Экспериментальные подходы к изучению тонкой трехмерной морфологии клеток возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы и некоторые особенности их поверхностных ультраструктур

Кузнецов, Олег Святославович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспериментальные подходы к изучению тонкой трехмерной морфологии клеток возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы и некоторые особенности их поверхностных ультраструктур
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальные подходы к изучению тонкой трехмерной морфологии клеток возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы и некоторые особенности их поверхностных ультраструктур"

994618842

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВ Олег Святославович

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ ТОНКОЙ ТРЕХМЕРНОЙ МОРФОЛОГИИ КЛЕТОК ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЧУМЫ, ХОЛЕРЫ, СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ И НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИХ ПОВЕРХНОСТНЫХ УЛЬТРАСТРУКТУР

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Саратов-2010

2 3 ЛЕН

004618842

Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумш институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты пр потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Коннов Николай Павлович

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Плотников Олег Петрович

доктор биологических наук,

доцент Гулий Ольга Ивановна

Ведущая организация: ФГУЗ «Иркутский ордена Трудового Красного Знаме научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока»

диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатск диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумш институт «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российск научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Защита состоится

часов на заседай

Учёный секретарь диссертационного совета • доктор биологических наук, старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Среди особо опасных инфекций бактериальной природы, в последние годы привлекающих большое внимание ученых, выделяются возбудители чумы, холеры и сибирской язвы, унесшие миллионы жизней в периоды пандемий и эпидемий. Пристальное внимание к этим биологически опасным агентам вызвано как постоянно существующей угрозой возникновения этих заболеваний на территории России, так и довольно высокой вероятностью использования их в качестве орудия биотерроризма.

Следует отметить, что в освещении патогенеза заболеваний, вызванных возбудителями чумы, холеры и сибирской язвы, важное место занимают знания об особенностях их строения и механизмах их взаимодействия с макроорганизмом. Для понимания этих процессов целесообразно привлечение современных экспериментальных подходов.

Перспективными являются подходы, позволяющие получать новые данные о субклеточном строении бактерий при их трехмерной визуализации. Так, использование современных информационных технологий в медицине и биологии существенно расширяет возможности традиционных способов изучения микромира: позволяет получать новую информацию об объекте исследования, осуществлять моделирование микрообъектов живой природы с сохранением их истинных размеров и форм, проводить компьютерную видовую диагностику в трехмерном режиме и накапливать информацию об их биоразнообразии [Verbeek F.J., 2002].

Создание системы экспериментальных подходов трехмерной ультраморфологии дает возможность получать, хранить и анализировать информацию о форме, рельефе поверхности и пространственных параметрах бактерий. Изучение ультраструктуры микроорганизмов необходимо, в первую очередь, для определения их приспособительной изменчивости, функциональной морфологии, поисков новых ключевых признаков и экологии микромира [Золотарев А.Г. с соавт., 2006; Gonzalez R.C. et al., 1992]. Имеющиеся сведения по морфо-функциональному анализу бактериальных клеток показывают, что они являются сложными высокоспециализированными организмами, способными к адаптации в окружающей среде и коллективному взаимодействию с другими макро- и микроорганизмами [Олескин А.В. с соавт., 2000; Shapiro J.А., 1998; Miller М.В. et al., 2001; Palkova Z. et al., 2006; Ben-Jacob E„ 2008].

Для полного понимания сложных пространственных механизмов и процессов, происходящих в клетке на ультраструктурном уровне, необходима визуализация и изучение ее трехмерной морфологии с высоким разрешением [Russ J.C., 1995]. Построение специализированной информационной системы для воссоздания цифровых трехмерных моделей микрообъектов живой природы является весьма актуальной задачей.

Однако в направлении трехмерного моделирования биологических ультраструктур имеется много нерешенных задач. В частности, не отработаны алгоритмы восстановления структур по серийным срезам, нет автоматизации процесса построения изображений, снижения его сложности и трудоемкости [Пучков Е.О., 2010; Loebl J., 1985; Soille P., 2004].

Все это привело к тому, что на сегодняшний день получены приближенные трехмерные изображения только нескольких видов микроорганизмов - дрожжевых клеток, кишечной палочки [Milliard А., 2007; Gonzalez R.C., 2008]. По имеющимся литературным данным и источникам Internet в настоящее время нет сведений об исследовании тонкой трехмерной структуры бактерий особо опасных инфекций.

Известно, что поверхностные структуры микроорганизма определяют характер его взаимодействия с макроорганизмом, обеспечивая развитие инфекционного или иммунного процесса. Кроме того, поверхностные структуры принимают участие в соединении с абиотической поверхностью, что способствует выживанию патогенов при нахождении вне живого организма [Кутырев В.В.с соавт., 2007; Mesnage S. et al., 1998; Faruque S.M. et al., 2008]. Это обстоятельство способствует повышению интереса к изучению поверхностных структур возбудителей особо опасных инфекционных болезней, тем более что в настоящее время появились новые методические подходы для их изучения с помощью электронной и зондовой микроскопии.

При подготовке высококачественного материала к электронно- и зондово-микроскопическим исследованиям требуется большое количество обязательных приемов, что приводит к потере значительного числа изучаемого материала, поэтому совершенствование технических приемов особенно актуально в связи с перспективами практического применения и возможностью максимального сохранения его ультраструктуры.

Таким образом, проведение комплекса работ, включающих создание устройства подготовки сверхмалого количества биологического материала для электронно-микроскопического исследования, разработку компьютерно-математического алгоритма для трехмерного моделирования клеток возбудителе! чумы, холеры и сибирской язвы, является актуальной задачей.

Цель работы - разработка методических подходов к изучению трехмерно! тонкой морфологии клеток возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы на баз создания компьютерно-математического алгоритма обработки изображений исследование их поверхностных ультраструктур.

Задачи исследования:

1. Разработать устройство для подготовки сверхмалых количеств про- i эукариотических клеток для исследования с помощью электронного микроскопа.

2. Создать компьютерно-математический алгоритм обработки изображена бактериальных микроструктур и программное обеспечение для последующего и: использования в трехмерном моделировании.

3. Визуализировать ультраструктуры чумного микроба, холерного вибриона i возбудителя сибирской язвы методом трехмерного моделирования.

4. Определить возможности вейвлет-анализа с целью увеличени разрешающей способности и контрастности электронных и зондовьг микроскопических изображений.

5. Показать особенности трехмерной ультраструктуры капсулы чумног микроба методом сканирующей зондовой микроскопии.

6. Выявить структуру экзополисахаридного слоя (капсулу) холерног вибриона электронно-гистохимическим методом.

7. Изучить субмикроскопическую морфологию S-слоя возбудителей чумы и сибирской язвы методами электронной и зондовой микроскопии с применением компьютерно-математических преобразований.

Научная новизна

Разработано устройство (фторопластовый контейнер) для концентрации, фиксации, последующей обработки и заливки в эпоксидную смолу малого количества (несколько десятков) клеток для последующего изучения их ультраструктуры (патент на полезную модель РФ №40318 от 10.09.2004 г.).

На основе серийных ультратонких срезов бактерий и полученных электронограмм, разработана структура программного обеспечения ЭВМ, способствующая моделированию тонкой трехмерной морфологии клеток. Программа автоматического построения изображений бактерий имеет современный интерфейс, позволяет поворачивать изучаемый объект на произвольно выбранный угол в произвольной плоскости.

Проведена реконструкция трехмерной структуры бактериальных клеток на основе методического подхода к данным электронограмм трансмиссивного электронного микроскопа и разработанного компьютерно-математического алгоритма.

Впервые получены трехмерные изображения поверхностных и внутренних тонких структур бактерий чумы, холеры и сибирской язвы с высоким пространственным разрешением с помощью программы для моделирования бактериальных клеток.

Создана программа проведения фильтрации от различного уровня загрязнений и шумов (свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ -№ 2005610679 от 22.03.2005 г.), позволяющая увеличить разрешающую способность и контрастность электронно-зондовых изображений бактерий, макромолекул (ДНК), на основе вейвлет-анализа.

С помощью сканирующей туннельной микроскопии капсульного антигена - FI (капсулы) чумного микроба впервые показана его ультраструктура в виде геля размерностью частиц 50 нм, с упорядоченным поверхностным и внутренним строением по типу трехмерной пространственной решетки, выполняющей функцию дополнительной «мембраны» клеточной стенки.

Электронно-гистохимическим методом выявлен экзополисахаридный слой бактерии у клеток О-клонов холерного вибриона классического биовара. На поверхности колонии указанных клонов методом сканирующей электронной микроскопии показано присутствие рыхлого слоя.

Показано наличие упорядоченной структуры S-слоя клеточной поверхности чумного микроба методами негативного контрастирования и ультратонких срезов. При электронно-микроскопическом исследовании установлено, что изолированный белок формирует пластинчатые структуры с кристаллоподобной поверхностью.

С помощью трансмиссионного электронного микроскопа, в негативно окрашенных препаратах, визуализирована ультраструктура белков S-слоя (Sap и ЕА1) сибиреязвенного микроба, которая представлена в виде решетчатых структур размерами 7-9 нм с наклонной симметрией. Впервые продемонстрированы методом прямого преобразования Фурье их скрытые изображения со строго выраженной периодичностью и волнообразной симметрией.

С помощью атомно-силовой микроскопии дана субмикроскопическая морфологическая характеристика белков Sap и ЕА1 сибиреязвенного микроба в виде параллельных рядов упорядоченных линейных цепочек размерами кластеров 2-3 нм и 7-8 нм соответственно.

Практическая значимость

Разработан способ обеззараживания микроорганизмов I—IV групп патогенности для исследования методом сканирующей зондовой микроскопии (Акт комиссионных испытаний утвержден директором РосНИПЧИ «Микроб», 2009 г.). Данный способ применяется в отделе диагностики инфекционных болезней ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» при приготовлении препаратов для зондовой и атомно-силовой микроскопии.

Применяется на практике: «Устройство для концентрации сверхмалого количества клеток при приготовлении электронно-микроскопических препаратов» в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» и Учреждении Российской академии наук «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов» (Акт от 28 июня 2010 г.).

Создана программа для реконструкции трехмерной организации клеточных наноструктур и оценки качества полученного изображения. Она максимально автоматизирована, проста в использовании и не требует вмешательства высокопрофессионального оператора, может использоваться для прикладных и фундаментальных исследований. Программу используют в учебном процессе кафедры программного обеспечения вычислительной техники и автоматических систем Саратовского государственного технического университета (Акт от 29 июня 2010 г.).

Материалы диссертации используют в учебном процессе на курсах профессиональной переподготовки и повышении квалификации специалистов отдела образовательных программ и подготовки специалистов ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (Акт от 2 июля 2010 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработано устройство, позволяющее проводить электронно микроскопическое исследование сверхмалого количества клеток.

2. Комплексный методический подход, созданный на основе трансмиссионны: электронных изображений серийных ультратонких срезов, и разработанно программное обеспечение позволяют воссоздать трехмерное изображение бактерш чумы, холеры и сибирской язвы с высоким пространственным разрешением.

3. Компьютерно-математическая обработка и фильтрация изображений помощью ортогональных и стационарных вейвлетов Добеши и Фурье преобразований увеличивает разрешающую способность электронограмм i сканограмм.

4. Выявлены особенности субмикроскопической морфологии капсул! бактерий чумы и холерного вибриона, а также трехмерной организации S-сло Y. pestis и В. anthracis при использовании трансмиссионной и растровой электронно: микроскопии, сканирующей зондовой микроскопии и электронно-гистохимически методов.

Апробация работы

Результаты работы доложены и представлены на ежегодных итоговых научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (2002, 2003, 2005, 2006-2009 гг.), ежегодных симпозиумах и конференциях по электронной микроскопии Российской Академии наук в г. Черноголовка (2000, 2002, 2005, 2007-2009 гг.). Работа выполнялась в рамках тем: «Создание диагностических и профилактических препаратов нового поколения, на основе модифицированных биологически активных веществ возбудителей ООИ» НИОКР 34-03.08 и «Конструирование современных средств специфической профилактики и иммунодиагностики сибирской язвы» НИОКР 41-33.09.

Публикации

Основное содержание диссертации отражено в 23 научных работах, из которых 5 опубликованы в рекомендованных ВАК РФ изданиях.

Структура и объём диссертации

Диссертация представлена на 115 страницах текста, состоит из введения, главы обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 38 рисунками. Библиографический указатель содержит 147 работ, в том числе - 94 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы. Работа выполнена на штаммах Yersinia pestis EV НИИЭГ и Yersinia pestis КМ218 (бесплазмидный, дериват EV НИИЭГ); штаммах Vibrio cholerae Дакка 35 и Vibrio cholerae 641/67 CRC IDH, Bacillus anthracis Sterne ДТ Prt-Sap+. Штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». Все исследования на моделях чумного микроба, холерного вибриона и сибиреязвенного микроба проводились в соответствии с требованиями Санитарных правил 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами 1-Й групп патогенности» и Санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности».

Образцы S-слоя чумного и сибиреязвенного микробов были любезно предоставлены сотрудниками лаборатории экспериментальной биотехнологии и прикладной генетики ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» [Антонова O.A., 1999; Гончарова А.Ю., 2007].

Методы. Методы подготовки проб проводились согласно «Методическим рекомендациям по дезинфицирующим режимам фиксации для электронной микроскопии материала, зараженного возбудителями чумы, сапа, мелиоидоза, холеры, туляремии, бруцеллеза, кокцидиоидоза», Волгоград, 1983 г.

Методы электронной микроскопии:

- негативного контрастирования (ТЭМ-микроскопия);

- ультратонких срезов (ТЭМ-микроскопия);

(Препараты просматривали на электронных микроскопах JEM-7A или HU-12A при ускоряющем напряжении 80 и 75кВ соответственно).

- сканирующей электронной микроскопии (РЭМ-микроскопия);

(Образцы просматривали на сканирующей приставке HSE-2 электронного микроскопа HU-12A при ускоряющем напряжении - 10-50 кВ).

Методы зондовой микроскопии:

- туннельной микроскопии;

- атомно-силовой микроскопии;

(Препараты просматривали на атомно-силовом микроскопе Solver P47-PRO («NT-MDT», Россия), используя программу управления микроскопом «NOVA». Работа велась в режиме полуконтактного (SemiContact) метода зондирования. Поле сканирования варьировалось в пределах 50x50 - 10x10 мкм. При работе использовались кантилеверы Bioset/50 - NSG01/30 с прямоугольными балками, фирмы «NT-MDT», Россия).

Компьютерно-математические методы обработки экпериментальных данных

Для трехмерной реконструкции бактериальных клеток использовали язык программирования Delphi под программу Microsoft DirectX.

Для этапа улучшенной трехмерной визуализации использовали стандартный коммерческий пакет трехмерного моделирования и дизайна 3D StudioMax, фирмы Kinetix, США.

Преобразования Фурье и вейвлет-анализ выполняли с использованием пакета математических программ MatLab (MatLab or Matrix Laboratory, США).

Результаты исследований

Разработка устройства для подготовки сверхмалых количеств биологического материала при проведении исследования с помощью трансмиссионного электронного микроскопа

Одним из наиболее информативных физических методов изучения ультраструктуры клеток является электронная микроскопия их ультратонких срезов. Данный метод до настоящего времени остается единственным физическим способо\ изучения вновь открываемых микроорганизмов и эукариотических клеток. Однако, несмотря на значительные достижения при использовании вышеуказанного метода значительное число биологических объектов остаются малоизученными по причин! их малого количества в объекте исследования.

Для изучения малых количеств биологического материала было изготовленс устройство для концентрации, последующей обработки и запивки образца i эпоксидную смолу (рисунок 1).

Методический подход заключался в следующем: бактерии выращивали hî типичных средах, фиксировали, обезвоживали в градиенте спиртов и заливал! четырехкомпонентной смолой Spurr с применением вышеуказанного устройства Серийные ультратонкие срезы толщиной 300 нм выполняли на ультрамикротоме переносили на микроскопические сетки и исследовали в трансмиссионш» электронном микроскопе.

Устройство использовано при приготовлении электронно-микроскопическоп материала, данные которого входили в информационную базу для последующе! трехмерной визуализации бактериальных клеток.

I_I

12 3 4

_- центрифугирование

Рисунок 1 - Этапы приготовления образца с помощью созданного устройства.

1 - фиксация, дегидратация; 2 - концентрация, пропитка; 3 - заливка; 4 -полимеризация (а - контейнер устройства; б - отвинчивающийся цилиндр; в -изучаемый материал; г - готовый блок смолы для резки на ультрамикротоме).

Данный способ апробирован на бактериальных клетках, а также клетках гемолимфы блох и дал положительные результаты. При проведении процедуры фиксации, обезвоживания и проводки материала для последующей заливки в эпоксидную смолу потери изучаемого материала минимальные.

Таким образом, предлагаемый метод и устройство позволяют получать уникальные данные ультраструктуры единичных клеток.

Трехмерная визуализация ультраструктуры бактерий чумы, сибирской язвы и холерного вибриона программными средствами DirectX и 3D StudioMax

Для получения трехмерных изображений бактериальных клеток с высоким пространственным разрешением в данной работе впервые был использован разработанный авторами способ и его программное обеспечение, основанное на компьютерной реконструкции поверхности бактериальной клетки по трансмиссионным электронно-микроскопическим фотографиям серийных ультратонких срезов бактерий.

После получения необходимого количества электронограмм (серий), относящихся к одной случайно выбранной бактериальной клетке, создана база данных, содержащая десятки микрофотографий бактериальной клетки по уровням срезов для каждого отдельного объекта исследования.

С помощью графического редактора контуры изображения одной клетки на микрофотографии очерчивали вручную. Для правильной трехмерной реконструкции клетки проставлена общая точка начала координат (рисунок 2). Этап работы, по выделению индивидуального контура клетки, повторялся для каждой микрофотографии. Количество снимков для объекта было в пределах 50. Для визуализации в 3D StudioMax составлялся собственный набор контуров, который включал в себя элементы внутренней структуры, соответствующий одному из микрокомпонентов клетки. Таким образом, формировалась база данных по контурам и объектам исследования.

Рисунок 2 - Схема сборки трехмерной реконструкции клетки в программе Ктейх ЗБ ЗШсПоМах. А - Трансмиссионные электронно-микроскопические фотографии ультратонких срезов бактериальных клеток возбудителя чумы (исходное изображение, изображение среза оконтурено вручную (показано стрелкой). Отмечено начало координат (точка), необходимое для сборки трехмерного изображения; Б - сборка контуров трехмерной модели.

В дальнейшем трехмерная реконструкция выполнялась с помощью программы трехмерного моделирования Ктейх ЗБ ЗШсНоМах (рисунок 3).

В Г

Рисунок 3 - Трехмерное изображение клеток возбудителя чумы, полученное с

помощью программы Ктейх ЗБ ЗШсНоМах. А - окно программы; Б - итог визуализации внешней структуры клетки; В, Г -внутренняя структура клетки: В - секущие плоскости модели; Г - итог визуализации внутренней структуры клетки.

Применение указанной мощной графической программы (Клпейх ЗЕ БШсйоМах) позволяет получать репрезентативные изображения с использованиен различных подсветок и теней.

В связи со сложностью вышеуказанной программы нами была разработан; специальная программа автоматического построения изображений, написанная Н1

языке программирования Delphi с использованием системы DirectX. Программа работает в графической среде Microsoft Windows и имеет современный и удобный графический интерфейс, позволяет поворачивать объект на любой угол в произвольной плоскости. Ее использование для автоматического построения 3D изображений не требует вмешательства оператора, она наиболее применима на начальном этапе предварительной оценки качества полученного объекта. В результате использования данной программы были получены трехмерные изображения бактериальных клеток Yersinia pestis, Vibrio cholerae и Bacillus anthracis, показанные под различными углами зрения, созданные в программе автоматического построения изображений с использованием системы прорисовки DirectX (рисунок 4).

f^ |

А Б .......В

Рисунок 4 - Трехмерное изображение бактерий, полученное с помощью программы автоматического построения изображений.

А - клетка возбудителя чумы; Б - клетка холерного вибриона; В, Г - клетка возбудителя сибирской язвы.

Возможности программы позволяют производить анимацию полученного изображения. Созданный ролик можно просматривать на современном компьютере. В связи с этим полученные данные могут использоваться в учебном процессе как наглядное пособие.

Таким образом, применение нового подхода к трехмерной визуализации бактериальных клеток позволяет получить 3D изображения как внешней, так и внутренней структуры клеток.

Использование вейвлет-анализа для фильтрации изображений в электронной и зондовой микроскопии

При исследовании биологических объектов одним из основных условий является повышенное требование к получению максимально возможного разрешения изображения на микрофотографиях. Однако специфика самих объектов способствует созданию помех, вызванных наличием загрязнений различной природы (остатки питательной среды, конгломераты вещества-контрастера, красок; дефекты подложки, различного рода шумов аппаратуры и др.) присутствующих в исследуемом материале и ухудшающих воспроизведение исследуемых субмикроскопических структур.

Наиболее многообещающим методом увеличения разрешения изображения в настоящее время является дискретный вейвлет-анализ, способствующий уменьшению шумов, удалению мелких дефектов, повышению контрастности, сжатию и масштабированию [Дремин И.М. с соавт., 2001]. Дискретный вейвлет-анализ позволяет проводить обработку изображений за счет разделения их на

il ËÊk

высоко- и низкочастотные составляющие, что делает возможным подавление искажений не затрагивая при этом исследуемой структуры.

Алгоритм обработки изображений состоит в вейвлет-разложении исходного изображения до заданного уровня и изменения детализирующих коэффициентов (уменьшение - для фильтрации шума и увеличение - для подчеркивания границ), после чего производится обратная операция вейвлет-синтеза изображения.

Для обработки микроскопических изображений с учетом особенностей выявления наноразмерных структур применяют различные типы вейвлет-анализа. В данной работе приведены результаты применения ортогональных и стационарных вейвлетов на основе вейвлетов Добеши [Астафьева Н.М., 1996].

Для этого нами написана программа в среде МаНаЬ, которая способствовала проведению фильтрация шумов и повышению контрастности электронно- и зондово-микроскопических изображений, (пример на рисунке 5), использованных впоследствии при трехмерной визуализации и при выявлении ультраструктурных особенностей морфологии бактерий.

а I * • Л Л"«»'»"*

Рисунок 5 - Электронограмма жгутика холерного вибриона до и после обработки программой стационарного вейвлет-анализа.

А - до обработки; Б - после обработки программой.

Резюмируя данный раздел работы, можно сделать следующее заключение: представленные данные по применению вейвлет-анализа открывают новые возможности этого математического аппарата, позволяющего улучшить качество получаемых изображений, повысить их контрастность, снизить уровень шума.

Выявление некоторых особенностей поверхностных ультраструктур бактерий чумы, холеры и сибирской язвы

Особенности ультраструктуры капсулы (Р1-антигена) чумного микроба

К наиболее полно изученным антигенам чумного микроба относит« капсульный - Р1 антиген, кодируемый плазмидой рБга (96,2 т.п.н.).

Первые шаги в его изучении были предприняты более полувека назад- Однако со временем стали накапливаться факты, свидетельствующие о наличии некоторы> денатурационных изменений в молекуле Р1, образование которых связывали с особенностями ее структурного состояния [Сердобинцев Л.Н., 1984].

С возникновением и интенсивным развитием в конце 80-х годов XX век< сканирующей туннельной микроскопии (СТМ) [В1пг% в. е1 а1., 1982] появилаа возможность исследования поверхностей твердых тел с атомарным разрешением (около 0,1 нм в плоскости объекта и 0,01 нм в перпендикулярном направлении).

В нашей работе приводятся результаты визуализации поверхностей бактерш возбудителя чумы с высоким пространственным разрешением (5-8 нм). На рисунк(

6 А приведено сканирующее туннельно-микроскопическое (СТМ) изображение фрагментов бактериальных клеток чумы, а на рисунке 6 Б увеличенное изображение фрагмента поверхности бактерии, на котором видны отдельные глобулы белка - Р1 (стрелка). Размерность глобул составила 50 нм.

А Б

Рисунок 6 - Результаты визуализации поверхности бактерий чумы.

А - СТМ изображение фрагмента клеток возбудителя чумы, покрытых пленкой Р№ толщиной 10 нм. Размер участка сканирования - 3>=3 мкм; Б - СТМ изображение фрагмента поверхности чумного микроба размером 700x700 нм.

На основании полученных результатов следует, что ультраструктура капсульного антигена (И) чумного микроба представляет собой гель с упорядоченным поверхностным и внутренним строением по типу трехмерной пространственной решетки. Можно предположить, что такая особенность капсулы может выполнять роль механического и биохимического буфера.

Выявление экзополисахаридного слоя холерного вибриона электронно-гистохимическим методом

При изучении популяционного состава природных штаммов холерного вибриона классического биовара были выявлены штаммы, в популяции которых присутствовали как типичные прозрачные Т-колонии, так и клоны, формирующие атипичные мутные О-колонии [Смирнова Н.И. с соавт., 2004]. Кроме морфологии колоний Т- и О-клоны отличались по продукции ряда факторов патогенности и персистенции [Исаев Н.Д. с соавт., 2005].

Для выявления структур, участвующих в изменении морфологии колоний в штаммах холерного вибриона, нами изучены поверхность клеток и содержание в них поли-р-гидроксибутирата модельного штамма V. ско1егае Дакка 35 классического биовара, имеющего в популяции Т- и О-клоны. Обнаружено, что клетки Т- и О-клонов содержали различные клеточные элементы, но электронно-плотных гранул поли-р-гидроксибутирата в клетках не обнаружено. В то же время при электронно-микроскопическом изучении двух фенотипически измененных вариантов V. ско1егае Дакка 35 выявлено, что на поверхности и между клетками О-вариантов присутствует рыхлый слой, который отсутствует у Т-клонов.

Обнаруженный дополнительный слой был выделен с поверхности двух фенотипически разных вариантов штамма V. ско1егае Дакка 35 и при биохимическом исследовании установлено, что он имеет полисахаридную природу [Заднова С.П. с соавт., 2004].

Для подтверждения факта обнаружения у штамма V. cholerae Дакка 35 экзополисахаридного слоя бактерии Т- и О-клонов исследованы электронно-гистохимическим методом после их обработки красителем рутением красным, применяемым для обнаружения экзополисахарида у грамотрицагельных бактерий [Johnson J.A.et al., 1992; Yildiz F.H. et al., 2001]. При изучении ультратонких срезов выявлено, что между клетками О-варианта Дакка 35 выявляется аморфный электронно-плотный слой окрашенных экзополисахаридов, тогда как у Т-варианта такой слой отсутствовал.

Для подтверждения выявления в О-вариантах штамма V. cholerae Дакка 35 экзополисахарида в работу был взят штамм V. cholerae 641/67 CRC ЮН эльтор биовара, в популяции которого также присутствуют Т- и О-варианты. При электронно-гистохимическом исследовании штамма V. cholerae 641/67 CRC IDH в О-вариантах обнаружен экзополисахаридный слой, который выявлялся в виде аморфного электронно-плотного слоя при окраске бактерий рутением красным (рисунок 7).

А Б

Рисунок 7 - Электронограмма эльтор вибрионов V. cholerae 641/67 CRC IDH, окрашенных рутением красным (ультратонкие срезы).

А - Т-колонии, не синтезирующие экзополисахарид; Б - О-колонии, продуцирующие экзополисахарид (экзополисахаридный слой показан стрелками).

Мы предполагаем, что присутствие экзополисахаридного слоя на поверхности клеток О-вариантов приводит к изменению структуры колоний. Для проверки данного предположения нами проведено изучение двух фенотипически разных вариантов штамма V. cholerae Дакка 35 в растровом электронном микроскопе, которое показало, что О-колонии V. cholerae Дакка 35 имели рыхлую поверхность с отпочкованными конгломератами бактерий (микроколонии, рисунок 8 А, стрелка), расположенными на ее поверхности. В основном, клетки были покрыты слизистой оболочкой в результате продукции экзополисахарида. Иное строение колоний просматривалось у популяции Т-клонов (рисунок 8 Б) - поверхность бактерий имела гладкую форму.

Рисунок 8 - Сканограммы колоний V. cholerae Дакка 35. А - колонии О-варианта; Б - колонии Т-варианта.

Таким образом, с помощью растровой электронной микроскопии подтверждено присутствие экзополисахаридного слоя у О-вариантов холерных вибрионов классического биовара, определяющего морфологию колоний данных вариантов.

Субмикроскопическая морфология белка в-слоя чумного и сибиреязвенного микробов

Согласно литературным данным показано, что 5-слои микроорганизмов представляют собой наиболее простой тип биологической мембраны, сформировавшийся в процессе эволюции. Функциональная роль этих структур разнообразна [Бкугг и., 1983].

Для изучения особенностей структурной организации и функциональной роли белка Б-слоя У. рейИй и В. агйкгаш мы провели исследования, применив при этом методы негативного контрастирования, сканирующей электронной и иммуно-электронной микроскопии.

В Г

Рисунок 9 - Электронограммы (ТЭМ) клеток штамма чумного микроба и белка

Б-слоя.

А - У. реБИэ КМ218; Б, В - У. реэШ ЕУ НИИЭГ (В - после ультразвуковой обработки); Г - конгломераты белка 8-слоя; ВМ - внешняя мембрана; ЦМ -цитоплазматическая мембрана; 8 - в-слой; П - поры.

Субмикроскопическая морфология белка 8-слоя чумного микроба. Для понимания особенностей структурной организации Б-слоя возбудителя чумы проведены исследования с использованием методов трансмиссионной электронной и сканирующей зондовой микроскопии.

По данным Н.П. Коннова с соавт. (1998) после ультразвуковой обработки бактериальной взвеси вакцинного штамма чумного микроба в некоторых случаях наблюдалось слущивание поверхностного слоя с тела клетки. На ультратонких срезах бактерий, над их внешней мембраной имелся четко выраженный дополнительный листок, в местах разрыва которого он заворачивался в

кольцеобразные структуры завитками внутрь. Структура эта была отнесена к S-слою чумного микроба [Antonova O.A. et al., 1998].

С использованием методов сканирующей туннельной и атомно-силовой микроскопии нами показано значительное отличие клеточных поверхностей штамма Y. pestis ЕV НИИЭГ и бесплазмидного производного - К pestis КМ218 (рисунок 9). В | эксперименте с клетками последнего штамма прослеживается наличие упорядоченной структуры, отсутствие которой на поверхности клеток родительского ! штамма мы объясняем экранированием S-слоя другими поверхностными антигенами. Иммуно-электронномикроскопическим анализом ранее [Антонова O.A., 1999] было подтверждено присутствие S-белка именно на поверхности клетки как бесплазмидного, так и плазмидсодержащего штамма.

Проведенный анализ продуктов самосборки белка S-слоя подтверждает сделанное ранее предположение о его относительно регулярном (паракристаллическом) строении (рисунок 10 В).

Электронно-микроскопические исследования показали, что молекулы изолированного белка образовывали паракристаллические пластинчатые структуры с размером пор 6-7 нм (рисунок 9 Г). Дополнительно была проведена Фурье-фильтрация полученных электронограмм, которая детально выявила упорядоченные поры изучаемого слоя.

Сканирующая туннельная и атомно-силовая микроскопия также показала значительное отличие бактериальных поверхностей штамма Y. pestis EV НИИЭГ и его бесплазмидного производного - Y. pestis КМ 218 (рисунок 10).

Субмикроскопическая морфология белка S-слоя сибиреязвенного микроба. S-слои сибиреязвенного микроба, составляющие приблизительно 10 % бактериального

Рисунок 10 - Зондовая микроскопия поверхности клеток чумного микроба и

продуктов самосборки Б-слоя. А - штамм У. рв5й$ КМ218, бесплазмидный; Б - штамм У. резйй ЕУ НИИЭГ; В - продукты самосборки белка 8-слоя на поверхности слюды. Участок сканирования 700x700 нм.

белка [РагсЬаиз .Г. е1 а!., 1995], являются компонентами сложной поверхностной клеточной организации, функциональная роль которых определяется специфическим взаимодействием с ассоциированными надмолекулярными структурами.

у tf"

Ball

ШНщ V

* v *

ДЩ

Рисунок 11 - Электронограммы препаратов белков Sap и ЕА1, выделенных из штамма В. anthracis Sterne ДТ Prt- после диализа и негативного контрастирования.

А - белок Sap; Б - белок ЕА1.

Исследование белков S-слоя сибиреязвенного микроба нами проводилось на бесплазмидном протеазонегативном производном вакцинного штамма В. anthracis Sterne 34F2 (Prt-). При просмотре препаратов белка в трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ) обнаруживались мелкие решетчатые структуры размером 7x9 нм со строго выраженной наклонной симметрией (рисунок 11 А, Б).

Для более детального исследования пространственной ультраструктурной организации изображения белков S-слоя был применен метод прямого преобразования Фурье, позволяющий выявить скрытое изображение в исследуемом объекте.

Изображение S-слоя подвергнуто полосовой Фурье-фильтрации в диапазонах частот, соответствующих локальным максимумам (рисунок 12 А). Полученное в результате фильтрации изображение представлено на рисунке 12 Б.

ТЭМ исследование белков S-слоя сибиреязвенного микроба, с использованием преобразования Фурье, дало наглядную картину их ультраструктур со строго выраженной периодичностью и волнообразной симметрией.

•■ > v ■

яжшп Щ яд ¡ИНШ

Kiyl ill

* • V

Рисунок 12 - Результат полосовой Фурье-фильтрации изображения 8-слоя сибиреязвенного микроба. А - диапазон частот, соответствующих локальным максимумам изображения; Б - итог полосовой Фурье-фильтрации изображения.

На изображениях атомно-силового микроскопа отчетливо видны параллельные ряды упорядоченных линейных цепочек белков с высотами 2-3 нм для белка Sap (рисунок 13 А) и 7-8 нм для ЕА1 (рисунок 13 Б).

А.

Рисунок 13 - СЗМ изображение препаратов белков Sap и ЕА1, выделенных из штамма В. anthracis Sterne ДТ Prt- после диализа и высушивания на поверхности слюды (сила взаимодействия острия и поверхности 2,6 нН). А - белок Sap. Участок сканирования - 600x600 нм; Б - белок ЕА1. Участок сканирования - 100x500 нм.

Таким образом, исследование белков сибиреязвенного микроба методами ТЭМ и АСМ показало хорошую корреляцию, симметричность и упорядоченность ультраструктуры образуемых ими слоев.

выводы

1. Создано устройство для осаждения и заливки в смолу сверхмалого количества (несколько десятков) про- или эукариотических клеток для электронно-микроскопических исследований. Показана высокая эффективность устройства, соответствующая классическим методам приготовления образцов для ультратонких срезов в электронной микроскопии.

2. Разработан алгоритм и программное обеспечение для построения трехмерных изображений бактериальных клеток на основе трансмиссионных электронных изображений серийных ультратонких срезов. Воссозданы трехмерные изображения бактериальных клеток Yersinia pestis, Bacillus anthracis и Vibrio cholerae с высоким пространственным разрешением.

3. Создана программа в среде Matlab, которая способствует эффективному проведению фильтрации шумов и повышению контрастности электронно-микроскопических и сканирующих зондовых изображений. Представлены результаты применения ортогональных и стационарных вейвлетов на основе вейвлетов Добеши.

4. Выявлены особенности ультраструктурного строения капсулы чумного микроба. Методом сканирующей туннельной микроскопии показано наличие на поверхности клеток упорядоченных по типу трехмерной пространственной решетки микроструктур диаметром со стороной куба 50 нм.

5. На поверхности клеток О-вариантов холерного вибриона классического биовара с помощью электронно-гистохимического метода негативно окрашенных бактерий выявлено наличие экзополисахаридного слоя, определяющего морфологию колоний этих вариантов.

6. Установлено, что изолированный белок S-слоя чумного микроба состоит из пластинчатых структур с кристаллоподобной волнообразной поверхностью, формирующий паракристаллический наружный слой клетки. Фурье-фильтрацией электронограмм показано наличие пор в структуре S-слоя чумного микроба, размерность которых составила 6-7 нм.

7. Выявлены особенности в строении S-слоя сибиреязвенного микроба. Сканирующей электронной микроскопией показано наличие мелких решетчатых структур размером 7><9 нм со строго выраженной наклонной симметрией. Данные о выраженной периодичности и волнообразной симметрии ультраструктур S-слоя сибиреязвенного микроба подтверждены атомно-силовой микроскопией и Фурье-фильтрацией.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Коннов Н.П., Байбурин В.Б., Новикова О.В., Кузнецов О.С., Волков Ю.П. Универсальный малогабаритный комплекс СЗМ для работы в полевых условиях // XVIII Российская конференция по электронной микроскопии РЭМ'2000. -Черноголовка, 2000. - С. 250.

2. Baibyrin V.B., Konnov N. P., Kuznetsov O.S., Volkov U.P. Versatile Near Field Scanning Optical Microscope // SPIE Proc. - San-Jose, USA, 2000. - Vol. 3915. - P. 258262.

3. Коннов Н.П., Осин A.B., Кузнецов O.C., Смирнова Н.И. Изучение полисахаридной капсулы у авирулентных штаммов Vibrio cholerae 0139 серогруппы методом электронной микроскопии // XIX Российская конференция по электронной микроскопии РЭМ'2002. - Черноголовка, 2002. - С. 230.

4. Коннов Н.П., Байбурин В.Б., Волков Ю.П. Кузнецов О.С. Сканирующая туннельная микроскопия возбудителей особо опасных инфекций // Проблемы особо опасных инфекций. - 2002. - Вып. 1(83). - С. 90-95.

5. Коннов Н.П., Волков Ю.П., Кузнецов О.С., Якименко P.A., Новикова О.В., Микшис Н.И. Трехмерная микроскопия бактериальных клеток с высоким пространственным разрешением // Проблемы особо опасных инфекций. - 2002. -Вып. 1(83).-С. 86-90.

6. Коннов Н.П., Волков Ю.П., Корсакова А.Ю., Данилова Т.В., Микшис Н.И., Мантуров А.О., Кузнецов О.С., Попов Ю.А., Киреев М.Н. Трансмиссионная электронная и сканирующая силовая микроскопия белков S-слоя сибиреязвенного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. - 2004. - Вып. 88. - С. 34-36.

7. Волков Ю.П., Коннов Н.П., Кузнецов О.С., Киреев М.Н. Использование атомного силового микроскопа в иммунохимических исследованиях // Медицинская микробиология - XXI век: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Саратов, 2004. - С. 61-62.

8. Голова А.Б., Федорова В.А., Девдариани 3.JI., Уткин Д.В., Кузнецов О.С., Коннов Н.П. Особенности синтеза капсульной субстанции Yersinia pestis II Сб. тез. НИЦ им. Сеченова III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - М., 2004. -С. 166.

9. Федорова В.А., Петрова A.B., Девдариани 3.JL, Голова А.Б., Панькина JI.H., Кузнецов О.С. Модификация полисахаридных цепей углеводсодержащих антигено патогенных иерсиний в зависимости от условий культивирования бактерий Материалы конференции, посвященной 70-летию Противочумного центр «Противочумные учреждения России и их роль в обеспечении эпидемиологического благополучия населения страны». - М., 2004. - С. 164.

10. Пат. 40318 Российская Федерация, МПК7 С12 M 1/00, U1. Устройство для осаждения и заливки в эпоксидную смолу сверхмалых количеств клеток / Коннов Н.П., Волков Ю.П., Кузнецов О.С., Нечаева О.В.; заявитель и патентообладател ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». - № 2004113812/22; заявл. 06.05.04; опубл. 10.09.0' Бюл. № 25. - 2 е.; ил.

11. Киреев М.Н., Коннов Н.П., Волков Ю.П., Кузнецов О.С. Иммунохимическая детекция белка чумного микроба методом сканирующей силовой микроскопии // XIV Российский симпозиум по растровой электронной

микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел РЭМ'2005. -Черноголовка, 2005. - С. 255.

12. Кузнецов О.С., Заднова С.П., Исаев Н.Д., Смирнова Н.И., Коннов Н.П. Изучение морфологии колоний Vibrio cholerae ДАККА35 методами растровой и трансмиссионной электронной микроскопии // XIV Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел РЭМ'2005. - Черноголовка, 2005. - С. 261.

13. Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ №2005610679 Российская Федерация. Программа для реконструкции трехмерной организации клеточных наноструктур / Коннов Н.П., Волков Ю.П., Кузнецов О.С., Киреев М.Н.; заявитель и правообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». -№ 2005610136; заявл. 25.01.05; опубл. 22.03.05. - 2 с.

14. Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2006612852 Российская Федерация. Универсальная компьютерная программа для количественного учета биохимических реакций / Киреев М.Н., Данилова Т.В., Волков Ю.П., Коннов Н.П., Кузнецов О.С.; заявитель и правообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». -№ 2006612059; заявл. 20.06.06; опубл. 10.08.06. - 2 с.

15. Коннов Н.П., Волков Ю.П., Кузнецов О.С., Киреев М.Н. Применение атомно-силовой микроскопии для детекции антител к возбудителям иерсиниозов // Инфекции, обусловленные иерсиниями. Материалы II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - СПб., 2006. - С. 23.

16. Бугоркова С.А., Ливанова Л.Ф., Кобкова И.М., Бугоркова Т.В., Коннов Н.П., Кузнецов О.С., Смирнова Н.И. Ультраструктурные аспекты изучения влияния рекомбинантных штаммов холерного вибриона на организм биомодели // Проблемы особо опасных инфекций. - 2006. - Вып. 1(91). - С. 53-56.

17. Кузнецов О.С., Коннов Н.П., Князева Т.В., Мокроусова Т.В., Волков Ю.П., Киреев М.Н. Исследование ультратонких срезов гемолимфы блох // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов и паразитологов. - М., 2007. - Т. 3. - С. 342.

18. Коннов Н.П., Волков Ю.П., Кузнецов О.С., Киреев М.Н. Вейвлет-анализ в распознавании различных ультраструктур бактерий при электронно-микроскопических исследованиях особо опасных инфекций // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов и паразитологов. -М., 2007. - Т. 2. - С. 249.

19. Кузнецов О.С., Коннов Н.П., Киреев М.Н., Волков Ю.П. Использование вейвлет-анализа для фильтрации электронно-микроскопических изображений биологических объектов // XV Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел РЭМ'2007. -Черноголовка, 2007. - С. 294.

20. Волков Ю.П., Коннов Н.П., Кузнецов О .С., Киреев М.Н. Устройство для осаждения и заливки в эпоксидную смолу сверхмалых количеств клеток для ультратонких срезов // XXII Российская конференция по электронной микроскопии РЭМ'2008. - Черноголовка, 2008. - С. 262.

21. Коннов Н.П., Волков Ю.П., Киреев М.Н., Кузнецов О.С. Использование вейвлет-анализа для фильтрации изображений в электронной и зондовой микроскопии // Проблемы особо опасных инфекций. - 2008. - Вып. 3(97). - С. 60-63.

22. Коннов Н.П., Байбурин В.Б., Волков Ю.П., Кузнецов О.С., Киреев М.Н. Устройство для концентрации и ультраструктурного исследования сверхмалого количества клеток // Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине -2008. / Под ред. проф. Д.А. Усанова. - Саратов, 2008. - С. 165-168.

23. Ерохин П.С., Уткин Д.В., Кузнецов О.С., Портенко С.А. Влияние различных способов фиксации на морфологию клеток холерного вибриона при проведении исследований с применением сканирующей зондовой микроскопии // Российская конференция по электронной микроскопии РЭМ'2010. - Черноголовка, 2010.-С. 355.

Подписано в печать 19.11.2010. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный

институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кузнецов, Олег Святославович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современные методы трехмерной микроскопии микробиологических объектов.

1.2. Морфологические особенности некоторых поверхностных ультраструктур бактериальных клеток чумы, холеры и сибирской язвы.

1.3. Методы построения трехмерных моделей биообъектов на основе данных электронной микроскопии.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе.

2.2. Питательные среды.

2.3. Реактивы и растворы.

2.4. Эктопаразиты.

2.5. Оборудование и приборы.

2.6. Методы подготовки проб.

2.7. Методы электронной микроскопии.

2.7.1. Приготовление плёнок-подложек.

2.7.2. Метод негативного контрастирования.

2.7.3. Получение ультратонких срезов бактериальных препаратов для электронной микроскопии.

2.7.4. Метод сканирующей электронной микроскопии.

2.8. Методы зондовой микроскопии.

2.9. Компьютерно-математические методы обработки данных.

ГЛАВА 3. УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПОДГОТОВКИ СВЕРХМАЛЫХ

КОЛИЧЕСТВ КЛЕТОК ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ С ПОМОЩЬЮ ТРАНСМИССИОННОГО ЭЛЕКТРОННОГО МИКРОСКОПА.

3.1. Принципиальная схема устройства и его технические характеристики.

3.2. Апробация устройства на практике и оценка его эффективности.

ГЛАВА 4. ТРЕХМЕРНАЯ МОДЕЛЬ ТОНКОЙ СТРУКТУРЫ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК НА ПРИМЕРЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ, ХОЛЕРЫ И СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ. ФИЛЬТРАЦИЯ ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ИЗОБРАЖЕНИЙ.

4.1. Трехмерная визуализация ультраструктуры бактерии чумы, сибирской язвы и холерного вибриона программными средствами DirectX и 3D StudioMax.

4.2. Использование вейвлет-анализа для фильтрации изображений в электронной и зондовой микроскопии.

ГЛАВА 5. ОСОБЕННОСТИ НЕКОТОРЫХ ПОВЕРХНОСТНЫХ УЛЬТРАСТРУКТУР ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЧУМЫ, ХОЛЕРЫ И СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ.

5.1. Особенности ультраструктуры капсулы

FI-антигена) чумного микроба.

5.2. Изучение полисахаридной капсулы холерного вибриона электронно-гистохимическим методом.

5.3. Субмикроскопическая морфология белков S-слоя чумного и сибиреязвенного микробов.

5.3.1. 8-слой чумного микроба.

5.3.2. Б-слой сибиреязвенного микроба.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспериментальные подходы к изучению тонкой трехмерной морфологии клеток возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы и некоторые особенности их поверхностных ультраструктур"

Актуальность проблемы

Создание системы экспериментальных подходов трехмерной ультраморфологии дает возможность получать, хранить и анализировать информацию о форме, рельефе поверхности и пространственных параметрах бактерий. Изучение ультраструктуры микроорганизмов необходимо, в первую очередь, для определения их приспособительной изменчивости, функциональной морфологии, поисков новых ключевых признаков и экологии микромира [Золотарев А.Г. с соавт., 2006; Gonzalez R.C. et al., 1992]. Имеющиеся сведения по морфо-функциональному анализу бактериальных клеток показывают, что они являются сложными высокоспециализированными организмами, способными к адаптации в окружающей среде и коллективному взаимодействию с другими макро- и микроорганизмами [Олескин А.В. с соавт., 2000; Shapiro J.A., 1998; Miller М.В. et al., 2001; Palkova Z. et al., 2006; Ben-Jacob E., 2008].

Все это привело к тому, что на сегодняшний день получены приближенные трехмерные изображения только нескольких видов микроорганизмов — дрожжевых клеток, кишечной палочки [Milliard А., 2007; Gonzalez R.C., 2008]. По имеющимся литературным данным и источникам Internet в настоящее время нет сведений об исследовании тонкой трехмерной структуры бактерий особо опасных инфекций.

Известно, что поверхностные структуры микроорганизма определяют характер его взаимодействия с макроорганизмом, обеспечивая развитие инфекционного или иммунного процесса. Кроме того, поверхностные структуры принимают участие в соединении с абиотической поверхностью, что способствует выживанию патогенов при нахождении вне живого организма [Кутырев В.В.с соавт., 2007; МеБпаве 8. ег а1., 1998; Батцие Э.М. ег а1., 2008]. Это обстоятельство способствует повышению интереса к изучению поверхностных структур возбудителей особо опасных инфекционных болезней, тем более что в настоящее время появились новые методические подходы для их изучения с помощью электронной и зондовой микроскопии.

Таким образом, проведение комплекса работ, включающих создание устройства подготовки сверхмалого количества биологического материала для электронно-микроскопического исследования, разработку компьютерно-математического алгоритма для трехмерного моделирования клеток возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы, является актуальной задачей.

Цель работы — разработка методических подходов к изучению трехмерной тонкой морфологии клеток возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы на базе создания компьютерно-математического алгоритма обработки изображений, исследование их поверхностных ультраструктур.

Задачи исследования:

1. Разработать устройство для подготовки сверхмалых количеств про- и эукариотических клеток для исследования с помощью электронного микроскопа.

2. Создать компьютерно-математический алгоритм обработки изображений бактериальных микроструктур и программное обеспечение для последующего их использования в трехмерном моделировании.

3. Визуализировать ультраструктуры чумного микроба, холерного вибриона и возбудителя сибирской язвы методом трехмерного моделирования.

4. Определить возможности вейвлет-анализа с целью увеличения разрешающей способности и контрастности электронных и зондовых микроскопических изображений.

5. Показать особенности трехмерной ультраструктуры капсулы чумного микроба методом сканирующей зондовой микроскопии.

6. Выявить структуру экзополисахаридного слоя (капсулу) холерного вибриона электронно-гистохимическим методом.

7. Изучить субмикроскопическую морфологию Б-слоя возбудителей чумы и сибирской язвы методами электронной и зондовой микроскопии с применением компьютерно-математических преобразований.

Научная новизна

Проведена реконструкция трехмерной структуры бактериальных клеток на основе методического подхода к данным электронограмм трансмиссионого электронного микроскопа и разработанного компьютерно-математического алгоритма.

Создана программа проведения фильтрации от различного уровня загрязнений и шумов (свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ - №2005610679 от 22.03.2005 г.), позволяющая увеличить разрешающую способность и контрастность электронно-зондовых изображений бактерий, макромолекул (ДНК), на основе вейвлет-анализа.

С помощью сканирующей туннельной микроскопии капсульного антигена - (капсулы) чумного микроба впервые показана его ультраструктура в виде геля размерностью частиц 50 нм, с упорядоченным поверхностным и внутренним строением по типу трехмерной пространственной решетки, выполняющей функцию дополнительной «мембраны» клеточной стенки.

Показано наличие упорядоченной структуры 8-слоя клеточной поверхности чумного микроба методами негативного контрастирования и ультратонких срезов. При электронно-микроскопическом исследовании установлено, что изолированный белок формирует пластинчатые структуры с кристаллоподобной поверхностью.

С помощью трансмиссионного электронного микроскопа, в негативно окрашенных препаратах, визуализирована ультраструктура белков Э-слоя (Бар и ЕА1) сибиреязвенного микроба, которая представлена в виде решетчатых структур размерами 7-9 нм с наклонной симметрией. Впервые продемонстрированы методом прямого преобразования Фурье их скрытые изображения со строго выраженной периодичностью и волнообразной симметрией.

Практическая значимость

Разработан способ обеззараживания микроорганизмов I-IV групп патогенности для исследования методом сканирующей зондовой микроскопии (Акт комиссионных испытаний утвержден директором РосНИПЧИ «Микроб»,

2009 г.). Данный способ применяется в отделе диагностики инфекционных болезней ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» при приготовлении препаратов для зондовой и атомно-силовой микроскопии.

2010 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработано устройство, позволяющее проводить электронно-микроскопическое исследование сверхмалого количества клеток.

2. Комплексный методический подход, созданный на основе трансмиссионных электронных изображений серийных ультратонких срезов, и разработанное программное обеспечение позволяют воссоздать трехмерное изображение бактерий чумы, холеры и сибирской язвы с высоким пространственным разрешением.

3. Компьютерно-математическая обработка и фильтрация изображений с помощью ортогональных и стационарных вейвлетов Добеши и Фурье-преобразований увеличивает разрешающую способность электронограмм и сканограмм.

4. Выявлены особенности субмикроскопической морфологии капсулы бактерий чумы и холерного вибриона, а также трехмерной организации 8-слоя У. реБНБ и В. апЖгаыя при использовании трансмиссионной и растровой электронной микроскопии, сканирующей зондовой микроскопии и электронно-гистохимических методов.

Апробация работы

Публикации

Структура и объём диссертации

Диссертация представлена на 114 страницах текста, состоит из введения, главы обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 38 рисунками. Библиографический указатель содержит 147 работ, в том числе - 94 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Кузнецов, Олег Святославович

выводы

6. Установлено, что изолированный белок S-слоя чумного микроба состоит из пластинчатых структур с кристаллоподобной волнообразной поверхностью, формирующий паракристаллический наружный слой клетки. Фурьефильтрацией электронограмм показано наличие пор в структуре Б-слоя чумного микроба, размерность которых составила 6—7 нм.

7. Выявлены особенности в строении Б-слоя сибиреязвенного микроба. Сканирующей электронной микроскопией показано наличие мелких решетчатых структур размером 7><9 нм со строго выраженной наклонной симметрией. Данные о выраженной периодичности и волнообразной симметрии ультраструктур 8-слоя сибиреязвенного микроба подтверждены атомно-силовой микроскопией и Фурье-фильтрацией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наши знания субмикроскопической организации микроорганизмов способствуют развитию такого теоретического раздела современной биологии как функциональная морфология. Современные представления о процессах, протекающих в живой клетке — хорошо организованном и ритмично работающем «механизме» дополняются с помощью различных аналитических методов, включая световую и электронную микроскопию.

Новейшие способы изучения трехмерной морфологии клеток, такие как лазерная конфокальная микроскопия, сканирующая электронная микроскопия, зондовая микроскопия (атомно-силовая, туннельная) способны демонстрировать трехмерную поверхностную структуру объекта. Однако для легкодеформируемых биологических микрообъектов такие исследования не имеют достаточно высокого разрешения. Это связано со специфическими особенностями биообъектов: малыми размерами, сложным рельефом поверхности, прозрачностью, мягкостью и легкой повреждаемостью при исследованиях. К тому же методические приемы этих видов микроскопии для биопрепаратов пока еще далеки от совершенства [Миронов В.Л., 2005; Володин А.П. с соавт., 1998].

Наиболее информативным методом изучения тонкой морфологии микробиологических объектов, на сегодняшний день признана трансмиссионная электронная микроскопия ультратонких срезов бактериальных клеток. Она позволяет выявлять детали как внешней, так и внутренней ультраструктуры с достаточно высокой разрешающей способностью порядка 1,5-2,0 нм [Williams D. В. et al., 1996]. Новые перспективы для изучения трехмерной ультраструктуры биообъектов дает современная электронно-вычислительная техника (компьютеры), с помощью которой стало возможным автоматизировать построение трехмерных изображений клеток по их серийным ультратонким срезам [Fiala J.C. et al., 2005].

Основная цель нашей работы — разработать экспериментальные подходы для построения пространственной модели клеток возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, в том числе изучение субмикроскопической морфологии поверхностных структур: капсулы чумного микроба и холерного вибриона, белков S-слоя возбудителя чумы и сибирской язвы, используя при этом новые методы электронной и зондовой микроскопии.

Для реализации данного исследования, в первую очередь, уделяли внимание способам приготовления образцов, имеющих определенную специфику и допускающих выполнение операций с ними по существующим санитарно-эпидемиологическим правилам [Санитарно-эпидемиологические., 2003; Санитарно-эпидемиологические., 2008]. Необходимо подчеркнуть, несмотря на то, что существуют общие правила приготовления объектов для изучения их в электронном микроскопе, в каждом отдельном случае нами были подобраны необходимые условия и режимы для успешного проведения работы, в зависимости от объекта и цели исследования.

Значительное число микробиологических объектов остаются малоизученными по причине их малого количества. Сложность подобных исследований вызвана большими потерями изучаемого материала при приготовлении препаратов к просмотру. Известные методы обработки биологических объектов с целью получения ультратонких срезов не позволяют обрабатывать столь малые количества клеток (десятки штук). Разработанная нами оригинальная методика и запатентованное авторами устройство по заливке сверхмалых количеств исследуемого вещества, позволяет получать уникальные данные внешней и внутренней ультраструктуры единичных про- и эукариотических клеток.

Впервые нами разработан способ и программное обеспечение, использующее возможности графической обработки данных Microsoft Windows

- DirectX по автоматическому построению трехмерного изображения. Программа написана на языке программирования Delphi и имеет простой пользовательский интерфейс. Угол обзора реконструированной модели составляет 360 градусов и позволяет, кроме поворота изображения на любой угол в произвольной плоскости, получать изображение внешней и внутренней структуры клеток при сечении ее произвольно выбранной плоскостью. С помощью созданного программного обеспечения построена объемная модель клеток возбудителей чумы, сибирской язвы и холерного вибриона. Дальнейшее использование мощной графической программы Kinetix 3D StudioMax позволяет получать более репрезентативные изображения с применением различных подсветок и теней. Программа использкется как для прикладных, так и фундаментальных исследований в медико-биологических приложениях.

В электронно-микроскопических изображениях биологических ультраструктур достаточно часто наблюдаются помехи, вызванные наличием загрязнений различной природы (остатки питательной среды, разрушенные бактерии, конгломераты вещества-контрастера, дефекты подложки и прочее). Для устранения вышеуказанных помех, в своей работе, мы использовали математические методы обработки электронно-микроскопических изображений, в частности, применяли преобразование Фурье и вейвлет-анализ. Результаты применения программ дискретного и стационарного вейвлет-анализа и преобразование Фурье способствовали проведению пространственной фильтрации изображения объекта от шумов, удалив мелкие дефекты и увеличив, тем самым, разрешающую способность изображения.

Наличие сложно устроенных поверхностных структур бактерий дает им большое преимущество в борьбе за существование. Известно, что в значительной степени эти структуры определяют выраженность вирулентных и иммуногенных свойств бактерий, обеспечивая развитие инфекционного или иммунного процессов. При изучении капсульного антигена (FI) чумного микроба с помощью сканирующей туннельной микроскопии нами установлено, что он представляет собой гель с упорядоченным поверхностным и внутренним строением по типу трехмерной пространственной решетки. Предполагается, что такая особенность капсулы может исполнять роль механического, биохимического буфера и служить дополнительным защитным слоем клеточной стенки бактерии.

С помощью трансмиссионной электронной микроскопии было обнаружено и подтверждено наличие капсулы у Тох" вариантов холерного вибриона. Ранее С.П. Задновой (2009) установлено, что эта капсула имеет полисахаридную природу. Можно предположить, что наличие капсулы в популяции атоксигенных вариантов холерного вибриона способствует лучшему выживанию бактерий в неблагоприятных условиях внешней среды.

Еще одной важной поверхностной структурой бактерий являются белки 8-слоя. Согласно литературным данным следует, что Э-слои микроорганизмов представляют собой простой тип биологической «мембраны» [81еу1г и., 1997], а функциональная роль этих структур разнообразна, Считают, что у патогенных микроорганизмов Б-слои могут являться даже факторами патогенности [8аЬе1М. е1 а\., 2003]. Для изучения особенностей структурной организации и функциональной роли белков Б-слоя и В. аШкгаЫэ мы провели их исследование, применив при этом методы негативного контрастирования, сканирующую зондовую электронную и иммуно-электронную микроскопию. Сканирующая туннельная микроскопия показала значительное отличие бактериальных поверхностей штамма У.реяШ ЕУ НИИЭГ и его бесплазмидного производного - У. рехШ КМ 218.

Исследование белков 8-слоя В. аЫкгаЫз методами просвечивающей электронной и атомно-силовой микроскопии показали мелкие решетчатые структуры размером 7X9 нм со строго выраженной наклонной симметрией. Для более детального исследования пространственной ультраструктурной организации изображения белков 8-слоя В. аЫкга^, был применен метод прямого преобразования Фурье, который выявил хорошую корреляцию, симметричность и упорядоченность ультраструктуры образуемых 8-слоев.

Таким образом, нами впервые был создан экспериментальный комплексный подход к изучению трехмерной морфологии бактериальных ультраструктур, включающий в себя этапы подготовки материала, способов обработки полученных данных и системы реализации непосредственно самой визуализации. Выяснены особенности поверхностных бактериальных ультраструктур у возбудителя чумы, холеры и сибирской язвы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кузнецов, Олег Святославович, Саратов

1. Авакян A.A., Кац Л.Н., Павлова И.Б. Атлас анатомии бактерий, патогенных для человека и животных. М.: Медицина, 1972. - 184 с.

2. Анисимов П.И. Вклад исследований по генетике возбудителя чумы в разработку методов лабораторной диагностики // Лабораторная диагностика и генетика вирулентности возбудителей особо опасных инфекций. Саратов: Изд-во «Коммунист», 1990. - С. 3-7.

3. Антонова O.A. Выявление, изучение структуры и иммунобиологических свойств S-слоя чумного микроба: Дис. . канд. биол. наук. — Саратов, 1999.-160 с.

4. Астафьева Н.М. Вейвлет-анализ: основы теории и примеры применения // Успехи физических наук. 1996. - Т. 166, № 11. - С. 1145-1170.

5. Байбурин В.Б., Коннов Н.П., Волков Ю.П. Сканирующий оптический микроскоп ближнего поля // Приборы и техника эксперимента. 1998. -№2.-С. 1-4.

6. Бароян О.В. Холера Эль-Тор. 2-е изд. перераб. и доп. М.: Медицина, 1971.-256 с.

7. Блаттер К. Вейвлет-анализ. Основы теории. М.: УРСС, 2004. - 412 с.

8. Брейсуэлл Р.Н. Преобразование Фурье. // Scientific American (изд. на рус. яз.)- 1989.-№8.-С. 48-56.

9. Вайнштейн Б.К. Электронная микроскопия атомного разрешения // Успехи физических наук. 1987. - Т. 152. - Вып. 1. - С. 75-122.

10. Володин А.П. Новое в сканирующей микроскопии // Приборы и техника эксперимента. 1998. - № 6. - С. 3-42.

11. Гончарова А.Ю. Выделение, биохимическая и иммунобиологическая характеристика белков S-слоя сибиреязвенного микроба: Дис. . канд. мед. наук. Саратов, 2007. - 137 с.

12. Добеши И. Десять лекций по вейвлетам. — Ижевск: НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика», 2001. 464 с.

13. Домарадский И.В. Чума. М.: Медицина, 1998. - 354 с.

14. Дремин И.М., Иванов О.В., Нечитайло В.А. Вейвлеты и их использование // Успехи физических наук, 2001. Т. 171, № 5. - С. 465-501.

15. Дряхлушин В.Ф., Климов А.Ю., Рогов В.В., Гусев С.А. Зонд сканирующего ближнепольного оптического микроскопа // Приборы и техника эксперимента. 1998. - № 2. - С. 138-139.

16. Заднова С.П., Исаев Н.Д., Коннов Н.П., Захарова T.JL, Смирнова Н.И. Биохимический анализ двух фенотипически различных клонов штамма Vibrio cholerae Дакка 35 Ol // Проблемы особо опасных инфекций, Саратов. 2004. - Вып. 1(87). - С. 42^15.

17. Заднова С.П. Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности: Дис. . д-ра. биол. наук. Саратов, 2009. - 238 с.

18. Золотарев А.Г., Дармов И.В., Пименов Е.В. Возбудители особо опасных инфекционных заболеваний бактериальной природы. Морфология и ультраструктура. М.: Медицина, 2006. - 267 с.

19. Иваницкий Г.Р., Кринский В.И., Сельков Е.Е. Математическая биофизика клетки. -М.: Наука, 1978. 312 с.

20. Исаев Н.Д., Лозовский Ю.В., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Популяционная неоднородность природных штаммов Vibrio cholerae классического биовара: координированное изменение морфологии колоний, подвижности, токсигенности и ферментативных свойств //

21. Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 2005. - Вып. 1 (89). -С. 43-46.

22. Карупу В.Я. Электронная микроскопия. Киев: Вища шк. - 1984. - 137 с.

23. Козлов М.П., Надеина В.П., Чумакова И.В. Клетки гемолимфы блох и их фагоцитарная активность // Паразитология. 1988. - Т. 22, № 4 - С. 321— 328.

24. Коннов Н.П. Ультраструктурно-функциональный анализ чумного микроба и его взаимоотношения с организмом блохи: Дис. . д-ра. биол. наук. Саратов, 1990. - 316 с.

25. Коннов Н.П., Дятлов И.А., Антонова O.A., Волков Ю.П. Электронно-микроскопическое изучение S-слоев чумного микроба // XVII Российская конференция по электронной микроскопии РЭМ" 98. Черноголовка, 1998.-С. 257.

26. Корсакова А.Ю., Микшис Н.И., Попов Ю.А., Коннов Н.П., Киреев М.Н., Подборонова Н. В., Полунина Т.А. Выделение белков S-слоя сибиреязвенного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. 2004. - Вып. 1 (87). - С. 48-50.

27. Корсакова А.Ю., Микшис Н.И., Попов Ю.А., Коннов Н.П. Иммуно-электронная микроскопия для характеристики белков S-слоя Bacillusanthracis // Материалы XX Российской конференции по электронной микроскопии ЭМ'2004. Черноголовка, 2004. - С. 238.

28. Корсакова А.Ю., Микшис Н.И., Попов Ю.А., Коннов Н.П. Электронно-микроскопическое исследование белков S-слоя сибиреязвенного микроба // Материалы XX Российской конференции по электронной микроскопии ЭМ'2004. Черноголовка, 2004. - С. 239.

29. Кутырев В.В., Коннов Н.П., Волков Ю.П. Возбудитель чумы: ультраструктура и локализация в переносчике. — М.: Медицина, 2007. -224 с.

30. Кэй Д. Техника электронной микроскопии / Пер. с англ. М.: Мир, 1965. -350 с.

31. Методические рекомендации по дезинфицирующим режимам фиксации для электронной микроскопии материала, зараженного возбудителем чумы, сапа, мелиоидоза, холеры, туляремии, бруцеллеза, кокцидиоидоза. Волгоград, 1983. - 8 с.

32. Миронов A.A., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. СПб.: Наука. Ленингр. отд-е, 1994.-400 с.

33. Миронов B.JI. Основы сканирующей зондовой микроскопии. М.: Техносфера, 2005. - 144 с.

34. Олескин A.B., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология. -2000. Т. 69, № 3. - С. 309-327.

35. Пучков Е.О. Компьютерный анализ изображений колоний микроорганизмов // Микробиология. 2010. - Т. 79, № 2. - С. 160-172.

36. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ: В 2 т. -М.: Мир, 1984.-Т. 1.-303 с.

37. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03. Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности) / Госсанэпиднадзор России. М., 2003. - 104 с.

38. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08. Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней / Госсанэпиднадзор России. М., 2008.- 102 с.

39. Северина JI.O. Бактериальные S-слои // Микробиология. -1995. Т. 64., №6.-С. 725-733.

40. Сердобинцев JI.H. Полиморфизм капсульного антигена чумного микроба: Дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1984. - 165 с.

41. Смирнова Н.И. Адгезины Vibrio cholerae: фенотипический анализ и генетический контроль синтеза // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1995. - № 3. - С. 18-26.

42. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Эволюция возбудителя холеры // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2004. - № 4. -С. 3-13.

43. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Сравнительный анализ молекулярно-генетических особенностей геномов и их эволюционных преобразований у возбудителей холеры, чумы и сибирской язвы // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2006. - № 2 . - С. 9-19.

44. Суслов A.A., Чижик С.А. Сканирующие зондовые микроскопы (обзор) // Материалы, технологии, инструменты. 1997. - Т. 2, № 3. - С. 78-89.

45. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М.: Мир, 1975. -325 с.

46. Феофанов А.В. Конфокальная микроскопия в биологических исследованиях // Успехи биологической химии. 2007. -Т. 47.-С. 371410.

47. Чандлер Д., Роберсон Р. Оптическая и электронная микроскопия в медицине и биологии / Пер. с англ. М.: Интеллект, 2010. - 700 с.

48. Ченцов Ю.С. Введение в клеточную биологию М.: Медицина, 2004. -496 с.

49. Чуй К. Введение в вэйвлеты. М.: Мир, 2001. - 356 с.

50. Штейн Г.И. Конфокальная микроскопия: мифы и реальность // Приборы и техника эксперимента. 2008. - № 3. - С. 32-33.

51. Antonova О.А., Dyatlov I.A., Konnov N.P., Anisimov A.P. Isolation and characterization of the novel surface glycoprotein from Yersinia pestis IIiL

52. Medische Microbiologie. 7 International congress on Yersinia. Nijmegen. -1998. - Vol. 6, suppl. II. - P. 30.

53. Austin J.W., Stewart M., Murray R. Structural and chemical characterization of the S-layer of Pseudomonas-like bacterium // J. Bacteriol. 1990. -Vol. 172, №2.-P. 808-817.

54. Baker T.S., Olson N.H., Fuller D. Adding the third dimension of virus life cycle: three-dimensional reconstruction of viruses from cryo-electron micrographs // Microbiology and molecular biology reviews. 1999. -Vol. 63, №4.-P. 862-922.

55. Ben-Jacob E. Social behavior of bacteria: from physics to complex organization // The European Physical J. 2008. - Vol. 65, № 3. - P. 315322.

56. Beveridge T.J., Powels P.H., Sara H., Kotiranta A. Function of S-layers // FEMS Microbiol. Rev. 1997. - Vol. 20, № 1-2. - P. 99-149.

57. Binnig G., Rohrer, H., Gerber C., Weibel E. Surface studies by scanning tunneling microscopy // Phys. Rev. Letters. 1982. - № 49. - P. 57-61.

58. Bron C., Gremillet P. 3D reconstruction by image-processing of serial section in electron microscopy // Visualisation in biomedical microscopies, 3D imaging and computer applications / Ed. A. Kriete. Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft, 1992.-P. 75-104.

59. Bultheel A. Wavelets in Medicine and Biology / Eds. A. Aldroubi, M. Unser. -Boca Raton, USA: CRC Press, 1996. 616 p.

60. Cabado R., Machado-Santelli G.M. Image Analysis and 3D Reconstruction: An Innovating Methodology in Microscopy // Acta Microscópica. 2003. -Vol. 12.-P. 55-58.

61. Caston J.R., Berenguer J., Kocsis E. 3-Dimensional Structure of different aggregates built-up by the S-layer protein of Thermus termophilus II J. Structural Biology . 1994. - Vol. 113, № 2. - P. 164-176.

62. Comstock L.E., Maneval D., Paningrahi P. The capsule and O-antigen in Vibrio cholerae 0139 Bengal are associated with a genetic region not present in Vibrio cholerae OI 11 Infect. Immun. 1995. - Vol. 63, № 1. - P. 317-323.

63. Couture-Tosi E., Delacroix H., Mignot T., Mesnage S., Chami M., Fouet A., Mosser G. Structural analysis and evidence for dynamic emergence of Bacillus anthracis S-layer networks // J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184, № 23. - P. 64486456.

64. Cowley J. M. TEM Holography // Ultramicroscopy. 1992. - Vol. 41. -P. 335.

65. Daubechies I. Orthonormal Bases of Compactly Supported Wavelets // Comm. Pure Application Math. 1988. - Vol. 41. - P. 909-996.

66. Engel A., Schonenberger C.A., Muller D.J. High resolution imaging of native biological sample surfaces using scanning probe microscopy // Curr. Opin. Struct. Biology. 1997. - Vol. 7. - P. 279-284.

67. Ezzell J., Abshire T. Immunological Analysis of Cell-Associated Antigens of Bacillus anthracis // Infect. Immun. 1988. - Vol. 56, № 2. - P. 349-356.

68. Farchaus J., Ribot W., Downs M., Ezzell J. Purification and Characterization of the Major Surface Array Protein from the Avirulent Bacillus anthracis Delta Sterne-1 // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177, № 9. - P. 2481-2489.

69. Faruque S.M., Nair G.B. Vibrio cholerae genomics and molecular biology. — Norfolk, UK: Caister Academic Press. 2008. - 218 p.

70. Fiala J.C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy // J. Microscopy. 2005. - Vol. 218. - P. 52-61.

71. Finkelstein R.A., Boesman-Finkelstein M., Chang Y., Hase C.C. Vibrio cholerae hemagglutinin-protease, colonial variation, virulence and detachment // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60, № 2. - P. 472-478.

72. Frank J. Electron Tomography: Three-Dimensional Imaging with the Transmission Electron Microscope. New York: Plenum Press, 1992. - 456 p.

73. Frank J., Radermacher M., Penczek P., Zhu J., Li Y., Ladjadj M., Leith A. SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields // J. Structural Biology. 1996. - Vol. 116. -P. 190-199.

74. Frank J. Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. San Diego: Academic Press, 1996. - 340 p.

75. Giessibl F. Advances in Atomic Force Microscopy // Reviews of Modern Physics. 2003. - Vol. 75 (3). - P. 949-983.

76. Gonzalez R.C., Woods R.E. Digital Image Processing. Addison-Wesley: Developmental bioinformatics, 1992. - 771 p.

77. Gonzalez R.C., Woods R.E. Digital Image Processing. 3rd ed. Prentice Hall: Developmental bioinformatics, 2008. - 954 p.

78. Griffmi P., Smorenburg S.M., Verbeek F.J., van Noorden C.J.F. Three-Dimensional reconstruction of colon carcinoma metastasis in Liver // J. Microscopy. 1997. - Vol. 169 - P. 375-382.

79. Hawkes P.W., Valdre U. Biophysical Electron Microscopy: Basic Concepts and Modern Techniques. USA: Press., 1990. - 435 p.

80. Henderson R., Baldwin J. M., Ceska T. A., Zemlin F., Beckmann E., Downing K. H. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy // J. Molecular Biology 1990. - Vol. 213. -P. 899-929.

81. Johnson J.A., Panigrahi P., Morris J.G. Non-Ol Vibrio cholerae NRT36S produces a polysaccharide capsule that determines colony morphology, serum resistance, and virulence in mice 11 Infect. Immun. 1992. - Vol. 60, № 3. -P. 864-869.

82. Johnson J.A., Salles C.A., Panigrahi P., Albert M.J. Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal is closely related to Vibrio cholerae Eltor but has important differences // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62, № 5. - P. 2108-2110.

83. Kaper J.B., Morris J., Levin M. Cholera // Clin. Microbiol. Rev. 1995. -Vol. 8, № 1. - P. 48-89.

84. Karaolis D.K.R., Johnson J.A., Bailey C.C., Boedeker E.C., Kaper J.B., Reeves P.R. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95, № 6. -P. 3134-3139.

85. Konnov N.P., Baibyrin V.B., Dyatlov I.A., Antonova O.A., Volkov Y.P. Electron and scanning probe microscopy study of S-iayers of plague microbe // SPIE Proc. Stockholm, Sweden, 1998. - Vol. 3568. - P. 38.

86. Konnov N.P., Baibyrin V.B., Zadnova S.P., Volkov Y.P. Comparative microscopy study of Vibrio cholera flagella // SPIE Proc. San-Jose, USA, 1999.-Vol. 3607, №25.-P. 30-31.

87. Konnov N.P., Volkov Y.P., Novikova O.V. Transmission electron microscopy study of thin sections of ultra small quantity of cells // SPIE Proc. Munich, Germany, 2001a. - Vol. 4434. - P. 256-259.

88. Konnov N.P., Volkov Y.P., Novikova O.V. Bacteria cell ultra structure three-dimensional image // SPIE Proc. Munich, Germany, 20016. - Vol. 4434. -P. 251-255.

89. Konnov N.P., Volkov Y.P., Novikova O.V., Yakimenko R.A. Plague and anthrax bacteria cell ultra structure 3D images // SPIE Proc. Saratov, Russia, 2001c. - Vol. 4707. - P. 371-374.

90. Konnov N.P., Volkov Y.P., Novikova O.V. Transmission electron microscopy study of flea lymph cells thin sections // SPIE Proc. Saratov, Russia, 2001c/. -Vol. 4707.-P. 367-370.

91. Loebl J. Image analysis. Principles and practice. USA: Gateshead, 1985. -256 p.

92. Manders E. M., Verbeek, F. J., Aten J. A. Measurement of colocalization of objects in dual-colour confocal images // J. of Microscopy. 1993. - Vol. 169. -P. 375-382.

93. Matsumoto B. Methods in cell biology. Cell biological applications of confocal microscopy. 2nd ed. USA: Academia Press, 2002. - 508 p.

94. Mesnage S., Tosi-Couture E., Gounon P., Mock M., Fouet A. The capsule and S-layer: two independent and yet compatible macromolecular structures in Bacillus anthracis II Bacteriology J. 1998. - Vol. 180, № 1. - P. 52-58.

95. Miller M.B., Bassler B.L. Quorum sensing in bacteria // Annu. Rev. Microbiol. -2001.-Vol. 55.-P. 165-199.

96. Misell D. L. Image Analysis, Enhancement and Interpretation. In «Practical Methods in Electron Microscopy» / Ed. A. M. Glauert. USA: Press, 1978. -P. 321.

97. Mizunoe Y., Wai S.N., Takade A., Yoshida S.I. Isolation and characterization of rugose form of Vibrio cholerae 0139 strain MOIO // Infect. Immun. 1999. -Vol. 67, №2.-P. 958-963.

98. Mock M., Fouet A. Anthrax // Annu. Rev. Microbiol. 2001. - Vol. 55. -P. 647-671.

99. Morris V. J., Kirby A. R., Gunning A. P. Atomic Force Microscopy for Biologists. UK: Imperial College Press, 1999. - 220 p.

100. Moss V.A. Acquisition and visualisation of serial section images // Visualisation in biomedical microscopies, 3D imaging and computer applications / Ed. A. Kriete. Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft, 1992. -P. 19-44.

101. Mullard A. Microscopy: Eukaryotic cell, now showing in 3D // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2007. - Vol. 8. - P. 272-273.

102. Murray J.M. Confocal microscopy, deconvolution, and structured illumination methods. In «Live Cell Imaging A Laboratory Manual» / Eds. R.D. Goldman, D.L. Spector. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratoiy Press, 2005. - P. 239-279.

103. Palkova Z., Vachova L. Life within a community, benefit to yeast long-term survival // FEMS Microbiol. Rev. 2006. - Vol. 30. - P. 806-824.

104. Peters T.M., Williams J.C. The Fourier Transform in Biomedical Engineering (Applied and Numerical Harmonic Analysis). Boston: Birkhauser, 1998. — 199 p.

105. Pizurica A., Philips W., Lemahieu I., Acheroy M. A versatile wavelet domain noise filtration technique for medical imaging // Medical Imaging, IEEE. -2003. Vol. 22, № 3. - P. 323-331.

106. Reguera G., Kolter R. Virulence and the environment: a novel role for Vibrio cholerae toxin-coregulated pili in biofilm formation on chitin // J. Bacteriol. -2005.-Vol. 187, № 10.-P. 3551-3555.

107. Russ J.C. The Image Processing Handbook. Boca Raton, USA: CRC Press, 1995.-270 p.

108. Sabet M., Lee S.-W., Nauman R., Sims T., Um H.-S. The surface (S-) layer is a virulence factor of Bacteroides forsythus // J. Microbiol. 2003. - Vol. 149. — P. 3617-3627.

109. Shapiro J.A. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms // Annu. Rev. Microbiol. 1998. - Vol. 52. - P. 81-104.

110. Slcoglund T., Pascher R., Berthold C.H., Rydmark M., Jansson T., Gustavsson T. 3D reconstruction of biological objects from sequential image planes -applied on cerebral cortex from cat // Comput. Med. Imaging Graph. 1993. -Vol. 17.-P. 165-174.

111. Sleytr U., Messner P. Crysalline surface layers on bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 1983. - Vol. 37. - P. 311-339.

112. Sleytr U., Messner P. Crysalline Surface Layers in Procaryotes // J. Bacteriol. -1988«. Vol. 170, № 7. - P. 2891-2897.

113. Sleytr U., Messenger P., Pum D. Analysis of crystalline bacterial surface layers by freeze-etching, meet shadowing, negative staining and ultrathin section methods // J. Microbiol. 19886. - Vol. 20. - P. 29-60.

114. Sleytr U., Bayley H., Sara M. Applicants of S-layer // FEMS Microbiol. Rev. -1997.-Vol. 20.-P. 151-175.

115. Sleytr U., Beveridge T.J. Bacterial S-layers // Trends Microbiology. 1999. -Vol. 7. - P. 253-260.

116. Soille P. Morphological image analysis. Principles and applications. 2nd ed. -Berlin; Heidelberg; New York: Springer-Verlag, 2004. 391 p.

117. Spence J.S.H. Experimental High-Resolution Electron Microscopy. Oxford: Clarendon Press, 1981. - 132 p.

118. Spurr A.R. A low-viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy // J. Ultrastructure Research. 1969. - Vol. 26. - P. 31-43.

119. Unser M. Wavelets, Statistics and Biomedical Applications // Proceedings of the Eighth IEEE Signal Processing Workshop on Statistical Signal and Array Processing. Corfu, Greece. - 1996. - P. 244-249.

120. Unser M., Sage D., Jacob M., Meijering E., Thevenaz P. Image Processing and Analysis of Biological Images // Live Cell Imaging Workshop, Swiss Federal Institute of Technology. Lausanne, Switzerland. - 2002. - P. 670-698.

121. Unser M., Aldroubi A., Laine A. F. Wavelets in Medical Imaging // IEEE Transactions on Medical Imaging. 2003. - Vol. 22, № 3. - P. 285-288.

122. Unser M. Wavelets and Advanced Biomedical Imaging // Tenth International Conference on Control, Automation, Robotics and Vision (ICARCV'2008). -Hanoi, Vietnam. 2008. - P. 678-688.

123. Unser M. Wavelet Techniques for Advanced Biomedical Image Reconstruction // Minicourse on Mathematics of Emerging Biomedical Imaging III. Paris, France. - 2009. - P. 789-799.

124. Verbeek F.J. Deformation correction using Euclidean contour distance maps // Proceedings 11 International Conference on Pattern Recognition, IEEE Comp. Soc. Press. 1992. - Vol. 3. - P. 347-351.

125. Verbeek F.J. Three dimensional reconstruction from serial sections including deformation correction: Thesis . Ph.D. Delft University of Technology. — 1995.- 17 p.

126. Verbeek F.J., Huijsmans D.P., Baeten R.W.A.M., Schoutsen N.C.J., Lamers W.H. Design and Implementation of a database and an program for 3D-reconstruction from serial sections: A data driven approach // Microscopy Res. Tech. 1995. - Vol. 30. - P. 1-17.

127. Verbeek F.J. 3D reconstruction from serial sections, applications and limitations // Microscopy and Analysis (UK version). 1996. - Vol. 56. -P. 33-35.

128. Verbeek F.J., Huijsmans D.P. A Graphical database for 3D reconstruction supporting 4 different Geometrical Representations // Databases in Biomedical research / Ed. T.C.S. Wong. Boston: Kluwer Academic Publishers, 1998. -P. 117-144.

129. Verbeek F.J. Theory and Practice of 3D-reconstructions from serial sections. In «Image Processing, A Practical Approach» / Eds. R.A. Baldock, J. Graham. -Oxford: Oxford University Press, 1999.- P. 153-195.

130. Verbeek F.J., Lawson K.A. Bard J.B.L. Developmental bioinformatics: linking genetic data to virtual embryos // Intern. J. Dev. Biol. 1999. - Vol. 43. -P. 761-771.

131. Verbeek F.J., Boon P.J. High-resolution 3D reconstruction from serial sections: microscope instrumentation, software design, and its implementations, Netherlands Institute for Developmental Biology // SPIE Proc. San-Jose, USA, 2002.-Vol. 4621.-P. 13.

132. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin // Science. 1996. - Vol. 272, № 5270. - P. 1910— 1914.

133. Waters J.C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy // JCB.-2009.-Vol. 185.-P. 1135-1148.

134. Watnick P.I., Fullner K.J., Kolter R. A role for the mannose-sensitive hemagglutinin in biofilm formation by Vibrio cholerae El Tor // J. Bacteriol. — 1999.-Vol. 181, № 11. P. 3606-3609.

135. Wickramasinghe H.K. Progress in scanning probe microscopy // Acta materialia. 2000. - № 48. - P. 347-358.

136. Wiesendanger R. Scanning Probe Microscopy and Spectroscopy. Cambridge: Cambridge University Press, 1994.-P. 121-133.

137. Williams D. B., Carter C. B. Transmission Electron Microscopy (I Basic, II Diffraction, III Imaging, IV Spectrometry). New York: Plenum Press. -1996.-435 p.

138. Yildiz F.H., Lie X.S., Heydorn A., Schoolnik G.K. Molecular analysis of rugosity in a Vibrio cholerae 01 Eltor phase variant // Mol. Microbiol. 2004. -Vol. 53, №2.-P. 497-515.

139. Zhu J., Mekalanos J.J. Quorum sensing-dependent biofilms enhance colonization in Vibrio cholerae II Dev. Cell. 2003. - Vol. 5, № 4. - P. 647656.

Информация о работе

Кузнецов, Олег Святославович
кандидата биологических наук
Саратов, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Экспериментальные подходы к изучению тонкой трехмерной морфологии клеток возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы и некоторые особенности их поверхностных ультраструктур - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы