Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфология, ультраструктура, метаболизм некультивируемых форм холерных вибрионов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Морфология, ультраструктура, метаболизм некультивируемых форм холерных вибрионов"

РГб од

1 8 ДЕН тп

На правах рукописи

СОКОЛЕНКО АННА ВАСИЛЬЕВНА

МОРФОЛОГИЯ, УЛЬТРАСТРУКТУРА, МЕТАБОЛИЗМ НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ ФОРМ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

03.00.07. — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов 2000 г.

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Ю.М. Ломов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор

Н.И. Смирнова

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Л.В. Саяпина

Ведущая организация:

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится « 5 » декабря 2000 г. на заседании Диссертационного совета Д 074 3201 при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб»

(410005, г. Саратов, Университетская ул., 46)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института «Микроб». Автореферат разослан « 3 » ноября 2000г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Г.А. Корнеев

/>¿64. злео

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Холера как болезнь, вызывавшая опустошительные эпидемии, известна 1авно. С развитием медицины и микробиологии появились эффективные метода лечения, позволившие значительно снизить смертность, методы обнаружения и идентификации вибрионов, на основе которых разработана многоступен-*атая система надзора за холерой. Однако по ряду причин заболевание холерой а мире не удается взять под абсолютный контроль. За период седьмой пандемии в мире в 146 странах Азии, Африки, Америки, Австралии и Океании зарегистрировано более четырех миллионов случаев холеры (Ломов Ю.М. и др., 1998). В 1999 году 53 страны мира информировали ВОЗ о 201334 случаях холеры, за пять месяцев 2000 года зарегистрировано 15652 заболевания (Ю.М. Ломов и др., 2000). В связи с постоянно сохраняющейся угрозой завоза холеры из-за рубежа актуальна эта проблема и для России.

Ситуация осложняется еще и тем, что, как выяснилось в последние два десятилетия, вибрионы, как и другие микроорганизмы, во внешней среде спо-юбны переходить в некультивируемое состояние (R.R.Colwell et.al.,1985, S.Duncan et.al., 1994, A.J. Alvarez et.al., 1994, R.A. Chmielevski et.al., 1995, D. D. Weichart, S. Kjelleberg, 1996, M. Stainert et.al., 1997, G.Wang, M. Doyle, 1998, M.S. Islam et.al., 1999). Такие формы не растут на питательных средах, что существенно затрудняет выделение и идентификацию возбудителя. Однако они могут представлять опасность для здоровья человека, так как сохраняют в НС вирулентность (Colwell R.R., 1985; Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., 1997, А. Саго et.al., 1999, J.M. Cappelier, 1999, Y. Mizunoe et.al., 2000). Последнее обстоятельство объясняет пристальный интерес исследователей к некультивируе-иым формам (НФ) бактерий.

С момента начала изучения феномена прошло почти двадцать лет. Однако о некультивируемых формах известно немного. Предполагают, что это покоящаяся форма грамотрицательных бактерий, аналогичная спорам (Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург, 1993, R.R. Colwell, 1996). Пока не существует единого мнения о природе явления, функциональной значимости и степени их потенци-1льной опасности для человека. Практически неизученным остается метаболизм некультивируемых клеток. Все это справедливо и для холерных вибрио-яов. В доступной литературе мы не обнаружили сведений, касающихся динамики морфологических изменений, ультраструктурной организации клеток холерных вибрионов в НС, их ферментативной активности. Изучение биологиче-:ких свойств НФ, помимо теоретического, представляет практический интерес. Исследование закономерностей образования НФ, специфики ультраструктуры •л особенностей метаболизма позволит создать теоретическую базу для разра-эотки новых быстрых и высоко специфичных методов их обнаружения. Изуче-дие динамики, глубины и степени обратимости изменений особенно важно для понимания эпидемической значимости НФ холерных вибрионов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Цель настоящей работы - исследование структурных и метаболических

изменений, происходящих в НФ холерных вибрионов и оценка их биологиче ской активности.

В связи с поставленной целью были сформулированы основные задач! исследования:

1. Характеристика морфологических изменений некультивируемых клеток I динамики этого процесса.

2. Изучение ультраструктурной организации некультивируемых клеток хо лерного вибриона.

3. Изучение характера и интенсивности метаболизма, функционального со стояния НФ по активности дыхательных ферментов тетразолредуктазы НАДН-дегидрогеназы и маркерных ферментов цитоплазматической мем браны - АТФ-азы, 5 - нуклеотидазы.

А. Исследование основных путей диссимиляции глюкозы холерными виб рионами в разные сроки некультивируемости.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Впервые проведены систематические исследования степени и динамик! морфологических изменений НФ холерных вибрионов. Показано, что эти изме нения сопряжены с модификацией метаболизма. Впервые представлены данны по активности дегидрогеназ цикла Кребса у НФ, НАДН-дегидрогеназы актив ности маркеров структурно-функционального состояния цитоплазматическо мембраны (ЦПМ): АТФ-азы, 5~-нуклеотидазы. Обнаружена интенсификаци процессов дыхания, и других ферментативных реакций на уровне некультиви руемой популяции, что сопряжено с изменениями структуры, большим содер жанием белка в некультивируемых клетках и остаточной активностью мембра лизированных клеток. Впервые обнаружено, что исходные штаммы 01 и 013 серогруппы, независимо от наличия гена холерогенности, обладали К+ зависимой АТФ-азой, этим же свойством обладал холерогенный штамм не О серогруппы. По мере пребывания в НС указанная АТФ-аза переставала регион рироваться, а выявлялась только Са^ - зависимая - АТФ-аза, характерна для прокариот. Получены данные об особенностях НАДН-дегидрогеназной аи тивности НФ, интенсивность которой напоминает сапрофитическую. Впервы представлены данные о путях диссимиляции глюкозы некультивируемыми хс лерными вибрионами и сдвиге этого процесса в сторону анаэробного усвоения

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.

Полученные в результате исследований данные представляют интерес точки зрения поиска путей разработки новых доступных методов выделения идентификации возбудителя, находящегося в НФ. Этому может способствоват показанная возможность применения метода восстановления трифенилтетрг золхлорида (ТТХ) и 2,6 - дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ) для определени в водной среде живых микроорганизмов, не растущих на питательных среда) На основе указанного метода разработаны методические рекомендации: «Ис пользование сукцинатдегидрогеназной активности для идентификации некул!

гивируемых форм холерных вибрионов», которые утверждены Ученым Советом РПЧИ 22.06.2000. Выявленные различия в диссимиляции глюкозы некуль-гивируемых клеток могут быть основой для разработки дифференциальных гестов. Обнаруженная гндролазная и оксидоредуктазная активность, в том чис-1е и в поздние сроки некультивируемостн, может быть положена в основу разработки простых лабораторных тестов идентификации НФ. Выявленные особенности биологических свойств НФ холерных вибрионов призваны способствовать совершенствованию методов надзора за холерой.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Токсигенные и атоксигенные холерные вибрионы разных серогрупп при +4 °С переходят в НФ, что сопровождается динамическим изменением морфологических и ультраструктурных свойств: вибрионы утрачивают типичную морфологию и подвижность, приобретая овальную форму. В соответствии с изменившимися условиями среды и обменными процессами модифицируется ультраструктура.

2. Метаболизм НФ сдвигается в сторону анаэробного усвоения субстрата, первоначально увеличивается активность изученных оксидоредуктаз и гидролзз. Уровень ферментативной активности нестабилен, по мере пребывания холерных зибрионое г Н<" г^!по::<пость одних ферментов интенсифицируется, а других, нижается. Изменения носят неспецифический адаптивный характер.

3. Наблюдаемые в НС холерных вибрионов изменения напоминают процессы, сопровождающие спорообразование, но НФ отличаются отсутствием истинных защитных оболочек, более высоким уровнем функционирования изученных ферментов и выраженной динамикой индуцированных процессов.

4. В связи с тем, что НФ холерных вибрионов поглощают субстрат, сохраняют ферменты основных катаболических путей, генетические детерминанты вирулентности, способны восстанавливать исходные свойства, в течение не менее, чем 1-2 месяцев некультивируемостн, они представляют потенциальную опасность и должны учитываться при скрининге объектов окружающей среды.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Исследования проведены в рамках плановой темы «Экологические параметры образования некультивируемых форм холерных вибрионов» № 002821 >т 01.009. 90г.

План диссертационной работы утвержден Ученым Советом РПЧИ !2.06.2000г.

Материалы, полученные в ходе проведения исследований, были представлены на научных конференциях:

- холера и патогенные для человека вибрионы (Всероссийская проблемная

комиссия), Ростов-на-Дону, 1999г.;

- проблемы биологической и экологической безопасности (Международна научная конференция), Оболенск, 2000 г.;

- холера и патогенные для человека вибрионы (Всероссийская проблемна комиссия), Ростов-на-Дону, 2000 г.;

- 9th International Congress for Culture Collection, Brisbana, Australia;

- а также обсуждались на 2 научных конференциях РПЧИ.

ПУБЛИКАЦИИ: по материалам исследований опубликовано 9 работ, том числе 3 в зарубежной печати.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ: работа изложена на 231 страниц машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, пс священной материалам и методам исследования, 4 глав собственных исследс ваний, обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрировг на 35 таблицами и 14 рисунками. Библиография включает 323 источника, и них 197 отечественных и 126 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использовано 15 токсигенных и атоксигенных штаммов холер ных вибрионов разных серогрупп, выделенных от человека и из объектов ок ружающей среды. НФ получали из 6 штаммов - по два биотипа eltor, 0139 се рогруппы и поп 01 серогруппы - в микрокосмах с дистиллированной, морско водой, 0,85% раствором NaCl при 4 °С. Всего было получено 68 некультиви руемых проб. Жизнеспособность клеток контролировали методами витальног окрашивания и в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Принадлежность НФ роду Vibrio подтверждали серологически.

Морфологию и тинкториальные свойства некультивируемых клеток изу чали микроскопированием фиксированных препаратов, окрашенных по Грам или фуксином. Подвижность вибрионов исследовали в люминесцентном мин роскопе в препаратах «раздавленная капля», окрашенных акридиновым оран жевым. Более детально морфологию, а также ультраструктуру НФ изучали применением метода негативного контрастирования уранилацетатом и цитра том свинца. Для приготовления мазков 5 мл взвеси из микрокосма центрифуги ровали в течение 20 мин при 5000g, из полученного осадка готовили препарат! для электронно-микроскопического исследования.

Ферментативную активность некультивируемых взвесей изучали на ди агностических питательных средах с набором Сахаров, аминокислот, маннитоы В пробирки вносили по 0,2 мл микробной взвеси исходной агаровой культур! или ее некультивируемого варианта равной концентрации, которую определял)

нефелометрически. Изменение цвета среды учитывали в исходных пробах в течение трех суток, а в некультивируемых - 14 суток.

Для определения активности тетразолредуктазы, НАДН-дегидрогеназы, АТФ-азы, 5'-нуклеотидазы использовали взвеси исходных и НФ на дистиллированной, морской воде или фосфатном буфере, рН 7,4. Концентрация исходных клеток в суспензиях была равна 109м.кл./мл, а в некультивируемых пробах определялась нефелометрически и вычислялась по калибровочной кривой. Активность ферментов выражали в мкг образовавшегося вещества /103 м.кл. за время инкубации. Активность тетразолредуктазы проводили, как описано у B.C. Рудник (1974), НАДН-дегидрогеназы - по методу H.R. Mahler (1955), АТФ-азы - по Р.Н.Глебову, Н.М. Дмитриевой (1974), 5'-нуклеотидазы - по B.C. Туровскому (1980). Диссимиляцию глюкозы в НФ исследовали радиореспиро-метрическим методом С.Н. Wang et.al. (1958). Реакционная смесь содержала 5 млрд. м.кл/мл ( исходных или некультивируемых), 60 мкМ фосфатного буфера, рН 7,4, 0.8 мкКи 1С14-, 2С14- или 6С,4-глюкозы и 15 мкМ глюкозоносителя. Результат выражали в процентах радиоактивности выделенного С02 от количества внесенной радиоактивной глюкозы.

Наличие генов, кодирующих синтез холерного токсина (vet) и токсин-корегулируемых пилей (tcp) определяли в ПЦР, как описано у И.Ю. Сучкова с соавт. (1997). Помимо ПЦР родовую принадлежность некультивируемых клеток в микрокосмах подтверждали окраской люминесцентной «0»-холерной сывороткой и в развернутой реакции агглютинации с эритроцитарным «О» -холерным антигенным диагностикумом.

С целью получения реверсии свойств НФ взвеси из микрокосмов вводили по 0,2 мл кроликам-сосункам. In vitro повышали температуру культивирования до 20 или 37 °С, в сочетании с повышением температуры или отдельно к 1 мл некультивируемой взвеси прибавляли равный объем бульона Мартена, рН 7,6, 0,85% раствора NaCI, фосфатного буфера, рН 7,4. Контрольные высевы делали на агар Мартена с интервалом 3-4 суток.

Количество белка в пробах определяли по Lowry (1951).

Полученные результаты обрабатывали статистически по таблицам экспресс обработки экспериментального и клинического материала (Р.Б. Стрелков, 1980), определяли значения доверительных интервалов (L), среднего арифметического (М) для уровня достоверности (Р) 95% или 99%., степень корреляции по коэффициенту корреляции рангов Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Применение перечисленных методов исследования для изучения НФ разных сроков некультивируемости позволило выявить следующее. Концентрация клеток, способных расти на плотной питательной среде, в микрокосмах снижалась постепенно. Полиморфизм и ослабление подвижности вибрионов наблюдалось в популяциях, из которых еще высевались отдельные клетки. Утрата способности образовывать колонии на питательных средах на начальных эта-

пах не сопровождалась радикальными изменениями в структуре популяции морфологии клеток и их подвижности. При витальном окрашивании акридино вым оранжевым в препаратах выявляли зеленые подвижные типичные или не сколько удлиненные клетки, зеленые неподвижные округлые, собранные i конгломераты разной величины, и красные неподвижные округлой формы. Kai известно, флуоресценция подвижных клеток зеленым цветом свидетельствуй об их жизнеспособности, в то время как красные клетки принято считать мерт выми (J.E. Hobbie et.al., 1977, D.B. Roszak, R.R. Colwell, 1987). В фиксирован ных мазках, окрашенных по Граму, также выявляли клетки типичной и изме ненной морфологаи. Через два-три месяца клетки хуже воспринимали краси тель, что свидетельствует о перестройках поверхностных структур.

Более детально морфологию НФ холерных вибрионов изучали с приме нением методов электронной микроскопии. В негативно контрастированны: образцах из трехмесячных некультивируемых популяций в небольшом количе стве обнаруживали вибрионы типичной или измененной морфологии в той ил! иной степени сохранившие жгутик. Часть особей популяции имела глубоки! деструктивные изменения (рис.1). Наряду с этим выявляли небольшое количе ство клеток размером 0,6x1,2 мкм с гладкими очертаниями, овальной формы без жгутика, с продольной электронно-плотной складкой. Такие клетки чере: 10 месяцев НС составили основную массу популяции. На ультратонких среза: у них обнаружена вакуолизация клеточной стенки, сильное сжатие периплазма тического пространства, хорошо выраженная зернистость цитоплазмы, в зо№ нуклеоида электронно-плотный материал. По периферии клеток концентриче ски располагались несколько слоев мембран отмерших особей. Изменений, » совместимых с жизнедеятельностью, не выявлено.

Учитывая, что гибель клетки может не приводить к грубым структурнып изменениям, нами была предпринята попытка оценить жизнеспособность НС другими методами, а также сопоставить выявленные изменения морфологии i ультраструктуры с физиологическими процессами в НС. Первоначально изуча ли активность на диагностических питательных средах, содержащих набор са харов, аминокислот и маннит.

Учитывая данные литературы об изменчивости ферментативной активно сти вибрионов при длительном сохранении их в воде (B.JI. Семиотрочев и др. 1969, Н.В. Урюпина, Г.П. Никитина, 1977, И.Э. Эмдина, Л.П. Алексеева, 1984 В.Д. Беляков и др., 1986, В.В. Алексеенко и др., 1991), мы начали изучени свойств с микрокосмов, в которых еще высевалось 102-103 кл/мл, предполага изменение признаков на этом этапе. Обнаружено, что после 10-14 дневноп пребывания в дистиллированной воде при 4 °С замедлялась утилизация все: предложенных соединений. Через 4 дня НС все штаммы утратили способност аэробно расщеплять глюкозу и сахарозу, декарбоксилировать орнитин. Одно месячные НФ замедленно слабо ферментировали глюкозу, окисляли маннит i декарбоксилировали лизин. Через 5 месяцев НС активности на диагностически: питательных средах не обнаружено. Снижение интенсивности ферментации са харов на диагностических средах сопоставимо с количеством типичных

Рис. 1. Состав популяции НФ холерного вибриона через три месяца НС.

подвижных вибрионов в изучаемых культурах. В связи с этим была предприня та попытка оценить жизнеспособность некультивируемых популяций и изучит! принципиальную возможность функционирования в НФ гликолитическогс цикла и цикла трикарбоновых кислот. Учитывая распространенное мнение, чтс о жизнеспособности культуры можно судить по восстановлению солей тетразо ла дегидрогеназами дыхательной цепи (R. Zimmerman et.al., 1978, Р. Досон < соав., 1991, М.Ю. Щелканов и др., 1999), мы выбрали этот метод для продол жения изучения ферментативной активности НФ.

В качестве акцептора использовали трифенилтетразолхлорид (ТТХ). Изучали эндогенную активность (без добавления извне субстрата) и в присутствт глюкозы или интермедиатов цикла Кребса: янтарной, щавелевоуксусно{ (ЩУК), кетоглутаровой кислот. Качественная характеристика тетразолредук-тазной активности подтвердила, что концентрация клеток в микрокосмах сни жалась на 1-2 порядка, клетки дегидрировали субстраты цикла трикарбоновьо кислот. Неэнзиматическое восстановление ТГХ в убитых взвесях показалс большее содержание в НФ донаторов водорода, что согласуется с данными литературы о накоплении Сахаров в условиях низкой температуры и недостатке питательных веществ (Е.П. Феофилова, 1992). Количественное определение тетразолредуктазной активности НФ позволило охарактеризовать динамик) процесса в популяциях разного возраста. Через месяц пребывания в НФ эндогенное восстановление ТТХ возросло в 7-11 раз в зависимости от штамма. Через 5 месяцев показатели снизились в 1,5-2 раза, а к 10 месяцам достигли исходного уровня или были несколько ниже. Для всех использованных штаммов находящихся в НФ, отмечена обратно пропорциональная зависимость восстановления ТТХ от активности в исходном состоянии (рис. 2).

Аналогичные результаты получены в присутствии субстратов. Через 1 месяц НС эндогенное образование формазана превышало исходный уровень i присутствии глюкозы в 5-10 раз, при добавлении а-кетогутарата - в 5-14 раз, янтарной и щавелевоуксусной кислот - в 3-6 и 5-13 раз соответственно. По мере старения популяции эти показатели снижались: через 5 месяцев - в 2-3 раза, через 10 месяцев достигали практически исходного уровня. Высокая активность дегидрогеназ вызвана совокупностью факторов, в том числе неодинаковым содержание донаторов электронов и структурно-функциональными изменениями в клетках.

Выявленная способность НФ поглощать и дегидрировать субстраты цикла Кребса дегидрогеназами цепи переноса электронов (ЦПЭ) свидетельствуют о поддержании определенного уровня энергетического обмена в клетках, что согласуется с данными литературы (Ю.М. Романова, А.Л.Гинцбург, 1993, L.T. Gribbon, M.R. Barrer, 1995, А. Саго et.al„ 1999). Поэтому объектами дальнейших исследований стали ключевые ферменты дыхательной цепи - НАДН- и сукцинатдегидрогеназа. В качестве акцептора электронов применяли 2,6-дихлорфенолиндофенол (2,6-ДХФИФ).

НАДН - дегидрогеназная активность атоксигенных штаммов, выделенных из воды, была достоверно выше, чем у токсигенных, выделенных от чело-

Рис.2 Эндогенная тетразолредукгазная активность исходных »и НФ холерных вибрионов

V.ЛЫег»«еЬ» V.сЪоЬгавеИ<ж V.ОиЛегае0139 V. Ло1мэ« 0139 У.сМааепоп01 VЙю1вгавпоп01 17551 17558 16065 17673 370 117

?ис.З. Редукция 2,6ДХФИФ исх. и НФ.

мкг/1000 мк.кл.

V СИМ«».

Лог 17551 У-АЛм»

«йог 17558 4 <*"'«'" „

013916065 " Л*пг ^ 013» 17673 *

ПОП01 370

штаммы

века. Подобной зависимости у НФ не обнаружено. Окисление НАДН одномесячными некультивируемыми клетками превышало исходный уровень в 3-13 раз, сукцината - в 5-17 раз. Через 5 месяцев НС утилизация субстратов была выше начального уровня в 20-50 раз и 17-46 раз соответственно (рис. 3).Данные литературы (Н.С. Гельман и др., 1966, В.К. Акименко, 1999) свидетельствуют, что высокие показатели НАДН- и сукцинатдегидрогеназной активности обусловлены действием неблагоприятных условий среды, которые приводят к адаптивной интенсификации работы ферментов, качественному и количественному изменению состава энзимов дыхательной цепи, их диффундированию е клеточную стенку, конформационным изменениям в ЦПМ. Обнаруженное снижение концентрации клеток в микрокосмах на 1-2 порядка также может вносить вклад в увеличение активности ферментов по мере старения некульти-вируемой популяции.

В связи с предполагаемыми изменениями ЦПМ объектом дальнейших исследований стали два маркерных фермента структурно-функционального состояния цитоплазматической мембраны: АТФ-аза и 5'-нуклеотидаза. Создаваемые АТФ-азой градиенты вовлечены в регуляцию обмена клетки, контроль за дыханием, pH и трансмембранным переносом Сахаров и аминокислот (P. Mitchell, 1970,1.S. West, 1974, И.А. Медведева, 1993). 5'- нуклеотидаза катализирует отщепление неорганического фосфора от нукпеозид-5'-фосфатов, участвуя тем самым в обмене нуклеиновых кислот в клетке (Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина. 1998). Оба фермента локализованы в ЦПМ.

Определение активности АТФ-азы исходных культур показало, что > большинства штаммов, в геноме которых присутствовал ген холерогенности. активность общей АТФ-азы превышала активность Ca++Mg++-3aBHCHMofl. На долю уабаиночувствительного К+Ка+-зависимого транспорта приходилось 1652%. Через месяц НС признак был утрачен штаммами 0139 серогруппы и значительно сократился у штаммов биотипа эльтор (рис. 4 и 5).

Через 5 месяцев НС К^а+-зависимая АТФ-аза не обнаружена. По мере пребывания в НФ активность фермента изменялась следующим образом: через месяц превышала исходный уровень в 2,6-10 раз, через 5 месяцев снизилась е 1,5-2 раза, а к 10 месяцам достигла исходных показателей или снизилась в 1,5 раза. Утрата К+Иа+-зависимой АТФ-азы в НС может указывать на приспособление микроба к неблагоприятным условиям среды по пути сапрофитизации обмена.

Активность другого маркерного фермента ЦПМ - 5'- нуклеотидазы - > одномесячных некультивируемых клеток возросла по сравнению с исходным уровнем в 2,7-3,4 раза. Профиль активности НФ полностью повторял таковой у исходных вариантов (рис.5).

Через пять месяцв после утраты способности расти на питательных средах активность возросла в среднем в 10 раз, за исключением штамма, раньше других утратившего пролиферативные свойства, у которого активность фермента была максимальной для всех серий опыта. Полученные результаты, сопоставляемые с данными литературы (С.Ю. Тюкавкина и др., 1995, Б.Н. Ми-

Рис. 4. Активность АТФ-азы исходных штаммов холерных вибрионов

мкгДОООшсг

0,25-1

V.

еНог " усН

V.

•Ног

"»а»

V.

0139 * "тс1+

V.

0139

V. с|1Ыегм V. сМегае 01 370 01 117

Рис. 5. Активность АТФ-азы НФ холерных вибрионов (1мес. НС)

мкг/1000 1.»-)'

М.КЛ

1,(

□К, Ыа- зависим. НФ ИСа. Мд - зависим. Ж

V. сМегм V. с1го[егае V. сМегм V. сЬо)егм V. с№ег» поп V. сЬо*епе поп еАог 17551 е*ог 1755Й «1+ 013916065 013917873 01 370 01117уа-

«1* \с(-

Штяммы

шанькин и др., 1997) свидетельствуют, что в НФ холерных вибрионов в течение первого месяца происходит угнетение клеточных функций, однако процессы не носят дезинтегрирующий характер и поддерживают жизнеспособность клеток. Дальнейшая динамика активности фермента указывает на глубокие изменения в ЦПМ, значительном угнетении клеточных функций под действием продолжающих действовать неблагоприятных условий среды.

Рис.6. 5'- нукгаовддаия активность исходных и НФ холерных вибрионов

пол 01370 «Лйегав пол 01117

В полученных результатах обращает внимание высокие показатели активности изученных ферментов через 1 -5 месяцев НС. Большинство исследователей, изучавших физиологию микробов в неблагоприятных условиях, сталкивались с этим фактом (И.А. Работнова, 1975, A.B. Калакуцкий, Н.С. Агре, 1977, S.W. Drew, A.L. Demain, 1977, R. Marchai, 1977). Гиперфункция ферментов в неблагоприятных условиях связана с разобщением конструктивных и энергетических процессов. На неблагоприятные условия среды клетка реагирует прекращением размножения, ферментные системы катаболизма поддерживают энергетический обмен. В случае наступления благоприятных условий репродуктивные функции возобновляются.

Изучение морфологии и ферментативной активности НФ холерных вибрионов и обнаруженная специфика этих показателей обусловили необходимость исследования окислительного метаболизма с применением меченых соединений. Радиореспирометрический метод позволяет получить сведения о путях диссимиляции различных соединений и не вызывает сомнений относительно регистрации процессов жизнедеятельности, а не лизиса клеток. В ранние сроки сохранения популяции в условиях микрокосма (высеваемость составляла

nlO5 кл/мл) происходила перестройка метаболизма, проявляющаяся в замедлении и уменьшении количества выделенного радиоактивного С02. По мере пребывания в НС клетки все медленнее и в меньших количествах выделяли углекислоту. Через 2 часа инкубации с 1С14 - и 6С14- глюкозой выход радиоактивного СО2 трехдневными НФ составил 0,03% от исходного уровня, а у 14-дневных клеток не регистрировался, увеличение времени инкубации с меткой до 17-18 часов позволило выявить слабую активность и у таких культур. На основе равной радиоактивности выделенного СОг при использовании глюкозы, меченной по первому и шестому атомам, сделан вывод об ограниченном функционировании гексозомонофосфатного шунта в НФ. Применение 1,4С14 - янтарной кислоты и 2С14 - глюкозы, показало, что терминальное окисление углеводов в НФ осуществляется в реакциях цикла Кребса, однако этот процесс сокращен до 12% по сравнению с исходными культурами. Полученные результаты свидетельствуют о сдвиге метаболизма в сторону гликолиза в НФ и о функционировании, по крайней мере, отдельных стадий цикла Кребса.

Дополнительно к перечисленным методам исследования в некультиви-руемых пробах разных сроков давности проводили тестирование генов, кодирующих синтез холерогена и пилей адгезии - vet и tcp-генов в ПНР. Определяли количество белка в пробах. Предпринимали попытки получения реверсии. Обнаружено, что в ПЦР тестируемые детерминанты патогенности обнаруживались в течение 1-2 месяцев. Проявление ферментативной активности и реверсия свойств при наступлении благоприятных условий (повышение температуры культивирования, введении кроликам-сосункам) более старых НФ позволяют думать, что не выявление vet и tcp-генов связано со структурно-конформационными перестройками ДНК и клеточных структур, а не с лизисом клеток, (М.Ю. Аксенов и др., 1995, В.И. Иванов, 1998). Количество белка в некультивируемых клетках разного возраста было в среднем в два раза выше, чем в исходных культурах, что согласуется с данными литературы о необходимости синтеза белка для поддержания клеток в НС и о синтезе дополнительных белков в неблагоприятных условиях (И.А. Баснакьян, В.А. Мельникова, 1996, Ю.М. Романова, Н.В. Алексеева, 1997, S.P. Watson etal., 1998).

Представленные данные, на наш взгляд, позволяют сделать следующее заключение. НФ холерных вибрионов - это результат динамического развития популяции в неблагоприятных условиях. Низкая температура и отсутствие питательных веществ индуцируют запуск адаптационных механизмов, направленных на сохранение популяции. Их реализация осуществляется на уровне отдельной клетки и популяции в целом. Изученные свойства позволяют выделить, по крайней мере, три стадии последовательного развития процесса:

Первая стадия: концентрация клеток исходная. Клетки постепенно утрачивают способность к росту, но отдельные еще образуют колонии на агаровых средах. Морфология полиморфна. На диагностических средах активность замедляется, сохраняется спектр утилизируемых веществ. Активность изученных ферментов близка к первоначальному уровню. В ПЦР регистрируются vet- и tcp-гены. При наступлении благоприятных условий возобновляется рост всей

популяции.

Вторая стадия: концентрация клеток снижается на 1-2 порядка. Колонии не образуют. Утрата подвижности, преобладают морфологически измененные клетки. На диагностических средах ферментативная активность не регистрируется. Гиперфункция изученных ферментов. Метаболизм изменен, признаки са-профитизации. Дают положительный ответ в ПЦР. Возможна реверсия первоначальных свойств.

Третья стадия: концентрация клеток не изменяется или снижается очень незначительно. Глубокое изменение морфологии. Колоний не образуют. На диагностических средах активность не выявляется. Активность ферментов на исходном уровне или ниже. Часть клеток сохраняют целостность структур, у них не выявлено изменений, не совместимых с жизнедеятельностью. Не дают положительного ответа в ПЦР. Реверсия свойств не получена.

Утрата подвижности, своеобразное строение клеток в НС, покрытых мембранами отмерших особей, высокая НАДН-дегидрогеназная активность, большее содержание белка позволяют проводить аналогии между спорами и НФ Однако последние отличаются отсутствием истинных дополнительных защитных оболочек, более высокой активностью изученных гидролаз и оксидоредук-таз. Сходство НФ со спорами не может не настораживать, так как свидетельствует о потенциальной возможности сохр-дн?';ия патогеном жизнеспособности, которая не проявляется при . ¿¿г.. ;• ... .м традиционными методами. То обстоятельство, что в НС выр^кс;.^ мапа.лика структурно-функциональных изменений, позволяет делать прогноз относительно потенциальной опасности менее серьезным. Однако не следует недооценивать значимость НФ. Выявленная > них способность поглощать субстрат, наличие ферментов гликолиза и цикл* Кребса, целостность покровов, отсутствие деструктивных изменений в тонком строении свидетельствуют о наличии определенного уровня обмена веществ что по современным представлениям является показателем жизнеспособности клеток. Это обстоятельство, а также сохранение детерминант патогенности V способности к реверсии свойств определяют необходимость учета возможного наличия НФ при проведении мониторинга объектов окружающей среды. Выявленная ферментативная активность НФ холерных вибрионов в поздние сроки некультивируемости позволяет рассматривать ферментативный анализ, как перспективное направление для разработки методов тестирования НФ.

ВЫВОДЫ

1. Изучение биологических свойств НФ холерных вибрионов разных срокоь некультивируемости, полученных нами в эксперименте, позволило установить, что переход в НС сопровождался качественным и количественным изменением изученных признаков, которое носило динамический характер.

2. Переход в НС характеризовался изменением морфологии клеток от типичных подвижных до неподвижных овальной формы без жгутика, которые

преобладали в стареющих некультивируемых популяциях. Морфологические изменения коррелировали с модификацией ультратонкого строения, проявляющейся в вакуолизации клеточной стенки, сокращении периплазма-тического пространства, концентрации нуклеоида. Клетки сохраняли целостность поверхностных структур. Несовместимых с жизнедеятельностью структурных изменений не обнаружено.

3. Изменение ферментативной активности на диагностических питательных средах выражалось в замедлении реакций и сокращении числа утилизируемых субстратов, с последующей утратой признака. Наиболее длительно сохранялась способность ферментировать глюкозу.

4. Активность дыхательных ферментов (тетразолредуктазы и НАДН-дегидрогеназны) через месяц, в зависимости от штамма и субстрата, возрастала в 3-13 раз. В дальнейшем активность тетразолредуктазы снижалась, а НАДН-дегидрогеназы - увеличивалась.

5. Изучение активности маркерных ферментов ЦПМ показало интенсификацию их деятельности через месяц НС в среднем в 10 раз, по мере старения популяций активность АТФ-азы постепенно снижалась, а 5'-нуклеотидазы продолжала увеличиваться, что свидетельствует о структурно-функционапьных перестройках ЦПМ и физиологическом угнетении клеток.

6. Радиореспирометрическое изучение утилизации глюкозы выявило сокращение объема и замедление выделения С02. К четырем месяцам НС незначительное выделение углекислого газа обнаружено только при длительных сроках инкубации, что свидетельствует о перестройке метаболизма и сдвиге его реакций в сторону гликолиза.

7. Морфологические и ультраструктурные особенности, высокая НАДН-дегидрогеназная активность, повышенное содержание белка позволяют проводить параллели между спорами и НФ, однако последние отличаются отсутствием истинных защитных оболочек и большей активностью изученных гидролаз и оксидоредуктаз. Высокая дегидрогеназная и АТФ-азная активность, утрата уабаиночувствительной К^Иа^зависимой АТФ-азы, уменьшение выделения С02 в НС свидетельствует об отдельных метаболических процессах, свойственных сапрофитам.

8. Наличие обменных процессов в поздние сроки некультивируемости, свидетельствующее о поддержании жизнеспособности, сохранение детерминант вирулентности и восстановление первоначальных свойств при наступлении благоприятных условий указывают на необходимость учета НФ холерных вибрионов при мониторинге объектов окружающей среды в рамках надзора за холерой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Л.С. Подосинникова, А.В. Соколенко, Е.А. Чепкова и др. Экспериментальное получение и характеристика некультивируемых форм холерных вибрионов.//Холера и патогенные для человека вибрионоы. - Ростов-на-Дону, 1999. - С.39-41.

2. О.С. Бурша, B.C. Каграманов, А.В. Соколенко. Определение активности рибулозодифосфаткарбоксилазы у инактавных вариантов V. cholerae el-tor. //Журн. микробиол., эпидемиол. и вирусол, - 1999. - №6, С. 90-91.

3. Е.А. Чепкова, А.В. Соколенко, О.Ю. Олехова. Влияние различных экологических факторов не образование некультивируемых форм холерных вибрионов в эксперименте. //Гигиена окружающей среды и человека. - Саратов, 1999. -С.86-87.

4. О.С. Бурша, А.В. Соколенко. Изучение условий реверсии инактивны> вариантов холерного вибриона в исходные формы. //Проблемы биологической и экологической безопасности. - Материалы Международной конференции. - Оболенск, 2000. — С.22-23.

5. А.В. Соколенко, О.Ю. Олехова, Е.А. Чепкова. Некультивируемьк формы холерных вибрионов, как результат динамического развития популя ции в неблагоприятных условиях. //Там же. - С. 85-87.

6. А.В. Соколенко, Л.С. Подосинникова, Л.Е. Асеева, B.C. Каграманов Активность некоторых ферментов некультивируемых форм холерных виб рионов. //Холера и патогенные для человека вибрионы. - Ростов-на-Дону 2000. -Вып.13. - С.48-50.

7. М. Lomov, A. Sokolenko, V. Kagramanov, L. Aseeva. Feature of an ex change of a glucose at the nonculturable forms of Vibrio cholerae. // Abstracts o: Ninth International Congress for Culture Collections. - Brisbane, Australia. • July,23-28. - 2000., p.13-16.

8. A. Sokolenko, L.Aseeva, V. Kagramanov, O. Burscha. Activity of some en zymes of a cytoplasm membrane of the nonculturable forms of Vibrio cholerae. / Abstracts of Ninth International Congress for Culture Collections. - Brisbane Australia. - July, 23-28.-2000., - 27-28.

9. L. Podosinnikova, A. Sokolenko, E. Chepkova, O. Olehova, S. Saymov Biological properties of the nonculturable forms of Vibrio cholerae. // Abstracts о Ninth International Congress for Culture Collections. - Brisbane, Australia. - July 23-28.-2000.,- p.59-61.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соколенко, Анна Васильевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ФОРМЫ БАКТЕРИЙ - МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ, СВОЙСТВА, РОЛЬ В ЭПИДЕМИОЛОГИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Некультивируемые формы бактерий. История вопроса.

1.2. Методы обнаружения и изучения свойств некультивируемых форм.

1.3. Свойства некультивируемых форм бактерий.

1.4. Некультивируемые формы как стратегия выживания бактерий.

1.5. Некоторые особенности морфологии и метаболизма покоящихся форм бактерий.

1.6. Морфологические и метаболические проявления стрессового состояния у бактерий.

1.7. Морфологическая и биохимическая изменчивость холерных вибрионов, выделенных из окружающей среды.

1.7.1. Изменения морфологии, агглютинабельности и фагочувствительности.

1.7.2. Краткие сведения о метаболизме холерных вибрионов и изменчивости ферментативной активности.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы.

2.2. Реактивы.

2.3. Метод получения НФ холерных вибрионов.

2.4. Методы изучения морфологии и ультраструктуры

2.5. Биохимические методы исследования ферментативной активности.

2.5.1. Тетразолредуктазы.

2.5.2. АТФ-азы.

2.5.3. 5"-нуклеотидазы.

2.5.4. НАДН-дегидрогеназы.».

2.6. Радиореспирометрический метод изучения диссимиляции глюкозы некультивируемыми формами холерных вибрионов.

2.7. Полимеразная цепная реакция.

2.8. Дифференциальное центрифугирование.

2.9. Развернутая реакция агглютинации с эритроцитарным «0»-холерным диагностикумом.

2.10.Методы реверсии НФ холерных вибрионов.

2.11. Статистическая обработка результатов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. МОРФОЛОГИЯ, ТИНКТОРИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА, УЛЬТРАСТРУКТУРА НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ ФОРМ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ.

3.1. Свойства, выявляемые при световой микроскопии.

3.2. Свойства, выявляемые электронно-микроскопическими методами исследования.

ГЛАВА 4. БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ ФОРМ НА СРЕДАХ С УГЛЕВОДАМИ, МАННИТОМ И АМИНОКИСЛОТАМИ.

ГЛАВА 5. ОСОБЕННОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ ФОРМ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ.

5.1 .Тетразолредуктазная активность НФ.

5.2. Активность НАДН - и сукцинатдегидрогеназы.

5.3. Активность маркерных ферментов цитоплазматической мембраны.

5.3.1. Активность АТФ-азы.

5.3.2. Активность 5" -нуклеотидазы.

ГЛАВА 6. ДИССИМИЛЯЦИЯ ГЛЮКОЗЫ НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫМИ ФОРМАМИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфология, ультраструктура, метаболизм некультивируемых форм холерных вибрионов"

Актуальность проблемы.

Холера как болезнь, вызывавшая опустошительные эпидемии, известна давно. Упоминание о ней можно встретить в древних литературных источниках Индии, Китая, Тибета (Я-Л. Со1\уе11, 1996). С развитием медицины и микробиологии появились эффективные методы лечения, позволившие значительно снизить смертность, а также методы обнаружения и идентификации вибрионов, на основе которых разработана многоступенчатая система надзора за холерой. Однако по ряду причин заболевания холерой в мире не удается взять под абсолютный контроль. За период только 7-й пандемии в мире в 146 странах Азии, Африки, Америки, Австралии и Океании зарегистрировано более четырех миллионов случаев холеры (Ломов Ю.М. и др., 1998). В 1999 году 53 страны мира информировали ВОЗ о 201334 случаях холеры, за пять месяцев 2000 года зарегистрировано 15652 заболевания (Ю.М. Ломов и др., 2000). В связи с постоянно сохраняющейся угрозой завоза холеры из-за рубежа актуальна эта проблема и для России.

Ситуация осложняется еще и тем, что, как выяснилось в последние два десятилетия, холерный вибрион во внешней среде способен переходить в некультивируемое состояние (НС). Такие формы не растут на питательных средах, что существенно затрудняет выделение и идентификацию возбудителя. Однако они могут представлять опасность для здоровья человека, так как сохраняют в НС вирулентность (СоЫеП Я.Я., 1985; Гинцбург А. Л., Романова Ю.М., 1997). Последнее обстоятельство объясняет пристальный интерес исследователей к некультивируемым формам (НФ) бактерий.

С момента начала изучения феномена прошло почти двадцать лет. Однако о некультивируемых формах известно немного. Предполагают, что это покоящаяся форма грамотрицательных бактерий, аналогичная спорам. Пока не существует единого мнения о природе явления, функциональной значимости и степени их потенциальной опасности для человека. Практически неизученным остается метаболизм некультивируемых / клеток. Все это справедливо и для холерных вибрионов. В доступной литературе мы не обнаружили сведений, касающихся динамики морфологических изменений, ультраструктурной организации клеток холерных вибрионов в НС, их ферментативной активности. Изучение биологических свойств НФ помимо теоретического представляет практический интерес. Исследование закономерностей образования НФ, специфики ультраструктуры и особенностей метаболизма позволит создать теоретическую базу для разработки новых быстрых и высоко специфичных методов обнаружения. Изучение динамики, глубины и степени обратимости изменений особенно важно для понимания эпидемической значимости НФ холерных вибрионов. Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы - исследование структурных и метаболических изменений, происходящих в НФ холерных вибрионов и оценка их биологической активности.

В связи с поставленной целью были сформулированы основные задачи исследования:

1. Характеристика морфологических изменений некультивируемых клеток и динамики этого процесса.

2. Изучение ультраструктурной организации некультивируемых клеток холерного вибриона.

3. Изучение характера и интенсивности метаболизма, функционального состояния НФ по активности дыхательных ферментов тетразолредуктазы, НАДН-дегидрогеназы и маркерных ферментов цитоплазматической мембраны - АТФ-азы, 5х- нуклеотидазы. 4. Исследование основных путей диссимиляции глюкозы холерными вибрионами в разные сроки некультивируемости.

Научная новизна

Впервые проведены систематические исследования степени и динамики морфологических изменений НФ холерных вибрионов. Показано, что эти изменения сопряжены с модификацией метаболизма. Впервые представлены данные по активности дегидрогеназ цикла Кребса у НФ, НАДН-дегидрогеназы, активности маркеров структурно-функционального состояния цитоплазматической мембраны (ЦПМ): АТФ-азы, 5"-нуклеотидазы. Обнаружена интенсификация процессов дыхания, и других ферментативных реакций на уровне некультивируемой популяции, что обусловлено структурными изменениями, большим содержанием белка в некультивируемых клетках и остаточной активностью мембран лизированных клеток. Впервые обнаружено, что исходные штаммы 01 и 0139 серогрупп, независимо от наличия гена холерогенности, обладали К+ Ка+-зависимой АТФ-азой, этим же свойством обладал холерогенный штамм не 01 серогруппы. По мере пребывания в НС указанная АТФ-аза переставала регистрироваться, а выявлялась только Са++ М§++ - зависимая -АТФ-аза, характерная для прокариот. Получены сведения об особенностях НАДН-дегидрогеназной активности НФ, интенсивность которой напоминает сапрофитическую. Впервые представлены данные о путях диссимиляции глюкозы некультивируемыми холерными вибрионами и о сдвиге этого процесса в сторону анаэробного усвоения.

Научно-практическая ценность работы

Полученные в результате исследований данные представляют интерес с точки зрения поиска путей разработки новых доступных методов выделения и идентификации возбудителя, находящегося в НФ. Этому может способствовать показанная принципиальная применимость метода восстановления трифенилтетразолхлорида (ТТХ) и 2,6 -дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ) для определения в водной среде живых микроорганизмов, не растущих на питательных средах. На основе указанного метода разработаны методические рекомендации «Использование сукцинатдегидрогеназной активности для идентификации некультивируемых форм холерных вибрионов», которые утверждены на Ученом Совете РПЧИ 22.06.2000. Выявленные различия в диссимиляции глюкозы некультивируемых клеток могут быть основой для разработки дифференциальных тестов. Обнаруженная гидролазная и оксидоредуктазная активность, в том числе и в поздние сроки некультивируемости, может быть положена в основу разработки простых лабораторных тестов идентификации НФ. Выявленные особенности биологических свойств НФ холерных вибрионов призваны способствовать совершенствованию методов надзора за холерой.

Положения, выносимые на защиту

1. Токсигенные и атоксигенные холерные вибрионы разных серогрупп при +4°С переходят в НФ, что сопровождается динамическим изменением морфологических и ультраструктурных свойств: вибрионы утрачивают типичную морфологию и подвижность, приобретая овальную форму. В соответствии с изменившимися условиями среды и обменными процессами модифицируется ультраструктура.

2. Метаболизм сдвигается в сторону анаэробного усвоения субстрата, первоначально увеличивается активность изученных оксидоредуктаз и гидролаз. Уровень ферментативной активности нестабилен, по мере пребывания в НС деятельность одних ферментов интенсифицируется, а других, напротив, снижается. Изменения носят неспецифический адаптивный характер.

3. Наблюдаемые в НС холерных вибрионов изменения напоминают процессы, сопровождающие спорообразование, но отличаются отсутствием истинных защитных оболочек, более высоким уровнем функционирования изученных ферментов и выраженной динамикой индуцированных процессов.

4. В связи с тем, что НФ холерных вибрионов поглощают субстрат, сохраняют ферменты основных катаболических путей, генетические детерминанты вирулентности, они способны восстанавливать первоначальные свойства, по крайней мере, в течение 1-2 месяцев некультивируемости, представляют потенциальную опасность и должны учитываться при скрининге объектов окружающей среды. Апробация работы

Исследования проведены в рамках плановой темы «Экологические параметры образования некультивируемых форм холерных вибрионов» № 002821 от 01.009. 90.

План диссертационной работы утвержден Ученым Советом РПЧИ 22.06.2000.

Материалы, полученные в ходе проведения исследований, были представлены на научных конференциях:

- Холера и патогенные для человека вибрионы (Всероссийская проблемная комиссия), Ростов-на-Дону, 1999

- Проблемы биологической и экологической безопасности (Международная научная конференция), Оболенск, 2000

- Холера и патогенные для человека вибрионы (Всероссийская проблемная комиссия), Ростов-на-Дону, 2000

10 th

- 9 International Congress for Culture Collection, Brisbane, Australia, 2000, а также обсуждались на 2 научных конференциях РПЧИ. По материалам исследований опубликовано 9 работ, в том числе 3 в зарубежной печати.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Соколенко, Анна Васильевна

ВЫВОДЫ

1. Изучение биологических свойств НФ холерных вибрионов разных сроков некультивируемости, полученных нами в эксперименте, позволило установить, что переход в НС сопровождался качественным и количественным изменением изученных признаков, которое носило динамический характер.

2. Переход в НС характеризовлася изменением морфологии клеток от типичных подвижных до неподвижных овальной формы без жгутика, которые преобладали в стареющих некультивируемых популяциях. Морфологические изменения коррелировали с модификацией ультратонкого строения, проявляющейся в вакуолизации клеточной стенки, сокращении периплазматического пространства, концентрации нуклеоида. Клетки сохраняли целостность поверхностных структур. Несовместимых с жизнедеятельностью структурных изменений не обнаружено.

3. Изменение ферментативной активности на диагностических питательных средах претерпевала первые изменения еще до полной утраты пролиферации. Выражалось в замедлении реакций и сокращении числа утилизируемых субстратов, с последующей утратой признака. Наиболее длительно сохранялась способность ферментировать глюкозу.

4. Активность дыхательных ферментов (тетразолредуктазы и НАДН-дегидрогеназы) через месяц, в зависимости от штамма и субстрата, возрастала в 3-13 раз. В дальнейшем активность тетразолредуктазы снижалась, а НАДН-дегидрогеназы - увеличивалась.

5. Изучение активности маркерных ферментов ЦПМ показало интенсификацию их деятельности через месяц НС в среднем в 10 раз, по мере старения популяций активность АТФ-азы постепенно снижалась, а 5" -нуклеотидазы продолжала увеличиваться, что свидетельствует о структурно-функциональных перестройках ЦПМ и физиологическом угнетении клеток.

6. Радиореспирометрическое изучение утилизации глюкозы выявило сокращение объема и замедление выделения СОг. К четырем месяцам НС выделение углекислого газа при данных сроках инкубации не обнаружено, что свидетельствует о перестройке метаболизма и сдвиге его реакций в сторону гликолиза.

7. Морфологические и ультраструктурные особенности, высокая НАДН-дегидрогеназная активность, повышенное содержание белка позволяют проводить параллели между спорами и НФ, однако последние отличаются отсутствием истинных защитных оболочек и большей активностью изученных гидролаз и оксидоредуктаз.Высокая дегидрогеназная и АТФ-азная активность, утрата уабаиночувствительной К+Ыа+-зависимой АТФ-азы, уменьшение выделения С02 в НС свидетельствует об отдельных метаболических процессах, свойственных сапрофитам.

8. Наличие обменных процессов в поздние сроки некультивируемости, свидетельствующее о поддержании жизнеспособности, сохранение детерминант вирулентности и восстановление исходных свойств при наступлении благоприятных условий указывают на необходимость учета НФ холерных вибрионов при мониторинге объектов окружающей среды в рамках надзора за холерой.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соколенко, Анна Васильевна, Ростов-на-Дону

1. Авакян A.A., Кац Л.Н., Харатьян Е.Ф. Изучение локализации дегидрогеназ у аэробных и анаэробных бактерий на субмикроскопическом уровне. // Изв. АН СССР. Серия биол. 1982. -№5. -С. 686-696.

2. Адамов А.К., Иванов В.А., Шмеркевич Д.Л. Гидробионтный Фактор распространения холеры. //Пробл. особо опасн. инф.- 1971. Вып. 6 -С. 11-14.

3. Адамов А.К., Тихонов Н.Г., Павлова Ю.П. и др. Механизмы антиферментного иммунитета.//.- Пробл. особо опасн. инф.- 1977.- вып. 3.-С. 49-54.

4. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы. Саратов, 1984. -с. 328.

5. Акименко В.К. Альтернативные оксидазы микроорганизмов. -М.: «Наука», 1989.-262с.

6. Аксенов М.Ю., Гаровникова Ю.С., Левина Г.А. и др. Использование метода полимеразной цепной реакции для изучения процесса перехода клеток Salmonella typhimurium в некультивируемое состояние. // Молек. генет., 1994. - №2. - С. 17-20.

7. Аксенов М.Ю., Гинцбург А.Л. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода полимеразной цепной реакции. //Молек.генет., микробиол., вирусол. 1993. - №4. - С.3-8.

8. Ю.Алексеева Л.П. Пути диссимиляции глюкозы, манозы и глюконата у неагглютинирующихся и Эль-Тор вибрионов. Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Ростов-на-Дону^ 1975. -20с.

9. П.Алексеева Л.П. К вопросу о терминальном окислении углеводов у нехолерных и Эль-Тор вибрионов. // Пробл. особо опасн. инф. 1976. -Вып.З. - С.27-29.

10. Алексеева Л.П., Домарадский И.В., Голубинский Е.П. Превращение глюкозы и манозы у НАГ- и нехолерных вибрионов. // Пробл. особо опасн. инф. 1974.- Вып. 1.- С. 51-55.

11. Алексеева Л.П., Гальцева Г.В. Окисление маннозы вибрионами. /Матер. 3-й Сев.-Кав. биохим. конф. Ростов-на-Дону, 1976.- С. 180-181.

12. Алексеева Л.П., Рублев Б.В. Использование глюконовой кислоты вибрионами. //Материалы 3-й Сев.-Кав. биохим. конф. Ростов-на-Дону, -1976. -С. 181 -182.

13. Алексеенко В.В., Лысенко З.А., Царева О.Н. и др. Динамика изменчивости биологических свойств Vibrio cholerae при длительном их сохранении в воде и во льду.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1991.- № 11.- С. 17-20.

14. Альберте А. Биология клетки. М: «Мир», 1988. - т.1. - с.48-52.

15. Андрусенко И.Т., Александрова И.К., Алексеенко В.В., Ермолов В.И. Изучение атипичных форм холерных вибрионов. //Микробиол. журн.-1983.-Т. 45, №6.-С. 76-80.

16. Андрусенко И.Т., Пастернак H.A., Ведьмина Е.А. и др. Действие энтеротоксина Vibrio cholerae на микроорганизмы. //Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1984.- № 10.- С. 52-55.

17. Бабин В.Н., Домарадский И.В., Дубинин A.B. и др. Биохимические и молекулярные аспекты симбиоза человека и его микрофлоры // Росс, хим. журн,- 1994.- Т. 38, № 6.- С. 66-78.

18. Балашов М.П. Холера Эль-Тор как природноочаговая инфекция. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1990.- № 2.- с. 119-120.

19. Бароян О.В. Холера эльтор.- М.: Медицина, 1971.- 256 с.

20. Бароян О.В., Бургасов П.Н., Гайлонская И.Н., Мединский Г.М. Экология холерных вибрионов // Вест. АМН СССР.- 1975.- № 2.- С. 4553.

21. Баснакьян И.А., Боровко В.М., Кузьмин С.Н. Патология и физиология микробов. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1981. -№9.- С. 14-19

22. Баснакьян И.А., Мельникова В.А. Стрессовые белки у бактерий. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1996 - № 6. - с.99-103.

23. Беляков В.Д., Каминский Г.Д., Каминская С.Г. Гипотеза направленной самоперестройки популяции микроорганизмов и ее общебиологическое значение.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1986. -№1. - С.93-100.

24. Беляков В.Д., Литвин В.Ю., Емельяненко E.H., Пушкарева В.И. Патогенные бактерии, общие для человека и растений. //Патогенные бактерии в сообществах (механизмы и формы существования). М.: Росагросервис. - 1994. - С. 11-16.

25. Беляков В.Д., Марамович A.C., Каминский Г.Д. Гетерогенность и изменчивость популяций Vibrio cholerae eltor и их роль в развитииэпидемического процесса. // Журн. микробиол., эпидемоло. и иммунобиол. 1986. - № 2. - С. 91-96.

26. Биологический энциклопедический словарь. М.: «Сов. энциклопедия». - 1989. - 864 с.

27. Бичуль К.Г. Свойства холерных ЭльТор вибрионов, выделенных из открытых водоемов. // Пробл. особо опасн. инф. -1969. -Вып.5. С.176-182.

28. Болдырев A.A. Биохимические мембраны и транспорт ионов. М.: Наука, 1985.-271 с.

29. Бурша О.С., Каграманов B.C., Соколенко A.B. Определение активности рибулозодифосфаткарбоксилазы у инактивных вариантов Vibrio cholerae eltor. // Журн. микробиол., эпидемиоло. и иммунобиол. 1999. -№6.-С. 90-91.

30. Бухарин C.B. Персистенция бактериальных патогенов как результат отношений в системе паразит-хозяин. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1997.- № 4.-С. 3-9.

31. Вадимов В.М. Использование молекулярного спектрального анализа в бактериологии и иммунологии. // Журн. микролиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1962. -№3 , - С.3-8.

32. Вайсман И.Ш. Предпосылки комплексной оценки физиологического состояния бактерий и их популяций. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1984. - №4, - с.3-8.

33. Ващенок Г.И., Гурьянова Л.И., Пунько Т.А. К вопросу о диссоциации вибриона, выделенного от человека. // Пробл. особо опасн. инф.- 1971. -№3.-С. 47-53.

34. Вейде А.А., Марамович А.С., Ганин В.С.и др. Характеристика холерных вибрионов, выделенных в Астраханской области в 1970 году.// Пробл. особо опасн. инф.- 1975. Вып. 2. - С. 81-85.

35. Веселовский В.А. Структурно функциональные изменения мембран растительной клетки при адаптации к повреждающим воздействиям. Автореф. дисс. . докт. биол. наук. -М., 1990. -45 с.

36. Вершигора А.Е. Общая микробиология. Киев, «Выща школа». 1988 -342с.

37. Воронежская Л.Г., Подосинникова JI.C., Кутырева И.В, Касаткин Н.Ф. Селекция и основные свойства ферментативных мутантов холерных вибрионов. // Пробл. особо опасн. инф.- 1973. вып. 1-е. 143-147.

38. Гаффон Г. Определяющие этапы фотохимической эволюции. //Горизонты биохимии. М., «Мир». - 1964. - С.49- 73.

39. Гвоздяк Р.И., Яковлева Л.М. Об особенностях патогенности Pseudomonas aeruginosa. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1987. -№3. - С. 3-5.

40. Гельман Н.С., Лукоянова М.А., Островский Д.Н. Дыхательный аппарат бактерий. -М., «Наука». -1966. -198с.

41. Гельман Н.С., Лукоянова М.А., Островский Д.Н. Мембраны бактерий и дыхательная цепь. М.: Наука, 1972- 246с.

42. Гинцбург А.Л., Романова Ю.М. Некультивируемые формы бактерий и их роль в сохранении возбудителей сапронозов во внешней среде. // Журн. микробиол., эпидемол. и иммунобиол. 1997. - №3. - С.116-121.

43. Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Алексеева Н.В. и др. Механизм действия и природа факторов, индуцирующих образованиенекультивируемых форм у Salmonella typhimurium. // Журн. микробиол.,эпидемиол. и йммунобиол. 1999. - №6 - С.3-8.

44. Гинцбург A.JI., Романова Ю.М., Емельяненко Е.И. и др. Некультивируемые формы патогенных бактерий. //Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М.: «Фармарус - Принт», - 1998. - с. 197225.

45. Глебов Р.Н., Дмитриева Н.М. Свойства Na+, К+ АТФ-азы из коры головного мозга крыс. // Биохимия.- 1974.- Т. 39.- Вып. 4.- С. 822-827.

46. Голдовский A.M., Иванова Е.В. Действие кислорода на клетки в анабиозе //Цитология. -1984. -Т.26., №11. -С.1321-1323.

47. Голубев Б.П., Ломов Ю.М., Мединский Г.М. и др. Влияние биотических и абиотических факторов поверхностных водоемов на свойства холерных вибрионов. // Материалы VII съезда Всерос. общ-ва эпидемиол., микробиол., паразитол. М., 1997. - Т.1. - С.285-286.

48. Голубинский Е.П. Дыхательный аппарат и окислительный метаболизм чумного микроба. Автореф. дис. . док. мед. наук.Саратов, 1974.-34с.

49. Голубкова Л. А. Морфология и физиология Л-форм холерных вибрионов. Автореф.дисс. . канд. биол. наук.Саратов, 1989.-21с.

50. Готтшалк. Г. Метаболизм бактерий. М.: Мир, 1982. - 310 с.

51. Громов Б.В. Павленко Г.В. Экология бактерий. Ленинград, Изд-во ЛГУ, 1989.-248 с.

52. Джапаридзе М.Н., Урюпина Н.В., Никитина Г.П. К вопросу о дегидрогеназной активности холерного, Эль-Тор и водного вибрионов. // Пробл. особо опасн. инф- 1974. -вып.З-С.92-96.

53. Дзадзиева М.Ф., Бузолева JI.C., Попков А.А. Влияние трофических и температурных условий культивирования на синтез липидов Yersinia pseudotuberculosis. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1999.-№6-С. 17-20.

54. Домарадский И.В. Нужен ли термин «сапронозы»? // Журн.микробиол., эпижемиол. и иммунобиол. 1988. -№12. -С. 117-122.

55. Домарадский И.В. Зачем микробам токсины (о роли токсинов в экологии бактерий)? // Молек. генет., вирусол.,микробиол. 1990. -№9. -С.3-10.

56. Домарадский И.В. Некоторые проблемы адаптации патогенных бактерий к окружающей среде. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. - №4. -с.31-35.

57. Досон Р., ЭлиотУ., Джонс К., Джонс К. Справочник биохимика М., «Мир».-1991.-543с.

58. Драновская Е.А., Дубровская И.И. Некоторые особенности дегидрогеназной и оксидазной активности бруцелл в зависимости от вирулентности культуры и видовой принадлежности. // Биохимия микробов и иммунохимия : //Матер, конф Горький, 1996. - С.95-96.

59. Дрожевкина М.С., Либинзон А.Е., Харитонова Т.И. и др. Применение комплексного метода для определения вирулентности вибрионов ЭльТор. // Пробл. особо опасн. инф. 1978. -Вып.4. -С.39-42.

60. Дятлов А.И. О непаразитарном механизме энзоотии чумы.//Экология возбудителей сапронозо. Сб. науч.тр. -М., 1988. -С. 105-117.

61. Емельяненко E.H., Аксенов М.Ю., Гаровникова Ю.С., и др. Выявление и оценка численности некультивируемых форм псевдотуберкулезного микроба в почве с помощью полимеразной цепной реакции. //Там же. -С. 139-142.

62. Иванов В.Б. Активные красители в биологии. М., «Наука», 1982. -214с.

63. Иванов В.И. А-ДНК. //Сорос.образоват.журн. -1998. -№>1. -С.3-7.

64. Иванов М.М., Дацевич Л.И. Метод определения количества живых бруцелл в бруцеллезной вакцине. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1962. - №3. - С.46 -50.

65. Инструкция по организации и проведению противохолерных мероприятий /Информ. издат. центр Госкомсанэпиднадзора РФ. - М., 1995.- 190с.

66. Калакуцкий A.B., Агре Н.С. Развитие актиномицетов. М: «Наука». -1977.-285с.

67. Калина Г.П. Теоретические обоснования изучения потенциально -патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды. // Гигиена и санитария. 1983. -№10. - С.4-7.

68. Каминский Г.Д. Изменчивость микроорганизмов в процессе фазового преобразования их популяций. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1985. -№7. -С.111 -122.

69. Кац J1.H., Харатьян Е.Ф. Изучение локализации окислительных ферментов у бактерий с помощью методов электронно-микроскопической цитохимии. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1980. -№3. С.16-22.

70. Клюйвер А., Ван-Ниль К. Вклад микробов в биологию- М.: Изд-во: «Ин. лит-ра». 1959.- 194с.

71. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. -М.: «Высшая школа». -1998.-478с.

72. Колесов С.Г. Анабиоз патогенных микроорганизмов. М.: Сельхозгиз. 1956.- 142 с.

73. Конев C.B., Волотковский И. Д. Структурные перестройки биологических мембран. //Биомембраны. Структура, функции, методы исследования. -Рига: Зинатне, 1977. -С.42-76.

74. Корн М.Я., Соловьев H.H. Применение поляризационной микроскопии для обнаружения кристаллов формазана в бактериальных клетках. //Микробиология . 1962. -T.XXXI. -Вып.З. -С.540-541.

75. Коробкова Е.И. Микробиология и эпидемиология холеры.- М.: Медгиз, 1959.-303 с.

76. Коробкова Е.И., Дертева И.И., Кузьмиченко И.А., Лискина И.В. Дегидрогеназная активность классических холерных вибрионов и Эль Тор вибрионов.// Пробл. особо опасн. инф. 1970.- Вып.1. - С. 147-152.

77. Коробкова Е.И., Дертева И.И., Денисова Е.П. Образование сферопластов у холерных вибрионов и Эль-Тор различного происхождения.// Проблема ООИ.- 1971.- № 3.- с. 17-21

78. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология.- СПб: «Специальня литература», 1998.592 с.

79. Кудрякова Т. А., Македонова Л.Д., Качина Г.В. Устойчивость умеренных холерных фагов к воздействию некоторых физических и химических факторов. // Мат. науч. практ. конф., посвященной 100-летию Противочумной службы России. - Саратов, 1997. -т.2. -с.71.

80. Курочкин Н.Я., Щуркина И.И. Изучение декарбоксилазной активности холерных вибрионов. //Микробиол., патофизиол. и иннунол. холеры. -1976. Саратов, 1976.-Вып.2.-С.3-5.

81. Ларионов Г.М. Методология изучения сапронозов // Материалы VII съезда Всерос. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.- М., 1997.- Т. 1. -С. 92-94.

82. Ларионов Г.М., Беляков В. Д. Стратегия жизни и механизмы саморегуляции популяций возбудителей сапронозов (на примере Pseudomonas pseudomallei). // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1990. -№1. -С.13 -17.

83. Ларионов Г.М., Тихонов С.И., Жукова Е.А. О природной очаговости холеры. // Природноочаговые инфекции в России: совр. эпидемиол., диагн., тактика защиты населения: Тез. докл. Всеросс. науч. практ. конф. - Омск, 1998. - С.21-23.

84. Лис Г. Биохимия автотрофных бактерий. -М.: Мир. 1958. -126с.

85. Литвин В.Ю. Сапрофитическая фаза в экологии возбудителей инфекционных заболеваний.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1985 - № 6.- С. 98-103.

86. Литвин В.Ю. Эколого-эпидемиологические аспекты случайного паразитизма некоторых патогенных бактерий.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1986.- № 1.-С. 85-91.

87. Литвин В.Ю. Экология возбудителей сапронозов: Общие закономерности и механизмы существования патогенных микроорганизмов в водных экосистемах М., 1988.- С. 2-34.

88. Литвин В.Ю. Потенциальная патогенности и случайный паразитизм.// Потенциальная патогенность бактерий в природе.- М.: 1991.- С. 9-30.

89. Литвин В.Ю. Случайный паразитизм микроорганизмов.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1992.- № 1.- С. 52-55.

90. Литвин В.Ю. Холера как природноочаговая сапронозная инфекция.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1995.- № 6.- С. 30-31.

91. Литвин В.Ю. Экосистемный пусковой механизм эпидемического проявления сапронозов (на примере холеры Эльтор).// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1996.- № 3.- С. 11-15.

92. Литвин В.Ю. Механизмы устойчивого сохранения возбудителя чумы в окружающей среде (новые факты и гипотезы).// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1997.-№ 4,- С. 26-31.

93. Литвин В.Ю. Природноочаговые инфекции: ключевые вопросы и новые позиции. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1999. №5. - С.26-33.

94. Лозина-Лозинский Л.К. Влияние охлаждения на клетки и тела как многофакторный процесс. // Цитология. -1982. -Т.24, №4. -С.371-390.

95. Ломов Ю.М., Асеева Л.Е., Каграманов B.C. Диссимиляция глюкозы штаммами Л-форм холерных вибрионов. //Микробиол. журн. -1983. -Т.45. -№3. С.42-45.

96. Ломов Ю.М., Голубкова Л.А. Некоторые биологические свойства Л-форм холерных вибрионов и НАГ вибрионов.//Микробиол.журн. -1980. -Т.42.№4. -С.502-507.

97. Ломов Ю.М., Мединский Г.М. Сохранение возбудителя холеры в межэпидемический сезон. // Холера. Матер.Росс.Науч,- практ.конф. по проблеме «Холера» Ростов-на-Дону, 1995.-е. 17-24.

98. Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Беспалов H.A. и др. Холера в 19901999 гг: состояние и тенденция заболеваемости в мире, странах СНГ, России. Прогноз. // Холера и патогенные для человека вибрионы. 2000 г.-вып.13.-с.11-17.

99. Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Подосинникова Л.С. Холера: современный взгляд на проблему.// Научная мысль Кавказа.- 1998.-№ 3.-е. 3-15.

100. Ломов Ю.М., Голубев Б.П., Власов В.П. и др. Изучение возможности выявления жизнеспособных, но некультивируемых форм холерных вибрионов.// Матер. VII съезда Всерос. общ. эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 1997.- Т. 1.- С. 301.

101. Марамович A.C., Пинигин А.Ф., Ганин B.C. Осауленко О.В. Сапрофитическая фаза в экологии холерного вибриона. //Экология возбудителей сапронозов. Сб.науч.тр.- М.: НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, 1988.- С. 52-65.

102. Марамович A.C., Наркевич М.Н. // Холера. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней.- М.: Медицина, 1993.- Т.2. С. 85-104.

103. Медведева И.А. Динамика и механизм изменения активности Na+, К+ АТФ-азы эритроцитов крыс в условиях стресса. Автореф. дисс. -канд. биол. наук. Ростов-на-Дону, 1993.- 21с.

104. Мейсель М.Н., Медведева Г.А., Алексеева В.М. О выявлении живых, поврежденных и мертвых микроорганизмов. //Микробиология.-1961.-Т. XXX.-№.5.-С. 855-861.

105. ИЗ. Мельникова В.А., Баснакьян И.А. Экономический коэффициент как показатель физиологического и патологического состояния микроорганизмов.//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1984.-№ П.-С. 9-14.

106. Мельникова В.А., Баснакьян И.А. Патология и физиология микробов. Сообщение III. Критерии оценки функционального состояния.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1984,- № 1,-С. 42-46.

107. Метод, рек. по дезинфецирующим режимам фиксации для электронной микроскопии материала, зараженного возбудителями чумы, сапа, мелиоидоза, холеры, туляремии, бруцеллеза, кокцидиоидоза. -Волгоград. 1983.- 20с.

108. Механизмы и диапазон изменчивости холерных вибрионов. / Науч. ред. Милютин В.Н.- Ростов-на-Дону, 1981.- 176 с.

109. Михайлов И.Ф., Дьяков С.И. Люминесцентная микроскопия (применение в медицинской микробиологии).-М.: Медгиз, 1961. 223с.

110. Мишанькин Б.Н., Сучков И.Ю. Вирулентность некультивируемых форм Yersinia pestis.// Матер, науч.-практ. конф., посвященной 100-летию образов.противочумной службы России. Саратов., 1997.- Т. 1.-С. 285-286.

111. Мишин В.Н., Вассер Н.Р. Влияние некоторых абиотических и биотических факторов на динамику популяции штамма холерного вибриона Эль Тор в лабораторных условиях.//Иммунология холеры и биология возбудителя. Тр.инст. Пастера- Л., 1978.- С. 83-91.

112. Монахова Е.В., Власов В.П., Вуцан В.Н.и др. Видоспецифичный ДНК-зонд для идентификации холерных вибрионов.// Мол.генет., микробиол. и вирусол.- 1993.-№ 4.- С. 8-12.

113. Наркевич М.И., Мединский Г.М., Титенко М.Т. Эпидемическая роль холерных вибрионов с измененными свойствами.// Обл. науч.-практ. конф. по пробл. «Холера»: Тез. докл. Ростов-на-Дону, 1984.- С. 17-22.

114. Наумшина М.С., Адамов А.К., Боровикова Т.П. О токсинах холерного вибриона. // Факторы патогенности: хим. природа, биол. функции, ген. контроль. Тез. докл. 2-го Всесоюз. симпоз. -М., 1974. -с.42-43.

115. Нефедов В.Д., Ясайтис А.А. Гомеостаз на различных уровнях организации биосистем. Новосибирск: Наука, 1991.-231 с.

116. Николаев Ю.А., Матвеева Н.И. Влияние солености среды на состав цитохромов, активность и устойчивость к цианиду дыхательной цепи галотолерантной бактерии Micrococcus varians.// Микробиология.- 1992. Т. 61.-Вып. 5.-С. 787-792.

117. Общая микробиология. Под ред. Вершигора А.Е. Киев. -«Вьица школа.» - 1988. - 342с.

118. Онищенко Г.Г., Мединский Г.М., Ломов Ю.М. и др. Эколого-географические аспекты распространения Vibrio eltor в объектах окружающей среды.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1993.-№ 1.-С. 24-28.

119. Онищенко Г.Г., Глухов А.И., Грачев C.B. и др. Анализ ДНК штаммов Vibrio cholerae методом полимеразной цепной реакции. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1996.- № 4.- С. 38-41.

120. Определитель бактерий Берджи. М.: Мир, 1997.- Т. 1.- С. 199-200.

121. Островский Д.Н. Молекулярная организация биологических мембран. // Биомембраны. Структура, функции и методы исследования-Рига: Знатие.- 1977.-С.7-27.

122. Остроумова Н.М., Успенская Л.В., Царева С.А., Ведяпина В.Д. Некоторые закономерности размножения холерных вибрионов в воде. //Пробл.особо опасн. инф.- 1975.- № 3-4.- С. 132-137.

123. Павлов A.B., Алексеенко В.В., Доброштан Е.В. Основы борьбы с холерой. Киев: Здоровья. -1976. - 335с.

124. Патогенные бактерии в сообществах (механизмы и формы существования ).- М.: Росагросервис.- 1994.- 154 с.

125. Погорелов В.И., Пинигин А.Ф., Марамович A.C. и др. Изучение взаимоотношений Vibrio cholerae с инфузориями Tetrahymena pyriformis.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1995.- № 2.-С. 22-25.

126. Подосинникова Л.С. Холерные вибрионы, выделенные на территории СССР в период седьмой пандемии . Автореф. дисс. . док. мед. наук. -Саратов, 1993.- 44с.

127. Прозоровский С.В., Ломов Ю.М., Полковникова О.В. и др. // Пробл. особо опасн. инф. 1976. —Вып.З. -С.30-35.

128. Пушкарева В.И., Емельяненко Е.Н., Литвин В.Ю. и др. Патогенные листерии в почве и в ассоциации с водорослями: обратимый переход в некультивируемое состояние. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. -№3. -С.3-10.

129. Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология. -М., «Медицина». -1981.-511с.

130. Работнова И.А., Позмогова И.Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов.- М.: Наука,- 1979.- 207с.

131. Рапопорт А.И., Бекер М.Е. О разрушении РНК в дрожжевых клетках при обезвоживании.//Микробиология -1986. -Т.55. -№5. -С.855-857.

132. Реннеберг Р. Эликсиры жизни. Новейшие результаты в области исследования ферментов. М., «Мир», 1987 - 152с.

133. Родзиковский А.В. Популяционная динамика сибиреязвенного микроба в некоторых почвах. Автореф. дисс. . канд.мед.наук. -М., 1989.-20с.

134. Родзиковский А.В., Поликарпова Е.В., Сорокин Ю.И. Глиоксилатный шунт у возбудителя сибирской язвы один из путейбиохимической адаптации. // Современные аспекты природной очаговости, эпид. и профилакт. ООИ. Ставрополь. - 1993. -С.264 -265.

135. Романова Ю.М., Алексеева Н.В., Гинцбург A.JI. Некультивируемое состояние у патогенных бактерий на модели Salmonella typhimurium: феномен и генетический контроль. // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1997. -№4. -С.35-41.

136. Романова Н.А., Бровко Л.Ю. Махлис Т.А. и др. Биолюминесценция свободных и иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта рекомбинантных клеток Escherichia coli, содержащих люциферазу светляков. // Биохимия. -1998. -Т.63, №.5. -С.684-689.

137. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Есть ли сходство в механизмах образования «некультивируемых форм» у грамотрицательных бактерий и спор у бацилл? // Мол. генет., вирусол. и микробиол. -1993. -№6. -С.34-37.

138. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Генетический контроль индикации некультивируемого состояния у патогенных бактерий. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1996. -№3. -С. 16-18.

139. Романова Ю.М., Терехова А.А., Гинцбург А.Л. Выделение и характеристика мутантов Salmonella typhymurium с нарушенным процессом образования некультивируемых форм.// Генетика.- 1995.- Т. 31.-№8.-С. 1073-1078.

140. Романова Ю.М., Чегаева Е.В., Гинцбург А.Л. Некультивируемое состояние у патогенных бактерий: известные и возможные факторы индукции обратимого процесса. // Молек. генет., микробиол., вирусол. -1998.-№3-C.3-8.

141. Рубан Е.А. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. М.: Наука. -1986. -199с.

142. Рудник B.C. Сравнительная характеристика окислительно -восстановительных ферментов у вирулентных и авирулентных субкультур чумного микроба. Автореф. дисс. . канд.мед.наук-Иркутск, 1975, 27с.

143. Самсонова A.B. Морфологическая изменчивость холерного вибриона.// Журн. микробиол., эпидемиол. и микробиол. -1978.- № 11.-С. 143-144.

144. Саямов P.M., Зайденов A.M. Выживаемость и свойства холерных вибрионов при культивировании в минеральной воде. //Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1978. №11. -С. 66-70.

145. Семиотрочев В.Л., Стогова А.Г., Саакянц Л.Г. Идентификация холерных вибрионов, ферментирующих арабинозу.// Лаб. дело.- 1970.-№3.-С. 174-175.

146. Сеппи И.В. К клинике холеры эльтор.//Ш Всерос. съезд эпидемиол., микробиол., инфекционист. Тез. докл.- М., 1972.- С. 11-12.

147. Сергиев В.П., Марамович A.C. Эпидемиологические и экологические проблемы холеры Эль-Тор. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1988-№1-с.88-94.

148. Сибирская язва М., «Колос». -1976. - С. 24-32.

149. Скулачев. В.П. Феноптоз: запрограммированная смерть организма. // Биохимия. 1999. - Т.64, - №12. - С.1679-1689.

150. Смирнова Н.И., Ерошенко Г.А., Щелканова Е.Ю. и др. Умеренный фаг Vibrio cholerae 0139: характеристика и роль в измененииэкспрессии хромосомных генов вирулентности. // Молек.генет., микробиол., вирусол. -1999. №1. -С.3-9.

151. Сомов Г.П. Еще раз о сапронозах. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1985. -№5. -С.98-104.

152. Справочник-кадастр распространения вибрионов Эльтор в поверхностных водоемах и сточных водах на территории СССР во время 7-ой пандемии холеры. Ростов-на-Дону, 1991, -172с.

153. Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрем Дж. Мир микробов. -М.: Мир, 1979. -в 3-х т.

154. Стогова А.Г. К вопросу о характере биохимической изменчивости у холерных вибрионов.// Матер. VIII науч. конф.противочум. учрежд. Сред. Азии и Казахстана.-Алма-Ата, 1974.- с. 402-404.

155. Сучков Ю.Г., Худяков И.В., Емельяненко E.H. и др. О возможности сохранения возбудителя чумы в почве в покоящейся форме (некультивируемой форме). // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1997. -№4. -С.42-46.

156. Тафельштейн Э.Е. Вейде A.A., Блинова JI.C. Дегидрогеназы клеточных структур холерных и неагглютинирующихся вибрионов . // Пробл.особо опасн. инф. -1978. -Вып.4. -С.67.

157. Терских В.И. Сапронозы (о болезнях людей и животных, вызываемых микробами, способными размножаться вне организма во внешней среде, являющейся для них местом обитания). // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1958. -№8. -С. 118-122.

158. Тимофеев-Ресовский Н.В., Воронцов H.H., Яблоков A.B. Краткий очерк теории эволюции. -М: «Наука». -1969. -407с.

159. Тихонова Г.В. Протондвижущая сила как способ энергообеспечения бактериального транспорта. //Биомембраны. Структура, функции, методы исследования. Рига: Знатие 1977. - С.165-185.

160. Трофименко А.Ф., Кузина О.Н., Беленикина З.В. и др. Механизм метаболической гибели клеток Escherihia coli после замораживания-оттаивания при замораживании оттаивании. //Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1986. -№2. -С.30-34.

161. Туровский B.C. Распределение 5'- нуклеотидазной активности в субклеточных фракциях коры головного мозга кроликов. //Биохимия. -1980. -Т.45. -Вып.5. С.901-903.

162. Тюкавкина С.Ю., Москаленко Е.П., Рыбянец A.A. Изменение активности 5Л- нуклеотидазы в динамике формирования противококлюшного иммунитета. //Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1995. -№6. -С.46-47.

163. Хайтович А.Б. Изменчивость биологических характеристик Vibrio cholerae, выделенных из объектов окружающей среды.// Журн. микробиол., эпидемиол. и микробиол.- 1996.- № 4.- С. 23-26.

164. Феофилова Е.П. Трегалоза, стресс и анабиоз. // Микробиология.-1992. Т.61. - №5 - С.741-755.

165. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии.-М.: «Агар», 1999.- 512 с.

166. Черепахина И.Я., Кутырева И.В. Нейраминидазная активность штаммов и мутантов холерных вибрионов с различной биологической характеристикой. //Проблемы медицинской и санитарной микробиологии города. Тез.докл.- 1984 Ростов-на-Дону, - С.183-183.

167. Черепахина И.Я., Балахнова В.В., Подосинникова JI.C. и др. Современные подходы к изучению антигенной вариабельности Vibrio cholerae.// Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. -1996.- № 4.- С. 85-86.

168. Четина Е.В. Влияние некоторых физиологических и генетических факторов на процесс перехода энтеротоксигенных штаммов Escherichia coli в некультивируемое состояние. // Молек. генет., микробиол. и вирусол. 1997. -№1. - с.8-14.

169. Четина Е.В., Гинцбург. A.JL, Грижебовский Г.М. и др. Исследование эпидемической значимости некультивируемых форм холерных вибрионов методом полимеразной цепной реакции.// Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1992. -№3. С.21-24.

170. Четина Е.В., Грижебовский Г.М., Брюханов А.Ф. и др. О возможном механизме эндемичности современной холеры (роль некультивируемых форм Vibrio cholerae 01).-// Молек.генет., микробиол., вирусол. -1993. -№6.-С. 18-22.

171. Шагинян И.А., Ананьина Ю.В., Токарская О.Н. и др. Геномная дактилоскопия возбудителей сапронозов.// Журн. микробиол., эпидемоло. и иммунобиол.- 1991.- № 6.- С. 25-29.

172. Шимчук Л.Ф., Лесняк С.В., Петухов В.Г. Определение жизнеспособности Escherichia coli М 17 по дыхательной активности. //Журн. микробиол., эпидемол. и иммунобиол. -1984.-№ 5.-С. 40-44.

173. Шлегель Г. Общая микробиология М.: Мир. -1987. -566с.

174. Шмальгаузен И.И. Факторы эволюции. М: «Наука», -1968. -451с.

175. Шмеркевич Д.Л., Петрова Л.С. Характеристика неагглютинирующихся вибрионов в SR, MR, g — формах и возможность их реверсии в типичные эльтор вибрионы. // Пробл. особо опасн. инф-1976. -Вып.4. -С. 52-56.

176. Щелканов М.Ю., Еремин В.Ф., Сахурия И.Б. и др. Дегидрогеназная активность инфицированных клеток и биологические свойства различных вариантов ВИЧ-1.// Биохимия.- 1999.- Т. 64.- В. 4.- С. 513519.

177. Эмдина И.А., Алексеева Л.П. Инактивные формы холерного вибриона и механизм их образования.// Тез. докл. по проблеме «Холера», -Ростов-на-Дону, 1984.- С. 44-45.

178. Эмдина И.А., Подосинникова Л.С., Сомова А.Г. и др. изменение свойств холерных вибрионов при длительном их культивировании в речной воде. // Актуальные вопросы сан. микробиол.: Тез. докл. Всесоюз. конф. М., 1978. -с.86-88.

179. Эмдина И.А., Подосинникова Л.С., Сомова А.Г. О вирулентности R-вариантов Vibrio eltor.// Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1982.-№9.-С. 119-120.

180. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. /Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.И. и др. —М:, «Фармарус Принт». -1998. -256с.

181. Эйхлер В. Яды в нашей пище. М., «Мир».- 1993. 187с.

182. Aleljung P, Nillson H.O., Wang X. et.al. Gastrointestinal colonisation of BALB/cA mice by Helicobacter pylori monitored by heparin magnetic separation. //FEMS Immunol. Med. Microbiol. -1996. -V.13(4).- P.303-309.

183. Alexander E., Pham D., Steck T.R. The viable -but- nonculturable condition is indused by copper in Agrobacterium tumefaciens and Rhizobium leguminosarum. //Appl. Environ. Microbiol. -1999. -V.65,N8.- P.3754-3756.

184. Anderson J.I.W., Hefferman W.P. Isolation and characterization of filterable marine bacteria. //J. Bacteriol. -1965. -V.90. -P.1713-1718.

185. Arora K.L, Krishna Murti C.R. Enzyme inhibition studies in relation to drug action . Part VIII. Action of certain antibacterial agents on the tricarboxylic acid cycle of Vibrio cholerae. //J. Scient Industr. Res. -1955. -V.14. -N3, -P.66-69.

186. Barcina I., Gonzales J.M., Iriberri J. Survival strategy of Escherichia coli and Enterococcus fecalis in illuminated fresh and marine systems. //J.Appl. Bacteriol. -1990. -V.68. -P.189-198.

187. Berlin D.L., Herson D.S., Hicks D.S., Hoover D.G. Response of pahtogenic Vibrio species to high hydrostatic pressure. //Appl. Environ. Microbiol. -1999. -V.65,N6. -P.2776-2780.

188. Beumer R.R., de Vries J., Rombouts F.M. Campilobacter jejuni nonculturable coccoid cells. //J. Food Microbiol. -1992. -V.15. -V.153-163.

189. Bej A.K., Mahbubani M.H. Application of the polimeras chain reaction in environmental microbiology. //PCR Methods Appl. -1992. -V.l. -P. 151159.

190. Bergsma J., Van Dongen. M.B.M., Konings W.N. Purification and characterization of NADH-dehydrogenase from Bacillus subtilis. // Europ J. Biohem.- 1982. -v.128. -p.151-157.

191. Borneleit P.,Kleber H.-P. Purification and properties of the membrane-bound dehydrogenase from hydrocarbon grown Acinetobacter calcoaceticus. //Biochem. Biophys. Acta. -1983. -V. 722. -P. 94-101.

192. Borroto R.J. Ecology of Vibrio cholerae serogroup Ol in aquatic environments. //Rev. Panam. Salud. Public. -1997. -V.l. -Nl. -P.3-8.

193. Borroto R.J. Survival of Vibrio cholera Ol in freshwater surfase and endemic cholerae : a geological hypotesis. // Rev. Panam. Salud. Public. -1998. -V.4(6).-P.371-374.

194. Boylen C.W., Ensign J.C. Long term starvation of rod and spherical stage cells of Arthrobacter cristallopoietes. //J. Bacteriol. -1970. -V.l03. -P.569-577.

195. Brock T.B., Brock M.L. Autoradiograpy as a tool in microbiol ecology. // Nature (London). 1966. -v.209., N5024-p.734-736.

196. Byrd J.J., Xu H.-S., Colwell R.R. Viable but nonculturable bacteria in drinkin water. // Appl. Environ. Microbiol. -1991. -V.57. -P.875-878.

197. Caro A., Got P., Lesne J.et.al. Viability and virulens of experimentally stressed nonculturable Salmonella typhimurium. //Appl. Environ. Microbiol. -1999. -V.65.N7. -P.3229-3232.

198. Collins F.M., Lascelles J. The effect of growth conditions on oxidative and dehydrogenase activyty in Staphylococcus aureus. //J.Gen. Microbiol. -1962. -V.29. -P.531-539.

199. Colwell R.R. Nonculturable but still viable and potentially pathogenic . //1.t. J. Med. Microbiol.Virol.Pafasitol.Infect.Dis. 1993. -v.279. -N2. -p.154156.

200. Colwell R.R. Global climate and infectious diseas: the cholera paradigm. // Science. -1996. -V.274. -Dec.20. -P.2025-2031.

201. Colwell R.R., Bryton P. R., Grimes D.J. et.al. Viable but nonculturable Vibrio cholerae and related pahtogenes in the environment: implication for the releas of genetically engineered microorganisms. // Bio/ Technology. -1985.-V.3.-P.817-820.

202. Colwell R.R., Seider R.J., Kaper J. et.al. Occurence of Vibrio cholerae serotype Ol in Maryland and Louisiana estuaries. //Appl. Environm. microbiol. -1981. -v.41.-N2 -p.555-558.

203. Crowe B. A., Owen P. Immunochemical analysis of respiratory chain components of Micrococcus luteus (lysodeikticus). //J. Bacteriol. -1983. -V.153. -P.498-505.

204. Del Mar Lleo M., Tafi M.C., Signoretto C. et.al. Copetitiv polimerase chain reaction for quantification of nonculturable Enterococcus faecalis cells in lake water. //FEMS Microbiol Ecol. 1999. -V.30. -N4. -P.345-353.

205. De Bari V.A., Needle M.A. Mechanism for transport of nitro-blue tetrasolium into viable and non-viable leukocytes. // Histochemistry. 1978-V.55, N2. -1978. -P.155-163.

206. Daley R.J., Hobbie J.E. Direct counts of aquatic bacteria by a modified epifluorescence technique. // Limnol. Oceanogr. 1975. -V.20. -P.875-882.

207. Dawes E.A. Endogenous methabolism and the survival of starved prokaryotes.// Symp. Soc. Gen. Microbiol. -1976. -V.26. -P.49-53.

208. Dencey G.F., Shapiro B.M. The NADH dehydrogenase of the respiratory chain of Escherihia coli. //J.Biol.Chem. -1976. -V.251. -N19. -P.59221-5928.

209. Dutton R.J., Bitton G, Koopman B. Malachite green -INT (MINT)method for tetermining active bacteria in sewage. //Appl.Environ. Microbiol. -1983. -V.46. -P. 1263-1267.

210. Farr S.B. ,Kogoma T. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. // Microbiol. -Rev. -1991. -V.55. -P.561-585.

211. Faruque S.M., Albert M.J., Mekalanos J.J. Epidemiology, genetics and ecology of toxigenic Vibrio cholerae. //Microbiol. Mol. Biol. Rev.,- 1998. — V.62(4). -P.1301-1314.

212. Fliermans C.B., Schmidt E.L. Autoradiography and immunofluorescence combined for autecological study of single cell activity with Nitrobacter as a model system. // Appl. Microbiol. -1975. -V.30. -P.676 -684.

213. Foster J.E., Brestel C. NAD metabolism in Vibrio cholerae. // J.Bacteriol. -1982.-V. 149.-P.368-371.

214. Francisco D.E., Mah R.A., Rabin A.C. Acridin orange epifluorescent technique for counting bacteria in natural waters. // Trans. Am. Microsc. Soc. -1973. -V.92. -P.416-421.23 5. Gallut J. "Cholera vibrioes". //Cholera. -Philadelphia. -1974. -P. 17-40.

215. George I., Petit M., Servais P. Use of enzymatic methods for rapid enumeration of coliformes in freshwaters. //J. Appl. Microbiol. -2000. -V.88. -N3. -P.404-413.

216. Ghosh D.K., Haldar D., Ghosh B.K. Chattergee A.N. Pentose phosphate cycle in Vibrio cholerae. //Ann. Biochem. exp. Med., -1960. -V.20. -P.221-224.

217. Gould G.W. Germination. The bacterial spore. Academic Press.Inc., -London, -1969. -P.397-444.

218. Hussong D., Colwell R.R., CVBrien M. et.al. Viable Legionella pneumophyla not detectable by culture on agar medium. // Bio/Technology. -1987. -v.5. -p.947-950.

219. Inamdar A.N., Canapthi K. Biochemistry of Vibrio cholerae: Part I. Metabolism of glucose and other carbon intermediates under conditions of growth in shaken cultures. // J.Exp. Biol. -1963. -Nl. -P 123-126.

220. Ingole K.V., Jalgaonakar S.V., Fule R.P. Study of proteases and other enzymes of Vibrio cholerae Ol El Tor and 0139 serotypes isoleted in Yavatmal (Maharashtra) //Indidn J. Pathol . Microbiol. -1998 V.41(4). -P.419-422.

221. Islam M.S., Drasar B.S., Bradly D.J. Survival of toxigenic Vibrio cholerae Ol with a common duckweed, Lemna minor, in artificial aquaticecosystems. //Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. -1990. V.84. -N3. -P.422-424.

222. Islam M.S., Rahim L., Alam M.J. et.al. Association of Vibrio cholerae Ol with the cyanobacterium, Anabaena sp.,elusidated by polymerase chain reaction and trensmission electron microscopy. //Trans R. Soc. Trop.Med. Hyg. -1999. -V.93. N1. P.36-40.

223. Jannasch H.W., Jones G. E. Bacterial populations in saewater by different methods of enumeration. // Limnol. Oseanogr. -1959. -V.4. -P. 128-139.

224. Jesudason M.V., Saaya R. Resistance of Vibrio cholerae Ol to nalidixic acid . // Indian. J. Med. Res. -1997. -V.105. -P. 153-154.

225. Jones K.L., Rhodes Roberts M.E. The survival of marine bacteria under starvation conditions. //J.Appl. Bacteriol. -1981. -v.50. -p.247-258.

226. Jones D.M., Sutcliffe'E.M., Curry A. Recovery of viable but nonculturable Campylobacter jejunii. // Microb. Ecol. Health disease. -1991. -N4. Spec. Issue. -P.577.

227. Hochman A. Programmed cell death in prokaryotes. //Grit. Rev. Microbiol. -1997. -V.23. -N3. -P.207-214.

228. Hua J., Ho B. Is the coccoid form of Helicobacter pylori viable? //Microbios. -1996. -V.87(351). -P.103-112.

229. Hobbie J.E., Daley R.J., Jasper S. Use of nucleopore filtres for counting bacteria by fluorescence microscopy. // Appl. Environ. Microbiol. 1977. -V.33. -P.1225-1228.

230. Huq A., Huq Sh., Grimes D. et.al. Colonisation of the gut of the blue crab (Callinectes sapidus) by Vibrio cholerae . // Appl. Environm. Microbiol. -1986. -V.52. -N3. -P.586-588.

231. Huq A., Small E.B., West P.A. et.al. Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepodes. // Appl. Environ. Microbiol.-1983.-V.45(l).-P.275-283.

232. Kabir S. Composition and immunochemical properties of outer membrane proteins of Vibrio cholerae. //J. Bacterid. -1980. -V.144. -P.382-388.

233. Kavada N., Tareda K., Nosoh Y. Effect of lipids on a membrane-bound NADH dehydrogenase from Bacillus caldotenex. //J. Bioenerg. and Biomembr. -1980. -V.12. -P.265-276.

234. Keynan A. Spore structure and its relations to resistance, dormancy and germination. //Spores VII. Amer. Soc. Microbiol. Washington-1978. -P.43-53.

235. Kjeldgaard N.O. The kinetics of RNA and protein formation in Salmonella typhimurium during the transition between different states of balanced growth. // Biochem.Biophys. Acta. -1961. -V.49. -P.64-76.

236. Kogure K., Simidu U., Taga N. A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria. // Can. J. Microbiol. -1979. V.25. -P.415-420.

237. Kojima S., Yamamoto K., Kawagishi I., Homma M. The polar flagellar motor of Vibrio cholerae is driven by an Na+ motive force // J. Bacteriol. -1999.-V.181.-N6.-P.1927-1930.

238. Korgaonkar K.S., Ranade S.S. Evoluation of acridine orange fluorescence test in viability studies on Escherichia coli. //Can J. Microbiol. -1966. V.12. -P. 185-190.

239. Krishna Murti C.R., Shrivastava D.L. C.R. Studies on the enzymesmake up of Vibrio cholerae: Part XI The glycolytic enzymes of V.cholerae. //J.Scient.Ind. Res., -1956. -V.158. - P.125-127.

240. Kunst F., Rapoport G. Salt stress is an environmental signal affecting enzyme synthesis in Bacillus subtilis. // J. Bacterid. -1995. V.177, N9, p.2403-2407.

241. Kurath G., Morita Y. Starvation survival physiological studies of a marine Pseudomonas sp. //Appl. Environ. Microbiol. -1983. -V.45. -P. 1206 -1211.

242. Linder K., Oliver J.D. Membrane fatty acid and virulence changes in the viable but nonculturable state of Vibrio vulnificus.// Appl. Environ. Microbiol. -1989. -V.55. -P.2837 -2842.

243. Mahler H.R. Diaforases .11 Mehtods in Enzimol., -New York,-1955. -N11.-p 707.

244. Mc Kay A.M. Viable but nonculturable forms of potentially pathogenic bacteria in water. // Leet. Appl. Microbiol. -1984. -V.14. -P. 129-135.

245. Megraund F. Transmission of Helicobacter pylori: faecal oral versus oral -oral route. //Aliment. Pharmacol.Ther. - 1995. - V.9(2). -P.85-91.

246. Meyer-Reil L-A. Autoradiography and epifluorescence microscopy combined for the determination of namber and spectrum of activelymetabolizing bacteria in natural waters.//Appl. Environ. Microbiol.- 1978.-V. 36.-p. 506-512.

247. Minasi L.A., Willsky G.R. Characterization of vanadate-dependent NADH oxidation stimulated by Saccharomyces cerevisiae plasma membranes. //J.Bacteriol. -1991. -V.173, N2. -P.834-841.

248. Mitchel P. Membranes of cells and organelles: morfology, transport and metabolism. //Organization and control in prokaryotic and eukaryotic cells.XXth Symp. Soc. Microbiol. Great Britain. -1970. -P. 121-166.

249. Mizunoe Y., Wai S.N., Ishikana T. et.al. Resuscitation of viable but nonculturable cells of Vibrio parahaemolyticus indused at low temperature unde starvation. //FEMS Microbiol. Lett. -2000. -V.186.- N1. -P. 115-120.

250. Mizunoe Y., Wai S.N., Takade A., Yoshida S. I. Isoleation and characterization of rugose (r) form of Vibrio cholerae 0139 strain MO 10. //Infect. Immun. 1999. -Feb. V.67(2). -P.958-963.

251. Morgan J.A., Rhodes W., Pickup R.W. Survival of nonculturable Aeromonas salmonicida in lake water. //Appl. Environ. Microbiol. -1993. -V.59. -P.874-880.

252. Morita R.Y. Is H2 universal energy source for long-term survival? //Microbiol. Ecol. -1999. -V.38. -N4. -P.307-320.

253. Morris J. G., Johnson J.A., Tacket et. al. Vibrio cholerae Ol can assume a chlorine resistant rugose survival form that is virulent for humans. // J. Infect. Dis. - 1996. -V.174. -N6. -P. 1364-1368.

254. Nalin D.R., Daya V., Ried A.et.al. Absorptionand growth of Vibrio cholerae on chitin. //Infect. Immun. -1979. -V.25. -P.768-770.

255. Nelson L.M., Parkinson D. Effects of starvation on survival of three bacterial isolates from an arctic soil. //Can. J. Microbiol. -1978. -V.24. -p.1460-1467.

256. Nilsson L., Oliver J.D., Kjelleberg S. Resuscitation of Vibrio vulnificus from the viable but nonculturable state // J. Bacteriol., 1991.- V.173., -N16,-P.5054-5059.

257. Novitsky J.A., Morita RJ. Possible strategy for the survival of marine bacteria under starvation conditions. // Mar. Biol. -1978. -V.48. -P.289-295.

258. Ohshima T., Drews G. Isolation and partial characterization of the membrane-bound NADH dehydrogenase from phototrophic bacterium Rodopseudomonas capsulata .// Ztchr. Naturformsch.- 1981. -Bd. 36. -S.400-406.

259. Oliver J.D. Formation of viable but nonculturable cells. // Starvation in Bacteria, Ney- York. -1993. -P.239-241.

260. Oliver J.D., Bockian R. In vivo resuscitation and virulence towardes mice, of viable but nonculturable cells of Vibrio vulnificus. //Appl. Environ. Microbiol. -1995. -V.61. -N7. -P.2620-2627.

261. Oliver J.D., Nilsson L., Kjelleberg S. Formation of nonculturable Vibrio vulnificus cells and its reletionship to the starvation state. //Appl. Environ. Microbiol. -1991. -V.57.,N9. -P.2640-2644.

262. Olson B.H. Enhanced accuracy of coliform testing in sea water by a modification of most probable number method. // Appl. Environ. Microbiol. -1978.-V.36. N3, -p.438-444.

263. Osava R., Okitsu T., Sata S., Yamai S. Rapid screening method for identification of cholera toxin produsing Vibrio choleraeOl and 0139. // J.Clin. Microbiol. -1997. - V.35(4). -P.951-953.

264. Page M., Dufour C. Measurement of cell growth by a rapid U.V. spectrophotometric method. 7/Biomedcine. -1976. -V.25. -P. 170-173.

265. Parrot R., Marchal G., Deshais B., et.al. Nonculturable tuberculosis bacilli observed by fluorescens microscopy. //Rev/ Tuberc. Pneumol.(Paris): 1971. -V.35. -N2. P.197-210.

266. Pedersen J.C., Leser T.D. Demonstration of viable but nonculturable cells Enterobacter cloacae on leaves and in soil. //6th Int. Symp. Microbiol.Ecol. (ISME-6). -Barcelona. -1992. -p. 117.

267. Peroni C., Laverello O. Microbial activities as a function of water depth in the Ligurian Sea: an autoradiographic study. //Mar. Biol. -1975. -V.30. -P.37-50.

268. Pitonzo B.J., Amy P.S., Rudin M. Resuscitation of microorganisms after gamma irradiation. //Radiat.Res. -1999. -V.152. -Nl. -P.71-75.

269. Roszak D. B., Colwell R.R. Metabolic activity of bacterial cells enumerated by direct viable count. // Appl. Environment. Microbiol. 1987. -V.53. - P.2889-2893.

270. Roszak D.B., Colwell R.B. Survival strategies of bacteria in the natural environment. // Microbiol. Reviews. -1987. -Sept., V.51. -N3. P.365-379.

271. Roszak D.B., Grimes D.J., Colwell R.R. Viable but nonrecoverable stage of Salmonella enteritidis in aquatic systems. // Can. J. Microbiol. -1984. -v.30. -p.334-338.

272. Salerno J., Harmon HJ.j Blum H. et.al. A transmembrane quinone pair in the succcinate-dehydrogenase-cytochrome b region. //FEBS Lett. -1977. -V.82. -P. 178-181.

273. Schleifer K.H., Amann R., Ludwig W. Tracking down the nonculturable bacteria: a challeng for the molecular taxonomist. //Alpe. Adria. Microbiol.J. -1992.-N3. -P. 182.

274. Slater T.P. Stadies on Succinat tetrazolium reductase system II III. //Biochem., Biophys. Acta. -1963. - V.77. -N3. -P.365-383.

275. Spira W.M., Huq A., Achmad Q. et. al. Uptake of Vibrio cholerae biotyp Eltor from contaminated water by water Hyacinth ( Eichornia crassipes). //Apl. Environ. Microbiol. -1981. -v.42.- N3. -p.550-553.

276. Spring J., Amann R., Zudurig W., Saeed Y.A. Phylogenetic diversity and identification of nonculturable magnetotactic bacteria. //System. Appl. Microbiol. -1992. -V. 15. P. 116-122.

277. Stevenson L.H. A case for bacterial dormancy in aquatic systems. // Microbiol. Ecol. -1978. -v.4. -p.127-133.

278. Strugger S. Fluorescence microscope examination of bacteria in soil. //Can. J. res. -1948. -V.26. -P.188.

279. Tabor P.S., Neihof R.A. Improved microautoradiographic method to determine individual microorganisms active in substrate uptake in natural waters. //Appl. Environ. Microbiol. -1982. -V.44. -P.945-953.

280. Tabor P.S., Ohwada K., Colwell R.R. Filterable marine bacteria found in the deep sea: distribution, taxonomy and response to starvation. // Microb. Ecol.-1981.-v.7.-p.67-83,

281. Thiagalingam S., Yang T. NADH dehydrogenase and NADH oxidation in Bacillus megaterium. // Curr. Microbiol. -1986. -V.14. -P.217-220.

282. Van de Giessen A.W., Heuvelman C.J., Abee T., Haseleger W.C. Experimental studies on the infectivity of Campylobacter spp. in chicks and mice. // Epidemiol. Infect. -1996. -V.l 17(3). -P.436-470.

283. Valentine R.C., Bradfield J.R. The urea method for bacterial viability counts with the electron microscope and its relation to other viability counting methods. // J. Gen. Microbiol. -1954. -v.l 1. -p.349-357.

284. Wang C.H., Stern J., Gilmour C.M. et.al. Comparativ study of glucose catabolism by radiorespirometrie method . // J. Bacteriol. 1958. -V.76. -N1. -P.207-211.

285. Warner J.M., Oliver J.D. Randomy amplififed polymorphic DNA analisis of starved and viable but nonculturable Vibrio vulnificus cells. //Appl. Environ. Microbiol. -1998. -V.64. -N8. -P.3025-3028.

286. Warrin F.C., Sustramongkole U. Nonculturable acid-fast forms in the sputum of patients wiht tuberculosis and chronic pulmonary disease. //Am.Rev.Respir. Dis. -1970. V.102. -N5. -P.714-724.

287. Weichart S., Oliver J., Kjelleberg S. Low temperature Induced nonculpability and killing of Vibrio vulnificus.//FEMS Microbiol. Lett.: Ecology. Rev. Immunol, and Med Microbiol. -1992. V.100, -Nl-3. -p.205-210.

288. Weichart D., Mc Dougaled D., Jacobs D., Kjelleberg S. In situ analysis of nucleic axids in cold-indused nonculturable Vibrio vulnificus. // Appl. Environ. Microbiol. -1997. -V.63. -N7. -P.2754-2758.

289. West I.C. The membrane adenosine triphosphatase of bacteria. London, 1974. -p.27-38.

290. Williams N. Phage transfer : a new player turns up is cholera infection. // Science . -1996. -V.272.,N5270. -P. 1869-1870.

291. Wong Hin -Chung, Peng P.-Y., Han Yun-Ming et al. Effect of mild acid treatment on the survival, enteropathogenicity, and protein production in Vibrio parahaemoyiticus. // Infect. Immun. -1998. -V.66. -N7. -P.3066-3071.

292. Wright R.T. Measurement and significance of specific activity in the heterotrophic bacteria of natural waters. //Appl. Environm. Microbiol. -1978. -V.36. P.297-305.

293. Xu H.- Sh., Roberts N., Singleton F.L. et.al. Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment. //Microbiol. Ecol. -1982. -V.8. -P. 313-323.231

294. Yagi T. Purification and characterization of NADH dehydrogenase complex from Paracoccus denitriflcans. // Arch. Biochem. and Biophys. -1986. -V.250. -P.302-311.

295. Yildis F.H., Schoolnik G.K. Role of rpoS in stress survival and virulence of Vibrio cholerae. // J.Bacteriol. -1998. -V.180. -N4. -P.773-784.

296. Yoch D.C., Carithers R.P. Bacterial iron-sulfur proteins. //Microbiol. Rev.- 1979. -V.43.,P.3 84-421.

297. Zimmermann R., Iturriaga R., Becker Birck J. Simultaneous determination of the total number of aquatic bacteria and the number therof involved in respiration. //Appl. Environ. Microbiol. -1978. -V.36. - P.926-935.