Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы селективного транспорта ионов через амилорид-чувствительный натриевый канал

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы селективного транспорта ионов через амилорид-чувствительный натриевый канал"

АКАДЕНИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН "ИНСТИТУТ^РИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ

?го оа

на правах рукописи Шлёнский Вадим Геннадьевич

УДК 677.352.26

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СЕЛЕКТИВНОГО ТРАНСПОРТА ИОНОВ ЧЕРЕЗ АМИЛОРИД -ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ НАТРИЕВЫЙ КАНАЛ '

0100.02-биофиэика

АВТОРЕФЕРАТ диссертациина соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Институте физиологии и биофизики АН РУз.

Научный руководитель:

к.б.н. И.И. Исмаилов

Официальные оппоненты:

д.б.н., проф. Салахутдинов Б.А. к.б.н., Азимова Р.К.

Ведущая организация: Ташкентский Государственный Университет им М. Улугбека.

Защита состоится (оо;^ 1988 года а ^Ч часов

на заседании Специализированного совета Д 015.01.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте физиологии и биофизики АН РУз по адресу: 700015, Ташкент, ул. Нмязоаа, 1.

С диссертацией можно ознакомился в библиотеке Института физиологии и биофизики АН РУз.

I

Ученый секретарь

Специализированного сове™ Лй д.б.н. Капикуноп Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЛСОТЫ

Актуальность темы: С ;иовным фактором, лимитирующим скорость трэнсэпителиального транспорта Ма*, являются зпителиальныо каналы - компоненты апикальных мембран ео многих ион- • рэабсорбир/тощих опителиях. Эти каналы фармакологически отличзются от На* каналоз нервных и мышечных клеток по их чувствительности к аммлориду (кзлий-сберегающ му диуретику) и его аналогам. Эпителиальные На* каналы встречаются в таких эпителиальных тканях, . кз!: кожа амфибий, о которой они осуществляют функцию абсорбции и рззбсорбции натрия из окружающей среды и из внеклеточныхжидкостей. Б клетках эпителия почки эп? каналы участвуют а формировании конечной мочи. В эпителии дыхательных путей животных натриевые * каналы необходимы для процессов поддержания. «собходимого уровня концентрации воды в жидкости, выстилающей эпитош..'|, а также в предохранении аль^оп от переувлажнения. Аиилорид-чусствительныс " На* каналы были тагскэ найдены в лимфоцитах, клетках кишечник-;, рецепторных клетках, определяющих концентрацию солей, и механерецглторкых клетках. Как известно, дисфункция этих ионных каналов '..приводит к р"цу серьёзных заболеваний, в'том ч„спе • гипертеизйи. К настоящему времени в литературе описано около * ■ нескольких десятков ионных каналов, по своим характеристикам относящихся к семейству эпителиальных амилорид-чувствйтельных каналоз. Неясным остается генет».ческоо происхождение этих каналор' являются ли си», продуктами одного гекэ с многочисленным^ лсшранш1яцйо!шымииод»1фикациями, "ти'оатопро/- таы разных генов. ' Нсдайнзо успешное кпенированиз эпителиального Ма* канала из кишечника крысы, состоящего из трех гомологичных субъединиц (назаанных я-, р-, и у- гЕИаС) <Сапе$га е! а1„.:'.1'504);%эдсшзе<дло

возможность поиска молекулярной основы этого класса каналов в клетках разных тканой. Дальнейшие исследования показал» наличие экспрессии матричной РНК и/или белков, г ми.к>гичных а.рЛ'-гЕЫаС, во многих видах транспортного эпителия, что является существенным свидетельством в пользу гипотезы о наличии единого гена эпителиальных натриевых каналов. Согласно этой гипотезе, большинство этих ионных каналов долж ы были бы обладать общим механизмом селективного трснспста Ыа* вне зависимости от физиологических регуляторных механизмов.

Основной целью настоящей работы является систематическое исследование основополагающих Механизмов селективного переноса ионов через клонированный амилорид-чувствительный канал - а,{3,у-гЕЫаС в модельной системе.

В ходе исследования решались спедующиэ основные задачи: ; - 1'чучение проводимости I селективности а,р,у-»с№С;

. - Исследование механизма блокирования канала непроникающим

ИОНОМ Си' , '■■■'.'■;*■

- Изучение транспорта воды, сопряженного с переносом мокоз через , аДу-гЕ^Ю;

- Создание и ретроспективная проверка новой тсрмодикашчаской

модели эпителиальных амигорид-чувствительных натриевых

каналов. ' '

Научная нояизнь полученных результатов. ■■'■■: '

В настоящей работе влерпыа установлено, 'что: ,

1) зависимость прозодимоегч клонированного эпителиального амилорсд-чувсгвительного канала (аДу-гЕ№С) от концентрации, проникающего иона имеет максимум при .ют'зртрации 1М.

2) в растворах о различным молярным соотношенк ял ионов Ма* и

и*, но при постоянной общей ионной концентрации равной 1М, проводимость канала ЗУ^ЕНзС имеет аномальной поседение с минимальинн« значением при молярной Фракции зтих ионов 4:1.

3) селективнос<ъ канала аРу-гЕМаС имеет концентр?)•!..;;!.чу;о Зависимость.

4) проводят .ая пора канала аРу-гЕ№С содержит, по крайиой мере, деа связывающих места ионоз.

5) проводящая пора канала а(3у-г&\' зС мо:шгейсомсдировать 2-3 молекулы воды.

6) Разработанная для канала офу-гЕМаС компьютерна;4 ■. . . ^

термодинамическая модель корректно описывает линейность вольт-

змпроиых характерце лга а симметричных ионных условиях, их несимметричность в Ьи-ионных условиях и аном«льмоэ поведение прооодшисти конапз о расг21\г«с с различной молярной фракцией Ма* и и\ Предлагаемая ад^еп«» вьще$$аает ретроспективное ср?чнение с ранеэ опубликованными япгг^.турлглтм данными н совместима с полученными результат ми по количеству и рг^г^тогаи-.Ч! ссягысающих ы?.ст коноа, а тагоко паллию молекул я пора канала,

полученными в данной работе. ' V

Получ_нныо экспериментальные данные уг,ту0пжот гя<зн»я о Сиофмзичссмк механизмах селективного трансферта ионов через ^М1торид-чуестс:ггельньго натриевые каналы.

Установленное сходств биофизических характеристик локированного амйлорид-чувствительногЬ натриевого канала с таковыми, полученными для натриезых каналах нативных юте-, эк, подтве^жает гипотезу о гене ическом единстзе класса амилср!*д-чувсш1тепч«ы* мтриеаых каналов.

Результаты работы представляют интерес для специалистов, занимающихся проблемами ионного транспорта, и могут найти применение в биофизике. Ащкшция работы:

Результаты работы были, .олсжены на Конференции Амерш<?чского Общества Нефрологии (Новый Орлеан - 1990,), на Конференции

• Американского биофизического Общества (Новый Орлеан - 1997) и на Конференции Американского Общества Экспериментальной Биологии (Ноаый Орлеан -1997).

Структура и объе,.> циссектации. Работа изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературных данных, главы с описанием материалов и методов исследования, двух глав изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитарозанной литературы,. . содержащего 179 наименований. Диссертация содержит 23 рисунка и 6 таблиц.

диссертации изложены е 4 печатных работах. • , '

: , ' МАТЕРИАЛЫ .И МЕТОДЫ. . " '

В ргботе были использованы:

* * -,

-фосфолипиды (AvanÜ Polar Lipids), холестерин (£ gtria), окисленный по мотоду Tien et al., (1966), и ваниноыицин (Stgma).

Очищенная и пинеартоеанная ДНК плазмчд, кодирующих казедую субъедимицу, была in vitro транскрибирована с использованием 17 РНК юлимеразы (Pro.nega). In vitro трансляция индивидуальных субъед шц была провь^ена с использованием uns. много пизата .ютикулоцитоа кролика, оОработшшых мифококкоеой нуклеазой (Pronrjaga), в

у.'";;.: б. '

присутствии микросомальных мем Зрзн собаки. Транслиросснные белки а-, р-, и Y-rENaC были элкшрооэиы с гель-фильтрпаионной коленки (PharmaciaBiotech).

Пл^^кке бислойиьге мембраны фори лропали по методу Мюллера. Элеетр'лчеседо параметры измеряли а режиме фиксации потенциала.

проводилось ; помощью

програыггего обеспечения pCLAMPñ.G.

■ Коэффициенты... сслекттности канала определяли по потенциалам рс?орс;«п, полученные в ^и-ионных условиях, с использованием урзвнений тока и потенциалов Гопьдчана-Хор*»а{Ина-1(втца. Моделирование гиоргетимеекпч профилей проводилось'о соотвотстоии с теорией НШе & Schwnrí: (1978). Для того чтобы получить профиль .свободной энергии дат^сна о K"Sü?Jio, тош через одиночный'apywENa'C, измеренные при р?глич;«ых потенциалах, были подвержены процедур« нйгинейнои окстрзполпци:?, основанной на мотодо Гаусс-Ньютон, с использованием программы AJUSTE (Alvarez et al., 1992) ».модели Три Барьера-Два Мест? Связывания (ЗБ2М).

РЕЗУЛЬТАТЫ

б наших окслеримгнтах транслированные In vitro болки a{3y-rENaC 'были встроены в бислойны© фоефелипеднио мембраны, разделяющие СИММЭТрПЧКЫЭ растссры ХЛОРИДОВ ЩЭ. (ОЧНЫХ МОТПЛЛОП. Симметричное пссы:ыо!п;е гонцыг. рацки иенев Na* о обоих сторонах камеры TOnpoDKrflanocjiyeenifnsHiteanpcsoAHfiocnvKis^a.ToKoo^onoBsAeiiito-кг taná, толь» о большой прсподимостыо, было оонзруяано о рострах

* •• .v

10 vM • 3 ГЛ UC!. Тзуи кзноз !Г через кзкал стансзили'сь иамгримы при «..«цситрзцш КС1 пышо 1 М. Крнлп со проводил ir меримого тока п растворах ГО>* и Сз* (сплот* до 3 М) п прогулах' прйпо&еьпых лотснцитлоо ±120 мВ. ; , •

Амилорид эффективно блокировав канал в субмихромолярных

концентрациях с константой инги жирования -170 рМ при 100 мМ NaCI.

Проводимость одиночного канала oßy-rENaC насыщалась с

повышением концентрации Li* и Na * (рис. 1). Построение графика i

зависимости проводимости от "онцентрации иона, однако, выяенд! максимум проводимости при.концентрации 1 М. Такой феномен был объяснен с точки зрения множественной занятости канала ион~ми. Ö соответствии с этой идеей канал может изображен в виде ряда барьеров и ям потенциальной энергии (Lauger, 1973; Hille and Schwartz, 1978), a проводимость канала может быть описана уравнением параболы типа (Schumaker and MacKinnon, 1990):

РСУд ~(квТ/г*ег) (А + BpCJ*С-рС}) (1)

где д - это проводимость одиночного канала при концентрации ßC],kB - ' это постоянная Больтцмана, г - это валентность чона, в - заряд электрона, и Г = °К. Коэффициенты А, В и Ca yptмнении соотносятся с константами скорости входа иона в канал (а), выхода иона из канала (е) и перескока между соязывающими местами (к) как: А-2п'1, . .. . /,. -В=2Ь-1+(ц-1)пК\ Св(п-1)ак1Ь'1, ,

где п это число связывающих мест в канале (предположенное п=>2).

Описанный выше максимум лроеодимосга являотси отличительной че^1*ой мульти-ионных • каналов, .способных содержать й"езоей ; проводдщей поре более одного иона одновременно (Hille and Schwartz, 1978). Это наблюдение поставило ' основание для проведения . экспериментов по выяв/1е]нию аномального эффекта молярной фракции в растворах, содержащих двч проникающих иона. Аномальное пезедзняз ' проявляется, если проводимость канала а раствора в присутствии двух

'.'•'» л *' ''S

проникающих ионов меньше, чем проводимость в растворе одного проникающего иона при той же ионной сипе. По современным представлениям, этот эффект также является свидетельством множественной занятости канала ионами (Neher, 1975; Eisenman, Sanblom and Neher, 1977; Hille and Schwartz, 1078; Mlronov, 1992). В действительности, аномальный эффект молярной фракции был обнаружен для aßy-fENaC а растворах с ионной силой 1 M (рис. 2), таким образом поддерживая гипотезу о множественной занятости этого канала иона».«!. Однако, о растворах с ионной силой равной 100 мМ отношение лроводимостей увеличивалось монотонно, не обнаруживая явного аномального эффекта (рис. 2). На рисунка ¿(вставка) также представлены энергетические профили ионов Na* и LI* в aßV VÊNaC, полученные аппроксимированием вольт-амперных характеристик, измеренных в различных ионнь'Х условиях к модели три-барьерб^два-места связывания 352М (г;х минимальной модели. разрешающей MHoKSCTSoHt ßb занятость канала ионами) о использованием компьютерной програпшы AJUSTE (Alvarez of nl„ 1992). Эти про^тн характеризуют канал с симметричным расположением пиков и Высоты наружного, центрального и внутреннего пика были 4.5, б.З й 4 1 KT, соотватсшвнно для Na*; й 0.7 и 40 кТ соответственно Длй U*. Глубины наружмей и вн/тр&нней ймы былй и KT соответствен дпя Na*; и -7.0 и -7,5 кТооотееююанно дпяИ*. Эибргия рыульсии иойёй

sj

¡3

с . >a

Рис. 1. Зависимость проиодкмости от £Ма*1 и

С"!.

Точки и сшдорныв откпонен'-ч представляют среднкь зхзчёная .фоаодимоагм подпровод гицеги состояния для 7 »¡сзаенаыых эксперимзнтое дг.я и* и 10 для Яииии на графике представляют 'юлинейнук* регрессию с использованием уравнения (1). Константы сгороста, полученные лэ зтих регрессий были а=2.97-103 сек"'М" 6-0.03-10® се!'1, Л=30.6-10" се х-1 для N3*; и а=3.35Ю4 сск"'М\6-0.12Ю* .сек<с=2ав-10э сек-'для и*.

¡Ион'), и

1.5

£ M N 3

и

0,5

».AL.

M

JL

j-

M M M

i.i

Fiic. 2. Аномальный ьффаст молярной фракции и эноргетичвсиио профили эноо На* и U* в ару-гЕМаС.

Тс км предгтаалйют иг .ошена? проводимости одиночного канала в растворах, содержащих Na* и U* при. разл>1ч1;ь.х ыол^рьых фракциях к проводимости а раслгаоро. с fbCI. Сплошные ш,.м прйдставпглт rsopsTVî'iccKiiô линии, пра;.эсазанкые по энергетическим профита, показанным ùj естазке, гда линий прзаадены через точа», полученные лроржшй AJUSTE о результате коипыотерньяс рассчет«з, с и тальзоваиигм ... вольт-ампэриых характеристик opy-rENaf. Полученные параметры были: G1U 3.2 Î;T, 0,2-2.< kT G3LM.5 кТ, WLN-7.0 кТ, U2u==-7.5 кТ, G1Na=4.S «<T,G2Na»e.3 кТ, G3Na=4.8 кТ, ' 1Ua=-6.3 кТ, Ubttae-7.8 ИГ. 01=0.5, D2=0.4, 03=0.6, 04=0.4, 05=0.6, параметр взаимодействуя ианоа А=' 34 кТ Ось абсцисс выразима в относительных единицах расстояний злешческого поля внутри канала. Виэ-пвточный вход канала обозначен как ноль, а

кТ. Э.и энергетические профили удовлетворительно описывают поведение иро&одимост : канала о экспериментах с молярной фракцией как при концентрации 1 М (г=0.8б4, Р<0.03), так и при концентрами 100' чМ (г=0.993, Р<0.001) (линии на рис. 2).

Проницаемость аРу-гЕМаС была также исследована а би-ионных условиях. На рисунка ЗА продета плены вольт-амперные характеристики ару-гЕМаС о Си-ионных усясзиях, описанные уравнением тока Гольдмана-Ходжш о-Катца. Последовательность стнссительных • проницаемостей, определенная по бичионным потенциалам рсверсии тока Была г((1.72)>ма(?.00}>к(0.г1)>яь(0.01)>с5(0.с07), когда транс-отсс^ камеры содержал 100 мМ МаС1, а цис- отсек содержал 100 мМ хлорида тестируемого катиона. :

ТАБЛИЦА 1.■ Бм-иоиикэ потенциалы реверси» той» а,р,у-гЕЫаС.

iter-ï ЦУ2 р..« 55

U* -П.7У. 3 172 5

m* О±1.0 ✓ 7

• к* •♦55.045.2 0.1Г 0

— па* • +1137i*l0 0.01 0

Со* +123.247.2 0.007 7

*гиач?)Г.*я Сыггл определены tr/rcM зппрокснмацим бячюнньк /Л/ отношений а < прйсутсга.<а 1(»ыШ}гС1птрзк!стогкз и 100к?Л урсрида теояфусмото катиона о tl»ie ot&xs s ypséiaem тещ Г^дканэ-Ходжкинз-Ка-пз (ГХК> и корректирования . нзоттеннудаффуаюгоRerettçtaras- '••• ' "ПосантеннЦ&'го «f£iï урзатпа тетекциалеэ 1Ж ' .

Ля!й!И иа график» 3S предстг,аляй5т теоретические вольт-змперны*» ''KàpsérepitcnisM, ' лояучеин«»с ''покощью. программы AJUSTE с : использованием фдаетрсеатьк паргшьгрез энергетических профилей Na* и Li* (рис 2). Эти теоретические пинки но сильно отличамтся от зкеперпментальшх Данных, более тсго, штрехеимирогажю (IV характеристик, полученных при различных fta/К би-нснНых yaiormx-к

модели ЗБ2М, позволило полуить профиль свободной энергии иона К* в aPy-rENaC (см. р.ю. ЗВ), с энергетичеси ль пиками 2.1,4.0 и 2.3 кТ и энергетическими ямами-10.4 и-13.3 кТ.

В литературе также существуют примеры тоги, что способность мульти-ионного канала дискриминировать ионы может зависеть от общей концентрации иона (Meyers and Haydon, '972; BegenisHi and Ohalan, 1980; Aimers and McCfeskey, 1984). Риг унок 4A представляет результаты измерения Li/Na селективности в apy-rENaC при различных ионных концентрациях. Отношение PJP^, вычисленное по потенциалам реверсии в би-ионных условиях, значительно увеличивалось с повышением концентрации, в то время как только небольшое увеличение наблюдалось для отношения проводимостей ионов Li* и Na*. Теоретические ли"ии для PJP^ и отношения проводимостей, подсчи" ;нныз программой AJUSTE для модели ЧБ2М (см. параметры на рис. 2), были сравнимы с экспериментальными данными (рис 4А). Натрий-калиезая селективность также зависела от концентр пц"и. Отношение PN¡A\, рассчитанное по потенциалам реверсии, повышалось с 9.2±1.5 при концеь. оации 50 мМ до 22.9±2.3 при концентрации 3 fА (рис 4Б). Также, как и в случае натрий-литиевой селективности, предсказание усовершенствованной нами ЗБ2М модели удовлетворительно описывает концентрационную зависимость натрий-калиеьой сьлет:шюсп1;

Таким образом, данные по селективности и их иорргляцяя с теоретическими линиями, прег,сказанными tía осноае онерютичсиж профилей для индивидуальных ионов, также подтверждаютсьшод о т с«., что про.шкновениз моновалентных катионов через aPy-rENaC может-быть описано с точки зрения модели мульти-ионного качала с треь& энергетическими барьерами и двумя ион-связыющими местами.

Мы также исследовали блокирование канала y-rENaC

UMC

- 100 inm jm»')

- 100 mM |L1*J • 100 .14 |K*J

- 1С« mM (Rto*|

- 100 mM (C**J

Ри-

3. Оольт-гипзрныо хз^ктсристн^и ару-rEHaC в Sh-iioi.hlix условиях.

Транс отсек камеры всегда содержал 100 мМ NaC), 10 мМ WOPS-Tris, рН 7.4. Рзспзср о цис отсеке содержал хлорид тестируе- -его катиона гак указано на рисунке Плюс 10 мM К jPS-Тпз, f4 7.4. Течки предстаапяют среднее эдачение дг i 4 независимых экспериментов. Линии на графиках презедзны либо путем аппроксимации к уравнению тока ПХК (А), либо программой AJUSTE (Б) с использованием фиксированных пзраметроя энергетических профилей для Ma* и Li, как укз:эно на рис. 2. Профиль свободной энергии для !С (В) был определен путем аппроксимирования ьопьт-ашерных характерней« a Na/K би-ионных услозиях с помо'чью про. ¿зшы AJUS. Е санированными параметрами для Na*. Полученные пэргметры были; G1K=2.1 'Т, Q2K=405 kT, G3K 2.3, кТ, U2LΗ13.3 кТ,

п:р->\ютр азак.«.!сдейстсия ионоз А=1.23. Расположение пиша и ям было как указано на рис. 2. Ось абсцисс выражена в от зеительных единицах расстояний эпеетическсго поля внутри канала. L .«еклеточный вход кгналэ обозначен как ноль, а внутриклеточный 'ход * как 1.0.

ни/ан. Pu, '-'к.

в. i

I i

—fi i i

° etit/HK

• ''Iîr/PK

Рис. 4. Концзнтрациснная зависимость Р^/Ри, Р^РК И отношений проводимости длч этих катионов. \

А. Точки представляют среднее значение в независимых зкепериментоб для кшадего экспериментального условия. Лииир из граф, .в представляют тоорешческиэ зависимости, построенные на основа знгргаь,веских профилей, поденных нэ рис. % для Ри,/Ри (сплошная линия) й для отешения превс -.имостей (пунктирная ¡иния),

Б. Точки предстззляют среднее зна зима б независимых экспериментов для кзждогс экспериментального условия. Линия на графике представляет +ссретичесхую гаг-с^ость для Ри^Р*, построенные на ссноео знерготеческих профилей, показанных на рис, 2 и 4.

непроникающим ионом Са2*. О контрольных условиях, когда мембрана, содержащая аРу-гЕМаС, разделяла камеры, заполненные раствором 100 мМ МаС! в прису.ствии 11±4 рМ свободного Са" (измеренное по флуоресценции Фура-2), хара!сгер открывания этого канала подчинялся модели трех кооперативных г эдпроврдящих состояний (1зта!1о" е! а1., 1938). Удаление свободного Саг* мз растворов с обоих сторон камеры добавлением 10 мМ ЭГТА отражалось но повышении нормализованного тока через ару-гЕЫаС (»^ c0.12t0.02 до 0.6Ш.05 (рис. Б). Повышение концентрации свободного иа2* в растворе с любой стороны камеры вызывало дозо-зависимое понижение нормалшоаанного тока без 'изменения амплитуды открывания канала. Записи, полученные в одном из таких экспериментов, в которое Са2+ был добавлен в цис-сторону ячейки (т.е. предполагаемую цитоллазматичоскую сторону канала, что было подтверэдено тестами на воздействие ашшорнда), показаны на рис. Б. Добавления в транс-отсек ячейки вызывали сходный аффект, только с другой концентрационной завнсодостыо. Более того, блокирующий **фе)гг при кш^ой конкретной концентрации кальция зависел 'от приложенного потенциала. ' Алпрокетшация. экспериментальных дайны*. к уравнению Михазлис-Шатен позволила определить константы нггибирования канала (К,). Значения констант ингибироиания были различными в зависимости с г стороны, в которую был добавлен Са**, а тахжэ от приложенного потонцитла. Рисунок О подставляет полулогарифмический фафик значений цис- и транс- к; в . зависимости от потенциала, фиксированного на мембрана. Иэдеафика видно, что ингибироеаниа канала ионами Са14 с цис и транс стороны имеют имеют обратные зависимости от приложенного потенциала. Рессчоты по уравнению, сйгласмо теории УУоос!НиН (1973/, показали, что в электрическом поле поры <*ру-гЕ№С сущестоуюг. как минимум, два

«ею&сгы

Рис. 5. Эффект (Са5*] на аРучЕМаС, рс£С1Кггрунрооаиный в бислойную лигчдную меабрану

Ряспзоры содержала 100 кМ N301, 10 ыМ МОРЭ-Тгй (рН=7.4). Записи р.гпиотся типичными для пяти независимых ягакримонтоа. Числа рядом о записями обозначают нормализованный ток через а$у-гЕМаС для каждого экспериментального условия, подсчитанный с помощью программы рС(.АМР5.в для лалиси продолжительностью нэ менее 3 минут. Ксчзчнзп концентрация [Са'*) для каждого условия указана над записью. Добаь.си раствора СаС12, необходимые для достижения нужного уровня свободного Са" были рассчитаны с помощью грограммы Воипй-апй 0е1ептапе(1.

19

.х.

41

Рис. в. Потомиизп-записимолть констант и"гибнроааш<|| Са'\

Точки представляют среднее значение констант инмбирования для цис и транс Са2*, полученных по уравнению Михаэлис^ 'ентен. Линия через точки представляют аппроксимации к уравнению УУооагшИ (1973) с предположением, что исн-связыэзющиэ места находятся внутри электрического поля канала:

К(У)»К(0) ехп (в г ЯШТ) где К(У) это константа инл^бирования при данном потенциале; К(0) это константа »гнгиСлросатга при 0 мВ; 5 зто фракция блохтричйского поля канала между местом, сзягызанкя иона и сходом в канал; г это

» ■ ■ . ? ■..... гтлетисстквнгибитора (*2 для кальция); Т

( у {} это обсо.1К>теая темпгратурз и Р, V, « й

Првзят! сявгри, кЗ

' |9М%(0Т ссов о£ лчноэ гнэчзши».

• . . V

■'•■'■. ■:■ V

места связывания для ¡юной Саг\ которые расположены на расстояниях 14.7*1.5% и 19.8±1.3% лроаодящаго лу. : с внутриклеточной и неклеточной стороны канала, соответственно. Таким обра-олл, эти результаты подтверждают гипоте-у, что ионы С а3* не тосредственно регулируют воротное свойство а{Зу-гЕ№С по механизму, сходному с блокированием амилорид-чувствнтельных каналов а нативных клетках ОэтаНоу е! а» 19056; а^ег а!., 1993).

Прямыэ измерения потенциала течения на уроьна одиночного канала предоставляют качественную информацию о проводящей поре канала - сопряжении потока иоиоь и молекул соды, что р свою очередь может свидетельствовал, о геометрии перы. Риг1 «иск 7к представляет .записи одиночного офу-гЕМаС с присутстЕ..и 2 М раствора сахарозы а цне отсеке каморы. Как видно из рисунка, токи при нулевом прикладьиае.уоы потенциале можно наблюдать дгека при низком соотношении сигнал/шум. Амплитуда токов одиночного канию при кай<дэ;.! потенциал Зыла определена из гистограммы амплитуд событий, ген рируемой программой рС1АМР для конфетной записи. Вольт-амперныо характеристики, полученные о отсутствии и в присутствии 2 № сахарозы а расаоре, доказаны на рис 7Б. Проводимость кайала о условиях осмотического давления была на 9% нж:о, чей в контрольный усяов-ях (35.6±0.о пСм протез 39.1±0.5 пСм). Это понижение прэйсдкмосч может бйть объяснено уменьшенной проаодимотью растете," содержащих сахарозу, блокирующим аффектом сахарозы на канал или другим ео опосредованным фармакологическим воздойствиоы. Чтобы выявить истинный потенциал точения, выэоамш Ч потопом соды чероэ К&..&л, измерения потенциала реверсии в условиях осмотического давления были проведены поело добавления 10 валиномицина. При этой концентрации в&линомицин вызывал более чем 100-кратн о увеличение

тока через мембрану и понижение измеренного потенциала реверсии с 7.i.J:1.1 мВ до 5.2Ю.5 мВ (п=5). В присутствии валимо^ицина салицина "отенциапа реверсии была почти п доа раза больше, чем таковая; изжаренная дня таких жэ осмотических /сяовий н гкеперим«?нтях т Саг<-актиокруемо" К-кзнало (Miller, 1982; Alcayaga ct а?., 1369), чи может быть отр-жением naroir льгх ионных условий. Мы предлоге».: ем в нашей систем» наличие более высоких диффузионных потенциалов на границе ■ раздела Na/Na ьнутри нелсремешивакнцихся слоев и иа границе разлила МаК между агаровыг. и мостиками и раствором, по сравнению с диффузионными потенциалами из границе разд па К/К о двух предыдущих исследована?« (Ш!ег, 1982; Alcayaga ct о!., ,909). Другое отличие гкепериментъльных условий заключается о 1000-кратно большей концентрации валиног-гицина, использованной в измерениях, 'по сравнению с таковог?, пслотсстеоной для ¡(-каналов. Однако, о наших условиях увеличение проводимости пзлмнэмгцин-модифкцироваиной мембраны было сравнимо с экспериментами иа К-каналпх#(Шег, 19°>2; Alcayaga et а!., 1°Е9). Теки» образом, едчиг потс'нциаг:-. реверсии ".в ' 2.0±0.7 мВ рпляется мзкеньальной оценкой знамения потенциала течения, вызванного потоком ооды через a{2y-rENsC.

Измерения потенциала тсчгиич были также ^резедены при различных концентрациях Г.'а при пс тоянней концентрации сахзроеы. Было обнаружено, '.то потскичал течеммя понижается с увеличением концентрации NnC! (рис. П). Наклон гтой зависимости был разе» -1.1 в мВЯЛ со 'стандартным'. отвдонешем '•-. 0.30 мВ/ЭД, Наклон был Члатислмосидс тосорно отличен от нуля (Р<0,01). Потенциал течения 1; пределе '»улезой кснц'хггрзц'.пгЫаС! был равен 2.1 ¿0.2 мВ при Дп™-2 Осмоль/«\ Учитыпая, что <p=0.46N, 1Дв М - это »испо'ггалскуй соды, транспортируемых имеете с одним никои 'Rosenberg and Fintyilstelrt,

»

• i

l«a t

« 4 -It

.......

1

■I 1 l T,*S

II С It tt

Рис. 7. Записи одиночного шанта upy-tENaC а присутствии осмотического гродкит {Л) и еольт-ам.тгрныг характеристики сфучЕНаС в отсутствии и в присутствии осыоптежог® градиента (6).

А. Коицготрация сахарозы в ц»с стсекв была 7 ОсиогаЛг, Пркпсзквйный пст«адда укзззд спрьаг от запит. С. Сплошная яшв орвдгтгЕлявг тнеЛуп рвгросоао через точки, голучлйчья в : отсутствие осмотического грод«япа. Ton*» представляет данмыз отдальш-г- зсгшришяога в присутствии 2 Осмоль/кг сахарозы е цис отсека гаисры. Потомциая реверсии юа«г»а б г^асутетаа . caxcpoiu был 7,211.1 мВ. Потем«эдрегераывф*сэггстеж10|4Мдо^^ 5.2Ю.5 м9.

FKC..6. , . Лотеждаиш - твчзккя, игм'ервмние , при розничных (вмцетрацяяхМаСг. ."■. < •

Кшкгя точйЬ * прадстгзлязт norotsaan твчв»ыя, пояр«гг ьй to отд»пы«й мембрвна. Все эюкржвим был» прозадены при градаснга caxtpi зы 2 ОшоаьЬг. ' Линкя яыишся 1шой«8< ' рецессией данных с нагоном -ЦвЮЗЭ ' м&ТА Каотсн ствтмспнвсти стлюят от йупл (Р<0.01, Crwcfi^Kt i тесч.

1Ь/8), и при услс зли, что 4п=1 Осмол-, кг, мы подсчитали, что вместе с одним ионом Ма* я канале ару-гЕ№С при низкой ионной концентрации транспортируется 1.16/0. 16 = 2.52 молекулы воды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные посаоляют предположить, что:

1. ¡Сана" аД, гЕГ'зС является водснапс.шенней порой, в которой ионы дшссутс!' а -5дии ряд.

2. Проводящая пора канала содержит, по крайней мера, дпа исн-связывагащдх места, которые могут быть гзняты ионами одновременно.

3. Селективны"' транспорт ионоа ^реэ мульти-ионный канал аДу-иЫаС определяется сложной комбинацией ям и пиков свободно'4 энергии ионов, и, частично, энергией отталкивания ионов внутри канала;

Рассчитанная нг..ли на основе вольт-амперных характеристик канала модель мульти-ионного канала а.Р.у-гЕЫаС -Б2М, находится о согласии „ наблюдаемыми- максимумом' проводимости в экспериментах с одним проникающим ионом, минимумом проводимости в экспериментах с мслярной фракцией двух проникающих йеной, нелинейностью вольт-амгкрных характеристик п би-ионных условиях, концентрационной зависимостью коэффициентов селективности, наличием молекул воды в поре канала и двух нон-связнс лощих мест.

Компьютерные рассчеты модели ЗБ2М достаточно адекватно воэсоздают лаписимость проводимости иммуноочищенного амилорид-чуестрнтопьного Ма кзнала пз почки быка и тока короткого замыкания в коже лягушки <Мг концентрации ионоа, ;гаким образом лодтеьрждаг. сос оительность «»дели. \ ,'■'.

Полученные р&гультаты и их модельный анализ подтверждают гипотезу, что именно &,Р,\ *ЕМаС формирует проводящую пору мне/их амилсрид-чувствительнъ«<.нат| Ю8ЫХ каналов.

выводы

. 1. Установлено, что проводимость клонированного эпителиального канала из кишечника крысы (аДу-гЕЫаС), реконструированного в плоские лилидные мембраны, для ионов и* и Ыа* яалялясь нелинейной функцией; концентрации этих ионоа с максимумами, равными 39.4±2.9 пСМ и 18.5±1.9 пСм, соответственно, при их концентрации, равной 1М.

' 2.' Показано, что проз^цимость канала а,(3,у-гЕ№С, измеренная в симметричных растворах смесм ионов Ыа* и СГ при условии постоянной концентрации, равной 1 М, имела аномальную зависимость от молярного соотношзы.д этих ионов с минимумом при соотношении 4:1 и7Ыа\

3. Выявлена последовательность относительных проницаемостей ионов какала а,р,у-гЕЫаС: и+>Ма*>К+»КЬ>Св+. Конкретные значения . коэффициентов селективности зависят от метода V» определения и конкретной концентрации ионов, и варьируют в пределах порядка измерения. V '

■4. 1$ основа анализа потенциал зависимости аффекта блокирования канала ионами Са"'* показано, что проводящая пора а.р.у-гЕЫаС содержит, по крайней мере, даа ион-свизыэающих места. ' • б. Обнаружено, что перенос одного иона Ыа через канал а.р.у-г£№С сопряжен с переносом 2-2 ¿юлекул воды при низкой иоыэй силе и. 1-2 при высокой ионной сипе омывающих растворов. ~

б. Рассчитанная нами ..а основе вольт-амперных характеристик канала модель мупьти-ионного канала «,&у-г£№С ЗБ2М, находится в сотасчи с наблюдаемыми максимумом лрошадмьхгги и экспериментах сед ям проникающим ионом, минимумом проводимости в экспериментах $ молярной фраю нйй цаух г-чоникающих ионов, * «линейностью вольт-.амперных хврчктяриепк а би-ионных условиях, гоицантрационной

зависимостью коэффициентов селективности, наличием молекул воды в поре канала и поддерживается наблюдениями дзух ион-с.?лзыеающнх мест.

7. Компьютерны® симуляции модели 352М достаточно ад^затно возеоздают зависимость проводимости иммуноочищонного ямиперид-чувствител'-ного На качала из почки Сыка и коротко-замкнукто тока вг коже лягушки-от концентрации ненов, таким образом г.:дтае|—<дал состоятельность модели.

Полученные результаты и их модельный анализ лодтсеродатат гипотезу, что имеиио а Ду-rENaC формирует проводящую лору многих

о^илорид-чуБсгеительных!!зтриевых!Шналов. >

,>" 1

1. fsmaiiov I.I., ВегсПоу В.К.,' Ghlyonskу V.Gh., Bones D.J. Meciiancsensffivily of a dsned epithelial Na* channel: ЯйЬззо from Co*4,

' block. Biophysical Jourijat. 72:1182-t 11S97.

2. Ismallov l.t, SHIyonsky V.Gh., Вепоз D.J. Streaming potential mcasu*3ni£nts м «0у-гЕЫзС in planar lipid bllayers. Procseding"* <5f

• 84:7651-7664, 1807.-''

> SJsmailov.1.Ц Weber-Emmons,Т., Lin, C., Berdlcv, B.K., Shlyonsky, V.Gh., . Palton, H.K., Ful'sr C.M;, Worrell, R.,: Zuckerman J.B., Sun, W., Eaton, ^ D.G., Еепоз Ш.; end Kleymsn; T.R. identification of an emilorlds binding dontairi wtth&i ttra alpha cabiinitcf tha epithelial No channel Journal of Blolosfcc! Chemistry, 272:21075-21083,1997. : 4. Ismsliov I.I., Shlyoriskyy.Gb., AJvarozO., Взпоз OJ. Cation permeability of a doned cpPJtsliiiRi, arnilodds-sonslUvQ Na* channel,о{5у-г£№С. i Journal of Physiology (London). 504:207400,1897.

ишнинг ;;ис^ача мазмуни

В.Г. Шлёнский

Олинган маълумотлар пмилорид-сезувчан эпителиал каналпарнинг биофизик хусусияти туфисидаги билимларни Ьойитади. Маьлум булишича, ару-гЕЫаС гетеритри^ер каналлининг икки к^тламли ясс.1 мембранэларда У* ва N3* учун угказувч?. лиги 00.4±2.9 ва 18.5±1.9 пСм макспчумли ион кенцентрациясини. (1 М) и+ ва №* учун нотугр» функция экан. Ыа/и (1 М)нинг симметрии аралашмаларида улчанган ару-гЕЫаСнингутказуочанлиги1!/Манингминимуми4:1 мочяр нисбатида булган моляр фракцияга нисбатан аномал боглиг^их борлигини намоён к^лди. сфу-гЕМаСнинг танловчанлик кетма-кетлиги 1.»>№>К>Р?Ь>С8ни ташкил кулди. Танловчанлик козффициеятининг к^ймати улэрни улчаш тартиби атрофида булиб, аницлаш услуби, >р«да ион концентрацияси з ботик ур.

Кальций билан канални блоклаш ор^али потенциагьбоглицлиши тавсифлаш асосида офу-гЕНаСиинг утказувчам пораси каммда 2та и^н- , богловчи уринга «палит курсатилд".

Аницланишич , 0fPyчENaC ювувчи эритманинг паст ион кучида 2-Зта, юкрри ион кучида зса 1-2таС"П иолокуласини жорлащтириши мушинэкан. , ■>.',-■ .'У, ■ г

Вол^т-амлер характеристикаси зсосида би- ишпаб чи^н.З-барьер(тусиц)-2-ботовчи урин мбдшшнииг «ав&удпит вир «онли' эритманинг ыаксиму)Л утказувчашшгн, цзлпрфрагщилл".» так-ои&шзрда минимум утка.гувчанлиги, ион концонтрациясшшнг танлззчзнлш'ига боглицлиги бьлан (.юс иелзди ва пэтенцизлнинг кечишиса 2та ион-. ботоачи уриннинг кузатуьлари билан куллыб-^усзатланади. Ушбу иод ал билан аншртангаи компьютер сииупяцкяси буяр буйратнинг иммуидЕН тозагзнган канали ва ба^а герисидаги киска-ёпиц токнинг утказувчаялик а

TapruoHKH nparafiH oa aiy opt;ann ¡.icAeniuïKr wycratyinjinniini TacAUK^ariAM.

OitUMran Hamacanap ua ynapiuwr woAon Tanc:::b<! HnsC ¡cynfv.ua anuTeni'-an Na-KanannapAa yrr^yciii nopami uiaKJinaHTiipafl« flerau riincTe33Hit ticBomniifiti.

SUMMARY

. . \

V.Gh. Shiycnsky

The ot-sined data lncrer<:s our knowledge cf biophysical properties of epilhetia! ami'Ofide-sansilivR tfisnnols. it was fennel that conductance of hsterotriiTir'fIc rat epithelial Na* channels {0f,p,Y-rÉNaCs} for Li" and Na* planar lip'-i bilaysra n non-linear function of icn concentration with a maximum of 30.4±2.0 fiS and 1 ?.5±1.9 pS at 1M Li* and Na4, respectively The o,0,v-rENaC conductance measured in symmetrical mlsturés pfNa*-LP(1 M) exhibited an anomalous tr.pl© fraction dependence, with a minimum at 4:1 Ù* to Ha* molar rat'o. Hie permeability sequence of a,fJ,y-tENaC was Li^Nn*>K*>>r\£f>C3*. Thi) values of selectivity coeffieli.rts depend on the . method of d?fa, minotion arufihe ionic rviccnlration ..nd very y/i'hin live order ^magnitude.' ■ • — '. '' • -

On tho basis cf the analyste r f the potential-dependence of Ch5* block of the channel, it was shewn mr.J the concMcting pore of a,p,v-rEHaC

■ ■■■■■■;. ■ ■ v : - -v „

contains at lanst two ¡on-binding sites. ' x •

It was found that c.p.y-iENaC car. ao. smodatoi'2-3 water molecule* a, tow ionic strenght and 1-? v,r.(or mof-scufos at high lente strenght of b. .thing.

solutions.. .".,.■• .i _

Predictions of model featuring three energy barriers, two binding sites , (2S3B), and allowing double occupancy, developed by us on lir basis of single ion current-voltage relationships, are in agreement v.ith the observed conductance maximum in single ion experiments, conductance minimum in the mole fraction experiments, non-lineari'y of the currant-voltage curves in bi-ionic expe Iments, the concentration dependence of permeability ratio" and consistent with observation of streaming potential and uf two ion-binding sites. Computer simulations using 2S3B model recreate the ion concentration dependencies of single channel conductance observed for tiie immunopurified bovine rena' amiioride-sensitiva Ma* channel, and short circuit current in jog skin, thus supporting the eligibility of the model.

. The results and their model analysis support the hypothjs's that ENaCs fonn a core conduction unit of epithelial Na* channels.