Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы регуляции и энергообеспечения ионных насосов эпителиальных тканей

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции и энергообеспечения ионных насосов эпителиальных тканей"

КЬиГан ¿¡ил Телетг^асрного -

ОПЗ ^г ОбщоЧЪ /3 СИ-^лС, 2.() На к 9 3&2ЧО?-

АКАДЕМИЯ НАУК С±& <1*Ч>Си<££€**><€> %

дальневосточное отделение /(¿[¿ц ¿гс+и^

ТИХООКЕАНСКИЙ ОКЕАНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ .

УДК 597.0

На правах рукописи

БЕССОНОВ ЮРИС ИВАНОВИЧ

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ И ЭНЕРГООБЕСПЕЧЕНИЯ ИОННЫХ НАСОСОВ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Владивосток 1989

Работа выполнена в Тихоокеанском океанологическом Институте Дальневосточного отделения Академии наук СССР

Официальные оппоненты: доктор биологических наук М.С.Еременко

доктор биологических наук г.Миронова доктор биологических наук С.Н.Орлов

Ведущая организация: Институт цитологии АН СССР

Защита состоится "_"_'_1989 г. в час. на

заседании Специализированного Совета

в Институте физиологии АН УССР (252601 Киев, 24 ГСП ул. Богомольца, д. 4) .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Автореферат разослан "_" _ _ 1989 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета д.б.н.

/

3.А.Сорокина

ОБШДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Все известные в настоящее время эпителиальные ткани являются барьером, отделяющим внутреннюю среду живых организмов (кровь, гемолимфа, интерстициальная жидкость) от внешней среды и, как правило, активно, с затратами энергии участвуют в системе гомеостаза организма, для поддержания которого активно транспортируют ионы из внешней среды в кровь (сорбирующие эпителии^ или в обратном направлении (секретирующие эпителии). В связи с тем, что система гомеостаза отслеживает обычно сразу несколько концентраций ионов, актуальным является изучение механизмов регуляции и энергообеспечения ионных насосов эпителиальных тканей, тем более, что нарушения в их работе могут привести к серьезной патологии организма и даже к его гибели.В настоящее время предложен ряд фармакологических препаратов (ами-лорид, фуросемид, этакриновая кислота, уабаин, их производные и т.п.), которые позволяют корректировать некоторые нарушения в системе гомеостаза. С другой стороны, слабо изучено взаимодействие механизмов регуляции и энергообеспечения ионных насосов эпителиальных такней с эндогенными регуляторами и субстратами ферментативных реакций, в том числе их взаимодействие с АТФ и ее производными.

Как показано в настоящей работе на примере эпителиев, представляющих основные 'морфологические (одно- и многослойные) и функциональные (сорбирующие и секретирующие) типы эпителиальных тканей, АТФ и ее производные активно взаимодействуют с системами трансэпителиального транспорта ионов, являясь аллостерическим регулятором, субстратом (в реакциях гидролиза) и продуктом (в реакциях синтеза АТФ) ферментов, осуществляющих трансэпителиальный транспорт ионов. Это взаимодействие весьма чувствительно к

"Г"" — "« 1Т1ТПМ I» иилиЛ|»ч*ЛпЯМ XT Р^-ЛФЛач!^ ОТ СЛ ~ ~ ^

быми электрическими полями и сопряжено с трансэпителиальной миграцией АТФ.

Состояние вопроса, в литературе по биофизике, физиологии и биохимии эпителиев содержатся единичные работы, в которых исследовалось взаимодействие экзогенной АТФ с системой трансэпителиального транспорта натрия. Из 14 типов эпителия (рассмотренных в обзоре литературы диссертации) данные о таком взаимодействии приведены только для трех эпителиальных тканей: в тонком кишечнике Лягушки и крысы АТФ стимулировала трансэпителиальный /абаин-чувствительный транспорт натрия (Kohn et al., 1967, 1970? Serencseer, Armstrong, 1971); эпителий слизистой желудка гид-

ролизует экзогенную АТФ внешней и серозной поверхностям (Durbin, Kircher, 1975), причем этот гидролиз, по-видимому сопряжен с секрецией водорода (Kidder et al., 1966); эпителиальные клетки проксимальных канальцев за 20 минут полностью поглощали АТФ из перфузата со стороны серозной поверхности (Shumpio et al., 1986).

Несмотря на небольшое число опубликованных фактов можно констатировать , что эффекты экзогенной АТФ не укладываются в существующие теоретические представления и не могут быть объяснены в рамках общепринятой в настоящее время "трансклеточной" гипотезы Функциональной организации трансэпителиального транспорта ионов натрия (Ussing, Windhager, 1964; Ussing, 1982).

Так же не могут быть объяснены в рамках трансклеточной гипотезы и некоторые другие экспериментальные факты: 1) чистая сорбция натрия из очень разбавленных растворов (менее 0.1 ммоль/л), когда пассивный вход натрия в цитоплазму эпителиальных клеток кожи лягушки через апикальную мембрану невозможен (Krogh, 1937, 1938; Cereijido.Rotunno, 1967,. Moreno et al., 1973); 2) ничтожно малый транспортный фонд натрия в эпителии кожи лягушки, исключающий диффузию натрия через цитоплазму клеток (Zerahn, 1969; Acevs, Erlij, 1971; Dorge,Nagel , 1972; Moreno et al., 1973); 3) базолатеральная локализация Na+,К+-АТФазы в секретирующих натрий эпителиях, исключающая ее участие в активной секреции натрия из'клетки через апикальные мембраны (Karnaky et al., 1971; Stirling, 1975; Ernst, 1975; Ernst, Mills, 1977; Silva et al., 1977; Mills, Dibona, 1980); 4) отсутствие обмена натрия, транспортируемого через эпителий желчного пузыря с внутриклеточным натрием (Hill, Hill, 1987); 5) угнетение трансэпителиального активного транспорта натрия через изолированную кожу лягушки флюороацетатом при неизменной концентрации натрия в цитоплазме эпителиальных клеток (Duncan et al., 1985) и т.п.

В связи с актуальностью как в теоретическом, так и в прикладном а,спекте правильного понимания функциональной организации трансэпителиального транспорта ионов представляется принципиально важным дальнейшее изучение фактов, не укладаваюшихся в схему общепринятой трансклеточной гипотезы. Эти исследования открывают новое направление в изучении эпителиев, конечной целью которого является создание функциональной модели трансэпителиального транспорта ионов натрия адекватной всем имеющимся экспериментальным данным.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в выяснении молекулярных механизмов взаимодействия экзогенной АТФ

с основными типами эпителиальных тканей (одно-,многослойных/сек-ретирующих-сорбирующих) , основных реакций этого взаимодействия, условий обратимости и механизмов регулирования этих реакций. В этой связи в число основных задач исследования входило:

1) Изучение влияния экзогенной АТФ из растворов, омывающих внешнюю поверхность эпителия, на трансмембранный транспорт ионов натрия (ТКЗ), в том числе в присутствии ингибиторов ионного транспорта.

2) Выяснение возможности специфического гидролиза экзогенной АТФ уабаин-чувствительной Ыа+,К+-АТФазой.

3) Выяснение условий обратимости реакции гидролиза АТФ, выяснение возможности синтеза АТФ на внешней поверхности эпителиальных тканей из АДФ и неорганического фосфата.

4) Выяснение возможности управления (регулирования) процессами гидролиза и синтеза АТФ внешней поверхностью эпителия трансэпителиальным электрохимическим градиентом.

5) Выяснение возможности трансэпителиальной миграции АТФ и определение фонда АТФ эпителиальных тканей.

Научная новизна работы. В итоге выполнения работы обнаружен ряд новых, неизвестных ранэе свойств эпителия , позволяющих существенно скорректировать представления о функциональной организации эпителиальных тканей. £

Впервые показано, что экзогенная АТФ из внешнего омывающего изолированную кожу лягушки раствора осуществляет регулирующее воздействие на систему трансэпителиального транспорта натрия, стимулирует этот транспорт (при концентрациях, превышающих 100

мкмоль/л) и уменьшает ингибирующий эффект амилорида на ТКЗ в диа-—8 —1

пазоне концентраций 10 -10 моль/л, причем, степень стимулирования ТКЗ и защитного эффекта от амилорида зависят от концентрации ^^илотлу Т7 М1"1 Я цгтпо АТФ—Си (II—ТрИ.1, "-ЛИЛ I МИГипЛ/ внешнем омывающем растворе.

Впервые показана способность внешней поверхности основных типов эпителиев (однослойных-многослойных/сорбирующих-секретирую-щих) к специфическому, уабаин-, амилорид-чувствительному гидролизу экзогенной АТФ внешней поверхностью эпителиев. Уабаин ингиби-ровал этот гидролиз при приложении со стороны серозной поверхности эпителия, амилорид - со стороны внешней (мукозной) поверхности. Интенсивность этого гидролиза у всех исследованных эпителиальных тканей была пропорциональна йонцентрации экзогенной АТФ и изменялась в зависимости от концентраций основных лигандов Иа+,К+-АТФазы в омывающих растворах, управлялась (регулировалась) как

трансэпителиальными электрохимическими (по калию и натрию) градиентами, так и слабыми (+50 мВ) электрическими полями.

Впервые на эпителиальных тканях показана обратимость реакции гидролиза АТФ (внешняя поверхность эпителия кожи и мочевого пузыря лягушки и кожи морской рыбы продемонстрировали способность к синтезу АТФ из АДФ и неорганического фосфата ) и определены некоторые условия обращения реакции Иа+,К+-АТФазы.

Впервые показана способность АТФ к трансэпителиальной миграции и к накоплению в эпителии изолированной кожи лягушки, определены составляющие Фонда АТФ в этом эпителии.

На основании анализа собственных экспериментальных данных и обзора литературы по предмету исследования в главе "Обсуждение результатов" показаны противоречия "трансклеточной" гипотезы с полученными результатами и предложена оригинальная "одномембран-. ная" модель функциональной организации трансэпителиального транспорта ионов натрия.

Практическое значение работы. На основании результатов экспериментальных исследований показано, что одной из мишеней токсических, лекарственных и других веществ, апплицированных к внешней поверхности эпителиальных тканей являются цитоплазматические центры N8 ,К -АТФазы, сохраняющие функциональную активность. Использование данных о функциональной организации трансэпителиального транспорта ионов натрия позволило обнаружить новое семейство гли-козидов (полигонатозидов), обладающих выраженной кардиотонической активностью, не ингибирующих Ыа+ ,К+-АТФазу и ТКЗ через кожу лягушки и, по-видимому, как следствие, обладающих чрезвычайно малой токсичностью - терапевтический диапазон концентраций полигонатозидов достигает двух-трех порядков (Стригина и др., 1985).

Полученные в работе данные позволили предложить изолированные эпителии водных животных, в том числе морских рыб в качестве тест -объекта для выяснения механизмов токсического действия на живые организмы тяжелых металлов и других загрязнений антропогенной природы, растворенных в воде (Бессонов и др., 1988).

Данные о функциональной организации многослойных эпителиальных тканей позволили предложить оригинальные решения при выполнении хоздоговорных работ, в результате чего получено авторское свидетельство

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на 12-м Всесоюзном съезде физиологов им. Павлова (Тбилиси, 1975) , на международном симпозиуме "Взаимодействие между водой и живым ве-

иеством" (Одесса, 1975) , I Всесоюзном биофизическом конгрессе (Москва, 1982), на Всесоюзном совещании по межведомственной программе "Ионный канал" (Каунас, 1983), на Выездной сессии межведомственного научно-технического Совета по биофизике (пос.Витязь, Владивосток, 1985) , на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" (Пуиино, 1986), на международных симпозиумах СССР-ФРГ (Киев, 1983, 1987), на П Международном Тихоокеанском симпозиуме по морским наукам (Находка,1988), представлены на 6 Всесоюзной конференции "Физиология почек и водно-солевого обмена" (Новосибирск, 1981), на б международном биофизическом конгрессе (Киото, 1978) , на 8 международном биофизическом конгрессе (Бристоль, 1984), на международном симпозиуме "Транспорт воды и ионов через эпителии" (Париж, 1986). По материалам диссертации опубликовано 37 научных работ.

Место проведения работы. Работа выполнялась на морской экспериментальной станции Тихоокеанского океанологического Института ДВО АН СССР "Витязь". Разделы, связанные с изотопными исследованиями, проведены в изотопной лаборатории МГУ (потоковые измерения 22 2 4

Ка и N8) и изотопных лабораториях Института белка АН СССР и Института биофизики АН СССР (измерения миграции АТФ и потоков неорганических фосфатов, а также включения метки неорганического фосфата в АТФ при изучении синтеза АТФ из АДФ и неорганических фосфатов). Автор благодарен за методическую помощь при измерении микроконцентраций АТФ В.А.Кратасюк и Г.Е.Бронникову; за помощь при выделении Ыа+ ,К+-АТФазы и определении ее активности К.Н.Дкан-джугазян и О.М. Рожмановой . Автор считает также своим приятным долгом поблагодарить директора Тихоокеанского океанологического Института ДЮ АН СССР, академика В.И.Ильичева за содействие и поддержку в проведении работы; К.Н,Джанджугазян за обсуждение и критические замечания к главам, посвященным свойствам Ыа+,К+-АТФ-азы, коллектив лаборатории физико-химической биологии ТОЙ ДЮ АН СССР за помощь в проведении экспериментов, обработке и оформлении результатов.

Структура и объем диссертации. Рукопись состоит из введения, шести глав, заключения и выводов. В первой главе даны основные-определения элементов системы трансэпителиального транспорта ионов, приведено краткое описание морфологии различных типов эпи-телиев, подробно рассмотрены ограничения, накладываемые при использовании электрофизиологических и потоковых методов изучения эпителиев. Вторая_глава посвящена описанию объектов и методов исследований. В третьей и четвертой главах обобщены главным образом

литературные данные. В третьей главе обобщены данные о молекулярных механизмах системы трансэпителиального транспорта ионов. В четвертой главе приведено в виде краткого обзора сравнение основных свойств системы трансэпителиального транспорта ионов натрия у 14 наиболее изученных эпителиальных тканей. В пятой главе изложены собственные экспериментальные данные. В шестой_главе "Обсуждение результатов" приведен обзор существующих гипотез трансэпителиального транспорта ионов, предложена оригинальная "одномембранная" модель функциональной организации трансэпителиального транспорта ионов натрия, обсуждаются следующие из этой модели выводы и новые подхода к проблеме ионного натриевого канала эпителиальных тканей и стехиометрии гидролиза/синтеза АТФ + +

Na ,К -АТФазой и трансэпителиального транспорта ионов натрия. За шестой главой следуют заключение и выводы к диссертации. Работа изложена на 390 страницах машинописного текста, включает 11 таблиц, 60 рисунков. Список литературы содержит 705 названий работ отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении к диссертации дано обоснование актуальности проведенных исследований, сформулированы цели и задачи работы, показана научная новизна результатов, практическое их использование, личное участие автора в получении изложенных данных, полнота публикации материалов и их апробация.

В первой главе "Основные определения" обобщены данные по морфологии эпителиальных тканей на примере кожи рыб и амфибий (многослойные эпителии*, мочевого пузыря, тонкого кишечника, жабр рыб (однослойные эпителии). Особое внимание уделено существованию на внешней поверхности эпителиев клеток, апикальные мембраны которых обладают неспецифической проницаемостью, а их цитоплазма доступна из раствора, омывающего внешнюю поверхность эпителия для веществ, обычно не проникающих через клеточные мембраны, например, лантана, свинца и т.п. В однослойных эпителиях эти клетки рассеяны мозаично по площади эпителия (McAvoy, Dixon, 1978) Rick et al., I978j Macknight, I980î Brown, Orci, 1986). В многослойных эпителиях эти клетки объединены в слои Stratum сог-neum (Rawlins et al., I97CÇMartinez-Palomo et aL,I97l;Erli j , Martinez-Palomo, 1972) , причем, как видно на рисунках, иллюстрирующих первый раздел главы, повреждение апикальных мембран при трансформации клеток Str. granulosum в клетки Str. corneum может происходить принудительно: при слущивании уходящие клетки уносят на ба-золатеральных мембранах в зонах межклеточных контактов обрывки 6

апикальных мембран клеток нижележашего слоя. Далее, в шести разделах первой главы представлены определения однонаправленных и чистого трансэпителиальных потокоэ ионов, как они определены Ус-сингом (Usslng, 1949 а,Ь) ; рассмотрено потоковое уравнение Ус-синга; определено понятие транспортного фонда, важнейшей характеристики система трансзпителиального транспорта ионов, измерение которого показало, что натрий пересекает эпителий, не обмениваясь с натрием цитоплазмы клеток (Zerahn, 1969; Acevs, Erlij, 1411} Dorge-, Nagel, 1972; Moreno et al., 1973); определено понятие электрогенного транспорта ионов, резюмирована история измерений трансэпителиальной разности потенциалов. Приведено понятие тока короткого замыкания (Ussing, Zerahn, 1951) , приведены ограничения применимости этого метода, рассмотрен метод фиксации потенциалов и измерения вольтамперных характеристик эпителиев; рассмотрены причины возникновения элактрических полей у поверхности эпителиев,

В главе П "Объекты и методы исследования" содержатся характеристики выбранных для изучения изолированных эпителиальных тканей (кожа морских рыб и амфибия, яабры рыб, мочевые пузыри позвоночных животных). Приведены рецептуры растворов, использовалных для инкубирования эпителиальных тканей, описаны метода измерения электрофизиологических (ток короткого замыкания, TK3J и разность потенциалов, РП) потоковых (изотопных) и биохимических параметров системы трансэпителиального транспорта конов натрия, приведены методик:: определения активности На+,к+-АТФазы, определения концентраций неорганических фосфатов, ATO, суммарных нуклеотидоЕ •и другие методики.

В главе И "Молекулярные механизмы трансэпителнального транспорта ионое" обобщены данные о молекулярных механизмах трансэпителиального транспорта ионов натрия - "базового" иона, транспортируемого активно, за редким исключением, всеми известными эпителиальными тканями. Все изученные эпителии транспортируют натрий прн участии Na+,К+-ATФазы (Ussing, Windhager, I964;Keynes, 1969; Erlij, 1976), специфически ингиокруемой ya Санном. С помощью меченого уаСаина была показана базолатеральная локализация фермента практически у всех (за исключением сосудистого сплетения) изученных эпителиев. Такая полярность эпителиальных клеток создает (наряду с малыми значениями транспортного фонда натрия) значительные затруднения для понимания, каким образом ионы натрия сорбируются эпителием из очень разбавленных растворов, когда электрохимический градиент для натрия через апикальные мембраны клеток направлен из цитоплазмы во внешний раствор, или каким об-

разом натрий секретируется в морскую воду через апикальные мембраны, когда электрохимический градиент имеет обратное направление.

Рассмотрена т.н. Na+,Na+-AT<t>a3a - режим работы Na+,K -АТФ-азы, при высоких концентрациях натрия в среде (Schuurmans-Ste-khoven et al., 1986). Показано, что в этом режиме работы фермент может осуществлять реверс направления чистого транспорта натрия. В нативных условиях (в эпителиях жабр и солевых желез морских рыб) Na+,К+-АТФаза, по-видимому, работает именно в таком режиме, характеризующемся,кроме изменения направления чистого натрия,сопряженным транспортом ионов хлора.

Пассивную ступень трансэпителиального транспорта ионов натрия подавляющее большинство авторов рассматривают как вход ионов в цитоплазму через селективные к натрию амилорид-чувствительные каналы апикальных мембран эпителиальных клеток (Cuthbert, Wong, 1972). Обычно (Cuthbert, Wong, 1972), но не всегда (Beños et al., 1979) синергистом эффекта амилорида на внешней поверхности эпителия является кальций. Далее в главе обобщены экспериментальные данные по изучению взаимодействия амилорида с внешней поверхностью эпителиев, рассмотрены модели натриевых каналов, представлены результаты их изучения методом patch clamp (Hamilton, Eaton, 1986) , показавших, так же как и при интегральных измерениях, существование двух популяций каналов (рецепторов амилорида), различающихся по сродству к ингибитору. Краткий обзор работ, посвященных изучению калиевого канала на внешней поверхности эпителия свидетельствует о"сопряженности" работы натриевого и калиевого каналов на внешней поверхности эпителиев: как правило, секреция калия осуществляется в обмен на сорбируемый ион натрия (McRobbie, Ussing, 1961; Zeiscke, Van Driessche, 1981). Обобщение данных литературы позволяет заметить очевидное сходство (по ряду свойств идентичность) свойств натриевых и калиевых ионных каналов со свойствами натриевых и калиевых центров Ыа+,К+-АТФазы.

В главе IV "Эпителиальные ткани, транспортирующие ионы" по данным литературы и собственным данным (для кожи рыб) произреде-но сравнение основных свойств системы трансэпителиального транспорта ионов у 8 секретирующих эпителиев (солевые железы, жабры рыб, оперкулярный эпителий, эпителий полости рта рыб, эпителий слизистой рта рыб, эпителий плавников рыб, кожа рыб, сосудистое сплетение) и 6 типов сорбирующих эпителиев (кожа амфибий, мочевой пузырь, почечные канальцы, слизистая желудка), а также приведены краткие данные об исследованиях на менее изученных эпителиях (анальные сосочки личинок и канальцы взрослых насекомых, эпи-

телий молочных желез, рубец овцы, роговица и хрусталик глаза, эпителий трахеи, клоаки птиц и т.п.).

Сравнение свойств "основных" и наиболее изученных типов эпителия проведено по 12 основным признакам (электрогенность, значения ТКЗ, ионные компоненты ТКЗ, функциональная асимметрия эпителия, чувствительность транспорта ионов к уабаину и амилориду, локализация Ыа+,К+-АТФазы, величина транспортного фонда натрия в сравнении с фондом натрия цитоплазмы, значения внутриклеточных концентраций натрия при различных концентрациях натрия в среде, данные о синцитиальной сети эпителиальных клеток и данные о взаимодействии экзогенной АТФ с эпителиальными тканями). Проведенное сравнение позволяет заключить, что несмотря на большое разнообразие эпителиальных тканей, транспортирующих натрий, основой системы трансэпителиального транспорта натрия как в секретирующих,

+ +

так и в сорбирующих эпителиях является Иа ,К -АТФаза, локализованная, как правило, в базолатеральных мембранах эпителиальных клеток и работающая в одном из двух режимов: электрогенном, уаба-ин- и амилорид-чувствительном режиме транспорта натрия и электронейтральном режиме транспорта натрия, сопряженном с транспортом аниона.

В главе V "Теоретический и экспериментальный анализ системы трансэпителиального транспорта ионов натрия" приведены собственные экспериментальные данные, сгруппированные в шесть основных разделов.

В разделе У.1 показано взаимодействие АТФ, АДФ и АМФ с системой трансэпителиального транспорта ионов и их влияние на степень ингибирования ТКЗ через изолированную кожу лягушки амило-ридом. Добавление в раствор рингера, омывающий внешнюю поверхность кожи, АТФ до конечной концентрации 10 мкмоль/л - 10 ммоль/л как правило, сопровождалось небольшим увеличением ТКЗ - до 120140% от исходного уровня. Введение АДФ, АМФ или повторное добавление АТФ в этот же раствор, а также введение АТФ в раствор, омывающий внутреннюю поверхность эпителия, не изменяло достоверно ТКЗ и РП. Введение АТФ на фоне эквимолярных концентраций На2НРО^ сопровождалось усилением стимуляции ТКЗ до 140-180% от исходного уровня. Стимулирующий эффект АТФ полностью снимался при введении

в раствор, омывающий внутреннюю (серозную) поверхность кожи,уаба--4

ина (10 моль/л) , ингибированиего ТКЗ независимо от присутствия АТФ во внешнем растворе. Присутствие в растворе, омывающем внешнюю поверхность кожи, эквимолярных с АТФ концентраций хлористого магния или высоких (выше 18 ммоль/л) концентраций калия также исключало стимулирующий эффект АТФ.

Помимо стимуляции ТКЗ АТФ в мукозном растворе в диапазоне концентраций 1 мкмоль/л - 100 ммоль/л ослабляла ингибирующий эффект амилорида на транспорт натрия (ТКЗ). Опубликованные ранее (Бессонов, Буцук, 1983) более низкие значения концентраций АТФ, ослабляющие эффект амилорида (расширение диапазона концентраций до 0.1 нмоль/л ) по-видимому^можно объяснить тем, что в этой работе не были учтены выявленные позже явления накопления АТФ в эпителии (Фонд АТФ),обеспечивающие в растворах, омывающих (в полукю-

2

ветах Уссинга с удельным объемом 1 мл/см ) изолированную кожу,концентрацию АТФ не ниже 1-2 мкмоль/л за счет эндогенной АТФ (см. раздел \\3.1). Уменьшение концентрации натрия в омывающих кожу растворах или увеличение концентрации калия сопровождалось уменьшением "защитного" эффекта АТФ.

Результаты, приведенные в этсм разделе, свидетельствуют, что на внешней поверхности эпителия кожи лягушки находятся (и доступны нз омывающего эту поверхность раствора) "рецепторы" АТФ, свойства которых сразу по нескольким признакам напоминают свойства цитоплазматических центров Ыа+,К+-АТФаэы.

Б разделе V.2 приведены результаты экспериментальной проверки

+ +

предположения о доступности цитоплазматических центров На ,К -АТФ-азы из растворов, смывающих внешнюю поверхность эпителиев изолированной кожи лягушки, мочевого пузыря лягушки, крысы и свиньи (сорбирующие эпителии), кожи и жабр морских рыб ИуохосерЬа1ив ЬгапйЫ (секретирующие натрий эпителии). При -постановке экспериментов исходили из предположения, что если цитоплазматические центры фермента сохраняют Функциональную активность, то они должны осуществлять уаСаин-чувствительныЯ гидролиз экзогенной АТФ, добавленной в раствор, омывающий внешнюю поверхность эпителия. На рисунке 1 приведена кинетика гидролиза экзогенной АТФ (200 мкмоль/л), добавленной в раствор, омываккий внешнюю поверхность кожи лягушки, измеренного по появлению неорганического фосфата в этсм растворе при различных экспериментальных воздействиях. Интенсивность гидролиза АТФ внешней поверхностью у всех исследованных эпителиев была пропорциональна концентрации АТФ (рис.2) и имела сложную форму зависимости от концентрации натрия во внешнем окызающем растворе (рис.3).

Особое внимание пртлгкашт "траисэпителиалыгле "эффекты лигандэв и ингибиторов из раствора, омывающего внутреннюю поверхность эпителия, на гидролиз АТФ внешней поверхностью. Так уабаин и бескалиевый раствор рингера, апплицированные со стороны внутренней поверхности эпителия кохи лягушки и морской рыбы, ингибировали этот гидролиз, причем степень ингибирования зависела от концентрации нат-10

рия и АТФ в растворе, омывающем внешнюю поверхность эпителия(табл. 1). Такая же (трансэпителиальная) уабаин-чувствительность гидролиза АТФ внешней поверхностью эпителия зарегистрирована для эпителия мочевого пузыря лягушки, крысы и свиньи. С другой стороны, добавление АТФ в раствор, омывающий внутреннюю поверхность эпителия, "трансэпителиально" стимулирует гидролиз АТФ внешней поверхностью эпителия кожи рыб.(рис.4).

Ф

н

[мкмоль/л] 60

40

Рис.1.Кинетика гидролиза экзогенной АТФ (2-Ю-4 М)(появления неорганического фосфата) внешней поверхностью изолированной кожи лягушки:

1 - контроль (2•10~4моль/л АТФ во внешнем омывающем растворе);

2 - внутренний омывающий раствор - бескалиевый Рингер;

3 - контроль (после отмыва чистыми растворами) во внешнем омывающем растворе 2•10~4 моль/л АТФ;

4 - во внешнем омывающем растворе 2 •10""' моль/л АТФ и 2 •Ю-4 моль/л амило-рид;

* 5 - контроль (после отмыва)

2-Ю-4 моль/л АТФ;

6 - в растворах, омывающих внутреннюю поверхность кожи лягушки 2-10"4 моль/л уабаина, во внешнем омывающем растворе 2-Ю-4 моль/ /л АТФ.

20

10'

20

30

40 t[Mtffl]

Рис.2.Концентрационная зависимость интенсивности гидролиза АТФ внешней поверхностью эпителия :

1,2 - кожи лягушки R.ri-dibunda (1- 115 ммоль/л натрия,2 - 2.5 ммоль/л натрия);

3 - кожи рыбы M.brandti (500 ммоль/л натрия во внешнем растворе);

4 - мочевого пузыря лягушки R.ridibunda (10 ммоль/л натрия);

5 - моневого пузыря крысы (10 ммоль/л натрия) и

6 - мочевого пузыря свиньи (10 ммоль/л натрия во внешней среде)

от концентрации АТФ в растворе, омывающем внешнюю поверхность эпителия.

ю4Ч

10

10

10

^ ч

3 2

-1дС0АТф[м]

10 £

[нмоль/см^ч]

0,1

10

100 1000 Ыа[нмоль/л]

Рис.3.Концентрационная зависимость интенсивности гидролиза экзогенной АТФ (2* •104 моль/л) внешней. поверхностью кожи лягушки Е.г1-с11Ьипс1а (1) кожи рыб. М.Ьгап<ЗЪ1 (2) и жабр рыб (3) от концентрации натрия в растворе, омывающем внешнюю поверхность кожи, — М + ст.

Интенсивность гидролиза нмоль

Рис.4.Трансэпителиальное влияние экзогенной АТФ из раствора, омывающего внутреннюю поверхность кожи рыб М.Ьгапс11:1, на гидролиз АТФ внешней поверхностью эпителия.

1 - концентрационная зависимость гидролиза экзогенной АТФ внешней поверхностью кожи. В растворе, омывающем внутреннюю поверхность кожи, АТФ нет;

2 - в растворе, омывающем внутреннюю поверхность кожи 2 ммоль/л АТФ,(М + о) .

Обнаружены также ингибиторы гидролиза АТФ внешней поверхностью эпителия : амилорид и кальций, действующие со стороны внешней поверхности (табл. 2). Для сравнения в этой же таблице приведены данные, что уабаин из внешнего раствора не ингибирует гидролиз АТФ внешней поверхностью эпителия кожи амфибий и морских рыб.

Результаты, приведенные в разделе У.2, свидетельствуют, что

из раствора, омывающего внешнюю поверхность исследованных эпите-лиев, доступны цитоплазматические центры Ыа+,К+-АТФазы, осуществляющие уабаин-чувствительный гидролиз АТФ. Противоположный полюс

(центры) фермента (внешний, уабаин- и калий-чувствительный) недоступны из этого раствора для уабаина (табл.2). Однако эти центры доступны для уабаина и калия из раствора, омываюшего внутреннюю поверхность эпителиев. Показано, что АТФ из этого раствора является "трансэпителиальным" стимулятором гидролиза АТФ этим ферментом, а амилорид и кальций со стороны цитоплазматических центров -ингибиторами гидролиза. Таким образом, имеются основания предполагать "трансэпителиальную локализацию фермента, гидролизуюшего АТФ на внешней поверхности эпителия.

Таблица 1. Эффект уабаина (2-10 4 моль/л) и отсутствия калия в растворе, омываюкем внутреннюю поверхность эпителия кожи лягушки и рыбы. В скобках приведено число измерений (М + а)

Концентрация Концентрация натрия во АТФ во внеш-внешнем ра- нем растворе Контроль створе_

Интенсивность гидролиза

Уабаин

Бэскалиен^й раствор Рингера

ммоль/л

ммоль/л нмоль/см час

% к исходному уровню

0.1 2.5 115

0.2 30+4 (4) 0.5 96+6 (6) 0.5 228 +-9 (8)

100 +12 (4) 0+0 (8) -75 + 6 (8)1

33+4 (8) 38 + 6 (8)

115 300 500

0.2 102 + 6 (8) 0.2 100 +12 (8) 0.2 100 + 8 (8)

40 + 7 (4) 50+6 (4) 104 + 7 (4)

81+4 (4) 84 +11 (4)

♦Примечание: знак минус означает, что после воздействия ингибитора уровень фосфатов в растворе стал меньше исходного уровня.

В разделе V.25 показано влияние слабых электрических градиентов "^стояннох и и перемепшл'и тодии Hd гидролиз эпителиями экзогенной АТФ.

Высказанное в предыдущем разделе предположение о "трансэпителиальной "локализации Na ,К+-АТФазы, гидролизуюшей АТФ на внешней поверхности эпителия, сделало актуальным изучение потенциалзависи-мости работы этого фермента, т.е. изучение зависимости интенсивности гидролиза АТФ от трансэпителиального электрического градиента. К моменту начала этих исследований- имелась предварительная информация о том, что гидролиз АТФ Na+,K+-AT®asoft может регулироваться слабым электрическим полем (Viera et al., 1972;Teissie, Tsong, 1980;Johnson, Chapman, 1985; Mironova et al., 1986).

*

Таблица 2. Эффект некоторых ингибиторов из внешнего раствора на гидролиз экзогенной АТФ внешней поверхностью кожи лягушки К.г1(11Ьипйа и рыбы М.Ьгапс1Ъ1

Концентра- Концентрация натрия ция АТФ во во внешнем внешнем растворе растворе

Интенсивность гидролиза

2 +

Контроль Амилорид Са Уабаин

(только 0.2 ммоль/ 0.2 0.2

АТФ)_/л_ ммоль/л ммоль/л

ммоль/л ммоль/л нмоль/л

% к исходному уровню

0.1 2.5 115

0.5 0.5 0.5

88+8 (8) 102+4 (8) 170+8(16)

-8+6 (4) -180+14(4) -120+8 (8)

2+1 (4) 150+9 (4) 95+8 (4)

115 0.2 93+8 (8) - - 95+6 14)

* 300 0.2 165+7 (8) 25+4 (4) 57+10(4) 100+8 (2)

§, 500 0.2 516+13 8 21+3 (4) 103+14(2)

£

На рисунке 5 представлена зависимость интенсивности гидролиза АТФ внешней поверхностью эпителия кожи рыбы М.ЬгапсИ:! от фиксированного на нем трансэпителиального электрического поля и влияние на это взаимодействие 0.2 ммоль/л амилорида, добавленного в раствор, омывающий внешнюю поверхность. Налицо высокая потенциал-зависимость этого гидролиза в области положительных потенциалов внешней поверхности эпителия (по отношению к внутренней) и практически независимость работы фермента при противоположных полярностях. Эффект амилорида также был потенциалзависим;в области отрицательных потенциалов поля, ингибирующий эффект амилорида уменьшается до 0 уже при -30 мв, Фиксированных на эпителии. "Отрицательные" значения интенсивности гидролиза означают, что наблюдалось уменьшение концентрации фосфатов (после введения амилорида) по сравнению с исходным уровнем (обычно около 20-30 мкмоль/л),т.е. фосфаты уходили в эпителий. Интенсивность гидролиза АТФ внутренней поверхностью эпителия кожи рыб также зависела от полярности и величины фиксированного трансэпителиального потенциала.

На рисунке 6 представлена частотная характеристика эффекта переменного трансэпителиального потенциала, амплитуда которого фиксировалась на эпителии кожи рыб и амфибий. Максимальная потен-циалэависимость гидролиза АТФ внешней поверхностью эпителия кожи рыб наблюдалась на частоте 10 Гц и 10 кГц, в коже амфибий на частоте 100 Гц. Интенсивность гидролиза АТФ внутренней поверхностью исследованных эпителиев не изменялась достоверно при фиксации на них переменной разности потенциалов в диапазоне частот от 0 до 10 кГц и амплитуд от 10 до 100 мВ. 14

Рис.5.Зависимость гидролиза экзогенной АТФ (4 ммоль/л) внешней

поверхностью кожи рыб МуохосерЬа1иэ Ьгапс1Ъ1 от трансэпителиальной фиксируемой разности потенциалов постоянного тока,

М + ст: в-в без амилорида, (п=8); I-А во внешнем растворе

0.2 ммоль/л амилорида, (п=8).

Рис.6(а и б).Амплитудно-частотная характеристика эффекта переменного напряжения, фиксируемого на эгителии кожи лягушки И.г1-сНЬшкЗа (а) и кожи рыб М.Ьгап<Н1 (б) , на гидролиз экзогенной АТФ (4 ммоль/л) внешней поверхностью кожи, М + а. В процентах к исходному уровню, принятому за 100%.

Результаты, приведенные в разделе V.2. ^свидетельствуют о высокой потенциалзависимости работы ферментов, гидролизующих АТФ на внешней поверхности исследованных эпителиев, и хорошо согласуются с данными, полученными на клеточных мембранах (Teissie, Tsong, 1980;Johnson, Chapman, 1985) и бислойных липидных мембранах, в которые предварительно встраивали Na+,К+-АТФаэу или ее Фрагменты (Kuraazawa et al., 1986; Mironova et al., 1986). Суммируя результаты, приведенные в разделе V.2.5, и данные литературы, можно заключить , что они не противоречат предположению о "трансэпителиальной" локализации фермента, работающего на внешней поверхности эпителия, по-видимому, в базолатеральных мембранах одного из наружных слоев клеток эпителия, цитоплазма которых доступна из внешнего раствора для АТФ, амилорида, кальция и т.п.

Раздел 425. "Проблема миграции АТФ". При анализе результатов, приведенных в разделе V.2 нашей работы, наше внимание привлек факт "трансэпителиальной" стимуляции гидролиза АТФ внешней поверхностью эпителия кожи рыб при аппликации АТФ в раствор, омывающий внутреннюю поверхность кожи. Имевшиеся к тому времени данные литературы свидетельствовали об активном взаимодействии экзогенной АТФ с клеточными и искусственными липидными мембранами (Hoffman, Proverbio, 1974; Besch et al., 1975, 1977; Hyman, 1975, 1977; Racker, Specter, I98Z; Gadsby et al., 1984; Elgavish, Elgavish, 1985, Shoemaker, Hoffman, 1985; Candia, 1986; Kitagawa, Akamatsu, 1986 и др.). Суммируя собственные экспериментальные данные и данные, приведенные в цитируемой литературе, мы пришли к выводу о возможности встраивания экзогенной АТФ в мембраны эпителиальных клеток и, как следствие, о возможности трансэпителиальной миграции АТФ, о существовании фонда накопления АТФ в эпителиях.

В разделе VÍ3.I приведены результаты экспериментальной проверки этих предположений.

В прямых опытах по измерению трансэпителиальной миграции АТФ концентрация нуклеотидов в растворе,омываюмем внешнюю поверхность эпите лия кожи лягушки, была пропорциональна концентрации АТФ (начиная с 2 ммоль/л) во внутреннем омывающем растворе и зависела от концентрации магния во внешнем растворе (рис.7). При меньших концентрациях АТФ во внутреннем растворе ее появление во внешнем растворе было ничтожно и не зависело от концентрации АТФ во внутреннем растворе. Однако, вывод о том, что при меньших концентрациях трансэпителиальная миграция АТФ не происходит, был бы преждевременным. Из данных, представленных на рисунке 8, следует, что уже начиная с концентраций АТФ во внутреннем растворе 50 мкмоль/л, о появлении АТФ в клеточных мембранах внешней поверхности эпителия

свидетельствует(пропорциональное увеличению ее концентрации в растворе, омывающем внутреннюю поверхность эпителия) появление неорганического фосфата в растворе, омывающем внешнюю поверхность кожи лягушки (зависевшее также от концентрации магния в этом растворе) . Идентичная закономерность зарегистрирована й в обратном направлении (рис.9): продукция неорганического фосфата в растворе, омывающем внутреннюю поверхность кожи лягушки, пропорциональна концентрации АТФ во внешнем омывающем растворе, начиная с концентрации 20-50 мкмоль/л.

7. Концентрационная зависимость интенсивности появления нуклеоти-дов в растворе, омывающем внешнюю поверхность,от концентрации АТФ в растворе, омывающем внутреннюю поверхность кожи лягушки К.г1с11Ьипс1а,

М+а: в-в без

Мд2+ во внешнем омывающем растворе (п=4) ; т- -Т 1 ммоль/л МдСХз во внешнем омывающем растворе,(п=4).

нуклеотиды Рис

Рис.8.Концентрационная зависимость интенсивности появления неорганических фосфатов ("эндогенного" гидролиза) во внешнем, омывающем кожу лягушки I*. г 1<ИЬипс1а растворе от концентрации экзогенного АТФ в растворе,омывающем внутреннюю поверхность кожи.

М+сг:®-

без Мд

5+

[нмоль/см ч] 80

60

40

20

во внешнем растворе, (п=3) -Т 1 ммоль/ /л мдС12 во внешнем омывающем растворе, (п=4).

^----

ММОЛЬ/Л

10 юо 1000 10000

*АТФ^[мкмоль/л]

О встраивании АТФ в мембраны клеток внешней и внутренней поверхностей кожи лягушки свидетельствуют также результаты измерения фонда АТФ на внешней и внутренней поверхностях эпителия (рис. 10)'. Так же как и в опытах по "трансэпителиальной" продукции

фосфатов зависимость величины фонда АТФ от ее концентрации в омывающих растворах регистрируется, начиная с концентраций, превышающих 50 мкмоль/л. Из данных, приведенных на рисунке 10, следует существование эндогенного фонда АТФ в клеточных мембранах (или клетках) внешней и внутренней поверхностей кожи лягушки, величина которого имеет порядок соответственно 20 и 50 нмоль/см . За счет

экзогенной АТФ объем этого фонда может возрасти соответственно до 2

100 и 1500 нмоль/см при 10 ммоль/л АТФ в омывающих растворах. Однако, как следует из рисунка 7, АТФ крайне "неохотно" мигрирует из фонда во внешнюю среду - это происходит только при очень больших трансэпителиальных градиентах АТФ. , 2

нмоль/см .4 „ „ ._ _

^ Рис.У. Влияние АТФ в растворе,

омывающем внешнюю поверхность эпителия кожи лягушки <31Ьипс1а на трансэпителиальный поток фосфатов (интенсивность появления в растворе, омывающем внутреннюю поверхность), М + с:

х-х без АТФ во внутреннем

омывающем растворе,(п = 4);

в-о 5-10 5 моль/л АТФ во

внутреннем омывающем растворе, (п = 4) . .

10 ' АТФ, М

Рис.10.Зависимость величины

фонда АТФ на внешней (•-• ),

(п = 4) и внутренней;»- -•), (п = 4) поверхностях кожи лягушки И.г1й1Ьипда от концентрации АТФ в омывающих эти поверхности растворах, М + а.

2000

1000

100'

10

Нуклеотиды_ [нмоль/см2]

/ /

/У

_ВНУ ----У /

/

Снаружи ' /

/

У/

10

100

1000 100С АТФ [мкмоль/д

1

Результаты, приведенные в разделе У.Э. ^свидетельствуют о способности внешней и внутренней поверхностей эпителиеа сорбировать экзогенную АТФ, принимающую непосредственное участие в "трансэпителиальной" продукции (секреции и сорбции) неорганических фосфатов. Трансэпителиальная миграция АТФ (вез выхода нуклвотидоя в раствор, омывающий противоположную поверхность эпителия) регистрируется в диапазоне концентраций АТФ 50-2000 мкмоль/л, при более высоких концентрациях АТФ в раствора, омывающем внутреннюю поверхность эпителия кожи лягушки, трансэпителиальная миграция АТФ сопровождается выходом нуклеотидоз а раствор, 0№!вак>ший внешнюю поверхность .

Раздел посзяжен изучению проницаемости неорганических фосфатов через эпителий кожи лягушки и рыбы, т.к. данные предыду-каго раздела позволяют сделать вывод, что, по крайней мэре часть трансэпителиальнся проницаемости для фосфатов определяется взаимодействием АТФ с мембранами и Ферментами эпителиальных клеток. При низких концентрация АТФ з ошщахдаих внутреннюю поверхность эпителия растворах (менее 2 мкмоль/л), как следует из рисунков 8-11, АТФ служит своеобразным переносчиком фосфата, секретируемо-го во внешний раствор в результате гидролиза молекулы нуклеотида, остающейся в мембране, либо, что менее вероятно, за счет конкурентного вытеснения АТФ фосфатов из их фонда в эпителии. Денные о стимулирующем действии амилорида на трансэпителиальную проницаемость для фосфатсв (табл.3) свидетельствуют о том, что эта проницаемость пропорциональна концентрации АТФ во внешнем ошавшем растворе, причем эффект амилорида также пропорционален этой концентрации.

Таблица 3. Влияние амилорида на трансэпителиальннй поток фосфатов через кожу лягушки Я.г1<11Ьипйа из внешнего зо знутрен-

«•«л тля««"« . пэтёуеп»»«»

на 60-Я минуте после введения амилорида

Концентрация натрия во внешнем растворе

Концентрация АТФ во внешнем растворе

Интенсивность потока фосфатов

Дмилорид (0.2 тюль/ Контроль /л) во зяешяем растворе

ммоль/л

нмоль/см ч

% к иск.

2.5 2-Ю"4 60+4 (8) 140 + 5 (3)

10 5'10"4 100 (2) 815 +220(5)

115 Ю"5 17+1 (4) 107*+ б (4)

115 10"3 270 +10 (4) 1053 +80 (4)

Аналир данных, проведенный в разделе \Л3.2,по влиянию на проницаемость для фосфатов амилорида, АТФ, трансэпителиального электрического поля, бескалиевого раствора Рингера и др. позволяют

предположить, что эта проницаемость сопряжена с работой "транс-

+ +

эпителиально" локализованной Na ,К -АТФазы и, в значительной мере, определяется поляризацией фиксированных зарядов в устье ионного канала, проводимость которого для фосфатов индуцируется указанными выше воздействиями.

+ +

В разделе У.4 исследована возможность обращения Ыа ,К -АТФаз-ной реакции внешней поверхности эпителиальных тканей с гидролиза на синтез АТФ. На рисунках 11, 12 и 13 представлена кинетика появления (синтеза) АТФ в растворе, омывающем внешнюю поверхность * эпителия кожи рыб, кожи амфибий и мочевого пузыря амфибий. Главным условием обращения реакции являлось превышение концентрации АДФ (субстрата реакции синтеза и продукта гидролиза) над концентрацией АТФ (субстрата реакции гидролиза и продукта реакции синтеза) . Высокая концентрация натрия во внешнем растворе является необходимым условием синтеза АТФ внешней поверхностью секретирующе-го натрий эпителия кожи рыб, но ингибирует синтез АТФ сорбирующим. эпителием - кожи и мочевого пузыря амфибий.. Калий и уабаин из раствора, омывающего внутреннюю поверхность эпителия "трансэпителиально" ингибировали синтез АТФ, соответственно кожей лягушки.

Синтез АТФ у внешней поверхности изолированной кожи лягушки в случае избытка АДФ и неорганического фосфата регистрируется в течение продолжительного времени - до десяти часов и более.

Рис.11.Кинетика появления (синтеза) АТФ в растворе, омывающем внешнюю поверхность кожи рыб М.Ьгапс^!, М + а: о——о во внешнем растворе 200 мкмоль/л АДФ и столько же Ыа2НРС>41(п=4) ;

^—^ после преинкубации внутренней поверхности с уабаином 0.2 ммоль/л, (п=4) ;

©-

-О кинетика сорбции АТФ из внешнего раствора.

30 [ мин]

АТФ [мкмоль/л]

100'

60 мин

Рис.12.Кинетика синтеза АТФ в растворе , омывающем внешнюю поверхность кожи лягушки И. г1<31-ЬшкЗа, М +о:

1 - контроль (во внешнем растворе

200 мкмоль/л АРФ и неорганического фосфата, изнутри -бескалиевый Рингер);

2 - в раствор, омывающий внутрен-

нюю поверхность кожи (Рингер), добавлен калий (2 ммоль/л) (п = 4) ;

3 - после отмыва калия из внутрен-

него омывающего раствора

4 - запуск реакции синтеза АТФ на

фоне гидролиза экзогенной АТФ внешней поверхностью кожи добавлением избыточного количества АДФ (600 мкмоль/л)

АТФ. [мкмоль/л}

Рис.13.Кинетика синтеза АТФ внутренней(А--А---А) и внешней

-•) поверхностью кожи лягушки К.г1<НЬип<За. Представлены результаты измерений синтеза на двух изолированных кусочках кожи »1 и »2.

Результаты, представленные в разделе У.4, свидетельствуют о том, что локализованная на внешней поверхности эпителия Ка+,К+-АТФаза сохраняет способность к обращению реакции гидролиза на синтез, чувствительный ("трансэпителиально") к-добавлению калия и уабаина к внутренней поверхности эпителия.

Глава VI "Функциональная организация трансэпителиального транспорта ионов натрия" содержит обсуждение результатов и обсуждение проблем, поставленных полученными результатами перед теорией эпителиальных тканей.

В первом разделе главы, разделе VI.1, критически рассмотрены существующие гипотезы функциональной организации трансэпителиальной сорбции и секреции ионов натрия (гипотезы: селективной мембраны, переносчиков, активного насоса на апикальной мембране,

?рансклаточкь:х каналов, единственного асимметричного барьера, латерального транспорта, "пассивной" секреции и секреции по трансклеточным каналам) к показаны их противоречия существующим экспо-римантвльньх фактам.

В раздело VI.2 обобщены противоречия теории трансэпителиального транспорта и показано, что без существенной модификации ни одна и$ суцоствувьих моделей трансэпителиального транспорта ионов ко в состоянии объяснить имеющиеся в распоряжении исследователей экспериментальные факты.

В раздела VI.3 проведено сравнение свойств по 33 признакам цитоплазматических центров Иа+,К+-АТФазь: и рецепторов АТС, амило-рида, натрия, Са, Мд к др. на внешней поверхности эпителиев. Показано совпадение их свойств по этим признакам.

а раздало VI.4 на основании собственный экспериментальных данник и анализа данных литературы предложена одномембранная модель функциональной организации трансзпитолиального транспорта ионов натрия для сокротируюшх и сорбирукгах эпнтелкеа (рис.14).

>1 ¿ß^fr^^ji^^fi

гЧН W И'.

v м-'

[ fiii

лг

..-г-«*

Рис.14, Одномембранная гипотеза, t.j. - плотные контакты, непроницаемые для уабаиаа и калия»«С - Н«'г,К+-АТФаза» N - ядра клеток»еэ- митохондрии) цитоплазма клеток слоев Str.granulosuir., Str. spinosum и Str.gerrninatium объединена проницаемей межклеточными контактами в "синцитиальную" сеть. Единственным барьером для электрохимического града-бита а конов, пересекающих эпителий, является самый внутренние (на рисунке слава) спой клеток Str.corneura,соединенных плотными контактам:!, апикальная мембрана которых обладает неспецифическоа проницаемостью.

Предложенная модель позволяет объяснить многие необъяснимые в свете существующих гипотез экспериментальные факты (трансэпителиальную сорбцию натрия из очень разбавленных растворов, ничтожно малый транспортный фонд натрия, секрецию натрия в гипертонические растворы против электрохимического градиента гидролиз и синтез АТФ внешней поверхностью эпителиев, трансэпителиальные эффекты ингибиторов и стимуляторов транспорта ионов и т.п.). С другой стороны одномембранная модель ставит перед исследователями новые проблемы, например, проблему энергообеспечения такого транспорта, проблему ионного канала эпителиальных тканей, проблему стехиометрии гидролиза АТФ и трансэпителиального транспорта ионов. Часть из этих проблем экспериментально разрешена в процессе раГоты над диссертацией, две последние обсуждаются в разделах VI.5 и VI.6.

В разделе VI.5 обсуждается проблема ионного канала, сопряжен-+ +

ного с Ыа ,К -АТФазой. На основании анализа литературы и собственных данных делается предположение, что натриевый амилорид-чувст-вителькый канал внешней поверхности эпителия - это канал, содержащийся в комплексе фермент-мембрана и локализованный в базолате-ральных мембранах эпителиальных клеток, доступных из раствора, омывающего внешнюю поверхность эпителия.

В разделе VI.6 обсуждается стехиометрия трансэпителиального транспорта ионов натрия и его сопряжение с гидролизом и синтезом АТФ Иа+,К+-АТФаэой. Центральным в этом обсуждении является вопрос

о соотношении энергии, высвобождаемой при гидролизе одной молеку-

+ +

лы АТФ (или необходимой для синтеза одной молекулы АТФ) Ша ,К -АТФазой и числом ионов, которые могут быть перенесены за счет этой энергии против электрохимического градиента(ЭХГ), или числом ионов, которым необходимо отдать энергию ЭХГ для того, чтобы обеспечить синтез одной молекулы АТФ. В ситуациях, характерных для нативных клеток, при ЭХГ порядка 110 мВ и энергии гидролиза ЛТ5 около 320 эмБ эта стехиометрия составляет 3 иона натрия на одну молекулу АТФ как для гидролиза и активного транспорта натрия, так и для обращенной реакции. Однако при значительно меньших ЭХГ, характерных для некоторых типов эпителиЯ'(0-50мЕ),за счет энергии гидролиза одной молекулы АТФ против ЭХГ может быть перенесено значительно большее число ионов натрия. В этом случае появляется избыточная энергия (если число натриевых центров на ферменте не изменяется и равно, как принято считать, 3). Эти расчеты ставят исследователей перед дилеммой: либо эта энергия обращается в тепло; и тогда это можно зарегистрировать в калориметрических измерениях, либо изменяется число мест связывания на ферменте* Вопрос остается открытым.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение взаимодействия экзогенной АТФ с внешней поверхностью эпителиальных тканей позволило обнаружить ряд новых, неизвестных ранее свойств эпителиев. Полученные данные существенно дополняют наши знания о возможной роли АТФ в системе энергообеспечения и регулирования трансэпителиального ионного транспорта; о свойствах внешней и внутренней поверхностей эпителиев кожи амфибий, рыб, жабр рыб, мочевого пузыря позвоночных животных; о свойствах Na+,К+-АТФаэы "трансэпителиально" локализованной на внешней поверхности эпителиальных тканей; о возможных мишенях фармакологических и токсических веществ на поверхности эпителия; о природе воздействйя слабых электрических полей на живые организмы и т.п. Многие из полученных результатов, так же как и некоторые известные ранее экспериментальные факты, перечисленные в разделе VI.2, не могут быть объяснены в свете существующих модификаций общепринятой в настоящее время трансклеточной гипотезы функциональной организации трансэпителиального транспорта ионов натрия. Предложенная автором в качестве рабочей гипотезы "одно-мембранная" модель трансэпителиального транспорта ионов натрия снимает многие из указанных выше противоречий и оказалась конструктивной при проведении данной работы. С ее помощью обоснована целесообразность постановки экспериментов по изучению систем гидролиза экзогенной АТФ и синтеза АТФ из АРФ и неорганического фосфата внешней поверхностью эпителия (бессмысленных с позиций "трансклеточной" гипотезы)(Эксперименты по изучению трансэпителиальной миграции АТФ и фосфатов и эксперименты по влиянию слабых электрических полей на работу Na+,К+-АТФазы внешней поверхности эпителия .

вывода

1. Внешняя поверхность эпителиев кожи лягушки Rana ridibunda и рыб Myoxocephalus brandti, мочевого пузыря лягушки, крысы и свиньи, жабр рыб (М.brandti) обладает способностью гидролиэо-вать экзогенную АТФ при участии Na ,К -АТФазы, локализованной трансэпителиально. Гидролизующие АТФ амилорид-чувствительные, кальций-чувствительные и натриевые центры фермента доступны из раствора, омывающего внешнюю поверхность эпителия, а уаба-ин-чувствительные и калиевые центры этих же молекул доступны из раствора, омывающего внутреннюю (серозную) поверхность эпителия и не доступны для калия и уабаина из раствора, омывающего внешнюю поверхность.

2. Система гидролиза АТФ внешней (и внутренней) поверхностью эпителия кожи лягушки Е.г1<Шэип<За и рыб М.Ьгап<31;1 модулируется. по интенсивности гидролиза при фиксации трансэпителиально внешнего электрического поля 10-100 мВ в диапазоне частот от 0 до 10000 Гц. "Резонансные" частоты (частоты наибольшего угнетения гидролиза) специфичны и отличаются у эпителия кожи рыб и амфибий.

3. Внешняя поверхность эпителия кожи лягушки И. г1с11Ьипс1а и рыб М.ЬгапсИ:! обладает способностью синтезировать АТФ из АДФ и неорганического фосфата при участии Ка+,К+-АТФазы, локализованной трансэпителиально. Синтезирующие АТФ центры фермента доступны (для АДФ и фосфата) из раствора, омывающего внешнюю поверхность эпителия, уабаин- и калий-чувствительные центры - из раствора, омывающего внутреннюю поверхность эпителия. Для запуска синтеза АТФ внешней поверхностью эпителия необходима высокая концентрация натрия со стороны диссоциации натрия от трансэпителиальной транспортной системы (то есть со стороны серозной поверхности у лягушки и со стороны внешней поверхности у рыб)и превышение концентрации АДФ над концентрацией АТФ.

4. Внешняя и внутренняя поверхность эпителия кожи лягушки и рыб сорбирует экзогенную АТФ из омывающих растворов. При этом АТФ накапливается в эпителии в виде двух составляющих фонда АТФ: быстрой (£^2 ~ мин) и медленной 20-40 мин).

5. АТФ из раствора, омывающего внутреннюю поверхность эпителия кожи амфибий и рыб, мигрирует через эпителий к внешней поверхности и принимает участие в продукции (секреции) неорганических фосфатов во внешний омывающий раствор (и в обратном направлении) . При концентрации АТФ в растворе, омывающем внутреннюю поверхность эпителия с юмкмоль/л до 2 ммоль/л эта АТФ-зависимая продукция фосфата осуществляется без выхода АТФ во внешний раствор. Дальнейшее увеличение концентрации АТФ сопровождается пропорциональным увеличением ее концентрации во внешнем растворе.

6. Проницаемость эпителия кожи лягушки для фосфатов пропорциональна концентрации АТФ в омывающих кожу растворах и достоверно увеличивается после введения во внешний омывающий раствор амилорида. Увеличение проницаемости для фосфатов, индуцированное 'амилоридом, также пропорционально концентрации АТФ в омывающих растворах.

7. Приведенные в настоящей работе результаты хорошо согласуются с предложенной авторога "одномембранной" моделью, согласно которой единственным физико-химическим барьером, разделяющим растворы, омывающие внешнюю и внутреннюю поверхности эпителия, являются базолатеральные мембраны самого внутреннего (самого молодого) слоя клеток Stratum corneum для многослойного эпителия ^ (и/или базолатеральные мембраны клеток, мозаично рассеянных по однослойному эпителию), апикальные мембраны которых обладают неспецифической проницаемостью. Цитоплазмати-ческая поверхность этих базолатеральных мембран доступна для АТФ, кальция, натрия, амилорида и др. из раствора, омывающего внешнюю поверхность эпителия, а их внешняя поверхность доступна для уабаина, натрия, калия и др. из раствора, омывающего внутреннюю поверхность эпителия, но недоступна для этих веществ из раствора, омывающего внешнюю поверхность эпителия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Бессонов Б.И. Исследование активного транспорта ионов в проксимальном и дистальном сегментах нефрона крысы // Материалы 3 Всесоюзн. конф. по водно-солевому обмену. Орджоникидзе, 1971.

Бессонов Б.И. Электрофизиологическое исследование функции проксимального и дистачьного канальцев нефрона некоторых позвоночных // Журн. эволюц. биохим. и физиол. АН СССР, 1972.- Т. 8. - С. 206-208.

Бессонов Б.И. Физико-химические основы трансэпителиального активного транспорта ионов натрия // Доклад на Еыездной сессии научного Совета АН СССР по проблемам биофизики в ДВНЦ АН СССР. Владивосток, 1985 / Информ. бюлл. н.с. по проблемам биофизики АН СССР, 1986.- № 20,- С. 36-38.

Бессонов Б.И., Бобков Ю.В., Бронников Г.Е., Еуцук C.B., Никифоров E.JI. , Пластинкинд. В. , Суриц В. Б. Синтез АТФ внешней поверхностью кожи лягушки // Докл. АН СССР, 1989.-

Бессонов Б.И., Бельчева H.H., Саенко Г.Н., Холкин В.Я. Эффект

2,4-динитрофенола на светоиндуцированные изменения накопления ионов в талломе Ulva fenistrata // Взаимодействие между водой и живым веществом. М.: Наука, 1979.

Бессонов Б.И., Буцук C.B. Электрофизиологическое исследование нефрона крысы при различном уровне реабсорбции // Материалы конф. молодых ученых ИЭФ и Б им. Сеченова АН СССР. Ленинград, 1971.

Бессонов Б.И., Буцук C.B. Влияние фуросемида и строфантина на активный транспорт ионов в канальцах нефрона крыс // Физиологический журнал АН СССР, 1972.- Т. 58, № 8.- С. 1281-1286.

Бессонов Б.И., Буцук C.B. Исследование электрических полей постоянного тока и механизмов их генерирования у морских костистых рыб // Измерение параметров динамических систем. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1977.

Бессонов Б.И., Буцук C.B. Влияние некоторых химических, физических и биологических факторов на электрическое поле постоянного тока подкаменщика M.brandtl // Тезисы Всесоюзн. конф."По-

ведение рыб в связи с техникой рыбоводства". Клайпеда, 1980.

Бессонов Б.И., Еуцук С.Е. Электрическое поле постоянного тока и СНЧ в морской воде, генерируемое морскими костистыми рыбами // Тезисы Океанологического съезда. Ялта, 1982.

Бессонов Б.И., Буцук C.B. Влияние АТФ на амилорид-чувствительные к натрию ионные каналы внешней поверхностью кожи лягушки // Тезисы I Всесоюзн. биофиэ. съезда СССР. Москва, 1982.

Бессонов Б.И., Буцук C.B. АТФ-зависимый активный транспорт ионов кожей морского подкаменщика // Тезисы I Всесоюзн. биофиз. съезда СССР. Москва, 1982.

Бессонов Е.И., Буцук C.B. Влияние некоторых нуклеотидов, амилори-да и ионов на активный транспорт ионов кожей лягушки. Одно-мембранная модель // Докл. АН СССР, 1983.- Т. 268, № 2.-С. 478-481.

Бессонов Б.И., Буцук C.B. Модель системы гидролиза-синтеза АТФ внешней поверхностью эпителия // Тезисы Всесоюзн. симп. "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена". nj'iHHHO, 1986.

Бессонов Б.И., Буцук C.B., Миронова Н.К. Изучение молекулярных

механизмов генерирования электрических полей постоянного тока и СНЧ // Тезисы Всесоюзн. конф. "Поведение рыб в связи с техникой рыболовства". Клайпеда, 1980.

Бессонов Б.И. , Буцук C.B., Никифоров E.JI. , Бобков Г. В. , Косолапов A.B., Пономарева Т.И. , Пластинкин Д.В. Эффект цинка на гидролиз АТФ эпителием кожи рыб // Тезисы доклада на 2 Международном тихоокеанском симп. по морским наукам. Находка, 1988.

Бессонов Б.И., Буцук C.B., Овчинникова М.Б., Яснецкий Г.Н. Взаимодействие амилорида и АТФ с системой активного транспорта ионов натрия эпителиальными тканями // Тезисы 6 Всесоюзн. конф. "Физиология почек и водно-солевого обмена". Новосибирск, 1981.

Бессонов Б.И., Буцук C.B., Свешников В.Г. Активный транспорт

ионов кожей морских костистых рыб // Тезисы международн.симп.-"Взаимодействие между водой и живым веществом". Одесса, 1975.

Бессонов Б.И., Буцук C.B., Свешников В.Г. Электрогенные механизмы ионного транспорта кожи рыб // Экологическая физиология рыб. Киев: Наукова Думка, АН СССР. 1976,- Т. 1.- С. 129-130.

Бессонов Б.И., Буцук C.B., Федоров А.И. Электрическое поле кожи рыб // Вопросы ихтиологии АН СССР, 1975.- Т. 15, № 5,- С.929-931.

Бессонов Б.И., Буцук C.B., Свешников В.Г. Активный транспорт

ионов кожей морских рыб // Тезисы 12 Всесоюзн. съезда физиологов им. Павлова. Тбилиси, 1975.

Бессонов Б.И., Буцук C.B., Черноусова М. Б. Амилорид-чувствитель-ньте селективные к натрию ионные каналы внешней поверхности кожи морского подкаменщика // Тезисы I Есесоюэн. биофиэ. съезда СССР. Москва, 1982.

Бессонов Б.И., Буцук C.B., Черноусова М.Б. Гидролиз АТФ и синтез АТФ из АДФ и неорганического фосфата внешней поверхностью кожи морского подкаменщика // Докл. АН СССР, 1987,- Т. 296, № 5.- С. 1269-1273.

Будук С. В., Бессонов Б.И., Марцен Е.В. , Полякова В.Э. Гидролиз и синтез АТФ внешней поверхностью кожи морского подкаменщика // Тезисы Всесоюзн. симп. "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена". Пущино, 1986.

Буцук С.В., Свешников Б.Г., Бессонов Б.И. Активный транспорт ионов кожей морских костистых рыб // Взаимодействие между водой и живым веществом. М.: Наука, 1979.- С. 152-156.

Ильичев В.И., Бессонов Б.И., Буцук С.В., Павлов В.И. Влияние электрического поля на гидролиз АТФ изолированной кожей морского подкаменщика Myoxocephalus brandti. Одномембранная модель // Докл. АН СССР, 1987.- Т. 297, № 1,- С. 215-218.

Коркушко А.О., Крьчцталь О.А. , Бессонов Б.И., Тесленко В.И. Амило-рид и другие органические катионы блокируют протон-активируе-мую натриевую проводимость мембраны нервной клетки // Тезисы 3 Международ, симп. СССР-Швейцария. Ташкент, 1983.

Коркушко А.О., Крышталь О.А., Кессонов Б.И., Тесленко В.И.

Блокирование амилоридом активируемой ионами водорода натриевой проницаемости мембраны сенсорных нейронов // Врачебное дело, 1984.- Вып. 3.- С. 84-87.,

Соколова М.М., Бахтеева В.Г., Бессонов Б.И. Участие почек в ионной регуляции Тихоокеанского лосося в пресноводный период // Эволюция вегетативных функций. Ленинград: Наука, 1972.

Стригина Л.Н., Мешерская К.А., Кривилевич В.Я., Бессонов Б.И.

Влияние производных 25 R-cnHpocT-5-ЕН-З В 17 а-диола на сердечно-сосудистую систему // Химико-фармацевтический журнал, 1985.- » 8.- С. 984-987.

Bessonov B.I., Butsuk S.V. , Jasnetski G.N. The reverse of the active sodium transport through the isolated abdominal fish skin (Myoxocephalus brandti) // Proceed. Sixth Internat. Biophysics Congress. Kyoto, 1978.- P. 288.

Bessonov B.X., Butsuk S.V., Chernousova M.B. Amilorid-sensitive fragment of the Na-selective transmembrane structures // Proceed. 8th International Biophysics Congress. Bristol, 1984.- P. 086.

Bessonov B.I., Butsuk S.V., Chernousova M.B., Shulatiev A.E. The anion (phosphate) permeability of epithelia induced by amiloride // Rep. Intern. Symp. USSR-W.Germany, Kiev, 1987.

Butsuk S.V., Bessonov B.I. The reverse of the short circuit current and potential differences through the Isolated abdominal fish skin Myoxocephalus brandti // Proceed. 6th International Biophysics Congress. Kyoto, 1978.- P. 297.

Butsuk S.V., Bessonov B.I. The reverse of the direct current

electric field around marine teleosts // Proceed. 6th International Biophysics Congress. Kyoto, 1978.- P. 126.

Butsuk S.V., Bessonov B.I. Direct current electric field in seme Teleost species: effect of medium salinity // J. Сотр. Physiol. , 1981.- Vol. 141, N 2.- P. 277-282.

Butsuk S.V., Gerdev Ju.P., Marchen E.V., Kosolapov A.V., Bessonov B.I. Effect of direct current and alterate (10 Hz - 10 kHz) transepithelial potential differences on the ATP hydrolysis by the external and internal epithelial surfaces // Rep. Intern. Symp. USSR-W.Germany. Kiev, 1987.

T-II32S 30.06.89 г. Зак. I952P Тир. 150 экз. Уч.изд.л.- 2.0

Отпечатано на ротапринте в СНТИ ffJS!