Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Четвертичная структура и конформационные изменения потенциал-зависимых калиевых каналов Kv2.1 и Kv10.2

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Четвертичная структура и конформационные изменения потенциал-зависимых калиевых каналов Kv2.1 и Kv10.2"

005013490

Гризель Анастасия Владимировна

На правах рукописи

ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА И КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ Ку2Л И Ку10.2

Специальность: 03.01.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 2 (М?

Москва-2011

005013490

Работа выполнена на кафедре биоинженерии Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова.

Научный руководитель:

Соколова Ольга Сергеевна

кандидат биологических наук, доцент

Официальные оппоненты:

Рубцов Александр Михайлович

доктор биологических наук, профессор, зам. декана по научной работе Биологического факультета МГУ им М.В. Ломоносова

Крупянский Юрий Федорович

доктор физико-математических наук, профессор, руководитель лаборатории динамики биополимеров Института химической физики им. H.H. Семенова РАН

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится «19» апреля 2012 г. в 14 ч. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 Биологического факультета Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра Биофизики, «Новая» аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «16» марта 2012 г. Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук С---* М.Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Калиевые потенциал-зависимые каналы (К„) играют важную регуляторную роль в разнообразных клеточных процессах: в функционировании возбудимых клеток, в процессах регуляции апоптоза, клеточной дифференцировки и роста, при выделении нейротрансмиттеров, гормонов, обеспечении сердечной деятельности и других процессах (Wang et al, 1996; Schräder et al., 2002). Нарушение их функционирования приводит к тяжелым наследственным заболеваниям (Wray, 2001) и развитию опухолей, в том числе раковых (Camacho, 2006). Так как функционирование Kv каналов можно регулировать, применяя активаторы или блокаторы, они представляют собой перспективные мишени для лекарственных средств.

Для понимания механизма функционирования ионных каналов, необходимы данные об их пространственной структуре. Зная пространственную структуру, можно детально изучать конформационные перестройки при активации/инактивации канала, в частности, методами молекулярного моделирования (ММ) (Pathak et al., 2007).

К настоящему времени механизм функционирования К„ каналов до конца не известен. Хотя многие гены, кодирующие ДНК Kv каналов, клонированы, четвертичная структура большинства мембранных белков остается неизвестной, так как они с большим трудом поддаются кристаллизации. Внемембранные части белка (как правило, N- и С-концы) осложняют кристаллизацию из-за своей гибкости, поэтому для получения кристаллов белок подвергают транкированию по N- и С-концам. В то же время, объединение подходов просвечивающей электронной микроскопии макромолекул (ПЭММ) и ММ предоставляет уникальную возможность изучать строение полноразмерных каналов, имеющих обширные цитоплазматические части. Это особенно актуально для изучения структур Kv каналов, для которых показана высокая степень гомологии (более 20%) трансмембранных частей и большая вариабельность цитоплазматических участков, которые в основном и отвечают за разнообразие выполняемых

з

функций Kv каналов различных семейств. У каналов Kv10.2 и Kv2.1 цитоплазматическая часть особенно велика (составляет -75% всего белка), и играет ключевую роль в регуляции активационных свойств (Wray, 2009).

Таким образом, получение структурных данных о Kv каналах методом ПЭММ, в особенности о строении их цитоплазматической части, а также изучение конформационных перестроек и роли внутриклеточных доменов в функционировании этих каналов является актуальной задачей биофизики и открывает широкие перспективы для планирования экспериментов по направленному мутагенезу и дизайну новых лекарственных средств.

Цели и задачи исследования. Целью данной диссертационной работы является исследование четвертичной структуры и конформационных изменений эукариотических калиевых потенциал-зависимых каналов Kv2.1 и КД0.2.

Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие основные задачи:

1. Получить трехмерные структуры (3D) транкированных каналов крысы Kv2.1 с помощью метода ПЭММ и определить локализацию их цитоплазматических доменов Kv 2 и СТА;

2. Определить влияние цитоплазматических доменов канала К„2.1 на конформацию его трансмембранного участка;

3. Получить 3D структуру полноразмерного человеческого канала Kv10.2 с помощью метода ПЭММ и определить локализацию его цитоплазматических доменов PAS и cNBD;

4. Определить особенности локализации в цитоплазматической мембране каналов Kv10.2 и Kv 2.1 и выявить роль С-концевых доменов в этом процессе.

Научная новизна и практическая значимость работы. В данной диссертационной работе с помощью метода ПЭММ впервые определены 3D структуры мутантных каналов КУ2.1ДСТА и KV2.1AC с разрешением в 23 Â и 24,5 Â, соответственно. Впервые получена 3D структура Kv канала в закрытой конформации (KV2.1ACTA). На основе 3D реконструкций впервые

4

получены данные о локализации цитоплазматических доменов канала К„2.1, которые играют важную роль в его функционировании. Показано, что цитоплазматический С-конец канала К.,2.1 влияет на конформационые перестройки, происходящие в мембранном домене при активации канала.

Впервые была получена ЗБ структура полноразмерного канала семейства ЕАв (Ку10.2) с разрешением в 34 А.

На живой клеточной культуре была показана кластерная организация каналов Ку2.1 в мембране клетки, а также получены данные о том, что цитоплазматический С-конец канала Ку2.1 выполняет важную роль в поверхностной экспрессии канала. Впервые было показано, что полноразмерный канал К„10.2 образует кластеры на поверхности клеток. В отличие от Ку2.1, кластеры Ку10.2 колокализуются с актиновыми филаментами.

Практическая значимость работы заключается в выяснении структурных особенностей макромолекул Ку каналов, которые до настоящего времени не были подвергнуты кристаллизации, и их атомная структура не расшифрована. Полученные знания в дальнейшем могут быть применены для теоретических исследований в области строения мембранных белков, белок-белковых комплексов, и как структурные предпосылки для моделирования (направленная доставка лекарств, дизайн новых лекарственных средств), а также для практической работы по детекции и анализу наночастиц биологического происхождения.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы изложены в 3 статьях, опубликованных в российских и международных реферируемых научных журналах и одном учебном пособии, подготовленном в соавторстве. Материалы работы были представлены на студенческом симпозиуме по биоинженерии, 2007, 2009, Москва; на научно-практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии», 2007, 2009, Москва; на международной конференции «Ломоносов» 2008, 2010, Москва; на международном конкурсе научных работ молодых ученых в

5

области нанотехнологий, 2008, Москва; на международной конференции «Современные достижения бионаноскопии» (2008, 2009), Москва; на международных курсах «The ЕМВО practical course on cryo-EM and 3D image processing at EMBL», 2009, Лондон, Великобритания; на международных курсах «EMBN Train Advanced Course on 'proteins - production, purification, stabilisation and structures'», 2009, Лидс, Великобритания; EDICT annual General Assembly meeting, 2009, Испания; EDICT annual General Assembly meeting, 2010, Таллин, Эстония; на всероссийском конкурсе научно-исследовательских работ студентов вузов в области нанотехнологий и наноматериалов, 2010, Москва; на виртуальной интернет-конференции «Современные проблемы биохимии и бионанотехнологии», 2010, Казань.

Работе присвоена медаль «За лучшую научную студенческую работу» па всероссийском конкурсе научно-исследовательских работ студентов вузов в области нанотехнологий и наноматериалов 2010 года, Москва.

Исследования частично поддержаны грантом РФФИ (08-04-01348-а) и седьмой рамочной программы Европейского союза - проектом EDICT.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, состоит из Введения, трех глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение) и Выводов. Работа проиллюстрирована 43 рисунками и 3 таблицами. Библиографический указатель содержит 250 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении сформулированы основные цели и задачи исследования, и обоснована его актуальность и практическая важность. Глава 1 представляет собой обзор литературы. Он посвящен современным данным о строении потенциал-зависимых калиевых каналов и их конформационных перестройках, особое внимание уделено строению цитоплазматических частей и их роли в функционировании каналов, а также строению и функциям каналов К„2.1 и Ку10.2, изучаемых в данной работе.

Описание методов, использованных в работе, дано в Главе 2. Полученные результаты и их обсуждение приведены в Главе 3.

Третичная структура калиевых потенциал-зависимых каналов (К,,).

pas"*

Рисунок 1. Схема строения мономера К„ каналов. Трансмембранные сегменты S1-S6, петля "Р", формирующая пору, N- и С-концы подписаны. Сенсор мембранного

потенциала S4 обозначен плюсами. A. Kv2.1. Показаны домены Т1, К„2 и СТА. Б. Kv10.2. Показаны домены PAS и cNBD.

Каждый ген канала К„ кодирует а-субъединицу (Kva). Четыре Kva тетрамеризуются с образованием функционального канала. Трансмембранный домен всех Kv каналов состоит из шести сегментов (S1-S6) (рис.1). Пора формируется участками S5 и S6, а петля между ними образует селективный фильтр (Р). Спирали S1-S4 являются доменом, чувствительным к изменению потенциала. В ответ на деполяризацию мембраны, сенсор мембранного потенциала S4 изменяет свое положение, и канал активируется (Long et al., 2005, 2007). N- и С-концевыс участки расположены в цитоплазме и имеют различное строение у Kv каналов разных семейств. Так, цитоплазматический С-конец у канала Kv2.1 разделен на два домена: Kv2 домен (463-711 а.о.) и СТА (741-853 а.о.), aN-конец содержит Т1 домен (Ju et al., 2003). Внутриклеточная часть канала Kv10.2 содержит PAS

(31-131 а.о.) домен на N-конце и cNBD (551-660 а.о.) домен на С-концевом участке (Bauer et al., 2001) (рис.1).

Экспрессия, выделение и очистка потенциал-зависимых каналов Ку2.1 и КД0.2.

Для проведения структурных исследований мутантные каналы

KV2.1ACTA, KV2.1AC, а также каналы дикого типа Kv2.1 и Kv10.2 были

экспрессированы в эукариотической клеточной линии Vero. У канала

KV2.1ACTA был удален цитоплазматический С-концевой домен СТА (741-

853а.о.), у KV2.1AC полностью отсутствует внутриклеточный С-конец,

включающий Kv2 и СТА домены (рис.1). К С-концу каждого гена через

линкер (12 а.к.) пришита специфическая последовательность - фрагмент 1D4,

используемая для аффинной очистки белка (Oprian et al, 1987).

Рисунок 2. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях

очищенного белка каналов К„2.1 и Kv10.2.

A. KV2.1ACTA. дорожка 1- маркер молекулярных весов белков (MW); 2 - злюция белка с афиннной колонки, 3 - вестерн-блотт клеточного экстракта, 4 - вестерн блотт элюции с аффинной колонки; Б. KV2.1AC. дорожка 1 - MW; 2 - элюция белка с афиннной колонки; 3 - вестерн блотт элюции с аффинной колонки.

B. Kv10.2. Дорожка 1- MW; 2 -элюция белка с афиннной колонки; Г. Kv10.2. Результат вестерн-блотта. 1 - маркер молекулярных весов белков; 2 - элюция белка с аффинной колонки Значения молекулярных весов белков-маркеров подписаны в кДа._

При очистке белка каналов производилось его растворение в детергенте

CHAPS (2,5%), заменяющем липидное окружение белка, и, тем самым, сохраняющим его нативное состояние. Очистка белков каналов производилась на аффинной колонке с моноклональными 1D4 антителами (Sokolova et al, 2001). Элюция проводилась с помощью оригинального 1D4

пептида, имеющего большее сродство к антителам, чем рекомбинантная последовательность.

В результате очистки было получено достаточное количество чистых белков двух мутантных каналов К„2.1 и полноразмерного канала Kv10.2 для изучения их структуры методом ПЭММ (рис.2).

Флуоресцентные тесты каналов, экспрессированных in vitro

Определение корректности фолдинга и уровня экспрессии каналов KJ.1 и КV10.2.

Проверка корректности фолдинга тетрамеров каналов, а также определение эффективности трансфекции и особенностей расположения каналов в цитоплазматической мембране клеток были проведены на живой клеточной культуре с помощью теста на основе флуоресцентно-меченого рекомбинантного блокатора каналов - аджитоксина скорпиона AgTx2 (Карлова и др., 2011). Аджитоксин обратимо связывается с поровой частью только тех молекул калиевых потенциал-зависимых каналов, расположенных в мембране клетки, которые образуют правильный гомотетрамер (MacKinnon et al., 1988). Окраска при этом наблюдается только с внешней стороны клеток. Этим методом было показано, что эффективность трансфекции составляет 50-60%.

Кластеризация Kv каналов в мембране клеток и влияние С-концевых доменов на этот процесс:

Каналы Kv2.1 экспрессируются в виде кластеров на поверхности клеток (Mohapatra and Trimmer, 2006; Tamkun et al., 2007). Согласно предыдущим исследованиям удаление 318 а.о. с С-конца этого канала, содержащих PRC последовательность, приводит к разрушению кластеров (Lim et al., 2000), а делеция последних 396 а.о. С-концевого участка полностью нарушает транспорт каналов в направлении плазмалеммы (Mohapatra et al., 2008).

С использованием живых клеточных культур и флуоресцентно-меченного AgTx2 мы уточнили данные о кластерной локализации каналов Kv2.1 (рис.3). При удалении СТА доменов сохранялась способность канала к

9

образованию кластеров, но их размер уменьшался (рис.4А). При удалении всего С-конца каналы продолжали транспортироваться к поверхности и образовывали кластеры, однако общая площадь кластеров на поверхности клетки достоверно уменьшалась (рис.4Б).

Рисунок 3. Экспрессия белка каналов на поверхности клеток, исследуемая флуоресцентным методом. А-Г. Поверхностное распределение кластеров каналов, связанных с флуоресцентно меченным AgTx-СуЗ А. Полноразмерный канал К„2.1. Б. KV2.1ACTA. В. К„2.1ЛС. Г. К„10.2. N - ядро. Масштабный отрезок -20 мкм. Д-3. Изображения клеток в проходящем свете, соответствующие изображениям А-Г.

Таким образом, наши данные указывают на то, что PRC фрагмент не является единственным детерминантом кластеризации каналов Kv2.1. Уменьшение диаметра кластеров при удалении СТА домена указывает на то, что этот домен участвует в процессе кластеризации. Возможно, он создает конформацию, необходимую для эффективной работы участка PRC.

Ч 0£

05

I 1

— 1

|вКу2.1уИ DKv2.1 dCTA □ Kv2.1 dC j

□ K^lwi CJKv21dCTA EJKv21dC

Рисунок 4. Диаграммы средних значений диаметра кластеров каналов (А) и доли площади клетки, занимаемой кластерами (Б). Столбцы слева-направо: К2.Ш, К„2.1 ДСТА, К„2.1 ДС.

Мы впервые продемонстрировали, что канал Kv10.2 также способен к образованию кластеров в мембране клетки (рис.3 Г,3). Отличительной особенностью кластеров Kv10.2 является то, что они колокализуются с актиновым цитоскелетом, что свидетельствует о том, что эти каналы могут взаимодействовать с актиновыми филаментами в отличие от каналов Kv2.1 (Tamkun et al., 2007). Различия во взаимодействии с актином у каналов Kv2.1 и К„10.2 можно объяснить значительными различиями в строении их цитоплазматических доменов и выполняемых ими функциях. Для исследования структур каналов Kv2.1 и Kv10.2 применялся метод ПЭММ.

Исследование структур каналов KV2.1AC, KV2.1ACTA н КЛ0.2 методом ПЭММ.

Для получения трехмерных структур очищенный белок канала дикого типа K10.2wt, а также мутантных каналов Kv2.1ДСТА и Kv2.1 АС исследовали методом ПЭММ с негативным окрашиванием 1% уранил ацетатом. В результате были получены электронные микрофотографии каналов KV2.1ACTA, Ку2.1ДС и Kv10.2 с увеличением 52 ООО.

При исследовании белков методом ПЭММ в целях минимизации радиационного повреждения используется режим низкой дозы (10е"/А2), вследствие чего возрастает уровень шума. Для его снижения и увеличения сигнала используется суммирование множества одинаковых изображений канала в одно, для чего необходимо получить большое их количество (Boekema et al., 2009). Отбор удачных изображений одиночных каналов Kv2.1 и Ку10.2 проводился вручную с помощью программы Signature (Chen and Grigorieff, 2007). Всего было отобрано 3989 изображений канала KV2.1ACTA, 4042 изображений - KV2.1AC и 1400 изображений Kv10.2. Изображения были отфильтрованы от шума, нормализованы, выровнены (рис. 5(1)) и разбиты на классы с помощью программы IMAGIC (Heel et al., 1996). Каждый класс представляет собой суммированные одинаковые изображения канала, то есть находящиеся в одной ориентации. Классы лучшего качества, включающие большее количество изображений (рис.5(2)), использовались для расчета

11

начальной трехмерной структуры с помощью угловой реконструкции (Heel, 1987).

Затем были получены 2D проекции начальной трехмерной структуры (обратные проекции) (рис.5(3)), которые используются для улучшения классификации частиц, выступая в качестве образцов при новом разбиении всего массива частиц на классы. Всего было проведено по 10 итеративных циклов для канала KV2.1AC и Kv10.2 и 27 для КД1ДСТА. Предварительные 3D реконструкции каналов представлены на рис. 5(4).

Ф- йл 1 ш I л.. Л Ш r.v, ¡.TPfSfi оу?

Д- С' 0 Г\ ш^щМ С шв** ч- к '•-г-: ЩЩ ш

, N 6 < в CD 3. О щ & m pti © ё

Ц Q

А. Б. В.

Рисунок 5. Процесс обработки изображений каналов К„2.14С (А), КУ2.1ДСТА (Б) и Kv10.2 (В). 1. Выбранные изображения каналов, отфильтрованные от шума; 2. Некоторые классы, использованные при расчете трехмерной реконструкции каналов; 3. Обратные проекции трехмерной структуры, находящиеся в той же ориентации, что и классы на рисунке (2); 4. 3D структура каналов. Масштабный отрезок равен 10 нм

В дальнейшем 3D структура была улучшена с помощью программы FREALIGN (Grigorieff, 2007): сначала 3D структуры были скорректированы согласно частотно-контрастной характеристике (CTF) электронного микроскопа, а затем было произведено их улучшение путем систематического поиска и улучшения углов Эйлера в Фурье-пространстве. Финальные 3D структуры представлены на рис 7 (Kv2.1) и рис. 11 (Kv10.2).

Разрешение полученных трехмерных структур каналов KV2.1AC, Kv2.1АСТА и Kv10.2 вычислялось с помощью коэффициента объемной корреляции Фурье (FSC) (Harauz and Heel, 1988) (рис.6). В результате были получены следующие значения: Kv2.1ACTA-22,7 A, Kv2.1AC-24,5 А, и Kv10.2 - 34,2 А.

Пространственная частота (1/А)

Рисунок 6. Определение разрешения структур каналов К„2.1ДСТА, КУ2.1ДС и Kv10.2. График зависимости коэффициента объемной корреляции Фурье (FCS) от пространственной частоты для каналов К„2.1ДСТА (мелкий пунктир), KV2.1AC (крупный пунктир) и К„10.2 (сплошная кривая). Итоговое разрешение структур, находится как величина, обратная пространственной частоте при которой коэффициент FSC равен 0,5.

3D структуры мутантных каналов KV2.IAC и Kv2.1ЛСТА:

3D структура канала с удаленным С-концом (KV2.1AC) имеет пирамидальную форму. Ее можно разделить на две части: большую (~80А) и меньшую (~50А), которые разделяются резким сужением канала в центральной части (~40А) (рис.7А). 3D структура канала KV2.1ACTA имеет размеры: длина ~80А, ширина в верхней части канала ~80А, в нижней части ~35А, в средней части канал имеет диаметр ~65А (рис.7В).

Верхняя часть 3D структур обоих мутантных каналов Kv2.1 плоская, она структурно гомологична мембранной части полноразмерного человеческого канала Kv2.1 (рис. 12A) (Adair et al, 2008). При этом она отличается от мембранной части канала Shaker (Sokolova et al., 2001), которая имеет колоколообразный выступ на внеклеточной поверхности (рис. 7Б), исчезающий при экспериментальном дегликозилировании. Известно, что у

канала Kv2.1 N-гликозилирование отсутствует (Shi and Trimmer, 1999).

IB

Исходя из вышесказанного, можно сделать вывод, что верхняя часть 3D структур Kv2.1 является трансмембранной. Этот вывод подтверждают результаты докинга кристаллической структуры канала Kv1.2 (Long et al., 2005) в полученную электронную плотность (рис.8). Мембранно-связанный домен канала Kv1.2 соответствует по размерам верхней части обеих 3D реконструкций (для KV2.1AC R=0,88; для KV2.1ACTA R=0,9).

Рисунок 7. Финальные 3D структуры каналов: А. К„2.1ЛС Б. 3D структура канала Shaker (Sokolova et al., 2001). Белой стрелкой показаны «окна». Серой стрелкой показан выступ мембранной части, образованный гликозилированием. В. К„2.1ДСТА. Слева направо: две боковые ориентации, вид на канал с цитоплазматической стороны. Масштабный отрезок -10 нм

Нижняя часть 3D структур каналов KV2.1AC и KV2.1ACTA (рис.7), соответственно, представляет собой цитоплазматический домен. Цитоплазматический домен канала KV2.1AC (рис. 7А) обладает небольшими размерами и имеет четыре выступа, повернутые относительно мембранной части канала на 45°. Докинг кристаллической структуры канала Kv1.2 (Long et al., 2005) показал, что эти выступы по объему соответствуют тетрамеру N-концевых Т1 доменов (рис.8А) (R=0,98). В более ранних работах (Mohapatra et al., 2008) было показано, что домен Т1 канала Kv2.1 в своей нижней части имеет специфичный для семейства Kv2 мотив, который регулирует взаимодействие с С-концом канала Kv2.1 и его экспрессию на поверхности клетки. Этот мотив представляет собой дополнительную петлю (55-71 а.о.), наличие которой было предсказано методом моделирования по гомологии (Ju

В

А

et al., 2003; Mohapatra et al., 2008). На полученной нами структуре канала KV2.1AC, в нижней части домена Т1 находится дополнительный выступ, отсутствующий у канала Kvl.l (Sokolova et al., 2001) (рис.7Б), который вероятно образован данной петлей (стрелка на рис.8А).

Рисунок 8. Докинг структуры канала К„1.2 (Long et al., 2005) (показана спиралями) в трехмерные структуры каналов КУ2.1ЛС (А) и К„2.1 ACTA (Б). Стрелкой показана оптическая плотность, занимаемая Т1 петлей

Цитоплазматическая часть канала KV2.1ACTA отличается от Kv2.1 АС массивными выступами в нижней части канала (рис.7В); они повернуты относительно мембранной части на 60". В результате докинга кристаллической структуры канала Kv1.2 (Long et al., 2005) большая часть цитоплазматической части вокруг Т1 домена остается свободной (рис.8Б). Следовательно, есть все предпосылки считать, что она занята С-концевым доменом Ку2, присутствующим в KV2.1ACTA.

м Рисунок 9. Ю структура К„2.1ДС е (светло-серая) с наложенной разностной " структурой (показана темно-серой), р Серые стрелки указывают на Ку2 домены, черные стрелки указывают на а разность мембранной части мутантных каналов.

Для проверки этой гипотезы мы сравнили две полученные 30 структуры между собой, путем вычитания трехмерной модели КУ2.1ДС из модели КУ2.1ДСТА с помощью программы 1МАС1С (рис.9). Объем и масса разностных пиков (около 30 кДа каждый) достаточна для помещения 250 а.о., соответствующих домену Ку2. При сравнении структур транкированных Ку2.1 каналов со структурой полноразмерного человеческого Ку2.1 канала

(Adair et al, 2008), видно, что у обоих мутантных каналов отсутствует массивная нижняя часть, очевидно, являющаяся СТА доменом (рис.12).

Таким образом, полученные нами электронно-микроскопическое данные о строении мутантных каналов Kv2.1 подтверждают гипотезу, высказанную ранее на основе физиолого-биохимических экспериментов (Ju et al., 2003) о том, что в 3D структуре канала Kv2.1 обширные цитоплазматические С-концевые домены Kv2 и СТА частично окружают N-концевой Т1 домен. Мы показали, что при этом четыре домена Kv2 расположены по бокам Т1 домена, а СТА-домены занимают дистальную часть цитоплазматического домена.

3D структура канала К J 0,2:

3D структура канала Kv10.2wt имеет трапециевидную форму с высотой -95Á, шириной в верхней части канала -100 Á, в нижней части -120 Á, в средней части имеется небольшое сужение до ~90 Á (рис.10).

Верхняя часть канала, в отличие от KV2.1ACTA и KV2.1AC, не плоская, а имеет куполообразный выступ диаметром ~30 Á, который может являться результатом iV-гликозилирования белка. Данную гипотезу подтверждает наличие сходного выступа на поверхности мембранного домена N-гликозилированного канала Shaker (Sokolova et al.,2001) (рис.7Б).

Рисунок 10. ЗР реконструкция канала К„10.2. Показаны два боковых вида (отличающиеся друг от друга поворотом на 90'), а также вид сверху (с внеклеточной стороны). Масштабный отрезок равен 10 нм. М - трансмембранный домен; Р и Э - цитоплазматические домены; О - окно.

Для интерпретации полученной 30 структуры канала использовался докинг молекулярной модели мембранной части КД0.2 (Соколова и др., 2012), рассчитанной по гомологии с кристаллической структурой

90°

90'

М

бактериального канала MlotiKl (Clayton et al., 2008). Моделирование проводилось нашими коллегами с каф. биоинженерии биологического ф-та МГУ. Полученная модель трансмембранного домена хорошо соответствует по размерам верхней части полученной реконструкции Kv10.2 (рис.11А), выступы которой имеют крестообразную форму со слегка закрученными лопастями (R=0,62). Таким образом, верхняя часть модели, скорее всего, является трансмембранной, а нижняя часть - цитоплазматической. Обширная цитоплазматическая часть структурно подразделяется на субдоменьг «Р» и «D», которые, видимо, сформированы N- и С-концевыми доменами (рис.10).

В отличие от трехмерных структур каналов Kv2.1, верхнюю и нижнюю части канала Kv10.2 разделяют линкеры, которые ограничивают характерные для большинства Kv каналов «окна». Размеры «окон» в нашей модели составляют около 0.25 х 0.3 нм2, что согласуется с данными, полученными ранее для канала Shaker (Sokolova et al., 2001).

Kyl0.2: Расположение цитоплазматических доменов.

Для определения локализации цитоплазматических доменов канала Kv10.2 мы проводили докинг моделей N- и С-концевых доменов Kv10.2, построенных по гомологии с моделями других ионных каналов (рис.11).

Для построения модели //-концевого домена PAS в качестве шаблона была выбрана структура гомологичного домена Kv канала человека hErg (Kvll). Для построения модели С-концевого cNBD-домена была использована кристаллическая структура человеческого сАМР-зависимого канала HCN4. Докинг модели тетрамера cNBD привел к результатам, не согласующимся с полученной реконструкцией (R=0,1) (рис. 11В). Однако, перемещая отдельные мономеры cNBD в направлении, указанном стрелками на рис 11В, их можно встроить в область субдоменов «D». В пользу этого варианта свидетельствует относительное соответствие объемов субдоменов и мономеров cNBD (R=0,89) (рис. 11Г). Докинг модели jV-концевых доменов (PAS) в область субдоменов «Р» позволил разместить эти домены дальше от

центральной оси канала, в непосредственном контакте с С-концевыми доменами (11=0,89) (рис. 11 Д, Е) (Соколова и др., 2012).

cNBD

мв_ PAS cNBD cNBD

Рисунок 11. Интерпретация реконструкции канала Kv10.2. А. Докинг смоделированного

трансмембранного домена в верхнюю часть реконструкции канала Kv10.2; Б. Вид сбоку: ТМ -трансмембранный домен; В. вид снизу: докинг тетрамера cNBD доменов, моделированного по гомологии с кристаллической структурой человеческого цАМФ-зависимого канала HCN4 (PDB ID: 30TF); Г. вид снизу: докинг cNBD доменов (красный) в область субдоменов «Р»; Д. Вид сбоку: докинг доменов PAS (голубой) и cNBD (красный) в

цитоплазматическую часть. ТМ -трансмембранный домен; Е. Вид снизу, обозначения, как на рис. 5Д.

Таким образом, в данной работе при сочетании методов электронной

микроскопии и молекулярного моделирования была впервые определена

локализация цитоплазматических доменов канала Kv10.2. Выявленное

расположение цитоплазматических доменов PAS и cNBD соответствует

современным данным об их строении и функционировании. Как и было

предсказано (Stevens and Wray, 2009) домены PAS и cNBD тесно

объединены, образуя олигомерную структуру, способствующую их

взаимодействию, при этом домены cNBD не располагаются в центре канала,

как предполагалось ранее, а находятся на его периферии.

Роль С-концевых цитоплазматических доменов в активации канала

В предыдущих исследованиях было продемонстрировано, что активация

Kv каналов регулируется посредством цитоплазматических N- и С-концов (Ju

et al. 2003). Удаление N-концевого участка приводит к значительному

18

снижению скорости активации и сдвигу порога активации в сторону деполяризации на 30 мВ. Удаление С-конца канала приводит к увеличению скорости активации канала и гиперполяризационному сдвигу порога активации (VanDogen е1 а1., 1990). Во время деполяризации Ку2.1 С-конец перемещается к периферии белка параллельно плоскости мембраны на расстояние 1-2 нм (КоЬппБку е1 а1., 2006).

СТА ) СТА СТА

А. ^ Б. В.

Рисунок 12. Сравнение 3D структур каналов К„2.1. А. 3D структура полноразмерного канала Kv2.1 (Adair et al., 2008). Б. 3D структура канала К„2.1ДСТА. В. 3D структура канала Ки2.1ДС. Цитоплазматические домены СТА, Т1 и Kv2 отмечены. М1, М2, МЗ, М4- субдомены мембранного домена.

Для того чтобы установить, как изменения, происходящие в цитоплазматической части отражаются на строении мембранного участка мы сравнили структуры мутантных каналов К„2.1ЛС и KV2.1ACTA между собой и со структурой полноразмерного канала Kv2.1 (Adair et al., 2008) (рис.12).

Мембранная часть всех приведенных на рис. 12 каналов содержит характерные структурные элементы (субдомены М1-М4). Расположение субдоменов М1,МЗ и М4 схоже у всех трех структур, а локализация субдомена М2 заметно меняется (движение -10Á). Возможно, такая разница положений субдоменов связана с изменением активационного состояния канала при удалении С-концевых доменов.

Для проверки этого предположения мы сравнили полученные 3D реконструкции мутантных каналов с моделями трансмембранной части канала Kv2.1 в открытой (Kv2. lopen) и закрытой (Kv2.1closed) конформациях. Молекулярные модели были получены коллегами из

лаборатории молекулярного моделирования каф. биоинженерии биологического ф-та МГУ.

В качестве шаблона для моделирования были использованы модели открытого и закрытого состояний канала К„1.2 (Нап е! а1., 2008), основанные на модели активации (РаЛак й а1., 2007). Согласно этой модели наибольшие движения при активации канала совершают спирали 83-84, верхние части которых движутся вместе в направлении к периферии канала (рис.13).

Рисунок 13. Модели канала К72.1 в закрытом (А) и открытом (Б) состоянии, вид сверху. Структуры моделей представлены в виде спиралей, а также показана сгенерированная с разрешением в 20А 30 поверхность. Петля 33-84 подписана.

закрытый канал

КУ2.1ДС

Рисунок 14. Сравнение моделей Ку2.1с1озе и Кч2.1ореп (Зй структуры с разрешением 20А) со структурами каналов К„2.1ДСТА и К„2.1ДС. А. Сверху -модель Ку2.1с1озе (голубая). Снизу - канал КУ2.1ДСТА (синий). Б. Сверху - модель К„2.1ореп (светло-зеленая). Снизу - канал КУ2.1ДС (темно-зеленый). Обозначены субдомены М1-М4. Черная стрелка показывает направление движения субдомена М2 (спирали 33-34).

Сравнение молекулярных моделей с мембранной частью мутантных каналов показало высокий уровень сходства (рис.14). У ЗБ структур и

соответствующих моделей совпадает расположение субдоменов М1-М4. Докинг показал лучшее соответствие модели К,,2.1ореп со структурой Kv2.1ДС (R=0,95), a Kv2.1close с KV2.1ACTA (R=0,95), чем структуры Kv1.2 (Long et al, 2005): R=0,88 при докинге в Kv2.1AC; R=0,9 при докинге в КУ2.1ДСТА.

Гипотеза конформационных изменений потенциал-зависимого канала при активации: Наши исследования структуры Kv каналов, в сочетании с данными мировой литературы позволили создать модель конформационных изменений цитоплазматических доменов потенциал-зависимого канала при активации (рис.15) (Pischalnikova et al., 2009).

Рисунок 15. Схема конформационных изменений в Kv каналах при активации. 3D схема субъединицы К„ канала в "закрытой" конформации. Спирали S1-S6, и петля S4-S5, показаны цилиндрами. Спираль S3 разделена на две: S3a и S3b (как в Jiang et al., 2003). Символами "+" обозначены заряженные а.о. в спирали S4. N-концевой Стрелочки указывают направления движения спиралей. В рамке-кристаллическая структура мономера химерного канала Kv1.2/Kv2.1 в открытой конформации (Long et al., 2007). Стрелка показывает направление движения ионов в поре канала. (Pishalnikova and SokolovaJ?009)______

Открытие поры

Согласно последним данным, при активации канала наибольшие движения в мембранной части происходят в спиралях 83-84, которые движутся к периферии канала, оказывая воздействие на 84-85 линкер, который тянет спираль Э5 в сторону от оси поры. Спирали 85 формируют

"манжету" на периферии спиралей S6, и возможно, что при расширении "манжеты" спиралей S5 спирали S6 следуют за ними наружу, открывая пору (Yellen 2002; Long et al. 2005a, b, Pathak et al., 2007). Так как сегмент S6 участвует в открытии и закрытии ворот канала, С-конец, напрямую с ним связанный, может влиять на этот процесс (Long et al., 2005) (стрелочка 7) (Kobrinsky et al. 2006; Wray 2008). Действительно, было показано, что при активации канала С-конец канала Kv2.1 движется в том же направлении (к периферии), что и сегмент S6 (рис.15).

Эта гипотеза подтверждается нашими данными ПЭММ. Субдомен М2 включает верхнюю часть спиралей S3-S4, совершающую наибольшие движения (Pathak et al., 2007). У канала в открытом состоянии он располагается на периферии белка, а при закрытии смещается внутрь (рис.14). Удаление С-концевых доменов приводит к конформационным изменениям в мембранной части каналов, что является выражением изменения активационного состояния канала.

ВЫВОДЫ

1. Определена 3D структура С-концевых мутантов крысиного канала К„2.1 - КУ2.1ДСТА и КУ2.1ДС с разрешением в 23Â и 24,2Â соответственно. Локализованы цитоплазматические домены канала Kv2.1: С-концевые домены Kv2 и СТА окружают N-концевой Т1 домен, домены Kv2 расположены по бокам Tl, а СТА-домены занимают дистальную часть цитоплазматического домена.

2. Получены структурные доказательства того, что цитоплазматический С-конец принимает участие в изменении активационного состояния канала Kv2.1.

3. Определена 3D структура полноразмерного человеческого канала Kv10.2 с разрешением в 34,2 Â и выявлена локализация его цитоплазматических доменов. Домены PAS и cNBD образуют структуру по

типу «висящей гондолы». Домены cNBD находятся на периферии цитоплазматической части канала, ниже доменов PAS.

4. На живой клеточной культуре была показана кластерная организация каналов Kv2,l. Цитоплазматический С-конец канала Kv2.1 выполняет функции вспомогательной субъединицы и участвует в поверхностной экспрессии канала. Показана кластерная организация канала К„10. Кластеры Kv10.2 колокализуются с актиновыми филаментами.

5. Выдвинута гипотеза, объясняющая конформационные изменения доменов потенциал-зависимого калиевого канала при переходе из закрытого состояния в открытое.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи и учебные пособия:

1. Pischalnikova A.V.. Sokolova O.S. The domain and conformational organization in potassium voltage-gated ion channels.// Journal of Neuroimmune Pharmacology, 2009. V.4(l). P. 71-82

2. М.Г.Карлова, А.В.Пищальникова. А.А.Рамонова, M. М. Мойсенович, О. С. Соколова, К. В. Шайтан. Тест-система для изучения фолдинга калиевых потенциал-зависимых каналов, экспрессируемых in vitro. Биофизика, 2011, т.56, вып.2, стр 272-2

3. О.С.Соколова, К.В.Шайтан, А.В.Гризель. А.В.Попинако, М.Г.Карлова, М.П.Кирпичников. 3D структура человеческого канала Kv10.2 по данным электронной микроскопии макромолекул. Биофизика, 2012, №2, стр. 1-8.

4. О.С.Соколова, А.Г.Богданов, А.В. Гризель. Учебно-методический комплекс для магистров по дисциплине - Электронная микроскопия нанобиообъектов. - М.: НОУДПО «Институт АйТи», 2011.

Тезисы конференций:

5. Пищальникова А.В. Четвертичная структура человеческого калиевого канала с удаленным цитоплазматическим доменом по данным электронной микроскопии. // Тезисы докладов второго студенческого симпозиума по

23

биоинженерии 21 октября 2007. - М .: изд-во Биологического ф-та МГУ, 2007.-с.21-23

6. Пищальникова A.B. 3D структура человеческого калиевого канала KV2.1AC по данным электронной микроскопии. // Перспективы развития инноваций в биологии. Материалы научно-практической конференции в рамках международной научно-образовательной школы-конференции по биоинженерии и приложениям 23 ноября 2007 года. - М.: Изд-во «Инноватика», 2007. - с.63-64

7. Пищальникова A.B. Трёхмерная структура калиевого канала Kv2.1 АС. // Материалы докладов XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». - М.: Издательский центр Факультета журналистики МГУ им. М.В. Ломоносова, 2008. - с. 20

8. Пищальникова А.В, Соколова О.С. Локализация С-концевых цитоплазматических доменов человеческого канала Kv2.1. // Сборник тезисов докладов Международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехнологий. - М.: Роснано, 2008. -с.493-494

9. Пищальникова A.B., Соколова О.С. Локализация цитоплазматических доменов человеческого канала Kv2.1. // Сборник тезисов. Первая международная конференция 17-19 июня 2008 г. Современные достижения бионаноскопии.- М.: изд-во Физического факультета МГУ, 2008. - с.45

10. Карлова М.Г., Пищальникова A.B.. Рамонова A.A., Мойсенович М.М., Соколова О.С. In-vitro флуоресцентный тест на правильность фолдинга калиевого потенциал-зависимого канала // Сборник тезисов. Вторая международная конференция 16-18 июня 2009 г. Современные достижения бионаноскопии. - М.: изд-во Физического факультета МГУ, 2009. - с.ЗО

11. Пищальникова A.B., Карлова М.Г., Рамонова А.А, Мойсенович М.М., Соколова О.С. Разработка флуоресцентного теста in-vitro на правильность фолдинга калиевых потенциал-зависимых каналов // Тезисы докладов четвертого студенческого симпозиума по биоинженерии 30 октября 2009. -

М.: изд-во Биологического фак-та МГУ, 2009. - с.45-48.

24

12. Пищальникова А.В., Карлова М.Г., Рамонова А.А, Мойсенович М.М., Соколова О.С. Флуоресцентный метод скрининга лигандов калиевых потенциал-зависимых каналов // Перспективы развития инноваций в биологии: Материалы III научно-практической конференции, 11-13 ноября

2009 г., Москва, МГУ имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет. -М.: МАКС пресс, 2009. - с. 134 - 135.

13. Пищальникова А.В. Получение потенциал-зависимого калиевого канала Heag2 для исследования методом электронной микроскопии. // Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2010». - М.: МАКС Пресс, 2010. - с. 34

14. Пищальникова А.В., Соколова О.С. Получение потенциал-зависимого калиевого канала Heag2 для структурных исследований. // Современные проблемы биохимии и биохимии и бионанотехнологии. Сборник трудов Всероссийской Виртуальной Интернет-конференции. Казань, 17-22 Ноября

2010 г. - Казань. Издательство Казанского Университета с. 129 - 131.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ а.о. - аминокислотный остаток ММ - молекулярное моделирование ПААГ - полиакриламидный гель

ПЭММ - просвечивающая электронная микроскопия макромолекул

CTF - частотно-контрастная функция электронного микроскопа (contrast-

transfer function)

FSC - коэффициент объемной корреляции Фурье Kv — потенциал-зависимые калиевые каналы

Подписано в печать 13.03.2012 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 1189 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гризель, Анастасия Владимировна, Москва

61 12-3/741

Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова

На правах рукописи Гризель Анастасия Владимировна

ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА И КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ Ку2.1 И КУ10.2

специальность 03.01.02 - Биофизика

Научный руководитель кандидат биологических наук Соколова Ольга Сергеевна

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2012 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................5

ГЛАВА I. СТРОЕНИЕ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ, ИХ КОНФОРМАЦИОННЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ И РОЛЬ

ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ДОМЕНОВ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)....................................................................................................................Ю

1.1 Общее строение Kv каналов..................................................................................14

1.2 Конформационные перестройки, происходящие при активировании Kv каналов.............................................................................................................................17

1.3 Особенности строения и функционирования некоторых типов потенциал-зависимых калиевых каналов.........................................................................................25

1.3.1 Канал Kv2.1:........................................................................................................28

1.3.2 Канал Kvl0.2:......................................................................................................42

1.4 Метод электронной микроскопии макромолекул...............................................47

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...........................................................................55

2.1 Материалы..............................................................................................................55

2.1.1 Стандартные растворы...................................................................................55

2.1.2 Среды...................................................................................................................55

2.1.3 Вектор, штаммы и эукариотические клеточные линии, использованные в работе.............................................................................................................................55

2.1.4 Маркеры размера и молекулярной массы........................................................56

2.2.1 Наработка плазмид pMT3-Kv2.1АСТА, pMT3-Kv2.1АС иpMT3-Kv10.2.........57

2.2.2 Выделение плазмидpMT3-Kv2.1ACTA, pMT3-Kv2.1AC иpMT3-Kv10.2..........57

2.2.3 Рестрикция векторовpMT3-Kv2.1ACTA, pMT3-Kv2.1AC иpMT3-Kv10.2.....58

2.2.4 Аналитический электрофорез плазмидной ДНК в агарозном геле...............58

2.2.6 Временная трансфекция эукариотических клеточных линий

трансфецирующим агентом - Metafecten™PRO «Biontex» (Германия)..................58

2.2.7 Условия культивирования эукариотических клеточных линий.....................59

2.2.8 Приготовление аффинной колонки с 1D4 антителами.................................60

2.2.9 Очистка каналов Kv2.1АС, Kv2.1АСТА и Kvl0.2.............................................61

2.2.10 Электрофорез в ПААГ...................................................................................62

2.2.11 Окраска белковых гелей серебром................................................................62

2.2.12 Вестерн блоттинг.........................................................................................63

2.2.13 Получение флуоресцентно-меченого аджитоксина 2 для тестирования экспрессии каналов.........................................................................................................65

2.2.14 Определение особенностей локализации каналов в мембране клеток методом конфокальной микроскопии..........................................................................66

2.2.14 Измерение параметров кластеров каналов в мембране клеток...............67

2.2.15 Приготовление образцов для электронной микроскопии...........................68

2.2.16 Условия проведения ЭМ эксперимента........................................................68

2.2.17 Компьютерная обработка изображений канала.......................................69

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..............................................................73

3.1 Экспрессия потенциал-зависимых каналов Kv2.1 и Kvl0.2................................73

3.2 Флуоресцентные тесты экспрессированных каналов.......................................76

3.2.1 Определение корректности фолдинга и эффективности трансфекции каналов Kv2.1 и Kvl0.2...................................................................................................76

3.2.2 Растеризация Kv2 каналов в мембране клеток и влияние С-концевых доменов на этот прогресс:.............................................................................................77

3.3 Выделение и очистка потенциал-зависимых каналов Kv2.1 и Kvl0.2..............83

3.4 Исследование структур каналов Kv2.1AC, Kv2.1АСТА и Kvl0.2 методом ПЭММ..............................................................................................................................86

3.4.1 Получение трехмерных структур каналов Kv2.lA.CTA, Kv2.1AC и Kvl0.2.. 86

3.4.2 Трехмерные структуры мутантных каналов Kv2.1АСТА и Kv2.1АС..........89

3.4.3 Трехмерная структура канала Kvl0.2:............................................................97

3.4.4 Kv2.1: Роль С-концевых цитоплазматических доменов в активации канала 104

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................................................................112

ВЫВОДЫ.............................................................................................................................114

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ......................................................115

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотный остаток

ИЮПАК - IUPAC - международный союз теоретической и прикладной химии

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

ММ - молекулярное моделирование

МРА — мульти-рефересный анализ

МСА — многомерный статистический анализ

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразно-цепная реакция

ПЭММ - просвечивающая электронная микроскопия макромолекул

РСА - рентгеноструктурный анализ

ЭМ - электронная микроскопия

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЯМР - ядерно-магнитный резонанс

cNBD - cyclic nucleotide-binding domain - домен, связывающий циклические нуклеотиды

CTF — contrast-transfer function - частотно-контрастная характеристика электронного микроскопа

СТА - C-terminal activation domain - С-концевой активацонный домен

FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer - метод резонансного переноса энергии

флуоресценции

FSC - коэффициент объемной корреляции Фурье

GFP - green fluorescent protein - зеленый флуоресцентный белок

HCN - hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel - канал активируемый гиперполяризацией и открываемый циклическими нуклеотидами

HGNC - Hugo (Human Genome Organization) Gene Nomenclature Committee - комитет no генной номенклатуре организации по геному человека Kv - потенциал-зависимые калиевые каналы PD - pore domain - поровый домен

VSD - voltage sensing domain - домен чувствительный к потенциалу WT -wild type - дикий тип

ВВЕДЕНИЕ

Мембранные белки составляют около 30% всех белков организма, при этом около половины из них - это белки-переносчики и ионные каналы. Калиевые ионные каналы представляют собой самый большой, разнообразный и чрезвычайно широко распространённый класс мембранных белков, в котором семейство потенциал-зависимых калиевых каналов формирует наибольшее семейство.

Калиевые потенциал-зависимые каналы (Kv) играют важную регуляторную роль в разнообразных клеточных процессах: в функционировании возбудимых клеток, (Hoshi et al., 1990; Yellen, 2002), в процессах регуляции апоптоза (Pal et al., 2003), клеточной дифференцировки и роста (Deutsch and Chen, 1993), при выделении нейротрансмиттеров (Singer-Lahat et al., 2008), гормонов (MacDonald and Wheeler, 2003; Kim et al., 2005), обеспечении сердечной деятельности (Wang et al, 1996) и других процессах (Gulledge and Kampa, 2005; Schräder et al., 2002). Нарушение их функционирования приводит к различным тяжелым наследственным заболеваниям и развитию опухолей, в том числе раковых (Camacho, 2006). Причем, список болезней, вызываемых мутациями в Kv каналов, постоянно растет. Так как функционирование потенциал-зависимых калиевых каналов можно регулировать, применяя различные активаторы и/или блокаторы, они представляют собой перспективные мишени для лекарственных средств.

Для понимания механизма функционирования ионных каналов необходимы данные об их пространственной структуре. Зная пространственную структуру, можно детально изучать конформационные перестройки при активации/инактивации канала, в частности методами молекулярного моделирования (ММ) (Pathak et al., 2007).

К настоящему времени клонированы многие гены, кодирующие ДНК ионных каналов эукариотического происхождения, а также их бактериальных аналогов. Однако четвертичная структура большинства мембранных белков остается неизвестной, так как они с большим трудом поддаются кристаллизации. Исследователям удалось расшифровать атомную структуру для нескольких прокариотических (например, (Doyle et al., 1998; Kuo et al., 2003)) и эукариотических каналов (Long et al., 2005; Miyazawa et al., 2003; Kawate et al., 2009; Tao et al., 2009; Ujwal et al., 2008; Jasti et al., 2007). Внемембранные части белка (как правило, N- и С-концы) осложняют кристаллизацию из-за своей гибкости, поэтому для получения кристаллов часто используют белок, не имеющий массивных цитоплазматических доменов (как в работах (Doyle et al., 1998;

Ujwal et al., 2008)), либо подвергают его транкированию по N- и С-концам (как в работе (Jasti et al., 2007)). В то же время, объединение подходов просвечивающей электронной микроскопии макромолекул (ПЭММ) и молекулярного моделирования предоставляет уникальную возможность изучать строение полноразмерных каналов, имеющих обширные цитоплазматические части. Это особенно актуально для изучения структур потенциал-зависимых калиевых каналов, для которых показана высокая степень гомологии трансмембранных частей и огромная вариабельность цитоплазматических участков, которые отвечают за разнообразие выполняемых функций Kv каналов разных семейств. У каналов Kvl0.2 и Kv2.1 цитоплазматическая часть особенно велика, и составляет около 75% всего белка (Wray, 2009).

Потенциал-зависимый канал Kv2.1 (Albrecht et al., 1993) представляет большой интерес для исследования, в связи с тем, что он широко распространен в центральной нервной системе человека, в основном в составе постсинаптических мембран, а также является доминирующим ионным каналом в нейроэндокринных и эндокринных клетках, таких как Р-клетки поджелудочной железы (MacDonald et al., 2002). Нарушения его функционирования могут приводить к развитию эпилепсии (Misonou et al., 2005), гипертиреоза (Nishiyama et al., 1998) и диабета (MacDonald et al., 2001). Канал Kv2.1 является потенциальной мишенью для развития новых способов лечения этих тяжелых болезней.

Решающую роль в регуляции функционирования канала Kv2.1 играют цитоплазматические N- и С-концевые домены (Ju et al., 2003). Так, цитоплазматический С-концевой домен канала Kv2.1 составляет 440 а.о., и является детерминантом многих функций канала, как то регулирование потенциал-зависимого воротного механизма (Ju et al., 2003; Scholle et al., 2004), участие в образовании поляризованной и кластерной локализации канала на поверхности мембраны (Lim et al., 2000), а также регулирование активационных и инактивационных свойств канала посредством фосфорилирования С-конца канала (Misonou et al., 2004, 2005; Mohapatra and Trimmer, 2006; Park et al., 2006). Все потенциал-зависимые ионные каналы для выполнения своих функций должны быть транспортированы в клеточную мембрану. К настоящему времени, механизм транспорта к и от клеточной мембраны Kv каналов малоизучен, и на данный момент нет никаких данных о поверхностной экспрессии многих Kv каналов, в том числе Kvl0.2. Однако, известно, что у большинства Kv каналов ведущая роль в регулировании этого процесса принадлежит цитоплазматической части (Hill et al., 2008; Kim et al., 1995; Mohapatra et al., 2008; Xu et al., 2007). Недавние исследования

продемонстрировали, что каналы Kv2.1 на поверхности многих типов клеток экспрессируются в виде кластеров (Misonou et al., 2005; Mohapatra and Trimmer, 2006), при разрушении которых происходит возрастание активности каналов, и вследствие этого, снижение возбудимости, что может обеспечивать гомеостаз в условиях физиологического или патофизиологического возрастания синоптической стимуляции (Misonou et al., 2005). В связи с этим каналы Kv2.1 являются потенциальными супрессорами нейрональной возбудимости и представляют собой хороших кандидатов для терапевтической модуляции нейрональной активности, включая нейрональную гипервозбудимость, которая происходит при эпилептических припадках и инсультах. В исследованиях, проводимых на фиксированных и преиммобилизованных культурах клеток с помощью флуоресцентно-меченных антител, а также на живых клетках с использованием канала Kv2.1 с GFP тагом (Tamkun et al., 2007), было показано, что при удалении С-концевого участка канала Kv2.1 происходит нарушение его поверхностной экспрессии и кластеризации (Mohapatra et al., 2008). Несмотря на важнейшую роль цитоплазматической части в функционировании канала, механизм этих процессов остается неизвестным, в связи с недостатком данных о строении канала Kv2.1.

Недавно с помощью метода электронной микроскопии с негативным окрашиванием была получена структура человеческого полноразмерного канала Kv2.1 дикого типа (wt) с разрешением 25 A (Adair et al.,2008), однако точное расположение его цитоплазматических доменов до сих пор не выяснено. Существует предположение, сделанное на основе физиолого-биохимических экспериментов, что С-конец канала Kv2.1 состоит из двух доменов, таких как Kv2 и СТА (Ju et al., 2003), причем Kv2-домены полностью окружают центральный N-концевой Т1 домен со всех сторон, в то время как СТА домен располагается в нижней части канала и взаимодействует с Т1 доменом (Ju et al., 2003; Kobrinsky et al., 2006; Wray, 2009). Прямые структурные данные о месторасположении С-концевых цитоплазматических доменов канала Kv2.1 и их влияния на конформацию мембранной части можно получить с помощью ПЭММ путем сравнения трехмерной структуры целого канала Kv2.1 со структурами его мутантов, у которых удалены различные домены: KV2.1AC (отсутствует полностью С-конец) и Kv2.1 ACTA (отсутствует домен СТА).

Открытый недавно человеческий потенциал-зависимый канал Kvl0.2 (hEag2 (Ju and Wray., 2002), относится к семейству ether-a-go-go (Gutman et al., 2005). Он локализуется в основном в мозгу, но обнаруживается и в других тканях (Ludwig et al., 2003; Malin and Nerbonne, 2002; Saganich et al., 2001). Показано, что Kvl0.2 связан с

процессами возникновения и развития опухолей (Camacho, 2006). Сверхэкспрессия этого канала обнаружена в клетках рака почки (Wadhwa et al., 2009), в то время как нормальная ткань почек не имеет этих каналов. Присутствие KvlO.2 в опухоли делает их потенциальным диагностическим маркером, а также благодаря ограниченному распределению в нормальных тканях и усилению экспрессии в раковых клетках, они представляют собой огромный интерес как возможный инструмент для развития специфического лечения рака.

Большую роль в регулирование функционирования канала KvlO.2 играет его цитоплазматическая часть. Было показано, что она влияет на активационные свойства канала (Wray, 2009; Ju et al., 2006), a также вовлечена в белок-белковые взаимодействия с а-/В-тубулином и белком теплового шока Hsp70 (Wray, 2009). Известно, что массивные цитоплазматические концы этого канала могут содержать домены PAS на N-конце канала и домен cNBD — на С-конце (Stevens et al., 2009). На основе данных мутагенеза и исследований олигомерного состояния доменов была предложена гипотетическая модель строения канала KvlO.2 (Stevens et al., 2009). Согласно этой модели, С-концевые домены cNBD объединены в тетрамер и расположены в центральной части канала, в то время как N-концевые домены PAS на периферии. При этом домены cNBD и PAS представляют собой олигомерную структуру и тесно взаимодействуют. Несмотря на существующую модель, нет никаких прямых структурных данных о строении канала KvlO.2 и расположении его цитоплазматических доменов.

Таким образом, получение структурных данных методом ПЭММ о Kv каналах, до настоящего времени не подвергнутых кристаллизации, а также изучение конформационных перестроек и их роли в функционировании этих каналов является актуальной задачей биофизики и открывает широкие перспективы для теоретических исследований в области строения мембранных белков, белок-белковых комплексов, и как структурные предпосылки для моделирования (направленная доставка лекарств, дизайн новых лекарственных средств).

Целью данной диссертационной работы является исследование четвертичной структуры и конформационных изменений эукариотических калиевых потенциал-зависимых каналов Ку2.1 и Kv10.2.

Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие основные задачи:

1. Получить трехмерные структуры (3D) транкированных каналов крысы Kv2.1 с

помощью метода ПЭММ и определить локализацию их цитоплазматических доменов Kv2 и СТА;

2. Определить влияние цитоплазматических доменов канала Kv2.1 на конформацию его трансмембранного участка;

3. Получить 3D структуру полноразмерного человеческого канала Kv10.2 с помощью метода ПЭММ и определить локализацию его цитоплазматических доменов PAS и cNBD;

4. Определить особенности локализации в цитоплазматической мембране каналов Kv10.2 и Kv 2.1 и выявить роль С-концевых доменов в этом процессе.

ГЛАВА I. Строение потенциал-зависимых калиевых каналов, их конформационные перестройки и роль цитоплазматических доменов в функционировании (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Калиевые ионные каналы представляют собой самый большой, разнообразный и чрезвычайно широко распространённый класс мембранных белков, представленный примерно 70 известными локусами в геноме млекопитающих (Gutman et al, 2005). Они классифицированы на основе молекулярно-биологических данных и генетической гомологии на несколько надсемейств: Са2+ -активируемые (Кса), каналы внутреннего выпрямления (Kir), двупоровые К+ каналы (Кгр) и потенциал-зависимые (Kv) каналы. Среди всех надсемейств Kv каналы формируют наибольшее (около 40 генов в группе человеческих калиевых каналов) (рис. 1) и разделяютс�