Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Н+-АТФаза и транспорт ионов через вакуолярную мембрану дрожжей Saccharomyces carlsbergensis

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кулаковская, Татьяна Валентиновна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА I. Функции вакуолей в клетках грибов и растений

1. Методы исследования вакуолей

2. Вакуоль-лизосома дрожжевой и растительной клетки. . II

3. Вакуолярная компартментация низкомолекулярных метаболитов, и участие вакуоли в регуляции их содержания в цитоплазме

ГЛАВА 2. Транспорт веществ через вакуолярную мембрану

1. Белково-ляшщцный состав тонопласта.

2. Характеристика некоторых транспортных систем вакуолярной мембраны

3. АТФ-зависимый транспорт в изолированные вакуоли и везикулы тонопласта

ГЛАВА 3, Н^-АТФаза ~ основной фермент, энергизующий транспорт через мембрану вакуолей

1. Свойства АТФазы вакуолей

2. АТФаза вакуолей - электрогенная БГ^-транслоказа

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Выращивание дрожжей

2. Получение сферопластов из дрожжевых клеток

3. Выделение вакуолей

4. Выделение тонопласта

5. Солюбилизация и очистка вакуолярной АТФазы*

6. Аналитические методы

Определение активностей ферментов:

Глюкозо-б-фосфат-дегидрогеназа

Сукцинатдегидрогеназа. оС-маннозидаза

Неспецифическая фосфатаза

АТФаза и другие фосфогидролазы.

Оцределение ортофосфата.

Определение белка.

Оцределение ДрН и Е^

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА I. Обнаружение специфической АТФазы в вакуолях дрожжей .•

1. Характеристика препарата вакуолей, выделенных из клеток дрожжей.

2. Сравнение свойств АТФазной и других фосфогидро-лазных активностей вакуолей дрожжей

3. Солюбилизация АТФазы из вакуолей дрожжей и очистка ее от других вакуолярных фосфогидролаз.

ГЛАВА 2. Транспортные системы вакуолярной мембраны дрожжей .•.••••.•••.

1. АТФаза - главный протонный насос вакуолярной мембраны

2. Дирофосфатаза - второй протонный насос вакуолярной мембраны.

3. hVhoh антипорт - основной механизм транспорта ионов через тонопласт дрожжей

4, Анионный канал вакуолярной мембраны и модификация его катионами металлов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Н+-АТФаза и транспорт ионов через вакуолярную мембрану дрожжей Saccharomyces carlsbergensis"

Вакуолярная система грибных и растительных клеток, включающая в себя как крупную центральную вакуоль, так и более мелкие везикулы, вовлечена в регуляцию уровня в клетке некоторых ферментов, а также важнейших низкомолекулярных метаболитов и неорганических ионов (Matile, 1978; bichko et al., 1982; Окороков, 1983).

Пристальное внимание исследователей к вакуолям цривлечено тем, что в этих органеллах накапливаются различные полезные для человека вещества: незаменимые аминокислоты, витамины, алкалоиды, органические кислоты, сахара (Matile, 1982).

Так, в вакуолях дрожжей сосредоточены аргинин, орнитин, s-аденозил-ь-метдонин (Matile, 1978), ионы Mg2+, К+, ортофосфа-та (Личко, Окороков, 1976; Личко, 1981). Вакуолярная компартмен-тация позволяет поддерживать в цитоплазме относительно постоянные и оптимальные для работы клеточных систем концентрации ряда веществ, а также мобилизовать запасные пулы метаболитов и ионов для поддержания жизнедеятельности в случае изменения внешних условий.

Накопление в вакуолях различных веществ против градиента концентрации, а также необходимость регуляции процессов входа и выхода их через вакуолярную мембрану указывают на то, что в этой мембране должны существовать специфические транспортные системы для этих веществ, а также системы, обеспечивающие эти транспортные процессы энергией.

Актуальность теш оцределяется тем, что изучение транспортных систем вакуолей позволяет понять как сами механизмы транспорта через вакуолярную мембрану, так и их взаимодействие со всем метаболизмом, и на этой основе увеличить накопление полезных для человека веществ.

К началу настоящей работы данные как по транспортным системам вакуолярной мембраны, так и по их энергообеспечению были немногочисленными. Изучение свойств систем транспорта аргинина (Boiler et al., 1975) и Б.^аденозил-1нУ1етионнна (Schwen-cke and de Robichon-Szulmajster, 1976) привело известнейшего исследователя вакуолей Матиля к выводу, что общим свойством вакуолярных транспортных систем, изученных в опытах с изолированными вакуолями, по-видимому, является отсутствие прямой зависимости транспорта от энергии, высвобождаемой при метаболизме (Matile, 1978).

В то же время, базируясь на общности законов клеточной энергетики, а также учитывая данные о наличии в вакуолях АТФ-азной активности, можно было предполагать возможность существования и участия в энергизации транспорта вакуолярной АТФазы.

АТФазная активность была определена в вакуолях дрожжей еще в 1969 году (Wiemken, 1969), однако множественность вакуолярных фосфогидролаз (Wiemken et al., 1979), не позволяла сделать вывода о существовании в вакуолях дрожжей специфической АТФ азы. Долгое время данные по оцределению АТФазной активности вакуолей, выделенных из различных организмов были противоречивыми. Одним авторы находили такую активность (Wiemken, 1969; Шабалин, 1979; Lin et al., 1977), другие не обнаруживали ее (Циоменко, 1978; Briskin and Leonard, 1980). До последнего времени некоторые авторы не считали окончательно доказанным существование специфической АТФазы в вакуолярной мембране (Boiler, 1982; Палладина, 1983).

Целью настоящей работы было определить, существует ли в вакуолях дрожжей Saccharomyces carlsbergeneis специфическая АТФаза, а также оценить ее возможное участие в энергизации транспорта ионов через вакуолярную мембрану у этих дрожжей.

Экспериментальные задачи были сформулированы следующим образом:

1. Изучить свойства АТФазной и других фосфогидролазных активностей вакуолей дрожжей S.carisbergensis с тем, чтобы выяснить, не обусловлена ли АТФазная активность другими фосфо-гидролазами вакуолей.

2. Солюбилизировать и очистить от других фосфогидролаз ✓

АТФазу из вакуолей S.carisbergensis.

3. Выяснить, способна ли АТФаза вакуолей S.carisbergensis создавать электрохимический градиент ионов водорода U^IT1") через мембрану этих органелл.

4. Может ли пирофосфатаза вакуолей выполнять функцию протонного насоса.

5. Определить, могут ли ионы, накапливающиеся в вакуолях in vivo использовать создаваемый АТФазой Л/И1Г1" для своего транспорта.

6. Изучить, как некоторые ионы влияют на формирование химического градиента ионов водорода ( dpH) и мембранного потенциала (Eg) через вакуолярную мембрану и могут ж эти ионы изменять анионную проницаемость тонопласта.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ