Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Энергетические функции проницаемых межклеточных контактов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Энергетические функции проницаемых межклеточных контактов"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ЙРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНА!1.1ЕНИ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В.ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

УДК: 577.3 + 576.54 + + 577.355

Потапова Татьяна Васильевна

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ ЛУНКЩ-М ПРОНИЦАЕМЫХ ЖШЕТОЧНЫХ КОНТАКТОВ

03.00.02 - биофизика АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

москва I989

Работа выполнена в Межфакультетской проблемной научно-исследовательской лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химии им. акад. А.Н.Белозерского, Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Официальные оппоненты: член-корр.АП СССР, доктор биологических

наук, профессор А.Л.Вызов, доктор биологических наук, профессор А.1.1.Гутман,

член-корр.АН СССР, доктор химических наук, профессор Ю.А.Чизмадкев.

Ведущая организация - ¡Институт фотобиологии АН ЕССР.

Защита диссертации состоится "_"_1990 г.

в _ часов на заседании специализированного Совета

Д.053.05.53 ;<1ГУ по адресу: 119899, .Москва, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_"__1990 г.

Ученый секретарь специализированного Совета доктор биологических наук

Т.Е.Кренделева

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТШЙ РАБОТЫ

Актуальность проблем. Появление в ходе эволюции прост-иственно организованных многоклеточных систем (тканей) >зволило отдельным клеткам приобретать специализацию, несов-ютимую с одиночным существованием, но выгодную для системы целом. Очевидно, что разделение труда мезкду клетками возмо-[о только при наличии надеиных иэффективных систем коммуника-ги. Специфически?.! механизмом, обеспечивающим интеграцию клеток ткани, являются проницаеше контакты (.ПК) .которые позво-пот водорастворимым компонентам низкомолекулярного пула сво->дно обмениваться между цитоплазмами соседних клеток. ПК су-¡ствуют на разных уровнях эволюции. Это: микроплазмодесмы нит-1тых цианобактерий, плазмодесмы высших растений, септальные >ры грибов, ¡целевые контакты животных.

Информационные аспекты взаимодействий между клетками через С привлекают внимание исследователей уже более четверти века, юретический анализ разнообразных моделей связанных ПК возбу-мых тканей и экспериментальные оценки, полученные для сердца, ¡рвной ткани и ряда рецепторных систем, показали, что с помо-,ю ПК из одинаковых возбудимых клеток могут быть организованы :ани с разными функциональными свойствами. Для невозбудимых ;аней общие модельные рассмотрения на основе представлений о )ханизмах регуляции ферментативной активности также дают осно-1ния считать, что в ткани из одинаковых клеток благодаря ПК >жет появиться ряд новых свойств: синхронизация клеточных ре-:ций, стабилизация ткзни, локальная и обратимая специализация ;еток и т.д.

Энергетические аспекты локальных межклеточных взаимодей-'вий через ПК' до настоящего времени фактически не исследова-[сь, хотя определенные теоретические предпосылки были созданы ;е в начале 60-х годов. Так, концепция энергетического сопря-:ния Питера Митчелла /Щ^сИеИ, 1961/ возникла как идея о том, ■о создание трансмембранной разности электрохимических потен-;алов является необходимым звеном в цепи реакций окислительно-| и фотосинтетического фосфорилирования. Развитием этой идеи ¡илось предположение В.П.Скулачева /19^5/ о роли№+/К+ градира на внешней мембране животных клеток: "Дуи^может исполь-шаться 1в качестве транспортабельной формы энергии, перемещайся вдоль внешней мембраны клетки и даже от одной метки к угой через так называемые щелевые контакты внешних клеточных

мембран". Однако, исследования энергетических взаимодействий через ПК тормозились отсутствием четкой идеологии, адекватных экспериментальных моделей и соответствующих методических приемов, позволяющих анализировать динамику параметров отдельных клеток и ПК функционально активной ткани. Реальные возможности для такого анализа дает исследование относительно "автономных" тканей, то-есть клеточных популяций, непосредственно контактирующих с внешней средой: многоклеточных микроорганизмов, клеточных культур.

Настоящее исследование представляет собой обобщение концепции энергетического сопряжения Митчелла на плазматические мембраны клеток и клеточных систем, связанных ПК. Согласно этим представлениям ткань, являясь пространственно организованной системой клеток, объединенных проницаемыми контактами, энергетически не эквивалентна разобщенной популяции, а энергетический статус отдельной клетки в значительной степени определяется потоками ионов и метаболитов через ПК.

Цель и задачи исследования. Основная цель настоящей работъ - на основании анализа свойств плазматических и контактных мембран в системах невозбудимых клеток определить возможности и физиологическую значимость энергетической кооперации посредством ионных потоков через ПК.

Основные этапы исследования:

1. Теоретический анализ условий энергетической кооперации клеток, электрически связанных через ПК.

2. Разработка экспериментальных моделей и методических приемов, позволяющих исследовать свойства и функции ПК в связи с энергетическим метаболизмом у таксономически различных объектов.

3. Сопоставление аналитических оценок и экспериментальных результатов, определение энергетической значимости взаимодействий через ПК у различных объектов и в различных физиологических ситуациях.

Научная новизна, йадвинуты и обоснованы новые общие положения о перераспределении энергетических ресурсов в многоклеточных системах и установлена роль проницаемых межклеточных контактов в этом процессе.Определено основное условие энергетической кооперации электрически связанных клеток. Показано,что необходимым и достаточным условием энергетической кооперации посредством ионных потоков через ПК является наличие на плазмати-

ских мембранах контактирующих клеток дисбаланса между потока-ионов через ионные насосы и "диссипаторы", что благодаря ектрогенности ионных насосов приводит к появлению электриче-ого тока через ПК. Мощность,передаваемая через ПК в виде ион-х потоков, пропорциональна электрическому току, текущему че-з ПК.

Разработаны экспериментальные модели и методические под-ды для исследования энергетических функций ПК у далеких в эво-ционном плане клеточных систем, тлеющих разное строение ПК и зличные механизмы электрогенеза плазматических мембран:

= модель смешанной культуры уабаин-чувствительных и уаба--резистентных клеток млекопитающих;

= модели интрагифального и верхушечного роста мицелиальдах ибов;

= методы регистрации фотоэлектрических ответов пучков и дельных трихомов нитчатых цианобактерий при локальной засве-е.

Исследованы параметры электрической связи и перетекания рез ПК флуоресцеина у нитчатой цианобактерии Р1)огт!с/('ит

, ряда штаммов мицелиального гриба Не-игозрога ста. ,а также в монослойных культурах клеток мышей, крыс, мячка, быка, человека. Установлена близость электрических и М'узионных параметров межклеточного обмена через ПК у всех следованных объектов. Показано, что постоянная длины элект-тсского кабеля у всех объектов значительно превышает размеры цельной клетки, что позволяет осуществить эффективное энерге-зескоэ сопряжение транспортных процессов в плазматических ме-ранах соседних клеток.

Показана возможность регуляции обмена через ПК у всех ис-здованных объектов. В том числе:

= обнаружена возможность регуляции межклеточного обмена зез ПК у грибов факторами внешней среды (синий свет') и эн-реншвли факторами (градиент электрического потенциала между зтками) ;

= обнаружена возможность усиления обмена через ПК у живот-с трехвалентным лантаном;

= обнаружена способность к репарации локально нарушенной тзи через ПК у грибов путем интрагифального роста;'

= у всех исследованных объектов обнаружено прерывание элегической связи при нарушении плазматической мембраны у одной контактирующих клеток.

3.

Проведен сравнительный анализ параметров плазматических мембран и ПК у генетически различных линий грибов (9 линий) и культивируемых клеток млекопитающих (19 линий ) :

= показана генетическая предопределенность обмена через Г = не обнаружено корреляции мезвду степенью опухолеродноста и обменом через ПК для культивируемых клеток лшвотных ( более 10 линий) ;

- обнаружена мутантная линия гриба N . с г ста, WC-I, у которой дефект по электрической связи коррелирует с нарушениями фоторегуляции ряда физиологических процессов.

Исследована степень гетерогенности клеток в квазиоднородных (недифференцированных) популяциях:

= на отдельных клетках цианобактерий обнаружена пигментн; гетерогенность, коррелирующая с функциональной неоднородность! оцениваемой по спектрам действия фотоэлектрических ответов;

= обнаружена гетерогенность отдельных клеток в гифах ми-целиальных грибов по величине мембранного потенциала и прирос1: входного сопротивления на свет;

= обнаружена гетерогенность отдельных культивируемых клеток животных.

На основании аналитических оценок и экспериментальных результатов получены количественные оценки передачи энергии чер< ПК в виде ионных потоков для всех исследованных объектов: нитчатых цианобактерий, мицелиальных грибов, культивируемых клет/ млекопитающих. Показано, что мощность, передаваемая через ПК ионными потоками, соизмерила с общим энергопроизводством отдельной клетки в состоянии покоя и на два порядка превосходит возможность энергетической кооперации за счет потока через ПК макроэргов, например, АТР.

Научно-практическое значение работы. Выявление энергети ческих функций у ПК на разных ступенях эволюции и тех особенн стей тканевой организации, которые создаются благодаря взаимо действию клеток с помощью ионных потоков через ПК, является вкладом в развитие основных принципов биологии клеток и клето ных систем. Наряду с общенаучным значением полученные результ ты могут найти следующее практическое применение.

Представления об энергетической кооперации между клеткам в ткани позволяют формулировать требования к ключевым экспери ментам по выявлению реакции ткани на внешние воздействия (на пример, для определения критериев оценки активности биологиче ски активных веществ) .

Смешанные культуры плеток млекопитающих с разной чувстви-льностыо к уабаину могут использоваться в лабораторной прак-[ке как адекватные модели квазиоднородной ткани с функциональ-I гетерогенными клетками.

Нитчатые цианобактерии и мицелиальные грибы также могут ¡пользоваться в лабораторной практике как адекватные модели гнкционально активных тканей, обладающих ПК и состоящих из мелодически гетерогенных клеток.

Метод регистрации фотоэлектрических ответов одиночного три->ма цианобактерий может быть использован для регистрации элек-шческих параметров других элонгированньгх микрообъектов.

Полученные в диссертации данные о генетической предопре-зленности взаимодействий через ПК у грибов необходимо учиты-1ть в биотехнологии при получении и культивировании этих промы-тенно важных продуцентов биологически активных веществ.

Модель интрагифального роста мицелиальных грибов может лть рекомендована для студенческого практикума "Рост у низших астений".

Результаты теоретического описания энергетической коопера-т посредством ионных потоков через ПК могут быть рекомендова-а в курсы лекций "Электрофизиология", "Биоэнергетика" и "Регу-яция метаболизма" для студентов, специализирующихся в области изиологии, биофизики, биохимии, цитологии.

На защиту выносятся следующие положения: Условие энергетической кооперации в многоклеточной систе-е посредством ионных потоков через проницаемые контакты.

Экспериментальные модели энергетической кооперации, демон-трирутощие пространственное разделение ионных насосов и "дисси-аторов" в многоклеточной системе:

= при активации ионных насосов у части клеток в популяции цианобактерии) ;

= при полной блокаде ионных насосов у части клеток в попу-яции (смешанные культуры уабаин-чувствительных и уабаин-рези-тентных клеток млекопитающих) ;

= при нативной сегрегации ионных насосов и "диссипаторов" (верхушка грибной гифы) .

!. Экспериментальный анализ энергетической кооперации в много-шеточной системе, включающий :

= доказательства наличия ПК между клетками; = оценки кабельных параметров системы клеток, связанных ПК;

= регистрацию зфадиентов электрического потенциала на ПК или межклеточных токов;

= оценки функциональной гетерогенности клеток в квазиоднородной популяции;

= оценки энергетической значимости электрических токов через ПК.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано более 50 научных работ в отечественных и зарубежных изданиях, а также коллективная монография "Высокопроницаемые контактные мембра ны" (под ред.Л.М.Чайлахяна) .

Апробация работы. Материалы работы докладывались на Всесоюзных конференциях "Молекулярные механизмы проницаемости мембранных структур" ( Паланга,1972, 1976, 1979 ), П Всесоюзном симпозиум! "Генетические и биохимические характеристики злокачественного превращения клеток" (Ленинград, 1976) , УШ Всесоюзном совещянш по эволюционной физиологии (Ленинград, 1982) , I Всесоюзном Б физическом СЬезде ( Москва, 1982) , Всесоюзной конференции "Миц< лиальные грибы: физиология, биохимия, биотехнология" (Пущино, 1983) , Всесоюзной конференции "Молекулярные механизмы действш оптического излучения" (Ялта, 1984) , Всесоюзной конференции "Современные проблемы эволюционной биохимии и происхождения жис ни" ( Петрозаводск, 1984, Телави, 1988) , Научно-практической конференции "Экстремальные условия существования микромицетов к охрана окружающей среды" (Киев, 1985) , ХП Всесоюзном совещании по транспортным АТРазам (Иркутск, 1987) , Всесоюзной конферени "Структурно-функциональная организация клеток микроорганизмов" (Пущино, 1987) , Всесоюзной конференции "Структурни-функционал ная динамика биологических мембран" (Минск, 1988^ , на совмести заседании секции биохимии микроорганизмов и биохимии мембран Вс союзного биохимического общества АН СССР (Мооква, 1988) , на ме. лабораторном семинаре ИППИ АН СССР (Москва, 1988) , заседании ; учно-технического Совета Лаборатории им,А.Н.Белозерского, МГУ (1989) , совместном заседании кафедр биофизики.Влологического и Физического факультетов М1У (1989).

Материалы работы были представлены на 1У Международном Биофизическом Конгрессе (Москва, 1972) , Ш Советско-Швейцарском сш позиуме "Биологические мембраны: структура и функции" (Ташкент, 1983) , Ш Советско-Шведском симпозиуме "Физико-химическая биология" ( Тбилиси,1984) , Международном симпозиуме Федерации европе{ ских микробиологических обществ "Регуляция микробного метаболиз-

i факторами внешней среды" (Пущино, 1983) , ХУ1 Симпозиуме ¡дерации европейских биохимических обществ (Москва, 1984) , >ветско-американском сешшаре "Кодирование и передача инфор-щии в биологических системах" (Суздаль, 1986) , Х1У Микробио-1Гическом Конгрессе (Манчестер, 1986) .

Материалы работы докладывались в виде лекций на школах: :есоюзной школе по межклеточным взаимодействиям ( Каунас, 1977, ©4, 1988) , Всесоюзной школе-конференции по биоэнергетике Карадаг, 1980, Боржоми, 1985, Дилижан, 1988) , 1У Всесоюзной :оле молодого биолога "Регуляция в биологических системах" ^ахкадзор, 1984) , Республиканской школе "Биологические мем-аны" ( Алушта, 1982, Славск, 1984 ) .

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, ти глав, заключения и выводов. Объем диссертации 2.в^стр., том числе 12?- стр. машинописного текста, {8 таблиц, 56 ринков, списка работ автора по теме диссертации и названий тируемых литературных источников.

ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЕ СОПРЯЖЕНИЕ ТРАНСПОРТНЫХ ПРОЦЕССОВ В ПЛАЗМТИЧЕСКИХ МЕЖРАНАХ.

В I главе на основании анализа литературного материала де-этся вывод о возможности энергетического сопряжения двух кле-х и принципиальной возможности изучения такого сопряжения зктрофизиологическими методами.

Для поддержания ионно-осмотического гомеостаза живая кле- . 1 непрерывно расходует энергию. При этом значительная часть шческой энергии или энергии света сначала преобразуется в ¡нсмембранный градиент электрохимического потенциала некото: ионов, в основном, N&+ и Н+, а затем энергия электрохими-;кого градиента ионов на плазматической мембране "диссипиру-' в ряде процессов, связанных с выполнением полезной для кле-t работы, например, по транспорту субстрата $ , как показано рис.1. Кроме транспорта субстратов, вторичные транспортные ■теш , или "диссипаторы" энергии градиентов электрохимиче-го потенциала на плазматической мембране, осуществляют уда-ие продуктов распада, поддерживают осмотическое равновесие, ливают сигнал гормона или нейромедиатора и 'т.д. Преобразова-з химической или световой энергии в энергию градиентов -элек-шшических потенциалов неорганических ионов осуществляется

первичными транспортными системами, иначе, ионными насосами. П оценкам ряда авторов, выполненным для разных объектов, на поддержание трансмембранных градиентов электрохимических потенци алов ионов клетка расходует от 20 до 80 °А% всей энергопродукци (см.обзоры /Веренинов,Марахова, 1986; Скулачев, 1989/).

Между величиной потока ионов, направленного против элект' рохимического потенциала, и энергией, затрачиваемой клеткой, существует определенная зависимость. У большинства микроорган: змов и растений энергозависимый транспорт ионов через плазмат: ческую мембрану осуществляют редокс-цепи ( дыхательная, фотосинтетическая ) или Н+-АТРазы. У животных меток эту функцию выполняет №+,К+-АТРаза. Во всех случаях, как перенос Н+, так и сопряженный обмен ЗМа+: 2К*, приводят к переносу положитель ного заряда из цитоплазмы в окружающую среду. Стехиометрия вс перечисленных генераторов такова, что на перенос единицы заря да против электрохимического потенциала затрачивается энергии не меньше, чей энергия гидролиза одно.": молекулы АТР.

Градиент электрического потенциала на плазматической ме: бране отдельной клетки определяется суммой диффузионного пот циала, возникающего за счет неравновесного распределения ионо и избирательной проницаемости мембраны, и метаболической составляющей, определяемой как падение напряжения на сопротивле нии мембраны за счет электрического тока, который генерирует ионный насос.

Проницаемые контакты превращают многоклеточную систему в единый электрический кабель, позволяя пространственно раздели по разным клеткам ионные насосы и "диссипаторы". Если у отдел ной изолированной клетки энергозависимый транспорт осуществля ется собственным ионным насосом с использованием эндогенной энергии, то в системе электрически связанных клеток энергия,

Рис.1. Цикл положительного иона в отдельной клетке.

Е -¿АД -г Л

обходимая для поддержания ионно-осмотического гомеостаза, мот затрачиваться,в принципе, в любой клетке. Для отдельной етки условие стационарности выражается в равенстве входящих выходящих потоков для воды и неорганических ионов, то-есть в венстве потоков через ионный насос и "диссипаторы". В системе ектрически связанных клеток это условие выполняется только я всей системы в целом. Для отдельной клетки условие стацио-рности -выражается в равенстве нулю алгебраической суммы трех токов: через насос, через "диссипаторы" и через ПК.

э*

-о

L

Е -+А

Рис.2. Нескомпенсиро-ванный-перенос положительного иона в системе связанных ПК клеток. Перенос иона из цитоплазмы осуществляется с затратой энергии. Прохождение иона через мембрану другой клетки сопряжено с выполнением работы. Электрическая цепь замыкается через

Валено отметить, что ионные потоки через ПК всегда направ-ш по соответствующим электрохимическим градиентам. Поток iOB через ПК, создаваемый и поддерживаемый ионным насосом азматической мембраны, является для клетки-донора энергии звая клетка на рис.2), компонентом пассивного потока, а для зтки-акцептора энергии (правая клетка на рис.2) компонен-,1 активного потока. У всех типов клеток "передача энергии" в ;е ионньйс потоков через ПК приводит к экономии эндогенного 3 в клетке-акцепторе энергии, а у микроорганизмов, имеющих зргосопрягающуго плазматическую мембрану ( цианобактерии) , сет привести и к синтезу АТР за счет активации АТРсинтазы.

Исходя из вышеизложенного, перенос через ПК единицы поло-цельного заряда эквивалентен "переносу" в противоположном гравлении энергии .равной энергии гидролиза одной молекулы

При этом мощность, передаваемая через ПК посредством ион-I потоков, пропорциональна электрическому току, текущему ду клетками.

Количественные оценки энергии, передаваемой в виде ионных ■оков через ПК, могут быть проведены на основании электриче-'й эквивалентной схемы, представленной на рис.3.

Рис.3. Эквивалентная электрическая схема двух клеток, связанных через ПК. Ионные насосы генерирует токи

и V и V - мембранные потенциалы соответствующих клеток, R-^и - сопротивления плазматических мембран, Яс -сопротивление электрической связи, Ew и - э.д.с., обусловленные наличием трансмембранных

градиентов электрохимических потенциалов для всех ионов и селективностью мембранной проводимости. и Fm

могут быть определены экспериментально как разности потенциалов на плазматической мембране, возникающие непосредственно после блокады ионного насоса. Reut -

сопротивление внешнего раствора. Направление нескомпе-нсированного потока катионов обозначено стрелками при

условии: > I .

Эквивалентная электрическая схема составлена на основании следующих простейших допущений:

1. цитоплазма каждой из клеток и омывающий раствор эквипотенциальны <*• (L^) ;

2. утечка в области ПК в наружную среду отсутствует;

3. электрический ток, генерируемый насосом, зависит только О' концентраций соответствующих ионов и концентрации АТР и не зависит от разности потенциалов на мембране /giynn. ,1985/, для элементов пассивной проводимости мембраны и сопротивления связи Ис ионный насос является генератором тока;

4. электрический ток, генерируемый насосом, пропорционален энергетическим затратам клетки на активный транспорт;

5. ионный состав внешней среды для обеих клеток одинаков. Пренебрегая сопротивлением омывающего раствора, можно за-

сать:

мощность,передаваемая через ПК ионными потоками, (W)

(2)

; £ -энергия гидролиза I моля ATP, F -число 5арадея.

Из анализа выражений (I) и (2) следует,что электрический i, а следовательно и "поток энергии" через ПК отсутствует тога в двух случаях: когда , или когда Rt~**co . Таким залом, необходимым и достаточным условием энергетической коо-зации в системе электрически связанных клеток является наличие здиента электрического потенциала на ПК или электрического то-через ПК. Наличие энергетической кооперации однозначно связа-с дисбалансом мезэду потока!,ш через насосы и "диссипаторы" у тактирующих клеток.

Максимальное количество энергии в рассматриваемой системе íot передаваться через ПК при полной блокаде ионных насосов в юй из клеток и при R-t=0. Максимальное количество энергии, ко-зое конкретная клетка, обладающая ионными насосами, может пе-1ать популяции в виде ионного потока через ПК, лимитировано: злом насосных единиц, скоростью производства АТР, скоростями зтупления субстратов. С другой стороны, в стационарном состо-ш клетка-акцептор не может получить в виде ионных потоков эез ПК энергии больше, чем она затрачивает на работу "дисси-зоров". Исключение составляют клетки, обладающие энергосопря-зщей плазматической мембраной (цианобактерии) : у них мощ-:ть, передаваемая посредством ионных потоков через ПК^мозкет тести к увеличению скорости оборота эндогенного пула АТР за зт активации АТРсинтаз.

Мозшо предполагать, что в системе клеток, способной пере-зпределять энергетические ресурсы с помощью ионных потоков зез ПК, наряду с гетерогенностью энергозатрат отдельных lait-с на работу ионных насосов проявится гетерогенность и по ряду тих признаков, доступных для экспериментального анализа фометодэми in vivo .

ОБЪЕКТЫ И НЕГОДЫ

2-я глава содержит обзор литературы по выбранным объектам а также обоснование выбора объектов и методов для решения осно; ной задачи.

Экспериментальный анализ рассмотренных выше положений об энергетическом сопряжении клеток посредством ионных потоков че рез ПК должен включать: доказательства наличия ПК между клетка ми; регистрацию градиента потенциала на ПК или межклеточного т ка; сравнение электрического тока через ПК с током, генерируе мым ионным насосом отдельной клетки, то-есть оценку энергетиче ской значимости регистрируемых токов-. Идеальной эксперименталь ной моделью была бы система из нескольких связанных ПК клеток, каждой из которых можно было бы произвольно менять активности, сосов и диссипаторов, ингибировать или активировать конкретные энергоемкие процессы внутри клетки, непрерывно регистрируя при этом электрические и метаболи* еские параметры калдой клетки и стояние ПК.

Мы исследовали энергетические функции ПК у эволюционно да леких объектов, имеющих разные типы плазматических мембран и р ные структуры ПК С см.табл. I) : нитчатых цианобактерий Phcrmic/i'«т uncjnaium , мицелиальных грибов Ь/еигсйрогц егоз-. и культивируемых клеток животных. Все выбранные нами объекты с стоят из квазиоднородных клеток, то.-есть клеток без устойчивой специализации. Все наши объекты позволяют осуществлять микроэл ктродные отведения и микрохирургические манипуляции под микроскопическим контролем и обладают достаточно простой геометрие2 Каждый из объектов, естественно, лишь частично удовлетворяет т бованиям для идеальной модели. Все штаммы гриба tf . c.raiia. в работе использован мицелий дикого типа и 8 мутантных линий,' любезно предоставлены Центром культур генетики грибов при Мед* цинском центре Канзасского Университета ( г.Канзас-Сити, США ) Из коллекций ряда Институтов АН СССР и ВОНЦ АМН СССР мы получу использованные в работе культуры клеток животных: мышей, крыс, хомячков, свиньи, собаки, быка, - а также первичные эмбрионал! фибробласты человека. Всего исследовано 19 клеточных линий.

Эксперименты проводились главным образом при помощи разнс разных модификаций методов и приемов с использованием стеклят микроэлектродов: внутри- и внеклеточные регистрации, электриче екая поляризация, внутриклеточные инъекции флуоресциирующих щ сителей-маркеров ПК, а также с помощью микроспектральных и мт

ирургических методов, юифофотосъемки. Коэффициент электриче-кой связи,Ксв= , определялся путем пропускания через

яутриклеточный микроэлектрод импульса электрического тока, теС1Г, а входное сопротивление электрического кабеля определюсь, как 1тест.. Отдельно учитывалась систематиче-кая ошибка, связанная с шунтированием микроэлектродом сопро-лвления плазматической мембраны /1аиео , Лсаткиеп ,1978;/лге t а.1. ,1986/. Количественные оценки взаимосвязи регистрируемых эличин А вх с реальным отношением проводимостей плазматиче-■сой мембраны и ПК проводили по методу Соколара /$осо(аг, 1977/, татывающему кабельные свойства объектов разной геометрии.

аблица I. Параметры плазматических мембран и проницаемых контактов у исследованных объектов.

Объект Циано-бактерии Грибы Животные

Тип плазматической мембраны Знерго-сопрягающая Неэнергосо-прягащая Неэнергосо-прягающая

Механизм активного транспорта Фотосинтетическая цепь Н+-АТРаза А/а, К-АТРаза

Активно транспортируемый ион Н+ ЗЛСа* 2К*~

Тип ПК Микро-плазмодесмы Септальные поры Щелевые контакты

Число элементарных каналов между клетками 50-200 I до Ю4

Площадь жидкостного контакта между клетками, 0,004-0,015 0,030-0,060 0,001-0,030

шз/

Размеры отдельной клетки, мкм 2x2x5 15x15x100 5 хЮ х20

Объем, мкм^ 20 22500 1000

Тип электрического кабеля Одномерный Одномерный с ветвлением Двумерный трехмерный

1Ъ.

СВОЙСТВА ПК И МЕХАНИЗМЫ ИХ РЕГУЛЯЦИИ

В 3-й главе приведен обзор литературы и собственные экспериментальные данные по свойствам и механизмам регуляции ПК у вы бранных для исследования объектов.

Оценки степени связанности клеток через ПК у всех объектоь как по движению из клетки в клетку флуоресцеина, так и по элект рической связи, дали близкие результаты, суммированные в табл. Электрическая связь в трихомах нитчатых цианобактерий впервые с сана нами..

Таблица 2. Характеристики ПК исследованных систем.

Объект бактерии ^ибы Животные

Постоянная длины электрического кабеля, 600-800

МЕМ

Скорость движения флуоресцеина по системе 1,0-3,0 клеток, мкм/с

600-800 40-2500*

1,0-2,0 0,07-1,5

36 Включены данные из обзора /Ееркинблит и др.,1981/

Значительное превышение постоянной длины электрического ка беля над размерами отдельной клетки указывает на возможность■эф фективной энергетической кооперации с помощью ионных потоков че рез ПК во всех исследованных системах. Существенным моментом дл осуществления энергетической кооперации мевду клетками по рассм триваемому механизму должно быть наличие факторов, регулирующи состояние ПК в зависимости от потребностей клеточного метаболиз

I. Цианобактерии.

Обнаружена зависимость кабельных параметров трихома от величины утечек через плазматическую мембрану: ионофоры, динитро-фенол, валиномицин и др. ухудшали кабельные свойства трихома, бл катор Н+-АТРсинтазы,дициклогексилкарбодиимид - улучшал. Некотор

Ик

рюсомы в наших опытах оказывались разделенными на два или более езависимых кабеля. Природа подобных нарушений кабельной переда-и пока не ясна. Аналогичное явление отмечено в работе с потен-иалчувствительными красителями \/еп'па , Я1сц/ас[>е1/> 1985/.

. Грибы.

В экспериментах на взрослых грибных гифах мы выявили несколь-о способов полной блокады ПК: механическое повреждение одной из леток, сильная деполяризация внутриклеточным током и др., - а акже возможность модифицировать сопротивление ПК синим светом, ¡шкальным свойством ПК грибов является различие реакций сеп.таль-ах пор на противопологшых полюсах одной клетки на одно и то же эздействие: например, ПК на апикальном полюсе блокируется и ме-эническим повреждением, и деполяризацией раньше,чем ПК на проти-эположном полюсе,удаленном от верхушки гифы. Нет аналогий среди ругих объектов и такому обнаруженному нами свойству ПК грибов, ак быстрая регенерация локально прерванной электрической связи: зли путем микрохирургического вскрытия одной клетки в среде низ-эй осмотичности вызвать ее мгновенное опустошение и блокаду в гом месте ПК, то через 1,5-2 ч связь восстанавливается за счет зтречного интрагифального роста клеток, примыкающих к опустошен-эй. Все явления, характеризующие лабильность ПК у грибов и воз-эжности регуляции септальных пор,впервые описаны нами.

. Животные.

В монослойных культурах мышиных клеток мы установили зависнуть состояния ПК от плотности культуры, как в разные сроки поте пересева, так и в разных зонах выходящего в рану пласта клене. Ряд трансформированных клеточных линий со слабой связью че-зз ПК в наших опытах оказался способен к эффективной межклеточ-)й связи с нормальными фибробластами мыши С клетки линий й и '13К2^. Этот эффект впервые описан нами. В то же время в смешана культурах эпителиальных клеток быка и мыши скорость движения 1уоресцеина через ПК к клеткам своего типа всегда была выше, чем зрез гетеротипные ПК.

У ряда трансформированных клеточных линий грызунов нам уда-шось в значительной мере усилить связь через ПК с помощью трех-шентного лантана ( I мМ, 37°, 15 мин ) . Измерения мембранных »тенциалов, оценки интенсивности отмешивания в гранулы внутри [еток нейтрального красного, оценки подвижности клеток и элект->нно-микроскопической структуры их не выявили патологических из-яений после указанной обработки лантаном. Поскольку 0,002% но-жаина в наших опытах защищали клетки от действия лантана на ПК,

можно предполагать, что лантан, связываясь на поверхности клет по тем же местам, что обычно Са^+, усиливает сцепление клеток друг с другом, что способствует формированию ПК. Возможность б строй интенсификации ПК в клеточных культурах впервые описана нами.

Проведенные экспериментальные исследования и анализ литер турного материала показали наличие эффективной регуляции ПК. Е сочетании с возможностями регулировать активность насосов и ди сипаторов это создает предпосылки для распределения функций ме ду клетками, которое позволило бы с максимальной эффективность использовать ресурсы энергетического метаболизма многоклеточно системы.

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ ВЗМ'.ЮДЕПСТВИЯ МЩУ КЛЕТКАМИ

В 1У главе приведены результаты экспериментального анали ситуаций, характеризующихся дисбалансом в энергетическом или т нспортном статусе отдельных клеток многоклеточной системы, свя занной ПК. Для кадцого объекта этот анализ потребовал специфи ческих подходов. Для цианобактерий мы использовали локальную засветку части трихома; для грибов - нативную пространственную сегрегацию первичных насосов и вторичных транспортных систем в плазматических мембранах растущей верхушки гифы; для животных -природную резистентность к блокатору//а. ,К-АТРазы, уабаину, у грызунов и способность к формированию.ПК мезгду клетками грызунов и человека в смешанной культуре, что позволило получить монослой связанных ПК клеток с активными и неактивными ионными насосами.

I. Активация ионных насосов при локальной засветке нескольких клеток трихома цианобактерии.

Этот прием дал возможность оценить энергетическую значимость активации фотосинтетической редокс-цепи, электрические г раметры клеточных мембран и ПК, системные электрические параме ры трихома как кабеля.

Электрическая эквивалентная схема, приведенная на рис.4, отражает особенности регистрации внеклеточных токов при локаи ной засветке одиночного трихома Рк . ипсупа.(ит ,фиксированног в стзклянной микропипетке с дистиллированной водой, сопротивле ние которой (К.) оказывается сравнимым с сопротивлением плазме ческой мембраны отдельной клетки

Рис. 4. При локальной засветке части клеток тринома (на схеме - светлые участки длиной 20 мш ) развивается гиперполяризация плазматических мембран в месте освещения ( соответствует фазе нарастания амплитуды внеклеточного фотоэлектрического ответа } , которая распространяется на расстояние в несколько сотен клеток, гиперполяризуя плазматические мембраны большого участка трихома ( соответствует Фазе спада фотоэлектрического ответа при включенной засветке) . Направление фотоэлектрических токов определяется местоположением генератора на схеме фотоэлектрические ответы и соответствующие зоны засветки соединены стрелками.

Как правило, в наших опытах Я. > 400 МОм. Напряжение на кончике микропипетки при засветке около 10 клеток достигало V = = 20 х 10"^ В. При сопротивлении пипетки R. =400 л " 10® Ом ток через пипетку, I = V /(L , составляет: I =20 х 10"^ В / 4 х х 10® Ом = 5 х ГО'11 А. Учитывая, что ток в 1 пикоА переносит в 1с б х 10® единичных зарядов, зарегистрированный в наших опытах фотоэлектрический ток через ПК эквивалентен переносу 3 х 10® АТР/с. Скорость оборота пула АТР в бактериальной клетке около 10^- ТО8 АТР/с (см./Chapman, aikimon ,1977/) . Таким образом, в исследованной ситуации с трихомом цианобактерии"транспорт анергии"через ПК соизмерим с суммарным энергопроизводством отдельной клетки.

п.

2. Нативные градиенты мембранного потенциала между клетками гриб-

ной гифы. Локальная специализация клеток верхушки гифы.

«О ' 160 ! по ! Ш> ¡вдем! 200 ! 200~|~150 }

0,1 0,9 1,0 о,? 0,3 ОД

, 80 ! 160 I 180 ! 120 ; по \ *4

5

* г

О,? 0,3

о

Рис. 5. Градиенты мембранного потенциала между соседними клетками основной гифы С вверху ) и ее же боковой ветви ( внизу) . Чем слабее электрическая связь С коэффициенты связи для конкретных ПК указаны стрелками") , тем сильнее выражена гетерогенность соседних клеток по величине мембранного потенциала.

В зонах поляризованного роста: верхушках основных гиф или боковых ветвей, - градиенты мембранного потенциала обнаруживали четкую направленность, мб

«о-

160-

1«-

120-

100-

Рис. 6. Прямые измерения с помощью двух микроэлектродов, введенных одновременно в соседние клетки верхушки гифы С расстояние от кончика гифы указано по оси абсцисс ) , показали, что 2-3 верхушечные клетки на расстоянии 150-200 мкм от кончика всегда на 10-30 мВ деполяризованы по сравнению с более зрелыми клетками гифы. По оси ординат - величина мембранного потенциала,мВ. Одновременные измерения в клетках одной гифы соединены линиями.

юо

400

600 мки

На рис,7 приведена схема экспериментов по прямому измерению электрических параметров клеток и ПК грибной гифы для количественной оценки энергетической кооперации.

М)

I)

Рис.7. Схема измерения электрических параметров клеток и ПК.верхушки грибной гифы до изоляции верхушечных клеток 1А) и после изоляции (В) ; (Б) и(Д) - соответствующие электрические эквивалентные схемы, обозначения на которых те же, что на рис.3.

В 7 опытах, проведенных по схеме, представленной на рис.7, после электрической изоляции верхушечных клеток от основной гифы мембранный потенциал в них падал до величины -40 - 50 мВ, -уровня, который соответствует состоянию грибной клетки с полностью отключенной Н+-АТРазой ( см. /Шацтап. ,1987ДПовышение уровня входного сопротивления верхушечных клеток после изоляции от гифы свидетельствовало о целостности их плазматиче-

ских мембран. Важно отметить, что сниженная активность ЬГ^-АТРазы в верхушечной клетке - явление временное: через 1,5-2 ч нормального роста, когда бывшая верхушечная клетка становится 4-5-й от кончика, она приобретает способность самостоятельно генерировать высокий уровень мембранного потенциала, - это показали опыты с электрической изоляцией верхушечных фрагментов длиной более 800 мкм. йгсокий уровень мембранных потенциалов у верхушечных клеток, лишенных Н+-АТРаз,поддерживают электрические токи, генерируемые протонными насосами более взрослых клеток. Насосный тон единичной клетки N . craiift: 1,2 - 6 наноА /Sfa^man, 1987/. Расчеты на основании данных экспериментов, проиллюстрированных рис.7, дают величины 0,4-4,2 наноА для токов между верхушкой и основной ги-фой. Н+-АТРаза потребляет 30-50?á% суммарного энергопроизводства грибной клетки. Таким образом, за счет электрической связи с основной гифой растущая верхушечная клетка экономит около 30-50 %% эндогенного АТР, что должно обеспечить более эффективное протекание внутриклеточных синтезов и движений - процессов, обычно конкурирующих за АТР с ионными насосами, причем с приоритетом за последними.

3. Блокада ионных насосов у части клеток в многоклеточных системах у млекопитающих.

Способность животных клеток обеспечивать посредством ионных потоков через ПК клетки с неактивными насосами достаточным количеством энергии для поддержания нормальных электрохимических ионных градиентов через плазматические мембраны была протестирована нами с помощью смешанных культур фибробластов человека и хомячка (BHK-2I). Результаты эксперимента были предсказаны с помощью математической модели /Qiíantcíi'} Panfi'icv ,1986/, включающей детально описание энергетики ионного транспорта, апробированной ранее авторами на одиночных невозбудимых клетках животных /Асланиди,1987/ В рамках указанной модели установление ПК между двумя клетками -с активной и неактивной А'а,К-АТРазами ( см.рис. 2 ) - соответствует увеличению пассивной проницаемости плазматической мембраны активной клетки. Увеличение проницаемости в два раза снижает мембранный потенциал активной клетки не более, чем на I мВ, в то же время, мембранные потенциалы неактивных клеток благодаря ионным потокам через ПК с активными клетками должны держаться на уровне, близком к нормальному. Естественно, что при этом энергопотреблени насосов клетки-донора энергии должно возрасти вдвое.

Результаты электрофизиологических измерений в смешанных культурах клеток человека и хомячка схематически иллюстрирует диаграмма, представленная на рис. 8.

+ I

Рис. 8. Средние значения мембранных потенциалов клеток че-| -) ловека и хомячка в чистых ку-

льтурах составили в наших опытах, соответственно, около - 40 мВ и -50 мВ. Установление ПК с хомячковыми клетками, отмеченное на диаграмме стрелкой I, приводило к гиперполяризации клеток человека до уровня, характерного для хомячковых клеток. Такие клетки удерживали высокий уровень мембранных потенциалов после 2 ч ин*

кубации в присутствии 1х ТОМ

I уабаина, в то время как клетки человека, не имеющие ПК с хомячковыми, в течение 2 ч после отмеченного стрелкой 2 добавления уабаина деполяризовались практически полностью.

Таким образом, клетки человека с инактивированными насосами, будучи связанными ПК с клетками хомячка, имеющими активные насосы, поддерживают нормальный уровень мембранного потенциала за счет ионных потоков через ПК, что имеет смысл передачи энергии от хомячковых к человеческим клеткам. Более того, как показали измерения внутриклеточного содержания ионов Иа и К"1" в этих культурах, проведенные методом пламенно-эмиссионной фотометрии совместно с И.И.Мараховой и Т.А.Виноградовой (Институт цитологии АН СССР) , в присутствии уабаина у клеток человека поддерживается за счет ионных потоков- через ПК нормальный ге-терогенитет по ионам и К1" (см.рис.9) .

Рис.9. Зависимость К[/Ма-16 .......... '

12. 8

4

о

о

*

от плотности культуры. Светлые кружки - оценки для чистых культур, темные - для смешанных, звездочкой указана сме-

л о - шанная культура в при-

9 о сутствии уабаина. По

»о оси абсцисс - плотность

° культуры в мг белка на

О5 I см^.

20 40 60 &0

В качестве величины тока, создаваемого ионным насосом животной клетки, может быть принята величина Г*= I х ICT^A, что соответствует гликозидчувствительному потоку ионов КГ1", равному 1,2 х 10® ионов/с ( см./Веренинов,Марахова,1986/) при стехиометрии /Уа,К-АТРазы 3Va.: 2К4". При этом ионный насос осуществляет гидролиз АТР со скоростью около 5 х 10^ АТР/с, потребляя от 10 до 80 %% суммарного производства АТР. Очевидно, что энергетическая кооперация с помощью ионных потоков через ПК в рассмотренном выше случае осуществляется в масштабах, сравнимых с суммарным энергопроизводством, что эквивалентно переносу через ПК энергии, освобождающейся при гидролизе около 10^ АТР/с.

4. Оценка потоков макроэргических соединений через ПК.

Поскольку каналы всех типов ПК проницаемы для АТР, прямая диффузия этого соединения, казалось бы также могла вносить вклад в энергетическую кооперацию между клетками. Однако, следует заметить, что коэффициенты диффузии через ПК гораздо выше для неорганических конов С 10"^ cm'Vc ) , чем для соединений, близких по размеру к АТР (ТО-7 см2/с.)/Safranioi 5 Cai/елеу ,1985/. В связи с этим очевидно, что при одинаковых концентрационных градиентах поток АТР через ПК будет, как минимум, на два порядка ниже, чем поток неорганических ионов. Если поток ионов К4" через ПК при физиологических градиентах концентраций соизмерил с ионным потоком, который создает через плазматическую мембрану насос, что эквивалентно переносу через ПК энергии гидролиза около 10 АТР/с, то поток АТР не может составить более 10 АТР/с. Эта последняя оценка совпадает с экспериментальными данными о величине потока нукле-отедов через ПК при метаболической кооперации в культурах животных клеток /Pittiy ti'mmi , 1977/.

Реально разница между ионными потоками и потоками АТР должна быть еще больше, так как концентрация АТР во всех клетках стабилизирована и существенным образом при функциональных нагрузках меняется только скорость оборота пула АТР: почти на порядок.Кроме того, для эффективной передачи энергии в виде потоков АТР необходим противоток через ПК неорганического фосфата и АДР. Наконец, транспорт энергии в виде АТР не освобождает системы внутриклеточных синтезов и движений от конкуренции за АТР с насосами, которые, обладая большим сродством к АТР, чем многие клеточные ферменты, в любой ситуации потребляют значительную долю энергопродукции клетки.

Рис.10. Схемы, иллюстрирующие протекание локальных электрических токов в ходе перераспределения энергетических ресурсов с помощью ионных потоков через ПК для различных в эволюционном плане многоклеточных систем:

A. - локальная экспериментальная активация фотосинтетической редокс-цепи плазматических мембран трихома нитчатой цианобактерии;

Б. - нативная пространственная сегрегация насосов и диссипаторов в растущей верхушке грибной гифы;

B. - экспериментальная блокада уабаином насосов животных меток, имеющих ПК с

резистентными к уабаину партнерами.

РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСПОРТНЫХ ПРОЦЕССОВ В ПЛАЗ:,!АТИЧЕС1Ш ЖЖРАНАХ. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ И МЗГАВОЛИЧЕСКАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ СВЯЗАННЫХ ПК

КЛЕТОК.

В главе У рассмотрен ряд экспериментальных подходов к выявлению метаболической и функциональной гетерогенности связанных ПК клеток.

I.Цианобактерии.

При анализе спектральных характеристик трихомов Ph.4ncyna.turr) в наших опытах обнаружилась неоднородность фотосинтетических пигментов хлорофиллов и фикобилинов у разных клеток одного трихома. Гетерогенность усиливалась при ухудшении внешних условий, в частности при длительном культивировании без смены питательной среды. Учитывая то,что спектры действия фотоэлектрических ответов в наших опытах соответствовали спектрам поглощения отдельных клеток тленно в максимумах, характерных для фотосинтетических пигментов, можно расценивать спектральную гетерогенность как индикатор метабо-

лической специализации отдельных клеток недифференцированного трихома Ph . uncynatum . Возможно, что подобная локальная специализация когда-то в ходе эволюции послужила основой для постоянной дифференцировки на фиксирующие азот клетки, гетероцисты, и фотосинтезирующие, вегетативные, клетки. Отсутствие у ряда клеток хлорофилла, то-есть фотосистемы, работающей с выделением Og,могло создавать в этих клетках особо благоприятные условия для работы ингибируемого О2 фермента системы фиксации азота, нитратредук-тазы. Энергоемкий процесс фиксации азота при этом энергетически поддерживается за счет электрической связи через ПК с фотосинте-зирующими, то-есть генерирующими электрохимические градиенты ионов через плазматическую мембрану, клетками.

2. Грибы.

Интересный подход к исследованию механизмов регуляции протонного насоса грибной клетки наметился при электрофизиологическом анализе влияния синего света. Синий свет регулирует у грибов несколько физиологических процессов, связанных с морфогенезом репродуктивных структур, а также сдвиг циркадных ритмов конидиообра-зования, тропизм прот^перитециев и биосинтез каротиноидных пигментов. № обнаружили самые ранние реакции клетки на синий свет: преходящее увеличение входного сопротивления с последующей более медленной гиперполяризацией клеток. Эти реакции оказались нарушенными у ряда мутантов с дефектами в генах, ответственных за синтез каротиногенных ферментов, но, что самое интересное, мы выявили мутанта, тлеющего полный набор гено'в, регулирующих биосинтез каро-тиноидов, и тем не менее не способного к фоторегуляции этих синтезов и не отвечающего на синий свет электрическими изменениями, характерными для клеток дикого типа. Последний мутант отличался крайне низкими значениями KQB и резко выраженной гетерогенностью клеток по величине мембранного потенциала: градиенты потенциала через некоторые ПК достигали 40-50 мВ.Представляется перспективным исследование этого штамма М .ссана. Cwc-±) как уникальной модели для анализа роли ПК в интеграции (функционирования метаболически гетерогенной системы клеток.

3. Животные.

Вследствие перераспределения энергии в клеточной популяции может установиться различная скорость воспроизводства АТР в отдельных клетках. При анализе спектров собственной флуоресценции, характеризующих состояние дыхательных переносчиков С восстановленных пиридиннуклеотидов и окисленных флазопротеинов ) ,мы,действительно, наблюдали значительную гетерогенность в отдельных клетках

2Л.

смешанной культуры человеческих и хомячковых фибробластов. Добавление в среду уабадаа в концентрации, блокирующей насосы человеческих клеток, в первые 10-20 мин нивелировало гетерогенность популяции, усиливая скорость дыхания в клетках, где она прежде была ослаблена. Дальнейшие исследования в этом направлении кажутся интересными и перспективными. Интересно также перейти от модельной системы с локальной транспортной специализацией клеток, какой является описанный смешанный монослой человеческих и хомячковых клеток, к нативной многоклеточной системе с локальной временной специализацией отдельных клеток, а именно, к глиальному синцитию. Описание энергетики ионных потоков, участвующих в обеспечении гли-альным синцитием ионно-осмотического гомеостаза.окружающей нейроны среды, может оказаться плодотворным в плане анализа энергетических взаимодействий в системах нейрон-глия. В качестве подхода к такому анализу нами начаты исследования на модельной системе: смешанной культуре уабаин-чувствителзных фибробластов человека с уабаин-грезистентными клетками крысиной глиош С6, линии, обладающей многими признаками астроцитарных клеток центральной нервной системы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенный экспериментальный и теоретический анализ позволяет заключить, что благодаря ионным потокам через ПК отдельные клетки системы могут приобрести специализацию, несовместимую с одиночным существованием, а именно, требующую, притока энергии от соседних клеток. При этом, чем сильнее связь, тем ярче может быть выражена специализация клеток, обеспечиваемая перераспределением энергетических ресурсов с помощью ионных потоков через ПК. Существование энергетической кооперации между клетками по описанному механизму накладывает ряд ограничений на систему и вызывает появление в ней некоторых особенностей.

I. Энергетические критерии адекватности микроэлектродных измерений.

Следует помнить, что в стационарном состоянии у животных и грибных клеток разность всех втекающих и вытекающих через ПК токов не может превышать величину тока, необходимого для поддержания ионно-осмотического гомеостаза клетки. В соответствии с этим, например, при Ят =100 МОм и Ис =200 МОм, - типичные значения для_ животных меток, - различия по величине мембранного потенциала у электрически связанных клеток не могут превышать 16 мВ при

Ксв= 0,1 и не могут превышать точности микроэлектродных измерений, то-есть 1-2 мВ, при Ксв> 0,5. Стационарный разброс величин мембранного потенциала в монослое может наблюдаться только для изолированных друг от друга клеточных групп.

Энергетические соображения необходимо тлеть в виду,как при решении задачи экспериментальной оценки средней величины мембранного потенциала в связанном ПК монослое, так и при решении аналогичной задачи для отдельной клетки. Любой прокол клеточной мембраны микроэлектродом вызывает ток утечки, более или менее деполяризующий клетку. Очевидно, что животная клетка, находящаяся в полноценной питательной среде при 37°, благодаря активации ионных насосов какое-то время удержит мембранный потенциал на оптимальном для своего ныннешнего состояния уровне С см./Асланиди,Панфилов, 1986/ ) , однако, это будет уже клетка с измененным метаболическим статусом. Клетка в монослое, естественно, решит задачу стабилизации мембранного потенциала с меньшими затратили собственной энергии благодаря ионным потокам через ПК.

Изложенные выше соображения заставляют очень осторожно относиться к количественным оценкам мембранных потенциалов, проводимым в солевых растворах при комнатной температуре.

2. Механизмы ограничения энергообмена за счет ионных потоков через ПК.

Важно подчеркнуть, что в рамках рассмотренных представлений должны существовать предельные максимальные значения электрического тока через ПК, не допускающие полной энергетической разрядки клетки-донора энергии. Такие пределы, действительно, существуют: экспериментально установлено замыкание ПК, когда градиент потенциала через ПК превышает некоторую величину. Для животных клеток этот градиент составляет около 15 мВ /ОЬсн'Л а1. ,1984; £рг-ау <г£ а!. , 1986/, для грибных клеток, по нашим данным, - более 100 мВ. Эти величины, как и их различия для грибов и животных, хорошо согласуются с величинами'насосных токов ( см.гл.1У) .

3. Электрическая поляризация-ткани.

Специализация части клеток на активном выбросе катионов из цитоплазмы в межклеточную среду неизбежно приведет к электрической поляризации ткани. При этом в узких межклеточных ¡целях может создаваться значительная плотность тока, так что наличие межклеточного электрического поля будет модулировать движение метаболитов и сигнальных соединений не только через цитоплазматическую сРеДУ» но и в межклеточном пространстве.

В последнее время рядом исследователей рассматривается возможность влияния локальных ионных токов на процессы роста и развития путем создания полярности в распределении компонентов цитоплазмы, а также за счет перераспределения внутримембранных и при-мембранных белков в слабых внеклеточных электрических полях, создаваемых локальными токами. В ряде работ на культурах животных клеток зарегистрированы изменения характера роста под влиянием слабых электрических полей, порядка 0,1-6 мВ на клетку, а также закономерные изменения двигательной активности макрофагов, фибро-бластов и других клеток. Наличие локальных токов, а также электрических, ионных и других градиентов обнаружено у широкого круга объектов в процессах зародышевого развития и регенерации и обсуждается в плане создания "позиционных" градиентов во внутри- и внеклеточной среде. Изложенные выше представления об энергетической роли ионных потоков через ПК могут оказаться полезным инструментом при анализе широкого круга явлений, связанных с электрической поляризацией многоклеточных систем.

4. Эволюционный консерватизм энергетической функции ПК.

Эволюция идет путем повторов, обрастающих разнообразны;,ж специфическими отношениями. При' этом какие-то фундаментальные свойства, однажды установившись, подвергаются незначительным изменениям. Пожалуй, самые разительные примеры консерватизма эволюции обнаруживаются на клеточном уровне. Основные клеточные механизмы зложились миллиарды лет назад. В этом плане не является исключением функциональная возможность обмена цитоплазматическим содержимым через ПК: нитчатые цианобактерии существуют на Земле около '¿,5 млрд. лет /МоНс ,1973/. Анализируя становление функций ПК в эволюционном ряду животных, Ривель /Цене { ,19УР/ останавливается перед логически:.! противоречием: забуфернвающей ролью ПК и не->бходикостью комплементарности клеточных функций в многоклеточно.. ;истеме,- Очевидно, что это противоречие отсутствует при осуществ-гении ПК энергетической функции с помощью ионных потоков.

Биологическая упорядоченность поддерживается благодаря посто-лному притоку энергии. Как возникла первая клетка, способная додерживать ионно-осмотический гомеостаз и направленные транспорты а счет преобразования энергии в форму градиента электрохимичес-ого потенциала ионов на плазматической мембране, пока не ясно, днано, очевидно, что уже в системе из двух подобных клеток, свя-ашых диффузионным каналом, появилась реальная возможность разде-ения труда по схеме,представленной на рис.2. Миллиарды лет эволю-яи,поводимому, лишь расширили 5фуг задач, которые многоклеточные ястемы решают на основе .этого принципа.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

Шдвинуто и обосновано новое направление в исследовании принципов функционирования многоклеточных систем - перераспределение энергетических ресурсов в клеточной системе посредством ионных потоков через проницаемые межклеточные контакты.

1, Проницаемые межклеточные контакты являются необходимым звеном в осуществлении перераспределения энергетических ресурсов в многоклеточных системах. Наличие электрической связи через проницаемые межклеточные контакты превращает многоклеточную систему в единый электрический кабель, позволяя пространственно разделить по разным клеткам механизмы производства и потребления энергии в виде градиентов электрохимического потенциала неорганических ионов на плазматических мембранах.

2, Необходимым и достаточным условием энергетической кооперации между клетками посредством ионных потоков через проницаемые контакты является наличие на плазматических мембранах контактирующих клеток дисбаланса между потоками ионов через первичные ионные насосы, создающие градиенты электрохимических потенциалов на плазматических мембранах,и "диссипаторы", использующие энергию этих градиентов на осуществление транспортов ионов и метаболитов.

3. Энергетическая кооперация между клетками посредством ионных потоков может быть зарегистрирована в эксперименте в виде градиента электрического потенциала между цитоплазмами соответствующих клеток или в виде электрического тока, текущего через проницаемые контакты от клетки-акцептора энергии к клетке-донору энергии. При этом мощность, передаваемая через проницаемые контакты в веде потоков неорганических ионов, пропорциональна электрическому току, текущему через проницаемые контакты

4. Принцип энергетической кооперации посредством ионных потоков через проницаемые контакты универсален и выполняется во все многоклеточных системах. Это показано экспериментально на таких далеких в эволюционном плане клеточных системах, имеющих разное строение гидрофильных межклеточных каналов и различные механизмы электрогенеза плазматических мембран, как трихомы нитчатых цианобактерий, гифы мицелиальных грибов и культуры клеток шгеко питающих.

2.8.

5. Постоянная длины электрического кабеля в многоклеточной системе, связанной проницаемыми контактами, превышает размеры одиночной клетки и определяет размеры клеточного ансамбля, в пределах которого эффективна энергетическая кооперация. Экспериментально установлено, что постоянная длины электрического кабеля предопределена генетически, однако способна изменяться в широких пределах под влиянием эндогенных и экзогенных факторов, что создает предпосылки для гибкой регуляции метаболизма клеточной системы в целом в изменяющихся внешних условиях.

6. Максимальная мощность, передаваемая через проницаемые контакты посредством ионных потоков, соизмерима с суммарным энергопроизводством /энергопотреблением/ отдельной клетки и на два порядка превышает возможности энергетической кооперации за счет потоков макроэргов, в частности, АТР. Справедливость этого утверждения экспериментально продемонстрирована для цианобакте-рий, грибов и млекопитающих.

7. Выдвинуто предположение, что пространственная' сегрегация ионных насосов и "диссипаторов", создающая в клеточной системе связанной проницаемыми контактами, электрические токи, модулирует движение заряженных метаболитов и сигнальных молекул, как между цитоплазмами контактирующих клеток, так и по межклеточному пространству. Поляризация ткани, обуславливающая направление транспортов, является одним из существенных факторов, определяющих пространственно-функциональную организацию любой многоклеточной системы, состоящей как из электроневозбудимнх, так и из электровозбудимых клеток.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Т. Войцова Л.Ю., Ковалев С.А., Миттельман Л.А., Потапова Т.В., Рыбкин E.H., Чайлахян Л.М., Шаровская Ю.Ю. Сравнительное исследование проницаемости поверхностных и контактных мембран нормальных и трансформированных фибробластов в культуре.// Биофизика мембран.Сб.мат-лов симпозиума.Каунас, I97I.C.I75-

2. Бойцова Л.Ю., Потапова Т.В., Рывкин E.H. Проницаемость мембран нормальных и трансформированных фибробластов в культуре ткани.// Мат-лы 1У Межд.биофиз.Конгресса.Москва.1972.С.38Г.

3. Потапова Т.В., Шаровская Ю.Ю., Ковалев С.А., Миттельман Л.А.,. Чайлахян Л.М. Влияние ионного состава окружающей среды на мембранные потенциалы клеток L .// Цитология. 1972. T.I4. C.I335-I34I.

4. Бойцова Л.Ю., Потапова Т.В..Способность к образованию межклеточных контактов у нормальных и трансформированных мышиных Фибробластов, выращенных в смешанной культуре. // Бюлл. эксп. диол. мед. 1974. Ш. С.85-87.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22. 23.

Бойцова Л.Ю., Васильев Ю.М., Поталова Т.В. Шсокопроницаемые межклеточные контакты в культурах нормальных и трансформированных фибробластов.// Цитология. 1975. T.I7. С.279-285. Бойцова Л.Ю., Дунин-Барковский В.Л., Потапова Т.В. Электрические характеристики нормальных и трансформированных фибробластов в культуре. // Цитология. 1975. Т.17. С.286-292. Потапова Т.В. Установление высокопроницаемых межклеточных контактов под влиянием иона лантана.// Докл. АН СССР. 1975. Т.221. С.970-973. ,

Stav/ro«/ifc«.3ü А.S., S'erfinuka^a A. ¿ytLo3enbta~t V. P., PbtapovQ

The of ncn-lonU deitrttni iivetn-fo on cvlczmid- Z-eji'J^nt

tranlfofrvied mo«« ce-tfl. Il Ht. J. Cancer. 191Г. V■ IS". P.СGS■

Фетисова E.K., Потапова T.B. Культивирование эпителия эмбриональной печени мыши.// Бюлл. эксп. биол. мед. 1976. Т.8.С. 993-995.

Потапова Т.В. Высокопроницаемые контакты между эпителиальными клетками в культуре.// Цитология. 1976. Т.18. С.1470-1473. Снигиревская Е.С., Потапова Т.В., Комиссарчик Я.Ю., Чайлахян Л.М. Структурно-функциональное исследование септированных контактов грегарины.// Цитология. 1977. Т.19. С.342-349. Потапова Т.В., Беркинблит М.Б. Высокопроницаедае межклеточные контакты.// Природа. 1978. №3. С.64-77. Снигиревская Е.С., Потапова Т.В., Комиссарчик Я.Ю., Чайлахян Л.М. Ультраструктура специализированных межклеточных контактов в культуре клеток , обработанной низкими концентрациями лантана.// Цитология. 1979. Т.21. С.882-886. Потапова Т.В., Чайлахян Л.М. Изменения интенсивности межклеточного обмена в культуре L -клеток. // Цитология. 1979. Т. 21. C.I289-I295.

Потапова Т.В., Чайлахян Л.М. Влияние новокаина на стимуляцию лантаном межклеточного обмена. // Цитология. 1980. T.22.C.I89 -193.

Божкова В.П., Потапова Т.В., Чайлахян Л.М. Изучение межклеточного обмена в зародышах вьюна с помощью инъекций флуоресци-ирующих красителей. // Онтогенез. 1980. Т.Н. С.602-611. Глаголев А.Н., Глаголева Т.Н., Левин С.А., Потапова Т.В., Скулачев В.П,, Чайлахян Л.М. Транспорт энергии посредством передачи электрического потенциала вдоль трихома цианобактерии.// 'Докл. АН СССР. 1980. Т.255. CÎ.I490-T493. Беркинблит М.Б., Божкова В.П., Бойцова Л.Ю.,.Миттельман Л.А., Потапова Т.В., Чайлахян Л.М., Шаровская Ю.Ю. Шсокопроницае-ше контактные мембраны и их роль в межклеточных взаимодействиях. М.: "Науна", 1981.

Потапова Т.В., Фетисова Е.К. Высокопроницаемые контакты в сие шанной культуре эпителиальных клеток. // Цитология. 1981. Т. 23. С.38-47.

Чайлахян Л.М., Левин С.А., Потапова Т.В., Скулачев В.П. Генерация и передача электрических ответов на свет у нитчатых цианобактерии. // Тезисы Ш Сов.-Швед, симп.по физ.-хим.биол. Тбилиси. 1981. С.99. , х , ,.1:L j.

Pcrt^pov* Т. v., (/¿oeij P. eiec-tncAl profjertte3 and 4t>i "cj vo

Jorm louv-ii-iiiiance juncb'cM i» raï ntoplniUc ctiiù and it'ùiojica (Praia ). V.M-. P. 91 ~3&-

йванова О.Ю., Комм С.Г., Потапова T.B., Фетисова E.K. Взаимодействие разнотипных эпителиальных пластов. // Тезисы докл. У1 Всесоюз.сов.эмбриол. Ленинград. 1981. С.35. ^

Chailükhwtin LH.. QlneoicvA M. Ô{ao0ie^q f.M, ГПигМие/гс 9. M.,

Pcta.acvar. I/. ¡¿¿lache« fc Ал pcwtr ttbniwtihc«.

Qicr\o iri'chcmh cJ txanoêacten«. //ßioch<m. et Btophui. acta-

24. Левин С.А., Потапова Т.В., Скулачев В.П., Чайлахян Л.М. Распространение изменений электрического потенциала у нитчатых цианобактерий. // Биофизика. 1982. Т.27. С.280-284.

15. Левин С.А., Потапова Т.В,, Скулачев В.П., Чайлахян Л.М. Анализ кабельной структуры синезеленых водорослей. // Биофизика. 1982. Т.27. С.684-688:

26. Белозерская Т.А., Крицкий U.C., Потапова Т.В.Чайлахян Л.М. Влияние синего света на мембранный потенциал клеток Магырог«

сгоца .//Биофизика. 1982. Т.27. C.9I0-9II. '

27. Потапова Т.В. Свойства межклеточных каналов. // Тезисы I Всесоюзного Еиофиз.Оьезда. Москва. 1982. С.391.

28. Белозерская Т.А., Крицкий М.С., Левин O.A., Потапова Т.В., Чайлахян Л.М. Влияние света на мембранный потенциал нейро-споры. // Тезисы I Всесоюзного Еиофиз.Съезда. Москва. 1982. С.75.

29. Белозерская Т.А;, Крицкий М.С., Потапова Т.В., Соколовский В. Е., Чайлахян Л.М. О некоторых чертах сходства системы фоторецепции гриба NeurviporQ спиа. и зрительной рецепции. // Вопросы эвол.физиол. УШ Сов.по эвол.физиол. Тезисы сообщ. Ленинград. 1982. С.35.

30. Потапова Т.В., Левина H.H., Белозерская Т.А., Крицкий М.С., Чайлахян Л.М. Электрофизиологические исследования гриба fjtutoiforo turna, в связи с функционированием фоторецепторной системы. // Мат-лы Симп.ФЕМО. Пущино. IS83. С.53-54.

31. Потапова Т.В., Чайлахян Л.М., Лввина H.H., Белозерская Т.А. Увеличение сопротивления мембраны под действием света у

А'строга стала . // Мат-лы Ш Сов.-швейц. сиш."Биологические мембраны - структура и функции". Ташкент. 1983. С.117.

32. Потапова Т.В., Белозерская Т.А., Левина H.H.. Электрофизиологические исследования особенностей мицелиальных грибов. // Мат-лы Всесоюз.Сов. "Мицелиальные грибы: биохимия, физиология, биотехнология". Пущино. 1983. С.17.

33. Чайлахян Л.М., Потапова Т.В., Левина H.H., Белозерская Т.А., Крицкий М.С. Изучение межклеточных взаимодействий у мицели-ального гриба bturcjpora с га и а в связи с фотоэлектрическими изменениями в мембранах. // Виол.мембраны. 1984. T.I. С..44-55.

34. Белозерская Т.А., Левина H.H., Потапова Т.В. О возможной взаимосвязи функционирования фоторецепторной системы и электрогенного протонного насоса у гриба freurcjoora с гама, . // Тезисы ХУ1 Симп. ФЕБО. Москва. 1984. С. 290... .

¡5. potaeeva Р-К, Moia-ikaya f.fl., Uvha f-ff., Kfhky /Л.У. Jhá.lb -

36 Krihky ßfanHJt'ev« T. A., Btiojtrfiiaj« f. А., ' CÜaUakbjan LH-, ChtrniJt°vq F.K Uv.nt M¡1/.,

, Po6arva Г. V., ?ок*+омку V. JV! PLürtcephr тШлтм,* oLN.çsava centrai ever Ш cÜctnph^Mdikíl pteoer-ke-i 0¿

///SWtftf £f{<ch /¿с/. Stnw H.в. Н.-Ъ.-Ч. ¡Softer mtRZcï

M. Потапова T.B., Левин С.A.? Чайлахян Л.М. Участйе мГточньтх

Петрозаводск. 1984. С.28. ' "роисхож.

ьсесоюз.сов жизни

39. Потапова T.B., Левина H.H. Реакция нейроспоры на локальное повреждение клеточной мембраны. // Биол.мембраны. 1985. Т.2. C.I2I6-I2I8.

40. Потапова Т.В., Асланиди К.Б., Шалапенок A.A., Карнаухов В.Н., Чайлахян Л.М. 5>отоэлектрическая активность и спектральные характеристики одиночного трихома цианобактерии Phcr/n/dtum uncvneLium. II Докл. АН СССР. .1986. Т.290. C.I504-I507.

41. ыЩи-^ьчч r.fl., Кг.НКч Ol.С, Uv,]na Vfr, Potapova f'- V-,

Sodl^ , Chaijakhijan L-H- PhfäoicQjczi ieiponc^ e>f

iiLui-cipot-e. craio p{üim<J flicmbrantatojLX-(erflüi ÖApult. V/ micrct Qbiir. 'cf w m;crcb. Ccfijr. Mancher-, 13ГС. p.-(CC.

42. Белозерская Т.А., Левина H.H., Потапова Т.В., Соболева И.С. АТРаза плазматических; мембран гриба

в фоторецепции. // Ионный гомеостаз и влияние факторов внеш-неи^среды на жизнедеятельность клеток. М.:Изд-во МГУ, 1987.

43. Потапова Т.В., Белозерская Т.А., Левина H.H., Крицкий М.С., Чайлахян Л.М. Использование мутантов Heureipcra crai-ia

для изучения связи фоторецепиии с функционирование!: плазматических мембран. //Докл. АН СССР. 1987. Т.2§7. C.I274-I277.

44. Асланиди К.Б., Шалапенок A.A., Потапова Т.В. Метод регистрации фотоэлектрических характеристик элонгированных одно- и многоклеточных микрообъектов. // Приборы и лабораторное оборудование для научных исследований по новым направлениям био' логии и биотехнологии. Пущино. 1987. C.I0G-I04.

45. iev.'fi fi м. (i t ße/cjt«£ftv« T.fi.y CfiaifakfiycLn Д., (ürihtv Pct&povaT V- bUe-ÜSht iiicir.'cui UCfcflcel cl p-faJf»* mt/ябглпе cl wc-f mew«i irr«.//» <,/ ц'сьШрога ck&J*r. // hp^'pt. tSfS. V. /г. p,n-n.f f

46. Асланиди К.Б., Потапова T.B., Чайлахян Л.М. Энергетические оценки электрических и диффузионных взаимодействий через высокопроницаемые межклеточные контакты. // Докл. АН СССР. 1988. Т.299. С.992-995.

47. Потапова Т.В., Асланиди К.Б., Чайлахян Л.М. Транспорт энерги через высокопроницаемые контактные-мембраны. // Биол.мембран 1988. Т.5. С.Б13-627.

48. Белозерская Т.А., Левина H.H., Потапова Т.В., Соболева И.С., Крицкии М.С., Чайлахян Л.М. Анализ связи фотоиндуцированной гиперполяризации плазматических мембран с метаболизмом у (¿аигсзрсга .// Биол.мембраны. 1988. T.5.C.I08I-I089

49. Потапова Т.В., Асланиди К.Б., Белозерская Т.А., Левина H.H., Крицкий М.С. Влияние синего света на электрические характери стики плазматических и контактных мембран многоклеточных микроорганизмов. // Структурная динамика биологических мембран и ее цоль в ¡эе^ля^шм£отобиологических и рецепторных процес

50. Асланиди К.Б., Потапова'Т.В., Шалапенок A.A. Энергетическая кооперация у многоклеточных гидробионтов. // Тезисы докл. Ш Всесоюз.конф. по морской биол. Севастополь, 1988. Т.2. С.4-5

51. Асланиди К.Б., Шалапенок A.A., Потапова Т.В, Возможности низкотемпературного микроспектрального анализа. // Мат-лы Вс союз. конф. по люминесцентным,методам. Рига: РМЙ, 1988. С.6-

52. Potapova Г. К, Cbiantc/t jC.ß beloitnKtM f.fi-, UWnQ А A Tranl-CtHUUr ,cn!z cutren.fi £u octe^t/ai

j&üsn. 'а^гщ rm

53. Асланиди К.Б., Бойцова Л.Ю., Потапова Т.В., Чайлахян Л.М. ■Энергетическая кооперация между животными клетками при 'пол-иой блокаде у части клеток/Сл,К -насосов. // Докл. АН СССР.

l«oUD» 0»УУи—УУо,

аг..