Блокада NMDA-каналов пирамидных нейронов гиппокампа крысы местными анестетиками и их производными

Колесникова, Татьяна Валерьяновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Блокада NMDA-каналов пирамидных нейронов гиппокампа крысы местными анестетиками и их производными
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Блокада NMDA-каналов пирамидных нейронов гиппокампа крысы местными анестетиками и их производными"

На правах рукописи УДК 577.352.465

Колесникова Татьяна Валерьяновна

БЛОКАДА МНИА-КАНАЛОВ ПИРАМИДНЫХ НЕЙРОНОВ ГИППОКАМПА КРЫСЫ МЕСТНЫМИ АНЕСТЕТИКАМИ И ИХ ПРОИЗВОДНЫМИ

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва -2005

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте обшей патологии и патофизиологии РАМН и на кафедре физики живых систем Московского физико-технического института (Государственного университета)

Неумный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Борис Израилевич Ходоров Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, Денис Борисович Тихонов

Кандидат физико-математических наук, Николай Филиппович Перевозчиков

Ведущая организация: НИИ Мозга РАМН

Защита состоится 15 декабря 2005 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (Государственном университете) по адресу: 141700, Московская обл, г. Долгопрудный, Институтский пер., 9, МФТИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (Государственного университета).

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета К 212.156.0^ кандидат физико-математических наук

В.Е Братин.

mG-l 1Ш0

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В большинстве синапсов центральной нервной системы млекопитающих и человека передача возбуждающего сигнала осуществляется с помощью медиатора - глутамата Ионотропные рецепторы глутамата подразделяются на NMDA- (N-метил-D-acnaprar), AMP А- (а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазол пропионат) и каинаггный подтипы. Среди семейства глутаматных рецепторов NMDA-подтип отличается потенциалзависимой блокадой ионами Mg2* (Mayer et al, 1984; Nowak et al., 1984; Ascher and Nowak; 1988), медленной кинетикой активации, неполной десенситизацией (Johnson and Ascher, 1987; Lester et al., 1990), относительно высокой проницаемостью для ионов Ca3* (MacDermott et al., 1986). Эти и другие свойства NMDA-каналов лежат в основе формирования нервной системы на эмбриональной стадии, памяти и способности к обучению (Bliss and Coffingridge, 1993; Asztely and Gustaftson, 1996; KuDmaim et al., 2000), a также патогенеза болезней Паркиясона, Альцгеймера, ишемической болезни мозга, эпилепсии и др. (Doble, 1999; Anindine and Tymianski, 2004; Hynd et al., 2004; Rho, 2004).

Опыт исследований блокады ионных каналов различными соединениями показал, что результаты таких работ являются ценным источником информации о самих каналах (Hille, 2001). На протяжении ряда лет этот подход используется в работах нашего коллектива для изучения свойств NMDA-каналов (Кошелев и Ходоров, 1992, 1995; Sobolevsky et al, 1999). Настоящая работа является продолжением проводимых в лаборатории исследований В качестве новых инструментов изучения биофизических свойств и функциональной архитектуры NMDA-каналов в ней использованы местные анестетики и их производные (МА) В отличие от ранее применявшихся блокаторов, большинство МА содержит три функциональные группировки: ароматическое кольцо, третичную аминогруппу и полярную (амидную или эфирную) связь. рК. аминогруппы этих соединений лежит в диапазоне 8.1+9 4 (Strichartz et al., 1990), поэтому при физиологических pH МА находятся преимущественно в заряженной форме. Такое строение МА обусловливает их амфифильные свойства.

Цель работы: экспериментальный и теоретический анализ механизмов действия местных анестетиков и их производных на NMDA-каналы пирамидных нейронов гиппокампа крысы.

Задачи Pfflimmi"*;

1) В опытах на свежеизолированных нейронах зоны СА1 гиппокампа крысы с помощью метода "пэтч-кламп" (patch-clamp) в конфигурации "целая клетка" изучить зависимость действия МА от- (а) их концентрации и длительности действия; (б) концентрации агониста; (в) мембранного потенциала, (г) состояния воротного механизма канала.

2) На основании полученных данных выяснить, является ли уменьшение амплитуды тока через NMDA-каналы в присутствии МА результатом закупорки ионной поры канала или следствием аллостерического влияния на работу воротного механизма.

3) С помощью модели Вудхулл оценить в долях мембранного потенциала глубину расположения связывающих участков МА в NMDA-канале.

4) Используя математическое моделирование ионных токов через NMDA-каналы, определить влияние МА на работу воротного механизма NMDA-канала.

5) С помощью сравнительного анализа сродства различных МА к NMDA-каналу оценить вклад функциональных группировок этих соединений в связывание

6) Используя собственные и литературные данные, провести сравнительный анализ блокады Na+- и NMDA-каналов МА.

Яяпнт HWHW«

- Впервые проведено систематическое изучение действия пяти местных анестетиков (новокаин (НОВ), бензокаин (БЕНЗ), тетракаин (ТЕТР), лидокаин (ЛИД), зтидоканн (ЭТ)) и трех их производных (новокаинамид (НОВА), QX-314 и L30) на ионные токи через NMDA-каналы механически изолированных пирамидных нейронов гиппокампа крысы

- Изучена зависимость блокады NMDA-каналов этими соединениями от их концентрации, концентрации агониста и мембранного потенциала.

- Показано, что подавление ионных токов через NMDA-каналы протежируемыми МА и постоянно заряженным QX-314 является результатом закупорки ионной поры канала Оценена глубина проникновения в канал протонируемой аминогруппы третичных МА и постоянно заряженной аммониевой группы четвертичного QX-314 Наряду с этим показано существование потенциал-независимого механизма блокады у МА ксилидинового ряда.

- Изучена кинетика взаимодействия МА с NMDA-каналами и проанализированы структурные факторы, определяющие ее.

Проанализировано влияние блокады ионной поры ЫМОА-канала МА на работу воротного механизма

Проведен систематический анализ связи эффективности блокады ЫМОА-каналов МА с их структурой Оценен вклад заряженных, полярных и гидрофобных группировок во взаимодействие МА с КМОА-каналами

Научно-практическая ценность. Блокаторы ЫМОА-каналов считаются перспективными терапевтическими агентами для лечения нейродегенеративных заболеваний, однако введение этих средств в медицинскую практику на текущий момент существенно ограничивается серьезными осложнениями, которые вызывают многие из них Анализ этих явлений показывает, что безопасность применения блокаторов ЫКГОА-каналов зависит от их аффинности, кинетики блокады и взаимодействия с воротным механизмом канала 2000) Поэтому выявленные в данной работе закономерности

блокирующего действия МА на №*ГОА-каналы и их связь со структурой этих соединений могут быть использованы в дальнейшем для направленного синтеза новых лекарственных препаратов, мишенью действия которых являются ЫМОА-каналы

Практическая значимость исследования действия МА на NMDA-кaнaлы определяется широким применением этих соединений в медицине для местной, спинальной и других видов анестезии При этом с побочным действием МА на ММОА-каналы могут быть ассоциированы как положительные (предотвращение сенситизации болевой чувствительности), так и отрицательные (характерные для многих блокаторов ММРА-каналов) эффекты применения анестетиков Полученная информация о действии МА на ММОА-каналы может быть использована в дальнейшем для анализа этих явлений и создании усовершенствованных средств для контроля над болевой чувствительностью

Апробации работы Материалы диссертации доложены на Ш Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), Х1ЛУ и ХЬУН научных конференциях МФТИ (Долгопрудный, 2001 и 2004), международных семинарах, организованных физиологическим обществом Великобритании (Лидс, 2002; Санкт-Петербург, 2004; Севилья, 2005), VIII Международном далемском симпозиуме по клеточному узнаванию сигналов и их передаче (Берлин, 2003), 32 ежегодной конференции Американского общества по нейронаукам (Орландо, 2002).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 работ

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и пяти глав. Работа изложена на 183 страницах, проиллюстрирована 64 рисунками и содержит шесть таблиц. Библиографический список содержит 291 источник

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Опыты проводились на свежеизолированных пирамидных нейронах зоны СА1 гиппокампа крысы линии Вистар (возраст 14-21 день) Клетки выделяли методом вибродиссоциации (Vorobjev, 1991) из срезов гиппокампа толщиной 300-500 мкм, проинкубированных не менее 3 часов в растворе следующего состава (мМ) NaCl 124 0, КС1 3 0, СаСЬ 2 0, глюкоза 10 0, NaHCOj 26 0 Раствор непрерывно продували карбогеном (96% Ог и 4% СО2) при температуре 32°С Выделение клеток и регистрация токов проводились в безмагниевом растворе, содержащем (в мМ) NaCl 140.0, КС1 5.0, СаСЬ 2.0, глюкоза 15 0, N-(2-гидроксизткл)пиперазин-1Ч'-2-эггансульфоновую кислоту (HEPES) 10 0, глицин 0.003, рН7 3 Смена растворов при применении различных веществ осуществлялась методом концентрационного скачка (Benveniste et at., 1990). Постоянная времени смены раствора T«uh* 30 мс. Система подачи растворов на клетку представляла собой три параллельных трубки диаметром 0.5 мм, перемещение которых осуществлялось с помощью шагового двигателя Регистрация токов проводилась при комнатной температуре методом "пэтч-кламп" в конфигурации "целая клетка" с помощью микропипеток, изготовленных из стекла Пирекс и заполненных раствором следующего состава (мМ): CsF 140, NaCl 4, HEPES 10, рН7 2 Сопротивление заполненных микропипеток составляло 3-7 МОм Регистрируемые токи оцифровывали с частотой 1 кГц и записывали в память компьютера Статистический анализ данных проводился с помощью компьютерной программы Microcal Origin 6 0 (Microcal Software, Inc. USA). Экспериментальные данные представлены как х + Ах, где х -среднее значение измеренной величины. Ах - стандартное отклонение Исследование значимости различия между средними проводилось с помощью однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA) Величина уровня значимости была принята равной р = 0.05.

Глицин, аспартзт получены от фирмы "Sigma" (США) Местные анестетики и их производные получены от фирмы "Astra" (Швеция).

Компьютерное моделирование ионных токов основывалось на решении линейных систем дифференциальных уравнений первого порядка численным методом, описанным ранее (Benveniste et al., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Активация NMDA-каналов вызывалась применением 100 мкМ аспартата (АСП) в течение 3.5 с в растворе, содержащем 3 мкМ глицина и не содержащем Mg2*. В ответ на воздействие АСП при мембранном потенциале Е), = -100мВ возникал входящий ток амплитудой 300-2000 пА, который после быстрого начального подъема до пиковой

величины (Ico) уменьшался до некоторого уровня плато Ies (рис 2, серые кривые) В соответствии с существующими представлениями (Digledine et al, 1999) такое снижение амплитуды тока во время продолжительного действия агониста в отсутствие блокатора мы интерпре!провали как результат десенситизации NMDA-канал-рецепторного комплекса На рис I показаны структурные формулы применявшихся МА

MH-Q-I—о—сн^-

-о—сн^-сн, Бензокаин

СЧН- ж-ж Í _ /Н.

Ъ—{ ;—с—о—chj-ch—tí

н СН,

Тетракаин

1г—( у—с—о—сн^-сн—tí Новокаин

I,——С—NH—CHp-CHp-í^

Новокаинамид

сн, {¡н,

Лидокаин ;Н> 9

—NH—С—CII, М* CjH,

н. ¿л

QX-314

L30

/Г' Л ^

{ }—NH-С—СН—^

сн.

Этидокаин

Рис. 1. Структура применявшихся МА.

Воздействие 3 мМ БЕНЗ, 200 мкМ НОВ, 600 мкМ ТЕТР, 4 мМ ЛИД, 4 тМ <2Х-314, 300 мкМ НОВА, I мМ ЭТ. 5 мМ Ь30 в отсутствие АСП при Еь = -100мВ не вызывало токового ответа

1. Влияние МА на ионные токи через \МОА каналы. При сочетанием применении АСП с МА амплитуда пикового и стационарного тока была ниже, чем в контроле (рис 2) Несмотря на принципиальное сходство в строении МА, изменение параметров ионных токов под действием этих соединений было различным Блокада тока НОВ и НОВА, в отличие от действия остальных МА, усиливалась при их повторном применении (рис. 2, кривые 1-4 для НОВ и НОВА) При блокаде NMDA-кaнaлoв БЕНЗ, ТЕТР, ЭТ, НОВ и НОВА имело место снижение отношения плато/пик ММОА-тока (т.е. 1вкЯво < 1саЛсо) Спад тока после окончания воздействия АСП с БЕНЗ, НОВ или НОВА был монотонным во всем диапазоне применявшихся концентраций МА. В отличие от этого, деактивация тока после сочетанного воздействия АСП с ТЕТР, ЛИД ЭТ, Ь30 или ОХ-314 содержала кратковременное возрастание амплитуды тока с последующим ее спадом до нуля, причем в случае блокады

ЛИД спадающая фаза запаздывала по сравнению со спадом тока в контроле в 12 из 17 клеток (71%), а в случае блокады (}Х-314 - в 100% случаев (24 клетки) Более того, в ряде клеток амплитуда пика следового тока после действия 0Х-314 превышала стационарный уровень тока в контроле

1мМ БЕНЗ 02 мМ НОВ ОбмМТЕТР 0.3 мМ НОВА

зарегистрированные в ответ на сочетанное воздействие АСП с МА (черные линии), совмещены с контрольными кривыми, полученными в ответ на индивидуальное применение АСП (серые линии) В выносках показана деактивация тока в контроле и после прекращения сочетаниого воздействия АСП с МА. Цифрами обозначены порядковые номера ответов на сочетанные применения АСП с НОВ или НОВА. Длины вертикальных отрезков соответствуют силе тока 200 пА.

Концентрационные зависимости подавления тока МА были аппроксимированы уравнением:

1в/1с= 1/[1+([МА]/1С»Л,

где [МА] - концентрация МА, 1С» - концентрация МА, при которой наблюдается 50%-ное (от максимального) снижение амплитуды тока, р - коэффициент Хилла. Величины 1Су> и р, определенные по пику (Юм0, р°) и плато (1С5о5, р8) тока при Еь = -100 мВ приведены в Табл 1 Поскольку необходимым условием для определения величины 1С» является состояние (квази)равновесия реакции связывания блокатора с каналом, то для НОВ и НОВА эти величины определялись после насыщения кумулятивной блокады этими соединениями

Сравнение величин ICjo МА для NMDA-каналов (Табл 1) и Na'-каналов (Strichartz, 1973; Негуляев и Носырева, 1979, Brau et а!, 1998) показало, что при отрицательных мембранных потенциалах ТЕТР, ЛИД ЭТ и QX-314 на порядок и выше эффективнее блокируют Na*-, чем NMDA-каналы; БЕНЗ и НОВ блокируют эти каналы в сходных концентрациях; а НОВА на два порядка эффективнее блокирует NMDA-каналы Таким образом, в условиях клинического применения НОВ, БЕНЗ и НОВА следует учитывать возможность побочной блокады NMDA-каналов

Таблица 1. Блокирующая способность МА при Eh = -100 мВ

МА Пиковый ток Стационарный ток 1С»0/1С»» п

IC»0, мМ Р° 1С*Д мМ р"

Эфиры ТЕТР БЕНЗ НОВ 0.41±0.02 1.31*0.05 0.069*0.002 1.21*0.04 0.72*0.02 0 88*0.03 0.24*0.02 0.46*0.04 0.028*0.003 1.32*0.09 0.74*0.06 0.94*0.08 1.71*0.08 2.8*0.3 2.5*0.3 16 14 8-11

НОВА 0.056*0.008 0.99*0.02 0.040*0.002 1.08*0.06 1.4±0.2 8

ЛИД 1,92±0.08 1.20±0.07 2.00±0 10 1,08±0.07 0.96М.06 11

| QX-314 2.67*0.14 1.16*0.08 2.63*0.09 1.12*0.05 0.99±0.06 14

3 ЭТ 0.81*0.02 1.43*0.03 0.62*0.02 1.51*0.05 1.31 ±0.03 8

L30 2.34±0.07 1 17±0.06 2 08±0.03 1 29Ю.03 1.13±0 04 9-10

2. Кинетика взаимодействия МА е ШШ-пиигаш. На рис. За показан экспериментальный протокол, использовавшийся для изучения данного вопроса. Чтобы исключить вклад десенситизации свободных от блокатора каналов в кинетику изменения тока, МА применялись не ранее того момента, когда ток в ответ на воздействие АСП достигал стационарного уровня Кинетика блокирования и деблокирования ИМЛА-каналов большинством МА была монотонной Исключение составил <}Х-314 в 2 из 7 клеток ток в ответ на применение этого МА резко снижался до некоторого минимального значения, после чего плавно увеличивался до стационарного уровня блокады После удаления ОХ-314 из омывающего раствора в большинстве клеток в процессе деблокирования наблюдали кратковременное превышение амплитудой тока стационарного уровня в контроле ("овершут", Кошелев и Ходоров, 1995, рис. 36)

Параметры аппроксимации экспоненциальными функциями спада и восстановления ММОА-тока в ответ на добавление и удаление МА из окружающего раствора приведены в Табл 2 Кинетика блокады всеми МА, за исключением ЭТ и ЛИД (в ряде клеток), имела быструю и медленную компоненты

Рис. 3. Кинетика

взаимодействия МЛ с ЫКГОА-каналами в присутствии агонисга при Еь = -100мВ. а -экспериментальный протокол показан на примере применения О 2 мМ НОВА б - кинетика восстановления тока после удаления 1 мМ БЕНЗ, 0.1 мМ НОВ, 0 4 мМ ТЕТР, 4 мМ ЛИД, 8 мМ <}Х-314 и 1 мМ ЭТ. Длины вертикальных отрезков в б соответствуют силе тока 100 пА.

Таблица 2. Кинетические параметры спада и восстановления NMDA-TOi.ii в ответ на добавление и удаление МА из омывающего раствора в условиях постоянного присутствия АСП'

МА Е*. [МА], 1-1щ/1с8 Блокирование Деблокирование л

мВ мМ АГ т мс А/* Тг , мс тЛс

БЕНЗ -100 1 0.77±0 02 0 91±0 04 19±2 1.010.3 0 9110 05 57±8 1 9Ю.2 4

-100 0 1 0 72±0 01 0 691« 02 6819 0.71Ю.09 0 53+0 06 170128 1 1Ю2 8-9

НОВ -40 0« 0 80±002 0 7610 02 4718 0.4410.07 05710 04 72112 0 55Ю 07 6

+40 16 0 6010 02 0 7610 02 4113 0.40Ю 12 0.60Ю 07 34+2 0.19+0 01

ТЕТР -100 04 0 58±0 02 0 9410 02 1212 0.53Ю 07 08110 03 3012 0 4610 09 4

НОВА -100 02 0.87±0 02 0.5610 05 5715 0.86Ю.09 0.2510.03 87±19 1.610 2 5

ЛИД -100 4 0 69±0.04 1 14+3 - 1 3216 3

0 88Ю 02 09103 3

оп оК

-100 4 0 65Ю.02 1 36±0 12 1612 0 07Ю.02 1.2710 04 2212 0.38Ю 08 3 7

(}Х- 1 - 1 - 7 2

314 •40 в 0.74Ю.02 1 21+2 1.2210.06 3414 0.24Ю.07 4

1 2

+50 8 0.70±0.02 1 2613 - 1.22Ю.03 47±4 0.30+0 04 6

ЭТ -100 1 0.66Ю.04 1 12±2 - 1 26±5 - 4

' АСП I

б 66НЭ

си

ЛЦД

а.

нов

ОХ-314

СГГ]

эт

• А™, Аг""- удельный вес быстрой компоненты блокирования и деблокирования т," т,в, Тг0®, т,"®-постоянные времени быстрой и медленной компонент блокирования и деблокирования, соответственно.

Видно, что тГ, » удельный вес медленных компонент блокирования и деблокирования НОВ и НОВА, которые имеют кумулятивный характер блокады, существенно выше, чем при действии других соединений

Исследование зависимости кинетики действия МА от мембранного потенциала на примере блокады НОВ и ОХ-314 показало, что удельный вес быстрой и медленной компонент блокирования и деблокирования не зависит от мембранного потенциала в диапазоне от -100 до +50 мВ, наблюдается только значительное увеличение скорости блокирования и деблокирования в случае НОВ (Табл. 2).

3. Влияние мембранного потенциала на блокаду МА. Сдвиг мембранного потенциала в положительную сторону в диапазоне от -120 до 0 мВ ослаблял блокаду всеми протонируемыми МА и постоянно заряженным <2Х-314 (рис 4) Дальнейшее увеличение потенциала разным образом сказывалось на действии МА. Блокада НОВ и НОВА полностью устранялась при положительных потенциалах (показано на примере НОВА, рис 4«) В отличие от этого, степень подавления ИМОА-тока соединениями ксилидинового ряда (ЛИД, ЭТ, ОХ-314 и 00) оставалась постоянной и отличной от нуля в диапазоне 0+60 мВ (показано на примере ЛИД, рис. 4в).

Наряду с этим, блокада нейтральным при физиологических рН БЕНЗ не зависела от мембранного потенциала во всем диапазоне, в котором проводились эксперименты (от -100 до +60 мВ, р=*0.25, п=6, рис 4г) Это показывает, что зависимость блокады протонируемыми МА и постоянно заряженным ()Х-314 от мембранного потенциала является результатом непосредственного взаимодействия заряда блокатора с мембранным полем, а не связана с изменением свойств канала при сдвиге мембранного потенциала.

Ослабление блокады протонируемыми МА и постоянно заряженным ОХ-314 при деполяризации мембраны свидетельствует о том, что механизмом действия этих соединений является закупорка ионной поры канала. Потенциал-независимая компонента блокады теоретически может быть результатом взаимодействия нейтральной формы МА с каналом Однако наличие этой компоненты у постоянно заряженного <ЗХ-314 позволяет исключить это предположение и сделать вывод о существовании в канале дополнительного участка связывания ксилидинов, расположенного вне мембранного поля.

Зависимости блокады протонируемыми МА и постоянно заряженным (ЗХ-314 от мембранного потенциала были аппроксимированы уравнением Вудхулл (1973):

1в/ 1с- (1-А) / {1+ [МА] / [1С*)(0)»ехр(51Т2|/КТ)]}, где А - удельный вес потенциал-независимой компоненты блокады, 1См(0) - концентрация МА, при которой наблюдалось бы 50%-ное снижение амплитуды тока при 0 мВ (от максимального потенциалзависимого), б • доля мембранного электрического поля.

пересекаема* заряженной группировкой блокатора при диффузии из раствора к участку связывания внутри канала, И - постоянная Фарадея, К - универсальная газовая постоянная, Т - температура Значения А, б и 1С}<|(0) приведены в Табл 3

в АСП б _ЛИД

♦60 мВ

Т Т 1

* т I

гм 1

г---'

Т БЕНЗ

а ТЕТР

-150 -100

-150 -100 -50 0

Е.. МВ

-50 0 50

Е„.мВ

Рис. 4. Влияние мембранного потенциала на блокаду ЫМЛА-каналов МА_ а и б - токи, вызванные индивидуальным применением АСП (в) и в сочетании с 4 мМ ЛИД (б) при различных мембранных потенциалах, в и г - усредненные значения величины 1в<Лсо при различных мембранных потенциалах при блокаде 4 мМ ЛИД, 0 3 мМ НОВА, 0 5 мМ БЕНЗ и 0 4 мМ ТЕТР В диапазоне +20 + +40 мВ воздействие ксилидинов в применявшихся концентрациях в отсутствие АСП вызывало отклонение токовой кривой от нуля, поэтому при расчете степени блокирования производилась компенсация вклада АСП-независимой компоненты в суммарный ток.

Из Табл 3 видно, что алифатическая аминогруппа большинства МА при блокаде КМОА-каналов пересекает 60-90% мембранного поля, что совпадает с соответствующей величиной для классических блокаторов ЫМОА-каналов, таких, как МК-801, кетамин, фенциклидин и т.д. (!>оЬо1еуз1су, 2003, обзор). Исследования на рекомбинактных каналах показали, что участок связывания классических блокаторов ММОА-каналов образован селективным фильтром и прилегающими к нему областями. На этом основании мы заключили, что алифатическая аминогруппа большинства МА во время блокады располагается в районе селективного фильтра.

Таблица 3. Значения параметров аппроксимации зависимости блокады NMDA-кaнaлoв МА от мембранного потенциала уравнением Вудхулл (1973)

Степень

МА рКА протониро-вания МА при рН7 3 [МА], мМ А z6 1См(0), мМ п

| Эфиры 6 g X g 1 в ТЕТР НОВ 8.59 9 06 0.95 0 98 04 02 0 0 0.08±0 02 0 8610 02 0 6±0.2 1 9±0.3 9 4

НОВА 9.42 0.99 0.3 0 0.90±0.05 2.3±0.4 6

ЛИД 8.19 0.89 4 0.158±0.010 0.64±0.05 (8±2)*10 5

X QX-314 - 1 4 0.342±0.012 0.61±0.13 (6±2)»10 10

< i ЭТ 8.11 0.87 1 0.08±0.02 0.б7±0.09 16±7 9

и. L30 9.00 0.98 5 0.2410.07 0.85±0.07 (15±4)*10 6

Среди третичных МА выделялся ТЕТР, алифатическая аминогруппа которого пересекает около 8% мембранного поля. Эту особенность действия ТЕТР можно объяснить, если предположить, что, находясь в канале, ТЕТР, в отличие от других МА, ориентирован алифатической аминогруппой в сторону наружного устья, вследствие чего во время блокирования его заряд пересекает только малую долю поля. Мы предполагаем, что инвертированная ориентация ТЕТР в канале может быть объяснена связыванием ароматического радикала ТЕТР в районе селективного фильтра. Причиной этого может являться бутильный заместитель парааминогруппы, который, принимая квазициклическую конформацию, в совокупности с ароматическим кольцом воспроизводит пространственную структуру высокоаффинных блокаторов NMDA-каналов (Kroemer et al., 1998) Это может обусловливать повышенное, по сравнению с другими МА, сродство ароматической части ТЕТР к участку связывания классических NMDA-блокаторов

Итак, установлено, что МА проникают внутрь ионной поры канала и преграждают проход для проникающих ионов. Рассмотрим, как это сказывается на работе воротного механизма канала и диссоциации комплекса канал-агонист Начнем с МА с медленной кинетикой блокирования

4. Кумулятивный характер блокады НОВ и НОВА. Как сказано выше, при повторном сочетанием применении АСП с НОВ или НОВА блокирование NMDA-тока возрастает При Еь = -100мВ, длительности импульсов 3.5 с и интервале между ними 0.5-2.0 минуты амплитуда пикового тока в ответ на первое, второе и третье сочетанное применение АСП с 300 мкМ НОВА составила 63±4%, 18±2%, 15 7±1 1% (п=7) от значения в контроле и

оставалась неизменной при последующих импульсах (рис 2) Сходная карп и на имела место при блокаде НОВ Кумулятивный характер блокады НОВ и НОВА указывает на то, что каналы, занятые этими МА, сохраняют способность закрываться, после чего агонжл может покинуть блокированный канал. В результате эго блокирующая частица оказывается закрытой в канале, как в ловушке (эффект "ловушки"). На примере НОВ была показана независимость эффекта «ловушки» от мембранного потенциала в диапазоне от -120 до -30 мВ.

Итак, установлено, что ЫМОА-каналы, блокированные НОВ или НОВА, могут закрываться с последующей диссоциацией комплекса канал-агонист. Далее описаны эксперименты, в которых исследовалась способность этих МА блокировать и покидать >1МОА-каналы в закрытом состоянии.

5. Взаимодействие МА с Ю4ВА-канапами в отсутствие агониста. На рис. 5а

показаны токовые ответы на применение АСП в контроле и в сочетании с 40 мкМ НОВ.

Рис. 5. Исследование способности НОВ

взаимодействовать с закрытыми ЫМОА-

каналами. а и б- токовые ответы на применение АСП в контроле и в сочетании с 40 мкМ НОВ. а - МА применялся одновременно с АСП, б -после контрольного воздействия АСП МА постоянно находился в омывающем клетку

растворе.

Видно, что при втором сочетанием применении АСП с НОВ блокада пика тока возрастала. На рис. 56 показаны токовые кривые, полученные в сходном эксперименте, однако на этот раз после контрольного воздействия АСП (первая токовая кривая) в омывающий клетку раствор добавлено 40 мкМ НОВ Через 0 5-2 0 минуты КМЛА-каналы были активированы АСП Несмотря на то, что НОВ находился в растворе до воздействия АСП, блокада пикового тока при первом импульсе АСП была слабой и возрастала при последующем импульсе, что указывает на необходимость активации ЫМОА-каналов агонисгом для блокады НОВ Сходная картина имела место при действии НОВА

Итак, НОВ и НОВА не могут блокировать КМЛА-каналы в отсутствие агониста На примере блокады НОВ мы проверили способность МА покидать каналы в отсутствие

агоииста В результате приведенных опытов мы не зафиксировали угенки НОВ из закрытых каналов в течение 3 мин после окончания сочетанного применения АСП с НОВ.

Заметим, что рассмотренные критерии взаимодействия блокаторов с каналами в отсутствие агоииста неприменимы для быстрых блокаторов, поэтому результаты сходных экспериментов с БЕНЗ, ТЕТР, ЭТ, ЛИД ()Х-314 и ЬЗО не могут рассматриваться как доказательство отсутствия взаимодействия этих МА с не активированными агонистом ЫМОА-каналами.

Итак, установлено, что (1) блокированные НОВ или НОВА ММОА-каналы могут закрываться, а агонист покидать центр связывания, (2) для блокирования и деблокирования >1МОА-каналов НОВ и НОВА необходима их активация агонистом Следовательно, в качестве исходной для описания действия НОВ и НОВА можно принять модель 1, где остается невыясненным вопрос о возможности десеиситизации занятого блокатором канала (Саав-Оаав переход). Этот вопрос, а также соответствие предсказаний модели 1 экспериментальным данным будут проверены ниже.

модель 1*

О О

«АА ¡ГААВ

Перейдем теперь к вопросу о влиянии закупорки ионной поры МА с быстрой кинетикой блокирования на работу воротного механизма ММОА-канала. Для исследования этого вопроса были использованы критерии, разработанные для быстрых блокаторов (8оЬо1еу&ку, КогЫеу, Ююёогоу, 1999, далее - вКК-критерии). При этом мы предполагали, что при Еь т -100 мВ, при котором проводились описанные ниже эксперименты, доминирующую роль играет взаимодействие ЛИД ЭТ, (}Х-314 и ЬЗО с участком связывания внутри поры канала, т.к. отрицательное мембранное поле способствует диффузии положительно заряженных молекул к нему. Тем не менее, необходимо принимать во внимание, что потенциал-независимая компонента блокады ММОА-каналов ксилидинами может оказывать влияние на некоторые параметры блокады МА.

Для выяснения действия МА с быстрой кинетикой блокады на закрывание и десенситизацию ММОА-каналов (Одав-Саав и Саав-Одав переходы) были исследованы кинетика восстановления тока после удаления блокатора в условиях продолжающегося воздействия агоииста и отношение плато/пик ММОА-тока в присутствии блокатора.

' С - закрытые состояния канала, индексы А я АА укатывают на связывание 1-ой и 2-ух молекул агоииста, индекс В - обозначает связывание блокатора, Оаа - дееенситкзировашюе состояние, 0**а -открытое проводящее состояние.

6. Кинетика восстановления тока после удаления МА в условиях продолжающегося воздействия АСП показана на рис. 3 В соответствии с БКК-критериями монотонный характер восстановления тока после удаления БЕНЗ, ТЕТР, ЛИД и ЭТ из среды свидетельствует о способности блокированных каналов закрываться и десенситизироваться В тоже время, овершут тока небольшой амплитуды, который возникал после прекращения действия ОХ-314, свидетельствует о снижении статистического веса десенситизированных каналов при блокаде этим МА

7. Отношение плато/пик ЫМПА-тока. На рис 66 показано отношение плато/пик 1ММЛА-тока в присутствии МА, нормированное к соответствующей величине в контроле, при различной степени подавления стационарного тока Видно, что при действии БЕНЗ, ТЕТР, ЛИД ЭТ и и 0 отношение плато/пик было ниже, чем в контроле, а при действии

0,0 0.2 0.4 о.в од

о5> о2 о,4 о!ё 0Г

1 -о«/и

1 воздействие

2 воздействие

ор оЗ 63 оя 6ДГ~ 10 100 1000 10000

1-0,,/и с1

Рис. 6. Влияние МА на отношение плато/пик №ЛОА-тока а - экспериментальные кривые, зарегистрированные в ответ на индивидуальное применение АСП (к) и первое и второе сочетанное применение АСП и 100 мкМ НОВ (кривые НОВ 1,2) б и в - отношение плато/пик ММОА-тока в присутствии МА (б) и предсказываемое моделью 1 (в, БоЬо1еузку « а1,1999), нормированное к соответствующей величине в контроле По оси абсцисс отложена степень подавления стационарного тока Для НОВ и НОВА отношение плато/пик определялось после насыщения кумулятивной блокады, г - результат компьютерного моделирования токовых ответов на стимуляцию ИМОА каналов агонистом в контроле (кривая к) и в присутствии "медленного" блокатора, действие которого описывается моделью 1 (кривые б) д и е - нормированное к соответствующей величине в контроле отношение плато/пик ММОА-тока, предсказываемое моделью 1, при различных степенях подавления стационарного тока (д) и константах скорости к] (е) в ответ на первое и второе применение агониста с блокатором. Степень подавления стационарного тока в е (1-1в8/1сз)=0.75 Расчеты сделаны при к! = 1000 М"'с"', к2 = 70 с"1 и [В] = 2.3К,!, Ь = 2 мкМ"1с"'и 12 = 25 с-1, а-200 с"1, Р - 10 с \ у 1.2 с"1, е-1.2 с1

ОХ-314 - не изменялось Согласно вКК-критериям »го свидетельствуег о возможности десенситизации каналов, занятых БЕНЗ, ТЕТР, ЛИД ЬЗО и ЭТ, и незначительном снижении статистического веса десенситизированного состояния при блокаде ()Х-314.

Однако сравнение данных компьютерного моделирования с полученными в экспериментах показало, что БЕНЗ, ТЕТР, ЭТ и 1Л0 снижают отношение плато/пик в большей степени, чем это предсказывается моделью (ср. рис 66,в) В рамках моделей блокады открытых каналов это может быть объяснено существованием медленной компоненты взаимодействия блокатора с каналом или усилением десенситизации канала, вызываемым блокатором. Первое предположение было проверено с помощью компьютерного моделирования. На рис. 6г показаны токи, предсказываемые моделью 1 при значении константы скорости распада комплекса кан&л-блокатор, кг - 70 с'1. Видно, что при медленной кинетике взаимодействия блокатора с каналом моделирование предсказывает кумулятивный характер блокады, причем при первом применении агониста с блокатором подавление стационарного тока действительно значительно превышает подавление пикового тока, однако при повторном воздействии отношение плато/пик становится близким к соответствующей величине в контроле. На рис. 6д видно, что эта закономерность имеет место при любой степени подавления стационарного тока. Рис. бе показывает, что при снижении константы скорости кг от 10000 до 25 с"1 отношение плато/пик 1ЧМОА-тока в ответ на первое применение агониста с блокатором уменьшается и при кг< 1000 с*1 становится существенно ниже единицы Однако при этом блокада становится кумулятивной (данные не приведены). При повторном применении агониста с блокатором (при котором в данном диапазоне значений кг кумулятивная блокада достигает насыщения) отношение плато/пик ЫМЛА-тока всегда близко к единице.

Таким образом, значительное снижение отношения плато/пик МКГОА-гока не может быть объяснено существованием медленной компоненты взаимодействия МА с каналами Остается второе предположение: блокада ИМЛА-каналов МА вызывает усиление десенситизации. Однако при проверке этой гипотезы мы столкнулись с необходимостью ввести дополнительные предположения (см. раздел 8).

Рассмотрим отношение плато/пик ЫМЛА-тока в присутствии НОВ и НОВА. Как видно из рис 66, после насыщения кумулятивной блокады эта величина была значительно ниже единицы В то же время моделирование ионных токов в присутствии медленного блокатора (рис. бг-е) предсказало, что при насыщении кумулятивной блокады отношение плато/пик, нормированное к контролю, должно быть близким к единице. Таким образом, как и в случае БЕНЗ, ТЕТР, ЭТ и ЬЗО, отношение плато/пик ММОА-тока в присутствии НОВ и НОВА даже после насыщения кумулятивной блокады было значительно ниже, чем это предсказывается

моделированием Как и в случае с быстрыми блокаторами, причиной этого может быть усиление десенситизации каналов, занятых МА, возможность чего будет обсуждаться в разделе 8.

Перейдем к рассмотрению влияния блокады МА на диссоциацию комплекса канап-агонист (Сдав-Сди-Св переходы) Для изучения этого вопроса были исследованы зависимость блокирующего действия МА от концентрации агониста, кинетика спада тока после удаления агониста из омывающего раствора в непрерывном присутствии блокатора и величина заряда, переносимого через каналы во время следовых токов.

& Зависимость блокирующего действия МА от концентрации агониста. Рассматриваемый критерий применим как для быстрых, так и для медленных блокаторов (ЭоЫЯеузку г* а!, 1999), что позволяет использовать его для проверки соответствия предсказаний модели 1 действию НОВ и НОВА. На рис. 7а показаны токовые кривые, зарегистрированные в ответ на индивидуальное применение АСП в различных концентрациях и в сочетании с 250 мкМ ТЕТР. На рис 76 показаны средние значения степени подавления стационарного тока МА (1-1в«/1сз) в зависимости от концентрации АСП

3.7 м«М

АСГН0.25шМ ТЕТР 11 мкМ ЗЗмхМ

100 мкМ

ГГ

0,8

_р 0,6 J

-1 0,3

0,0

0,9 _Р 0.8

5»

0,3 0,0

-БЕНЗ -НОВ

АСП.МкМ

—Д—"IETP -О-НОВА

АСПмМ

100

0,8

0,3

0,0

0,9

0,8

0.3

0,0

-ЛИД -QX-314

10 .„г, 100

-ЭТ

К.

Рис. 7. Зависимость степени подавления ионных токов через KMDA-каналы МА от концентрации агониста. а - токи в ответ на

индивидуальное применение АСП в различных концентрациях (кривые к) и в сочетании с

250 мкМ ТЕТР (кривые б), б -средние значения степени подавления стационарного тока МА (1-WIcs) в зависимости от концентрации АСП.

10 100 АСПдшМ

Степень подавления стационарного тока БЕНЗ, НОВ НОВА, ТЕТР и ЭТ не зависела от концентрацииагониста(р = 0 24,0.31,0 13,0 5 и 0 11, соответственно) Блокирование ЛИД и ОХ-314 ослаблялось при возрастании концентрации АСП (р = ЗЧО"4 и 8*104, соответственно). Согласно вКК-критериям независимость блокады большинством применявшихся МА от концентрации агониста свидетельствует о том, что эти соединения не только не препятствуют агонисту покинуть блокированный канал, но и не влияют на работу воротного механизма. Снижение эффективности блокады ЛИД и ОХ-314 при увеличении концентрации агониста свидетельствует об уменьшении удельного веса десенсктизированного состояния блокированных каналов

Раннее было показано, что отношение плато/пик ММОА-тока в присутствии БЕНЗ, ТЕТР, ЭТ и ЬЗО, а также НОВ и НОВА (после насыщения кумулятивной блокады) значительно ниже единицы. Указанная особенность 1<1Ш)А-токов может быть объяснена усилением десенситизации канала, вызванным блокэтором. Однако, как отмечают БоЫЯеузку е1 а1. (1999), в этом случае эффективность блокирования должна возрастать при увеличении концентрации агониста. В действительности этого не наблюдалось при действии БЕНЗ, ТЕТР, ЭТ, ЬЗО, НОВ и НОВА Следует учесть, что эффективность блокады соединением, которое понижает сродство агониста к каналу или вероятность нахождения последнего в закрытом связанном с агонистом состоянии (Сллв), должна убывать при увеличении концентрации агониста. Поэтому независимость блокады от концентрации агониста соединением, усиливающим десенситизацию каналов, теоретически возможна, однако в этом случае действие блокатора на десенситизацию и закрывание канала или распад комплекса канал-агонист должны в точности компенсировать друг друга, что представляется маловероятным

Таким образом, модели блокатора открытых каналов, обладающего медленной кинетикой связывания (раздел 7) или усиливающего десенситизацию каналов (раздел 8), не описывают снижение отношения плато/пик ЫМОА-тока, которое наблюдалось при блокаде БЕНЗ, НОВ, НОВА ТЕТР, ЬЗО, и ЭТ На этом основании мы заключили, что указанное явление вызвано не блокадой ионной поры канала, а некоторым иным, пока не идентифицированным механизмом. Снижение отношения плато/пик тока в присутствии МА может бьпъ обусловлено существованием второго - модулирующего участка связывания МА, взаимодействие с которым не блокирует канал Однако этот вопрос требует дальнейшего изучения.

9. Кинетика деактивации тока после удаления агониста в непрерывном 'присутствии блокатора. Исследование этого процесса показало, что ни одно из соединений не влияет на кинетику деактивации ММОА-тока. В соответствии с БКК-

критериями это указывает на то, что ни один из МА с быстрой кинетикой блокады не препятствует диссоциации комплекса канап-агонист.

10. Величина юряАа, переносимого во время следовых токов после удаления агониста и МА и1 среды (0. Величина С? измерялась интегрированием площади между токовой кривой и осью абсцисс от момента прекращения воздействия АСП и МА и до полного исчезновения тока, после чего нормировалась на соответствующую величину в контроле (рис 8а) Величина 0 была больше единицы при действии <ЗХ-314, приближенно равна единице при действии ЛИД и ЭТ, и меньше единицы при действии остальных соединений (рис 86) Согласно вКК-критериям это свидетельствует о замедлении распада комплекса канал-агонист при блокаде <ЗХ-314, ЛИД и ЭТ и об отсутствии влияния остальных МА на кинетику этого процесса.

0,2 0,4 0.6 0,8

М'м/'с.)

Рис. 8. Величина заряда, переносимого во время деактивации КМОА-тока после одновременного удаления агониста и МА из раствора (Ов), нормированная к

соответствующей величине в контроле (Ос). По оси абсцисс в б отложена степень

подавления

стационарного тока.

Последние три критерия свидетельствуют о том, что большинство МА не нарушают работу воротного механизма ЫМОА-канала Исключение составляет <ЗХ-314 и ЛИД ослабление блокады которыми при увеличении концентрации агониста свидетельствует о том, что блокада этими МА может препятствовать десенситизации КМОА-каналов Данные о влиянии (}Х-314 и ЛИД на диссоциацию комплекса канал-агонист противоречивы С одной стороны, кинетика спада ММОА-тока после удаления АСП в присутствии этих МА свидетельствует о том, что блокада (}Х-314 и ЛИД не препятствует агонисту покинуть канал С другой стороны, величина 0 свидетельствует об обратном Кроме того, этот же критерий указывает на затруднение диссоциации комплекса канал-агонист в случае действия ЭТ

Выявленные противоречия между выводами, сделанными на основе различных критериев, могут быть связаны с существованием потенциал-независимого механизма блокады ксилидинами, который может маскировать овершут тока после удаления ЛИД из среды в продолжающемся присутствии агониста (рис 3), а также сказываться на отношении плато/пик КМОА-тока (рис 6) и виде агонистзависимосги (рис 7) Кроме того, потенциал-

независимый механизм блокады ксилидинами может маскировать запаздывание деактивации ЫМОА-тока после удаления агониста из среды в продолжающемся присутствии блокатора (раздел 9) Это, с одной стороны, может объяснить наблюдаемые противоречия, с другой стороны, говорит о ненадежности применения вышеуказанных критериев для анализа блокады ксилидинами Ситуация была частично прояснена с помощью следующего критерия

11. Кинетика следовых токов после одновременного прекращения воздействия АСП и МА описана в разделе 1 (рис 2, вставки) Согласно ЙКК-критериям задержка деактивации >ГМОА-тока после применения ЛИД и (}Х-314 свидетельствует о том, что эти МА нарушают работу воротного механизма Поскольку возникновение кратковременного увеличения тока после окончания применения агониста и блокатора и задержка деактивации тока обусловлены исключительно взаимодействием блокатора с участком связывания внутри ионной поры канала, рассматриваемый критерий позволяет достоверно утверждать, что, находясь в канале, ЛИД и ОХ-314 нарушают работу воротного механизма

Отсутствие задержки деактивации КМОА-тока после действия ЭТ, ЬЗО, ТЕТР и БЕНЗ может свидетельствовать о том, что блокада этими соединениями не изменяет протекание воротных процессов Однако запаздывание деактивации тока при действии ЬЗО и ЭТ может быть замаскировано потенциал-независимой компонентой блокады этими соединениями Тем не менее, то, что практически ни один из критериев не показал, что блокада ЬЗО и ЭТ препятствует закрыванию, десенситизации канала и распаду комплекса канал-агонист, свидетельствует о сохранении нормальной работы воротного механизма при блокаде этими МА

Обобщая результаты анализа влияния блокады ионной поры ИМЛА-каналов МА на работу воротного механизма, можно заключить, что большинство применявшихся соединений не препятствует работе воротного механизма и диссоциации комплекса канал-агонист (модель 1). Исключение составляют ЛИД и ОХ-314, блокада которыми затрудняет десенситизашло канала и/или распад комплекса канал-агонист, однако установить это точно не представляется возможным, поскольку выводы, сделанные на основе отдельных критериев, могут искажаться потенциал-независимой компонентой блокады этими МА

/2 Связь структуры и активности МА. Чтобы исключить вклад мембранного поля в изменение свободной энергии блокирующих частиц при проникновении внутрь канала, для оценки К<1 МА были использованы 1Сзо, оцененные при Еь = 0 мВ (1Ся(0), Табл 3) Кроме того, для большинства МА значение коэффициента Хнпла было отличным от единицы, что свидетельствует о существовании неблокирующих участков связывания МА Поэтому в

значение 1С»(0) была внесена поправка, рассчитанная по формуле Ки=1Ся)(0)*(2р',-1)'1, учитывающая взаимодействие МА с неблокирующими участками связывания (Табл 4) Анализ значений Ю показал, что

1) НОВ и БЕЮ имеют приблизительно ™л"ц* 4" Значения величин Р и равные значения К<), которые на два порядка оценка ^ МА ниже К<| тетразтиламмония На основании этого сделан вывод, что решающую роль непосредственно во взаимодействии МА с их участком связывания в ММОА-канале играет ароматический радикал, а заряд аминогруппы способствует диффузии молекул МА к их участку связывания внутри канала при отрицательных мембранных потенциалах, однако в связывании, по всей видимости, не принимает участия.

2) К<1 аминобензоатов (НОВ, НОВА, БЕНЗ, ТЕТР) на о дин-два порядка превосходят Ка ксилидинов (ЛИД, ЭТ, ОХ-314 и ЬЗО). Это может быть объяснено существованием у ксилидииов метальных групп в ортоположенин бензольного кольца, которые ограничивают ориентацию карбонильного атома кислорода перпендикулярно плоскости бензольного кольца, что препятствует тесному контакту ароматического радикала с участком связывания МА в КМЛА-канале, и, таким образом, подтверждает его важную роль во взаимодействии МА с ММОА-каналами.

3) К<| ЛИД в 3 раза превосходит К^ ЭТ, который имеет большее алкильное окружение вокруг концевого атома азота На этом основании сделан вывод о существовании гидрофобного взаимодействия между алкильными цепями алифатической аминогруппы МА и участком связывания МА в канале

4) В отличие от того, что имеет место при блокаде N8'-каналов, в случае блокады КМОА-каналов К<| НОВ и НОВА различались незначительно Это указывает на отсутствие специфического взаимодействия между полярной (амидной или эфирной) связью и участком связывания МА в ЫМОА-к&нале.

МА 1С5о(0), мМ Р КдмМ

ТЕТР 0 6±0 2 1.21 0.910.3

БЕНЗ 1 31±0 05 0.72 0 73±0 03

НОВ 1 9±0.3 0.88 1.5Ю.2

НОВА 2 3±0 4 0.99 2.3±0.4

ЛИД (8±2)*10 1.2 (12±3)»10

ОХ-314 (6±2)*10 1.16 (8±3)*10

ЬЗО (15±5)*10 1.17 (21±7)*10

ЭТ 16±7 1.43 (4±2)*10

ВЫВОДЫ

1. Методом "пэтч-кламп" в конфигурации "целая клетка" установлено, что при наружном воздействии на пирамидные нейроны гиппокампа крысы местные анестетики и их структурные производные (бензокаин, тетракаин, новокаин, этидокаин, лидокаин, новокаинамид, ЬЗО и ОХ-314) блокируют ионные токи через 1>1МОА-каналы в диапазоне концентраций 10 мкМ - 10 мМ

2 Механизмом блокады протонируемыми МА и постоянно заряженным ()Х-314 является закупорка ионной поры канала. При этом протонируемая (или постоянно заряженная в случае (}Х-314) группировка большинства МА проникает глубоко в ионную пору канала и располагается вблизи селективного фильтра Исключение составляет ТЕТР, протонируемая аминогруппа которого при блокаде ШЛ)А-каналов остается близко к наружному краю мембранного поля.

3. Закупорка ионной поры ЫМОА-каналов МА не нарушает нормальной работы воротного механизма канала и диссоциации комплекса каиал-агонист. Исключение составляют ОХ-314 и ЛИД, которые в некоторой степени препятствуют десеноггизации канала и/или распаду комплекса канал-агонист

4 Ведущую роль непосредственно во взаимодействии МА с их участком связывания внутри ЫМОА-канала играет ароматический радикал этих соединений. Кроме того, существует более слабое гидрофобное взаимодействие между алкильными цепями алифатической аминогруппы МА и участком связывания этих соединений в канале. Заряд аминогруппы способствует диффузии молекул МА к их участку связывания внутри канала при отрицательных мембранных потенциалах, однако его вклад непосредственно во взаимодействие МА с участком связывания мал. И, наконец, в отличие от того, что имеет место при блокаде Ыа1-каналов, взаимодействие МА с ЬТМОА-каналами слабо зависит от типа полярной (амидной или эфирной) связи промежуточной цепи

5 Зависимость блокады ЫМОА-каналов протонируемыми МА и постоянно заряженным (}Х-314 от мембранного потенциала является результатом непосредственного взаимодействия между зарядом блокатора и электрическим полем мембраны, а не связана с изменением свойств канала при сдвиге мембранного потенциала

6. Наряду с блокирующим участком внутри ионной поры канала, МА ксилидинового ряда (ЛИД, ЭТ, ОХ-314 и ЬЗО) имеют второй блокирующий участок, расположенный вне мембранного поля.

7. Сравнение величин 1С» МА при блокаде N8'- и ЫМБА-каналов показывает, что в условиях клинического применения некоторых МА (НОВ, БЕНЗ и НОВА) следует учитывать возможность побочной блокады ММОА-каналов

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1 Колесникова Т В , Кошелев С Г, Ходоров Б И Механизмы блокады NMDA-каналов местными анестетиками //Биологические мембраны 2005 -Том 22 №6 С 451-475

2 Kolesnikova Т V , Koshelev S G, Khodorov В I Local anesthetics as a tool for the study of biophysical properties of NMDA channels Proceedings of Young Physiologists Symposium -September8-9, 2002 -Leeds. UK -P 11

3 Колесникова T В , Ходоров Б И Действие местных анестетиков на ионные токи через NMDA-каналы нейронов гиппокампа крысы // Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук XLIV научная конференция московского физико-технического института Труды конференции Часть IV 23-30 ноября 2001 г - Москва-Долгопрудный - С.32.

4 Kolesnikova Т V Criterion for the Blocker Interaction with Closed NMDA Channels. // 8"" International Dahlem Symposium "Cellular Signal Recognition and Transduction", Proc. June 1821,2003. - Berlin, Germany -P.02

5 Kolesnikova T, Khodorov В Local Anesthetics May Help to Disclose Structural Properties of the NMDA Receptor Ion Pore // Transport Mechanism Across Cell Membranes' Channels and Pumps Proceedings International workshop in cell Physiology 13-17 October, 2004. - St. Petersburg, Russia. - P 38.

6 Колесникова T В, Ходоров Б И Местные анестетики помогают охарактеризовать структурные особенности ионной поры НМДА канала // Третий Российский Конгресс по Патофизиологии. Тез докл 9-12 ноября2004 г.-М.-С 139-140.

7 Колесникова Т В, Ходоров Б И Местные анестетики помогают охарактеризовать биофизические свойства ионной поры НМДА канала // Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук XLVII научная конференция московского физико-технического института Труды конференции Часть IV 26-27 ноября 2004 г - Москва-Долгопрудный - С.95

Колесникова Татьяна Валерьяновна

Блокада Ы№ГОА-каналов пирамидных нейронов гиппокампа крысы местными анестетиками и их производными

Изд. лиц. ИД №05403 от 16.07.2001. Подписано в печать 21.10.2005 Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 70 экз. Заказ №ф-513

Московский физико-технический институт (государственный университет) Отдел автоматизированных издательских систем «ФИЗТЕХ-ПОЛИГРАФ» 141700, Московская обл., г.Долгопрудный, Институтский пер., 9

»2T894

РНБ Русский фонд

2006-4 18980

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Колесникова, Татьяна Валерьяновна

СОДЕРЖАНИЕ.

ОСНОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ЫМЭА-КАНАЛЫ.

СТРУКТУРА.

ПРИНЦИПЫ РАБОТЫ ЫМИА-КАНАЛОВ.

БЛОКА ТОРЫ ЫМЭА-КАНАЛОВ.

МОДУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ЯША-КАНАЛОВ.

БЛОКАТОРЫ КАК ИНСТРУМЕНТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ИОННЫХ

КАНАЛОВ.

МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ БЛОКАТОРОВ

ОТКРЫТЫХ ЫМЭА-КАНАЛОВ.

МЕСТНЫЕ АНЕСТЕТИКИ.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МА.

ДЕЙСТВИЕ МА НА Ыа-КАНАЛЫ.

ТЕОРИИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МА С Ыа -КАНАЛАМИ.

СВЯЗЬ СТРУКТУРЫ МА И ИХ БЛОКИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ.

ДЕЙСТВИЕ МА НА ИМБА-КАНАЛЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ВЫДЕЛЕНИЕ ПИРАМИДНЫХ НЕЙРОНОВ ГИППОКАМПА.

РАСТВОРЫ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ УСТАНОВКА.

РЕГИСТРАЦИЯ ТОКОВ.

ОБРАБОТКА ДАННЫХ И МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

АКТИВАЦИЯ ЫМРА-КАНАЛОВ.

БЛОКАДА ^ОА-КАНАЛОВ МА.

НОВОКАИН.

НОВОКАИНАМИД.

ТЕТРАКАИН.

БЕНЗОКАИН.

ЛИДОКАИН. дх-314.

ЭТИДОКАИН.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

БЛОКАДА ^ОА-КАНАЛОВ МА.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БЛОКАДЫ Ыа+- И ЫМЭА-КАНАЛОВ.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Блокада NMDA-каналов пирамидных нейронов гиппокампа крысы местными анестетиками и их производными"

1987; Lester et al., 1990), относительно высокой проницаемостью для ионов Ca (MacDermott et al., 1986). Эти и другие свойства NMDA-каналов лежат в основе формирования нервной системы на эмбриональной стадии, памяти и способности к обучению (Bliss and Collingridge, 1993; Asztely and Gustafsson, 1996; Kulimann et al., 2000), а также патогенеза болезней Паркинсона, Альцгеймера, ишемической болезни мозга, эпилепсии и др. (Doble, 1999; Arundine and Tymianski, 2004; Hynd et al., 2004; Rho, 2004).

Существенный прогресс, достигнутый за последнее время в развитии методов молекулярной биологии и биохимии, позволил установить субъединичный состав, первичную структуру, трансмембранную топологию полипептидной цепи и.т.д. (см. обзоры Dingledine et al., 1999; Mayer and Armstrong, 2004; Wollmuth and Sobolevsky, 2004). Однако вышеперечисленные методы не позволяют определить трехмерное строение NMDA-каналов и конформационпые перестройки, лежащие в основе изменения их проводимости. На эти вопросы может ответить кристаллография. Однако ионные каналы представляют собой крупные трансмембранные белки со сложной укладкой полипептидной цепи, что на данный момент вызывает трудности при кристаллизации большинства типов ионных каналов.

Опыт исследований блокады ионных каналов различными соединениями показал, что результаты таких работ являются ценным источником информации о самих каналах (Hille, 2001). На протяжении ряда лет этот подход используется в работах нашего коллектива для изучения свойств NMDA-каналов (Кошелев и Ходоров, 1992, 1995; Sobolevsky et al, 1999а). Значительным шагом вперед стала разработка критериев, позволяющих расшифровать эффект быстрых блокаторов на работу воротного механизма NMDA-канала (Sobolevsky et al., 1999а, b). Экспериментальное исследование блокады NMDA-каналов тетраалкиламмониевыми соединениями в сочетании с компьютерным моделированием позволило установить, что закрытие и десенситизация связаны с различными структурами в канале. Кроме того, были оценены вероятность открывания канала, его диаметр в открытом состоянии на уровне активациопных ворот и др. (Sobolevsky et al., 1999а).

Настоящая работа является продолжением проводимых в лаборатории исследований. В качестве новых инструментов изучения биофизических свойств и функциональной архитектуры NMDA-каналов в ней использованы местные анестетики и их производные (МА). В отличие от ранее применявшихся блокаторов, большинство МА содержит три функциональные группировки: ароматическое кольцо, третичную аминогруппу и полярную (амидную или эфирную) связь. рКа аминогруппы этих соединений лежит в диапазоне 8.1^-9.4 (Strichartz et al., 1990), поэтому при физиологических pH МА находятся преимущественно в заряженной форме. Такое строение обусловливает амфифильные свойства этих соединений.

МА широко применяются в медицине для местной, спинальной и других видов анестезии. Основной мишенью действия МА считаются потенциалуправляемые №+-каналы. Однако действие МА на другие типы ионных каналов может обусловливать нежелательные побочные эффекты, поэтому изучение действия МА на NMDA-каналы представляет не только теоретический, но и огромный практический интерес. В первую очередь, потенциальную опасность может представлять блокада NMDA-каналов при спинальной анестезии, т.к. этот тип каналов важен для правильной работы центральной нервной системы, а применение антагонистов NMDA-каналов нередко вызывает тяжелые побочные эффекты, такие как нарушение памяти, внимания, двигательной координации и прочее (White and Ryan, 1996; Lees, 1997; Abi-Saab et al., 1998). С другой стороны, NMDA-каналы принимают участие в механизмах потенциации болевой чувствительности, в центральной нервной системе и на периферии (Petrenko et al., 2003, обзор), что может обусловливать преимущества применения в клинической практике МА с блокирующим действием на NMDA-каналы. Таким образом, с блокадой NMDA-каналов при анестезии могут быть сопряжены как отрицательные, так и положительные эффекты, что определяет необходимость исследования действия МА на NMDA-каналы.

Задачи исследования:

1) В опытах па свежеизолированных нейронах зоны CAI гиппокампа крысы с помощью метода "пэтч-кламп" (patch-clamp) в конфигурации "целая клетка" изучить зависимость действия МА от: (а) их концентрации и длительности действия; (б) концентрации агониста; (в) мембранного потенциала, (г) состояния воротного механизма канала.

2) На основании полученных данных выяснить, является ли уменьшение амплитуды тока через NMDA-каналы в присутствии МА результатом закупорки ионной поры канала или следствием аллостерического влияния Fia работу воротного механизма.

3) Оценить в долях мембранного потенциала глубину расположения связывающих участков МА в ЫМОА-канале.

4) Используя математическое моделирование ионных токов через ЫМОА-каналы, определить влияние МА на работу воротного механизма ЫМОА-канала.

5) С помощью сравнительного анализа сродства различных МА к ЫМОА-каналу оценить вклад функциональных группировок этих соединений в связывание.

6) Используя собственные и литературные данные, провести сравнительный анализ блокады и NMDA-кaнaлoв МА.

Научная новизна:

Впервые проведено систематическое изучение действия пяти местных анестетиков (новокаин (НОВ), бензокаин (БЕНЗ), тетракаин (ТЕТР), лидокаин (ЛИД), этидокаин (ЭТ)) и трех их производных (новокаинамид (НОВА), (}Х-314 и ЬЗО) на ионные токи через NMDA-каналы механически изолированных пирамидных нейронов гиппокампа крысы.

Изучена зависимость блокады ЫМОА-каналов этими соединениями от их концентрации, концентрации агониста и мембранного потенциала.

Показано, что подавление ионных токов через ЫМОА-каналы протонируемыми МА и постоянно заряженным (}Х-314 является результатом закупорки ионной поры канала. Оценена глубина проникновения в канал протонируемой аминогруппы третичных МА и постоянно заряженной аммониевой группы четвертичного (}Х-314. Наряду с этим показано существование потенциал-независимого механизма блокады у МА ксилидинового ряда.

Изучена кинетика взаимодействия МА с ЫМОА-каналами и проанализированы структурные факторы, определяющие ее.

Проанализировано влияние блокады ионной поры ЫМОА-канала МА на работу воротного механизма.

Проведен систематический анализ связи эффективности блокады NMDA-кaнaлoв МА с их структурой. Оценен вклад заряженных, полярных и гидрофобных группировок во взаимодействие МА с ЫМОА-каналами.

Научно-практическая ценность. Блокаторы ЫМОА-каналов считаются перспективными терапевтическими агентами для лечения нейродегенеративных заболеваний, однако введение этих средств в медицинскую практику на текущий момент существенно ограничивается серьезными осложнениями, которые вызывают многие из них. Анализ этих явлений показывает, что безопасность применения блокаторов ЫМОА-каналов зависит от их аффинности, кинетики блокады и взаимодействия с воротным механизмом канала (Кода\Уз1а, 2000). Поэтому выявленные в данной работе закономерности блокирующего действия МА на

NMDA-кaнaлы и их связь со структурой этих соединений могут быть использованы в дальнейшем для направленного синтеза новых лекарственных препаратов, мишенью действия которых являются NMDA-кaнaлы.

Практическая значимость исследования действия МА на ЫМОА-каналы определяется широким применением этих соединений в медицине для местной, спинальной и других видов анестезии. При этом с побочным действием МА на NMDA-кaнaлы могут быть ассоциированы как положительные (предотвращение сенситизации болевой чувствительности), так и отрицательные (характерные для многих блокаторов ЫМОА-каналов) эффекты применения анестетиков. Полученная информация о действии МА на NMDA-кaнaлы может быть использована в дальнейшем для анализа этих явлений и создания усовершенствованных средств для контроля над болевой чувствительностью.

Диссертационная работа состоит из введения и пяти глав, включая литературный обзор. В первой из них дан обзор данных о строении и принципах работы ЫМОА-каналов, действии МА на №+-каналы и исследований ионных каналов, в которых в качестве инструментов были применены блокаторы. Кроме того, описано математическое моделирование действия блокаторов открытых ЫМОА-каналов. Во втором разделе даны материалы и методы, применявшиеся в работе. Третий раздел содержит результаты исследования действия МА на ионные токи через NMDA-кaнaлы. В четвертом разделе проводится обсуждение полученных результатов. Сделанные по результатам работы выводы приведены в пятом разделе. Работа завершается библиографическим списком, состоящим из 291 источника. Диссертационная работа содержит 6 таблиц и 64 рисунка.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Колесникова, Татьяна Валерьяновна

выводы

1. Методом "пэтч-кламп" в конфигурации "целая клетка" установлено, что при наружном воздействии на пирамидные нейроны гиппокампа крысы местные анестетики и их структурные производные (бензокаин, тетракаин, новокаин, этидокаин, лидокаин, новокаинамид, ЬЗО и (}Х-314) блокируют ионные токи через ЫМОА-каналы в диапазоне концентраций 10 мкМ - 10 мМ.

2. Механизмом блокады протонируемыми МА и постоянно заряженным (}Х-314 является закупорка ионной поры канала. При этом протонируемая (или постоянно заряженная в случае (2Х-314) группировка большинства МА проникает глубоко в ионную пору канала и располагается вблизи селективного фильтра. Исключение составляет ТЕТР, протонируемая аминогруппа которого при блокаде ЫМОА-каналов остается близко к наружному краю мембранного поля.

3. Закупорка ионной поры ЫМОА-каналов МА не нарушает нормальной работы воротного механизма канала и диссоциации комплекса канал-агонист. Исключение составляют (2Х-314 и ЛИД, которые в некоторой степени препятствуют десенситизации канала и/или распаду комплекса канал-агонист.

4. Ведущую роль непосредственно во взаимодействии МА с их участком связывания внутри ЫМЭА-канала играет ароматический радикал этих соединений. Кроме того, существует более слабое гидрофобное взаимодействие между алкильными цепями алифатической аминогруппы МА и участком связывания этих соединений в канале. Заряд аминогруппы способствует диффузии молекул МА к их участку связывания внутри канала при отрицательных мембранных потенциалах, однако его вклад непосредственно во взаимодействие МА с участком связывания мал. И, наконец, в отличие от того, что имеет место при блокаде Ыа+-каналов, взаимодействие МА с ЫМОА-каналами слабо зависит от типа полярной (амидной или эфирной) связи промежуточной цепи.

5. Зависимость блокады ЫМОА-каналов протонируемыми МА и постоянно заряженным (}Х-314 от мембранного потенциала является результатом непосредственного взаимодействия между зарядом блокатора и электрическим полем мембраны, а не связана с изменением свойств канала при сдвиге мембранного потенциала.

7. Сравнение величин 1С50 МА при блокаде Ыа+- и ЫМОА-каналов показывает, что в условиях клинического применения некоторых МА (НОВ, БЕНЗ и НОВА) следует учитывать возможность побочной блокады ЫМОА-каналов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает сердечную благодарность своему научному руководителю профессору, доктору медицинских наук Борису Израилевичу Ходорову, без грамотного руководства и чуткого отношения которого выполнение работы было бы невозможно.

Также хотелось бы поблагодарить Сергея Геннадьевича Кошелева за ценные дискуссии, в ходе которых выкристаллизовывались основные идеи работы; а также ценные методические рекомендации и любезно предоставленные компьютерные программы для регистрации ионных токов через каналы, обработки экспериментальных данных и кинетического моделирования.

Отдельная благодарность Марии Елшанской и Евгению Резнику за терпение и помощь в освоении автором методики локальной фиксации потенциала.

Кроме того, хочу поблагодарить всех сотрудников лаборатории патологии ионного транспорта и внутриклеточной сигнализации НИИ ОПП РАМН за теплый климат в коллективе и постоянную поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Колесникова, Татьяна Валерьяновна, Москва

1. Кошелев С.Г., Ходоров Б.И. (1992) Тетраэтиламмоний и тетрабутиламмоний как инструменты исследования NMDA-каналов нейрональной мембраны. Биологические мембраны 6(10-11):1365-1369.

2. Кошелев С.Г. (1995) Блокада NMDA-каналов пирамидных нейронов гиппокампа органическими катионами. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва.

3. Кошелев С.Г., Ходоров Б.И. (1995) Тетрабутиламмоний, такрин и 9-аминоакридин, блокируя открытые каналы NMDA-каналы, препятствуют их закрыванию и десенситизации. Биологические мембраны 12(1):89-104.

4. Магазаник Л.Г., Антонов С.М., Лукомская Н., Потапьева H.H., Гмиро В.Е., Джонсон И.В. (1994). Блокада глутаминэргических и холинэргических ионных каналов производными адамантана. Физиологический Журнал им. И.М. Сеченова 80(7):99-112.

5. Негуляев, И. А., Носырева, Е. Д., 1979. Сравнительное исследование действия новокаина и бенззокаина на нормальные и модифицированные аконитином натриевые каналы. Цитология 21 (6):697-702.

6. Резник Е.В. Полиамины как инструменты исследования биофизических и хеморецептивных свойств НМДА рецепторов. Дипломная работа. Москва: Московский физико-технический институт (Государственный университет), 2003.

7. Соболевский А.И. Блокаторы как инструменты исследования биофизических свойств НМДА каналов: Дис. . к-та физико-математических наук. Москва: Московский физико-технический институт (Государственный университет), 1999. С. 122.

8. Соболевский А.И., Ходоров Б.И. (2000) Исследование функциональной архитектуры NMDA-канал рецепторного комплекса с помощью блокаторов. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова 86(9): 1118-1137.

9. Ходоров Б.И., Шишкова Л.Д., Пегаиов Э.М. (1974) Эффект новокаина и ионов Са2+на медленную иннактивацию натриевых каналов перехвата Ранвье нервного волокна лягушки. Бюл. Экспер. Биол. №3:10-14.

10. Ходоров Б.И. (1990) Аллостерическое взаимодействие между ВТХ-рецептором и другими рецепторами №+-каналов. В «Природные нейротоксины активаторы натриевых каналов возбудимых мембран нервных и мышечных клеток», Итоги науки и техники, том 44, стр. 123-133.

11. Ходоров Б.И. (1992) Медленная инактивация и блокада натриевых каналов возбудимой мембраны химическими соединениями. Пат. Физиол. и эксперим. терапия. № 4, стр. 24-30.

12. Abi-Saab W.M., D'Souza B.C., Moghaddam В., Krystal J.H. (1998) The NMDA antagonist model for schizophrenia: promise and pitfalls. Pharmacopsychiatry 31. Suppl 2.:104-109.

13. Amato A, Ballerini L and Attwell D (1994) Intracellular pH changes produced by glutamate uptake in rat hippocampal slices. J Neurophysiol 72:1686-1696.

14. Anis NA, Berry SC, Burton NR, Lodge D. (1983). The dissociative anaesthetics, ketamine and phencyclidine, selectively reduce excitation of central mammalian neurones by N-methyl-aspartate. Br J Pharmacol 79(2):565-575.

15. Anson LC, Chen PE, Wyllie DJA, Colquhoun D and Schoepfer R. (1998) Identification of amino acid residues of the NR2A subunit that control glutamate potency in recombinant NR1/NR2A NMDA receptors. J Neurosci 18:581-589.

16. Antonov SM, Johnson JW, Lukomskaya NY, Potapyeva NN, Gmiro VE, Magazanik LG. (1995). Novel adamantane derivatives act as blockers of open ligand-gated channels and as anticonvulsants. Mol Pharmacol. 47(3):558-67.

17. Antonov, S.M., Johnson, J.W. 1996. Voltage-dependent interaction of open-channel blocking molecules with gating of NMDA receptors in rat cortical neurons. J. Physiol. 493.2:425-445.

18. Antonov, S. M., Gmiro, V. E., Johnson, J. W. 1998. Binding sites for permeant ions in the channel ofNMDA receptors and their effects on channel block. Nat. Neuroscie. 1(6): 451-461.

19. Antonov, S.M, Johnson, J.W. 1999. Permeant ion regulation of N-methyl-D-aspartate receptor channel block by Mg2+. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(25):14571-14576.

20. Araneda RC, Zukin RS, Bennett MV. (1993) Effects of polyamines on NMDA-induced currents in rat hippocampal neurons: a whole-cell and single-channel study. Neurosci Lett. 152(1-2):107-112.

21. Araneda RC, Lan JY, Zheng X, Zukin RS, Bennett MV. (1999) Spermine and arcaine block and permeate N-methyl-D-aspartate receptor channels. Biophys J. 76(6):2899-911.

22. Armstrong CM. (1966) Time course of TEA(+)-induced anomalous rectification in squid giant axons. J Gen Physiol. 50(2):491-503.

23. Armstrong CM (1969) Inactivation of the potassium conductance and related phenomena caused by quaternary ammonium ion injection in squid axons. J Gen Physiol. 54(5):553-75.

24. Armstrong CM (1971) Interaction of tetraethylammonium ion derivatives with the potassium channels of giant axons. J Gen Physiol. 58(4):413-37.

25. Armstrong CM, Bezanilla F, Rojas E. (1973) Destruction of sodium conductance inactivation in squid axons perfused with pronase. J Gen Physiol. 62(4):375-91.

26. Armstrong N, Sun Y, Chen GQ, Gouaux E. (1998). Structure of a glutamate-receptor ligand-binding core in complex with kainate. Nature 395:913-17.

27. Armstrong N and Gouaux E (2000) Mechanisms for Activation and Antagonism of an AMPA-Sensitive Glutamate Receptor: Crystal Structures of the GluR2 Ligand Binding Core1. Neuron 28: 165-181.

28. Arundine M, Tymianski M. (2004) Molecular mechanisms of glutamate-dependent neurodegeneration in ischemia and traumatic brain injury. Cell Mol Life Sci. 61(6):657-68.

29. Ascher P, Bregestovski P, Nowak L. (1988) N-methyl-D-aspartate-activated channels of mouse central neurones in magnesium-free solutions. J Physiol. 399:207-26.

30. Ascher P, Nowak L. (1988) The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurones in culture. J Physiol. 399:247-66.

31. Asztely F, Gustafsson B. (1996) Ionotropic glutamate receptors. Their possible role in the expression of hippocampal synaptic plasticity. Mol Neurobiol. 12(1): 1-11.

32. Ayalon G, Stern-Bach Y. 2001. Functional assembly of AMPA and kainate receptors is mediated by several discrete proteinprotein interactions. Neuron 31:103-13.

33. Banke T.G., Traynelis S.F. (2003) Activation of NR1/NR2B NMDA receptors. Nature Neuroscience 6, 144- 152.

34. Banke TG, Dravid SM, Traynelis SF. (2005) Protons trap NR1/NR2B NMDA receptors in a nonconducting state. J Neurosci. 25(1):42-51.

35. Beck C, Wollmuth LP, Seeburg PH, Sakmann B, Kuner T. (1999) NMDAR channel segments forming the extracellular vestibule inferred from the accessibility of substituted cysteines. Neuron. 22(3):559-70.

36. Behe P, Stern P, Wylli D, Nassar M, Schoepfer R and Colquhoun D. (1995) Determination of NMDA NR1 subunit copy number in recombinant NMDA receptors. Proc R Soc Lond 262: 104106.

37. Benveniste M, Mienville J-M, Sernagor E and Mayer ML (1990a) Concentration-jump experiments with NMDA antagonists in mouse cultured hippocampal neurons. J Neurophysiol 63:1373-1384.

38. Benveniste M., Clements J., Vyklicky L. J., Mayer M.L. (1990b) A kinetic analysis of the modulation of N-methyl-D-aspartic acid receptors by glycine in mouse cultured hippocampal neurones. J Physiol. 428:333-57.

39. Benveniste M., Mayer M.L. (1991) Kinetic analysis of antagonist action at N-methyl-D-aspartic acid receptors. Two binding sites each for glutamate and glycine. Biophys J. 59(3):560-73.

40. Benveniste, M. and Mayer, M. L. (1993) Multiple effects of spermine on N-methyl-D-aspartic acid receptor responses of rat cultured hippocampal neurones. J. Physiol. (London) 464, 131-163

41. Benveniste M, Mayer ML. (1995) Trapping of glutamate and glycine during open channel block of rat hippocampal neuron NMDA receptors by 9-aminoacridine. J Physiol. 483 (2):367-84.

42. Blanpied TA, Boeckman FA, Aizenman E and Johnson JW (1997) Trapping channel block of NMDA-activated responses by amantadine and memantine. J Neurophys 77:309-323.

43. Blanpied TA, Clarke RJ, Johnson JW. (2005) Amantadine inhibits NMDA receptors by accelerating channel closure during channel block. J Neurosci. 25(13):3312-22.

44. Bliss TV, Collingridge GL. (1993) A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361(6407):31-9.

45. Bokesch PM and Strichartz GR (1983) Temperature modulation of local anesthetic block in mammalian nerve. Reg. Anaesth. 8:49.

46. Bokesch PM, Post C and Strichartz GR (1986) Structure-activity relationship of lidocaine homologues on tonic and frequency-dependent impulse blocked in nerve. J. Pharmacol Exp Ther 237: 773-781.

47. K. V. Bolshakov, V. E. Gmiro, D. B. Tikhonov and L. G. Magazanik (2003) Determinants of trapping block of N-methyl-D-aspartate receptor channels. Journal of Neurochemistry1. V. 87(1): 56 -65.

48. Bormann J (1989) Memantine is a potent blocker of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor channels. Eur J Pharmacol 166:591-592.

49. Brau ME, Vogel W, Hempelmann G. (1998) Fundamental properties of local anesthetics: halfmaximal blocking concentrations for tonic block of Na+ and K+ channels in peripheral nerve. Anesth Analg 87(4):885-9

50. Brose N, Gasik GP, Vetter DE, Sullivan JM and Heinemann SF (1993) Protein chemical characterisatioon and immunocytochemical localization of the NMDA receptor subunit NMDA Rl. J. Biol. Chem. 268:22663-22671.54

Информация о работе

Колесникова, Татьяна Валерьяновна
кандидата физико-математических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.02

Диссертация

Блокада NMDA-каналов пирамидных нейронов гиппокампа крысы местными анестетиками и их производными - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы