Комплексный подход к исследованию структуры белков на основе электронной микроскопии

Соколова, Ольга Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Комплексный подход к исследованию структуры белков на основе электронной микроскопии
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Комплексный подход к исследованию структуры белков на основе электронной микроскопии"

На правах рукописи

СОКОЛОВА Ольга Сергеевна

КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К ИССЛЕДОВАНИЮ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ НА ОСНОВЕ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

Специальность 03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

- 1 НОЯ 2012

Москва-2012

005054055

Работа выполнена на биологическом факультете Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова».

Научный консультант: Михаил Петрович Кирпичников, академик РАН, доктор биологических наук, профессор, декан биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Официальные оппоненты:

Виктор Ионович Цетлин, член-корр. РАН, доктор химических наук, профессор, заведующий отделом молекулярных основ нейросигнализации Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Наталья Александровна Чеботарева, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. Н.А.Баха РАН

Андрей Кимович Цатурян, доктор физико-математических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биомеханики НИИ механики МГУ имени М.В.Ломоносова.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук, г. Пущино.

Защита состоится «22» ноября 2012 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д501.001.96 Биологического факультета Московского Государственного университета имени М.В. Ломоносова по адресу: Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет МГУ имени М.В.Ломоносова, ауд. 389. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «16» октября 2012 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета, доктор биологических наук

М.Г.Страховская

«Мы не должны обижаться на тех ученых, которые вначале не поверили в электронный микроскоп» Э.Руска, Нобелевская лекция, 1986 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Современная молекулярная биология стремительно расширяет круг знаний, область интересов перемещается от одиночных молекул к более сложным молекулярным машинам, растет потребность в структурной информации о комплексах нанобиообьектов. В настоящее время в мире расшифровано более 80000 атомных структур белков, в их числе мембранные белки, ионные каналы, аквапорины, рибосомальные субъединицы и др. Однако структура одиночного компонента может рассматриваться только как первый шаг к пониманию основ функционирования всей системы в целом. Известно, что изменение конформационного состояния белка отражается на его функциональной активности (Рубин, 2004). Знание структуры макромолекулярных комплексов дает возможность интерпретировать конформационные изменения в молекулах в процессе их активации и автоингибирования, а также при связывании с лигандами и/или плазматической мембраной.

Признанными методами для изучения структуры и конформационных изменений в белковых молекулах являются: рентгеноструктурный анализ, ЯМР, метод спиновых меток, детекция люминисценции и спектроскопические методы (Вассерман, Коварский, 1986; Stock et al, 2005; Tyszka et al, 2005). Каждый из этих методов имеет свои преимущества и ограничения. Большинство методов способны детектировать лишь незначительные изменения полипептидной цепи и далеко не всеми методами можно определить, какая часть белка и как изменила свою конформацию. В то же время, современный метод просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) макромолекул позволяет визуализировать не только трехмерную структуру, но и динамику самых разнообразных биологических нанообъектов с разрешением от 2-5 нм до атомного (0,2 нм). Метод ПЭМ не связан многими недостатками перечисленных выше структурных методов: в нем нет лимитирующего размера частиц, не обязательно наличие кристаллов, количество используемого материала достаточно мало, крио-модификация метода ПЭМ позволяет наблюдать молекулы в нативном водном окружении в состоянии, близком к физиологическому. В сочетании с методом реконструкции макромолекул (van Heel and Frank, 1981) и фиттингом кристаллических структур, ПЭМ белков

позволяет получить представление о трехмерной структуре и конформационных изменениях макромолекулярных комплексов.

В данной диссертационной работе .метод . ПЭМ использовался для получения впервые трехмерных структур крупных мембранных и цитоплазматических глобулярных белков, а также для изучения основ формирования фибриллярных структур белками паутины, спидроинами. В последние пять лет изучению молекулярного строения мембранных белков (ионных каналов и транспортеров) уделяется особое внимание во всем мире в связи с разработкой новых эффективных лекарств против таких болезней, как рак (Wang et al, 1996), сердечные заболевания (Schmitt et al, 2000), эпилепсия (Misonou et al, 2005; Singh et al, 2006). Однако до сих пор многие ионные каналы не изучены в должной мере из-за сложностей с кристаллизацией мембранных белков. Расшифрованная атомная структура крупных актинсвязывающих белков (АСБ) была бы незаменима при разработке фармацевтических препаратов против целого ряда заболеваний, связанных с нарушением клеточной подвижности (Васильев, 1997; Geiger and Peeper, 2009). В тоже время атомных структур многих полноразмерных АСБ до сих пор получить не удалось. Относительно недавно в качестве материала для тканевой инженерии был предложен рекомбинантный белок паутины спидроин (Moisenovich et al, 2009). В связи с тем, что искусственные матриксы определяют механические свойства и форму имплантата, формируют субстрат для адгезии клеток, представляется актуальным исследовать четвертичную структуру входящего с их состав спидроина.

Целью работы является разработка комплексного подхода к изучению четвертичной структуры белковых молекул на основе просвечивающей электронной микроскопии.

Для достижения цели решаются следующие задачи:

1. Формулировка основных положений комплексного подхода к изучению четвертичной структуры белков;

2. Получение трехмерных структур ряда мембранных и цитоплазматических белков с разрешением 1,8-2,5 нм;

3. Построение молекулярных моделей белков на основе моделирования по гомологии и фиттинга;

4. Изучение конформационных перестроек в белковых молекулах при активации, взаимодействии с лигандами и с плазматической мембраной;

Научная новизна результатов

В работе впервые:

1- Получены трехмерные структуры калиевых потенциал-зависимых каналов Kv1.1, Kv2.1, Kv10.2 и их транкированных мутантов с разрешением 2,0-2,5 нм;

2. Полумены трехмерные структуры актинсвязывающих белков (mDial, Аф2/3, Srv2, IRSp53) и их олигомеров с разрешением 1,8-2,5 нм;

3. Построены молекулярные модели полноразмерных белков: ионного канала Kv10.2, АСБ mDial и IRSp53 на основе моделирования по гомологии и фиттинга;

4. Показано наличие конформационных перестроек в цитоплазматических доменах калиевых потенциал-зависимых каналов при межмолекулярных взаимодействиях и активации;

5. Изучены структурные основы кластеризации потенциал-зависимых каналов семейства Kv10;

6. Определены конформации комплекса Агр2/3 в нативном состоянии и при связывании с лигандами и выяснена связь Агр2/3 с функциональной активностью клетки;

7. Показано, что автоингибирование формина mDial связано со стерическим блокированием сайтов связывания актина;

8. Предложена тпотеза изменения конформационного состояния формина в зависимости от его функционального состояния;

9. Определено олигомерное строение комплекса Srv2, и показано, что олигомер N-концевых доменов Srv2 способен разрезать полимеризованый F-актин в присутствии кофилина;

10. Изучены структурные основы активации и модификации плазматической мембраны I-BAR белками;

11. Разработана модель для изучения фолдинга белков паутины и изучена структура нанофибрилл спидроина I.

Практическая значимость работы заключается в разработке методологического подхода к изучению структуры белковых молекул на основе электронной микроскопии и молекулярного моделирования. С использованием разработанного подхода были получены трехмерные структуры и изучены важные структурные особенности макромолекул и белок-белковых комплексов, которые до настоящего времени не были подвергнуты кристаллизации, и, следовательно, их атомная структура не была расшифрована. Полученные знания в дальнейшем могут быть применены при исследовании строения белков, белок-белковых

комплексов, и как структурные предпосылки для молекулярного моделирования (направленная доставка лекарств, дизайн новых лекарственных средств), а также для практической работы по детекции и анализу наночастиц биологического происхождения. Результаты моделирования in vitro процессов прядения паутины свидетельствуют о принципиальной возможности разработки биоматериалов с уникальными свойствами на основе рекомбинантных аналогов белков паутины путем имитации природных процессов формирования нитей паутины. Эти результаты используются при производстве матриксов для культивирования клеток в транспланталогии.

Материалы диссертации используются при чтении курсов «Введение в методы микроскопии в биологии» студентам, обучающимся по специальности «Биоинженерия» на кафедре биоинженерии Биологического факультета МП/ имени М.В.Ломоносова. Современные методы, изложенные в диссертации, включены в разделы практикумов по биоинженерии на кафедре биоинженерии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, используются студентами и аспирантами при выполнении курсовых, дипломных, магистерских и диссертационных работ.

Апробация работы Материалы работы были представлены на научных семинарах кафедры биоинженерии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (2006-2012), лаборатории электронной микроскопии ИКРАН им. А.В.Шубникова (2010) и кафедры биофизики Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (2012), семинарах факультетов Биохимии и Биологии университета Брандайз (2001-2010), семинаре Института мембранной и системной биологии университета Лидс (2007). Основные результаты работы были доложены на следующих международных и отечественных съездах, конференциях, семинарах: Гордоновской конференции по ионным каналам (2000); 54 ежегодной конференции по структуре транспортных белков и каналов и 54 ежегодном симпозиуме Общества основных физиологов США (2000); Ежегодном симпозиуме биофизического общества США (2001); Гордоновских конференциях по узнаванию лигандов и молекулярному управлению (2001; 2002); 1 и 2 международных конференциях по структуре, динамике и функции белков в биологических мембранах (2001, 2003); Гордоновских конференциях по трехмерной электронной микроскопии (2002, 2007, 2008, 2010, 2012); Московских конференциях по вычислительной молекулярной биологии (2007, 2009); конференциях Федерации европейского биохимического общества (FEBS): 30th

FEBS Congress (2005), 32nd FEBS Congress (2007), 33rd FEBS Congress & 11th IUBMB Meeting (2008), 34th FEBS Congress (2009); Международной конференции по структуре F-BAR белков (2009), конференциях Американского микроскопического общества (2010-2012), ежегодных Генеральных ассамблеях проекта EDICT 7 рамочной программы Евросоюза (2007-2012); Конференции Жак Моход «Молекулярные основы моделирования и организации мембран» (2011), IV и V Российских симпозиумах «Белки и пептиды» (2009, 2011), Конференциях общества клеточных биологов США (2006, 2011), международной конференции «Нанотехнологии в онкологии» (2011), 1 международной конференции по новым методам в структурной биологии (2012), IV международном съезде биофизиков (2012).

Публикации Всего по материалам диссертации опубликована 51 печатная работа, включая 24 статьи в реферируемых журналах, главу в коллективной монографии и два учебных пособия.

Личный—вклаД_автора Автором осуществлен выбор направления

исследований и постановка задач. Эксперименты, анализ и интерпретация данных проведены лично автором, либо под ее непосредственным руководством или в соавторстве. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Структура работы Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 352 источника. Работа изложена на 219 страницах, содержит 7 таблиц и иллюстрирована 103 рисунками.

ГЛАВА Л. КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К ИЗУЧЕНИЮ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ МАКРОМОЛЕКУЛ

В последнее десятилетие трансмиссионная (просвечивающая) электронная микроскопия (ПЭМ) превратилась в полноправный метод, применяемый в структурной биологии. Это стало возможным в связи со значительным улучшением методик электронной микроскопии и повышением возможностей компьютеров, применяемых для расчетов трехмерных структур. Электронная микроскопия расширяет возможности структурной биологии. Она предоставляет дополнительную информацию к другим методам структурной биологии, поскольку способна работать с большими макромолекулярными комплексами, которые могут находиться в различных конформациях одновременно, и требует только несколько микролитров раствора белка с небольшой (не более 1 мг/мл) концентрацией. Метод ПЭМ с успехом комбинируется с другими структурными методами,

позволяющими выявлять атомные структуры отдельных доменов. Фиттинг атомных структур в электронную плотность, рассчитанную по проекциям, полученным с использованием ПЭМ, позволяет интерпретировать меж-, и внутримолекулярные взаимодействия в комплексах. 1.1. Принципы ПЭМ и реконструкции макромолекул

Пучок ускоренных электронов, сформированный осветительной системой электронного микроскопа, взаимодействует с исследуемым объектом. Электроны, проходя через вещество объекта, упруго рассеиваются, то есть меняют свои траектории, а в результате и амплитуды, и фазы электронных волновых функций. Линза объектива собирает прошедшие через образец электроны в плоскости изображения, где формируется картина, которая содержит искомую информацию о структуре объекта. Основным следствием неупругого рассеяния электронов является накапливание их энергии в образце, приводящее к радиационному поражению (Frank, 2001). Радиационное поражение является серьезной проблемой в электронной микроскопии. Для того чтобы предотвратить радиационное поражение образец охлаждают. К сожалению, охлаждение не спасает полностью от повреждения, поэтому не рекомендуется подвергать образец избыточному электронному излучению. В результате отношение сигнал/шум оказывается низким. Низкое отношение сигнал/шум лимитирует количество информации, которую можно получить от одной молекулы. Следовательно, невозможно получить структуру с высоким разрешением от одной молекулы, для этого теоретически требуется, по крайней мере, 10,000 частиц, а на практике еще больше (Henderson, 1995).

Реконструкция трехмерной структуры макромолекул становится возможной, только в том случае, если на препарате молекулярные комплексы находятся в виде изолированных частиц, как правило, отличающихся по своей ориентации. Метод реконструкции макромолекул заключается в получении трехмерных моделей белков с использованием множества двумерных проекций молекул (рис.1). Проекционные изображения отдельных молекул подвергают полосовой фильтрации и выравнивают относительно общей суммы каждого изображения путем его перемещения и вращения. На основе выровненных проекций получают суммарные изображения частиц белка, далее, с помощью последовательных математических операций рассчитывают угловую реконструкцию - трехмерную модель (3D) поверхности белковой частицы, каждая точка которой определена в пространстве с помощью трех углов Эйлера.

начальная модель используется для дальнейшего улучшения Зй реконструкции; в этом заключается итеративность метода. Корректность полученной ЗР-модели проверяется путем обратного проецирования ее на сферу Эйлера с оценкой ошибки реконструкции при сравнении проекций и соответствующих обратных проекций. Разработано множество методов проверки корректности ЗЭ модели, в числе которых фиттинг существующих кристаллических структур отдельных доменов в полученную электронную плотность, иммуномечение, мутагенез, мечение с использованием электронноплотных наночастиц (8око1оуа, 2004).

Классы

классификация

Репрмекцнн

Угловая реконструкция

31) структура

Рисунок 1. Блок-схема метода трехмерной реконструкции макромолекул.

1.2. Построение молекулярных моделей белков на основе моделирования по гомологии.

Эволюция белковых структур идет таким образом, что для произвольного белка существует единственный, термодинамически наиболее выгодный способ укладки основной цепи (нативный). В процессе эволюции мутации ДНК порождают изменчивость в белковой структуре и функции, что сказывается на жизнеспособности организма и, соответственно, естественном отборе. Вариации аминокислотных замен в гомологичных белках показывают, как структура приспосабливается к изменениям. Механизмы, стабилизирующие структуру белка, ограничивают конформационные изменения, а функциональные требования к структуре гомологичных белков накладывают дополнительные ограничения на структурные искажения. Таким образом, семейства родственных белков имеют

тенденцию к сохранению общих паттернов укладки. Поиск гомологий - это мост между аминокислотной последовательностью и функцией. Предсказание структуры белка, основанное на сходстве с известными структурами -моделирование структуры по гомологии - является весьма продуктивным подходом. Для интерпретации ЗР структур белковых молекул, полученных с помощью ПЭМ, применяют фиттинг молекулярных структур отдельных доменов как имеющихся в базах данных, так и полученных в результате моделирования по гомологии.

1.3. Фиттинг - это метод молекулярного моделирования, который позволяет предсказать наиболее выгодную ориентацию и положение одной молекулы по отношению к другой (рис. 2). Различают жесткий и гибкий фиттинг. Метод жесткого фиттинга не учитывает конформационную подвижность белковых молекул. Фактически, жёсткий фиттинг можно свести к оценке энергии каждого конкретного комплекса. Гибкий фиттинг учитывает конформационную подвижность и может быть реализован с помощью автоматического перебора конформаций и ориентаций белковых молекул и оценке энергии взаимодействия. В результате, используя структуры отдельных доменов, возможно построить молекулярную модель полноразмерного белкового комплекса.

Л ; к

А» Электронная плотность для интерпретации

Р, (гК) ГЭТОГШС V ' Атомная плотность, спроектированная на решетку

# , прое фильтр 'ЙЙ " ■ киия сглаживание по пространству = свертка с гауссовым £ *Р*отю(гК) - />са1с(г)

ядром (д) ■V

С(Т) = |Реп1(г) ХрЫс(г + Т) Щ ш! ЗйэУ 1

Рассчитывается критерий совпадения для каждого поворота и каждого смещения Т по всему пространству 4 г

Рисунок 2. Схематическое представление процесса фиттинга атомной структуры в электронную плотность.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты ипг.прдрвания:

Объектами исследования являются рекомбинантные белки и макромолекулярные комплексы (ионные каналы и актинсвязывающие белки), а также атомные структуры отдельных доменов этих белков. Дизайн генов.

Гены, кодирующие полноразмерные потенциал-зависимые ионные каналы в рт13 векторе для экспрессии в клетках млекопитающих, были любезно предоставлены проф. К.Миллером (Kv1.1) и проф. Д.Вреем (Kv2.1, Kv10.2). Мутации (делеции и точечные мутации) проводили с использованием ПЦР и соответствующих праймеров. Корректность полученных мутантных генов проверяли с помощью секвенирования. Каждый ген, кодирующий потенциал-зависимый канал нес точечную мутацию в области поры (F425G) для увеличения сродства канала к токсину (Goldstein and Miller, 1992). Ген, кодирующий токсин желтого скорпиона (АдТх2) был предоставлен проф. К.Миллером. Гены, кодирующие АСБ, были любезно предоставлены проф. Б.Л.Гуде (Агр2/3, mDial, Srv2/CAP) и проф. П.Лаппалайненом (IRSp53). Для экспрессии mDlal использовалась конструкция, кодирующая транкированный формин (55 - 1255 а.к.). Предварительные биохимические эксперименты показали, что эта конструкция функционально не отличается от полноразмерного формина, но имеет значительно больший выход (Maiti et al, 2012).

Структуры искусственных генов, кодирующих белки-аналоги спидроинов I и II были смоделированы на основе известных нуклеотидных последовательностей природных генов: ген 1 f9 кодировал последовательность, аналогичную последовательности спидроина I паука Nephila clavipes (Xu and Lewis, 1990), а ген 2e12 - спидроина II паука N.madagascariensis (Motriuk-Smith et al, 2005). Мономеры рекомбинантных генов были получены в результате химико-ферментативного синтеза и амплифицированы в составе вектора. Экспрессия и очистка белков

Полноразмерные и транкированные потенциал-зависимые каналы (Kv1.1, Kv2.1, Kv10.2) экспрессировали в эукариотических клетках (COS-1, COS-7, НЕК293 или Vero). При очистке белков каналов использовали детергент CHAPS (2,5%). Для очистки на С-конец белков ионных каналов был амплифицирован 1D4 таг (TETSQVAPA) (Oprian et al, 1987). Очистка белков каналов производилась на аффинной колонке с пришитыми моноклональными антителами против 1D4, как

описано в (Sokolova et al, 2001; 2003). Выход целевого белка составил около 50 pMol.

АСБ экспрессировали в дрожжах Pishia pastorisпод контролем GAL- , индуцируемого промотора1, очищали с использованием аффинной либо металлохелатной хроматографии (для этого на N-концы белков были амплифицированы 6xHis либо GST таги) и последующей гель-фильтрации, как описано в (Rodal et al, 2005; Maiti et al, 2012; Chaudhry et al, 2012). Выход целевых

белков составил 150-300 pMol.

I-BAR домены и полноразмерный белок IRSp53 экспрессировали в клетках E.coli, выделяли из растворимой фракции клеток и очищали с использованием металлохелатной хроматографии и последующей гель-фильтрации. Выход

целевого белка составил 1 мг/мл.

Гибридную конструкцию, содержащую токсин (АдТх2), экспрессировали в E.coli, очищенный с помощью металлохелатной хроматографии слитый белок подвергали расщеплению трипсином, затем смесь разделяли на катионообменной колонке SP-Sephadex (Sigma) с последующей ВЭЖХ на колонке общей фазы С18, как описано в (Карлова с соавт., 2011).

Спидроины I и И экспрессировали в дрожжах Pishia pastoris под контролем метанолиндуцибельного промотора АОХ-12, выделяли из водорастворимой фракции клеток и очищали с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке HiPrepSP, как описано в (Bogush et al, 2009). Связывание нейротоксина

[H3]NEM-AgTx добавляли к клеткам и очищенному белку в концентрации 12.5 нМ. Связывание производили при 4°С 30 мин, после чего несвязавшийся токсин отделяли с применением микрофильтров Microcon. Радиоактивность измеряли на жидкостном сцинтилляторе (Beckmann). Полученные данные позволяют предположить, что выделенный белок ионного канала сохраняет стабильность достаточно долго для проведения структурных исследований. Флуоресцентные тесты3

Цифровые изображения получали с помощью микроскопа LSM510 Meta (Carl Zeiss AG, Германия). Изображения записывали с помощью объектива Plan-Apochromat 100х/1.4 Oil Ph3. Для возбуждения флуоресценции метки СуЗ использовали гелий-неоновый лазер (длина волны излучения 543 нм), для регистрации

' В сотрудничестве с проф. Б.Л.Гуяе, Brandeis University. ' В сотрудничестве с проф. В.Г.Дебабовым и В.Г.Ботушем, ГосНИИгенетика.

флуоресценции применяли фильтр с полосой пропускания 565-615 нм. Для обработки изображений использовали программное обеспечение Zeiss LSM 510Meta.

Сканирующая электронная микроскопия

Образцы паутины, высушенные на воздухе и покрытые нанометровым слоем золота, изучали в микроскопе Camscan S2 (Cambridge Instruments, UK). Изображения сохраняли на ПЗС камеру с помощью программного обеспечения MicroCapture (SMA, Russia). Моделирование по гомологии4 и фиттинг

Для идентификации шаблонов был использован сервер SWISS-MODEL (Kiefer et al, 2009). Аминокислотные последовательности выравнивали с помощью программы T-COFFEE (Notredane et al, 2000). Построение моделей на основе выравнивания гомологичных аминокислотных последовательностей проводили в программе MODELLER (Eswar et al, 2006). Фиттинг проводили в полуавтоматическом режиме с использованием программ Situs (Wriggers, 2010) и UCSF Chimera (Pettersen et al, 2004). Моделирование взаимодействия l-BAR доменов с PIP

Исследование проводилось в пакете Gromacs 3.3.1 (Berendsen et al, 1995) с силовым полем OPLS-AA (Jorgensen and Tirado-Rives, 1988) в случае полноатомного приближения. В случае крупно-зернистой молекулярной динамики использовалось силовое поле MARTINI (Marrink et al, 2007). Для исследования взаимодействия l-BAR домена с биологической мембраной методами использовались модельные липидные бислои, состоящие из 448 молекул фосфатидилхолинлипидов. РОРС (пальмитоил-олеил-фосфатидилхолин) использовали для нейтрально заряженной мембраны; для отрицательно заряженной мембраны в один монослой дополнительно вносили заряженные липиды - PIP(4,5)PC (фосфоинозитид (4,5) фосфатидилхолин) в соотношении 1 PIP(4,5)PC: 4 РОРС. ПЭМ макромолекул

Очищенный белок (3 мкл) наносили на сеточки для электронной микроскопии, покрытые углеродной пленкой на 30 с, отсасывали избыток жидкости фильтровальной бумагой и помещали на капли 1% раствора (50 мкл) уранилацетата для окраски (2 раза по 30 с).

' В сотрудничестве с М.М.Мойсеновичем, Биофак МГУ. В сотрудничестве с проф. К.В.Шайтаном, Биофак МГУ.

Изображения получали в электронном микроскопе Tecnai G-12 (FEI, Голландия) при ускоряющем напряжении 120 кВ в условиях низкой дозы электронов на квадратный ангстрем поверхности для предотвращения повреждения образцов под воздействием электронного пучка5. Изображения фиксировали с помощью ПЗС-камеры Eagle (FEI, Голландия) с увеличением 52

000 и дефокусом 1.4-3 мкм.

Отбор изображений одиночных белковых молекул для последующего построения трехмерной (3D) структуры проводили вручную с помощью программы Signature (Chen & Grigorieff, 2007). Последующую обработку производили в программе I MAGIC (van Heel et al, 1996); был использован стандартный протокол (Van Heel, 1987). Изображения отдельных частиц были отфильтрованы от шума, нормализованы и выровнены по центру путем вращения изображений, их передвижения и сравнения с усредненным изображением. Разрешение полученных реконструкций измерялось с помощью метода объемной корреляции Фурье (van Heel & Schatz, 2005).

ГЛАВА 3. ТРЕХМЕРНАЯ СТРУКТУРА И ДОМЕННОЕ СТРОЕНИЕ КАЛИЕВЫХ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ

Калиевые ионные каналы подразделяются в зависимости от их принципа функционирования на обратные ректификаторы, (Kir), Са2+-активируемые каналы (КСа), двупоровые (К2Р) и потенциал-зависимые (Kv) каналы. Потенциал-зависимые калиевые каналы представляют собой очень разнообразную группу каналов, представленную двенадцатью семействами: Kv1-Kv12. К наиболее интенсивно изучающимся семействам каналов Kv, относятся Kv1 (Shaker), Kv2 (.Shab), Kv4 (Shal), Kv7 (KVLOQ) и Kv10-12 (Ether-a-go-go).

В фундаментальном аспекте одной из основных задач до сих пор остается получение трехмерных структур полноразмерных ионных каналов, так как кристаллизация мембранных белков значительна затруднена. Наличие у белков Kv каналов ротационной симметрии упрощает задачу восстановления 3D структуры по 2D проекциям, увеличивая в 4 раза отношение сигнал/шум. 3.1. Трехмерная структура канала Shaker (Kv1.1) и конФормационные перестройки его С-концевого домена при взаимодействии с ß-субъединицей

Полученная нами впервые 3D реконструкция полноразмерного канала Kv1.1 (Shaker) (Sokolova et al, 2001; Sokolova et al, 2003) имеет разрешение 2,3 нм и

1 В сотрудничестве с чл.-корр. РАН, проф. Н.А.Киселевым, ИКРАН

представляет собой тетрамерный комплекс а-субъединиц, разделенный на две структурные части: мембранную и цитоплазматическую, которые соединены между собой тонкими линкерами, длиной 2-3 нм (рис. 3).

Линкеры ограничивают «окна», достаточные для того, чтобы крупный (более 5А в диаметре) N-концевой инактивационный пептид мог достичь порового комплекса для инактивации. Такая структура получила название «подвесная гондола» (Kobertz and Miller, 2000) и была впервые визуализована нами на примере канала Shaker (Sokolova et al, 2001).

Данные о доменной структуре канала Shaker были подтверждены кристаллографическими исследованиями на канале, принадлежащем к тому же семейству (Kv1.2) (Long et al, 2005; 2007). Более того, нами и другими исследователями продемонстрировано, что двухслойная организация характерна для многих других ионных каналов (Kv4. Kv10, RyR).

см ъ

:> r С > x ?

в г д ———

Рисунок 3. Трехмерная структура канала Shaker и локализация его С-концевого домена. (А) трехмерная структура альфа-субъединицы Shaker; (Б) трехмерная структура транкированного канала Shaker (ДС); (В-Д) - определение локализации С-концевого домена путем сравнения структур на рис. (А) и (Б), различные ориентации. Стрелки указывают на разницу в области цитоплазматического домена. (Е) Интерпретация 3D структуры путем фиттинга кристаллических структур канала KcsA и Т1 домена. Длина масштабного отрезка - 10 нм (Sokolova et al, 2001; 2003)

Мембранный домен канала Shaker структурно подразделяется на субдомены D1 и D2 (рис. ЗА,Б), включающие сенсор потенциала S4 и домены S1-S3, отсутствующие в бактериальном канале KcsA. Цитоплазматический домен объединяет комплекс N-концевых Т1 доменов и С-концевых участков.

До недавнего времени роль цитоплазматических доменов калиевых каналов была не определена. Сейчас становится ясно, что цитоплазматические домены вовлечены как во взаимодействия внутри тетрамера, так и, в белок-белковые взаимодействия, регулирующие проводимость и мембранную локализацию канала.

В данном разделе работы мы сосредоточились на исследовании конформационных изменений С-концевого участка канала Shaker методом мутагенеза с последующей ПЭМ. Для этой цели был экспрессирован и очищен мутантный канал, транкированный по С-концу (удалены 152 аминокислотных остатков) и рассчитана его 3D реконструкция с разрешением 2,3 нм (рис. 3). Связывание меченого нейротоксина (табл. 1) и дополнительные электрофизиологические исследования показали, что удаление С-концевых аминокислотных остатков незначительно влияет на активность канала (мы наблюдали сдвиг напряжения при активации на +12 mV), но ощутимо нарушает поверхностную экспрессию транкированных каналов в клетках (табл. 1).

Таблица 1. Радиоактивность (pMol/чашка) связавшегося с порой канала [H3]NEM-AgTx.

(WT - полноразмерный канал; ДС - канал с удаленным С-концом).

Образец Поверхность клетки Очищенный белок

WT Shaker а-субъединица 0,97±0,02 0,33±0,015

ДС Shaker а-субъединица 0,89±0,04 0,38±0,04

WT Shaker а-Р комплекс 1,24±0,12 0,33±0,02

ДС Shaker а-р комплекс 1,13±0Д2 0,35±0,08

Путем сравнения выровненных относительно друг друга реконструкций полноразмерного и транкированного канала (рис. 3) было установлено, что в составе цитоплазматического домена канала С-конец образует компактную структуру (стрелки на рис. 3 и рис. 4А). Эта структура располагается по бокам Т1 домена, со стороны мембраны. При взаимодействии а-субъединицы канала с р-субъединицей, С-концевой домен перемещается в положение вблизи от активного центра р-субъединицы, проходя в общей сложности расстояние около 5 нм (рис. 4).

Принимая во внимание факт, что при удалении С-концевого домена поверхностная экспрессия канала уменьшается (согласно результатам связывания [Н3]-нейротоксина; табл. 1), можно сделать вывод о том, что С-концевой домен

способен контролировать поверхностную экспрессию канала путем активации р-субъединицы (ЭокоЮуа е! а!, 2003). Для уточнения этого предположения мы детально изучили канал, относящийся к семейству Ку2 (БЛаЬ), по имеющимся данным не ассоциированный с Р-субъединицей.

Рисунок 4.

Конформационные изменения С-концевого домена (С) канала Shaker (А) при присоединении Р-субъединицы (Б). Отмечены домены: Т1, S1-S4, поровый домен и С-концевой домен. Масштабный отрезок - 10 нм. (Sokolova et al, 2003)

3.2. Трехмерная структура канала Kv2.1 и локализация его С-кониевых доменов.

В отличие от канала Shaker, цитоплазматическая часть канала Kv2.1 имеет значительные размеры, а его С-концевые домены могут принимать участие в регулировании кинетики активации канала (см. обзоры: Pishalnikova and Sokolova, 2009; Wray, 2009).

Массивный цитоплазматический С-конец этого канала содержит три структурных участка: линкер S6 (около 50 аминокислотных остатков), Srv2 домен (около 250 аминокислотных остатков) и СТА домен (около 100 аминокислотных остатков). Линкер S6 проявляет значительную гомологию среди Kv2 каналов и имеет структуру типа спираль-петля-спираль (Ju et al, 2003). С использованием FRET анализа (Kobrinsky et al., 2006) было показано, что при деполяризации дистальная часть С-конца канала Kv2 перемещается в периферическом направлении. На существующие взаимодействия между N- и С-концами указывают электрофизиологические данные (Ju et al, 2003). Однако до настоящего времени доменная структура канала Kv2.1 не была известна.

Нами были получены две 3D структуры мутантных каналов Kv2.1: транкированного по С-концевому СТА домену (Kv2.1ACTA) и с полностью удаленным С-концом (включающим СТА и Srv2 домены) с разрешением 2,3 нм (Grizel et al, 2012, submitted). Путем визуального сравнения полученных структур между собой и со структурой полноразмерного человеческого канала Kv2.1 (Adair

е( а|, 2008), было установлено, что массивный цитоплазматический субдомен располагающийся внизу структуры является СТА доменом (рис. 5А).

А. ^ Б. В.

Рисунок 5. Трехмерная структура канала Kv2.1 и локализация С-концевых доменов: (А) полноразмерный канал Kv2.1 (из Adair et al, 2008), вид сбоку; (Б) канал Kv2.1ACTA, вид в той же ориентации, что и на (А); (В) канал Kv2.1aC, ориентация та же, что и на (А) и (Б). М1-М4 - субдомены мембранной части канала, Kv2 и СТА- С-концевые домены канала (Grizel et al, 2012)

СТА

Выступы под мембраной, повернутые относительно мембранной части на 60°, одинаковые для структур полноразмерного канала и Ку2.1ДСТА, имеют размеры 50х20А и могут вместить 250 аминокислот, образующих домен Kv2 (с учетом плотности белка ~810Da/nm3 (Mattews, 1968)). Анализ трехмерных структур каналов обнаружил также различия в области мембранного домена, интерпретация этих различий приведена ниже. Таким образом, показано, что домены Kv2 и СТА частично окружают N-концевой Т1 домен. При этом четыре домена Kv2 расположены по бокам Т1 домена, а СТА-домены занимают дистальную часть. Следует отметить, что в отличие от других ионных каналов «окна» между мембранной и цитоплазматической частями канала при полученном разрешении не идентифицируются. Это отражает специфичность доменного строения каналов Shab.

3.3. Конформационные изменения мембранного домена канала Kv2.1

У полученных реконструкций каналов Ку2.1ДС и Kv2.1ACTA, а также структуры полноразмерного канала (Adair et al, 2008) в области мембранного домена можно вычленить характерные субдомены М1-М4 (рис. 5). Расположение субдоменов М1, МЗ и М4 аналогично у всех 3D структур; в то же время субдомен М2 испытывает значительные перемещения (до 1,5 нм). Он идентифицируется ближе к экстраклеточной части мембраны (в реконструкции канала Ку2.1ДС и

Kv2 1WT) или на уровне мембраны (в реконструкции каналов Kv2.1ACTA).

Известно, что при активации канала Kv2.1 происходят значительные конформационные изменения в положении сенсора потенциала S4. Этот процесс регулируется посредством цитоплазматических концов канала (Ju et al. 2003). Мы предположили, что разница в положении субдомена М4 может быть связана с изменением степени открытия канала при удалении С-концевого СТА домена.

Для проверки этого предположения использовались молекулярные модели трансмембранной части канала Kv2.1 в открытой и закрытой конформациях, полученные путем моделирования по гомологии (рис. 6 А, Б). В качестве шаблонов использовались модели открытого и закрытого канала Kv1.2 (Han et al, 2008), основанные на модели активации (Pathak et al, 2007). Гомология между моделями и шаблонами составила 65%. Сравнение полученных моделей позволило однозначно установить, что при открытии канала происходит поворот попасти S2-S3 из центра канала к периферии, a S3-S4 перемещается в направлении внеклеточного пространства (рис.6 А,Б). В результате данного конформационного изменения субдомен М2 опускается ближе к цитоплазме (рис. 6В,Г). Эти данные хорошо иллюстрируют различия в 3D структурах мутантных каналов, наблюдаемые нами (рис. 5Б,В), а также говорят в пользу того, что структура полноразмерного канала Kv2.1 (Adair et al, 2008) была получена в открытом состоянии (рис. 5А).

, Рисунок 6.

Ш-^ЛуЧ^3 £7 Интерпретация конфор-

^^ИЙ^*4' мационных изменений

3 '^^те^УЙГ мембранного домена канала

' Kv2.1. Молекулярные модели

трансмембранной части

А _Б канала Kv2.1 в закрытой (А) и

открытой (Б) конформациях. Jf" ■ Фиттинг закрытой структуры в

В _ • '•W^^^^Bfc , Ж Kv2.1 ДСТА (В) и открытой в

Ш Г' Ж ДД Kv2.1 ДС (Г) (одна субъеди-

"Hfv f^ K^^l ница' Отмечено положение линкера S3-S4.

3.4.Кластеризация Kv2 каналов и роль СТА домена в этом процессе

Известно, что полноразмерные каналы Kv2.1 экспрессируются на поверхности клеток в виде кластеров (Mohapatra and Trimmer, 2006; Tamkun et al.,

2007), и полное удаление С-конца приводит к нарушению транспорта каналов в направлении плазмалеммы (Mohapatra et al„ 2008). С использованием живых клеточных культур и флуоресцентно меченного нейротоксина (Карлова с соавт., 2011) мы показали, что каналы дикого типа (Kv2.1wt), а также каналы с удаленным С-концом (Kv2.1 ДС, Kv2.1 ДСТА) могут образовывать кластеры на поверхности мембраны. При этом общая площадь, занимаемая на поверхности клетки кластерами транкированных каналов, достоверно уменьшалась при удалении не только всего С-конца, но уже домена СТА (рис. 7Б). Таким образом, мы впервые показали, что способность каналов транспортироваться к клеточной мембране нарушается в результате делеции СТА-домена канала Kv2.1. Эти домены также участвуют в регуляции активационных свойств канала (Ju et al, 2003), что указывает на возможность выполнения ими роли отсутствующей у каналов Shab В-субъединицы (Grizel et al, 20126 submitted).

Рисунок 7. Кластеризация канала Ку10.2 (А) и участие С-концевых доменов каналов в поверхностной экспрессии канала Ку.2: (Б) относительная площадь, занимаемая каналами на поверхности клетки; (В) Средний диаметр кластеров исследуемых каналов Ку2.1 и «VI 0.2 (пт).

Мы впервые установили, что каналы Ку10.2 (Ьеад2) тоже образуют кластеры в мембране клетки (рис. 7А), однако, их размеры были меньше, чем у Ку2.ШТ (рис. 7В). Замечательной особенностью кластеров Ку10.2 является то, что они колокализуются с актиновым цитоскелетом (Карлова с соавт., 2011), что не показано для каналов Ку2.1. Эти различия во взаимодействии с актином можно объяснить значительными различиями в строении цитоплазматических доменов каналов Ку2.1 и Ку10.2 и в выполняемых ими функциях. Однако до сих пор структура каналов семейства Неад не была известна.

3.5. Трехмерная структура канала Ку10.2 и локализация его С-концевых доменов

Субсемейство ЕФег-а-до-до характеризуется экстремально длинными Ы- и С-концевыми последовательностями, в состав которых входят несколько

структурных доменов. В отличие от каналов семейств Kv1-Kv4, N-концевые домены у каналов Kv10 не являются тетрамеризационными (Cabrai et al, 1998). С-концевой участок содержит домен связывания циклических нуклеотидов (cNBD) и тетрамеризационный CAD домен (Zagotta et al, 2003). Делеция домена CAD приводит к синтезу нефункционального канала Kv10.

Рассчитанная нами по данным ПЭМ 3D реконструкция канала Kv10.2 имеет классическую двухслойную организацию (рис. 8). Две структурные части реконструкции разделяют линкеры, образующие «окна». Размеры «окон» в нашей модели составляют около 0.25 х 0.3 нм, что согласуется с данными, полученными для канала Shaker (Sokolova et al., 2001). Выступ (около 3 нм в диаметре) на верхней части канала может являться результатом N-гликозилирования, о чем свидетельствует наличие выступа со сходными размерами на поверхности мембранного домена канала Shaker, также N-гликозилированного (см. выше). Цитоплазматическая часть канала массивная и, как и ожидалось, подразделяется на домены.

Рисунок 8. 3D реконструкция канала Kv10.2. Слева направо: два боковых вида отличающихся друг от друга поворотом на 90', вид с внутриклеточной стороны. Масштабный отрезок равен 10 нм. M - трансмембранный домен; Р и D -цитоплазматические домены; О - окно. (Соколова с соавт., 2012)

3.6. Построение молекулярной модели полноразмерного канала КуЮ.?

Для локализации цитоплазматических доменов канала Kv10.2 мы проводили фиттинг N- и С-концевых доменов Kv10.2 (рис. 9). Атомные модели доменов были получены в результате моделирования по гомологии.

Для построения модели N-концевого домена PAS в качестве шаблона была выбрана структура гомологичного домена канала Herg (PDB код 2KXL). Для построения модели С-концевого cNBD-домена была использована кристаллическая структура человеческого сАМР-зависимого канала HCN4 (PDB код 30TF). Перемещая отдельные мономеры cNBD в направлении, указанном

стрелками на рис 9В, мы встроили их в область субдоменов «D». В пользу этого варианта свидетельствует относительное соответствие объемов субдоменов и

мономеров cNBD (рис. 9Г). .-m*-'

Фиттинг N-концевых доменов (PAS) в область субдоменов «Р» позволил разместить их дальше от центральной оси канала, в непосредственном контакте с С-концевыми доменами (рис. 9Д, Е). Эта структура уточняет выдвинутую ранее гипотезу (Wray, 2009), предполагающую расположение компактного тетрамера cNBD-доменов в центре цитоплазматической части канала, а PAS-доменов -ближе к периферии. Поскольку наша структура канала Kv10.2 определялась в отсутствие лигандов, то можно предположить возможную перегруппировку С-концевых доменов при связывании сАМР. В нашей реконструкции PAS-домены располагаются на 0.1 нм ближе к трансмембранной части, чем cNBD-домены, достаточно близко, чтобы взаимодействовать с S4-S5 линкером, и воздействовать, таким образом, на дезактивацию канала.

Рисунок 9.

Интерпретация трехмерной реконструкции канала «VI 0.2. А. Фиттинг модели трансмембранного домена в верхнюю часть реконструкции канала Ю/10.2; Б. Вид сбоку: ТМ - трансмембранный домен; В. вид снизу: фиттинг тетрамера сЫВР доменов, моделированного по гомологии с кристаллической структурой человеческого цАМФ-зависимого канала НСЫ4 (РОВ Ю: ЗОТР); Г. вид снизу: фиттинг сЫВО доменов в

PAS область субдоменов «Р»; Д.

cNBD

PAS

cNBD

Вид сбоку: фиттинг доменов PAS и cNBD в цитоплаз-матическую часть. ТМ — трансмембранный домен; Е. Вид снизу (Соколова с соавт., 2012)

3.7. Гипотеза изменения конформационного состояния калиевых каналов при активации

Наши структурные исследования структуры потенциал-зависимых каналов, в сочетании с данными мировой литературы позволили создать модель конформационных перестроек доменов потенциал-зависимого канала при его открытии (рис. 10) (Pischalnikova et al„ 2009). Согласно этой модели, в результате деполяризации мембраны спираль S4 совершает движение в направлении внеклеточного пространства (стрелка 1, рис.10), а также в сторону (стрелка 2) и поднимает N-концевой конец линкера S4-S5 (стрелка 3), что приводит к его повороту вбок и вверх. Спираль S6 при этом открывает ворота канала (стрелка 5) (Yellen, 2002; Long et al. 2005, Pathak et al, 2007).

Рисунок 10.

Схема конформационных изменений в Kv каналах при активации. А. 3D схема одной субъединицы Kv канала в "закрытой" конформации. N-концевой Т1 домен изображен как тетрамер. Пронумерованные стрелочки указывают предположительные направления движения спиралей при активации канала. (Pishalnikova and Sokolova, 2009). Б, В Кристаллические структуры Открытого (Б) и закрытого (В) Kv2.1 каналов, с разрешением 2 нм. Указаны субцомены М1-М4. (Grizel et al, 2012).

Следовательно, С-концевой домен, соединенный со спиралью S6, может двигаться во внешнем направлении (стрелка 6). У канала Shaker С-концевой

домен располагается близко к мембране и может, поэтому, взаимодействовать с линкером, либо непосредственно с основанием петли T1-S1 (рис. 10). Эта гипотеза подтверждается нашими ПЭМ данными о структуре каналов , Kv2.1 и Kv1.1. В структуре Kv2.1ACTA субдомены М2 (спираль S2) находятся на уровне мембраны, что соответствует закрытому состоянию канала. В структурах Kv2.1AC и Kv2.1WT субдомены М2 сдвигаются в сторону внутриклеточного пространства, что соответствует открытому каналу, причем амплитуда движения МЗ значительна (-1,5 нм) (рис.1 ОБ). Известно, что С-концевой домен канала Kv1.1 также испытывает значительные конформационные изменения при присоединении регуляторной р-субъединицы (Sokolova et al, 2003).

Таким образом, в результате исследований 3D структур потенциал-зависимых ионных каналов, представленных в главе 2, был открыт способ доменной организации альфа-субъединиц потенциал-зависимых калиевых каналов с характерным расположением цитоплазматических доменов в виде «подвесной гондолы». Данное расположение доменов связано со специфическими процессами инактивации Kv каналов. Были продемонстрированы конформационные изменения в потенциал-зависимых калиевых каналах при активации и присоединении лигандов. Показано, что С-концевой домен контролирует поверхностную экспрессию канала Shaker путем активации р-субъединицы. Цитоплазматические С-концевые СТА домены канала Kv2.1 несут функции отсутствующей у этого типа каналов р-субъединицы, контролируя степень поверхностной экспрессии канала. Каналы Kv10 способны организовываться в кластеры на поверхности клетки; в отличие от каналов Kv2, каналы Kv10 способны взаимодействовать с актиновым цитоскелетом посредством своего обширного цитоплазматического домена.

ГЛАВА 4. КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В АКТИНСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКАХ ПРИ АКТИВАЦИИ И ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ЛИГАНДАМИ

Актиновый цитоскелет - одна из важнейших структур клетки, обеспечивающая не только подвижность различных клеточных образований, но и такие функции, как эндоцитоз, цитокинез, фагоцитоз, а также внутриклеточный транспорт. Одним из важных признаков опухолевой трансформации клеток считают изменения цитоскелета (Васильев, 1997).

Регуляция работы актинового цитоскелета поддерживается большим набором актинсвязывающих белков (АСБ), отличающихся по строению и выполняемым

функциям (Goode & Eck, 2006). В цитоплазме многие АСБ в норме находятся в автоингибированном состоянии. До сих пор кристаллические структуры крупных мультидоменных АСБ не были получены. Наши исследования трехмерной структуры ряда АСБ позволили выдвинуть ряд гипотез о конформационных перестройках при активации и связывании с лигандами (Rodal et al, 2005; Соколова ссоавт., 2011; Maiti et al, 2012; Chaudhry et al, 2012). 4.1.Трехмерная структура комплекса CAP/srv2

Комплекс САР (у дрожжей Srv2) выполняет функции сборки-разборки актиновых мономеров (Goode and Eck, 2007). Суперспиральный (СС) N-концевой домен комплекса CAP/Srv2 (отмечен на рис. 11 А) взаимодействует с аденилатцикпазным комплексом (Gerst et al, 1991; Kawamukai et al, 2010) и участвует в формировании клеточного ответа путем активации Ras-белков. Последняя на сегодняшний день предложенная модель обновления актиновых филаментов (Quintero-Monzon et al., 2009) учитывает функции обоих концов CAP/Srv2 белка и предполагает ведущую роль С-концевого фрагмента в процессе нуклеотидного обмена. Однако остается невыясненной организация работы CAP/Srv2 в составе высокомолекулярного комплекса.

Для того чтобы выяснить олигомерное строение полноразмерного белка CAP/Srv2, мы изучали его структуру с помощью ПЭМ (рис. 11 Б). Комплекс имеет размеры около 30 нм в диаметре и содержит центральную часть, связанную линекерами с шестью периферическими глобулами. Так как полноразмерный комплекс не имеет фиксированной формы, центральная часть его, представляющая N-концевой олигомер, изучалась отдельно (Соколова с соавт., 2011; Chaudhry et al, 2012). Мы показали, что N-концевые фрагменты (N-Srv2) в растворе спонтанно олигомеризуются (рис. 11В). Олигомерная структура стабилизируется N-концевыми двойными спиралями СС доменов. Олигомер имеет размеры 10x10 нм и может вместить не более шести мономеров N-Srv2 (рис. 11 Г), что свидетельствует о том, что N-Srv2 является гексамером.

Эти данные были подтверждены результатами дифференциального центрифугирования (Quintero-Monzon et al, 2009). Удаление СС домена, ответственного за гексамеризацию, приводит к экспрессии нефункционального Srv2/CAP. Из полученных данных следует, что полноразмерный комплекс Srv2 (рис. 11 Б) является гексамером и включает G-актин в соотношении 1:1 (6 молекул Srv2 + 6 молекул актина).

C-Srv2

- £ 8 S §

И 14-5-3 I "HTwFHi м

G-actin

Рисунок 11. Структура N-концевого гексамера Srv2. (а) строение мономера; (б) ПЭМ полноразмерного Srv2; (В) 3D структура N-Srv2; (Г) фиттинг мономеров; (Д) F-актин; (Е) в Г F-актин с кофилином; (Ж) F-актин с

кофилином и N-Srv2; (3) увеличенный фрагмент (Ж) и фиттинг структуры (В) (стрелка). (Chaudhry et а/, 2012) Функциональная роль Srv2/CAP изучалась в системах in vitro (Chaudhry et al, 2012). Было показано, что полноразмерный белок усиливает скорость сборки актина из мономеров в присутствии кофилина (Cof1) и нуклеаторов, а изолированный N-Srv2 усиливает разрезание актинового филамента в присутствии кофактора Cof1. Эта функция N-Srv2 активируется только в гексамерной организации (рис. 11 Ж), в то время как мономеры не обладали разрезающей способностью.

С помощью двухцветной TIRF микроскопии было показано, что N-Srv2 присоединяется только в тех местах филамента, которые уже декорированы Cof1, при этом добавление гексамерного N-Srv2 увеличивало декорирование филаментов в 4 раза и ускоряло разрезание, видимо, за счет стерических взаимодействий. Таким образом, впервые было установлено, что N-концевой домен Srv2/CAP участвует в разрезании актиновых филаментов и что эта функция осуществляется путем взаимодействия N-Srv2 и Cof1. Полученные данные однозначно свидетельствуют о новой роли N-Srv2 в обновлении актиновых филаментов.

4.2. Трехмерная структура формина mDial и основы его автоингибирования

Роль форминов в клетке, как нуклеаторов актинового филамента впервые была определена в биохимических экспериментах с С-концевым фрагментом формина дрожжей ВпИ, содержащим домены FH1 и FH2 (Sagot et al, 2002).

Кристаллические структуры изолированных доменов FH2 (Xu et al, 2004) и DID (Otomo et al, 2005; Rose et al, 2005) представляют собой димеры, однако до сих пор полноразмерный формин не быя^закристаллизован, и не было известно его олигомерное состояние. Более того, две опубликованные структуры N-концевых димеров отличаются конформацией (симметричная - Rose et al, 2005; ассиметричная - Otomo et al, 2005). До сих пор не было найдено объяснение этому феномену, исследователи пришли к неоднозначному выводу, что одна из конформаций, видимо, неверная, и обусловлена периодическими граничными условиями в ячейке. При этом было не ясно, какая именно структура является корректной.

Полученная нами 3D структура молекулы автоингибированного формина mDial (55-1255) образована двумя слоями: на одном уровне располагается разветвленная структура (отмечена буквой «В» на рис.12А), а на другом -кольцевая структура (отмечена буквой «К» на рис. 12А). Для интерпретации 3D структуры мы использовали кристаллические структуры N- и С-концевых димеров (Otomo et al, 2005; Xu et al, 2004). Фиттинг N-концевого димера в область «вилки» (R=0.65) и С-концевого димера в область «кольца» (R=0,8) (рис. 12Б) позволил продемонстрировать, что полученная 3D реконструкция может вместить не более двух N- и двух С-концевых доменов, при этом актин-связывающие сайты С-концевого домена (Xu et al, 2004) полностью перекрываются N-концевым доменом.

90"

90'

Рисунок 12. Структура автоингибированного т01а1(55-1255) (А) Три ориентации Зй структуры; (Б) фиттинг кристалл-лических структур (Хи е1 а1, 2004; ОЮто е! а|, 2005) в рассчитанную электронную плотность в той же ориентации, что и на (А) (МаШ et а1, 2012)

Представленные данные убедительно свидетельствуют в пользу того, что формин является димером, находящимся в автоингибированной конформации, Таким образом, мы впервые показали, что автоингибирование формина имеет

стерическую природу. Следует заметить, что полученная нами 3D реконструкция могла вместить только ассиметричную структуру N-концевого домена (Otomo et al, 2005) с достаточной точностью (R=0.65), в то время как симметричная структура N-конца (Rose et al, 2005) плохо коррелировала с нашей 3D структурой (R=0.3).

Таким образом, можно сделать вывод о том, что в автоингибированной молекуле N-концевой домен формина принимает ассиметричную конформацию. Вероятно, что симметричная конформация N-концевого домена соответствует активированной молекуле. Исходя из полученных данных, активированный формин (в конформации, в которой актин-связывающие сайты доступны) должен представлять собой вытянутую молекулу.

Для того чтобы продемонстрировать, что эта гипотеза верна, мы изучили другой эукариотический формин - Bni1 из дрожжей. В отличие от mDial он не имеет DID домена и поэтому постоянно находится в активированном состоянии (Sagot et al, 2002). В соответствии с высказанным нами предположением, на микрофотографиях очищенного Вп11 можно было увидеть вытянутые частицы, на одном конце которых находилось «кольцо», а на другом - разветвление.

Б х X

2,0

1,5

A Bn¡1

mDialAC

mDial FL

частица

Рисунок 13. Конформационные изменения форминов при активации (А), выраженные в степени компактизации ПЭМ изображения молекулы, рассчитанной как отношение х/у (Б). (Соколова с соавт., 2011).

При изучении проекционных структур транкированного mDial, с удаленным DAD доменом и сравнении линейных размеров полноразмерного формина (рис.1 ЗА) показано, что удаление регуляторного DAD домена формина приводит к удлинению проекционной структуры, что коррелирует с активностью молекулы.

Все вышесказанное позволило нам сформулировать гипотезу физиологического обновления формина в клетке (рис. 14). В соответствии с этой гипотезой в цитоплазме формин находится в автоингибированном состоянии. Для того, чтобы перевести его в активное состояние необходимо взаимодействие с НПФ (факторы, промотирующие нуклеацию), Rho GTPase и липидами (Maiti et al, 2012). В результате формин переходит в открытую конформацию; его актин-связывающие сайты становятся доступны, это инициирует нуклеацию актинового филамента. Формин при этом остается связанным с плазмалеммой частично через Rho GTPase (Seth et al. 2006), частично это взаимодействие может быть опосредовано DID доменом формина. После отсоединения активатора Rho, формин может какое-то время оставаться на «+» конце филамента, кепируя его. Будучи вытесненным кепирующими белками и/или другими факторами (Chesarone et al, 2010), формин снова возвращается в цитоплазму в автоингибированном состоянии.

Рисунок 14. Схема активации и обновления формина в клетке (Maiti et al, 2012).

4.3. Структура комплекса Агр2/3 и его взаимодействие с лигандами

Формирование лидирующего края при движении клетки контролируется комплексом белков с общим названием Агр2/3. Сам по себе Агр2/3 комплекс имеет низкую способность к нуклеации, поэтому для его активации необходимы белки семейства WASP/WAVE (Shimada et al, 2004). Кристаллическая структура бычьего Агр2/3 комплекса была определена в 2001 году с разрешением 2,0А (Robinson et al, 2001). Было отмечено, что структура субъединиц Агр2 и АгрЗ гомологична структуре мономерного актина, поэтому было высказано предположение, что взаимодействие этих двух субъединиц и активатора (WASP) может служить сайтом нуклеации. Однако кристаллическая структура не давала ответ на вопрос, как происходит нуклеация, так как Агр2 и АгрЗ находились слишком далеко друг от друга.

В данном разделе главы 4 мы изучали проекционные и 3D структуры Агр2/3 комплекса и мутантов с различной нуклеаторной активностью и нашли, что Агр2/3 комплекс существует в растворе в виде смеси нескольких конформаций (рис.15А-В) - открытой, промежуточной и закрытой в различных соотношениях. Количество молекул в открытом состоянии прямо коррелирует с инактивацией нуклеирующей функции комплекса (Rodal et al, 2005). При добавлении активатора WASP мы наблюдали появление новой конформации - закрытого комплекса Агр2/3 с WASP (рис. 15Г). При этом WASP присоединялся в месте взаимодействия субъединиц Агр2 и АгрЗ, что соответствовало высказанным ранее предположениям (Robinson et al, 2001). При добавлении инактиватора Агр2/3 - коронин (Сгп) - все молекулы, взаимодействующие с Сгп, детектировались в открытой конформации (рис. 15Е). Это свидетельствует о том, что инактивация комплекса происходит путем стерического разделения в пространстве ответственных за нуклеацию субъединиц Агр2 и АгрЗ.

Данная гипотеза была подтверждена с использованием недавно открытого инактиватора Агр2/3 комплекса - фактора созревания глии (GMF) (Shi et al, 2006). При добавлении GMF мы не наблюдали закрытой конформации, но появлялась дополнительная конформация - комплекс Агр2/3 с GMF. При сравнении проекционных структур Агр2/3 и Агр2/3 с GMF, дополнительная электронная плотность регистрировалась рядом с субъединицей р19. В результате индуцировалось конформационное изменение, поворачивающее субъединицу АгрЗ и отдаляющее ее от Агр2, что выражается в инактивации нуклеаторной функции Агр2/3 комплекса (Ghandi et al, 2010). В результате проделанных

экспериментов мы смогли сформулировать гипотезу конформационных изменений в комплексе Агр2/3 при активации и инактивации (рис 16).

Рисунок 15. Проекционные структуры Агр2/3: открытая

(А), промежуточная (Б) и закрытая (В). Конформация ¿V-/* i*

Агр2/3 в комплексе с WASP (Г) и в комплексе с Сгп (Е). 'Л-

Д и Ж - соответствующие разностные пики (Rodal et al, i

2005). - r hfi ' t» * ;

Согласно этой гипотезе, активация Агр2/3 происходит в результате конформационного изменения, приближающего субъединицу Агр2 к АгрЗ, при этом вначале перемещается субъединица Агр2 (с образованием промежуточной конформации), а потом АгрЗ (закрытая конформация). Субъединица р18, соединенная с АгрЗ, также перемещается. Активатор WASP, взаимодействуя с Агр2 и АгрЗ, формирует платформу для присоединения следующих мономеров актина. Не так давно 3D структура Агр2/3 с WASP была решена с использованием электронной томографии (Rouiller et al, 2008).

CofonJn

A Г *Ф\ f

Jlftk. У ik. У ftk. ■• - -

Рисунок 16. Гипотеза конформационных перестроек в комплексе Агр2/3 при активации и

инактивации (Rodal et al, 2005). (А) открытая конформация - инактивированный комплекс;

(Б) промежуточная конформация - субъединица Агр2 перемещается; (В) закрытая

конформация с WASP - активированный комплекс. Подписаны основные субъединицы,

Сгп и WASP. Стрелки показывают направление движения субъединиц (Rodal et al, 2005).

Полученные данные полностью подтвердили нашу гипотезу. Более того, методом SAXT было показано, что первый мономер актина на тупом конце филамента действительно взаимодействует вначале с Агр2, а потом с АгрЗ (Bochlowska et al, 2008). Инактивация индуцируется взаимодействием с другими субъединицами комплекса (р35 и р19). Субъединицы р35 и р19 связаны друг с другом посредством С-концевых альфа-спиралей (Robinson et al, 2001), следовательно, конформационное изменение одной субъединицы может инициировать поворот другой. Субъединица р19 соединена с Агр2, соответственно Агр2 отдаляется от АгрЗ, инактивируя комплекс.

В заключение, врезультате исследований, описанных в главе 4, были впервые разработаны детальные модели конформационных изменений актинсвязывающих белков при регулировании динамики цитоскелета и плазматической мембраны. Нуклеаторный комплекс Агр2/3 находится в клетке в трех основных конформациях (открытой, промежуточной и закрытой), отражающих функциональную активность клетки. Активация комплекса происходит при присоединении WASP, инактивация - при взаимодействии с коронином или GMF. Показано, что нуклеатор актина формин является автоингибированным димером. Автоингибирование имеет стерическую природу. Предложены гипотезы конформационных изменений формина в процессе онтогенеза клетки. Впервые обнаружено, что N-концевой домен комплекса Srv2/CAP представляет собой гексамер, в то время как С-конец димеризуется и образует комплекс с G-актином. N-концевой домен специфически взаимодействует с F-актином, усиливая его фрагментацию с участием кофилина.

ГЛАВА 5. СТРУКТУРНЫЕ ОСНОВЫ МОДИФИКАЦИИ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ I-BAR БЕЛКАМИ

При движении клетки скоординированные процессы полимеризации актина и взаимодействие актинового цитоскелета с клеточной мембраной толкают активный край клетки вперед и приводят к образованию филоподий. Эти процессы координируются актинсвязывающими белками (Pollard et al, 2000). Белки, которые способны одновременно связывать актин, и взаимодействовать с плазматической мембраной, модифицируя ее с образованием филоподий (Zimmerberg and Kozlov, 2006) объединяют в одно семейство. Все они содержат так называемые BAR (Bin, Amphiphysin, Rvs) или l-BAR (или invert-BAR) домены. Кристаллические структуры некоторых I-BAR доменов были опубликованы (Millard et al, 2005; Lee et al, 2007;

Pykalainen et al, 2011), однако механизм связывания I-BAR домена с мембраной до сих пор не известен. До недавнего времени предполагалось, что I-BAR взаимодействует с мембраной своей выгнутой стороной, по аналогии с F-BAR доменом (Frost et al, 2009).

5.1. Модификация липидных мембран I-BAR доменами

Для изучения связывания I-BAR домена белка IRSp53 с POPC/PI(4,5)P2 липидов мембраной мы применили молекулярную динамику (в полноатомном и крупнозернистом приближении). Начальные стадии взаимодействия белка с мембраной проходили одинаково в обеих системах, что позволило нам использовать крупнозернистую модель для расчета взаимодействия I-BAR домена с мембраной в течение достаточно длительного времени (500 не). Анализировали три системы, включающие липидный бислой и димерный I-BAR домен (рис. 17А) в различных ориентациях по отношению к мембране (рис. 17В). Изначальная ориентация I-BAR домена не сказывалась на его способности взаимодействовать с мембранами. Во всех исследованных нами системах белок ложился на мембрану через 10 не. Это свидетельствует в пользу гидрофобных взаимодействий между мембраной и белком. В то же время, мы не наблюдали взаимодействия I-BAR домена с нейтрально заряженной мембраной, что демонстрирует наличие электростатических взаимодействий между белком и отрицательно заряженными липидами.

1 2 3

Анализируемая система

Рисунок 17. (А) Структура I-BAR домена; (Б) Изгибание I-BAR доменом мембраны; (В) Средние значения радиуса кривизны за 500 не. Анализируемые системы: 1 -С-концы белка повернуты от мембраны;

2 — вдоль «линии связывания липидов»;

3 - С-концы белка повернуты к мембране. (Певцова с соавт., 2011)

Большинство положительно заряженных аминокислот в исследуемом белке (в основном, лизин и аргинин) расположены на дистальных концах димера и вдоль стороны, противоположной С-концу. Во всех исследованных системах дистальные концы белка слегка погружались в область липидных головок (рис. 17Б). Это может объясняться тем, что на дистальных концах обоих мономеров в позиции 147 находится положительно заряженная аминокислота лизин (К147), которая одинаково доступна при любом положении димера относительно мембраны. Наблюдаемая динамика взаимодействия I-BAR домена с мембраной значительно отличалась от родственных им BAR доменов (Ferguson et al, 2009).У BAR доменов взаимодействие с мембраной начинается с дистальных концов и распространяется на центральную часть (Arkhipov et al, 2008). У I-BAR доменов мы вначале наблюдали взаимодействие между липидами и центральной частью димера. Это взаимодействие индуцировало образование кривизны мембраны уже на ранних стадиях белок-липидного взаимодействия. Природа этого взаимодействия - электростатическая и не стабилизировалась взаимодействием N-концевых спиралей с липидами, как это было предсказано для других белков (Saarikangas et al, 2009).

В зависимости от положения белка, наблюдали различный изгиб мембраны (рис. 17В). Радиус кривизны мембраны в экспериментах флуктуировал от 100 до 200 нм. Это, видимо, связано с тем, что одиночный домен не способен стабильно изгибать мембрану. Однако, одиночный I-BAR димер эффективно связывается с мембраной не своей выгнутой стороной, а вдоль "линии связывания липидов" (Yamagishi et al, 2004). В случае если несколько таких доменов расположены достаточно близко, они могут взаимодействовать друг с другом, поворачиваясь к мембране. При этом кластеры отрицательно заряженных липидов мигрируют к дистальным концам доменов (Левцова с соавт., 2011), которые далее проникают в полярную область мембраны и вызывают образование филоподий. Предполагается, что актинсвязывающие домены, находящиеся на С-конце в составе полноразмерного белка стабилизируют образующуюся филоподию. Для того чтобы изучить эти процессы в 3D пространстве, мы впервые получили структуру полноразмерного I-BAR белка. 5.2. Структура полноразмерного IRSp53

Считается, что в клетке белок IRSp53 находится в автоингибированном состоянии. На это указывает значительное увеличение числа филоподий в клетках, в которых был экспрессирован изолированный I-BAR домен, по

сравнению с клетками, в которых экспрессировали целый белок (Millard et al, 2005). Механизм автоингибирования белка пока не известен. Предполагается также, что активация белков происходит при взаимодействии с молекулами-активаторами, которые изменяют конформацию и пространственное расположение доменов так, что они могут одновременно взаимодействовать с мембранами и актиновым цитоскелетом (Disanza et al, 2006). Изучение очищенного белка методом ПЭМ позволило заключить, что в растворе IRSp53 даже в отсутствие активатора представляет собой смесь молекул в открытой и закрытой конформациях. Преимущество метода ПЭМ состоит в том, что можно из смеси проекций выбрать те, которые находятся в определенной конформации. Используя только проекции с удлиненным фенотипом, мы получили 3D реконструкцию IRSp53 в открытой (предположительно активной) конформации (рис. 18).

Реконструированная молекула имеет двухдоменное строение: вытянутый домен, имеющий размеры 10x1 нм, к которому посередине с помощью двух линкеров прикреплен глобулярный домен с размерами 5x8 нм. Построение молекулярной модели IRSp53 проводили с помощью фиттинга кристаллических структур N-концевого I-BAR домена белка IRSp53 (Yilmaz and Christofori, 2010) и доступных структур гомологичных доменов других белков.

Рисунок 18. Трехмерное строение IRSp53 в открытой конформации. Слева направо: два боковых вида, отличающихся друг от друга на 90°, и вид сверху. Произведен фиттинг кристаллических структур l-BAR, SH3 и WH2 доменов. (Соколова с соавт. 2011)

Фиттинг показал, что вытянутый домен является I-BAR доменом, так как кристаллическая структура последнего хорошо помещается в соответствующей части реконструкции. Компактный домен может поместить по две структуры гомологичных доменов SH3 и WH2, и остается достаточно места для двух CRIB доменов, структура которых до настоящего времени не известна. Полученная 3D

структура хорошо иллюстрирует гипотезу, представленную выше, объясняющую возможный механизм работы белков, содержащих I-BAR домены. Согласно этой гипотезе, I-BAR домен на одном конце белковой молекулы изгибает мембрану, с образованием филоподии, а другой конец молекулы стабилизирует образовывающийся вырост, посредством взаимодействия актинсвязывающего домена WH2 с растущим актиновым филаментом. Наличие в составе 3D структуры обособленных доменов, соединенных гибкими линкерами, способствует осуществлению этой функции.

Таким образом, в главе 5 впервые представлена структура полноразмерного I-BAR белка IRSp53 в открытой конформации и построена модель модификации его I-BAR доменом негативно заряженной мембраны в процессе генерации филоподии. Моделирование показало, что взаимодействия IRSp53 с отрицательно заряженными липидами имеют как электростатическую, так и гидрофобную природу.

ГЛАВА 6. ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА СПИДРОИНОВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ В ТРАНСПЛАНТАЛОГИИ

Одной из важнейших задач современной регенеративной медицины является разработка технологий замены поврежденных или утраченных органов и тканей на сконструированные in vitro биоискусственные аналоги. Одним из элементов технологии создания биоискусственных органов является формирование матрикса из биосовместимых материалов, имитирующих структуру здоровой ткани. Выбор материала для матриксов обусловлен механической прочностью, эластичностью, биосовместимостью на белковом и клеточном уровнях, деградируемостью и пористостью, способностью поддерживать прикрепление, рост и пролиферацию клеток. В последние годы в этой связи наблюдается большой интерес к белкам каркасной нити пауков - спидроинам (Kim et al, 2005). Уникальные свойства белков паутины обусловлены их четвертичной структурой (Jin and Kaplan, 2003). Для изучения фолдинга спидроинов мы разработали модель in vitro (Bogush et al, 2009; Соколова с соавт., 2010). На модели было продемонстрировано, что прочность матрикса зависит не только от способа образования, но и от первичной структуры белка. В процессе образования синтетической нити происходит перестройка губчатого матрикса с образованием нанофибрилл.

Рисунок 19. Спиральная структура нанофибрилл, образованных спидроином I. (А) АСМ изображение; (Б) профиль высот, полученный с помощью АСМ; (В) ПЭМ изображение нано-фибриллы. Стрелки указывают на поворот спирали. (Bogush et al, 2009)

С использованием АСМ и суперострого кантилевера с диаметром около 1 нм (Klinov et al, 2003) мы изучили периодическую структуру нанофибриллы (рис. 19А)6. С помощью ПЭМ показали, что нанофибриллы имеют толщину -10 нм в широкой части и ~5 нм в узкой (стрелка на рис. 19В) и спиральную организацию, с шагом спирали -40 нм (рис. 19В), что хорошо соотносится с данными АСМ. Линейные размеры нанофибрилл сходны с размерами амилоидных фибрилл, исследованных ранее с помощью ПЭМ (Jimenez et al, 2002; Sachse et al, 2006).

Изучение моделирования сборки нанофибрилл и состоящих из них нитей в дальнейшем может дать ключ к пониманию механизма образования фибрилл в природных нитях паутины. Представленные в главе 6 результаты свидетельствуют о принципиальной возможности разработки биоматериалов с уникальными свойствами на основе рекомбинантных аналогов спидроинов путем имитации природных процессов формирования нитей паутины.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Знание атомной структуры белковой молекулы позволяет интерпретировать функциональные изменения в молекуле в процессе ее активации и ингибирования. Для изучения структур белков, до настоящего времени не подвергшихся кристаллизации, перспективными являются комплексные методы, совмещающие структурные эксперименты с компьютерным молекулярным моделированием. При отсутствии кристаллических структур, моделирование

6 В сотрудничестве с Д.В.Клиновым, ИБХ РАН

может проводиться на основе выравнивания гомологичных аминокислотных последовательностей. В данном исследовании моделирование по гомологии проводилось для получения ряда структур мембранных и цитоплазматических доменов ионных каналов, а также глобулярных АСБ. Известно, что каналы эукариот достаточно гомологичны бактериальным каналам, для которых кристаллизация осуществлена более успешно (Doyle et al, 1998; Kuo et al, 2003).

На современном уровне развития протеомики становится все более важным не только определение структуры и функции отдельных белков, но и оценка активности различных мутантов. В частности, мутации в генах, связанных с функционированием потенциал-зависимых ионных каналов, являются причиной таких тяжелых наследственных заболеваний, как глухота, эпилепсия (Ashcroft and Gribble, 2000; Weinreich and Jentsch, 2000; Keating and Sanguinetti, 2001), а также сердечная аритмия (Schmitt et al, 2000), рассеянный склероз (Judge and Bever, 2006) и болевой синдром (Beekwilder et al, 2002). В последние пять лет изучению молекулярного строения ионных каналов уделяется особое внимание во всем мире в связи с разработкой новых эффективных лекарств против этих болезней.

Полученные нами с использованием комплексного подхода модели четвертичных структур мутантных ионных каналов Kv1, Kv2, Kv10 позволили изучить взаимное расположение и специфические взаимодействия цитоплазматических доменов этих каналов, и их роль в регуляции активности. В частности, сравнение структурных данных с результатами электрофизиологических экспериментов позволило сделать вывод о возможном влиянии цитоплазматических доменов на активацию/инактивацию каналов.

Все больше данных свидетельствует о том, что наличие нанофибрилл в нитях паутины обеспечивает ее уникальные механические свойства (Bogush et al, 2008). Полученные в данном исследовании новые знания о четвертичной структуре и конформационных перестройках белков паутины - спидроинов -имеют большое научное и практическое значение. Трехмерные матрицы на основе рекомбинантных спидроинов можно рассматривать в качестве перспективного материала для создания искусственных тканей и органов.

Согласно имеющимся данным, нарушения в функционировании актинсвязывающих белков являются отличительной особенностью необластических клеток (Васильев, 1996; Frame et al, 2002). Недавно открытый в неметастазирующих раковых клетках белок MIM (Lee et al, 2002) и гомологичный ему белок IRSp53 представляют особый интерес для исследования, так как они

одновременно регулируют сборку актиновых филаментов и стимулируют образование филоподий (Yamagishi et al, 2004; Mattila et al, 2007). Результаты исследования ряда структур АСБ, представленные в данной работе, существенно дополнили и скорректировали наши представления о механизмах функционирования АСБ.

Разработанный в данном исследовании комплексный подход к изучению четвертичной структуры белковых молекул на основе просвечивающей электронной микроскопии позволил получить новые молекулярные и структурные данные о строении ряда мембранных и цитоплазматических белков. Эти данные могут служить основой для дальнейших экспериментов по моделированию активации/инактивации, для планирования новых экспериментов по направленному мутагенезу и компьютерного дизайна новых лекарственных средств.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ:

1. Разработан комплексный подход к изучению четвертичной структуры белковых молекул на основе просвечивающей электронной микроскопии.

2. Получены трехмерные структуры ряда мембранных и цитоплазматических белков, до настоящего времени не подвергшихся кристаллизации.

3. С использованием трехмерных структур, моделирования по гомологии и фиттинга построены молекулярные модели ряда мембранных и цитоплазматических белков.

4. Показана принципиальная возможность использования просвечивающей электронной микроскопии в комплексе с молекулярным моделированием для изучения конформационных изменений в мембранных и цитоплазматических белках.

5. Показана возможность разработки биоматериалов с уникальными свойствами путем имитации в лабораторных условиях природных процессов формирования нитей паутины.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: Статьи в международных и отечественных журналах

1. O.Sokolova, L.Kolmakova-Partensky, N.Grigorieff. Three-dimensional structure of a voltage-gated potassium channel at 2.5 nm resolution. - Structure, 2001, v 9, pp. 215-220.

2. O.Sokolova, A.Accardi, D.Gutierrez, A.Lau, M.Rigney, N.Grigorieff. Conformational changes in the С terminus of Shaker K+ channel bound to the rat Kvbeta2-subunit. - Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2003, v 100, pp. 12607-12612.

3. O.Sokolova. Structure of cation channels, revealed by single particle electron microscopy. FEBS Lett. 2004, v 564(3), pp. 251-256.

4. A.A.Rodal, O.Sokolova, D.Robins, S.Hippenmeyer, H.Riezman, N.Grigorieff, and B.L.Goode. Conformational changes in the Arp2/3 complex leading to actin nucleation. Nat. Struct. Mol. Biol., 2005, v 12(1), pp. 26-31.

5. E.L.Paley, L.Smelyanski, V.Malinovskii, P.R.Subbarayan, Y.Berdichevsky, N.Posternak, J.M.Gershoni, O.Sokolova, G.Denisova. Mapping and molecular characterization of novel monoclonal antibodies to conformational epitopes on NH2 and COOH termini of mammalian Tryptophanyl-tRNA Synthetase reveal link of the epitopes to aggregation and Alzheimer's disease. - Mol Immunol. 2007; 44(4):541-57.

6. E.L.Paley, G.Denisova, O.Sokolova, N.Posternak, X.Wang, and A.-L.Brownell. Tryptamine Induces Tryptophanyl-tRNA Synthetase-Mediated Neurodegeneration With Neurofibrillary Tangles in Human Cell and Mouse Models. - Neuro Molecular Medicine, 2007, v.9, pp. 55-82

7. N.Sinitsyna, I.Orshansky, O.Sokolova. Actin-binding proteins - how to reveal the conformational changes. - Journal of Bioinformatics and Computational Biology Vol. 6, No. 4, 2008, pp. 869-884

8. A.V.Pischalnikova and O.S.Sokolova. The domain and conformational organization in potassium voltage-gated ion channels. - Journal of Neuroimmune Pharmacology: Vol. 4, Iss. 1 (2009), pp 71-82.

9. Агапов И.И, Пустовалова О.Л., Мойсенович M.M., Богуш В.Г., Соколова О.С., Севастьянов В.И., Дебабов В.Г., Кирпичников М.П. Трехмерный матрикс из рекомбинантного белка паутины для тканевой инженерии. ДАН, 2009, Т. 426, № 1, стр.

10. Пустовалова О.Л., Мойсенович М.М., Еремин П.С., Архипова А.Ю., Рамонова А.А., Соколова О.С., Богуш В.Г., Агапов И.И., Кирпичников М.П. Культивирование клеток на трехмерной матрице из рекомбинантного спидроина 1. Российский иммунологический журнал, 2009, Т. 3(12), №2, стр. 139-146.

11. V.G.Bogush, O.S.Sokolova, L.I.Davydova, D.V.KIinov, K.V.Sidoruk, N.G. Esipova, T.V.Neretina, I.A.Orchanskyi, V.Yu.Makeev, V.G.Tumanyan, K.V. Shayjtan, V.G.Debabov, M.P.Kirpichnikov. A novel model system for design of biomaterials based

on recombinant analogs of spider silk proteins. - J Neuroimmune Pharmacol. 2009, Vol 4(1): 17-27.

12. О.С.Соколова, В.Г.Богуш, Л.И.Давыдова, С.В.Полевова, С.А.Антонов, Т.В.Неретина, Д.В.Клинов, В.Г.Дебабов, М.П.Кирпичников. Формирование четвертичной структуры рекомбинантными аналогами белков паутины. Молекулярная биология, 2010, т. 44, № 1, стр. 162-169

13. И.И.Агапов, М.М.Мойсенович, Т.В.Васильева, О.Л.Пустовалова,

A.С.Коньков, А.Ю.Архипова, О.С.Соколова, В.Г.Богуш, В.И.Севастьянов,

B.Г.Дебабов, М.П.Кирпичников. Биодеградируемые матриксы из регенерированного шелка Bombyx топ. Доклады академии наук, 2010, т. 433, № 5, с. 1-4

14. О.С.Соколова. Как увидеть «нано»? Природа, 2010, т.9, стр.38-43

15. Danilevich VN, Vasilenko ЕА, Pechnikova EV, Sokolova O.S., Grishin EV. Micro-And Nanoparticles Of Condensed DNA Produced During PCR With Taq-polymerase In Presence Of Plasmid Matrices. Mikrobiologiia. 2011 May-Jun;80(3):411-23.

16. М.Г. Карлова, A.B. Пищальникова, A.A. Рамонова, M.M. Мойсенович, O.C. Соколова, K.B. Шайтан. Тест-система для изучения фолдинга калиевых потенциал-зависимых каналов, экспрессируемых in vitro. Биофизика, 2011, т.56, вып.2, стр 272-279.

17. О.В.Левцова, И.Д.Давлетов, О.С.Соколова, К.В.Шайтан. Молекулярная динамика взаимодействий домена I-BAR белка IRSp53 с отрицательно заряженными мембранами. Биофизика, 2011, т.56, вып.2, стр 242-247.

18. Moisenovich MM, Pustovalova OL, Arhipova AY, Vasiljeva TV, Sokolova OS, Bogush VG, Debabov VG, Sevastianov VI, Kirpichnikov MP, Agapov II. In vitro and in vivo biocompatibility studies of a recombinant analogue of spidroin 1 scaffolds. J Biomed Mater Res A. 2011 96(1):125-31

19. Levtsova OV, Antonov MY, Naumenkova TV, Sokolova O.S.. Interaction of zervamicin IIB with lipid bilayers. Molecular dynamics study. Comput Biol Chem. 2011 35(1):34-9.

20. Agapov II, Moisenovich MM, Druzhinina TV, Kamenchuk YA, Trofimov KV, Vasilyeva TV, Konkov AS, Arhipova AY, Sokolova O.S., Guzeev W, Kirpichnikov MP. Biocomposite scaffolds containing regenerated silk fibroin and nanohydroxyapatite for bone tissue regeneration. Dokl Biochem Biophys. 2011 440:228-30.

21. О.С.Соколова, К.В.Шайтан, А.В.Гризель, А.В.Попинако, М.Г.Карлова, М.П.Кирпичников. Трехмерная структура потенциал-зависимого человеческого

канала Kv10.2 по данным электронной микроскопии макромолекул и молекулярного моделирования. Биоорганическая химия, 2012, т. 2, стр. 1-8.

22. Maiti S, Michelot A, Gould С, Blanchoin L, Sokolova О, Goode BL. Structure and function of purified full-length formin mDial. Cytoskeleton (Hoboken). 2012, 69(6):393-405

23. M.M.Moisenovich, O.Pustovalova, J.Shackelford, T.V.Vasiljeva, T.V.Druzhinina, Y.A.Kamenchuk, V.V.Guzeev, O.S.Sokolova, V.G.Bogush, V.G.Debabov; M.P.Kirpichnikov, I.I.Agapov Tissue regeneration in vivo within recombinant spidroinl scaffolds. J. Biomaterials 2012. 33(15):3887-98

24. А.В.Попинако, О.С.Соколова. Как предсказать неизвестную структуру белка. Природа, 2012, т. 7, стр. 33-38.

Учебные пособия и монографии

25. О.С.Соколова Электронная микроскопия макромолекул. Сборник спецкурсов п/ред. М.П.Кирпичникова и К.В.Шайтана. М., 2007, стр 218-224.

26. О.С.Соколова, А.Г.Богданов, А.В.Гризель. Электронная микроскопия нанобиообъектов. М.: НОУДПО «Институт АйТи», 2011, -142 с.

27. Соколова О.С., Шаров Г.Г., Уласова Н.Ю., Печникова Е.В., Давлетов И.Д., Докрунова А.А. Архитектура актинсвязывающих белков и их полиморфизм при онкозаболеваниях. Сборник «Постгеномные методы исследования», 2011, стр.464491.

Тезисы международных и отечественных конференций

28. Sokolova, О; Grigorieff, N. Physical location of T1 domain in the Shaker potassium channel. // Journal of general physiology 2000 Volume: 116 Issue: 1

Pages: 5A-6A

29. Kolmakova-Partensky, L; Sokolova, O; Miller, C, et al. Expression and purification of two cysteine mutants of Shaker potassium channel for EM gold labeling. // Biophysical Journal 2001 Volume: 80 Issue: 1 Part 2 Pages: 372A

30. Sokolova, OS; Paley, EL Human Tryptophanyl-tRNA synthetase-derived peptides are linked to fibril formation and neurodegeneration // FEBS Journal 2005 V272 Pages: 537-538

31. Sokolova, O; Maiti, S; Grigorieff, N, et al Conformational changes in actin-binding proteins, revealed by single particle electron microscopy. // FEBS Journal 2007 V274 Pages: 107-107

32. Khasigov, P; Grachev, S; Kovalyov, L, et al. Glycoproteomic approach to the search of blomarkers in blood serum at prostate cancer. // FEBS Journal 2008 Volume: 275 Pages: 245-245

33. Sokolova, O; Bogush, V; Davydova, L, et al. The nanofibrils formation by the recombinant analogs of spidroins I and II // FEBS Journal 2008 V275 Pages: 372

34. Пищальникова A.B, Соколова O.C. Локализация С-концевых цитоплазматических доменов человеческого канала Kv2.1. // Сборник тезисов докладов Международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехнологий. - М.: Роснано, 2008. -с.493-494

35. Sharov G.G., Sokolova O.S. Exploration the structure of N-terminus of recombinant CAP protein. // The reports of the third student symposium on bioengineering 25 October 2008. - Moscow: MSU press, 2008. p. 39-43

36. Пищальникова A.B., Соколова O.C. Локализация цитоплазматических доменов человеческого канала Kv2.1. // Сборник тезисов. Первая международная конференция 17-19 июня 2008 г. Современные достижения бионаноскопии,- М.: изд-во Физического факультета МГУ, 2008. - с.45

37. Карлова М.Г., Пищальникова А.В., Рамонова А.А., Мойсенович М.М., Соколова O.C. In-vitro флуоресцентный тест на правильность фолдинга калиевого потенциал-зависимого канала // Сборник тезисов. Вторая международная конференция 16-18 июня 2009 г. Современные достижения бионаноскопии. - М.: изд-во Физического факультета МГУ, 2009. - с.ЗО

38. Sharov G.G., Chaudry F.A., Goode B.L., Sokolova O.S. Reconstruction of N-terminus of recombinant CAP/SRV2 protein, which participates in actin cytoskeleton turnover. // International Competition of scientific papers in nanotechnology for young researchers.- Moscow: Rusnano, 2009. p.837-838

39. Пищальникова A.B., Карлова М.Г., Рамонова A.A, Мойсенович M.M., Соколова O.C. Разработка флуоресцентного теста in-vitro на правильность фолдинга калиевых потенциал-зависимых каналов // Тезисы докладов четвертого студенческого симпозиума по биоинженерии 30 октября 2009. - М.: изд-во МГУ, 2009. - с.45-48.

40. Пищальникова А.В., Карлова М.Г., Рамонова А.А, Мойсенович М.М., Соколова О.С. Флуоресцентный метод скрининга лигандов калиевых потенциал-зависимых каналов // Перспективы развития инноваций в биологии: Материалы III научно-практической конференции, 11-13 ноября 2009 г., Москва, МГУ имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет. - М.: МАКС пресс, 2009. - с. 134 - 135.

41. Соколова О.С. Доменная организация и конформационные изменения белков, ассоциированных с клеточной поверхностью. Сборник трудов IV

. Российского симпозиума «Белки и пептиды» - Казань, 2009 с. 89

42. Sharov G.G., Chaudhry F.A., Goode B.L., Sokolova O.S. 3D-reconstruction of the structure of recombinant actin binding C-CAP domain using electron microsopy. // The reports of the Fourth International Conference «Progress and trends in BIONANOSCOPY» The MSU faculty of physics, 2010. p. 83-84

43. Пищальникова A.B., Соколова О.С. Получение потенциал-зависимого калиевого канала Неад2 для структурных исследований. Современные проблемы биохимии и биохимии и бионанотехнологии. Сборник трудов Всероссийской Виртуальной Интернет-конференции. Казань, 17-22 Ноября 2010 г. - Казань. Издательство Казанского Университета с. 129-131.

44. Соколова О.С., Карлова М.Г., Пищальникова А.В., Браже Н.А., Казакова Т.А., Новоселецкий В.Н., Максимов Г.В., Шайтан К.В. Изучение взаимодействия белков потенциал-зависимых ионных каналов человека с блокаторами, перспкетивными для создания фармакологических препаратов направленного действия // Труды первой международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной практике и клинической медицине» М.,2010, Стр.114-115.

45. G.G.Sharov, F.A.Chaudhry, B.L.Goode and O.S.Sokolova Three-dimensional Structure and Oligomeric State of the N-terminal Peptide of CAP/Srv2 Complex Microscopy and Microanalysis, 2011, V17, Iss S2, pp 128 - 129.

46. O.S.Sokolova, E.L.Paley. Axon Loss and Mitochondria Damage in Mice brain after Tryptamine Treating. Microscopy and Microanalysis, 2011, V17. Iss S2, pp 186 -187.

47. Шайтан K.B., Соколова O.C., Кирпичников М.П. Структурные и энергетические аспекты взаимодействия белков потенциал-зависимых каналов человека с лигандами (блокаторами). Сборник трудов V Российского симпозиума «Белки и пептиды» - Петрозаводск, 2011 с. 89

48. O.Sokolova, Y.Efremov, A.Dokrunova, О. Vorontsova, D.Bagrov inactivation of actin-binding protein affects elastic properties of eucaryotic cells. // International Jeque Monod Conference "Molecular basis for membrane remodelling and organization" CNRS, Strasbourgh, France. 2011, P. 59

49. Шаров Г.Г., Гуде Б.Л., Чаудри Ф.А., Соколова О.С. Реконструкция N-концевого фрагмента рекомбинантного CAP/SRV2-6enKa, участвующего в

обновлении актинового цитоскелета клетки. // Труды 5 интернациональной конференции «Успехи Бионаноскопии» М., 2011, Стр. 66-67.

50. ... Ю,М. Ефремов, A.A. Докрунова, Д.В. Багров, К.В. Шайтан, О.С. Соколова Атомно-силовая микроскопия как инструмент для измерения механических свойств клеток // Россия, Москва, Современные достижения бионаноскопии, Шестая международная конференция, сборник тезисов. - 2012. с. 22.

51. Ю.М. Ефремов, A.A. Докрунова, Д.В. Багров, О.В. Воронцова, К.В. Шайтан, О.С. Соколова Сравнение механических свойств нормальных и раковых клеток методом атомно-силовой микроскопии // Россия, Москва, Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты, V Всероссийская научно-практическая конференция, материалы. -2012. с. 39-40

Благодарности Выражаю искреннюю благодарность моим коллегам за плодотворное сотрудничество, постоянную подцержку и доброжелательную критику, без чего эта работа не могла бы состояться: М.П.Кирпичникову, К.В.Шайтану, В.О.Попову, Т.В.Калебиной, Г.Н.Давидовичу, И.И.Агапову, М.М.Мойсеновичу, А.В.Гризель (Пищальниковой), Н.Ю.Уласовой (Синицыной), Д.В.Багрову, В.Н.Новоселецкому, О.В.Левцовой, А.К.Шайтану, А.В.Попинако, М.Г.Карловой, Е.С.Трифоновой, Г.Г.Шарову, Т.Б.Станишневой-Коноваловой, Г.С.Глухову, И.Д.Давлетову, А.А.Докруновой, А.Г.Богданову, С.В.Полевовой, Т.В.Неретиной, (Биологический факультет МГУ), Н.А.Киселеву, Е.В.Печниковой (ИКРАН), Christopher Miller, Nikolaus Grigorieff, Bruce Goode, Ludmilla Kolmakova-Partensky, Ludmilla Reshetnikova, Chen Xu, Matthias Wolf, Duncan Sousa (Brandeis University), В.Г.Богушу (ГосНИИГенетика), Д.В.Клинову (ИБХ), Dennis Wray, Louisa Stevens, Peter Henderson (Leeds University), Anna Moroni, Giorgio Scita (Milano University), Pekka Lappalainen (University Helsinki), Elena Paley (Nova University). Также я благодарю моих родных и близких за постоянную поддержку и понимание.

Исследования, результаты которых представлены в диссертации, были поддержаны фантами РФФИ (№№ 07-04-12172, 08-04-01348, 08-04-91125, 08-0491759, 09-04-12146, 09-04-11518 и 11-04-11511), а также фантами CRDF (Na 2918), 7 Рамочной программы Евросоюза (EDICT, № 201924), Минобрнауки (ГК №№ 14.740.11.0255, 16.740.11.0373 и 14.740.11.0760) и междисциплинарной профаммы МГУ «Молекулярно-генетические основы заболеваний человека» (№ гос.рег. 01200955935). Автор являлась лауреатом стипендий фонда McNair (1999) и фонда Jane Coffin Childs (2000-2002), была награждена дипломом фонда «Культурная инициатива» за разработку обучающей базы данных и дипломами Рособразования РФ за руководство студенческими научными работами (2009, 2010). В 2012 г. автор стала лауреатом конкурса «Авангард Знаний» компании Астразенека.

Подписано в печать 09.10.2012 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1249 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Соколова, Ольга Сергеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К ИЗУЧЕНИЮ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ МАКРОМОЛЕКУЛ.

1.1. Применение электронной микроскопии в биологии, основы структурной протеомики.

1.2. Подготовка образцов нанобиообъектов.

1.2.1. Объектные сетки и пленки-подложки:.

1.2.2. Негативное контрастирование - преимущества и недостатки:.

1.2.3. Крио-микроскопия:.

1.2.4. Формирование изображения в ПЭМ:.

1.3. Получение электронно-микроскопических изображений. Разрешение и критерии его оценки.

1.3.1. Сходство и различие светового и электронного микроскопов:.

1.3.2. Аберрации:.

1.4. Принципы реконструкции макромолекул.

1.4.1. Сбор изображений частиц:.

1.4.2. Двухмерные проекции как основа для трехмерного изображения:.

1.4.3. Преобразование Фурье и факторы, влияющие на реконструкцию:.

1.4.4. Центрирование:.

1.4.5. Трансляционное и ротационное выравнивание:.

1.4.6. Классификация электронно-микроскопических изображений.

1.5. Трехмерная реконструкция: основные принципы.

1.5.1. Факторы реконструкции:.

1.5.2. Метод случайного конического наклона (КСТ):.

1.5.3. Метод обратных проекций:.

1.5.4. Сопоставление проекций:.

1.5.5. Разрешение реконструкции:.

1.6. Методы определения трехмерной структуры целых клеток и клеточных органелл

1.6.1. Стереопары:.

1.6.2. Принципы электронной томографии:.

1.7. Интерпретация трехмерной структуры.

1.7.1. «Визуальный» фиттинг.

1.7.2. Фиттинг известной кристаллической структуры:.

1.7.3. Программы для автоматического фиттинга:.

1.7.4. Построение молекулярных моделей белков на основе моделирования по гомологии:.

1.7.5. Мечение антителами или иммуномечение:.

1.7.6. Мутагенез:.

1.7.7. Кластеризация и образование комплексов:.

1.7.8. Мечение наночастицами золота:.

1.8. Значение структурной информации для медицины.

1.8.1. Роль потенциал-зависимых калиевых каналов в организме человека.

1.8.2 Канал Ку2.1.

1.8.3. Канал Ку1 0.2:.

1.8.4. Роль АСБ в организме человека:.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Комплексный подход к исследованию структуры белков на основе электронной микроскопии"

3.2. Очистка белков Kv каналов.90

3.2.1. Kv1.1:.91

3.2.2. Kv2.1áC и Kv2.1ACTA:.92

3.2.3. Kv10.2:.92

3.3. Электронная микроскопия и обработка изображений:.93

3.4. Строение и конформационные изменения канала Kv1.1 (Shaker).96

3.4.1. Трехмерная структура канала Shaker.96

3.4.2. Интерпретация 3D структуры и локализация доменов канала Shaker.98

3.4.3. Конформационные перестройки С-концевого домена канала Kv1 (Shaker) при взаимодействии с р-субъединицей:.100

3.5. Трехмерная структура канала Kv2.1 и докализация его С-концевых доменов.107

3.5.1. Трехмерные структуры мутантных каналов Kv2.1ACTA и Kv2.1aC:.108

3.5.2. Интерпретация 3D структур и локализация цитоплазматических доменов канала Kv2.1:.110

3.5.3. Сравнение структурных данных о цитоплазматических доменах канала Kv2.1 с экспериментальными:.112

3.5.4. Локализация «окон» между цитоплазматической и мембранной частями канала Kv2.1:.113

3.5.5. Конформационные изменения мембранного домена канала Kv2.1:.114

3.6. Построение молекулярной модели полноразмерного канала Kv10.2.121

3.7. Кластеризация Kv каналов и роль цитоплазматических доменов в этом процессе. .126

3.7.1. Кластеризация каналов Kv2.1.126

3.7.2. Кластеризация каналов Kv10.2.129

3.7.3. Механизм образования кластеров.129

3.8. Гипотеза изменения конформационного состояния калиевых каналов при активации

131

3.9. Заключение.133

ГЛАВА 4 КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В АКТИНСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКАХ ПРИ АКТИВАЦИИ И ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ЛИГАНДАМИ.134

4.1. Введение.134

4.2.Трехмерная структура комплекса CAP/srv2.134

4.2.1. Очистка белка Srv2:.136

4.2.2. Электронная микроскопия и обработка изображений:.136

4.2.3. Трехмерная структура N-Srv2:.137

4.2.4. Функциональная характеристика гексамера N-Srv2:.139

4.2.5. Структура С-концевого домена Srv2:.143

4.2.6. Модель полноразмерного комплекса Srv2:.145

4.3. Трехмерная структура формина mDial и основы его автоингибирования.147

4.3.1. Очистка формина, электронная микроскопия и обработка изображений:.148

4.3.2. 3D структура формина mDial (55-1255), полученная с помощью метода RCT: 149

4.3.3. 3D структура формина mDial (55-1255), полученная с помощью метода обратных проекций:.149

4.3.4. Интерпретация 3D структуры формина:.152

4.3.5. Сравнение ПЭМ данных о расположении доменов формина с данными рентгенострукгурного анализа:.155

4.3.6. Гипотеза физиологического обновления формина в клетке:.156

4.4. Структура комплекса Агр2/3 и его взаимодействие с лигандами.157

4.4.1. Электронная микроскопия и обработка изображений:.158

4.4.2. Конформационные изменения Агр2/3 комплекса при взаимодействии с лигандами:.159

4.4.3. Роль субъединицы р35 в активации Агр2/3 комплекса:.162

4.4.4. Гипотеза конформационных изменений Агр2/3 комплекса при активации и инактивации:.164

4.5. Заключение.165

ГЛАВА 5. СТРУКТУРНЫЕ ОСНОВЫ МОДИФИКАЦИИ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ I-BAR БЕЛКАМИ.166

5.1. Введение.166

5.2. Модификация липидных мембран I-BAR доменами.167

5.3. Структура полноразмерного IRSp53.175

5.3.1. Очистка IRSp53:.175

5.3.2. Электронная микроскопия и обработка изображений.176

5.3.3 Трехмерная структура полноразмерного IRSp53.177

5.4. Заключение.178

ГЛАВА 6. ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА СПИДРОИНОВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ В ТРАНСПЛАНТАЛОГИИ.179

6.1. Введение.179

6.2. Морфология синтетических нитей паутины.180

6.2.1. Морфология «0»-нитей:.180

6.2.2. Формование и морфология вытянутых нитей:.182

6.3. Морфология нанофибрилл, образованных белками паутины.185

6.4. Модельная система для изучения фолдинга нитей паутины.189

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.192

ВЫВОДЫ:.194

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА.195

БЛАГОДАРНОСТИ.221

Мы не должны обижаться на тех ученых, которые вначале не поверили в электронный микроскоп» Э.Руска, Нобелевская лекция, 1986 г.

ВВЕДЕНИЕ

Современная молекулярная биология стремительно расширяет круг знаний, область интересов перемещается от одиночных молекул к более сложным молекулярным машинам, растет потребность в структурной информации о комплексах нанобиообъектов.

В настоящее время (2012 г.) в мире расшифровано более 77000 атомных структур белков, в их числе мембранные белки, ионные каналы, аквапорины, рибосомальные субъединицы и др. Однако структура одиночного компонента может рассматриваться только как первый шаг к пониманию основ функционирования всей системы в целом. Известно, что изменение конформационного состояния белка отражается на его функциональной активности (Рубин, 2004). Знание структуры макромолекулярных комплексов дает возможность интерпретировать конформационные изменения в молекулах в процессе их активации и автоингибирования, а также при связывании с лигандами и/или плазматической мембраной.

Признанными методами для изучения структуры и конформационных изменений в белковых молекулах являются: рентгеноструктурный анализ, ЯМР, метод спиновых меток, детекция люминисценции и спектроскопические методы ((Blow, 2002; Tyszka et al, 2005; Вассерман & Коварский, 1986)). Каждый из этих методов имеет свои преимущества и ограничения. Большинство методов способны детектировать лишь незначительные изменения полипептидной цепи и далеко не всеми методами можно определить, какая часть белка и как изменила свою конформацию. Световая микроскопия в последние годы достигла разрешения около 50 нм, используя флуоресцентные маркеры и FRET метод наблюдения отдельных молекул (Huang et al, 2009). Рентгеновская томография позволяет изучать толстые (около 10 мкм) срезы с разрешением 15 нм (McDermott et al, 2009). Метод просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) макромолекул позволяют визуализировать не только трехмерную структуру, но и динамику самых разнообразных биологических нанообъектов с разрешением от 25 нм до атомного (0,2 нм) (Al-Amoudi et al, 2004; Bhushan et al, 2011; Dubochet et al, 1988; Gonen et al, 2005; Henderson et al, 1990; Zlegler et al, 2002). I

IS f

Метод ПЭМ не обременен многими сложностями, характерными для других структурных методов: в нем нет лимитирующего размера частиц, не обязательно наличие кристаллов, количество используемого материала достаточно мало, крио-модификация метода ПЭМ позволяет наблюдать молекулы в нативном водном окружении в состоянии, близком к физиологическому (Dubochet et al, 1988; Koster et al, 1997; Lucic et al, 2008; Mcintosh et al, 2005). В сочетании с методом реконструкции макромолекул (Van Heel, 1987а) и фиттингом кристаллических структур, ПЭМ белков позволяет получить представление о трехмерной структуре и конформационных изменениях макромолекулярных комплексов. Для изучения замороженных срезов клеток и тканей используют крио-томографию (Al-Amoudi et al, 2004; Hsieh et al, 2002).

В данной работе метод ПЭМ использовался для получения впервые трехмерных структур крупных мембранных и цитоплазматических глобулярных белков, а также для изучения основ формирования фибриллярных структур белками паутины, спидроинами.

Для достижения цели решаются следующие задачи:

1. Формулировка основных положений комплексного подхода к изучению четвертичной структуры белков;

2. Получение трехмерных структур ряда мембранных и цитоплазматических белков с разрешением 1,8-2,5 нм;

3. Построение молекулярных моделей белков на основе моделирования по гомологии и фиттинга;

4. Изучение конформационных перестроек в белковых молекулах при активации, взаимодействии с лигандами и с плазматической мембраной.

В работе были исследованы важные структурные особенности макромолекул и белок-белковых комплексов, до настоящего времени не закристаллизованных. В работе впервые:

1. Получены трехмерные структуры калиевых потенциал-зависимых каналов Kv1.1, Kv2.1, Kv10.2 и их транкированных мутантов с разрешением 2,0-2,5 нм;

2. Получены трехмерные структуры актинсвязывающих белков (mDial, Агр2/3, Srv2, IRSp53) и их изолированных доменов с разрешением 1,8-2,5 нм;

3. Показано наличие конформационных перестроек в цитоплазматических доменах калиевых потенциал-зависимых каналов при межмолекулярных взаимодействиях, связывании лигандов и проведении ионов;

4. Изучены структурные основы кластеризации потенциал-зависимых каналов семейства Kv10;

5. Предложена гипотеза изменения конформационного состояния калиевых каналов при активации;

8. Предложена гипотеза изменения конформационного состояния формина в зависимости от его функционального состояния;

9. Определено олигомерное строение комплекса Srv2, и показано, что олигомер N-концевых доменов Srv2 способен взаимодействовать с полимиризованым F- актином в присутствии кофилина;

10. Изучены структурные основы активации и модификации плазматической мембраны I-BAR белками;

11. Разработана модель для изучения фолдинга белков паутины и получена структура нанофибрилл спидроина I.

Полученные знания в дальнейшем могут быть применены для теоретических исследований в области строения белков, белок-белковых комплексов, как структурные предпосылки для молекулярного моделирования (направленная доставка лекарств, дизайн новых лекарственных средств), а также для практической работы по детекции и анализу наночастиц биологического происхождения. Результаты моделирования in vitro процессов прядения паутины свидетельствуют о принципиальной возможности разработки биоматериалов с уникальными свойствами на основе рекомбинантных аналогов белков паутины путем имитации природных процессов формирования нитей паутины. Эти результаты используются при производстве матриксов для культивирования клеток в транспланталогии.

Материалы диссертации используются при чтении курсов «Введение в методы микроскопии в биологии» студентам, обучающимся по специальности «Биоинженерия» на кафедре биоинженерии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова. Современные методы, изложенные в диссертации, включены в разделы практикумов по биоинженерии на кафедре биоинженерии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, используются студентами и аспирантами при выполнении курсовых, дипломных, магистерских и диссертационных работ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

3D - трехмерный

ACF - автокорреляционная функция

АдТх2 -аджитоксин-2

СС - взаимно-коррелятивная функция

CD - круговой дихроизм

CMC -критическая концентрация мицелл

CTF - частотно-контрастная характеристика

FTIR - инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

FRC - коэффициент двумерной корреляции Фурье

FSC - коэффициент объемной корреляции Фурье

GFP - зеленый флуоресцентный белок

Kv - потенциал-зависимые калиевые каналы

RCT - метод случайного конического наклона

RMSD - среднеквадратичное отклонение

TIRFM - флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения а.к. - аминокислота

АСБ - актинсвязывающие белки

АСМ - атомно-силовая микроскопия

КРЭП - карты распределения электронной плотности

МД - молекулярная динамика

ММ - молекулярное моделирование

МРА - мультирефересный анализ

МСА - многомерный статистический анализ

НПФ - факторы, способствующие нуклеации

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЗС - прибор с зарядовой связью

ПО - программное обеспечение

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия

ЯМР - ядерно-магнитный резонанс

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Соколова, Ольга Сергеевна

ВЫВОДЫ:

5. Показана возможность разработки биоматериалов с уникальными свойствами путем имитации природных процессов формирования нитей паутины.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Знание атомной структуры белковой молекулы позволяет интерпретировать функциональные изменения в молекуле в процессе ее активации и ингибирования. Однако далеко не все структуры белков известны к настоящему времени. Для изучения структур белков, не подвергшихся кристаллизации, перспективными являются комплексные методы, совмещающие структурные эксперименты с компьютерным молекулярным моделированием. При отсутствии кристаллических структур, моделирование может проводиться на основе выравнивания гомологичных аминокислотных последовательностей. В данном исследовании моделирование по гомологии проводилось для получения ряда структур мембранных и цитоплазматических доменов ионных каналов, а также глобулярных АСБ. Известно, что каналы зукариот достаточно гомологичны бактериальным каналам, для которых кристаллизация осуществлена более успешно (Doyle et al, 1998а; Kuo et al, 2003).

На современном уровне развития протеомики становится все более важным не только определение структуры и функции отдельных белков, но и оценка активности различных мутантов. В частности, мутации в генах, связанных с функционированием потенциал-зависимых ионных каналов, являются причиной таких тяжелых наследственных заболеваний, как глухота, эпилепсия, а также сердечная аритмия, рассеянный склероз и болевой синдром (Beekwilder et al, 2003; Droge & Schipper, 2007; Niizuma et al, 2009; Reynolds et al, 2007). В последние пять лет изучению молекулярного строения ионных каналов уделяется особое внимание во всем мире в связи с разработкой новых эффективных лекарств против этих болезней.

Все больше данных свидетельствует о том, что наличие нанофибрилл в нитях паутины обеспечивает ее уникальные механические свойства (Bogush et al, 2009). Полученные в данном исследовании новые знания о четвертичной

192 структуре и конформационных перестройках белков паутины - спидроинов -имеют большое научное и практическое значение. Трехмерные матрицы на основе рекомбинантных спидроинов можно рассматривать в качестве перспективного материала для создания искусственных тканей и органов.

Согласно имеющимся данным, нарушения в функционировании актинсвязывающих белков являются отличительной особенностью необластических клеток (Васильев, 1996). Открытый в неметастазирующих раковых клетках белок MIM (Lee et al, 2002) и гомологичный ему белок IRSp53 представляют особый интерес для исследования, так как они одновременно регулируют сборку актиновых филаменов и стимулируют образование филоподий (Mattila et al, 2003). Результаты исследования ряда структур АСБ, представленные в данной работе, существенно дополнили и скорректировали наши представления о механизмах функционирования АСБ.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Соколова, Ольга Сергеевна, Москва

1. Abola ЕЕ, Sussman JL, Prilusky J, Manning NO (1997) Protein Data Bank archives of three-dimensional macromolecular structures. Methods Enzymol 277:556-571

2. Adair B, Nunn R, Lewis S, Dukes I, Philipson L, Yeager M (2008) Single particle image reconstruction of the human recombinant Kv2.1 channel. BiophysJS4: 2106-2114

3. Adrian M, Dubochet J, Fuller SD, Harris JR (1998) Cryo-negative staining. Micron 29:145-160

4. Aizenman E, Stout AK, Hartnett KA, Dineley KE, McLaughlin B, Reynolds IJ (2000) Induction of neuronal apoptosis by thiol oxidation: putative role of intracellular zinc release. J Neurochem 75: 1878-1888

5. Al-Amoudi A, Chang JJ, Leforestier A, McDowall A, Salamin LM, Norlen LP, Richter K, Blanc NS, Studer D, Dubochet J (2004) Cryo-electron microscopy of vitreous sections. Embo J 23:3583-3588

6. Alber F, Forster F, Korkin D, Topf M, Sali A (2008) Integrating diverse data for structure determination of macromolecular assemblies. Annu Rev Biochem 77:443-477

7. Albrecht B, Lorra C, Stocker M, Pongs О (1993) Cloning and characterization of a human delayed rectifier potassium channel gene. Receptors Channels 1:99-110

8. Andre I, Bradley P, Wang C, Baker D (2007) Prediction of the structure of symmetrical protein assemblies. Proc Natl Acad Sci U S A 104:17656-17661

9. Andrianantoandro E, Pollard TD (2006) Mechanism of actin filament turnover by severing and nucleation at different concentrations of ADF/cofilin. Mol Cell 24:13-23

10. Arkhipov A, Yin Y, Schulten К (2008) Four-scale description of membrane sculpting by BAR domains. Biophys J 95: 2806-2821

11. Baker TS, Johnson JE (1996) Low resolution meets high: towards a resolution continuum from cells to atoms. Curr Opin Struct Biol 6:585-594

12. Ben-Zeev E, Kowalsman N, Ben-Shimon A, Segal D, Atarot T, Noivirt O, Shay T, Eisenstein M (2005) Docking to single-domain and multiple-domain proteins: old and new challenges. Proteins 60:195201

13. Berchanski A, Segal D, Eisenstein M (2005) Modeling oligomers with Cn or Dn symmetry: application to CAPRI target 10. Proteins 60:202-206

14. Berendsen HJC, Vanderspoel D, Vandrunen R (1995) Gromacs a Message-Passing Parallel Molecular-Dynamics Implementation. Comput Phys Comrrwn 91:43-56

15. Berriman J, Unwin N (1994) Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets. Ultramicroscopy 56:241-252

16. Bhushan S, Hoffmann T, Seidelt B, Frauenfeld J, Mielke T, Berninghausen O, Wilson DN, Beckmann R (2011) SecM-stalled ribosomes adopt an altered geometry at the peptidyl transferase center. PLoS Biol 9: el000581

17. Bixby KA, Nanao MH, Shen NV, Kreusch A, Bellamy H, Pfaffinger PJ, Choe S (1999) Zn2+-binding and molecular determinants of tetramerization in voltage-gated K+ channels. Nat Struct Biol 6:38-43

18. Blow D (2002) Outline of Crystallography for Biologists, Oxford: Oxford University Press.

19. Bompard G, Sharp SJ, Freiss G, Machesky LM (2005) Involvement of Rac in actin cytoskeleton rearrangements induced by MIM-B. J CellSci 118:5393-5403

20. Bossy-Wetzel E, Schwarzenbacher R, Lipton SA (2004) Molecular pathways to neurodegeneration. Nat Med 10 Suppl: S2-9

21. Bracey K, Ju M, Tian C, Stevens L, Wray D (2008) Tubulin as a binding partner of the heag2 voltage-gated potassium channel. J Membr Biol 222:115-125

22. Cai L, Makhov AM, Schafer DA, Bear JE (2008) Coronin IB antagonizes cortactin and remodels Arp2/3-containing actin branches in lamellipodia. Cell 134:828-842

23. Cai SO, Sesti F (2007) A new mode of regulation of N-type inactivation in a Caenorhabditis elegans voltage-gated potassium channel. J Biol Chem 282:18597-18601

24. Camacho J (2006) Ether a go-go potassium channels and cancer. Cancer Lett 233:1-928.

Информация о работе

Соколова, Ольга Сергеевна
доктора биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.02

Диссертация

Комплексный подход к исследованию структуры белков на основе электронной микроскопии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы