Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы взаимодействия проникающих и блокирующих ионов с открытым ионным каналом

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы взаимодействия проникающих и блокирующих ионов с открытым ионным каналом"

ОРДЕНОВ ЛЕНИНА И ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАД5ШЯ НАУК УССР

Ордена Трудового Красного Знамени институт физиологии имени А.А. Богомольца

На правах рукописи

ПИВ08АР0ВА Наталия Владимировна

МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРОНИКАЮЩИХ И БЛОКИРУЮЩИХ ИОНОВ С ОТКРЫТЫМ ИОННЫМ КАНАЛОМ

Специальность: 03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1991

Работа выполнена е Институте физиологии им. 'А.Л.Богомольца Ail УССР.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор И.С.Магура.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Демченкс А.П., член-корреспондент АН СССР Крышталь O.A.

Ведущее учреждение - КиеЕский государственный университет им.Т.Г.ШеЕченко.

./^ , ¿¿g-// /

Защита диссертации состоится "--" ■■' -—- I9SI г.

на заседании специализированного совета Д-01С.15.01 при Институте физиологии им.А.А.Богомольца All УССГ (Киев, ул. Богомольца, 4).

С диссертацией можно ознакомиться е библиотеке Института физиологии им. А.А.Богомольца АН УССР.

1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

3. А.Сорокина-Марина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАбОТЫ

Актуальность проблемы. Электроуправляемые ионные каналы плазматических мембран являются важнейшим компонентом системы, обеспечивающей клеточную Еозбудимость. Они представляют собой специальный класс интегральных белковых макромолекул, осуществляющих трансмембранный перенос ионов.

Современные методы исследования позволяют детально изучать молекулярные механизмы функционирования ионных каналов: измерять токи, вызываемые перемещениями воротных частиц, регистрировать токи через одиночные ионные каналы, выделять и встраивать в нативные и искусственные мембраны каналообразущие белки, исследовать влияние изменения первичной структуры каналов на выполнение свойственных им функций.

Тем не менее, механизмы взаимодействия проникающих и блокирующих ионов со структурами каналов, молекулярные механизмы воротных процессов остаются малоизученными.

В последние годы белки рассматривают как динамические структуры, подверженные конформационным флуктуациям в широком временном диапазоне. Такого рода внутренние движения белковых молекул необходимо учитывать и при рассмотрении молекулярных механизмов функционирования потенциалуправляемых ионных каналов.

Наряду с экспериментальными методами важным инструментом в изучении ионных каналов являются теоретические исследования.

В предложенных в последние годы теоретических подходах учет динамики каналообразующих белковых макромолекул обычно ограничивался рассмотрением небольшого числа. возможных конформационных состояний канала, причем переходы между ними не зависели от проходящих через канал ионов. Практически не рассматривались молекулярные механизмы, лежащие в основе переключений ионного канала между различными проводящими состояниями. Существующие модели, как правило, описывали либо кинетические, либо селективные свойства ионных каналов и не рассматривали влияние замены сорта проникающих катионов на кинетику функционирования ионного канала.

Это привело к необходимости развития нового класса

теоретических подходов к описанию ионного транспорта, основывающихся на динамической природе каналообразующих белковых макромолекул и описывающих совокупность свойств ионных каналов -кинетических и селективных.

Цель работы. Описать функционирование потенциалуправляемого одиночного ионного канала с учетом взаимодействия ионного потока, проходящего через канал с флуктуирующей каналообразующей белковой макромолекулой.

Главные задачи.

1. Разработать математический подход для описания функционирования потенциалуправляемого одиночного ионного канала на основе ион-конформационного взаимодействия.

2. Определить условия, при которых проявляются дискретные уровни проводимости ионного канала и случайные переключения между ними.

3. Изучить зависимость основных кинетических характеристик одиночного ионного канала от мембранного потенциала.

4. Исследовать влияние концентрации проникающих ионов, типа ионов, переносящих ток через ионный канал, на кинетику функционирования одиночного ионного канала.

Научная новизна. В результате проведенных исследований получены результаты, расширяющие представления о механизмах функционирования ионных каналов. Наиболее важными являются следующие:

1. Впервые предложен математический подход для описания функционирования одиночного потенциалуправляемого ионного канала на основе взаимодействия ионного потока с флуктуирующей белковой макромолекулой, формирующей ионный канал.

2. Показано, что взаимодействие ионного потока с каналообразующей белковой макромолекулой вызывает появление двух наиболее вероятных состояний каналообразующего белка, ассоциирующихся с открытым и закрытым состояниями ионного канала.

3. Показано, что под действием случайных тепловых флуктуации белковой молекулы, формирующей ионный канал, он может переходить из одного стационарного состояния проводимости в другое.

4. В рамках данного теоретического подхода впервые объяснена токозависимость среднего времени пребывания канала в открытом

-к-

состоянии.

5. Впервые предложен подход, позволяющий учитывать влияние типа проникающих катионов на кинетику функционирования одиночного ионного канала.

Практическая ценность работы. Полученные данные расширяют существующие представления о молекулярных механизмах функционирования ионных каналов и позволяют разрабатывать новые подходы в исследовании механизмов действия фармакологических препаратов на ионную проницаемость биологических мембран.

Аппробация работы. Ос-новные положения работы доложены и обсуждены : на Всесоюзной конференции "Математические и вычислительные методы в биологии" (Пущино, 1987), II Всесоюзной конференции по нейронаукам (Киев, 1988), XIV и XV конференциях молодых ученых МФТИ (Долгопрудный, 1988, 1939), Всесоюзных сипозиумах "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах" (Пущино, 1989, 1990), Международном симпозиуме "Neuronet-90" (Прага, 1990), семинарах Института физиологии им. А.А.Богомольца АН УССР (1990), заседании Ученого совета Института физиологии им. А.А.Богомольца АН УССР (1991). По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунком. Список литературы содержит ,155 источников.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. МОДЕЛИРОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ БЛОКИРОВАНИЯ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ ИОНАМИ ЩЕЛОЧНЫХ МЕТАЛЛОВ

I.I. Экспериментальные данные. В работе использовались экспериментальные данные, полученные на изолированных нейронах виноградной улитки Helix pomatla (Магура, 1986).Для регистрации токов использовался метод внутриклеточной перфузии (Костюк, Крышталь, Пидопличко, 1975). Эффективная смена внутри- и внеклеточных растворов и фиксация мембранного потенциала

позволили выделить основные компоненты полного трансмембранного тока и исследовать их основные характеристики. Для выделения нейронов виноградной улитки использовались традиционные методы (Костюк, Крышталь, 1980).

При исследовании взаимодействия внутриклеточных катионов Na+, Li\ Cs+ с калиевыми каналами непроникающие органические катионы Tris+ (трис-оксометил-аминометан) во внутриклеточном растворе замещались эквивалентной концентрацией исследуемых ионов. В том случае, когда раствор не содержал блокирующих ионов, вольт-амперная характеристика, построенная по максимальным значениям токов была линейной. Добавление блокирующих ионов во внутриклеточный раствор привело к потенциалзависимому подавлению выходящего калиевого тока, увеличивающемуся . с повышением их концентрации . Для случаев, когда блокирование осуществлялось ионами натрия или лития мгновенная вольт-амперная характеристика имела отрицательный наклон в той области мембранного потенциала, где Е превышало 20 mV (при Ша+]т = 50 ммоль, [Li+]in = 50 ммоль) Введение в аксон ионов цезия приводило к появлению "плато" мгновенной вольт-амперной характеристики.

Предварительно рассчитанная эффективная валентность блокирования для полученных экспериментальных данных превышала 1.7. Это свидетельствует об одновременном присутствии в калиевом канале нескольких (по минимуму двух) ионов. Поэтому в работе для описания блокирования ' калиевых каналов ионами щелочных металлов были использованы трех- и четырехбарьерные модели калиевого канала, основанные на подходе Хилле и Шварца (Hille,Schwarz, 1978).

1.2. Описание математической модели. Согласно модели Хилле-Шварца, калиевый канал представляется сравнительно узкой порой, в которой ионы движутся скачками в один ряд вдоль последовательности точек слабого связывания в канале. Постулируется, что для каждого иона в канале существует свой энергетический профиль: потенциальные барьеры соответствуют допущению о стерическом соответствии иона определенным участкам связывания канала, а потенциальные ямы - предположению о

-6-

необходимости связывания иона со структурами каналообразующего белка. Для описания ионного транспорта в калиевых каналах использовались трех и четырехбарьерные модели. Предполагалось, что заполнение мест связывания канала блокирующими и проникающими ионами определяется простой конкуренцией ионов за ограниченное число мест связывания ионов в канале, а константы скоростей возможных переходов ионов из одного места связывания в другое зависят от относительной величины энергетического барьера, пересекаемого ионом в каждом случае (как это следует из теории абсолютных скоростей реакций Эйринга).

1.3. Результаты математического моделирования и их обсуждение . Целью наших исследований была реконструкция энергетических профилей калиевого канала для проникающего иона калия и различных блокирующих ионов (Ь1+, Ыа+, Сз+), выяснение роли отдельных участков, канала в обеспечении его селективности, установление возможного механизма подавления калиевого тока ионами щелочных металлов.

Параметры моделей обычно находились из одного набора вольт-амперных характеристик (ВАХ) и использовались для предсказания ВАХ в других экспериментальных условиях. Точный подбор параметров энергетических профилей для проникающего' и блокирующих ионов проводился при помощи программы нелинейной оптимизации на ЭВМ. Использование трехбарьерной модели ионного транспорта дало хорошую аппроксимацию ВАХ, измерянных при различных концентрациях блокирующих ионов.

В рамках данной модели можно объяснить характерное потенциалозависимое подавление калиевого тока, пользуясь понятием простой конкуренции между ионами за ограниченное число мест связывания внутри калиевого канала. Так как активационные барьеры для ионов натрия существенно выше, чем для калия (12.8, 13.4, 13.0 ИТ и 9.5, 9.8, 13.0 ИТ соответственно от наружной к внутренней поверхности клетки), то для их преодоления Ма+ потребуется значительно большая энергия. Вероятность того, что связанный с каналообразующим белком ион натрия пройдет через канал, значительно возрастает при достаточно больших положительных значениях мембранного потенциала. В результате увеличивается общий

-7-

поток ионов через канал, а следовательно, уменьшается подавление калиевого тока. Участок с отрицательным наклоном вольт-амперной характеристики соответствует тому интервалу значений мембранного потенциала, где энергия ионов натрия недостаточна для преодоления активационных барьеров. При этом ионы натрия, вероятно, занимают места связывания внутри канала, тем самым блокируя его. Теоретически рассчитанные потоки ионов калия и натрия наружу и внутрь клетки подтверждают этот еывод: на Есем рассматриваемом промежутке значений мембранного потенциала iK/lNa » 100. Поток блокирующих ионов натрия существенно возрастает при деполяризации мембраны, однако недостаточен для непосредственной регистрации в эксперименте. Можно предположить, что как степень подавления калиевого тока,' так и крутизна отрицательного наклона должны уменьшаться с уменьшением внутриклеточной концентрации' блокирующих ионов (в данном случае натрия), а максимум вольт-амперной характеристики смещаться в сторону более положительных значений мембранного потенциала. Это подтверждается и теоретическими, и экспериментальными исследованиями.

Увеличение крутизны участка вольт-амперной характеристики с отрицательным наклоном в случае блокирования калиевого выходящего тока ионами Ь1+можно объяснить их более сильной, по сравнению с ионами натрия, конкурентноспособностью (параметры энергетического профиля для ионов Li+ : 17.7, 18.5, 13.0 RT от наружной к внутренней поверхности клетки).В случае блокирования ионами Сз+ рассчитанные величины энергетических барьеров профиля свободной энергии цезия б калиевом канале меньше, чем аналогичные характеристики ионов натрия (12.8, 12., 13.0 RT). Это и объясняет наличие "плато" в соответствующих мгновенных вольт-амперных характеристиках.

Применение четырехбарьерной модели ионного транспорта улучшило соответствие рассчитанных вольт-амперных характеристик экспериментальным данным. Это позволило предположить, что, вероятно, узкая пора калиевого канала содержит, по крайней мере, три места связывания для ионов. Этот вывод подтверадается экспериментальными данными (Neyton, Miller, 1988), . где

авторы доказали существование четырех участков каналообразующего белка, с различными константами связывающих ионы калия и натрия. На существование трех мест связывания указывают данные, полученные в экспериментах на Са-активируемых калиевых каналах эритроцитов

(Уев1;е^аи1-Вод1М, 1985), калиевых каналах гигантского аксона (Ве£еп1э1с11, йе 'Неег, 1980) и т.д.

Особенно актуальным в настоящее время является вопрос о том, какими именно факторами обусловлена селективность калиевого канала: специфическим связыванием ионов с каналообразующим белком или энергетическим отбором в узком селективном фильтре канала. По-видимому, на это указывают и полученные наш данные, селективные свойства определяются совокупностью этих факторов, поскольку вероятность переходов ионов из одного места связывания в другое зависит от относительного значения энергетического барьера. Однако, определяющим, вероятно, является стерический фактор -отбор ионов в узкой части калиевого канала, где расположен его селективный фильтр. Более определенного ответа в рамках барьерной модели ионного транспорта дать нельзя.

Следует отметить, что определенные недостатки барьерной модели: фиксированный во времени энергетический профиль канала, соответствующий представлению о белках как о жестких неподвижных структурах, невозможность учета влияния потока ионов, проходящих через канал, на конформационные состояния канала и т.д., ни в коей мере не умаляют ее достоинств, а именно, возможности объяснения и описания селективных свойств ионных каналов.

II. ОПИСАНИЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ПОТЕНЦШШПРАВЛЯЕМОГО ИОННОГО

КАНАЛА НА ОСНОВЕ ИОН-КОНФОРМАЦИОННОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ.

В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что белковые макромолекулы (в том числе и каналообразующие белки) могут находиться в различных конформациснных состояниях и переходить из одного конформационного состояния в другое как в

результате тепловых флуктуация, так и под действием некоторых факторов внешней среда. Наиболее очевидно влияние поднерживаемого на мембране потенциала на осуществление быстрых конформационных переходов мезду открытым и закрытым состояниями одиночного ионного канала и на вероятности жизни канала в этих состояниях (Hamll et al., 1981; Tslen et al.,1987; French, Horn, 1983; Latorre, Miller, 1983). Довольно тщательно в последнее время изучено влияние pH внеклеточного раствора (Pletrobon et al., 1988; Prod'hom et al., 1989). Исследуется также возможность сопряжения процесса переноса ионов через ионный канал с конформационными перестройками каналообразующего белка (Hille.Schwarz, 1978; lauger et al., 1980). Ион, проходя через узкую пору каналообразущей молекулы, электростатически (по крайней мере) взаимодействует с заряженными или полярными группами бежа, вызывает их переориентацию, а возможно,и изменяет конформационное состояние самого белка.

Приведенные данные позволяют предложить модель функционирования потенциалуцравляемого ионного канала на основе представлений об ионном транспорте как о существенно нелинейном процессе, включающем в себя взаимодействие ионов с конформационными изменениями белковых макромолекул, формирующих ионные каналы.

2.1. Описание модели. Основой данной модели является барьерный подход к описанию ионного транспорта в предположении, что белковая молекула, формирующая ионный канал, -динамичная, флуктуирующая структура. В рамках барьерной модели взаимодействие иона, находящегося в ионном канале, с конформационными изменениями каналообразующего белка приводит к изменению профиля потенциальной энергии иона з канале изменению высоты энергетических барьеров и глубины энергетических ям.

Будем различать конформационные изменения калообразующего белка: "быстрые" конформационные изменения, время релаксации торнх гораздо меньше, чем среднее время прохождения ионов через канал, и "медленные", чье время релаксации гораздо больше времени пребывания иона в канале. Поскольку медленные конформационные изменения характеризуются большими временами

Рис.1. Энергетический профиль иона в канале.Е01, Е12(0), - постоянные высоты энергетических барьеров, преодолеваемых ионами при прохок-дании через канал;Ео,Е1,Ег - энергетические минимумы потенциального профиля; Е12'и - величина, характеризующая изменение высоты энергетического барьера Е1а(О), связанное с медленными конформационными изменениями каналообразухщего бежа. Слева - внеклеточный раствор, справа - внутриклеточный.

релаксации а*, для каждого вновь поступившего в канал иона белковая молекула находится в неравновесном конформационном состоянии. В этом случае движение иона через канал зависит от того, сколько ионов ему предшествовало и как быстро они прошли через канал, так как каждый из предшественников деформировал канал и эта деформация не успела полностью "рассосаться". Другими словами, медленные конформационныв изменения реагируют на среднее число ионов в канале.

Пусть для простоты потенциальный профиль иона, проходящего через канал, тлеет вид, изображенный на рис Л. Тогда зависимость средней заселенности канала ионами описывается уравнением:

ио у/01 + ( тг + Ню ) (I),

где N0 - концентрация ионов снаружи клетки, №01, \712, \Ую -вероятности переходов ионов из одной энергетической ямы в другую, рассчитанные на основе теории абсолютных скоростей реакций Эйринга по формулам:

401 = По ехр [- Ео - а Ф°Д

тг- = П1 ехр[- - q Ф12^ Ф0] (2.1-2.3),

= 01 ехрС- - Ч

где П1, 1 = 0,1,2 - частота колебаний иона и 1-й энергетической

--И-

яме, Т - абсолютная температура, к - постоянная Больцмана, q -заряд иона, щз- ф± - разность потенциалов между соответствующими участками канала (1,3 = 0,1,2).

Отсутствие в уравнении (I) члена, описывающего переход в центральную энергетическую яму из правой , связано с предположением, что вероятность перехода иона из внутриклеточного раствора в канал пренебрежимо мала (внутриклеточная концентрация ионов практически равна нулю), что соответствует условиям функционирования кальциевых каналов.

Обозначим медлешше конформационные изменения как и(1). Уравнение движения для конформационной переменной и^) можно записать следующим образом:

ц-2 с£и + г»Й_Ц + и = цшг) (3),

• агг аг 00

где и - частота конформационных колебаний, %*- их время релаксации.

Пусть медленные конформационные изменения вызывают изменение высоты правого барьера:

Е12 з Е12(и) = Е12(0) + Е12 Ш) (4),

где Е12(0) - некоторое среднее его значение, Е12 - производная от функции, определяющей зависимость высоты потенциального барьера от конформационной переменной в точке, соответствующей каналу, не занятому ионами.

В этом случае уравнение ионного транспорта можно переписать в виде:

Ц = N0 №01 -[ №ю + «12|и=0ехр(- ^ ) ] (5).

Полученная система уравнений (3,5) отражает согласованный характер движения ионов с конформационными изменениями ионного канала. Она показывает, что ионный поток, взаимодействуя с флуктуирующей белковой макромолекулой, формирующей ионный канал, существенно изменяет потенциальный профиль иона в канале, , тем самым обеспечивая возможность управления кинетикой и проводящими свойствами канала.

2.2. Результаты математического моделирования и_их

обсуждение.

2.2.1. Вистабильный характер ионного транспорта. ' Исходя из

-У2-

предположений данной модели будем считать, что заселенность

N(0 канала ионами реагирует на мгновенное значение

конформационной переметой иЦ). В силу этого воспользуемся

адиабатическим принципом исключения быстрых переменных,

переходя в уравнении (5) к квазистационарному режиму. В

результате получим, что заселенность канала имеет вид: Р ехр ф

N(1) =-, (6),

I + т) ехр (ф - е)

где е (Г) = Е12 иЦ)/ И - безразмерная конформационная

переменная, ф = ( фю - ф12 )/ КГ « я (<ро —ф1 >/ КГ -

безразмерная разность протенциалов на мембране, Р = N0 ехр((

Ео - Е1)/ ИГ) - поток ионов через канал, т) = ехр (((Ею -

Е12(0))/ И ).

Уравнение для конформационной переменной в этом случае имеет вид: ш"г§г + т* § = - -^М (7),

Р Р

и (е) = — - г С р ехР Ф-а £• - (8)

2 -Ой) 1 + Т) ехр (ф - £' )

неравновесная потенциальная функция медленных конформационных

Еа.

изменений калообразугацего белка. В ней С = — , где Еа. =

кТ

= Е12 и^ - предельное значение изменения высоты энергетического барьера.

Графики потенциальной функции, рассчитанные на ЭВМ для разных значений параметров Риф представлены на рис.2А,Б. Видно, что с увеличением потока ионов, поступающих в кэнал ( в частности, с увеличением внеклеточной концентрации проникающих ионов), или с ростом разности потенциалов на мембране возрастает вероятность открытого состояния канала. Точками Е1, ез обозначены устойчивые стационарные состояния системы, £2 -неустойчивое стационарное состояние.

Точками , ¡г, Лз отмечены эти состояния на рис.3, где представлена зависимость ионного тока от Р при разных значениях мембранного потенциала. Эта кривая имеет Б-образную форму, характерную для неравновесных бистабильных систем. На этой кривой можно выделить три области: в первой имеется лишь одно стационарное состоние , характеризующееся малой проводимостью

Рис.2. Зависимость неравновесной потенциальной функции U(e) от величины потока ионов (А) и мембрашюгэ потенциала (Б). Для представленных на рис.2А кривых слева направо Р = 3.2, 3.37, 3.5 при значениях ф = 0.5, Т) = 10. На рис. 2Б - ф = 0.4, 0.5, С.6 при Р = 3.37 , т] = 10.

("закрытое" состояние), во Еторой - единственное стационарное состояние с большой проводимостью ("открытое"), в третьей канал может обратимо переходить из "открытого" в "закрытое" состояние через неустойчивое стационарное состояние. 2.2.2. Роль флуктузций каналообразувдэго белка в процессах функционирования ионного канала. Как видно из предыдущего рассмотрения, каналы в биологических мембранах являются неравновесными нелинейными системами, функционирующими вблизи точки неравновесного фазового перехода: бистабильность-моностабильность.

Рассмотрим роль флуктуаций в процессе функционирования канала. Будом считать, что на конформационную переменную u(t) действует случайная сила l(t'), обусловленная, например, тепловыми флуктуациями каналообразующай бежовой макромолекулы. Уравнение (3) в этом случае имеет вид:

,J 1Тг ЗГ = - gg-+ fU ) (9).

Беодя новую переменную t - и t', получим:

J 6

и -2 -О

Рис.3. Кривая бистабильности системы. Для представленных кривых ф растет слева направо.

8 Р

2

-§-§2 + р - - а4- + f(t>, р = и т* (10).

Проведенные рассчеты (уравнения 5,10) показывают, что в результате взаимодействия потока ионов с медленными конформационнкми изменениями каналообразующей белковой макромолекулы происходит перераспределение вероятностей реализации различных конформационных состояний белка таким образом, что наиболее вероятными оказываются два состояния канала с большой и практически нулевой проводимостями. Вследствие тепловых флуктуации белка ионный канал может случайным образом переключаться между этими состояниями, т.е. обратимо переходить из открытого состояния в закрытое (рис.4). 2.2.3. Потенциалозависимость средних времен пребывания канала в открытом и закрытом состояниях. Предлагаемая модель функционирования одиночного ионного канала позволяет исследовать зависимость основных кинетических характеристик одиночного потенциалупривляемого ионного канала от мембранного потенциала. Рассчеты проводились для тех значений параметров модели, когда канал проявлял пачечную активность (р = 0.1). Показано, что с ростом деполяризации мембраны

. лип иш^иг

Рис.4. Временшо зависимости ионного тока через одиночный ионный канал, полученные в результате численного моделирования уравнений (5,10) (Р = 3.37, т) = Ю, р = 0.2 (А), 0.1 (Б)). Тепловые флуктуации моделировались гауссовским случайным процессом ("белый шум" интенсивностью Б = 0.05).

уменьшалась как вероятность реализации открытого состояния канала, так и среднее время пребывания канала в этом состоянии. Так как в рассчетах внутриклеточная концентрация проникающих катионов приравнивалась к нулю, то деполяризация мембраны приводила к увеличению потока ионов, проходящих через канал. Каждый ион взаимодействовал с различными структурными группировками канала (С00~ группами, наведенными диполями и т.д.), вызывал их переориентацию таким образом, что увеличивался энергетический барьер, отделяющий пору канала от цитоплазмы Поэтому рост заселенности канала ионами приводил к значительному увеличению структурных деформаций каналообразующего белка, а следовательно, к более быстрому закрытию канала. При замене двухвалентных проникающих катионов одновалентными потенвдалозависимость была менее выраженной. Это можно, по-видимому, объяснить более слабым динамическим взаимодействием одновалентных катионов с полярными или заряженными группами канала. Вероятность реализации закрытого состояния канала практически не зависела от мембранного потенциала. Поэтому соответствующие кинетические характеристики тех не проявляли потенциалозавксимости (рис.5).

2.2.4. Зависимость кинетики функционирования одиночного ионного канала от концентрации проникающих ионов.

Поскольку Р = N0 пу е*р (Ео - Е1) , то при ехр (Ео - Е1)

TVu Tel -2.3

Рис.5. Зависимости средних времен пребывания канала в открытом (1,4) и закрытом (2, 3) состояниях от мембранного потенциала, рассчитанные в рамках ион-конформационной модели для двухвалентных (• ) и одновалентных ( • ) катионов.

■ю

■а

э

4<

6

2

а

ф 0.7 05 0,3

= const (т.е. в случае, когда через канал проходят ионы одного типа), данный подход позволяет исследовать зависимость кинетики функционирования одиночного ионного канала от внеклеточной концентрации проникающих ионов. Оказалось, что среднее время пребывания канала в открытом состоянии токозависимо: оно уменьшается с увеличением тока через канал. В рамках представленной модели токозависимость тор объясняется прямой зависимостью конформационной переменной от заселенности канала ионами, которая, в свою очередь, пропорциональна внеклеточной концентрации проникающих ионов. С увеличением внеклеточной концентрации ионов увеличивается ионный поток через канал, направленный по градиенту концентрации, растет заселенность канала N(t), а следовательно, усиливается взаимодействие проходящих через канал ионов с конформационной перемненной u(t), что непосредственно ведет к более быстрому закрытию канала.

Токозависимость среднего времени пребывания канала в открытом состоянии наблюдалась как в экспериментах, выполненных на уровне регистрации токов через одиночные ионные каналы (Погорелая и др., 1987), так и при регистрации интегральных кальциевых токов на изолированных нейронах виноградной улитки Helix pomatla в условиях внутриклеточного диализа их содержимого

(Кононенко.Щербатко, 1989).

2.2.5. Влияние замены проникающего катиона на кинетику одиночного потенциалулравляемого ионного канала. Ионы, переносящие ток через каналы плазматических мембран, различаются по заряду, размерам, степени гидратации, координационной химии и т.д. Попадая в узкую пору, сформированную белковой каналообразующей молекулой, они по-разному взаимодействуют со структурными группировками белка. В рамках барьерной модели это означает, 'что энергетический профиль канала для различных ионов будет существенно отличаться: различными будут энергетические минимумы, соответствующие, вероято, специфическому связыванию ионов в канале заряженными (например COO- ) группами каналообразующего белка, и энергетические барьеры, по-видимому, ассоциирующиеся с образованием "активированного комплекса" иона со структурами узкого селективного фильтра канала.

При исследовании влияния замены типа катионов, переносящих ток через ионный канал, на кинетические характеристики канала мы исходили из предположения, что как взаимодействие ионов со структурами канала, так и их влияние на медленные конформаци-онные изменения каналообразующего белка различны для разных типов ионов. В рассчетах были использованы параметры энергетического профиля кальциевого канала мембраны нейронов моллюсков для ионов Bat Cat Sr+ (Костюк и др., 1981). Проницаомость мембраны для ионов бария в этом случае оказалась выше проницаемости для ионов кальция и стронция. Связывание ионов Bat Cat Sr+ предполагаемой COO- группой, расположенной в поре кальциевого канала происходит по рассчетам авторов в следующей последовательности : Ква < Кса < Ksr ( Ki - константы связывания ионов с С00~ группой).

В рамках барьерной модели ионного транспорта это означает, что энергетические минимумы энергетического профиля, для рассматриваемых ионов отличаются следующим образом:

El(Ва) < Ei(Са) < El(Sr), поэтому при равной внеклеточной концентрации проникающих ионов (Mo = const, Р » ехр (Ео - Ei)): Р(Ва) < Р(Са) < P(Sr).

Из рис.2 следует,что в этом случае вероятности открытого -It.-

состояния канала для этих ионов следующие:

ро(Ва) < ро(Са) < po(Sr), следовательно

то(Ва) < Хо(Са) < to(Sr). Этс означает, что среднее время пребывания канала в открытом состоянии существенно зависит от силы взаимодействия иона, проходящего через ионный канал с заряженными группами канала. Чем сильнее связывание, тем меньше поток ионов через канал, тем слабее изменяется конформэция каналообразующего белка, тем большее среднее время пребывания канала в открытом состоянии.

Таким образом, рассчеты показывают, что среднее время пребывания канала в открытом состоянии для ионов с большей проникающей способностью короче.

Этот вывод соответствует экспериментальным данным, полученным как в результате регистрации токов через одиночные каналы (Погорелая и др. 1987; Nelson et al., 1986), так и при исследовании деактивации кальциевых каналов (Широков, 1988; Kostyuk, Shirokov, 1989).

ВЫВОДЫ

1. В рамках трехбарьерной модели ионного транспорта показано, что потенциалзависимое блокирование каливЕых каналов нейронов моллюсков ионами щелочных металлов является следствием конкуренции проникающих и блокирующих ионов за ограниченное число мест связывания в канале.

2. Разработан подход к описанию функционирования потенциалуправ-ляемого ионного канала с учетом динамической природы каналообразующих белковых макромолекул. Использование модели позволило показать, что взаимодействие ионного потока с флуктуирующим белком приводит к появлению двух наиболее вероятных конформационных состояний каналообразующего белка, ассоциирующихся с "открытым" и "закрытым" состояниями ионного канала.

3. Теоретические рассчеты, выполненные в рамках данного подхода показывают, что мембранный потенциал, концентрация и сорт

-У 9-

проникающих ионов определяют характер взаимодействия ионного потока с каналообразующим белком, что находит свое отражение в изменении кинетики одиночного ионного канала.

4. Показано, что среднее время пребывания канала в открытом состоянии существенно зависит от мембранного потенциала при переносе тока как двухвалентными, так и одновалентными ионами При положительном смещении мембранного потенциала среднее время пребывания канала в открытом состоянии уменьшается, в то время как вероятность открытого состояния канала растет.

5. Средние времена пребывания канала в закрытом состоянии практически не зависят от величины мембранного потенциала для любых концентраций проникающих ионов (как одно-, так и двухвалентных).

6. Увеличение внеклеточной концентрации проникающих ионов приводит к росту заселенности канала ионами, что вызывает уменьшение среднего времени пребывания канала в открытом состоянии. Таким образом, среднее время пребывания канала в открытом состоянии является токозависимым: оно уменьшается при увеличении тока через канал.

7. Применение данного подхода выявило зависимость среднего времени пребывания канала в открытом состоянии от сорта проникающего катиона. Для ионов с большей проникающей способностью оно короче.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Чинаров В.А., Березецкая Н.М., Пивоварова Н.В. Математическое моделирование взаимодействия ионов щелочных металлов с К+-каналами соматической мембраны нейронов моллюсков // Тезисы докладов II Всесоюзной конференции "Математические и вычислительные методы в биологии. Биомолекулярные системы" .-Лущино, 1987. - с.112-113.

2. Пивоварова Н.В., Чинаров В.А. Моделирование ' электрических характеристик одиночных ионных каналов в рамках синергетичес-кого подхода // Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах".- Пущино, 1989.- с.77.

3..Пивоварова H.B., Чинаров В.А. Моделирование зависимости кинетики функционирования ионного канала от его селективных свойств // Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Ионные каналы в биологических мембранах". - Москва, 1990.- с.68.

4. Пивоварова Н.В. Моделирование активности одиночных ионных каналов на основе ион-конформационного взаимодействия // Труды XV конференции молодых ученых МФТИ .- 1990. - ч.2, с. 86-94.

5. Chlnarov V.A., Galdldel Yu.B., Kharklanen V.N., Plvovarova N.V. Selí-organizatlon of a membrane Ion channel as a basis of neuronal computing // Proc's oí "Neuronet-90".- 1990.-p.58-67.

6. Гайдидей Ю.Б., Магура И.О., Пивоварова Н.В., Харкянен В.Н., Чинаров В.А. Описание функционирования потенциалуправляемого ионного канала на основе ион-конформационного взаимодействия/ Биологические мембраны.- 1991. - т.8, N 3.- с. 330-338.

y¡/v Л

¿ЧсупсИ.Г'г'О К /И.ЧСпИИ с*. 0.1. >90 ir.

C¿.:cxi ¡.llny,. <-? Цл$4'/ic.

HllO,. "iic.uiívct'.u.'.'r,;-,'." 44 .22 <5

7Vn\ Г JO