсуждение, 79 рисунков, 3 таблицы, заключение, выводы и список литературы. Личный вклад автора являлся определяющим на всех этапах работы и заключался в постановке задач исследования, участии в проведении экспериментов и обработке данных, анализе, обобщении и изложении результатов. Работа выполнена в Институте цитологии РАН при финансовой поддержке, полученной автором от Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 99-04-49652а, 02-04-48251 а, 05-04-48209а, 08-04-00574а).

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Морачевская, Елена Алексеевна

выводы

1. Активация и инактивация потенциал-зависимых натриевых (Ыэу) каналов нервной клетки управляется электрочувствительным воротным механизмом, в структуру которого входят отрицательно заряженные карбоксильные группы. В электроневозбудимых клетках активация и инактивация потенциал-независимых натриевых каналов контролируется процессами разборки-сборки примембранных микрофиламентов с участием актин-связывающих белков. Актиновые элементы цитоскелета, по-видимому, представляют важнейшую часть потенциал-независимого воротного механизма, управляющего открыванием и закрыванием каналов.

2. Активность потенциал-независимых натриевых каналов модулируется кэпирующими белками цитоскелета. Экзогенный кэпирующий белок Сар7 повышает вероятность открытого состояния каналов за счет ограничения роста актиновой нити. Эти результаты, а также данные о влиянии различных видов актина на ионные токи доказывают, что именно сборка микрофиламентов на цитоплазматической стороне мембраны приводит к инактивации каналов.

3. В регуляции потенциал-независимых натриевых каналов принимают участие малые ГТФ-азы. При этом ключевым звеном в цепи передачи сигнала «в-белок-канал» являются перестройки цитоскелета, вероятно, включающие декапирование микрофиламентов. Сопоставление эффектов негидролизуемого аналога ГТФ (СТРкв), фаллоидина и различных видов актина подтверждает, что влияние малых в-белков на активность натриевых каналов в клетке опосредовано реорганизацией примембранных микрофиламентов.

4. В клетках с пониженным содержанием холестерина натриевые каналы также активируются в ответ на разборку Р-актина. Добавление глобулярного (в) актина к цитоплазматической стороне мембраны приводит к быстрой инактивации каналов. Как в норме, так и после частичной экстракции холестерина ингибирующее действие в-актина на натриевые токи коррелировало с эффективностью сборки филаментов. Таким образом, связь натриевых каналов с динамикой актина сохраняется в условиях деструкции богатых холестерином мембранных микродоменов (рафтов).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В наших исследованиях определены функциональные свойства и основные пути регуляции потенциал-независимых катионных каналов - натриевых и механочувствительных, характерных для клеток эукариот. Обнаруженные феномены и закономерности способствуют выявлению универсальных механизмов активации и инактивации ионных каналов в электроневозбудимых клетках. В значительной степени это связано с тем, что в центре внимания - структурные компоненты, обязательные для эукариотической клетки: актин, один из основных белков цитоскелета. и холестерин, один из основных мембранных липидов. Совокупность полученных данных свидетельствует о значении для функционирования каналов липидного окружения и примембранного цитскелета, в их взаимосвязи и при доминирующей роли последнего. Именно перестройки микрофиламентов, по-видимому, представляют «точку» конвергенции различных сигнальных путей, модулирующих активность каналов в клеточной мембране. Влияние холестерина и мембранных микродоменов на активацию каналов в нативных клетках может быть опосредовано реорганизацией актиновой сети.

На начальном этапе нашей работы само понятие «ионный канал» связывалось, прежде всего, с электрической возбудимостью, проведением нервного импульса, оставаясь, таким образом, предметом нейрофизиологии. Согласно исторически сложившейся классификации каналов, натриевыми, калиевыми и кальциевыми называют потенциал-управляемые (voltage-gated) каналы возбудимых мембран. Эти названия, отражающие селективность каналов, остаются общепринятыми до сих пор, будучи дополненными номенклатурой на основе установленной аминокислотной последовательности и гомологии генов. Потенциал-управляемые натриевые каналы (Nav1.1-1.9) менее вариабельны по сравнению с калиевыми или кальциевыми каналами. В наших исследованиях выявлена важная роль карбоксильных групп как компонентов подвижного воротного заряда - главного функционального элемента активационной системы натриевых каналов нервной клетки.

Как следует из наших данных и работ других авторов, в различных электроневозбудимых клетках функционируют катионные каналы, характеризующиеся натриевой селективностью и отсутствием потенциал-управляемой активации и инактивации. В отличие от известных потенциал-зависимых (voltage-gated) каналов нервных и мышечных клеток они были названы потенциал-независимыми (non-voltage-gated) натриевыми каналами. Более точен англоязычный термин, поскольку уровень мембранного потенциала может оказывать некоторое модулирующее влияние на их активность. По биофизическим характеристикам исследуемые натриевые каналы близки к эпителиальным каналам (ENaC), за исключением чувствительности к амилориду и его производным. Анализ собственных и литературных данных позволяет полагать, что потенциал-независимые натриевые каналы, идентифицированные в клетках различной специализации, относятся к одному семейству катионных каналов DEG/ENaC, включающему также белки-дегенерины. Фармакологическая чувствительность, в частности, блокирование амилоридом, по-видимому, не может рассматриваться как необходимый и достаточный аргумент, доказывающий принадлежность каналов к этому семейству. Полное описание функциональных свойств исследуемых каналов позволяет ставить вопрос об их молекулярной идентификации с применением методов избирательной инактивации генов.

Благодаря применению метода локальной фиксации потенциала (patch clamp) в сочетании с биохимическими подходами в наших исследованиях выяснены детальные механизмы взаимосвязи ионных каналов и цитоскелета. Обобщая полученные результаты, можно заключить, что актиновые структуры, ассоциированные с мембраной, играют центральную роль в регуляции катионных каналов в электроневозбудимых клетках. Активность потенциал-независимых натриевых каналов непосредственно контролируется процессами сборки-разборки примембранного цитоскелета. Роль динамики актина в активации и инактивации каналов демонстрируют и результаты опытов с использованием кэпирующего белка. Актиновые структуры, вероятно, могут рассматриваться как часть потенциал-независимого воротного (gating) механизма. Следуя традициям мембранологии, исследуемые натриевые каналы можно также назвать актин-регулируемыми или актин-управляемыми (actin-regulated или actin-gated channels).

На сегодняшний день остаются неясными вопросы, касающиеся участия микрофиламентов в функционировании эпителиальных натриевых каналов почки, несмотря на известную молекулярную структуру и усилия исследователей. Прогрессу в этом направлении могло бы способствовать применение корректных экспериментальных подходов с использованием белков цитоскелета. Весьма вероятно, что реорганизация актина играет существенную роль в регуляции ENaC малыми ГТФ-азами, в частности Rho-белками. При анализе действия фосфоинозитидов на активность ENaC также резонно было бы учитывать возможное участие актина и актин-связывающих белков.

Достаточно давно дискутируются проблемы предполагаемой механочувствительности каналов семейства ОЕО/ЕМаС. Показана механозависимая активация эпителиальных каналов почки при стимуляции клеточной поверхности протоком жидкости, что может вносить вклад в обеспечение ионного гомеостаза на уровне организма. В этой связи в современной физиологии рассматриваются возможные механизмы «негормональной» регуляции каналов и вероятное участие цитоскелета в этих процессах.

Итоги нашей работы согласуются с представлениями о латеральной гетерогенности липидного бислоя. На основании полученных нами данных можно судить о структурной и функциональной взаимосвязи ионных каналов, кортикальных микрофиламентов и липидных микродоменов в клеточной мембране. Натриевые каналы, активность которых сопряжена с динамикой актина, по-видимому, не ассоциированы с богатыми холестерином мембранными микродоменами (рафтами). Однако, как показывают наши результаты, возможное участие холестерина и рафтов в работе каналов и других сигнальных молекул может определяться не только их непосредственной ассоциацией с рафтами. Так, реорганизация актинового цитоскелета, инициированная нарушением целостности рафтов, может представлять промежуточное звено в регуляции функций ионных каналов и других мембранных белков. Данные, полученные на различных типах клеток, позволяют полагать, что перестройки микрофиламентов включают стадию декэпирования и поэтому зависят от соотношения глобулярного и фибриллярного актина. Специального внимания заслуживает тот факт, что снижение содержания холестерина в нативных клетках может существенным образом модулировать процессы клеточной регуляции, связанные с ионными каналами и динамикой цитоскелета.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Морачевская, Елена Алексеевна, Санкт-Петербург

1. ВачуговаД. В., Морачевская Е. А. 2009. Механочувствительность катионных каналов семейства ОЕб/ЕЫаС. Цитология. 51 (10): 806-814.

2. Ведерникова* Е. А., Максимов А. В., Негуляев Ю. А. 1997. Функциональные свойства и цитоскелет-зависимая регуляция натриевых каналов в плазматической мембране лейкозных клеток. Цитология. 39 (12): 1142-1151.

3. Ведерникова Е. А., Максимов А. В., Негуляев Ю.А. 1999. Функциональнаяхарактеристика и молекулярная топология потенциал-независимых натриевых каналов. Цитология. 41 (8): 658-666.

4. Ведерникова Е. А., Негуляев, Ю. А. 1995. Новый тип натрий-селективных каналов в плазматической мембране невозбудимых клеток. Цитология. 37 (4): 364-365.

5. Ведерникова Е. А., Старущенко А. В., Негуляев Ю. А. 2001. Идентификация механо-активируемых каналов клеток лейкемии человека. Цитология. 43 (4): 326-327.

6. Ведерникова Е. А., Хайтлина С. Ю., Негуляев Ю. А. 2000. Роль актинового цитоскелета в регуляции потенциалнезависимых натриевых каналов. «Цитоскелет и клеточная регуляция». Пущино. 8.

7. Ивков В. Г., Берестовский Г. Н. 1981. Динамическая структура липидного бислоя. М. Наука: 286с.

8. Ивков В. Г., Берестовский Г. Н. 1982. Липидный бислой биологических мембран. М. Наука: 224с.

9. Казначеева Е. В., Зубов А. Н., Николаев А. В., Алексеенко В. А., Гусев К. О.,

10. Безпрозванный И. Б., Можаева Г. Н. 2002. Фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат модулирует активность каналов рецептор-индуцированного кальциевого входа в клетках А431. Биол. мембраны. 19 (1): 5-13.

11. Карымова Е. А., Катина И. Е., Плахова В. Б., Подзорова С. А., Кулов М. А., Иванов В. К, Крылов Б. В. 2008. Сенсорные системы. 22 (3): 257-270.с 2001 г. Морачевская.

12. Крылов Б. В., Дербенев А. В., Подзорова С. А., Людыно М. И., Кузьмин А. В., Изварина Н. Л. 1999. Морфин уменьшает чувствительность к потенциалу медленных натриевых каналов. Физиол. журнал. 85 (2): 225-236.

13. Мельницкая А. В., Крутецкая 3. И., Лебедев О. Е. 2006. Структурнофункциональная организация транспорта Na+ в эпителиальных системах. I.Эпителиальные натриевые каналы. Цитология. 48 (10): 817-840.

14. Наумов А. П., Негуляев Ю. А., Ведерникова Е. А. 1987. Влияние водорастворимого карбодиимида на воротный механизм "быстрых" натриевых каналов мембраны сенсорных нейронов крысы. Нейрофизиология. 19 (1): 46-53.

15. Негуляев Ю. А., Ведерникова Е. А. 1989. Блокирование ионами водородаодиночных натриевых каналов клеток нейробластомы. Нейрофизиология. 21 (1): 101-105.

16. Негуляев Ю. А., Ведерникова Е. А., Максимов А. В. 1996. Альдостерон повышает уровень активности Na-проводящих каналов в клетках хронической миелоидной лейкемии К562. ДАН РАН. 349 (5): 701-703.

17. Негуляев Ю. А., Наумов А. П., Ведерникова Е. А. 1986. Влияние реагента

18. Вудварда К на тетродотоксин-чувствительные натриевые каналы нейронов спинальных ганглиев крысы. Нейрофизиология. 18 (6): 839-842.

19. Савохина Г. А., Негуляев Ю. А., Ведерникова Е. А. 1991. Са2+-чувствительные хлорные каналы малой проводимости клеток HeLa. Биол. мембраны. 8 (9): 953-958.

20. Старущенко А. В., Мамин А. Г., Негуляев Ю. А., Ведерникова Е. А. 2000. Активация механочувствительных ионных каналов в плазматической мембране клеток К562. Цитология. 42 (7): 669-674.

21. Старущенко А. В., Негуляев Ю. А., Морачевская Е. А. 2002. Ингибирующее и стимулирующее действие амилорида на потенциал-независимые катионные каналы в клетках К562. Цитология. 44 (7): 675-680.

22. Сударикова А. ВЧубинский-Надеждин В. И., Негуляев Ю. А., Морачевская Е. А. 2009. Функциональные свойства натриевых каналов в клетках К562 после экстракции холестерина. Цитология. 51 (8): 676-683.

23. Achard J. М., Bubien J. К., Beños D. J., Warnock D. G. 1996. Stretch modulates amiloride sensitivity and cation selectivity of sodium channels in human В lymphocytes. Am. J. Physiol. 270: 214-223.

24. Ahn Y. J., BrookerD. R., Kosari F. 1999. Cloning and functional expression of the mouse epithelial sodium channel. Am. J. Physiol. 277: 121-129.

25. Althaus M., Bogdan R., Clauss W. G., Fronius M. 2007. Mechano-sensitivity of epithelial sodium channels (ENaCs): laminar shear stress increases ion channel open probability. FASEB J. 21: 2389-2399.

26. Apodaca G. 2002. Modulation of membrane traffic by mechanical stimuli. Am. J. Physiol. 282: 179-190.

27. Aimers W. 1978. Gating currents and charge movements in excitable membranes. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 82: 96-190.

28. Armstrong C.M. 1981. Sodium channels and gating currents. Physiol. Rev. 61: 644-83.

29. Armstrong C.M., Bezanilla F. 1973. Currents related to movement of the gating particles of the sodium channels. Nature (Lond). 242: 459-61.

30. Ausiello D. A., Stow J. L., Cantiello H. F., de Almeida J. B., Benos D. J. 1992. Purified epithelial Na+ channel complex contains the pertussis toxin-sensitive G alpha i-3 protein. J. Biol. Chem. 267: 4759^765.

31. Awayda M. S., Subramanyam M. 1998. Regulation of Epithelial Na+ Channel by membrane tension. J. Gen. Physiol. 112: 97-111.

32. Baba T., Udaka K., Terada N., Ueda H., Fujii Y., Ohno S., Sato S. B. 2003. Actin-rich spherical extrusion induced in okadaic acid-treated K562 cells by crosslinking of membrane microdomains. J. Histochem. Cytochem. 51: 245-252.

33. BabiychukE. B., Monastyrskaya K., Burkhard F. C., Wray S., DraegerA. 2002.

34. Modulating signaling events in smooth muscle: cleavage of annexin 2 abolishes its binding to lipid rafts. FASEB J. 16: 1177-1184.

35. Balut C, Steels P., Radu M., Ameloot M., van Driessche W., Jans D. 2006. Membrane cholesterol extraction decreases Na+ transport in A6 renal epithelia. Am. J. Physiol. 290: 87-94.

36. Bang H., Kim Y., Kim D. 2000. TREK-2, a new member of the mechanosensitive tandem-pore K+ channel family. J. Biol. Chem. 275: 17412-17419.

37. Barkalow K., Witke W., Kwiatkowski D. J., Hartwig J. H. 1996. Coordinated regulation of platelet actin filament barbed ends by gelsolin and capping protein. J. Cell Biol. 134: 389-399.

38. Barritt G. J., Gregory R. B. 1997. An evaluation of strategies available for theidentification of GTP-binding proteins required in intracellular signalling pathways. Cell Signal. 9: 207-218.

39. Barritt G., Rychkov G. 2005. TRPs as mechanosensitive channels. Nature Cell Biol. 7: 105-107.

40. Bass R. B., Strop P., Barclay M., Rees D. 2002. Crystal structure of

41. Escherichia coli MscS, a voltage-modulated and mechanosensitive channel. Science. 298: 1582-1587.

42. Basudev H., Romano-Silva M.A., BrammarM. J., Campbell L. C. 1995. Effects of sodium on PKC translocation; relationship to neurotransmitter release. NeuroReport. 6: 809-812.

43. Bear C. £., Li C. 1991. Calcium-permeable channels in rat hepatoma cells activated by extracellular nucleotides. Am. J. Physiol. 261: 1018-1024.

44. Benos D. J., Awayda M. S., Ismailov I. I., Johnson J. P. 1995. Structure and function of amiloride-sensitive Na+ channels. J. Membr. Biol. 143: 1-18.

45. Benos D. J., Fuller C. M., Shlyonsky V. G., Berdiev B. K., Ismailov I. I. 1997. Amiloride-sensitive Na+ channels: insights and outlooks. News Physiol. Sci. 12: 55-61.

46. Ben-Tabou S., Keller E., Nussinovitch I. 1994. Mechanosensitivity of voltage-gated calcium currents in rat anterior pituitary cells. J. Physiol. 476: 29-39.

47. Berdiev B. K., Prat A. G., Cantiello H. P., Ausiello D. A., Fuller C. M., Jovov B., Benos D. J., Ismailov 1.1. 1996. Regulation of epithelial sodium channels by short actin filaments. J. Biol. Chem. 271: 17704-17710.

48. BerrierC., Coulombe A., Szabo I., Zoratti M., Ghazi A. 1992. Gadolinium ion inhibits loss of metabolites induced by osmotic shock and large stretch-activated channels in bacteria. Eur. J. Biochem. 206: 559-565.

49. Bianchi L. 2007. Mechanotransduction: touch and feel at the molecular level as modeled in Caenorhabditis elegans. Mol. Neurobiol. 36: 254-271.

50. Biagi B. A., EnyeartJ. J. 1990. Gadolinium blocks low and high threshold calcium currents in pituitary cells. Am. J. Physiol. 264: 1037-1044.

51. Bickei, P. E., SchererP. E., SchnitzerJ. E., Oh P., Lisanti M. P., Lodish H. F. 1997. Flotillin and epidermal surface antigen define a new family of caveolae-associated integral membrane proteins. J. Biol. Chem. 272: 13793-13802.

52. Blin G., Margeat £., Carvalho K., Royer C. A., Roy C., Picart C. 2008. Quantitative analysis of the binding of ezrin to large unilamellar vesicles containing phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate. Biophys J. 94: 1021-1033.

53. Bock J., Szabo I., GamperN., Adams C., Gulbins E. 2003. Ceramide inhibits the potassium channel Kv1.3 by the formation of membrane platforms. Biochem. Biophys. Res. Commun. 305: 890-897.

54. Borisy G. G., Svitkina T. M. 2000. Actin machinery: pushing the envelope. Curr. Opin. Cell Biol. 12: 104-112.

55. Bounoutas A., Chalfie M. 2007. Touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. Pflugers Arch. 454: 691-702.

56. Bourque C.W., Oliet S.H.R. 1997. Osmoreceptors in the central nervous system. Annu. Rev. Physiol. 59: 601-619.

57. Bowman C. B., Ding J. P., Sachs P., Sokabe M. 1992. Mechanotransducing ion channels in astrocytes. Brain Res. 584: 272-286.

58. Brown D. A. 2006. Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals. Am. J. Physiol. 21: 430-439.

59. Brown D. A., London E. 1998. Structure and origin of ordered lipid domains in biological membranes. J. Membr. Biol. 164: 103-114.

60. Brown D. A., London E. 2000. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol. Chem. 275: 17221-17224.

61. Brown, D. A., Rose J. K. 1992. Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface. Cell. 68: 533544.

62. Brownlow S. L., Sage S. O. 2005. Transient receptor potential protein subunit assembly and membrane distribution in human platelets. Thromb. Haemost. 94: 839-845.

63. Bubien J. K., Jope R. S., Warnock D. G. 1994. G-proteins modulate amiloride-sensitive sodium channels. J. Biol. Chem. 269: 17780-17783.

64. Bubien J. K., Warnock D. G. 1993. Amiloride-sensitive sodium conductance in human B lymphoid cells. Am. J. Physiol. 265: 1175-1183.

65. BurkartA., Samii B., Con/era S., ShpetnerH. S. 2003. Regulation of the SHP-2 tyrosine phosphatase by a novel cholesterol- and cell confluence-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278: 360-367.

66. Burnstock G. 1999. Release of vasoactive substances from endothelial cells by shear stress and purinergic mechanosensory transduction. J. Anat. 194: 335-342.

67. Byfield F. J., Aranda-Espinoza H., Romanenko V. G., Rothblat G. H., Levitan I. 2004. Cholesterol depletion increases membrane stiffness of aortic endothelial cells. Biophys. J. 87: 3336-3343.

68. Canessa C.M., Horisberger J.D., Rossier B.C. 1993. Epithelial sodium channel related to proteins involved in neurodegeneration. Nature (Lond.). 361: 467-470.

69. Canessa C.M., Merillat A.M., Rossier B.C. 1994. Membrane topology of the epithelial sodium channel in intact cells. Am. J. Physiol. 267: 1682-1690.

70. Cantiello H. F., Prat A. G., Bonventre J. V., Cunningham C. C., Hartwig J. H., Ausiello D. A. 1993. Actin-binding protein contributes to cell volume regulatory ion channel activation in melanoma cells. J. Biol. Chem. 268: 4596-4599.

71. Carattino M. D., Sheng S., Kleyman T. R. 2003. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. J. Biol. Chem. 279: 4120-4126.

72. Carattino M. D., Sheng S., Kleyman T. R. 2005. Mutations in the pore region modify epithelial sodium channel gating by shear stress. J. Biol. Chem. 280: 4393-4401.

73. Carnally S. M., DevH. S., Stewart A. P. 2008. Direct visualization of the trimeric structure of the ASICIa channel, using AFM imaging. Biochem. Biophys. Res. Comm. 372: 752-755.

74. Cantiello H. F., Stow J. L., Prat A. G., Ausiello D. A. 1991. Actin filaments regulate epithelial Na+ channel activity. Am. J. Physiol. 261: 882-888.

75. Chalfie M., Thomson J. N. 1982. Structural and functional diversity in the neuronal microtubules of Caenorhabditis elegans. J. Cell Biol. 93: 15-23.

76. ChangS. S., GrunderS., Hanukoglu A., Rosier A., Mathew P. M. 1996. Mutations in subunits of the Epithelial Sodium Channel cause salt wasting with hyperkalaemic acidosis, pseudohypoaldesteronism type 1. Nat. Genet. 12: 248-253.

77. Chang H. M., Reitstetter R., Mason R. P., Gruener R. 1995. Attenuation of channel kinetics and conductance by cholesterol: an interpretation using structural stress as a unifying concept. J. Membr. Biol. 143: 51-63.

78. Chang G., Spencer R. H., Lee A. T., Barclay M. T., Rees D. C. 1998. Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel. Science. 282: 2220-2226.

79. Chapleau M. W. 1992. Cardiovascular mechanoreceptors. Adv. Comp. Environ. Physiol. 10: 138-164.

80. Chauhan V. S., Tuvia S., Buhusi M., Bennett V., Grant AO. 2000. Abnormal cardiac Na+ channel properties and QT heart rate adaptation in neonatal ankyrinB knockout mice. Circ. Res. 86: 441-447.

81. Chemin J., Patel A. J, Duprat F., Lauritzen /., Lazdunski M., Honoré E. 2005. Aphospholipid sensor controls mechanogating of the K+ channel TREK-1. EMBO J. 24: 44-53.

82. Cheng L., Wang K., Liu D., Li Y., Zhaoi Q. 2008. The functional roles of lipid rafts in T cell activation, immune diseases and HIV infection and prevention. Cell. Mol. Immunol. 5: 1-7.

83. Chichili G. R., Rodgers W. 2009. Cytoskeleton-membrane interactions in membrane raft structure. Cell. Mol. Life Sci. 66: 2319-2328.

84. Cho H., Shin J., Shin C. Y., Lee S. Y., Oh U. 2002. Mechanosensitive ion channels in cultured sensory neurons of neonatal rats. J. Neurosci. 22: 1238-1247.

85. Chong L. D, Traynor-Kaplan A., Bokoch G. M., Schwartz M. A. 1994. The small GTP-binding protein Rho regulates a phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase in mammalian cells. Cell. 79: 507-513.

86. Christian A. £., Haynes M. P., Phillips M. C., Rothblat G. H. 1997. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. J. Lipid Res. 38: 2264-2272.

87. Chun M., U. Liyanage K., Lisanti M. P., Lodish H. F. 1994. Signal transduction of a G protein-coupled receptor in caveolae: colocalization of endothelin and its receptor with caveolin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 11728-11732.

88. Clapham D.E. 2003. TRP channels as celluar sensors. Nature. 426: 517-24.

89. Cohen A, Sagron R, Somech E, Segal-Hayoun Y, Zilberberg N. 2009. Pain-associated signals, acidosis and lysophosphatidic acid modulate the neuronal K (2P) 2.1 channel. Mol. Cell Neurosci. 40: 382-389.

90. Codina J., YataniA., Grenet D., Brown A. M., Birnbaumer L. 1987. The alpha subunit of the GTP binding protein Gk opens atrial potassium channels. Science. 236: 442445.

91. Conrad R.E. 1981. Induction and collection of peritoneal exudate macrophages. In: Manual of Macrophage Methodology (Herscowitz H.B., Holden H.T., Bellanti J.A., Ghaffar A. eds.) pp 5-11, Marcel Dekker, Inc., New York.

92. Cooper J. A. 1987. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. J. Cell Biol. 105: 1473-1478.

93. Cooper J. A., Schafer D. A. 2000. Control of actin assembly and disassembly at filament ends. Curr. Opin. Cell Biol. 12: 97-103.

94. Cui C., Smith D. O., AdlerJ. 1995. Characterization of mechanosensitive channels in Escherichia coli cytoplasmic membrane by whole cell patch-clamp recording. J. Membr. Biol. 144: 31-42.

95. Davidson R. M. 1993. Membrane stretch activates a high-conductance K+ channel in G292 osteoblastic-like cells. J. Membr. Biol. 131: 81-92.

96. Davis M. J., DonovitzJ. A., Hood J. D. 1992. Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 262: 10831088.

97. De Almeida R. F., FedorovA., Prieto M. 2003.

98. Sphingomyelin/phosphatidylcholine/cholesterol phase diagram: boundaries and composition of lipid rafts. Biophys J. 85: 2406-2416.

99. DenkerS. P., Barber D. L. 2002. Ion transport proteins anchor and regulate the cytoskeleton. Curr. Opin. Cell Biol. 14: 214-220.

100. Denker S. P, Huang D. C, Orlowski J., Furthmayr H., Barber D. L. 2000. Direct binding of the Na-H exchanger NHE1 to ERM proteins regulates the cortical cytoskeleton and cell shape independently of H+ translocation. Mol. Cell. 6: 1425-1436.

101. De WeerP. 1976. Axoplasmic free magnesium levels and magnesium extrusion from squid giant axons. J. Gen. Physiol. 68: 159-178.

102. Ding J. P., Pickard B. G. 1993. Mechanosensory calcium-sensitive cation channels in epidermal cells. Plant J. 3: 83-110.

103. Downey, G. P., Chan, C. K., Trudel, S. Grinstein, S. 1990. Actin assembly in electropermeabilized neutrophils: role of intracellular calcium. J.Cell Biol. 110: 1975-1982.

104. Driscoll M., Chalfie M. 1991. The mec-4 gene is a member of a family of C. elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349: 588-593.

105. Drummond H.A., Gebremedhin D., Harder D.R. 2004. Degenerin/epithelial Na+ channel proteins: components of a vascular mechanosensor. Hypertension. 44: 643-648.

106. Drummond H. A., Welsch M. J., Abboud F. M. 2001. ENaC subunits are molecular components of the arterial baroreceptor complex. Ann. NY Acad. Sci. 234: 42—47.

107. Du H., Gu G., William C. M. and Chalfie M. 1996. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16: 183-194.

108. Dubreuil R. R., Wang P., Dahl S., Lee J., Goldstein L.S. 2000. Drosophila beta spectrin functions independently of alpha spectrin to polarize the Na,K ATPase in epithelial cells. J. Cell Biol. 149: 647-656.

109. Duncan R. L., Turner C. H. 1995. Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain. Calcif. Tissue. Int. 57: 344-358.

110. Eaton D.C., Hamilton K.L. 1988. The amiloride-blockable sodium channel of epithelial tissue. In: Ion channels. New York and London, Plenum Press.: 251-282.

111. Edidin M. 2003. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32: 257-283.

112. Elliott R., Szleifer I., Schick M. 2006. Phase diagram of a ternary mixture of cholesterol and saturated and unsaturated lipids calculated from a microscopic model. Phys. Rev. Lett. 96: 98-101.

113. Elinder F., Arhem P. 1994. Effects of gadolinium on ion channels in the myelinated axon of Xenopus laevis: four sites of action. Biophys. J. 67: 71-83.

114. Emtage L., Gu G., Hartwieg E., Chalfie M. 2004. Extracellular proteins organize the mechanosensory channel complex in C. elegans touch receptor neurons. Neuron. 44: 795-807.

115. Epand R. M. 2008. Proteins and cholesterol-rich domains. Biochim. Biophys Acta. 1778: 1576-1582.

116. Erdahl W. L, Chapman C. J., Taylor R. W., Pfeiffer D. R. 1994. Ca2+ transport properties of ionophores A23187, ionomycin, and 4-BrA23187 in a well defined model system. Biophys.J. 66: 1678-1693.

117. ErlerG. 1983. Reduction of mechanical sensitivity in an insect mechanoreceptor correlated with destruction of its tubular body. Cell Tissue Res. 234: 451-461.

118. Ermakov Y. A., Averbakh A. Z., Yusipovich A. I., Sukharev S. 2001. Dipole potentials indicate restructuring of the membrane interface induced by gadolinium and beryllium ions. Biophys. J. 80: 1851-1862.

119. FerayJ. C., Garay R. 1986. A Na+-stimulated Mg2+-transport system in human red blood cells. Biochim. Biophys. Acta. 856: 76-84.

120. Filipovic D., Sackin H. 1991. A calcium-permeable stretch-activated cation channel in renal proximal tubule. Am. J. Physiol. 260: 119-129.

121. FinkM., Lesage F., Duprat F., Heurteaux C., Reyes R., Fosset M., Lazdunski M. 2008. A neuronal two P domain K+ channel stimulated by arachidonic acid and polyunsaturated fatty acids. EMBO J. 17: 3297-3308.

122. Flatman P. W. 1991. Mechanisms of magnesium transport. Annu. Rev. Physiol. 53: 259-271.

123. FögerN., Marhaba R., Zöller M. 2001. Involvement of CD44 in cytoskeleton rearrangement and raft reorganization in T cells. J Cell Sei. 114: 1169-1178.

124. Folkesson H. G. 2008. Variations in ENaC subunit composition may determine amiloride sensivity and ^-adrenergic stimulation of lung fluid absorption. Am. J. Physiol. 294: 399-400.

125. Foster L. J., De Hoog С. L., Mann M. 2003. Unbiased quantitative proteomics of lipid rafts reveals high specificity for signaling factors. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 100: 5813-5818.

126. Foster L. J. 2008. Lessons learned from lipid raft proteomics. Expert Rev. Proteomics. 5: 541-543.

127. Franko A. Jr., Lansman J. B. 1990. Stretch-sensitive channels in developing muscle cells from a mouse cell line. J. Physiol. 427: 361-380.

128. Franko-Obregon A. Jr., Lansman J. B. 2002. Changes in mechanosensitive channel gating following mechanical stimulation in skeletal muscle myotubes from the mdx mouse. J. Physiol. 539: 391^07.

129. Fronius M., Clauss W. G. 2008. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Eur. J. Physiol. 455: 775-785.

130. Fujimoto Т., Miyawaki A., Mikoshiba K. 1995. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-like protein in plasmalemmal caveolae is linked to actin filaments. J. Cell Sei. 108: 7-15.

131. Gannier F., White E., Lacampagne A., Gamier D., Le GuennecJ. Y. 1994. Streptomycin reverses a large stretch induced increases in Ca2+.i in isolated guinea pig ventricular myocytes. Cardiovasc. Res. 28: 1193-1198.

132. Garty H. 1994. Molecular properties of epithelial amiloride-blockable Na+ channels. FASE В J. 8: 522-528.

133. Garty H., Palmer L.G. 1997. Epithelial sodium channel: functions, structure, regulation. Physiol. Rev. 77: 359-396.

134. Giebisch G. 1998. Renal potassium transport: mechanisms and regulation. Am. J. Physiol. 274: 817-833.

135. Gilman A. G. 1987. G proteins: transducers of receptor-generated signals. Annu. Rev. Biochem. 56: 615-649.

136. Goddette D. W., Frieden C. 1987. The kinetics of cytochalasin D binding to monomeric actin. J. Biol. Chem. 261: 15970-15973.

137. Gorodinsky A., Harris D. A. 1995. Glycolipid-anchored proteins in neuroblastoma cells form detergent-resistant complexes without caveolin. J. Cell Biol. 129: 619-627.

138. Gottlieb P., Folgering J., Maroto R., Raso A., Wood T. G., Kurosky A., Bowman C., BichetD., Pate! A., Sachs F., Martinac B., Hamill O. P., Honoré E. 2008. Revisiting TRPC1 and TRPC6 mechanosensitivity. Pflugers Arch. 455: 1097-1103.

139. Guharay F., Sachs F. 1984. Stretch-activated single ion channel currents in tissue cultured embryonic chick skeletal muscle. J. Physiol. 352: 685-701.

140. Gunther T., Vormann J. 1992. Activation of Na+/Mg2+ antiport in thymocytes by cAMP. FEBS Lett. 297: 132-134.

141. Hackney C.M., Furness D.M. 1995. Mechanotransduction in vertebrate hair cells: structure and function of the stereociliary bundle. Am. J. Physiol. 268 : 1-13.

142. Hamill O. P. 2006. Twenty odd years of stretch-sensitive channels. Pflugers Arch. 453: 333-351.

143. Hamill O. P, Martinac B. 2001. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiol. Rev. 81: 685-740.

144. Hamill O. P., Marty A., NeherE., Sakmann B., Sigworth F. J. 1981. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391: 85-100.

145. Hamill O. P., McBride Jr. D. W. 1992. Rapid adaptation of the MG channel in Xenopus oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 7462-7466.

146. Hamill O. P., McBride Jr. D. W. 1994a. The cloning of a mechano-gated membrane ion channel. Trends Neurosci. 17: 439-443.

147. Hamill O. P., McBride Jr., D. W. 1994b. Molecular mechanisms of mechano-receptor adaptation. News Physiol. Sci. 9: 53-59.

148. Hamill O. P., McBride Jr. D. W. 1996. The pharmacology of mechanogated membrane ion channels. Pharmacol. Rev. 48: 231-252.

149. Hanwell D., Ishikawa T., Saleki R., Rotin D. 2002. Trafficking and cell surface stability of the epithelial Na+ channel expressed in epithelial Madin-Darby canine kidney cells. J. Biol. Chem. 277: 9772-9779.

150. Harder T., KellnerR., Parton R. G., Gruenberg J. 1997. Specific release of membrane-bound annexin II and cortical cytoskeletal elements by sequestration of membrane cholesterol. Mol. Biol. Cell. 8: 533-545.

151. Harder T., Simons K. 1999. Clusters of glycolipid and glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins in lymphoid cells: accumulation of actin regulated by local tyrosine phosphorylation. Eur. J. Immunol. 29: 556-562.

152. Hartwig J., Chambers K. A Stossel, T. 1989. Association of gelsolin with actin filaments and cell membranes of macrophages and plateles. J.Cell Biol 108: 467^479.

153. Haws C. M., WinegarB. D., Lansman J. B. 1996. Block of single L-type Ca2+ channels in skeletal muscle fibers by aminoglycoside antibiotics. J. Gen. Physiol. 107: 421432.

154. Heiska L., Alfthan K., Gronholm M., Vilja P., VaheriA., Carpen O. 1998. Association of ezrin with intercellular adhesion molecule-1 and -2 (ICAM-1 and ICAM-2). Regulation by phosphatidylinositol4, 5-bisphosphate. J. Biol. Chem. 273: 2189321900.

155. Hibino H., Kurachi Y. 2007. Distinct detergent-resistant membrane microdomains (lipid rafts) respectively harvest K+ and water transport systems in brain astroglia. Eur. J. Neurosci. 26: 2539-2555.

156. Hille B. 2001. Ionic channels of excitable membranes. Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA, USA. 814p.

157. Hill W. G., An B., Johnson J. P. 2002. Endogenously expressed epithelial sodium channel is present in lipid rafts in A6 cells. J. Biol. Chem. 277: 33541-33544.

158. Hinssen H., Small J. V., Sobieszek A. 1984. A Ca2+-dependent actin modulator from vertebrate smooth muscle. FEBS Lett. 166: 90-95.

159. Hisada T., Singer J. J., Walsh J. V. 1993a. Aluminofluoride activates hyperpolarization-and stretch-activated cationic channels in single smooth muscle cells. Pflugers Arch. 422: 397^400.

160. Hisada T., Walsh J.V., Singer J.J. 1993b. Stretch-inactivated cationic channels in single smooth muscle cells. Pflugers Arch. 422: 393-396.

161. HmielS. P., Snavely M. D., FlorerJ. B., Maguire M. E., Miller C. G. 1989. Magnesium transport in Salmonella typhimurium: genetic characterization and cloning of three magnesium transport loci. J. Bacteriol. 171: 4742^4751.

162. Hodgkin A. L, Katz B. 1949. The effect of sodium ions on the electrical activity of the giant axons of the squid. J. Physiol. 108: 37-77.

163. Hodgkin A. L, Huxley A. F. 1952a. Currents carried by sodium and potassium ions through the membrane of the giant axon of Loligo. J. Physiol. 116: 449-472.

164. Hodgkin A. L., Huxley A. F. 1952b. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve J. Physiol. 117: 500-544.

165. Holmgren J., Lonnroth I., Mansson J-E., Svennerholm L. 1975. Interaction of cholera toxin and membrane GM1 ganglioside of small intestine. Proc. Nat. Acad. Sci. USA . 72:2520-2524.

166. Honoré E., Maingret F., Lazdunski M., Patel A. J. 2002. An intracellular proton sensor commands lipid-and mechano-gating of the K+ channel TREK-1. EMBO J. 21: 2968-2976.

167. Hope H. R., Pike L. J. 1996. Phosphoinositides and phosphoinositide-utilizing enzymes in detergent-insoluble lipid domains. Mol. Biol. Cell. 7: 843-851.

168. HorberJ. K., MosbacherJ., Haberle W., Ruppersberg J. P., Sakmann B. 1995. A look at membrane patches with a scanning force microscope. Biophys J. 68: 1687-1693.

169. Howard J., Roberts W. M., Hudspeth A. J. 1988. Mechanoelectrical transduction by hair cells. Annu. Rev. Biophys. Chem. 17 : 99-124.

170. HoyerJ., DistlerA., Haase W., Gogelein H. 1994. Ca2+ influx through stretch-activated cation channels activates maxi K+ channels in porcine endocardial endothelium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 2367-2371.

171. HoyerJ., KohlerR., Haase W., DistlerA. 1996. Up-regulation of pressure-activated Ca2+-permeable cation channel in intact vascular endothelium of hypertensive rats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 11253-11258.

172. Huang M., Chalfie M. 1994. Gene interactions affecting mechanosensory transduction in C. elegans. Nature. 311: 538-544.

173. Huang J., Feigenson G. W.1999. A microscopic interaction model of maximum solubility of cholesterol in lipid bilayers. Biophys. J. 76: 2142-2157.

174. Hug T., Koslowsky T., Ecke D., GregerR., Kunzelmann K. 1995. Actin-dependent activation of ion conductances in bronchial epithelial cells. Pflugers Arch. 429: 682690.

175. HugheyR. P., Bruns J. B., Kinlough C. L, Harkleroad K. L., Tong Q., Carattino M. D., Johnson J. P., Stockand J. D., Kleyman T. R. 2004. ENaCs are activated by furin-dependent proteolysis. J. Biol. Chem. 279: 48491-48494.

176. Janmey P. A. 1994. Phosphoinositides and calcium as regulators of cellular actin assembly and disassembly. Annu. Rev. Physiol. 56: 169-191.

177. Janmey P. A. 1998. The cytoskeleton and cell signaling: component localization and mechanical coupling. Physiol. Rev. 78: 763-781.

178. Jackson S. L., Heath I. B. 1993. Roles of calcium ions in hyphal tip growth. Microbiol. Rev. 57: 367-382.

179. Ji H. L., Fuller C. M., Benos D. J. 1998. Osmotic pressure regulates alpha beta gamma-rENaC expressed in Xenopus oocytes. Am. J. Physiol. 275: 1182-1190.

180. Jorgensen F. O. 1985. Effects of amiloride on the mechanosensitivity of lateral line organs of Necturus maculosus and Xenopus laevis. Acta Physiol. Scand. 124: 249.

181. Jorgensen F. O., Ohmori H. 1988. Amiloride blocks the mechano-electrical transduction channel of hair cells of the chick. J. Physiol. 403: 577-588.

182. JovovB., ToussonA., Ji H. L., Keeton D., Shlyonsky V., Ripoll P. J., Fuller C. M., Benos D. J. 1999. Regulation of epithelial Na+ channels by actin in planar lipid bilayers and in the Xenopus oocyte expression system. J. Biol. Chem. 274: 37845-37854.

183. Kamkin A., I. Kiseleva I., G. Isenberg G. 2003. Ion selectivity of stretch-activated cation currents in mouse ventricular myocytes, Pflugers Arch. 446: 220-231.

184. Kang D., Choe C., Kim D. 2005. Thermosensitivity of the two-pore domain K+ channels TREK-2 and TRAAK. J. Physiol. 564: 103-116.

185. Karnovsky M. J., Kleinfeld A. M., Hoover R. L, Klausner R. D. 1982. The concept of lipid domains in membranes. J. Cell Biol. 94: 1-6.

186. Kashlan O. B., Sheng S., Kleyman T. R. 2005. On the Interaction between Amiloride and Its Putative alpha-Subunit Epithelial Na-Channel Binding Site. J. Biol. Chem., 28:26206-26215.

187. Katagiri Y. U., Kiyokawa N., Fujimoto J. 2001. A role for lipid rafts in immune cell signaling. Microbiol. Immunol. 45: 1-8.

188. Katanaev V. L, Wymann M. P. 1998. GTPgammaS-induced actin polymerisation in vitro: ATP- and phosphoinositide-independent signalling via Rho-family proteins and a plasma membrane-associated guanine nucleotide exchange factor. J. Cell Sci. 111: 1583-1594.

189. Kaufmann S., Kas J., Goldmann W. H., Sackmann E., Isenberg G. 1992. Talin anchors and nucleates actin filaments at lipid membranes. A direct demonstration. FEBS Lett. 314:203-205.

190. Kellenberger S., Schild L. 2002. Epithelial Sodium Channel/Degenerin family of ion channels: a variety of functions for a shared structure. Physiol. Rev. 82: 735-767.

191. Kennard L. E., Chumbley J. R., Ranatunga K. M., Armstrong S. J., Veale E. L., Mathie A. 2005. Inhibition of the human two-pore domain potassium channel, TREK-1, by fluoxetine and its metabolite norfluoxetine. Br. J. Pharmacol. 144: 821-829.

192. Keynes R. D. 1951. The ionic movements during nervous activity. J. Physiol. (Lond.) 114: 119-150.

193. Khaitlina S. Yu, Collins J. H., Kuznetsova I. M., Pershina V. P., Synakevich I. G., Turoverov K. K., Usmanova A. M. 1991. Physico-chemical properties of actin cleaved with bacterial protease from E. coli A2 strain. FEBS Lett. 279: 49-51.

194. Kim D. 1992. A mechanosensitive K+ channel in heart cells: activation by arachidonic acid. J. Gen. Physiol. 100: 1021-1040.

195. Kim D., Sladek C. D., Aguado-Velasco C., Mathiasen J. R. 1995. Arachidonic acid activation of a new family of K+ channels in cultured rat neuronal cells. J. Physiol. 484: 643-660.

196. Kimitsuki T., Ohmori H. 1993. Dihydrostreptomycin modifies adaptation and blocks the mechano-electric transducer in chick cochlear hair cells. Brain Res. 624: 143-150.

197. Kirk K., Ellory J.C., Young J. D. 1992. Transport of organic substrates via a volume-activated channel. J. Biol. Chem. 267: 23475-23478.

198. KirberM. T., OrdwayR. W., Clapp L. H., Walsh Jr., J. V., Singe J. J. 1992. Both membrane stretch and fatty acids directly activate large conductance Ca2+ -activated K+ channels in vascular smooth muscle cells. FEBS Lett. 297: 24-28.

199. KirberM. T., Walsh J. V. Jr., Singer J. J. 1988. Stretch-activated ion channels in smooth muscle: a mechanism for the initiation of stretch-induced contraction. Pflugers Arch. 412: 339-345.

200. KizerN., GuoX-L., Hruska K. 1997. Reconstitution of stretch-activated cation channels by expression of the a-subunit of the epithelial sodium channel cloned from osteoblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 1013-1018.

201. Klein M., SeegerP., Schuricht B., AlperS. L., Schwab A. 2000. Polarization of Na+/H+ and CI7HC03" exchangers in migrating renal epithelial cells. J. Gen. Physiol. 115: 599-608.

202. Korlach J., Schwille P., Webb W. W., Feigenson G. W. 1999. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 8461-8466.

203. Kumada N., Terui N., Kuwaki T. 1990. Arterial baroreceptor reflex: its central and peripheral neural mechanisms. Progr. Neurobiol. 35: 331-361.

204. Kung C. 2005. A possible unifying principle for mechanosensation. Nature. 436: 647654.

205. Kunzelmann K. 2005. Ion channels and cancer. J. Membr. Biol. 205: 159-73.

206. Ma H. P., Li L., Zhou Z. H, Eaton D. C., Warnock D. G. 2002. ATP masks stretch activation of epithelial sodium channels in A6 distal nephron cells. Am. J. Physiol. 282: 501-505.

207. Maingret F., Fosset M., Lesage F., Lazdunski M., Honore E. 1999. TRAAK is amammalian neuronal mechano-gated K+ channel. J. Biol. Chem. 274: 1381-1387.

208. Maingret P., Honore E., Lazdunski M., Patel A. J. 2002. Molecular basis of the voltage-dependent gating of TREK-1, a mechano-sensitive K+ channel. Biochim. Biophys. Res. Comm. 292: 339-346.

209. Malhotra J. D., Kazen-Gillespie K., Hortsch M., Isom L. L. 2000. Sodium channel beta subunits mediate homophilic cell adhesion and recruit ankyrin to points of cell-cell contact. J. Biol. Chem. 275: 11383-11388.

210. MannechezA., Reungpatthanaphong P., de Certaines J. D., Leray G., Le Moyec L. 2005. Proton NMR visible mobile lipid signals in sensitive and multidrug-resistant K562 cells are modulated by rafts. Cancer Cell Int. 5: 2.

211. Marchenko S. M., Sage S. O. 1997. A novel mechanosensitive cationic channel from the endothelium of rat aorta. J. Physiol. 498: 419^425.

212. Markin V. S., Martinac B. 1991. Mechanosensitive ion channels as reporters of bilayer expansion: a theoretical model. Biophys. J. 60: 1120-1127.

213. Maroto R., RasoA., Wood T. G., Kurosky A., Martinac B., Hamill O. P. 2005. TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 7: 179185.

214. Martens J. R., Navarro-Polanco R., Coppock E. A., Nishiyama A., ParshleyL., Grobaski T. D., Tamkun M. M. 2000. Differential targeting of Shaker-like potassium channels to lipid rafts. J. Biol. Chem. 275: 7443-7446.

215. Martel V., Racaud-Sultan C., Dupe S., Marie C., Paulhe F., Galmiche A., Block M. R., Albiges-Rizo C. 2001. Conformation, localization, and integrin binding of talin depend on its interaction with phosphoinositides. J. Biol. Chem. 276: 2121721227.

216. Martens J. R., Navarro-Polanco R., Coppock E. A., Nishiyama A., Parshiey L., Grobaski T. D., Tamkun M. M. 2000. Differential targeting of Shaker-like potassium channels to lipid rafts. J. Biol. Chem. 275: 7443-7446.

217. Martens J. R., Sakamoto N., Sullivan S. A., Grobaski T. D„ Tamkun M. M. 2001. Isoform-specific localization of voltage-gated K+ channels to distinct lipid raft populations. Targeting of Kv15 to caveolae. J. Biol. Chem. 276: 8409-8414.

218. Martinac B. 2001. Mechanosensitive channels in prokaryotes. Cell Physiol. Biochem. 11: 61-76.

219. Martinac B. 2004. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. J. Cell Sci. 117:2449-2460.

220. Martinac В., AdlerJ., Kung C. 1990. Mechanosensitive ion channels of E. coli activated by amphipaths. Nature. 348: 261-263.

221. Martinac В., Buechner M., DelcourA. H., AdlerJ., Kung C. 1987. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 2297-2301.

222. Matveyev V.V., Usmanova A.M., Morozova A.V., Collins J.H., Khaitlina S.Y. 1996. Purification and characterization of the proteinase ECP 32 from Escherichia coli A2 strain. Biochim. Biophys. Acta. 1296: 55-62.

223. Maun N.A., SpeicherD. W., DiNubile M. J., Southwick F. S. 1996. Purification and properties of a Ca2+-independent barbed-end actin filament capping protein, CapZ, from human polymorphonuclear leukocytes. Biochemistry. 35: 3518-3524.

224. Maximov A. V., Vedernikova E. A., Hinssen H., Khaitlina S. Y. Negulyaev Yu. A. 1997a. Ca-dependent regulation of Na+- selective channels via actin cytoskeleton modification in leukemia cells. FEBS Letters. 412: 94-96.

225. Maximov A. V., Vedernikova E. A., Negulyaev Yu. A. 1997b. F-Actin network regulates the activity of Na+-selective channels in human myeloid leukemia cells. The role of plasma gelsolin and intracellular calcium. Biophys. J. 72: 266a.

226. McBride Jr. D. W., Hamill 0. P. 1992. Pressure clamp: a method for rapid step perturbation of mechanosensitive channels. Pflijgers Arch. 421: 606-612.

227. McDonald P. J., Price M. P., Snyder P. M., Welsh M. J. 1995. Cloning and expression of the beta- and gamma-subunits of the human epithelial sodium channel. Am. J. Physiol. 268: 1157-1163.

228. Middlebrook J. L., Dorland R. B. 1984. Bacterial Toxins: Cellular Mechanisms of Action Microbiol. Rev, 48: 199-221.

229. Millet В., Pickard B.G. 1988. Gadolinium ion is the inhibitor suitable for testing the putative role of stretch-activated ion channels in geotropism and thigmotropism. Biophys. J. 53:155a

230. Mineo, C., James G. L., Smart E. J., Anderson R. G. W. 1996. Localization of epidermal growth factor-stimulated Ras/Raf-1 interaction to caveolae membrane. J. Biol. Chem. 271: 11930-11935.

231. Morachevskaya E. A., Shumilina E. V., Negulyaev Y. A., Khaitlina S. Y. 2004.

232. Rearrangement of submembranous actin filaments mediates G-protein-dependent regulation of Na channels in human leukaemia cells. Biophys. J. 86: 231a.

233. Morachevskaya E. A., Sudarikova A. V., Negulyaev Y. A. 2007. Mechanosensitive channel activity and F-actin organization in cholesterol-depleted human leukaemia cells. Cell Biol. Int. 31: 374-381.

234. Morimoto T., Liu W., Woda C., Carattino M.D., Wei Y„ Hughey R. P., Apodaca G., Satlin L. M., Kleyman T. R. 2006. Mechanism underlying flow stimulation of sodium absorbtion in mammalian collecting duct. Am. J. Physiol. 291: 663-669.

235. Morris C. E. 1990. Mechanosensitive ion channels. J. Membr. Biol. 113: 93-107.

236. Morris C. E., Horn R. 1991. Failure to elicit neuronal macroscopic mechanosensitive currents anticipated by single channel studies. Science. 251: 1246-1249.

237. Morris C. E., Sigurdson W. J. 1989. Stretch-inactivated ion channels coexist with stretch-activated ion channels. Science. 243: 807-809.

238. Mozhayeva G. N., NaumovA. P. 1983. The permeability of sodium channels to hydrogen ions in nerve fibres. Pfliigers Arch. 396:163-173.

239. Mozhayeva G. N., NaumovA. P., Negulyaev Y. A. 1981. Evidence for existence of two acid groups controlling the conductance of sodium channel. Biochim. Biophys. Acta. 643: 251-255.

240. Munro S. 2003. Lipid rafts: elusive or illusive? Cell. 115: 377-388.

241. Murata, M., Peranen J., Schreiner R., Wieland F., Kurzchalia T. V., Simons K. 1995. VIP21/caveolin is a cholesterol-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 10339-10343.

242. Murphy E., Freudenrich C. C., Lieberman M. 1991. Cellular magnesium and Na/Mg exchange in heart cells. Annu. Rev. Physiol. 53: 273-287.

243. Muto S. 2001. Potassium transport in mammalian collecting duct. Physiol. Rev. 81: 85116.

244. Nakamura T.Y., Iwata Y., Sampaolesi M., Hanada H., Saito N., Artman M., Coetzee W.A., Shigekawa M. 2001. Stretch-activated cation channels in skeletal muscle myotubesfrom sarcoglycan-deficient hamsters. Am. J. Physiol. 281: 690-699.

245. Nebl T., Pestonjamasp K. N., Leszyk J. D., Crowley J. L., Oh S. W., Luna E. J. 2002. Proteomic analysis of a detergent-resistant membrane skeleton from neutrophil plasma membranes. J. Biol. Chem. 277: 43399-43409.

246. Needham D., Nunn R.S. 1990. Elastic deformation and failure of lipid bilayer membranes containing cholesterol. Biophys. J. 58: 997-1009.

247. Negulyaev Y. A., Khaitlina S. Y., Hinssen H., Shumilina E. V., Vedernikova E. A. 2000.

248. Sodium channel activity in leukemia cells is directly controlled by actin polymerization. J. Biol. Chem. 275: 40933-40937.

249. Negulyaev Yu. A., MaximovA. V., Vedernikova E. A., Katina I. E. 1997. Voltage-insensitive Na channels of different selectivity in human leukemic cells. Gen. Physiol. Biophys. 16: 163-173.

250. Negulyaev Yu. A., Vedernikova E. A. 1985. Effect of pH on fast sodium channels in neurons of the rat dorsal root ganglion. Gen. Physiol. Biophys. 4: 359-365.

251. Negulyaev Yu. A., Vedernikova E. A. 1994. Sodium-selective channels in membranes of rat macrophages. J. Membr. Biol. 138: 37-45.

252. Negulyaev Yu. A., Vedernikova E. A., Kinev A. V. Voronin A. P. 1996a. Exogenous heat shock protein hsp70 activates potassium channels in U937 cells. Biochim. Biophys. Acta. 1282: 156-162.

253. Negulyaev Yu. A., Vedernikova E. A., MaximovA. V. 1996b. Disruption of actin filaments increases the activity of Na-conducting channels in human myeloid leukemia cells. Mol. Biol. Cell. 7: 1857-1864.

254. Negulyaev Y. A., Vedernikova E. A., Mozhayeva G. N. 1994. Several types of sodium-conducting channels in human carcinoma A-431 cells. Biochim. Biophys. Acta. 1194: 171-175.

255. Negulyaev Yu. A., Vedernikova E. A. Savokhina G. A. 1990. Aconitine-induced modification of single sodium channels in neuroblasoma cell membrane. Gen. Physiol. Biophys. 9: 167-176.

256. Negulyaev Yu. A., Savokhina G. A., Vedernikova E. A. 1993. Calcium-permeable channels in HeLa cells. Gen. Physiol. Biophys. 12: 19-25.

257. Nilius B., Droogmans G. 1995. Ion channels of endothelial cells. In: Sperelakis N. (Ed). Physiology and pathophysiology of the heart. Kluwer Acad. Publishers. 961-973.

258. Nilius B., Eggermont J., Voets T., Buyse G., Manolopoulos V., Droogmans G. 1997. Properties of volume-regulated anion channels in mammalian cells. Progr. Biophys. Mol. Biol. 68: 69-119.

259. Nilius B., Owsianik G., Voets T., Peters J. A. 2007. Transient receptor cation channels in disease. Physiol. Rev. 87: 165-217.

260. Niisato N., Marunaka Y. 2001. Blocking action of cytochalasin D on protein kinase A stimulation of a stretch-activated cation channel in renal epithelial A6 cells. Biochem. Pharmacol. 61: 761-765.

261. O'Brodovich H., Yang P., Gandhi S., Otulakowski G. 2008. Amiloride-insensitive Na+ and fluid absorption in the mammal distal lung. Am. J. Physiol. 294: 401-408.

262. Ohara A., Matsunaga H., Eaton D. C. 1993. G protein activation inhibits amiloride-blockable highly selective sodium channels in A6 cells. Am. J. Physiol. 264: 352360.

263. Ohmori H. 1985. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. J. Physiol. 359: 189-217.

264. OhtaniE., trie T., Uekama K., Fukunaga K. Pitha J. 1989. Differential effects of alpha-, beta- and gamma -cyclodextrins on human erythrocytes. Eur. J. Biochem. 186: 1722.

265. Oike M., Schwarz G., SehrerJ., Jost M., Gerke V., Weber K., Droogmans G., Nilius B. 1994. Cytoskeletal modulation of the response to mechanical stimulation in human vascular endothelial cells. Pfliigers Arch. 428: 569-576.

266. Okada Y. 1997. Volume expansion-sensing outward-rectifier CI2 channel: fresh start to the molecular identity and volume sensor. Am. J. Physiol. 273: 755-789.

267. Oliet S. H., Bourque C. W. 1993. Mechanosensitive channels transduce osmosensitivity in supraoptic neurons. Nature. 364: 341-343.

268. Oliferenko S., Paiha K., Harder T., Gerke V., Schworzler C., Schwarz H. 1999. Analysis of CD44-containing lipid rafts: Recruitment of annexin II and stabilization by the actin cytoskeleton. J. Cell Biol. 146: 843-854.

269. Oude WeerninkP. A., Schulte P., Guo Y., Wetzel J., Amano M., Kaibuchi K., Haverland S., Voss M., Schmidt M., Mayr G. W., Jakobs K. H. 2000. Stimulation of phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase by Rho-kinase. J. Biol. Chem. 275: 10168-10174.

270. Palmer L. G. 1992. Epithelial Na channels: function and diversity. Annu. Rev. Physiol. 54: 51-66.

271. Palmer L. G., Frindt G. 1996. Gating of Na channels in the rat cortical collecting tubule: effects of voltage and membrane stretch. J. Gen. Physiol. 107: 35-45.

272. Paoletti P., AscherP. 1994. Mechanosensitivity of NMDA receptors in cultured mouse central neurons. Neuron. 13: 645-655.

273. Parekh A. B. 1996. Nonhydrolyzable analogues of GTP activate a new Na+ current in a rat mast cell line. J. Biol. Chem. 271: 23161-23168.

274. Parekh A. B. PennerR. 1997. Store depletion and calcium influx. Physiol. Rev. 77: 901930.

275. Parmryd I., AdlerJ., Patel R., MageeA.I. 2003. Imaging metabolism ofphosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate in T-cell GM1-enriched domains containing ras proteins. Exp. Cell Res. 285: 27-38.

276. ParkK., Lee S., Elliott A. C., Kim J. S., Lee J. H. 2002. Swelling-induced Ca2+ release from intracellular calcium stores in rat submandibular gland acinar cells. J. Membr. Biol. 186: 165-176.

277. Parton, R. G., Joggerst, B., Simons, K. 1994. Regulated internalization of caveolae. J. Cell Biol. 127:1199-1215.

278. Patel, A., Honoré, E., Maingret, F., Lesage, F., Fink, M., Duprat, F., Lazdunski, M. 1998. A mammalian two pore domain mechano-gated S-like K+ channel. EMBO J. 17: 4283-4290.

279. Perozo E., Cortes D. M., Sompornpisut P., Kloda A., Martinac B. 2002. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418: 942-948.

280. Petersen O. W., Hansen S. H., Laursen, I., van Deurs, B. 1989. Effect of insulin on growth and expression of smooth muscle isoactin in human breast gland myoepithelial cells in a chemically defined culture system. Eur. J. Cell Biol. 50: 500509.

281. Petrou S., OrdwayR. W„ Hamilton J. A., Walsh Jr., J. V., Singer J. J. 1994. Structural requirements for charged lipid molecules to directly increase or suppress K+ channels activity in smooth muscle cells. J. Gen. Physiol. 103: 471-486.

282. Piepenhagen P. A., Nelson W. J. 1998. Biogenesis of polarized epithelial cells during kidney development in situ: roles of E-cadherin-mediated cell-cell adhesion and membrane cytoskeleton organization. Mol. Biol. Cell. 9: 3161-3177.

283. Pierce S.K. 2002. Lipid rafts and B-cell activation. Nat. Rev. Immunol. .2: 96-105.

284. Pike L J., 2003. Lipid rafts bringing order to chaos. J. Lipid Res. 44: 655-667.

285. Pike L. J. 2006. Rafts defined. A report on the Keystone Symposium on lipid rafts and cell function. J. Lipid Res. 47: 1597-1598.

286. Pike L. J., Han X., Gross R. W. 2005. EGFR are localized to lipid rafts that contain a balance of inner and outer leaflet lipids: A shotgun lipidomics study. J. Biol. Chem. 280: 26796-26804.

287. Pike L. J. 2009. The challenge of lipid rafts. J. Lipid Res. 50: 323-328.

288. Pochynyuk O., Stockand J. D., Staruschenko A. 2007. Ion channel regulation by Ras, Rho, and Rab small GTPases. Exp. Biol. Med. 232: 1258-1265.

289. Pochynyuk O., Medina J. L., GamperN., Genth H., Stockand J. D., Staruschenko A. 2006. Rapid translocation and insertion of the epithelial Na+ channel in response to RhoA signaling. J. Biol. Chem. 281: 26520-26527.

290. Prat A. G., Bertoreilo A. M., Ausieiio D. A., Cantieiio H. F. 1993. Activation of epithelial Na+ channels by protein kinase A requires actin filaments. Am. J. Physiol. 265: 224233.

291. Prevarskaya N., Zhang L., Barritt G. 2007. TRP channels in cancer. Biochim. Biophys. Acta. 1772: 937-946.

292. Prince L. S., Welsh M. J. 1999. Effect of subunit composition and Liddle's syndrome mutations on biosynthesis of ENaC. Am. J. Physiol. 276: 1346-1351.

293. PulferM., Murphy R. C. 2003. Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrom. Rev. 22: 332-364.

294. Quamme G. A., Dai L. J., Rabkin S. W. 1993. Dynamics of intracellular free Mg2+ changes in a vascular smooth muscle cell line. Am. J. Physiol. 265: 281-288.

295. Remillard C. V., Yuan J. X-J. 2006. Transient receptor potential channels and caveolin-1: good friends in tight spaces. Mol. Pharmacol. 70: 1151-1154.

296. Remmert K., Vullhorst D., Hinssen H. 2000. In vitro refolding of heterodimeric CapZ expressed in E. coli as inclusion body protein. Protein Expr. Purif. 18: 11-19.

297. Ren X. D., Bokoch G. M., Traynor-Kaplan A., Jenkins G. H., Anderson R. A., Schwartz M. A. 1996. Physical association of the small GTPase Rho with a 68-kDa phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase in Swiss 3T3 cells. Mol. Biol. Cell. 7: 435^42.

298. Ribeiro C. M., Reece J., Putney J. W. 1997. Role of the cytoskeleton in calcium signaling in NIH 3T3 cells. An intact cytoskeleton is required for agonist-induced Ca2+.j signaling, but not for capacitative calcium entry. J. Biol. Chem. 272: 2655526561.

299. Ritchie K., lino R., Fujiwara T., Murase K., Kusumi A. 2003. The fence and picket structure of the plasma membrane of live cells as revealed by single molecule techniques. Mol. Membr. Biol. 20: 13-18.

300. Rohlich P., Allison A. C. 1976. Oriented pattern of membrane-associated vesicles in fibroblasts. J. Ultrastruct. Res. 57: 94-103.

301. Romanenko V. G., Fang Y., Byfield F., Travis A. J., Vandenberg C. A., Rothblat G. H., Levitan I. 2004. Cholesterol sensitivity and lipid raft targeting of Kir2.1 channels. Biophys. J. 87: 3850-3861.

302. Romanenko V. G., Rothblat G. H., Levitan I. 2002. Modulation of endothelial inward rectifier K1 current by optical isomers of cholesterol. Biophys. J. 83: 3211-3222.

303. Rossier B. C. 1998. Mechanosensitivity of the Epithelial Sodium channel (ENaC): controversy or pseudocontroversy? J. Gen. Physiol. 112: 95-96.

304. Rotin D., Bar-Sagi D., O'Brodovich H., Merilainen J., Lehto V. P., Canessa C. M., Rossier B. C., Downey G.P. 1994. An SH3 binding region in the epithelial Na+ channel (alpha rENaC) mediates its localization at the apical membrane. EMBO J. 13:4440-4450.

305. RubtsovA. M., Lopina O.D. 2000. Ankyrins. FEBS Lett. 482: 1-5.

306. Ruknudin A., Song M. J., Sachs F. 1991. The ultrastructure of patch-clampedmembranes: a study using high voltage electron microscopy. J Cell Biol. 112: 125134.

307. Ruknudin A., Sachs F., Bustamante J. O. 1993. Stretch-activated ion channels in tissue-cultured chick heart. Am. J. Physiol. 264: 960-972.

308. Rusch A., Kros C. J., Richardson G. P. 1994. Block by amiloride and Its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. J. Physiol. 474: 75-86.

309. Saeki K., Miura Y., Aki D., Kurosaki T.r Yoshimura A. 2003. The B cell specific major raft protein, Raftlin, is necessary for the integrity of lipid raft and BCR signal transduction. EMBO J. 2: 3015-3026.

310. Sachs F., Morris C. E. 1998. Mechanosensitive ion channels in nonspecialized cells. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 132: 1-77.

311. SalzerU., Prohaska R. 2001. Stomatin, flotillin-1, and flotillin-2 are major integral proteins of erythrocyte lipid rafts. Blood. 97: 1141-1143.

312. Sakmann B., NeherE. 1995. Single-Channel Recording. Plenum Press, New York. 700p.

313. Sargiacomo, M., Sudol M., Tang Z., Lisanti M. P. 1993. Signal transducing molecules and glycosyl-phosphatldylinositollinked proteins form a caveolin-rich insoluble complex in MDCK cells. J. Cell Biol. 122: 789-807.

314. SatlinL. M., Sheng S., Craig B. Woda C. B., Kleyman T. 2001. Epithelial Na+ channels are regulated by flow. Am. J. Physiol. 280: 1010-1018.

315. Schafer D. A., Jennings P. B., Cooper J. A. 1996. Dynamics of capping protein and actin assembly in vitro: uncapping barbed ends by polyphosphoinositides. J. Cell Biol. 135:169-179.

316. Schafer D. A., Welch M. D., Machesky L. M., Bridgman P. C., MeyerS. M., Cooper J. A. 1998. Visualization and molecular analysis of actin assembly in living cells. J. Cell Biol. 143: 1919-1930.

317. Scheiffele P., Roth M. G., and Simons K. 1997. Interaction of influenza virus haemagglutinin with sphingolipid-cholesterol membrane domains via its transmembrane domain. EMBO J. 16: 5501-5508.

318. Schild L., Schneeberger E., Gautschi /., FirsovD. 1997. Identification of amino acid residues in the cr, /?, y subunits of the epithelial sodium channel (ENaC) involved in amiloride block and ion permeation. J. Gen. Physiol. 109:15-26.

319. Schwiebert E. M., Mills J. W., Stanton B. A. 1994. Actin-based cytoskeleton regulates a chloride channel and cell volume in renal cortical collecting duct cell line. J. Biol. Chem. 269: 7081-7089.

320. Selden L. A., Estes J. E., Gershman L. C. 1983. The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization. Biochem. Biophys. Res. Commun. 116: 478-485.

321. Semenova S. B., Vassilieva I. O., Fomina A. F., RunovA. L., Negulyaev Y. A. 2009. Endogenous expression of TRPV5 and TRPV6 calcium channels in human leukemia K562 cells. Am. J. Physiol. 296: 1098-1104.

322. Sengupta P., Baird B., Holowka D. 2007. Lipid rafts, fluid/fluid phase separation, and their relevance to plasma membrane structure and function. Semin. Cell Dev Biol. 18: 583-590.

323. Shaul O., Hilgemann D. W., de-Almeida-Engler J., Van Montagu M., Inze D., Galili G. 1999. Cloning and characterization of a novel Mg2+/H+ exchanger. EMBO J. 18: 3973-3980.

324. Shaul P. W., Smart E. J., Robinson L. J., German Z., Yuhanna I. S., Ying Y., G.

325. Anderson R.W., Michel T. 1996. Acylation targets endothelial nitric-oxide synthase to plasmalemmal caveolae. J. Biol. Chem. 271: 6518-6522.

326. Sheetz M. P., SingerS. J. 1974. Biological membranes as bilayer couples. A molecular mechanism of drug-erythrocyte interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71: 44574461.

327. Shenoy-Scaria A. M., Dietzen D. J., Kwong J., Link D. C., Lublin D. M. 1994. Cysteine of Src family protein tyrosine kinases determines palmitoylation and localization in caveolae. J. Cell Biol. 126: 353-363.

328. Sheperd J. T., Mancia G. 1986. Reflex control of the human cardiovascular system. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 105: 3-99.

329. Shin K. S., Park J. Y., Ha D. B., Chung C. H., Kang M. S. 1996. Involvement of KCa channels and stretch-activated channels in calcium influx, triggering membrane fusion of chick embryonic myoblasts. Developm. Biol. 175: 14-23.

330. Shlyonsky V. G., Mies F., Saribian-Sohraby S. 2003. Epithelial sodium channel activity in detergent-resistant membrane microdomains. Am. J. Physiol. 284: 182-188.

331. Shumilina E., Khaitlina S., Morachevskaya E., Negulyaev Y. 2001. Role of actincytoskeieton dynamics in the regulation of non-voltage-gated sodium channels. Mol. Biol. Cell. 12:467a.

332. Shumilina E. V., Khaitlina S. Y., Morachevskaya E. A., Negulyaev Y. A. 2003a. Non-hydrolyzable analog of GTP induces activity of Na+ channels via disassembly of cortical actin cytoskeieton. FEBS Lett. 547: 27-31.

333. Shumilina E. V., Negulyaev Y. A., Morachevskaya E. A., Hinssen H., Khaitlina. S. Y. 2003b. Regulation of sodium channel activity by capping of actin filaments. Mol. Biol. Cell. 14: 1709-1716.

334. Sigurdson W. J., Morris C. E., Brezden B. L., Gardner D. R. 1987. Stretch activation of a K+ channel in molluscan heart cells. J. Exp. Biol. 127: 191-209.

335. Simons K., Ehehalt R. 2002. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest. 110: 597-603.

336. Simons K., Toomre D. 2000. Lipid rafts and signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1: 31-39.

337. Simpson-Holley M., Ellis D„ Fisher D., Elton D., McCauley J., Digard P. 2002. A functional link between the actin cytoskeleton and lipid rafts during budding of filamentous influenza virions. Virology. 301: 212-225.

338. SingerS. J., Nicolson G. L. 1972. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175: 720-731.

339. Small D. L, Morris C. E. 1994. Delayed activation of single mechanosensitive channels in Lymnaea neurons. Am. J. Physiol. 267: 598-606.

340. Small D. L., Morris C. E. 1995. Pore properties of Lymnaea Stagnalis neuron stretch-activated K+ channels. J. Exp. Biol. 198: 1919-1929.

341. Smart, E. J., Graf G. A., McNiven M. A., Sessa W. C., Engelman J. A., SchererP. E., Okamoto T., Lisanti M. P. 1999. Caveolins, liquid-ordered domains, and signal transduction. Mol. Cell. Biol. 19: 7289-7304.

342. Smith P. R., Saccomani G., Joe E. H., Angelides K. J., Benos D. J. 1991. Amiloride-sensitive sodium channel is linked to the cytoskeleton in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 88: 6971-6975.

343. Socabe M., Hasegawa N., Yamamori K. 1993. Blockers and activators for stretch-activated ion channels of chick skeletal muscle. Ann. N. Y. Acad. Sci. 707: 417^421.

344. Sokabe M., Sachs F., Jing Z. Q. 1991. Quantitative video microscopy of patch clamped membranes stress, strain, capacitance, and stretch channel activation. Biophys. J. 59: 722-728.

345. Song, K. S., Li S., Okamoto T„ Quilliam L. A., Sargiacom M., Lisanti M. P. 1996. Co-purification and direct interaction of Ras with caveolin, an integral membrane protein of caveolae microdomains. J. Biol. Chem. 271: 9690-9697.

346. Sonnino S., Mauri L, Chigorno V., Prinetti A. 2006.Gangliosides as components of lipid membrane domains. Glycobiology. 17: 1-13.

347. Spassova M. A., Hewavitharana T., Xu W., SoboloffJ., Gill D. L. 2006. A common mechanism underlies stretch activation and receptor activation of TRPC6 channels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103: 16586-16591.

348. Spudich J. A., Watt S. 1971. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. 1. Biochemical studies of the interactions of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. J. Biol. Chem. 246: 4866-4871.

349. Stahlhut M., van Deurs B. 2000. Identification of filamin as a novel ligand for caveolin-1: evidence for the organization of caveolin-1-associated membrane domains by the actin cytoskeleton. Mol. Biol. Cell. 11: 325-337.

350. Staruschenko A., Adams E., Booth R. E., Stockand J. D. 2005. Epithelial Na+ channel subunit stoichiometry. Biophys. J. 88: 3966-3975.

351. Staruschenko A. V., Negulyaev Y. A., Morachevskaya E. A. 2002. Actin disassembly affects the conductive properties of mechanosensitive channels in leukemia cells. Biophys. J. 82: 270A.

352. Staruschenko A. V., Negulyaev Y. A., Morachevskaya E. A. 2005. Actin cytoskeleton disassembly affects conductive properties of stretch-activated cation channels in leukaemia cells. Biochim. Biophys. Acta. 1669: 53-60.

353. Staruschenko A. V., Negulyaev Y. A., Vedernikova E. A. 2000. Stretch-activated ion channels in human leukemia cells. Neurophysiol. 32:180-181.

354. Staruschenko A. V., Sudarikova A. V., Negulyaev Y. A., Morachevskaya E. A. 2006. Magnesium permeation through mechanosensitive channels: single-current measurements. Cell Res. 16: 723-730.

355. Staruschenko A. V., Vedernikova E. A. 2002. Mechanosensitive cation channels in human leukemia cells: calcium permeation and blocking effect. J. Physiol. 541: 8190.

356. Staub O., Dho S„ Henry P., Correa J., Ishikawa T., McGlade J., Rotin D. 1990. WW domains of Nedd4 bind to the praline-rich PY motifs in the epithelial Na+ channel deleted in Liddle's syndrome. EMBO J. 15: 2371-2380.

357. Suchyna T. M., Besch S. R., Sachs F. 2004. Dynamic regulation of mechanosensitive channels: capacitance used to monitor patch tension in real time, Phys. Biol. 1: 118.

358. Sudarikova A. V., Negulyaev Y. A., Morachevskaya E. A. 2006. Cholesterol depletion affects mechanosensitive channel gating coupled with F-actin rearrangement. Proc. Physiol. Soc. 95-96.

359. Sukharev S. I., Blount P., Martinac B., Blattner F. R., Kung C. 1994. A largeconductance mechanosensitive channel In E. coli encoded by mscL alone. Nature. 368: 265-268.

360. Sukharev S. I., Blount P., Martinac B., Kung C.1997. Mechanosensitive channels of Escherichia coli: the MscL gene, protein, and activities. Annu. Rev. Physiol. 59: 633-657.

361. Suzuki N., Mihashi K. 1991a. Binding mode of cytochalasin B to F-actin is altered by lateral binding of regulatory proteins. J. Biochem. (Tokyo). 109: 19-23.

362. Suzuki N., Mihashi K. 1991b. High-affinity binding of cytochalasin B to the B-end of F-actin loses its inhibitory effect on subunit exchange when the bound nucleotide is ADP. J. Biochem. (Tokyo). 110: 514-519.

363. Takai Y„ Sasaki T., Matozaki T. 2001. Small GTP-binding proteins. Physiol. Rev. 81: 153-208.

364. Taglietti V., Toselli M. 1988. A study of stretch-activated ion channels of frog oocytes: interactions with Ca2+ ions. J. Physiol. 407: 311-328.

365. TardifM., Huang S., Redmond T., Safer D., Pring M., Zigmond S. H. 1995. Actin polymerization induced by GTP gamma S in permeabilized neutrophils is induced and maintained by free barbed ends. J. Biol. Chem. 270: 28075-28083.

366. Taverna E., Saba E., Rowe J., Francolini M., dementi F., Rosa P. 2004. Role of lipid microdomains in P/Q-type calcium channel (Cav 2.1) clustering and function in presynaptic membranes. J. Biol. Chem. 279: 5127-5134.

367. Tavernarakis N., Driscoll M. 2000. Caenorhabditis elegans degenerins and vertebrate ENaC ion channels contain an extracellular domain related to venom neurotoxins. J. Neurogenet. 13: 257-264.

368. TerzicA., Kurachi Y. 1996. Actin microfilament disrupters enhance Katp channel opening in patches from guinea-pig cardiomyocytes. J. Physiol. 492: 395-404.

369. Tolias K. F., Cantley L. C., Carpenter C. L. 1995. Rho family GTPases bind to phosphoinositide kinases. J. Biol. Chem. 270: 17656-17659.

370. TouyzR. M., Schiffrin E. L. 1996. Angiotensin II and vasopressin modulate intracellular free magnesium in vascular smooth muscle cells through Na+-dependent protein kinase C pathways. J. Biol. Chem. 271: 24353-24358.

371. Tskvitaria-Fuller I., Rozelle A. L., Yin H. L, and Wulfing C. 2003. Regulation ofsustained actin dynamics by the TCR and costimulation as a mechanism of receptor localization. J. Immunol. 171: 2287-2295.

372. Tsujikawa H., Song Y., Watanabe M., Masumiya H., Gupte S. A., Ochi R., Okada T. 2008. Cholesterol depletion modulates basal L-type Ca2+ current and abolishes its beta-adrenergic enhancement in ventricular myocytes. Am J. Physiol. 294: 285292.

373. Turoverov K. K., Haitlina S. Y., PinaevG. P. 1976. Ultra-violet fluorescence of actin. Determination of native actin content in actin preparations. FEBS Lett. 62: 4-6.

374. Urbanik E, Ware BR. 1989. Actin filament capping and cleaving activity of cytochalasins B, D, E, and H. Arch. Biochem. Biophys. 269: 181-187.

375. Uittenbogaard A., Everson W. V., Matveev S. V., Smart E. J. 2002. Cholesteryl ester is transported from caveolae to internal membranes as part of a caveolin-annexin II lipid-protein complex. J. Biol. Chem. 277: 4925-4931.

376. Valensin S., Paccani S. R., Ulivieri C., Mercati D., Pacini S., Patrussi L. 2002. F-actin dynamics control segregation of the TCR signaling cascade to clustered lipid rafts. Eur. J. Immunol. 32: 435^146.

377. Van Deurs B., Nilausen K., Faergeman O., MeinertzH. 1982. Coated pits andpinocytosis of cationized ferritin in human skin fibroblasts. Eur. J. Cell Biol. 27: 270278.

378. Vandorpe D. H., Morris C. E. 1992. Stretch-activation of the Aplysia S-channel. J. Membr. Biol. 127: 205-214.

379. Van HailerP. D., Donohoe S., Goodiett D. R., Aebersoid R., Watts J. D. 2001. Mass spectrometric characterization of proteins extracted from Jurkat T cell detergent-resistant membrane domains. Proteomics. 1: 1010-1021.

380. Van Renterghem C, Lazdunski M. 1991. A new non-voltage-dependent, epithelial-like Na+ channel in vascular smooth muscle cells. Pflugers Arch. 419: 401-408.

381. Van Rheenen J., Achame E. M., Janssen H., Caiafat J., Jalink K. 2005. PIP2 signaling in lipid domains: a critical re-evaluation. EMBO J. 24: 1664-1673.

382. Vedernikova E. A., MaximovA. V., Negulyaev Yu. A. 1997. Two types of Na+ -selective channels in human leukemia cells. XXXIII Int. Congr. Physiol. Sci. St. Petersburg. P002.43.

383. Vig M., KinetJ.P. 2007. The long and arduos road to CRAC. Cell Calcium. 42: 157-62.

384. Waldmann R., Champigny G., Bassilana P., Heurteaux C., Lazdunski M. 1997. A proton-gated cation channel involved in acid-sensing. Nature. 386: 173-177.

385. Wang N., Butler J. P., Ingber D. E. 1993. Mechanotransduction across the cell surface and through the sytoskeleton. Science. 260: 1124-1127.

386. Watzl C., Long E. 0.2003. Natural killer cell inhibitory receptors block actincytoskeleton-dependent recruitment of 2B4 (CD244) to lipid rafts. J. Exp. Med. 197: 77-85.

387. Weaver A. K., Olsen M. L., McFerrin M. B., Sontheimer H. 2007. BK channels are linked to inositol 1,4,5-triphosphate receptors via lipid lafts. J. Biol. Chem. 282: 31558-31568.

388. Weiss H., Lang F. 1992. Ion channels activated by swelling of Madin Darby canine kidney (MDCK) cells. J. Membr. Biol. 126: 109-114.

389. Woodhull A. M. 1973. Ionic blockage of sodium channels in nerve. J. Gen. Physiol. 61: 687-708.

390. Wu L., Gao X. 2007. Dual role of the TRPV channel as a sensor of flow and osmolality in renal epithelial cells. Am. J. Physiol. 293: 1699-1713.

391. Wu G., McBride Jr., D. W., Hamill O. P. 1998. Mg2+ block and inward rectification of mechanosensitive channels in Xenopus oocytes. Pflugers Arch. 435: 572-574.

392. Wu Z., Wong K., GlogauerM., Ellen R. P., McCulloch C. A. G. 1999. Regulation of stretch-activated intracellular calcium transients by actin filaments. Biochim. Biophis. Res. Comm. 261: 419^25.

393. Xu X., London E. 2000. The effect of sterol structure on membrane lipid domains reveals how cholesterol can induce lipid domain formation. Biochemistry. 39: 843849.

394. Yamamoto Y., Chen G., Miwa K., Suzuki H. 1992. Permeability and Mg2+ blockade of histamine-operated cation channel in endothelial cells of rat intrapulmonary artery. J. Physiol. 450: 395^08.

395. YangX. C., Sachs F. 1989. Block of stretch-activated ion channels in Xenopus oocytes by gadolinium and calcium ions. Science. 243: 1068-1071.

396. Yarbrough T. L., Lu T., Lee H-C., Shibata E.F. 2002. Localization of cardiac sodium channels in caveolin-rich membrane domains: regulation of sodium current amplitude. Circ. Res. 90: 443-449.

397. Yeh T. H., Herman P., Tsai M. C„ Tran P., Van Den Abbeele T. 1998. A cationicnonselective stretch-activated channel in the Reissner's membrane of the guinea pig cochlea. Am. J. Physiol. 274: 566-576.

398. Zweifach A., Desir G. V., Aronson P. S., Giebisch G. 1992. Inhibition of Ca-activated K+ channels from renal microvillus membrane vesicles by amiloride analogs. J. Membr. Biol. 128: 115-122.

Информация о работе

Морачевская, Елена Алексеевна
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.25

Диссертация

Механизмы регуляции катионных каналов в эукариотической клетке - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы