Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ультраструктурные основы трансэпителиальной проницаемости (трансцеллюлярный и парацеллюлярный транспорт веществ)

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Ультраструктурные основы трансэпителиальной проницаемости (трансцеллюлярный и парацеллюлярный транспорт веществ)"

^ ^ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

^ ' ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

№1 правых р\ копией УДК 582.232*576 Л 16.576..153.7

СНИГПРЕВСКАЯ Екатерина Сергеевна

УЛЫ ТАСП'УКТУРНЫЕ ОСНОВЫ ТРАНСЭПИТЕЛИАЛЫЮЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ (трянсцеллюлпрнмн п иаранеллкишриым транспорт веществ)

03.00.25 Клеточная биология

ДИССЕРТАЦИЯ

па соискание ученой степени доктора биологических наук н форме научного доклада

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена в Институте цитологии РАН.

академик,профессор Л.Н.ИВАНОВА Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

член-корр. РАМН,профессор В.А.ОТЕЛЛИН, НИИ экспериментальной медицины РАМН, С-Петербург

доктор биол. наук, С. А. КРОЛЕНКО, Институт цитологии РАН С.-Петербург

Ведущее учреждение - Инсгиут эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН. С.-Петербург

Защита состой гея » ноября 1997 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д 002 73 01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Официальные оппоненты:

Автореферат разослан октября 1997

г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биол. наук

Л.Н.ПИСАРЕВА

1. Общая x:ip:ticiepiicuiKii рлшнм

1.1 Актуальное!i. проблемы

Эпителии представляют собой наиболее ярко выраженный тип тканей, сформированных полярными клетками. Выстилая полости всех внутренних органов и механически защищая их, эпителии регулируют гомеостаз ионов, неэлектролитов и воды в разных компартментах организма и участвуют в продукции эксграиеллюлярных компонентов тканей. Проблема транеэпителиальной проницаемости является одной из центральных фундаментальных проблем клеточной биологии. Несмотря на то чю процессы транспорта веществ через различные эпителии исследуются уже со второй половины XIX столетия, до сих пор в этой проблеме остается много спорных вопросов, решение которых важно не только для фундаментальной науки, но и для ряда медицинских проблем. Для объяснения механизмов транспорта питательных веществ, воды и ионов в желудочно-кишечном тракте и в осморегулирующих органах млекопитающих предлагались альтернативные точки зрения (трансцеллюлярный или парацеллюлярный путь транспорта), поочередно доминирующие в литературе в зависимости от получения новых фактов.

Большой прогресс в понимании путей и механизмов транеэпителиальпого транспорта был сделан за последние 30 лет. Сочетание современнных физиологических и морфологических подходов позволило до некоторой степени приблизиться к разрешению ряда вопросов. Так, были открыты явления рецептор-опосредованного эндоцитоза для поглощения макромолекулярных питательных веществ (Goldstein et al., 1985); примембрапного пищеварения в тонкой кишке млекопитающих (Уголев, 1962); расшифрованы на биохимическом уровне механизмы регуляции вазопрессииом транспорта воды в плотных эпителиях (см. Иванова, Наточнн, 1987); открыто явление межклеточной коммуникации (Loewenstein, Каппо, 1964); обнаружены белки водных каналов - аквапорины (Agre el al., 1993) и каналов, осуществляющих межклеточный обмен ионами и метаболитами - коннексины (Goodenongli, Miisil, 1993). Однако, многие вопросы о морфологических путях транспорта веществ через эпителии еще ждут своего разрешения.

Экспериментальная стимуляция транспорта веществ через различные ткани дает возможность изучать процессы, связанные с поглощением и переносом веществ через клетку, такие, как рецепция лиганда, проведение сигнала через плазматическую мембрану и через клетку, ответ клетки на физиологические воздействия. Эксперименты, позволяющие дозировать нагрузку и количественно регистрировать всасывание и транспорт исследуемых веществ, обеспечивает проведение структурных исследований в строго определенных физиологических условиях.

В настоящее время и мире существует всего несколько исследовательских групп, занимающихся структурно-функциональным анализом транспортирующих эпителиев ( группа проф. Бурге во Франции, группы проф. Хенса, проф. Вейда и проф. Паипенгеймера в Америке). Каждая из этих групп занимается изучением одного типа эпителия с применением одного-двух методов электронной микроскопии. В связи с эгнм представляется актуальным комплексный подход к изучению [фоблсмы-пронниасмосш-эпптелнсв-с-нсиользованиемразных'объектов исследования и широкого спектра многообразных структурных методов.

1.2. Цель п задачи исследовании

Целью настоящей работы было выявление путей транспорта различных веществ (мало- и крупномолскулярных питательных веществ, изотонической жидкости, воды) через разные тины эпителиев (проницаемые и плот ные), клеточные культуры , ооциты насекомых, клетки простейших.

Для решения проблемы трапсэшпелиальной проницаемости был поставлен ряд задач:

1) изучить роль апикальной мембраны полярных эпителиальных клеток и плазматической мембраны одиночных клеток - ооцитов при стимуляции транспортных процессов;

2) оценить вклад межклеточных контактов в транспорт веществ между соседними клетками и через эпителиальные слои;

3) исследовать участие внутриклеточных оргапелл - элементов цитоскелега и вакуолярпой системы клеток в траисцеллюлярном транспорте веществ;

4) проследить судьбу комплекса лнганд-рецептор в процессе вителлогенеза ооцита комара.

1.3. Научат новизна работы

Впервые проведено сравнительное исследование апикальных мембран двух типов эпителия: проницаемого - тонкой кишки крыс и плотного - мочевого пузыря лягушки и установлены существенные различия в их структурной организации.

Получены абсолютно новые данные о возможности стимуляции водных потоков в плотном эпителии мочевого пузыря лягушки не только аншдиуретическим гормоном, по и отмывкой из эпителия физиологически активных веществ липидной природы, аутакоидов, способствующих сохранению низкого уровня водной проницаемости мочевого пузыря в норме. При стимуляции водного транспорта обоими способами обнаружены одни п те же изменения апикальной мембраны, свидетельствующие о встраивании в неё доменов с высокой водной проницаемостью.

Получена новая информация о перераспределении мембранных белков апикальной мембраны полярных клеток проницаемого и плотного эпителиев при стимуляции транспортных процессов через эпителии.

Впервые на электронномикроскопическом уровне полностью прослежена судьба комплекса лиганд-рецептор при поглощении питательных веществ развивающимися ооцитами комара, в частности, продемонстрированы процессы диссоциации рецептора и лиганда и возвращение рецептора в плазматическую мембрану ооцита.

Параллельные морфологические и физиологические исследования явления межклеточной коммуникации позволили обнаружить увеличение количества щелевых контактов при индукции межклеточной связи в клеточных культурах и наличие их в смешанном сенсомоторном синапсе лягушки.

Впервые па обьекте, обладающем лишь одним типом специализированных межклеточных контактов, сизигии грегарин, показано, что сепгнроканный контакт не участвует в межклеточной связи, а играет адгезионную роль.

1.4. Научно-практическое значение работы

Полученные в настоящей работе данные по структуре клеточных мембран, специализированных межклеточных контактов и внутриклеточных оргапелл в условиях всасывания и транспорта различных веществ разными типами клеток вносят существенный вклад в решение фундаментальной проблемы клеточной биологии - транеэпителиальной проницаемости. Обнаруженные изменения ультраструктуры исследуемых клеток дают новый уникальный материал для вскрытия механизмов трансмембранной, трансцеллюлярной и межклеточной проницаемости.

Наряду с общебиологическим значением представленные результаты могут быть использованы в учебных целях и в медицине при исследовании функциональных нарушений проницаемости пищеварительных и осморегулирующих органов. Известно, что в основе многих патологических изменений функций органов лежат нарушения в клеточном ответе на регуля горные факторы, выражающиеся в изменениях ультра структуры клеток.

Изучение особенностей развития ооцитов комара открывает новые возможности для разработки биологических методов борьбы с комарами, являющимися переносчиками ряда заболеваний, на ранних стадиях их развития.

1.5. Положения, выносимые на защит}'

1) Проведенный в работе сравнительный анализ изменений ультраструктуры основных барьеров проницаемости эпителиев: апикальной мембраны и плотных контактов позволил высказать предположение о том,

что основной путь транспорт веществ через проницаемые и плотные эпителии - трапсцеллюлярныП, а вклад парацеллюлярного пути очень мал.

2) В работе высказано предположение об участии аппарата Гольджи в регуляции клеточного обьема при транспорте изотопической жидкости и воды через проницаемые и плотные эпителии.

3) Постулируется участие специфических гранул эпителиальных клеток, формирующихеяв аппарате Гольджи во встраивании белков водных-каналов в апикальную мембрану.

4) Отмечается существенная роль микрофиламентов и микротрубочек в ответе клеток плотного эпителия на гидроосмогическое действие гормона.

5) В работе оценивается участие межклеточного пространства в транспорте изотонической жидкости и воды в проницаемых и плотных эпителиях - минимальная проницаемость зоны плотных контактов и проведение потоков жидкости в кровь по латеральным межклеточным щелям;

6) Анализируются особенности рецептор-опосредованного эндоцитоза в ооцигах комаров: нптерпализация комплексов лиганд-рецептор через окаймленные ямки, диссоциация комплексов при переходе ранних эндосом в поздние, возвращение рецептора в плазматическую мембрану, накопление лиганда в желточных телах.

7) Обсуждается корреляция между количеством щелевых контактов и степенью связанности клеток.

8) Функция септированного контакта ограничивается участием в адгезии клеток.

1.6. Апробации работы

Материалы работы доложены или представлены на Vlll- XVI Всесоюзных (Российских) конференциях по Электронной Микроскопии (1971, 1976,1982, 1988, 1992, 1996), съездах АГЭ (1972, 1981) ; на ХШ Междунар: Конф. по Электронной Микроскопии (Париж, 1994); на VI и VIII конф. но "Водно-солевому обмену и функции почек" (1981, 1990); на Всесоюзных съездах протозоологов (1976), физиологов (1983); на Междунар. Конф. "Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины" (1988); Междунар. Симп. "Межклеточная коммуникация» (1994); на научных семинарах в Сиенском Университете (Италия, 1991), Бернском Университете (Швейцария, 1991), на 4-х семинарах в Мичиганском Университете (США, 1994,1996); доклады на семинарах Института цитологии.

1.7. Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 46 статей, в том числе 2 обзора, глава в монографии Комиссарчика Я.Ю. и Миронова A.A. «Электронная микроскопия клеток и тканей: замораживание-скалыванне-траплепие», 1992, глава в атласе «Microscopic Anatomy of Invertebrates» и около 30 тезисов.

2. Материал и мешдм

В настоящей работе представлен анализ изменений ультраструктуры клеток двух типов эпителиев при различных физиологических воздействиях: проницаемого эпителия тонкой кишки крысы и плотного эпителия мочевого пузыря лягушки. Морфологические особенности поглощения макромолекулярных питательных веществ исследовались на ооцигах комара, межклеточной коммуникации на клеточных культурах (L и FBT), сенсомоторпом синапсе спинного мозга лягушки и двухклегочной стадии жизненного цикла простейших грегарин - сизигии.

Наряду со стандартными методами электронной микроскопии в настоящей работе были использованы следующие методы ультраструктурного анализа: замораживание-скалывание, замораживание-замещение, замораживание-высушивание, низко-температурная заливка в акриловые смолы, иммунная электронная микроскопия на срезах материала, залитого в различные смолы (postembedding) и на ультратонких замороженных срезах, рентгеноспсктральный анализ.

Ультратонкие срезы и реплики, полученные методом замораживания-скалывания просматривались в просвечивающих электронных микроскопах JEM-7, JEM-I00U, JEM-100C; JIZM-100CX, Pliilips-CMIO; поверхность клеток изучалась в сканирующем микроскопе JSM-35; для рентгеновского микроанализа использовался сканирующий электронный микроскоп JSM-U3.

Описание использованных физиологических методов приводится а разделах соот вестпующих глав "Постановка экспериментов". 2.1.Стандартные меч оды электронномпкроскоппческого исследования применялись для изучения особенностей морфологии клеток и тканей. Они включали в себя фиксацию материала 2,5% раствором глютар-альдегида, постфиксацию 1% раствором OsO^, дегидратацию в спиртах повышающейся концентрации и заливку в эпоксидные смолы.

В настоящей работе для приготовления фиксаторов использовались веронал-ацетатный, какодилатный и фосфатный буферы с pH - 7,2-7,4 и тоничностыо, соответствующей осмоляльности интерстициальной жидкости исследуемых объектов. Фиксация быстро вырезанного кусочка ткани анестезированного животного производилась при комнатной

температуре (К Г), сначала unoiар-альдегидом в течение 40 мин-1 ч, потом OsOj - в течение 1 ч. После продолжительной дегидратации (1,5-2 ч) и пропитки в заливочной среде материал заливался в Аралдит, Эпон, смесь Аралднта с Эпопом или LR-White. Полимеризация эпоксидных и акриловых смол осуществлялась в термостате при + 58-60°С в течение 2-х сугок. Ультратонкие срезы магериала, залитого в смолы, приготавливались на улырамикрогомах LKB 8800 и Reihert-Jtmg стеклянными и алмазными ножами:—Срезы из-эноксндных~смол~окрашивались—сначала спиртовым' раствором ураиил-ацетата (10 мин), затем цитратом свинца по Рейнолдсу (5 мин). Срезы материала, залитого в акриловые смолы, окрашивались водным раствором уранил-ацетага (5 мин) и цитратом свинца (1-2 мин).

2.2. Крномеюды. В связи со сходством ряда процедур все использованные в paGoïc низкотемпературные методы объединены в группу криомегодов.

2.2.1. Замороженные улмраюнкнс срезы использовались для целей иммуно-локализации клеточных белков. Перед криофиксацией делалась предварительная префиксация материала 2% раствором формальдегида с добавлением 0,05% глютар-альдегнда в течение 30-40 мин при комнатной температуре. Для предотвращения образования кристаллов льда в клетках объекты пропитывались растворами сахарозы повышающейся концентрации (0,5, 1,5, 2,3 M сахарозы) при +4°С на мешалке в течение суток. Криофиксация осуществлялась самым простым способом -быстрым погружением кусочков материала, закрепленных на держателях, в пропан, охлажденный до температуры -190°С жидким азотом. Образцы могут храниться в жидком азоте в течение нескольких месяцев. Замороженные срезы приготавливались сухими стеклянными ножами при -90°С по метолу Tokuyasn, 1986. Оптимальный угол наклона ножа 6°, оптимальная скорость резки 2 мм/сек. Перед резкой замороженный объект с держателем затачивался в камере микротома охлажденным металлическим стержнем. Срезы с сухой поверхности ножа снимались топкой металлической петлей (диаметр - 2мм), содержащей каплю 2,ЗМ сахарозы, н монтировались па покрытую пленкой никелевую сеточку. Сетки со срезами помещались на поверхность 2% желатины, залитой в чашку Петри, и храшшсь в холодильнике. Перед проведением иммуноцитохимической реакции сахароза отмывалась инкубацией срезов в ФБ при КТ. Контрастирование замороженных срезов отличается от такового срезов смолы. Их окрашивание производилось в два этапа: 1) 1 ч в нейтральном 2% растворе уранил-ацетата, содержащем 0,15 M оксалата калия (рН 7,2 доводится 10% аммиаком); 2) срезы промывались водой и переносятся в 2% кислый уранил-ацетат (рМ 5,8), содержащий 1,8% метил-целлюлозу.

2.2.2. Меюд заморажнвапнн-замещешш, сочетающий крнофиксацию материала и его заливку в смолы, способствует хорошей сохранности как ультраструктуры клеток, так и антигенных свойств его химических компонентов. 13 качестве криофиксации в настоящей работе была использована методика быстрого замораживания объекта на охлажденном металлическом блоке (зеркале). Объекты могут храниться в жидком азоте длительное время. При таком способе замораживания 5-10 мкм поверхности ткани, контактирующей с зеркалом, практически не содержат видимых в электронном микроскопе кристаллов льда. После криофиксации производилось замещение витрифицированной воды раствором ацетона, содержащем ОбО.| при -95°С в течение 3-х дней. Затем ткань медленно согревали до комнатной температуры (КТ) и заливали в одну из смол.

2.2.3. Метод заморажнвашш-скалывання. Для предотвращения образования в гкапп кристаллов льда мы использовали предварительную химическую фиксацию объекта глюгар-альдегидом и его пропитку 25% глицерином. Объект замораживался в золотом держателе, после чего помещался в установку с высоким вакуумом, где раскалывался при температуре -150°С и напылялся углем и платиной. Все эти процедуры проводятся в высоком вакууме при температуре жидкого азота. После растворения ткани гипохлоридом калия реплики исследовались в просвечивающем электронном микроскопе. Для обозначения поверхностей скола использовалась номенклатура, предложенная Брайтоном (Вга^оп, 1978).

2.2.4. Для сканирующего электронного микроскопа объекты замораживались одним из упомянутых методов и затем высушивались методом замораживания-высушивания, который по нашим и литературным данным имеет преимущество перед методом критической точки. Замораживание-высушивание проводилось в специальной установке, разработанной в нашей лаборатории. Высушенные объекты перед просмотром напылялись золотом для снятия заряда.

2.2.5. Рептгсно-снсктрпльпмн анализ элементного состава клеток проводился на полутонких (1-2 мкм) замороженных срезах, приготовленных на криомикротоме Ро11ег-В1шп при -40°С. Срезы просматривались в сканирующем электронном микроскопе-микроанализаторе ,15М-Ш (Япония). Разрешение метода составляет I мкм при диаметре электронного пучка 0,1 мкм. Ускоряющее напряжение составляло 10 и 25 кВ, ток не превышал 20 нА. В эксперименте регистрировалось наиболее интенсивная Ки-линия характеристического рентгеновского спектра исследуемых элементов. В работе в основном изучалось содержание калия в клетках и внутриклеточных вакуолях.

2.3. Иммунная jjickipoiinasi микроскопии была применена для определения локализации белкой и изучаемых объектах. Сохранение антигенных свойств белков и ультраструктуры клетки обеспечивалось соблюдением следующих условии препарирования образца: 1) использование "щадящего" фосфатного буфера (ФБ) для приготовления фиксаторов и растворов для дальнейшей обработки материала;

2)_фиксация_быстро.—проникающим— в—биологические—ткани— 2-4%

формальдегидом с добавлением небольших концентраций пнотар-альдегида (0,1-0,5%), способствующею лучшей сохранности ультраструкгуры клеток; 3) блокирование остаточных альдегидных групп глютар-альдегида 0,05 М раствором глицина в ФБ или 1% водным раствором борогндрида натрия; 4) исключение осмиевой постфиксации, так как осмий, связываясь с белками, делает многие антигенные детерминанты недоступными для реакции с антителами; 5) кратковременная (30-40 мин) дегидратация объектов, исключающая абсолютный спирт; 6) пропитка смолой LR-Wliite при комнатной температуре, пропитка Ловикрнлом при -28—30°С; 7) температура полимеризации смол должна быть ниже +60°С. Для заливки объектов для иммунной электронной микроскопии использовали гидрофильные

акриловые смолы, полимеризующиеся как при низких температурах (-20— 30°С) под УФ (LR-Gold, Unicryl, Lowicryl К4М), так и при +52 - 55°С (LR-Wliite).

В настоящей работе методами иммунной электронной микроскопии идентифицировались следующие белки: тубулин, актин, кератин, виментин, минорные желточные белки комара (вителлогенин, белок 44 KP, вителлогеиная карбоксипептидаза -VCP), клатрин. Был использован метод непрямого мечения антигенов коллоидным золотом на ультратонких срезах материала, залитого в акриловые смолы (postembedding), и на ультратонких замороженных срезах. Для иммунолокализации белков цитоскелета были использованы фирменные антитела (AT) (Amersham, Sigma, Polyscience), а также AT к специфическим желточным белкам и клатрину ооцитов комара, полученные в лаб. молекулярной биологии насекомых Мичиганского Университета (США).

2.3.1. Пммуноингохнмнчсскне реакции нп улыратопкнх срезах материала, залитого в смолы п па замороженных срезах проводилось одинаково (Roth, 1982). Прежде всего срезы инкубировались в растворе 1% бычьего альбумина в ФБ в течение 15-20 мин для уменьшения неспецифического связывания антител. Затем срезы инкубировались в первичных AT с различным разведением (от 10 доЮОО раз) в течение 1-2 ч при KT или в течение ночи при +4°С. Срезы промывались в ФБ, содержащем 0,05% детергента Tween-20, и помещались на каплю коныогата вторых AT или протеина А с золотом (разбавление от 3 до 50

раз). Через 40-60 мин срезы, тщательно промывались в ФБ и дистиллированной воде и замороженные срезы фиксировались в 1% водном растворе глютар-альдегнда. В том случае, когда определялась колокализация двух белков, применялся метод двойного мечения на двух сторонах среза, смонтированного па сетку без пленки подложки (Вепс1ауап, 1985). Использовалось два контроля: первые АТ замещались соответствующей неиммупной сывороткой или опускались.

Механизм непрямой иммунной реакции на ультратонком срезе, проиллюстрированный на рис. 1, заключается во взаимодействии специфических АТ с изучаемым антигеном на поверхности среза. Антитело связывается с антигенной детерминантой своим АВ-сайтом, в то время как С-фрагмент связывается со вторичными АТ: ¡цв или молекулами белка А, конъюгированными с коллоидным золотом. Электронноплотные частицы золота, таким образом, определяют локализацию данного антигена.

А Б

Рис. I Схема метода лммуноцитохимической реакции на ультратонком срезе (роз1етЬеёс1п1ц). А - метод двойной метки для определения колокализации двух антигенов на разных сторонах среза (но Ветк^ап, 1989). На стороне «а» проводится реакция на один антиген (I) с помощью соответствующих антител. АВ-фрагмент антитела связывается с соответствующей детерминантой антигена. Комплекс антиген-антитело выявляется при взаимодействии его с коныогатом вторых антител или белка А с коллоидным золотом (непрямой метод) с определенным размером частиц золота. На стороне «о» для определения локализации другого антигена (2) используются другие антитела и другой конъюгат с другим размером золотых частиц. Б - метод усиления интенсивности метки одного и того же антигена с использованием одних и тех же антител п одного и того же размера золотых частиц.

Чувствительность этою метода в значительной степени зависит от природы антигена и его сохранности во время электронномикроскопической обработки, а также от специфики используемых АТ. В тех случаях, когда иммунный ответ очень слаб, используются методы его амплификации. В

настоящей работе был предложен метод амплификации иммунного сигнала для определения локализации белков в ооцитах комара (Рис. 1). Метод основан па принципе двойной метки, предложенном Велс1ауап (1985) для локализации двух разных антигенов на двух сторонах среза. Для усиления интенсивности метки в настоящей работе также метились обе стороны среза, но не разными АТ, как при двойном мечении, а одними и теми же и затем коныогагом белка А с одним и тем же размером частиц коллоидного золота. Соответственно это увеличивало интенсивность золотой метки в два раза. Особенно этот метод пригоден для иммунолокализацпи белков в мелких компартментах, сечения которых находятся лишь па одной из поверхностей среза. Такое двойное мечение одного антигена может быть осуществлено простым погружением срезов, смонтированных на сетку без пленки подложки, в каплю с соответствующими реагентами.

3. Карьерная роль транспортирующих эшпелпев в диффузии веществ между внешней средой н ннтсрсгпнпалмшп жидкостью.

Физиологическими методами показано, что эпителиальные слои разных органов отличаются своей проницаемостью (Diamond, 1978). Различают эпителии с высокой и низкой транеэпителиальной проницаемостью, так называемые проницаемые (leaky) и плотные (tight) эпителии. Проницаемые эпителии характеризуются относительно низким электрическим сопротивлением, от 5 до 300 ом/см2, и участием в транеэпителиальпом изотопическом транспорте жидкости. Для плотных эпителиев характерно высокое трансэпителиальное сопротивление, от 300 до 80000 ом/см2. Они ограничивают протоки с гипо- или гипертоническим содержимым и участвуют в гипертонической секреции или абсорбции, которые регулируются стероидными и пептидными гормонами (Sousa, 1985).

Основными барьерами проницаемости эпителиальных пластов являются апикальные мембраны клеток и плотные контакты. Показано, что специализированные плотные контакты в значительной степени определяют функции эпителиев. Наряду с тем, что они осуществляют физическое сцепление клеток, они создают барьер для движения молекул и нонов по межклеточному пространству. В последние годы стало ясно, что плотный контакт не абсолютная пробка, а что он содержит селективные поры, определяющие проницаемость различных проницаемых эпителиев. Важной функцией плотных контактов является также ограничение латеральной диффузии мембранных белков апикального и

базолатеральиого доменов плазматической мембраны (Staelielin, 1974). Различный белковый состав этих мембранных доменов представляет собой неотъемлемое свойство полярных эпителиальных клеток. Полярные свойства эпителиалных клеток, в свою очередь, способствуют созданию векторных путей транспорта поглощаемых веществ - от апикальной поверхности к базолатеральной (абсорбция) или в обратном направлении (секреция).

В настоящем разделе будут рассмотрены изменения ультраструктуры эпителиальных клеток тонкой кишки крысы и мочевого пузыря лягушки при стимуляции процессов абсорбции.

3.1. Морфологические изменения проницаемых эпителиев при различных физиологических нагрузках

Характерной морфологической особенностью транспортных эпителиев является их полярность, выражающаяся в наличии щеточной каймы на апикальной и ннтердигитаций на базолатеральной поверхностях клеток. Целостность эпителиального слоя поддерживается апикальным соединительным комплексом, состоящим из трех типов

специализированных межклеточных контактов: плотный, промежуточный н десмосома. Плотный контакт запечатывает межклеточное пространство, препятствуя диффузии веществ но межклеточному пространству. Непроницаемость зоны плотного контакта в желчных капиллярах для неэлектролитов и белковых молекул имеет, в частности, решающее значение для нормального функционирования печени. Плотный контакт

разделяет пространство Диссе и желчных протоков,-не позволяя проникать-

желчи в кровь (Easler et al., 1983).

Несмотря на интенсивные исследования функциональных характеристик проницаемых эпителиев, участвующих в изотоническом транспорте жидкости, до сих пор не существует единого мнения о путях транспортирующейся через них жидкости. Известно, что глюкоза всасывается клетками кишечника с помощью специфических белков -переносчиков. Этот перенос глюкозы сопряжен с транспортом ионов Na+. Многочисленными физиологическими исследованиями показано, что в проницаемых эпителиях с входом глюкозы и натрия сопряжен также транспорт воды в клетку (см. обзор Zeiiliten, 1995). Разделить эти потоки экспериментально невозможно, поэтому, анализируя структурные корреляты всасывания глюкозы, мы фактически изучаем изменения ультраструктуры энтерощпов при изотоническом транспорте жидкости через проницаемый эпителий.

Наиболее активное всасывание глюкозы и аминокислот происходит в эпителии проксимального отдела тонкой кишки, выстланного однослойным цилиндрическим эпителием (Madara, Trier, 1987). Согласно распространенной в настоящее время точке зрения, основанной на морфо-функциональном изучении процессов всасывания глюкозы в тонкой кишке крыс (Madara, Pappenheimer, 1987; Pappenheimer, 1990,1993), основным путем транспорта глюкозы через эпителий является парацеллюлярный путь. Паппеигепмер с соавт. наблюдали раскрытие плотных контактов (образование блистеров) и расширение межклеточных щелей при нагрузке выделенных участков тонкой кишки глюкозой и аминокислотами.

Следует отметить, что в литературе практически отсутствуют данные об изменении структурной организации апикальных мембран энтероцитов при поглощении путриетов. Кроме того, нет работ, посвященных сравнительному изучению морфологических особенностей аппарата Гольджи в разных типах эпителиев и его поведению в условиях стимуляции транспорта различных веществ.

Целью настоящего раздела работы было изучение морфо-функциональных характеристик апикальной мембраны, плотного контакта и внутриклеточных структур двух проницаемых эпителиев: желчных капилляров печени п тонкой кишки крысы в разных экспериментальных условиях.

3.1.1. Постаношса эксиеримспто»

1. На печени белых лабораторных крыс изучалась роль ионов кальция в функциональной и структурной целостности плотного контакта. Сравнивалась ультраструктура клеточных контактов при короткой перфузии, 15 мин, и длительной перфузии, 1,5 час, раствором Рингера для теплокровных и бескальциевым раствором Рингера, содержащим 1 мМ ЭДТА. Подогретый до 38°С раствор Рингера вводился в печень наркотизированной крысы через портальную вену. Для выявления межклеточных щелей п межклеточных контактов использовалась электронно-плотная метка, хлористый лантан.

После перфузии печени нормальным или бескальциевым физиологическим раствором производилась перфузия физиологическим раствором, содержащим 0,3% LaCli в течение 3-5 мин, затем - глютар-альдегндом с такой же концентрацией хлористого лантана (Revel, Kamovsky, 1967). Через 5 мин физиологический раствор заменялся фиксатором. Перфузия фиксатором производилась в течение 40 мин при комнатной темлсршуре, после чего вырезанные кусочки ткани подвергались дальнейшей обработке для электронномикроскопического исследования.

2. Для острых и хронических опытов на тонкой кишке использовались крысы самцы линии Вистар. Хирургическая операция, заключающаяся в изоляции петель тонкой кишки, производилась на наркотизированных крысах (Уголев, Зарипов, 1979). В оба конца изолированной петли вводились фистульные трубки, которые выводились наружу. В течение эксперимента температура тела животных поддерживалась при 37°С. В дни отсутствия экспериментов для поддержания функционального состояния слизистой оболочки и замедления процесса её атрофии изолированный участок тонкой кишки перфузировался раствором глюкозы (25 мМ) в течение 1 час. В хроническом эксперименте нутриепты вводились в петли через 6-7 дней после операции. В остром эксперименте петли сразу же загружались нутриептами и для морфологического исследования материал брался через 20-25 мин.

В опытах с нагрузкой кишки нутриептами изолированные петли проксимального отдела тонкой кишки, длиной 3-5 см, загружались следующими субстратами: 1) 10 мМ -75 мМ раствор глюкозы; 2) раствор Рингера с пониженной концентрацией NaCI.;

3) 10 мМ раствор глицина; 4) 0,5% эмульсия триолеина. Все растворы имели pll 7,4 и были изоосмотичны стандартному раствору Рингера. Одну из петель использовали как контрольную. Все субстраты готовили на растворе Рингера с пониженной концентрацией NaCI (120 мМ) для того, чтобы при наивысшей из используемых концентраций глюкозы (75 мМ)

осмогмчность перфузионпого раствора была близка к осмотичности стандартного раствора Рингера. Для сохранения изоосмотичности исходных перфузнонных растворов при более низких концентрациях субстрата (12,5-50 мМ) в них добавляли соответствующее количество маннита. Для приготовления эмульсии триолеина использовали 5% раствор гуммиарабика на растворе Рингера.

После предварительной 15-минутной перфузии субстратом данной концентрации онжрали последовательно 3 пробы (в течение 5 мин каждую) для последующего биохимического анализа.

Концентрацию глюкозы в пробах определяли глюкозооксидазным методом, а сумму концентраций глюкозы в мМ - антроновым методом (Уголев и др., 1986).

Для электронномикроскопического анализа из середины каждого изолированного участка тонокй кишки вырезались кусочки длиной 5-7 мм. 3.1.2. Барьсршш роль пло!пых контактов в печени крысы

Электронномикроскоппческое изучение печени крыс стандартными методами позволяет выявить все известные для этой железы элементы, включая желчные капилляры. Просветы капилляров отделены от межклеточных пространств гепатоцитов зонами плотных контактов. Последние окружают апикальные области гепатоцитов сплошным поясом. На ультратонких срезах видно, что плотный контакт состоит из внутренних слоев плазматических мембран двух соседних клеток и среднего, часто прерывистого электронно-плотного слоя, отделенного от них электронно-прозрачными промежутками. Общая ширина контакта - 14-16 нм.

Барьерные свойства плотного контакта хорошо демонстрируются с помощью электронно-плотной метки, лантана. При перфузии печени крысы 0,3% раствором хлористого лантана метка выявляется в кровеносных сосудах (синусоидах) и в межклеточном пространстве печени, но никогда не встречается в просвете желчного капилляра, что свидетельствует о том, что лантан не проникает через плотные контакты.

При обработке ткани в течение 1,5 ч бескальциевыми растворами, содержащими 1 мМ ЭДТА, плотный контакт, запечатывающий желчные капилляры, может раскрываться и становиться проницаемым для лантана. Лантановая метка при раскрытии плотного контакта выявляется не только в межклеточной щели, но и внутри желчного капилляра.

Результаты этих опытов указывают на большое значение в сохранности структурной и функциональной целостности плотного контакта ионов кальция, а также поверхностных мембранных протеидов, которые вымываются при длительной обработке ткани бескальциевыми растворами.

3.1.3. Особенности струтуры эпителия тонкой кишки крыс

Тонкая кишка млекопитающих является одним из важнейших внутренних органов, обладающих барьерной и транспортной функцией. В ней происходит переваривание и всасывание питательных веществ и воды.

Физиологические данные, полученные в настоящей работе, показали, что скорость всасывания воды возрастала (с 0,40 до 1,75 мкл/мин на 1 см кишечной петли) при увеличении концентрации глюкозы в исходном перфузатс в днапозопе низких и средних концентраций (12,5-50 мМ) и оставалась неизменной в диапозоне высоких концентраций субстрата (50-75 мМ).

Электронномикроскоппческое исследование однослойного цилиндрического эпителия тонкой кишки позволяет выявить в его составе несколько типов клеток, преобладающими из которых являются всасывающие клетки, энтероциты (90%). На апикальной поверхности энтероцитов выявляются многочисленные плотно упакованные

микроворсинки, создающие специализированную структуру кишечного эпителия, щеточную кайму. Апикальная плазматическая мембрана толщиной 10 им с наружной стороны покрыта гликокаликсом, наиболее ярко выраженном на верхушках микроворсинок,имеющих диаметр в среднем 0,2 мкм и длину от 0,5 мкм до 2 мкм, в зависимости от положения клеток на ворсинке (наиболее короткие микроворсинки наблюдаются на всасывающих клетках крипт). Центральная часть микроворсинок заполнена микрофпламентами, собранными в аксиальный пучок. Между микроворсинкми встречаются отдельные окаймленные ямки, диаметром около 0,1 мкм.

Рис. 2. Р-поверхность апикальной мембраны энтероцитов на репликах, полученных методом замораживания-скалывания. А - равномерное распределение

внутрпмембранных частиц (ВМЧ) в контроле; Б - перемещение ВМЧ в область микровореннок при всасывании энтероцптамм глюкозы Стрелками указаны участки мембраны, лишенные ВМЧ

На репликах сколов кишки, полученных методом замораживания-скалывания со стороны мукозной поверхности, видна плотная гексагональная упаковка клеток, разделенных зонами плотных контактов. На поверхности клеток выявляются сколотые поперек пальцевидные

микроворсинки. При большом увеличении участков реплик со сколов апикальной мембраны обнаруживается большое количество внутримембранных частиц (ВМЧ) на Р-поверхности и малое на - Е-новерхности, что типично для большинства клеточных мембран (Рис. 2). Большая часть Р-поверхности равномерно покрыта ВМЧ.

Клетки эпителия скреплены между собой типичными соединительными комплексами, включающими контакты трех типов: ТшЬтТпжГконтакты, промежуточные контакты и десмосомы. Межклеточные контакты кишечного эпителия имеют характерную структуру, не отличающуюся от таковой,описанной в литературе, как на ультратонких срезах, гак и на репликах замораживания-скалывания (см. обзор Снигиревской, Комиссарчика, 1980).

Плотный контакт (гошНа осс1пс1сп5) опоясывает апикальные области клетки в виде сплошного нояса, отделяя межклеточное пространство эпителия ог просвета кишки. Мембраны соседних клеток в области контакта плотно приложат друг к другу, образуя пятислойную структуру: два внутренних электронноплогных слоя, два электроннопрозрачных и один средний электронноплотный слой, образованный слившимися экстрацеллюляриыми слоями соседних мембран. Общая ширина зоны плотного контакта около 15 им. На репликах сколов плазматической мембраны энтероцитов в области плотного контакта обнаруживаются гребни на Р-поверхности и соответствующие им впадины на Е-поверхности (Рис. 3). Гребни плотною контакта образуют разветвленную сеть, отделенную от апикальной мембраны одним непрерывным гребнем.

Рис 3. Схема ультраструктурнон и молекулярной организации плотного контакта. Внутрммембранные фибриллярные структуры (вфе) выявляются на Е-поверхности (EF) в виде желобков, а на l'-гюверхностн (PF) - в виде гребней. Микрофиламенты (МФ) связаны с цитоплазматнческон поверхностью контактирующих мембран.

Ниже плотного контакта располагается промежуточный контакт (zonula adhaerens), также опоясывающий клетку по всему периметру. Мембраны в области промежуточного контакта строго параллельны друг другу п расстояние между ними равно 14 нм; со стороны цитоплазмы к ним

МФ

примыкают электрошюилотные пластины. На Р-поверхности латеральной мембраны в зоне промежуточного контакта выявляются рыхло расположенные крупные ВМЧ (диаметр 16-17 им).

Входящие в соединительный комплекс 2-3 десмосомы (macula adhaerens), так же как и промежуточные контакты, характеризуются наличием электронноплогных пластин на цитоплазматической стороне соседних мембран. Кроме того, в межклеточном пространстве десмосомы обнаруживаются центральная элекгронноплотная пластина с отходящими от неё тонкими фибриллами. На сколотых Е- и Р-поверхностях латеральной мембраны десмосомы выявляются как округлые скопления крупных ВМЧ. Латеральные мембраны эпителиальных клеток тонкой кишки идут строго параллельно друг другу на расстоянии 15-18 нм, образуя в базальпой части эпителия многочисленные ипгердигитации. На репликах в них выявялется обычное распределение ВМЧ: много частиц на Р-поверхностн и мало па Е- поверхности.

3.1.4. Структурные изменения плаз,■магическом мембраны эптероцптов при всасывании нутриентов

При нагрузке изолированной петли тонкой кишки крысы липидом триолеином не удалось выявить каких-либо изменений в структуре апикальной мембраны и специализированных межклеточных контактов энтероцитов. Распределение иммунной метки к актину в пределах апикальной области энтероцитов и вблизи соединительного комплекса при всасывании триолеина практически пе отличается от соответствующих участков контрольных объектов.

При нагрузке кишки глюкозой в ультраструктурной организации апикальной мембраны энтероцитов наблюдаются некоторые изменения. При всасывании глюкозы между микроворсинками появляются участки мембраны, лишенные ВМЧ, тогда как на мембранах оснований микроворсинок выявляется большое количество плотно упакованных частиц (Рис. 2). Таким образом, происходит перемещение ВМЧ в пределах апикальной мембраны, отражающее, по-видимому, функциональное состояние белков мембраны. Изменений в ультраструктуре плотного контакта в этих условиях не выявляется. Лишь при высоких концентрациях глюкозы (40-75 мМ) на ультрагонкнх срезах в области плотного контакта в очень редких случаях (1%) наблюдалось нарушение структуры контакта, выражающееся н появлении блистеров. Ниже соединительного комплекса в межклеточном пространстве при всасывании глюкозы появляются лакунообразные расширения, но перераспределения ВМЧ в латеральных мембранах не происходит (Рис.4).

3.1.5. Особенное in структуры аппарата Гольджп энтсрошггов в контроле н при нсасынаннн глюкозы

Рпс. 4 Схематическое изображение изменений ультраструктуры всасывающих клеток тонкой кишки крысы при всасывании глюкозы. А - Энгероциты голодной крысы (контроль) Апикальная поверхность клеток покрыта многочисленными, регулярно расположенными мнкроворсинкамм (MB) Узкое на всем протяжении межклеточное пространство в базальпой части эпителия имеет извилистые контуры. Микрофнламсигы располагаются в виде пучков в микроворспнках, вблизи плотного контакта (Г1ЛК), а также в составе терминального сплетения (ТС), локализованного на уровне промежуточных контактов (ПРК). Ниже промежуточных контактов выявляются десмосомы (Д). Аппарат Гольджп состоит из 4-5 параллельных цистерн, часю слегка набухших 1> - При нагрузке тонкой кишки глюкозой межклеточное пространство ниже зоны соединительного комплекса разбухает, тогда как контакты остаются ннтактными При использовании высоких концентраций глюкозы появляются сгущения актиновы.х филаментов в области плотных контактов и между корневыми нитями Цистерны аппарата Гольджп набухают.

Цитоплазма энгероцитов заполнена большим количеством митохондрий, каналов шероховатого эндоплазматического ретикушома, рибосом и полисом. Некоторые клетки содержат большое количество липидных включении. Комплекс Гольджи, выявляемый над ядром, состоит

из стопки 5-6 параллельных цистерн, обычно сильно изогнутых таким образом, что транс-поверхность находится в вогнутой части. С

цистернами связано большое количество гладких и окаймленных пузырьков. Конденсированные вакуоли и продукты секреции аппарата Гольджи находятся внутри чаши, образованной цистернами. Ближе к апикальной поверхности энтероцитов обнаруживаются лизосомы и вторичные лизосомы. Следует отметить, что клетки, находящиеся в хроническом опыте, содержат несколько большее количество вторичных лизосом по сравнению с клетками из острого опыта. Для некоторых энтероцитов контрольных участков кишки характерно наличие набухших цистерн аппарата Гольджи, в особенности цис-цистерн.

Но особенно сильное набухание цистерн аппарата Гольджи наблюдается в условиях нагрузки петель кишки глюкозой и раствором Рингера, содержащим маниит, тогда как митохондрии и цистерны эндоплазматического ретикулюма выглядят так же как и в контроле. Возможно, это связано именно с тем, что энтероциты всасывают не только глюкозу и ионы, содержащиеся в растворе Рингера, но и воду, которая также транспортируется через стенку кишки. Можно предположить, что аппарат Гольджи сегрегирует из цитоплазмы излишки воды, спасая клетку от обводнения и выполняя тем самым функцию внутриклеточной осморегуляции.

3.1.6. Анализ распределении Г-актнна в апикальной области энтероцитов

Отдельного рассмотрения требует ультраструктура цитоскелета энтероцитов, который представлен немногочисленными микротрубочками и очень большим количеством промежуточных и актиновых филаментов. Промежуточные филаменты с диаметром 10 им связаны с промежуточными контактами и десмосомами и собраны в пучки на уровне этих контактов, часто простирающиеся в цитоплазму вплоть до ядра. Иммуноцитохимическое исследование промежуточных филаментов продемонстрировало их кератнповую природу, тогда как виментин в них обнаружен не был. Между зонами промежуточных контактов промежуточные и актиновые филаменты образуют непрерывную сеть, терминальное сплетение, отделяющее апикальную примембранную зону клетки от остальной цитоплазмы. Для этой зоны характерно отсутствие каких-либо оргаиелл, за исключением корневых нитей микроворсинок, представляющих собой пучки микрофиламентов. В этой области выявляются также отдельные микрофиламенты и тонкие филаменты (3-4 нм), возможно, представляющие собой актин-связывающие белки. Отдельные микротрубочки и микрофиламенты встречаются в остальной части цитоплазмы. При идентификации актина с помощью антител, конъюгпровапных с коллоидным золотом, метка выявляется на всем

протяжении пучка микрофнламснтов, проходящих в микроворсинках от их верхушек до конца корневых нитей, в терминальном сплетении и в базолагеральных выростах клеток. В контроле метка практически не обнаруживается в области десмосом и достаточно редко вблизи плотного и промежуточного контактов.

Распределение описанных цитоскелегных элементов в энтероцитах

крыс, -использованных—в-услоииях-различных-диет,-в-основном-было-

сходным, за исключением тех случаев, когда использовались высокие концентрации глюкозы. При введении в петлю 40 мМ глюкозы в энтероцитах появляются сгущения актинов их филаментов вблизи плотного контакта н в терминальном сплетении. Однако признаки дезорганизации самого плотного контакта практически отсутствовали (лишь в 1% исследованных памп случаев мы наблюдали блистеры в зоне плотных контактов), тогда как базолагеральные межклеточные пространства оказывались разбухшими. Нам не удалось повторить результаты Паппешеймера с соавт. (1987) по интенсивному раскрытию плотного контакта в этих условиях.

При пммупоцнтохимическом исследовании в условиях всасывания глюкозы плотность распределения анти-актиновой метки увеличивается по сравнению с контролем в области терминального сплетения, между корневыми нитями и вблизи плотного контакта. 3.1.7. Заключение

Исследование особенностей ультраструктуры двух проницаемых эпителиев: желчные капилляры печени и тонкая кишка крыс продемонстрировало барьерные свойства плотного контакта, запечатывающего межклеточное пространство. Эта функция плотного контакта определяется особенностями его структурной организации: наружные слои мембран двух соседних клеток в зоне контакта сливаются, образуя плотное соединение клеток с помощью длинных разветвленных фибрилл, залитых в мембранный матрикс. Интегральный белок плотного контакта обладает адгезионными свойствами, а также свойствами селективной норы (СитЫпег, 1995). Кроме того, в состав плотного контакта входит несколько периферических белков, участвующих в его сборке и поддержании клеточной полярности : 20-1, 20-2, цингулин (см. Сш е1 а1., 1991). В настоящее время эти белки идентифицированы, клонированы и секвенированы.

На электронномикроскопическом уровне барьерная роль плотного контакта в нормальной печени была выявлена нами с помощью электропноплотпой метки, хлористого лантана, который, заполняя межклеточное пространство между гепатоцнтами, никогда не проникает в желчный капилляр. При перфузии печени бескальциевыми растворами, вымывающими кальций и поверхностные мембранные протеиды,

целостность плотною контакта нарушается и лантан проникает в желчный капилляр.

Следует отметить, что наблюдаемые в настоящей работе изменения структуры проницаемых лппелиев, вызванные физиологическими нагрузками, существенно отличаются от изменений, являющихся результатом экспериментальных воздействий. По-видимому, такие обработки, как вымывание кальция и поверхностных мембранных протеидов, приводящие к раскрытию плотных контактов гепатоцитов, являются повреждающими п ни в коей мере не могут моделировать естественные процессы модуляции проницаемости эгштелиев, хотя и свидетельствую! о динамичности структуры и функции плотного контакта.

Используя физиологические нагрузки тонкой кишки крысы гидрофильными питательными веществами, мы получили ряд доказательств трасиеллюлярного переноса этих веществ всасывающими клетками. Как известно, одним из барьеров проницаемости эпителиев является апикальная мембрана клеток. В настоящей работе впервые были получены результаты о перераспределении интегральных белков апикальной мембраны энтсроцитов при нагрузке тонкой кишки крысы глюкозой, а именно, о концентрировании ВМЧ в областях микроворсинок. Можно думать, что перераспределение ВМЧ вызвано трансмембранным переносом этого моносахарида.

Преимущественно траисцеллюлярный транспорт глюкозы энтероцнтами подтверждается и данными по отсутствию изменений структуры плотных контактов в эпителии при нагрузке кишки глюкозой. Таким образом, полученные в настоящей работе данные опровергают популярную в последние годы точку зрения о том, что плотные контакты проницаемого эпителия топкой кишки млекопитающих могут легко перестраиваться при функциональных нагрузках, становясь высоконропицаемыми для воды, ионов и неэлектролитов (Madara, Pappenheimer, 1989; Pappenheimer, 1990, 1993). Возможно, появление блистеров в зоне плотного контакт кишки, наблюдаемое в работах Паппенгеймера и соавт., может быть связано с отличающимся от используемого в нашей работе методического подхода, а именно, постановкой опытов на изолированных из организма участках кишки. По нашему мнению, наиболее адекватной методикой для изучения транспорта путриентов через эпителий является постановка экспериментов in situ, на перевязанных петлях кишки в острых или хронических условиях (Уголев и др., 1986). Вместе с тем, не исключено, что некоторый вклад в трансэпителиальпую проницаемость тонкой кишки для глюкозы вносит и парацеллюлярный путь. Косвенным доказательством этого является наблюдаемая при высоких концентрациях глюкозы конденсация актина вблизи плотного кон raiera, который, как известно, в значительной степени

стабилизирует структурную организацию этого межклеточного соединения (Hull, Slaelieliii, 1979).

Рис 5. Схематическое изображение путей транспорта глюкозы через эпителий тонкой кишки крысы. Глюкоза входит в клетки путем котранспорта с ионами натрия через

апикальную мембрану и, выходя из клеток с током изотонической жидкости,

расширяет межклеточное

пространство эпителия

(длинные стрелки). Короткими стрелками указан возможный незначительный вклад в транспорт глюкозы

иарацеллюлярного пути.

Характерной особенностью структуры эпителия, нагруженного глюкозой, является увеличение расстояния между клетками ниже плотного контакта (Рнс. 4). По-видимому, эти расширения межклеточных пространств могут быть вызваны повышением в них гидравлического давления в результате входа в них жидкости, транспортирующейся через клетки. Как полагают сторонники гипотезы локального осмоса (см. обзор Diamond, 1979), через плотные контакты могут пассивно по элекгро-химическому градиенту перемешаться ионы, вследствие чего в межклеточном пространстве создается небольшая гипертония, что, в свою очередь, приводит к выходу воды из клеток. Однако, как отмечает ряд физиологов (Sackin, Boulpaep, 1975; Boulpaep, 1979; Zeuliten, 1995) вряд ли можно объяснить индукцию транспорта воды против осмотического градиента через кишечный эпителий, обладающий довольно низкой водной проницаемостью, повышением копией грации ионов в межклеточном пространстве. К тому же, данные о наличии в эитероцитах водных каналов, которые обнаружены в последние годы в плазматических мембранах многих клеток и которые обеспечивают большие пассивные водные потоки, пока еще очень спорны. В связи с этим Цойтеп (Zeuliten, 1995) предлагает гипотезу вторично активного транспорта воды в проницаемых эпителиях. По мнению Цойгена, вода входит в клетки с помощью переносчика глюкозы и натрия, а выходит из клеток с переносчиком калия и хлора (Zeuliten, 1995; Loo et al., 1996). Принимая во внимание выводы Цойгена и полученные в настоящей работе данные об отсутствии существенных перестроек структуры

плотного контакта энтероцитов при поглощении ими глюкозы и изменении структуры их апикальной мембраны, логично предположить, что глюкоза, натрий и вода входят в энтероцигы посредством активного транспорта и, выходя из клеток в базолатеральные межклеточные пространства также посредством вторично активного транспорта, расширяют их (Рис. 5).

Одним из изменений, которые были выявлены в энтероцитах участков тонкой кишки, нагруженных глюкозой и раствором Рингера, а иногда и в энтероцитах контрольных участков кишки с помощью стандартных электронно-микроскопических методов, является набухание цистерн аппарата Гольджи, подобное тому, какое наблюдается при обводнении клеток, находящихся в условиях гипотонии. Такое изменение цистерн аппарата Гольджи, по-видимому, связано с тем, что транспортирующийся через энтероциты раствор Рингера, содержащий глюкозу, несколько гнпотоничен по отношению к их цитоплазме. И действительно, имеются данные о том, что цитоплазма клеток ряда проницаемых эпителеев несколько гипероосмотична по отношению к плазме крови, и если эпителий омывается гипотонической жидкостью, разность осмотического давления между средой и цитоплазмой энтероцитов может достигать 40 мМ/л ^еиЫеп, 1995). Предполагается, что Ыа,К -А'ГФаза и К -С1-переносчики базолатеральной мембраны осуществляют осмотическую регуляцию внутриклеточной среды ^еиЫеп, 1995). Однако, несмотря па такую осморегуляцию, наблюдаемые картины набухания цистерн аппарата Гольджи энтероцитов в условиях транспорта глюкозы через кишечный эпителий свидетельствуют о некотором обводнении цитоплазмы энтероцитов. Можно предположить, что аппарат Гольджи поглощает воду из цитоплазмы, спасая клетку ог излишнего обводнения и выполняя тем самым функцию внутриклеточной осморегуляции.

Итак, результаты настоящей работы, свидетельствующие об отсутствии существенных перестроек структуры плотного контакта, наличии изменений в структуре апикальной мембраны, а также набухании цистерн аппарата Гольджи энтероцитов в условиях нагрузки тонкой кишки глюкозой позволяют поддержать точку зрения о том, что доминирующим является транспорт глюкозы через клетку и, возможно, лишь незначительная её часть может транспортироваться парацеллюлярно. 3.2. Проницаемость плотного эпителия мочевого пузыри амфибии для воды

Плотные эпителии отличаются от проницаемых эгштелиев низкой ионной и водной проницаемостью. В связи с тем, что они могут поддерживать высокий осмотический и ионный градиент между внешней средой и интерстициалыюй жидкостью, наличие плотных эпителиев

характерно для органов, содержащих и своем просвете гипотоническую жидкость, в частности, для осморсгулирующих органов, проницаемость которых для воды и понов регулируется пептидными и стероидными гормонами. Вопрос о путях транспорта воды в плотных эпителиях дебатировался в течение многих десятилетий и лишь в 1974 г были получены данные, указывающие па преимущественно грансцеллюлярный

путь переноса воды (Chevaliei^cjjiL_1974)._В последние годы достигнут-

большой прогресс в исследовании молекулярных механизмов изменений мембранной проницаемости для воды, обнаружены и клонированы белки, формирующие водные каналы, аквапорины (Agre et al., 1993).

Одним из типичных плотных эпителиев, обладающих высоким электрическим сопротивлением, 20000 ом/см2, является эпителий мочевого пузыря лягушки, являющийся моделью собирательных трубок почки млекопитающих. Его осмотическая проницаемость регулируется антидиуретическим гормоном (АДГ), api инин-вазотоцином. В настоящее время довольно хорошо изучены биохимические и функциональные аспекты гидроосмотического эффекта АДГ на эпителии мочевого пузыря амфибий и собирательных трубок почки млекопитающих. Предполагается, что аргинин-вазопрессин (АДГ млекопитающих) связывается со специфическими рецепторами, локализованными в базо-латеральной мембране эпителиальных клеток, запуская каскад биохимических реакции, приводящих к изменению водной проницаемости апикальной плазматической мембраны. Согласно современным представлениям, имеется но крайней мере два тина рецепторов вазопресспна, обозначаемых Vi и V2 (Bourgiiet et al., 1989; Наточин и др., 1989).

Связывание вазопресспна с Угрецепторами опосредованно через Gs-белок приводит к активации адепилат-циклазы и синтезу ц-АМФ (Orloff, Handler, 1962). ц-АМФ зависимая протеинкиназа А катализирует процессы фосфорилирования белков, способствующих встраиванию водных каналов в апикальную мембрану. Установлено, что повышение проницаемости апикальной мембраны клеток для воды пропорционально доле рецепторов, связанных с вазонресснном, и количеству синтезированной цАМФ (Sonsa, Grosso, 1985). Участие Vi-рецепторов приводит к гидролизу полнфосфоинозитола до ниозитол-трифосфата и 1,2-диацилглицерина, к освобождению Са2+ из внутриклеточных запасов и к активации протеннкиназы С.

В качестве вторичных мессенджеров генерации ответа на воздействие гормона являются цАМФ и ионы Са2+ (Sonsa, 1985). Этот путь рассматривается как негативная модуляция сигнального пути, связанного с Vj-penemopaMH (Парнова, 1996). Как и в других тканях, в клетках

вазопрессин-чувстви 1ельиы.\ эшпелиев обнаружен внутриклеточный рецептор ионов Са"+ - белок кальмодулпн (Sonsa, 1985).

Однако, расшифровка механизмов стимуляции вазопрессином водного транспорта осложняется тем, что в регуляции этого процесса важную роль играют многие факторы, связанные с жизнедеятельностью эпителия: синтез иростатлапдинов в клетках, транспортирующих воду, концентрация ионов натрия в клетке и ионов калия в среде, омывающей серозную оболочку и др.

В настоящей работе охарактеризована структура межклеточных контактов, клеточных мембран и внутриклеточных органелл в условиях стимулированного вазопрессином транспорта воды, 3.2.1. Постапонка физиологического эксперимента

Исследования проводились на мочевом пузыре лягушки Rana temporaria. Удобство этого обьекта для экспериментальной работы объясняется рядом причин: I) выделенный мочевой пузырь сохраняет основные функции н удобен для параллельных структурно-химических и физиологических исследований, 2) водная проницаемость стенки пузыря регулируется атиднуретическим гормоном (АДГ), добавленным в омывающий раствор со стороны серозной оболочки; 3) большая часть поверхности слизистой оболочки эпителия пузыря занята апикальными мембранами гранулярных клеток (более 90%), ответственных за его водную проницаемость.

Опыты с изучением проницаемости для воды проводили на выделенных мочевых пузыря лягушки, помещенных в аэрируемый раствор Рингера (осмоляльность 220 моем на 1 кг Н2О). Просвет пузыря заполняли раствором Рингера или гипотоническим раствором Рингера, для чего стандартный раствор разводили дистилированной водой в 10 раз (осмоляльность 2,5 моем на I кт 1ЬО). Осмотическую проницаемость оценивали гравиметрическим методом по величине потока воды по осмотическому градиенту в направлении от слизистой к серозной оболочке (Наточин, Шахматова, 1968). Взвешивание проводили на электронных весах ВЛЭ-200. Величину потока воды рассчитывали в мкл/мин на 1 см2 поверхности мочевого пузыря.

Для стимуляции осмотической проницаемости пузыря использовали как традиционный способ обработки пузыря вазопрессином (10"2-10"3 Ед на 1 мл), так и метод, разработанный в процессе проведения настоящей работы - многократная смена раствора Рингера (4-5 смен по 15 мин) со стороны серозной оболочки (Наточин, Шахматова, 1995). Обработке подвергали одну из двух половинок пузыря, тогда как другая половина служила контролем для первой.

При инкубации изолированного мочевого пузыря в одном и том же растворе Рингера с аэрацией и непрерывном перемешиванием сохраняется

низкая осмошчсская проницаемость и способность многократно реагировать на вазопрссспн. Добавление АДГ к раствору Рингера, омывающему серозную поверхность стенки мочевого пузыря, значительно увеличивает его осмотическую проницаемость. В присутствии осмотического градиента при добавлении МО'3 мЕд/мл вазопрессина поток воды через пузырь может увеличиваться в течение 30 мин с 0,07±0,01

ло_1,7_1±0,29_мкл/(см^мин).—Вследствие-набухан ия-клеток-н-возможного-

увеличения обьема содержание воды в ткани возрастает с 3,8+0,14 до 4,99+0,22 кг воды на I кг сухого вещества. Эти изменения осмотической проницаемости обратимы.

При многократной смене раствора Рингера со стороны серозной оболочки через каждые 15 мин па идентичный свежий раствор в устойчивом режиме перемешивания и аэрации постепенно увеличивается проницаемость эпителия. Через 75 мин повышение потока воды сопоставимо по величине с действием 1нМ АДГ. Так как контрольная половина пузыря, находящаяся в одном и том же растворе Рингера, не обнаруживает повышения водного потока через её эпителий, можно предположить, что причиной возрастания проницаемости опытной доли является удаление какого-то регуляторного фактора, поступающего из клеток пузыря в раствор Рингера у серозной оболочки. 3.2.2. Особенности структурной организации мембран с низкой водной проницаемостью

Характерной особенностью клеток плотных эпителиев является крайне низкая водная проницаемость их апикальных (^номинальных) мембран. Па ультра гонких срезах апикальная мембрана эпителиальных клеток мочевого пузыря лягушки обнаруживает типичную для всех мембран трехслойную структуру с более толстым наружным слоем, покрытым гликокаликсом. Толщина мембраны составляет 9-10 им, толщина гликокалнкса - 30-40 нм. Особенно сильного развития гликокаликс достигает па мпкровореннках, отходя от их верхушек в виде длинных радиальных нитей.

Использование для изучения структуры апикальной мембраны плотных эпителиев метода замораживания-скалывания позволило установить корреляцию между ультраструктурной организацией этой мембраны и её водной проницаемостью. Оказалось, что для гранулярных и "мнтохондриальпых" клеток мочевого пузыря характерно

инвертированное по сравнению с остальными типами клеток распределение ВМЧ на Р- и Е-новерхпостях сколов апикальной мембраны, т.е. много ВМЧ на Е-повсрхиости (616+77 на 1мкм2) и мало - на Р-поверхносги (302±39 на 1 мкм2). При исходно низкой водной проницаемости ВМЧ распределены относительно равномерно по

поверхностям сколов апикальной мембраны и не образуют четко выраженных агрегатов (Рис. 6). Вместе с тем следует подчеркнуть, что в разных клетках одного и того же эпителия количество ВМЧ существенно варьирует, что свидетельствует, по-видимому, о разном функциональном состоянии клеток.

Рис. 6. Участки апикальной мембраны гранулярных клеток мочевого пузыря лягушки на сколах (замораживание-скалывание). А - Р-поверхность с небольшим количеством мелких ВМЧ. Внизу видны гребни плотного контакта. Б - Е-поверхность, покрытая крупными ВМЧ. МВ - сколотые микроворсинки.

В гранулярных клетках различаются не только количество ВМЧ на Р-и Е-поверхностях сколов апикальной мембраны, но и размеры частиц: на Р-поверхности средний диаметр ВМЧ меньше (14,5 нм), чем на Е-поверхности (17 нм).

Плотный коптакг, имеющий па ультратонких срезах типичную пяти-слойную структуру, сплошным поясом опоясывает апикальные области клеток, отделяя межклеточное пространство пузыря от его просвета. На репликах, полученных методом замораживания-скалывания, выявляется широкая зона плотного контакта, состоящая из 8-9 анастомозирующих, непрерывных гребней на Р-поверхности латеральной мембраны и комплементарных нм бороздок на Е-поверхности (Рис. 6). 3.2.3. Динамика нзмененмП структуры апикальной мембраны клеток

плотных эннтелпев мри действии АДГ н многократном смены раствора Рмпгера

При элекгронно-микроскопическом исследовании апикальных мембран клеток мочевого пузыря лягушки в условиях осмотического

потока, стимулиропанпого ЛДГ или сменой раствора Рингера, было установлено, что в этих условиях структура апикальных мембран существенно изменяется, тогда как плотные контакты остаются без видимых изменений. Па Р-поверхности сколов апикальной мембраны гранулярных клеток обнаруживаются агрегаты крупных ВМЧ, а на комплементарной Е-поверхности - соответствующие им участки, содержащие бороздки и несколько крупных частиц (Рис. 7). Форма агрегатов может быть самой различной: округлой, звездчатой, кольцевидной, прямоугольной и т.д. Форма и размеры частиц, собранных в агрегаты, резко отличаются от ВМЧ, распределенных по остальной части Р-поверхности мембраны: они более крупные и имеют неправильную форму. Часто агрегаты располагаются вблизи мест слияния мембран гранул с апикальной мембраной. Интересно, что в соседних гранулярных клетках количество агрегатов ВМЧ существенно варьирует. Возможно, этот факт отражает разную реактивность клеток в отношении гормона, обусловленную их различным функциональным состоянием в момент его воздействия. Однако, в среднем доля площади мембраны, занятая агрегатами ВМЧ, зависит ог степени водной проницаемости эпителия. Наличие связи между площадью, занятой агрегатами, и величиной водного потока была обнаружена при изучении ингибирующего влияния ионов Со2+ на стимулируемый АДГ водный транспорт. Оказалось, что при больших водных потоках (1.56+0,16 мклсм"2мин"') относительная площадь апикальной мембраны, занимаемая агрегатами, составляет 1,8%, в то время как при их ингибировании ионами кобальта ( 0,44±0,02 мкл см"2-мин"') эта площадь равна лишь 0,3%.

Рис. 7. Комплементарные сколы апикальной мембраны гранулярных клеток при стимуляции трансмембранного транспорта воды. А - агрегаты крупных ВМЧ на Р-поверхности; Б - соответствующие им гладкие участки Е-поверхности, содержащие отдельные крупные ВМЧ и бороздки.

О том, чго выявляемые в апикальных мембранах клеток вазопрессин-чувствительных эпителиев агрегаты ВМЧ не являются следствием водного потока через другие участки мембраны, а служат для трансмембранного переноса воды, свидетельствуют данные об их наличии в апикальных мембранах эпителиальных клеток пузырей, обработанных АДГ в отсутствие осмотического градиента. В присутствии осмотического градиента наличие функционирующих водных каналов может обеспечить очень высокую водную проницаемое!ь эпителиального слоя.

Проблема происхождения агрегатов ВМЧ в АДГ-чувствительных эпителиях представляется очень важной для понимания механизмов стимуляции высокой водной трансмембранной проницаемости. Существуют досгаючно убеди юльные данные, как морфологические, так и биохимические, которые укал.тают на существование обмена доменами, обладающими высокой водной проницаемостью, между внутриклеточными и апикальными мембранами. Однако, если участки высокой водной проницаемости хорошо идентифицируются в электронном микроскопе (агрегаты ВМЧ), то идентификация аналогичных участков на мембранах клеточныз органелл чрезвычайно затруднена. Тубулярные структуры («агрефоры»), мембраны которых иногда содержат определенным образом организованные ВМЧ н которые ряд исследователей считает предшественниками высокопроницаемых участков апикальной мембраны, обнаруживаются крайне редко как в условиях исходно низкой, так и стимулированной АДГ водной проницаемости. Другой причиной, в силу которой участие л их структур в возникновении участков высокой водной проницаемости апкалыюй мембраны нельзя считать доказанным, является то, что что сплавление этих органелл с апикальными мембранами практически нельзя оишчить от сплавления с ней специфических гранул. Расположение агрегатов ВМЧ вблизи мест слияния мембран специфических гранул с апикальной мембраной и миграция гранул к апикальной мембране при действии АДГ, выявляемая на ультратонких срезах, свидетельствуют об участии гранул в формировании доменов апикальной мембраны с высокой водной проницаемостью. Таким образом, полученные нами данные прошворечат широко распространенному мнению о том, что пеючпнкамн агрегатов служат специфические мембранные канальцы, агрефоры, сливающиеся с апикальной мембраной при стимуляции водного транспорта.

Особый интерес представляют данные о том, что не только АДГ, но и многократная смена раствора Рингера со стороны серозной оболочки мочевого пузыря может стимулировать значительную осмотическую проницаемость эшпелия, сопровождающуюся формированием агрегатов ВМЧ в апикальной мембране По-видимому, при смене раствора Рингера

из эпителия вымываются какие-то физиологически активные вещества лииндноП природы, аутакопды, которые в нормальных условиях стабилизируют его структуру и обеспечивают низкий уровень осмотической проницаемости. Добавление 5 мкл раствора арахидоновой кислоты в смеси меганол-гексан (5:1) в конечной концентрации 7 мкМ приводило к резкому снижению уровня потока воды. Эти данные нозволяют иредноложип., что-функшио-стабилизации его-низкой водной-проницаемости могут выполнять в плот ном эпителии регуляторные липиды (арахидоновая кислота или продукты её метаболического превращения). 3.2.4. Состояние иакуолирноп системы клеток, участвующей в стимулируемом АДГ трапепорю воды

Наряду с изменениями апикальной мембраны стимуляция вазопресспном осмотических поюков воды вызывает заметные изменения и в других компартмеитах клеток эпителия мочевого пузыря лягушки. Гранулярные клетки набухают, их апикальные области выпячиваются в просвет, микроворсинки становятся менее четко выраженными. Межклеточные пространства в базо-латералыюй части эпителия разбухают (Рис. 8).

Некоторым изменениям подвергаются и внутриклеточные структуры, из которых наиболее существенными, по нашему мнению, являются перестройки элементов вакуолярной системы и цитоскелета, впервые обнаруженные в настоящей работе.

Для гранулярных клеток мочевого пузыря лягушки характерен хорошо развитый аппарат Гольджи, состоящий из параллельных уплощенных цистерн, вблизи которых локализуются его дериваты. Наряду с лизосомами к ним относятся гладкие и окаймленные мелкие пузырьки, тубулярпые мембранные структуры диаметром 30-40 нм, названные нами электронно-плотными канальцами, а также многочисленные специфические гранулы овальной или округлой формы с диаметром 30 нм -1 мкм. Последние распределены по всей цитоплазме, за исключением базальных областей клеток, и имеют разнообразную внутреннюю структуру: от гомогенной до кристаллической. Часто с гранулами связаны актиновые и промежуточные филаменты.

Анализ ультраструктуры аппарата Гольджи гранулярных клеток, находящихся в разном функциональном состоянии, указывает на высокую реактивность этой оргапеллы на гидроосмотическое действие АДГ. На основании наблюдаемых картин можно представить себе следующую динамику изменений аппарат Гольджи при стимуляции водного потока АДГ (Рис. 8, 18).

Рис 8 Схематическое изображение изменений структуры гранулярных клеток при стимуляции трансэпигелиалыюго транспорта воды ЛДГ или вымыванием аутакоидов. А- гранулярные клетки при исходно низкой водной проницаемости (контроль). Апикальная поверхность образует небольшие мнкропорсинки (МВ), межклеточное пространство узкое, и апикальной области эпителия клетки скреплены соединительным комплексом, состоящим их плотного контакта (ПЛК), промежуточного контакта (ПРК) н десмосом (Д). Клетки содержат хорошо развитый аппарат Гольджи (АГ) и располагающиеся вблизи него многочисленные специфические гранулы (ГР) Под апикальной мембраной располагается слой кортикальных актиновых филаментов (МФ - микрофиламенты). Б - гранулярные клетки в условиях сильных водных потоков через эпТттелий. Цитоплазма клеток просветляется, специфические гранулы мигрируют к апикальной поверхности, в области аппарата Гольджи появляются крупные вакуоли, межклеточное пространство в базалыюн части эпителия разбухает, специализированные межклеточные контакты не изменяются.

При исходно низкой волной проницаемости стенки мочевого пузыря аппарат Гольджи гранулярных клеток представляет собой, как упоминалось выше, хорошо развитый комплекс, состоящий из уплощенных параллельных цистерн, тубул, пузырьков, конденсированных вакуолей и специфических гранул (структура, подобная описанной в литературе для секреторных клеток). При кратковременном действии АДГ (5 мин), вызывающем незначительный осмотический поток воды, происходит фрагментация комплекса Гольджи на отдельные стопки цистерн, диктносомы. Возможно, что обособление и транслокация диктиосом в клетке происходит при участии микротрубочек, количество которых при

действии ЛДГ увеличивается но мною раз. После 5-минутного действия АДГ на мочевой пузырь чаем, цистерн аппарата Гольджп слегка набухает, тогда как заменю!о расширения базо-латеральных межклеточных щелей, характерного для стадии максимального эффекта АДГ (20 мин), ещё нет. При максимальном водном моюке (через 20-25 мин) специфические гранулы перемещаю! ся к апикальной мембране и в цитоплазме

Л!Оявл_яются_кру1П1ыезакуолт.!,^'^оз^ _

Гольджп: цистерны, мелкие гладкие и окаймленные пузырьки, электронно-плотные канальцы, а также элементы ниюскелета: микротрубочки и микрофиламешы (Рис. 9). Эги данные, а также аналогичное распределение ВМЧ в мембранах вакуолей и в цис-цистернах аппарата Гольджп указывают на то, что эти вакуоли формируются из цис-цистерн аппарата Гольджп. Наблюдаемые карпшы набухания цистерн аппарата Гольджп "в о Mie г на действие АДГ демонстрируют его участие во внутриклеючной осморегуляции во время возросшей во много раз водной проницаемости эшмелня. Такая ишсрпрстация полученных данных объясняет oicyiciBiie повреждения клешк в условиях сильной гипотонии.

Появление крупных вакуолей только в условиях сильных водных покжов в iipiicyiciiîiin осмотического градиента, по-видимому, указывает на их участие в транспорте воды через клетки (иногда можно наблюдать картины подхода вакуолей к базолатеральной мембране гранулярных клеток). Это предположение подтверждается опытами по набуханию эпителиальных клеток со стороны серозы. При погружении мочевых пузырей лягушек в гипотонический раствор Рингера обнаруживалось увеличение объема всех типов клеток. При этом в цитоплазме гранулярных клеток описанные выше крупные вакуоли с характерными примембраннымн структурами не обнаруживались никогда, но наблюдались многочисленные мелкие вакуоли, не связанные с элементами ни юскелета и характерные для обводненных клеток.

Исследование ультраструктурных особенностей крупных вакуолей гранулярных клеюк, а именно, связь с мембраной вакуоли элскт ронпоплом1ых канальцев и мик-poi рубочек, указывает на их морфологическое сходство с сократительными вакуолями некоторых простейших, в частности l'ammcaum, изучавшейся в настоящей работе. Наличие гппоюнпчсско!о содержимого в вакуолях гранулярных клеток, подобно тому, чю имеет место в сократигельных вакуолях простейших, было продемонстрировано памп с помощью рснтгено-спектральпого анализа. lia стимулированных АДГ мочевых пузырях лягушки было показано резкое падение содержания в вакуолях ионов калия. При этом концентрация К'1 и цитоплазме фннулярных клеток не отличается от таковой других клеюк и равна 110-120 мМ.

ч *) ^ *

¿¿т

4 • Л

-А» "¿л

-0.25 Ц

Рис. 9. При стимуляции больших водных потоков через эпителий мочевого пузыря лягушки в гранулярных клетках появляются крупные вакуоли, располагающиеся в области аппарата Гольджи.

Наряду с появлением крупных вакуолей в цитоплазме гранулярных клеток при воздействии АДГ происходит изменение локализации специфических гранул. Наиболее четко миграция гранул к апикальной мембране выражена в отсутствие осмотического градиента. При использовании метода замораживания-замещения часто наблюдаются картины слияния мембран гранул с апикальной мембраной, тогда как при использовании стандартных методов электронной микроскопии этот, по-видимому, быстрый процесс выявить удается крайне редко. Перед полным слиянием мембран гранул с апикальной мембраной целостность мембран гранул нарушается и в таких гранулах выявляются тубулярные структуры с диаметром 35-40 им. В большинстве случаев гранулы, мембраны которых сливаются с апикальной мембраной, обладают содержимым с низкой электронно-оптической плотностью. Содержимое этих гранул как бы растворяется в цитоплазме, не экзоиитируясь в экстрацеллюлярное пространство.

3.2.5. Участие цптоскелета во внутриклеточном транспорте воды

В последние годы большое внимание при анализе механизмов стимулируемого АДГ водного транспорта было уделено участию цигоскелетных элементов клеток: микротрубочек и микрофиламентов. В ряде работ было показано, что апикальная плазматическая мембрана клеток плотных эпителиев является не единственным барьером для

стимулируемых осмотических потоков. В качестве второго

постлюмпнальиот барьера рассматривается сеть цитоскелетных элементов (мпкрофиламентов и актин-связывающих белков) в апикальной цитоплазме клетки. Воздействие вазопрессина приводит, по мнению ряда исследователей, к увеличению проницаемости также и этого второго барьера (Kachadorian, 1979).

_Результагы_настряmero электронно-микроскопического исследования

продемонстрировали существенную роль элементов цитоскелета гранулярных клеток мочевого пузыря лягушки в ответе на гидроосмотическое действие АДЕ гж"тт

Рис. 10. Пучок «толстых» мпкротрубочек транспортирующих воду.

цитоплазме гранулярных клеток,

При сравнении ультраструктуры эпителиев с исходно низкой и стимулируемой АДГ водной проницаемостью получены прямые данные, указывающие на возрастание количества микротрубочек во много раз. Причем, в условиях стимулированных водных потоков выявляется две популяции микротрубочек: с диаметром 20-24 нм, как в контрольных пузырях, и с большим диаметром, 35-40 нм. Последние очень лабильны и обнаруживаются лишь при щадящих методах фиксации (отсутствие осмиевой постфиксацип, замораживание-замещение) (Рис. 10). При больших увеличениях электронного микроскопа на поперечных срезах микротрубочек обнаруживается их субъединичное строение. Однако, в отличие от обычных микротрубочек стенка "толстых" микротрубочек состоит не из 9, а из 15-17 субъединиц, размером 7,5 нм. Часть этих толстых микротрубочек имеет на своей поверхности регулярно располагающиеся осмиофильные глобулы (21-23 нм) представляющие собой, по-видимому, белки, ассоциированные с микротрубочками (МАРб). Возможно, они выполняют транспортную функцию, тогда как обычные стабильные микротрубочки, выявляющиеся в опыте и в контроле, являются опорными. Не исключено, что связь микротрубочек с вакуолярной мембраной при больших водных потоках способствует их миграции по

цитоплазме. Тубулиновая природа толстых микротрубочек подтверждается электрон номикроскопи чески ми иммуиоцигохимическими методами. Поликлоиальныс антитела к тубулниу метят как микротрубочки, свободно расположенные в цитоплазме, так и микртрубочки, содержащиеся внутри специфических гранул. Кроме того, метка встречается на кристаллическом содержимом гранул, что указывает на присутствие в нем тубулинового эпитопа. Возможно, это - кристаллическая форма мономерного тубулина, запасаемого гранулами.

Важную роль в стимулированном АДГ транспорте воды через клетки плотных эпитслисв наряду с мпкрофубочками играют также микрофиламенты.

При иммунопигохимическом изучении гранулярных клеток в электронном и конфокальном микроскопах было обнаружено уменьшение плотности анти-актнповон метки в кортикальной области цитоплазмы при стимуляции водных потоков как обработкой АДГ, так и вымыванием аутакопдов. Вместе с тем, в остальных частях клеток они по-прежнему многочисленны и четко выявляются в обводненной цитоплазме. В присутствии крупных вакуолей, принимающих, по нашему мнению, участие в переносе воды через клетку, обнаруживается связь микрофиламентов с ограничивающими их мембранами. На некоторых микрофотографиях можно видеть заякориванне микрофиламентов в мембранах вакуолей. Наличие ионов кальция в цитоплазме вблизи вакуоли, продемонстрированное нами с помощью пироантимонатного метода, может, по-видимому, обеспечить сократительную функцию актиновых фнламентов, участвующих вместе с микротрубочками в миграции вакуолей по цитоплазме.Эти результаты указывают на гетерогенность пула актиновых филамеитов I! клетке и участие примембранного актинового цитоскелега в регуляции водной проницаемости. Возможно, что деполимеризация кортикального актина облегчает подход гранул к поверхности п слиянию их мембран с апикальной мембраной.

Следует отметить, что картины изменения цитоскелета и миграции гранул к апикальной поверхности при действии АДГ наиболее ярко выражены в условиях равенства осмотических концентраций по обеим сторонам стенки мочевого пузыря (стандартный раствор Рингера со стороны слизистой и серозной оболочек). 3.2.6. Заключение

Полученные результаты показали, что при использовании разных способов стимуляции транспорта воды через стенку мочевого пузыря лягушки происходят сходные изменения ультраструктуры гранулярных клеток эпителия. До последнего времени считалось, что стимуляция транспорта воды через плотный осморегулируютций эпителий может быть вызвана лишь добавлением к серозной оболочке АДГ или ц-АМФ,

участвующей в осуществлении эффекта АДГ Другие способы увеличения проницаемости для воды осморегулирующих эпителиев были неизвестны. В настоящей работе впервые было показано, что увеличение осмотической проницаемости эпителия мочевого пузыря лягушки возможно при неоднократной смене раствора Гпнгера у серозной оболочки в отсутствие АДГ. По-видимому, при этом из клеток вымываются какие-то

физиологически_активные_вещества_(аутакоиды),_стабилизирующие_

эпителий и обеспечивающие низкий уровень его осмотической проницаемости. Их удаление приводит к повышению проницаемости эпителия для воды. Полученные данные указывают на то, что в регуляции водной проницаемости участвуют арахидоновая кислота или продукты ее метаболизма - простаглапдины. Важным фактом является то, что при вымывании аутакопдов обнаружены тс же молекулярные механизмы, что и при действии АДГ: активация аденилат-цпклазы и накопление ц-АМФ (Парнова, 1996).

Обнаруженные при обоих способах стимуляции транспорта воды изменения структурной организации таких клеточных органелл, как апикальная мембрана, примембранный актиновый цитоскелет, микротрубочки, вакуолярная система свидетельствуют о наличии трансцеллюлярного переноса воды из просвета мочевого пузыря в кровь через гранулярные клетки.

При исходно низкой водной проницаемости для клеток плотного эпителия характерны следующие ультраструктурные особенности: инвертированное распределение ВМЧ на сколотых поверхностях апикальной мембраны гранулярных клеток (большое количество ВМЧ на Е-поверхности и малое - на Р); широкая зона плотного контакта, состоящая из 8-9 гребней; хорошо развитый аппарат Гольджи, большое количество специфических гранул со структурированным содержимым, распределенных гго всей цитоплазме.

11апболее убедительными данными в пользу трансцеллюлярного пути транспорта воды являются данные но изменению ультраструктурной организации апикальной мембраны гранулярных клеток при увеличении её водной проницаемости. Обнаруженное в настоящей работе наличие корреляции между площадью, занятой агрегатами ВМЧ, и величиной водного потока подтверждает гипотезу Шевалье и соавт. (1974) о том, что агрегаты ВМЧ, возникающие в апикальной мембране при действии АДГ, являются участками мембраны, обладающими высокой водной проницаемостью. Согласно полученным в настоящей работе данным, источниками высокопропицаемых для воды участ ков апикальной мембраны служат мембраны специфических гранул, формирующихся в аппарате Гольджи (Рис. II). Этт вывод не согласуется с распространенным в литературе мнением, что водные Каналы встраиваются в апикальную

мембрану с помощью специфических мембранных структур - агрефоров (Müller, Kachadorian, 1980; Wade, 1980). Паши результаты указывают на то, что в условиях наибольшей водной проницаемости эпителия, стимулированной АДГ или удалением аутакопдов, вблизи апикальной мембраны обнаруживается наибольшее количество специфических гранул, причем многие из их мембран сливаются с апикальной мембраной клетки, не выбрасывая своего содержимого во внеклеточное пространство (отсутствие нормального экзоцитоза). При этом в цитоплазму, по-видимому, выходит ряд веществ, депонируемых в гранулах, необходимых как для слияния гранул, так п для реализации ответа клетки на гормон. В частности, такими веществами могут быть тубулин и кальций, аккумулируемый гранулами (Шахматова т др., 1982). Как известно, ионы Са2+ необходимы для реализации клеточного ответа на гормон.

Рис. I I. Схематическое изображение возможного участия аппарата Гольджи в пщроосмотнчсском ответе фанулярныч клеток. В ответ на воздействие АДГ специфические гранулы (ГР), формирующиеся в аппарате Гольджи, мигрируют к апикальной клеточной поверхности п их мембраны сливаются с апикальной мембраной, встраивая в нее водные каналы (ВК) Часть специфических гранул содержит кристаллическое содержимое, вступающее в реакню с антителами к тубулину. При выходе из гранул Са2' (прерывистые стрелки) происходит иолпмсрпзцпя микротрубочек (МТ), выход их из гранул и ассоциация с ними МАР'э и деполимеризация актпнового цнтоскелета (МФ). Вода, вошедшая в цитоплазму клетки (сплошные стрелки), сегрегируется цнс-цистернами аппарата Гольджи, мембраны которых связаны с микротрубочкамп н мпкрофпламентами. Выходя в латеральные межклеточные пространства, вода расширяет их.

Для решения проблемы трансмембранного переноса воды в плотных эпптелпях очень важен факт обнаружения в последние годы специализированных белков, аквапоринов, которым приписывается функция водных каналов (Ayre et al., 1993; Nielsen et al., 1993). Определение локализации акваиоринов в гранулярных клетках мочевого пузыря лягушки па электронномикросконическом уровне является одной

из первоочередных задач пашей работы в будущем.---

Обнаруженные в работе изменения вакуолярного аппарата гранулярных клеток также являются важным свидетельством трансцеллюлярного транспорта воды, стимулируемого АДГ. Полученные данные дают возможность предположить, что крупные вакуоли, возникающие при усиленных водных потоках через эпителий, принимают участие в транспорте гипотонической жидкости от апикальной к базолатеральной поверхности клетки. Факты локализации вакуолей вблизи везикулярных элементов аппарата Гольджи и сходного распределения ВМЧ на их мембранах и мембранах цис-цистерн Гольджи дают нам право считать эти вакуоли дериватами аппарата Гольджи (Рис. 9, 11). Почти полное отсутствие в литературе подобных результатов в отношении осморегулируюших эпителпев объясняется, по-видимому, использованием лишь стандартных электронно-микроскопических методов исследования, тогда как вакуоли могут быть выявлены только при щадящих методах фиксации.

Обнаружение '"сократительных" вакуолей в гранулярных клетках мочевого пузыря лягушки в условиях повышенного транспорта воды свидетельствует о более широком распространении этой структуры, чем предполагали до спх пор. Присутствие сократительных вакуолей отмечалось лишь в клетках низших организмов, не обладающих осморегулирующими органами: у пресноводных простейших и губок, а также у водорослей на тех стадиях жизненного цикла, когда клетки лишены оболочек. В связи с тем, что эти организмы обитают в пресной воде, для них существует опасность гипотонического шока, которую они избегают с помощью сократительной вакуоли, являющейся одним из регуляторов клеточного объема. В ходе эволюции при формировании органов и тканей, клетки которых находятся в изоосмотическом окружении и лишены опасности разбухания, необходимость в сократительной вакуоли отпала. Однако и у многоклеточных животных не все клетки находятся в изоосмотической среде. В некоторых органах, в полости которых содержится гипотоническая жидкость, имеются так называемые плотные эпителии с осмотически непроницаемыми межклеточными плотными контактами и апикальными мембранами клеток. В определенных условиях такой эпителий становится высокопроницаемым для воды и ионов. Для сохранения структуры клеток в этих условиях необходим совершенный

механизм внутриклеточной осморегуляции. В дополнение к натриевому насосу, эту роль, по-видимому, выполняют обнаруженные в гранулярных клетках мочевого пузыря эволюционно древние структуры - крупные вакуоли с примембраннымн структурами, аналогичные сократительным вакуолям простейших. Возможно, эти вакуоли, возникающие из цистерн аппарата Гольджи, не только спасают клетку от разбухания, но и транспортируют воду из полости пузыря в кровь. Таким образом, на мочевом пузыре лягушки четко прослеживается, на наш взгляд, функциональная гомология сократительной вакуоли простейших и аппарата Гольджи многоклеточных, на которую указывал Насонов (Nassonov, 1924).

Результаты морфологического и иммуноцитохимического изучения изменений клеючпых структур при стимуляции водного транспорта указывают на существенную роль в механизме гидроосмотического эффекта АДГ элементов тпоскелста: микротрубочек и микрофиламентов. Участие мпкрофубочек и микрофиламентов в транспорт воды через эпителий мочевого пузыря жабы было продемонстрировано в физиологических работах с помощью деполимеризующих их агентов: колхицина и винбллстнна, цитохалазииа В (Taylor, 1977;Sousa, 1985). Использование разных методов их визуализации в настоящей работе впервые позволило обнаружить существенное возрастание количества микротрубочек и деполимеризацию кортикальных микрофиламентов при стимуляции водных потоков. Высказывается предположение о том, что микротрубочки и микрофиламенты могут участвовать как в транспортировке водных каналов в мембрану из цитоплазмы с помощью гранул, так п в перемещении по клетке крупных вакуолей, транспортирующих воду через клетки.

Ввиду обнаружения в гранулярных клетках при действии АДГ большого количества микротрубочек, возникает вопрос о механизмах инициации полимеризации тубулнна. Можно предположить, что одним из факторов, обуславливающих отсутствие спонтанной полимеризации тубулнна, является его депонирование. В гранулярных клетках местом депонирования тубулнна могут быть специфические гранулы. При этом высокая концентрация в этих гранулах ионов Са2+ , обнаруженная в работе Шахматовой п др. (1982), по всей вероятности, препятствует полимеризации тубулнна. Известно, что одним из звеньев цепи реакций, запускаемой действием АДГ, является высвобождение из внутриклеточных запасов ионов кальция. К высвобождению ионов Са2+ из внутриклеточных хранилищ приводит сигнальный путь, возникающий в результате гидролиза инозитолфосфолипндов до инозитол-трифосфата (Volpe et al., 1988). Возможно, кальций высвобождается из гранул в тот момент, когда происходит нарушение целостности мембраны гранулы при её слиянии с

апикальной мембраной, после чего создаются условия, способствующие полимеризации тубулниа. Именно в таких гранулах, имеющих фрагментироваимую ограничивающую мембрану и располагающихся вблизи апикальной мембраны, часто выявляются толстые микротрубочки или кристаллический белок, имеющий эпитопы, специфически связывающиеся с АТ к тубулину. Ассоциация микротрубочек с

электронно-плотными глобулами (МАРб) происходит, по-видимому, уже в цитоплазме.

Проведенный в настоящей работе анализ распределения мнкрофиламентов в гранулярных клетках мочевого пузыря лягушки при стимуляции транспорта воды АДГ или удалением аутакоидов показал снижение плотности апикального слоя мнкрофиламентов. Распределение мнкрофиламентов в других участках гранулярных клеток практически не меняется. Этот факт свидетельствует о существовании гетерогенной чувствительности двух пулов актиновых филаментов гранулярных клеток к факторам регуляции проницаемости эпителия. Фрагментация кортикальных актиновых мнкрофиламентов может быть вызвана резким повышением концентрации ионов Са2+(Ут, 1987), высвобождающихся из гранул. Деполимеризация Р-актина в примембранной апикальной области способствует слиянию мембран специфических гранул с апикальной мембраной и встраиванию в неё водо-проницаемых каналов. Это предположение вполне согласуется с идеей, что апикальный актиновый цитоскелет является клеточным аппаратом, ограничивающим и регулирующим процессы экзоцитоза (МиаПеп е1 а1., 1995).

4. Поглощение питательных веществ клеткой носредовом рецентор-опосрсдова шино эндоцшоза

В отличие or малых полярных молекул п ионов, проникающих через клеточные мембраны с помощью мембранных переносчиков и каналов, большинство маркомолекул, необходимых для нормального

функционирования клеток, поглощаются ими посредством эндоцитоза. Эффективность поглощения специфических лигандов в значительной степени усиливается с помощью так называемого рецептор-опосредованного эндоцитоза, который обеспечивает механизм концентрирования поглощаемых веществ (Goldstein et al., 1985). Рецептор-опосредованный эндошпоз описан при поглощении холестерина (jiniioiipoieiiiii,! низкой плен нос ni=I.DL), трапсфсррнна, инсулина, эпидермалыюю фактора роста (1:G1:), аспалоглнкоиртеинов (ASGP), материнских антител у новорожденных млекопитающих, питательных веществ при ранпипи ооцитов. Для рецептор-опосредованного эндоцитоза характерно связывание лиганда со специфическими рецепторами, интерпализация комплексов в составе клатриновых пузырьков в ппшплазму и перенос соответствующего сигнала в ядро пли цшоплазмагпчеекпе структуры.

Одним из классических обьектов для изучения рецептор-опосредованного эндоцитоза являются ооциты комара, на которых впервые были обнаружены окаймленные клатрином ямки и пузырьки (Roth, Porter, 1964). Позже было показано, что они являются универсальными структурами эукариотичсской клетки, участвующей в рецептор-опосредованном эидоцн юзе.

В развивающихся оошпах комара Acdcs aegypti происходит интенсивное поглощение желточных белков, необходимых для их развития. В отличие от сомашческих клеток, в которых лиганд утилизируется или возвращается в экстраиеллюлярнос пространство, ооциты накапливают желточные белки, формируя в своей цитоплазме желточные гранулы. Только в последние годы удалось выделить белок рецептора к основному желточному белку ооцпга комара, пптеллогепину, охарактеризовать его и выработать к нему полнклональные антитела (Sappington et al., 1995). Используя эти антитела, а также антитела к двум минорным специфическим желточным протеинам, 44КР и VCP, было проведено исследование их пммуно-локалнзацпн в развивающихся ооцитах комара. 4.1. Постановка экспериментов

Для работы использовались взрослые самки комара AaJex uegypli , которые содержались при температуре +27°С и кормились 10% раствором сахарозы на физиологическом растворе. Для инициации вителлогенеза 3-х-5-и дневные самки кормились кровыо белых лабораторных крыс. Через 24

час после кормления из брюшных сегментов комара вырезались яичники, содержащие ооциты, и фиксировались для целей электронно-микроскопического исследования.

4.2. Судьба комплекса рецептор-иптеллогенпн на ранних стадиях эндоцнтоза

Во время вителлогенеза комаров желточные белки, синтезированные

_в_жировом_телет_доставляются—но-гемолимфе к развивающимся ооцитам,-

Для ооцитов, находяшхся на стадии вителлогенеза, характерно наличие большого количества микроворсинок на их поверхности, между которыми располагаются многочисленные окаймленные ямки. На поверхности ооцпта п в межклеточных пространствах фолликулярного слоя на ультрагонких замороженных срезах и на срезах материала, залитого в смол); коллоидное золою мепгг как вителлогенип, гак и два других белка, сопровождающих вителлогенип: белок 44КР и вителлогенную карбоксипептпдазу, VCP Рецеиторный к вителлогенину белок более надежно выявляется па замороженных срезах, в связи с чем было проведено сравнительное исследование иммунолокализации вителлогенина и его рецептора па улыратнких замороженных срезах.

С помощью коллоидною золота выявляется одинаковая локализация вителлогенина и его рецептора на плазматической мембране ооцита, главным образом между мнкроворсинками, на мембране микроворсионок в их основании и в окаймленных ямках. Верхние части микроворсинок практически лишены метки. В кортикальной цитоплазме вителлогенных ооцитов, как уже было указано, имеется очень большое количество окаймленных пузырьков. Цитоплазматическая поверхность окаймленных ямок и пузырьков (100-120 им в диаметре) содержит характерный фусс-слой, клатриновая природа которого четко демонстрируется с помощью поликлональных антител и копъюгата Протеин А-золото. Реакция на клатрии была проведена с помощью поликлональных антител к клатрину, выработанных в лабораюрии A.C. Ранхеля путем клонирования ДНК тяжелых цепей клатрпна ооцитов комаров Aedes aegypti (Kokoza et al., 1997). Кроме того, в примембранной области цитоплазмы встречаются гладкие везикулы несколько большего размера (150-300 им), имеющие , овальную или неправильную форму и представляющие собой, по-видимому, сливающиеся друг с другом ранние эндосомы. Известно, что ранние эндосомы формируются из клатриновых пузырьков, быстро теряющих после отпочковывания ог плазматической мембраны свое клатрнновое окаймление и сливающихся друг с другом. При

иммуноцитохимичсском анализе выявляется сходная локализация метки к вителлогенину и его рецептору как в окаймленных пузырьках, так и в ранних эидосомах. Обе клеточные органеллы содержат также метки к женским специфическим белкам: 44КР и VCP.

4.3. Диссоциации комплекса лпгапд-рецептор и возвращение рецептора и плазматическую мембрану

После слияния ранних эпдосом образуются поздние эндосомы, представляющие собой в ооцптах комара так называемые переходные желточные тела, накапливающие питательные вещества (Ка1кЬе1, 1992). Эти гранулы также располагаются в основном в кортикальной ооплазме и содержат золотые метки к вителлотенину, 44КР, УСР и к рецептору. Однако, локализация внтеллогсиппа н рецептора к нему совпадает в этом компартменге не полностью. Характерной особенностью переходных желточных тел является наличие большого количества отростков с диаметром 40-50 им, отходящих от их ограничивающих мембран. Анализ многих замороженных срезов показывает', что большинство этих тубуляриых структур простирается в сторону поверхности ооцита. Некоторые отростки соединяются с плазматической мембраной. По-видимому, гладкие мембранные тубулярпые структуры, располагающиеся в кортикальной цитоплазме, представляют собой отростки мембран желточных гранул.

Иммуноцптохнмнческий анализ переходных желточных тел показывает, что метки к вителлогенину п его рецептору имеют в этой оргаиелле различную локализацию. Рецептор обнаруживается, в основном, по периферии желточного тела и в его отростках, тогда как электронно-плотное содержимое центрального резервуара гранулы специфически метится антителами к вителлогенину. Это наблюдение свидетельствует о диссоциации комплексов рецептор-лиганд на стадии формирования поздих эндосом, переходных желточных гранул. Выявление рецептора в тубулярных отростках эндосомы, часто располагающихся в контакте с плазматической мембраной, может указывать на возвращение его и встраивание в плазматическую мембрану. Вероятно, циркулирующий рецептор может функционировать одновременно с вновь синтезированными и встраивающимися в плазматическую мембрану рецепторными белками. Специфика ооцита заключается в том, что лиганд не деградирует с помощью лизосом, как это происходит в соматических клетках, а накапливается в цитоплазме в виде желточных тел. Зрелые желточные тела ооцитов комара не содержат метки к рецептору, но заполнены частицами коллоидного золота, интенсивно метящими желточные белки: вителлогепип, который по мере созревания превращается в кристаллическую форму, вителлин; белок 44КР и УСР. Использование двойного меченпя продемонстрировало колокализацию всех трех желточных белков в зрелых желточных телах. Однако, в пределах гранулы этн белки сегрегированы таким образом, что вителлин всегда располагается в центральной части гранулы, тогда как 44КР и УСР занимают её периферическую часть (Рис. 12).

Рис. 12. Участок зрелой желточной гранулы ооцита комара с двойной меткой двух желточных белкой (Уц. \;СР)

4.4. Заключение

Параллельное нммуноцитохимическое исследование раерпделения вителлогенииа и рецептора к тпеллогенину в женских особях комаров Aedes aegypti позволило проследить судьбу этих антигенов в период поглощения вителлогенииа, В связи с тем, что мы пе смогли получить достоверные картины мечепия рецептора на срезах материала, залитого в смолу, в этой работе мы использовали технически более сложную методику - меченне ультрагонких замороженных срезов. В действительнотси, этот подход нам кажется более адекватным в отношении большинства белков, т.к. он исключает ряд повреждающих их антигенные свойства факторов: дегидратацию, пропитывание образцов и их заливку в смолу, а также полимеризацию смолы при высоких температурах. К сожалению, при использовании замороженных срезов невозможно осуществить двойную метку на двух сторонах среза, т.к. срезы монтируются на пленку-подложку. В связи с этим распределение внтеллотенина и его рецептора изучалось параллельно на соседних срезах. Отсутствие стандартной электронно-микроскопической обработки замороженного материала позволило выявить такие детали ультраструктурной организации клеток, которые не видны на срезах материала, залитого в смолу. Это особенно важно при изучении таких быстро протекающих процессов, как слияние мембран, эндо- и экзоцитоз. В частности, было обнаружено огромное количество мембранных тубулярных компарт ментов, связанных с поздними эндосомами - промежуточными желточными гранулами. Эти тубулы простираются в направлении поверхности ооцита и сливаются с его плазматической мембраной.

Как известно, в период вителлогенеза комаров в цитоплазме ооцитов происходит интенсивная аккумуляция вителлогенииа (Raikhel, 1992). Вителлогеппп доставляется к поверхности ооцита пе гемолимфе,

связывается с рецепторами п поглощается с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза (Рис. 13).

• В Г уВГР

Рис 13 Схематическое изображение эндоцитозного поглощения и последующей обработки вителлогенина (Вг), рецептора (ВгР) и их комплексов в ооците

комара. • Вителлогенин по гемолимфе доставляется к ооцпту и связывается с рецепторами, заякоренными н его плазматической мембране. Комплексы лиганд-рецептор конце!прируютсяв окаймленных ямках(ОЯ), отпочковывающихся в виде окаймленных пузырьков (ОН). Окаймленные пузырьки трансформируются в ранние эндосомы (РЭ) и затем в поздние эндосомы - в промежуточные желточные гранулы (ПЖГ), в которых происходит диссоциация

рецептора и лиганда. Отростки поздних эндосом,

сливающиеся с

плазматической мембраной ооцита, встраивают в нее рецепторы к вителлогенину. Зрелые желточные

гранулы

(ЗЖГ) содержат только вителлогенин и не

содержат

рецепторных белков.

С помощью двойною (розЮчнЬескйпц) или параллельного мечения грех желточных белков удалось показать, что все они поглощаются развивающимся ооцитом одинаково через окаймленные ямки и окаймленные пузырьки. Клатриновая природа их окаймления продемонстрирована с помощью поликлопальных АТ к клатрину. Окаймленные ямки, окаймленные пузырьки и ранние эндосомы ооцитов содержат как метку к вителлогенину, так и к его рецептору. Подобная локализация рецептора вителлогенина описана в ооцитах двух видов

яйцекладущих животных: курицы (Barber ct al., 1991) и таракана (Ferenz, 1993). Однако, дальнейшая судьба рецептора вителлогенина в ооцитах этих животных не изучена. В настоящей работе получены данные о последующих этапах судьбы комплекса вителлогенин-рецептор. Уже в поздних эндосомах (промежуточные желточные тела) локализация внгеллогснпна и рецептора различна: лиганд концентрируется в везикулярной—части—желточного—тела.—тогда—как—рецептор—связан—с отростками ограничивающих их мембран. Дальнейшая судьба рецептора и комплекса рецептор-лпганд в развивающихся ооцитах комара несколько отличается от судьбы аналогичных комплексов в соматических клетках, так как в ооцитах лиганд не деградирует, а накапливается в желточных телах (Raikhel,l992). Обнаружено, что после диссоциации комплекса в поздних эндосомах рецептор возвращается к плазматической мембране ооцита в составе тубулярных отростков мембраны, ограничивающей поздние эндосомы (Рис. 13). Полученные данные демонстрируют ещё один пример типичного рецептор-опосредованного эндоцитоза, так широко распространеного в природе и проходящего по единой схеме.

5. Участие спшиалнзпроианных межклеточных контактов в межклеточном обмене попами п метаболитами

Необходимым условием нормальною функционирования ткани является координация деятельности всех её клеточных элементов. Впервые возможность коммуникации между клетками была обнаружена на возбудимых тканях (гладкие и сердечные мышечные клетки, электрические синапсы), клетки которых электрически связаны друг с другом ( Robertson, 1963), а затем и на невозбудимых ( Loewenstein, 1966; Чаилахян и др., 1981). Характерное для большинства тканей наличие обмена веществами между клетками демонстрируется с помощью электрических измерений и флюоресцентных меток различною молекулярного веса. На основании изучения перетекания этих меток был сделан вывод о том, что между клетками существует область высокопроницаемых контактных мембран, так называемый щелевой контакт, через который способны проходить ионы п молекулы с молекулярным весом до 155 дальтон и размером 2,5-3,0 нм. В 70-е годы довольно широко была распространена точка зрения о том, что, наряду со щелевыми контактами, в межклеточной коммуникации принимают участие и септированные контакты, которые в тканях беспозвоночных животных всегда сопровождают щелевые (Staehelin, 1974).

Щелевым контактам придается большое значение в регуляции и поддержании ионного и метаболического гомеостаза внутренней среды. Это важно для нормального протекания морфогенетических процессов и функционирования дифференцированных тканей. По современным представлениям, существенную роль щелевые контакты играют в процессах малпгнизапии клеток (Loewenstein, 1977). Однако, наличие корреляции между неконтролируемым клеточным ростом и дефектами в развитии высокопроницаемых контактов не удается подтвердить.

Щелевые контакты в нервной ткани обеспечивают электротоническую передачу сигнала между нейронами. Это взаимодействие между клетками осуществляется практически без задержки, в отличие ог передачи возбуждения посредством химического синапса. Для ЦНС млекопитающих характерно наличие смешанных синапсов, впервые описанных Sotelo et Palay (1970). Однако, несмотря на сходные функциональные характеристики с ними сенсомоторных синапсов лягушек (Шаповалов, 1967), наличие морфологических коррелятов

двойному способу сип лиги чес кой передачи в спинном мозге лягушки до нашего исследования найдено не было.

13 невозбудимых тканях щелевой контакт был впервые идентифицирован в электронном микроскопе Ревелем и Карновским в 1967 г с помощью лаптановоп метки. Позже его ультраструктурная организация была детально изучена методами негативного контрастирования и -замораживания-скалы вапия.—Он-оказался—первой-специализированной ~ мембранной структурой, в которой могут быть визуализированы трансмембранные каналы. В настоящее время сделан большой прогресс в изучении щелевого контакта, в частности, выделены белки коннексины с разной молекулярной массой, формирующие его субъединицы (кониекеоны), специфические для разных тканей и к ним выработаны антитела (Hertzberg et al., 1985; Gootlenongli, Musil, 1993).

Для понимания механизмов межклеточной коммуникации большое значение имеют комплексные исследования структуры и функции межклеточных контактов в различных экспериментальных условиях. В связи с этим представлялось интересным параллельное изучение динамики изменений специализированных контактов (щелевых и септированных) и межклеточной связи методами электронной микроскопии и

электрофизиологическими методами. Эти исследования проводились нами на сенсомогормом синапсе лягушки, на клеточных культурах L-клеток и эпителиальных клеток трахей FBT, а также на простейшем Gregarina polymorpha на 2-х клеточной стадии развития - сизигии. 5.1. Постановка экспериментов

1. Для параллельного изучения структурных особенностей сенсо-моторного синапса лягушки ¡(ana riilihunda регистрировали возбуждающий постенпаитический потенциал (ВПСП) и инъецировали перокепдазу хрена (ПХ) в прссипаптическое первичное афферентное волокно и мотонейрон IX, X сегментов спинного мозга. Серийные срезы, толщиной 60-75 мкм, пршотовленнме на впбротоме из зафиксированного глютар-альдегидом мозга, обрабатывали по методу Грэхэма и Карновского в среде ДАБ-Н2О2 для выявления ПХ. Затем срезы осмировали, заливали в Аралдпт между двумя покровными стеклами, что обеспечивало возможность тщательною изучения препаратов под световым микроскопом. Срезы фотографировали, зарисовывали для воссоздания целостной картины связи первичное афферентное волокно-мотонейрон. Участки срезов с контактирующими мечеными ПХ элементами вырезали под контролем светового микроскопа, наклеивали на аралдитные блоки и готовили полутонкпе срезы толщиной 6-8 мкм. После анализа полутонких срезов в световом микроскопе из них готовили серийные ультратонкие срезы, которые монтировали на бленды, покрытые напыленной формваровой пленкой.

2. Работа проводилась на культуре L-клеток средней плотности, располагающейся на подложке в виде монослоя. Культура велась стандартным способом: на покровных стеклах в непициллиновых флаконах в смеси среды 199, гндролпзата лакт-альбумина и сыворотки крови рогатого скога. Межклеточный обмен тестировали с помощью внутриклеточной флюоресцентной метки. Из микропипеткн (диаметр кончика 0,5 мкм) электрофоретичсеки инъецировали флюоресиенн натрия (мол. вес 332) в клетку-донор с помощью микроманипулятора (СКБ БП, Пущино) при визуальном кош роле под микроскопом МБН-15. По наблюдениям в темпом поле регистрировали число клеток реципиентов, в которые перетекала флюоресцентная метка через контакты с донором. Интенсивность межклеточного обмена характеризуется степенью связанности (отношение числа ииьекций, в которых обнаруживалась хоть одна клетка-реципнепт, к общему числу ииьекций), а также средним числом реципиентов па одну нньскцию.

3. Эпителиальные клетки трахей быка FBT культивировали в среде, содержащей 45% среды lima, 45% 0,5%-ного гидролизага лактальбумина и 10% сыворотки крупного рогатого скота. Для использования в экспериментах клетки высевали па покровные стекла. При смене среды 1 раз в два дня на подложках к 3-7 дню формировался плотный слой клеток.

Покровное стекло с клетками помешали в камеру, заполненную средой, в которой культивировались клетки, и устанавливали под объективом универсального микроскопа JIIOMAM И-1 (J10M0). Источники света: лампа накаливания ОГП2-ЮО (12 В, 100Вт) и ртурно-кварцевая лампа ДРШ-250-3. Опыты проводили при комнатной температуре. Наличие высокопроницаемых контактов определяли с помощью флюоресцентных красителей. Электроды с диаметром кончика менее I мкм заполняли раствором флюоресцеипата натрия (Merck) в 0,1 М KCI или 3-5% раствором люцифера желтого (Sigma) в воде. Сопротивление электродов составляло около 100 мОм. Микроинъекцию осуществляли понофорезом, гнпернолярпзующмми толчками тока 3-10'* А, 200 мс, 1 имп/сек. В некоторых случаях краска поступала в клетку без ионофореза, путем диффузии из кончика электрода. Препарат фотографировали во время опыта с помощью мнкрофогонасадки. Во всех опытах использовали монослоиные культуры, в каждой из которых вводили электрод в несколько клеток. Для определения жизнеспособности клеток использовали метод окраски родамином 123 (Sigma) (10 мкг/мл, 10 мин).

4. Сизигий грегарины (ireaarina polymorphs, стадия жизненного цикла, подготовительная к половому размножению, состоит из двух клеток гамонгов: примнта и сателлита, которые «последствие формируют половые клетки. Сизигии выделялись из кишечника мучного червя Tenabno molilor в физиологическом растворе и использовались для физиологических

опытов п электронномнкроскоппчсского препарирования. Электрические измерения проводили в специальной камере, нижняя часть которой заполнена агар-агаром, приготовленном на растворе Хэнкса. Сверху камеру заливали свободным раствором Хэнкса, содержащим грегарин. Перед измерением сизигии помещали в узкую каиабку, сделанную в агаре, чтобы удержан, их в неподвижном состоянии.

-Для измерения мембранного потенциала (МП) в примите и сателлите-

использовалп оандаршые стеклянные мпкроэлектроды, заполненные 2 М К.С1, с наружным диаметром копчика менее 1 мкм. Для измерения входного сопротивления (Кцх) и коэффициента электрической связи (К) между иримшом н сателлитом был применен метод прямоугольных толчков тока. Принцип метода состоит в том, что через один внутриклеточный электрод (токовый) пропускается ток силой 1о, а вторым электродом (отводящим и находящимся в той же клетке) измеряется величина падения потенциала (У|) на мембране: \,!/1о=Квх- Если отводящий электрод находится в соседней клетке, то по величине разности потенциала на мембране второй клетки (У2) судят о коэффициенте электрической связи: К =\/|/\Л. Для измерения входного сопротивления оба электрода вводили в одну и ту же клетку сизигия, для измерения коэффициента электрической связи между клетками сизигия токовый и отводящий электроды вводили в разные клетки.

В качестве флюоресцентной метки использовали 25% раствор флюоресцеина натрия в растворе Рингера. В одну из особей сизигия с помощью стеклянного мпкроэлектрода инъецировали флюоресцеин натрия, который свободно диффундирует в цитоплазме. В темном поле люминесцентного микроскопа наблюдали флюоресценцию этого вещества в цитоплазме грегарии. Через 20-40 мин после инъекции флюоресцеина грегарины фиксировались на столике микроскопа при введенном микроэлектроде.

Измерения периметра сечения грегарин на срезах проводили на электронномпкросокпическпх фотографиях с помощью курвиметра. Среднее арифметическое длины плазматической мембраны определяли по 15 измерениям различных участ ков сечений поверхности грегарины. 5.2. Нысокопроннцасмьп) компонент сенсомоторного синапса лигушкп В результате электрофизиологического анализа унитарных постсинаптических потенциалов сенсомоторной связи были получены следующие характеристики: величина средней амплитуды химического компонента ответа составляла 568 мкВ, электрического - 120 мкВ.

При светооптическом исследовании серийных срезов мозга лягушки с меченной ПХ парой нервных клеток (первичное афферентное волокно-мотонейрон) обнаружено, что с дендритным деревом мотонейрона контактирует 3 обильно ветвящиеся в промежуточном сером веществе

коллатералн прееннагпического волокна. К поверхности дендритов различного диаметра плотно прилегают утолщения нресинаитичсского волокна на расстоянии от сомы мотопейрона в 200-700 мкм. В электронном микроскопе при исследовании физиологически охарактризованной пары первичное афферентное волокно-мотонейрон видно, что в местах контакта этих утолщений с дендритом имеются типичные синаптическпе структуры. Меченное ПХ синаптическое окончание содержит плотно упакованные округлые или слегка овальные пузырьки диаметром около 50 нм и везикулы диаметром 80 им с электронноплотным содержимым. Утолщения постсинаптической мембраны лучше выявляются без пероксидазиой метки на поперечном срезе дендрита. Ширина снпаптической щели составляет в среднем 20 нм, что соответвеетвует обычной ширине химического синапса. Однако, при анализе серийных улыраюнкнх срезов видно, чю вплотную к типичному химическому синапсу прилегает участок, в котором пре- и постсипапт ическая мембраны находятся на очень близком расстоянии. К сожалению, метка ПХ синаптического окончания, которая дает возможность обнаружить на улыраюнкнх срезах регистрируемую в электрофнзиологпческом эксперименте пару нервных клеток, маскирует в определенной степени как внутриклеточные, так и синаптическпе структуры. Тем не менее, с большой долей вероятности можно утверждать, что указанный участок снпаптической щели представляет собой типичный щелевой контакт. Этот факг хорошо согласуется с данными но электрофизпологпческнм измерениям, свидетельствующим о наличии в исследуемых синапсах химической и электрической связи одновременно.

Таким образом, использование ПХ для мечения сенсомоторного синапса лягушки позволило провести электрофизиологическое и ультраструктурное исследование одной и той же пары - первичное афферентное волокно-могопейрон и показать наличие структурных коррелятов электрической и химической передачи сигнала индивидуальной пары.

5.3. Усиление межчеле точного обмена в культуре Ь-клеток при обработке лап таном

Известно, что интенсивность и характер межклеточного обмена в многоклеточных системах подвержены влиянию разнообразных факторов, в основном повреждающих. Однако, на культуре Ь-клеток обнаружены факторы, которые усиливают межклеточный обмен. Это - кратковременная обработка клеток хлористым латаном, усиливающим межклеточный обмен в несколько раз (Потапова, 1975). Оказалось, что обработка лантаном Ь-клеток в концентрации 1мМ не нарушает роста культуры, гранулоотложения нейтрального красного и не снижает мембранного потенциала клеток.

С помощью стандартных электропномикроскопических методов нами показано, что значительная часть межклеточной границы культуры Ь-клеток представлена плотным контактом, выявляющим типичную для этого типа контактов ультраструктуру. Плотные контакты прерываются участками неспециализированной межклеточной щели и очень короткими и редко встречающимися контактами щелевого типа.

-В—опытах-по~наблюдению-за-распределеТТием внутриклеточной

флюоресцентной метки, а также в опытах по измерению электрической связи межклеточный обмен в культуре Ь-клеток обнаруживается очень редко. Степень связанности в культуре средней плотности составляет примерно 30%. При этом в среднем па одну клетку донора приходится всего 1-2 клетки-реципиента.

После обработки клеточных культур в течение 10-15 мин солевым раствором, содержащим хлористый лантан в концентрации 1мМ, степень связанности и среднее число реципиентов увеличивается в 2-3 раза. При этом монослой заменяется 2-3-х-слойпым распределением Ь-клеток. Существенных изменений в структуре клеточных ортанелл по сравнению с необработанными клетками выявлено не было. Лантан, введенный в физиологический раствор, обнаруживается как на свободных поверхностях, так и в межклеточных щелях. При этом сохраняется целостность плазматических мембран клеток. Однако существенные изменения наблюдаются в областях межклеточного контакта клеток: плотные контакты становятся очень редкими, тогда как щелевые контакты, напротив, занимают большую часть межклеточной границы. Благодаря обработке клеток лантаном зоны щелевых контактов становятся элекгронноплотными, что способствует их хорошему выявлению. Размер щели в области щелевою контакта вместе с наружными слоями прилегающих друг к л ругу клеточных мембран равен 8-9 нм.

Факт увеличения количества щелевых контактов в культуре Ь-клеток, обработанных лантаном, при повышении межклеточного обмена указывает на происходящие в клеточных мембранах перестройки. Не исключено, что в созданных экспериментальных условиях лантан может индуцировать переход плотных контактов в щелевые, которые и являются высокопроницаемыми участками мембран, осуществляющими диффузионный обмен флюоресцентной меткой между клетками.

Таким образом, полученные результаты показывают, что лантан, который применяется в электронной микроскопии как индикатор для выявления щелевых контактов, является модификатором поверхностных мембранных структур. В связи с этим следует учитывать влияние лантана при интерпретации электроппомикроскопических данных по

распределению щелевых контактов в тканях при его использовании.

5.4. Индукции иыеикоиропицаемых контактов и культуре эпителиальных клеюк

Одним из факторов, способствующих возникновению межклеточного обмена между клетками в культуре (эпителиальные клетки трахеи быка FBT), является УФ облучение клеток, используемое во флюоресцентной микроскопии (Шаровская, Марголис, 1985).

При введении в одну из клеток мпкроэлектрода с флюоресцентным красителем клетка окрашивается за несколько секунд. Перетекания красителя из клетки в клетку не происходит, как и в других эпителиальных клетках в культуре. II только в процессе наблюдения клеток в режиме флюоресцентной микроскопии (длина волны 300-480 им, интенсивность освещения 100-380 мВт/см2) через 1-5 мин после инъекции красителя окрашиваются все клетки, окружающие клетку-донор. При этом через 1060 мин после освещения изменяется морфология клеток, экспонированных в поле зрения микроскопа. При наблюдении клеток в фазово-контрастном микроскопе межклеточные границы уплотняются и становятся резко очерченными. Контролем служили клеточные культуры, наблюдаемые под микроскопом при освещении препарата белым светом, источником которого служил стандартный осветитель с лампой накаливания. В этом случае морфология клеюк не изменялась н в течение 2-3 час после начала работы межклеточная связь не возникала. То же самое наблюдалось и при освещении препарата светом длиной волны более 490 нм в течение 15 мин. Однако, через 30 мин облучения этим светом клетки гибнут.

При изучении культуральных клеток монослоя в электронном микроскопе выявляются ультраструктурные особенности, характерные для нормального эпителия. Апикальная мембрана клеток образует большое количество микроворсинок, содержащих продольно ориентированные фибриллярные структуры. Практически не выявляется гликокаликс, что несколько отличает клетки культуры от эпителия in situ. Клетки соединены в апикальной области типичным соединительным комплексом, состоящим из плотного и промежуточного контактов и 1-2 десмосом. Латеральная поверхность клеток извилиста, образует множественные складки. Ширина межклеточной щели в области иитердигитаций составляет 15-18 нм. Щелевые контакты па таких препаратах не обнаруживаются.

Клетки морфологически измененного УФ облучением поля в электронном микроскопе резко отличаются от контрольных клеток, окружающих эти поля. Апикальные поверхности клеток выпячиваются, разглаживаются микроворсинки, исчезает складчатость латеральных плазматических мембран. Межклеточные щели имеют более низкую, чем у контрольных клеток, электронную плотность. Иногда на латеральной границе наблюдаются специализированные участки, по своей структуре напоминающие щелевые контакты (Рис. 14).

Рис. 14 Ульгратонкин срез щелевого контакта. При большом увеличении видна его субъединнчная структура.

Ширина щели в них не превышает 5 им. Для их идентификации не использовались соли лантана, так как в предыдущей работе на Ь-клетках было показано, что сам лангап может индуцировать межклеточную связь. В некоторых областях между клетками выявляется лишь одна мембрана шириной 10-12 им, имеющая трехслойную структуру. В цитоплазме клеток также происходят некоторые изменения, в частности, просветление цитоплазмы и . набухание клеточных органелл, появление большого количества электронно-прозрачных вакуолей.

В связи с наблюдаемыми картинами набухания клеток были поставлены опыты по воздействию на межклеточные взаимоотношения гипотонической культуральной среды. Оказалось, что уменьшение осмотичности среды также вызывает аналогичные изменения: клетки набухали, их границы становились более темными. Но эти изменения были кратковременными и клетки быстро возвращались к исходному состоянию. При облучении обводненных клеток эффект индукции межклеточной связи возникает быстрее и дольше сохраняется.

Другие физические воздействия, такие как нагревание клеток до 45°С в течение 10 мин, помещение клеток в гипертоническую среду, не индуцировало сходных морфологических изменений.

Полученные данные указывают на то, что УФ облучение вызывает набухание клеток, в результате которого происходит сближение латеральных мембран соседних клеток. Возможно, в этом случае повреждается Ыа+,К+-АТФ-аза, что и приводит к ионному дисбалансу и набуханию клеток. Остается непонятным, каков же механизм возникновения межклеточной связи, Можно только предположить, что в области сблизившихся мембран латералыю диффундирующие в плазматических мембранах полуканалы формируют полные коннексоны,

что в свою очередь может вести к стабилизации физических контактов между соседними клетками. Формирование единственной мембраны между клетками свидетельствует о весьма существенном изменении структурно-химической организации плазматических мембран клеток при обработке клеток УФ.

5.5. Структура и функция сетпровапных контактов греглрнн

В сканирующем электронном микроскопе хорошо выявляется сложная структура пелликулы грегарипы, образующей глубокие продольные складки. Проведенные измерения показывают, что складчатость увеличивает площадь поверхности в 5-6 раз. На ультратонких срезах видно, что самый наружный слой пелликулы, трехслойная плазматическая мембрана (7-8 им), покрыта относительно толстым слоем гликокаликса. Под плазматической мембраной выявляется плотный гомогенный слой, толщиной 30 им, под которым уже располагается внутренний мембранный комплекс, состоящий из 2 мембран. Внутренний мембранный комплекс на всем его протяжении подстилается базалыюй ламиной. Па стадии жизненного цикла подготовки грегарин к половому размножению в кишечнике мучного червя две особи объединяются в так называемый сизигий. Передняя особь, примит, и задняя, сателлит, соединены таким образом, что передний конец сателлита, протомерит,

находится в контакте с задним концом примита, дейтомеритом (Рис. 15).

. ..—---^

1Ц

Рис. 15. Сизигий грегарины в световом микроскопе В переднюю особь введен флуоресцентный краситель, не проникающий в соседнюю клетку

Электроиномнкроскопическос исследование грегарин на стадии сизигия позволило обнаружим. между двумя клетками специализированный межклеточный контакт сеп тированного типа. Его структура оказалась очень сходной с септированными контактами тканей беспозвоночных животных. В областях контакта мембраны соседних

клеток идут строго параллельно друг другу, никогда не сливаясь. В щели видны периодически повторяющиеся септы. Толщина септ составляет 5-6 нм, расстояния между ними около 10 нм. При фиксации грегарин в присутствии лантана обнаруживается трехслойная структура септ: два электронноплотиых периферических слоя и средний, электроннопрозрачный. Па репликах замораживания-скалывания сентированный ко такт выявляется в виде параллельных рядов крупных ВМЧ.

Удобство этого объекта для изучении функции септированного контакта заключается в том, что он не сопровождается другими типами межклеточных контактов. Электрические измерения и флюоресцентная метка показали полное 01сутствпе связи между двумя особями сизигия (Рис. 15). В сизигии грегарин эти контакты, по-видимому, играют существенную роль в адгезии клеток. Не исключено, что участки плазматических мембран, создающих септированный контакт, имеют определенное значение в процессе узнавания клеток, вступающих в контакт. Действительно, при образовании сизигия всегда соединяются потенциально женская клетка с потенциально мужской и проксимальный конец одной особи прикрепляется к дистальному концу другой. Кроме того, с помощью септированного контакта может осуществляться механическая синхронизация движений примига и сателлита. 5.6. Заключение

Рис. 16 Схема ультраструктурной и молекулярной организации щелевого контакта. Коннексоны (К) пронизывают каждую из мембран контакта и прочно связаны между собой в области межклеточной щели. Каждый коннексон (К) состоит из 6 белковых субъеднннц, между которыми располагается гидрофильный канал. Большая часть межклеточном щели заполнена белками, коннекспнами. На Р-поверхности (РР) выявляются коннексоны в виде крупных ВМЧ, на Е-поверхности (ЕЙ) -соответствующие нм углубления. Р5 п Е5 - истинные поверхности контактирующих мембран' Р - цитоплазмагическая, Е - эктрацеллюлярная.

Структурно-функциональное изучение специализированных межклеточных контактов подтвердило доминирующую в литературе точку зрения на роль щелевых контактов как структур, участвующих в

межклеточной коммуникации и сен т ированных - в межклеточной адгезии (Loewenstein, 1977; Slaehelin, 1974; Peracliia, 1978). lia разных типах клеточных культур и простейших, а также на иейро-моториом синапсе спинного мозга лягушки выявлена корреляция между наличием электрической связи пли обмена флуоресцирующими красителями между клетками и присутствием между этими клетками щелевых контактов.

На клеточных культурах показана возможность индукции электрической связи между клетками ионами лантана и УФ, сопровождающейся возникновением специализированных щелевых контактов. Возникновение новых щелевых контактов в принципе возможно в связи с наличием в мембранах сблизившихся клеток образующих их белков (Чайлахян и др., 1981). Соединяясь друг с другом, полуканалы образуют субъедшнщы щелевых конт актов - копнексоны (Рис. 16).

В 60-е и ранние 70-е годы предполагалось, что септированные контакты беспозвоночных также участвуют в электрической связи между клетками. На слюнных железах Cluronumus, в которых были описаны в это время септированные десмосомы, было обнаружено наличие электрической связи и перетекание НХ между клетками. На основании этих данных было высказано предположение, что эта связь осуществляется через септированные десмосомы (Locke, 1965; Giliila et al., 1970). Однако, позже эта точка зрения была подвергнута сомнению. На том же объекте было обнаружено, что при исчезновении электрической связи между клетками слюнной железы сегппрованный контакт остается, тогда как структура щелевою контакта нарушается (Loewenstein, 1973). Анализ функции септировапного контакта грегарин также подтвердил неправомочность приведенной точки зрения. В сизигии никогда не наблюдалось наличия электрической связи или перетекания флюоресцентного красителя между формирующими его двумя клетками. Важно, что в предложенной модели (сизигий грегарины) септированный контакт не сопровождается другими тинами межклеточных контактов. Основная функция септировапного контакта, обнаруженного нами впервые между двумя особями 2-х клеточной стадии грегарины - сизигия сводится, по-видимому, к созданию механической связи между этими клетками, готовящимися к половому размножению.

Результаты анализа структурной организации септировапного контакта грегарин, выявляемой на ультратонких срезах с помощью лантана, трудно согласовать с возможностью транспорта ионов или гидрофильных молекул по его септам. При обработке лантаном, добавленном в осмиевый фиксатор, септы выявляются п виде трехслойной структуры, состоящей из двух электронпоплотных периферических слоев и центрального электропнопрозрачиого слоя. Пели принять, что электронно-оптическая плотность в данном случае обусловлена введенным лантаном, то плотные

слои сспт должны включать в себя гидрофильные белки, гдикопротеиды и полисахариды, и то время как центральная прозрачная зона должна состоять из более гидрофобного материала, непроницаемого для гидрофильных веществ (Рис. 17). Эти данные хорошо согласуются с результатами оценки электрической связи между клетками сизигия и наблюдениями по перетеканию красителей.

Рис. 17. Схема ультраструктурной и молекулярной организации септированного контакта гладкого типа Р-иоиерхность контактирующих мембран (РР) содержит крупные внутрчмембранные частицы (ВМЧ), Е-поверхность (ЕР) содержит соответствующие им в/давления ВМЧ двух контактирующих мембран соединяются регулярно расположенными септами.

6. Общее заключение

Проведенное морфо-функциональное исследование двух типов эпителиев и клеток, моделирующих различные аспекты трансцеллюлярного и парацеллюлярпого транспорта, позволило установить некоторые ультраструктурныс основы трансэпителиалыюго переноса веществ.

Сравнительное изучение проницаемого эпителия тонкой кишки крысы и плотною эпителия мочевого пузыря лягушки продемонстрировало наличие корреляции между их проницаемостью и некоторыми особенностями улыраструктурной организации составляющих их клеток. Прежде всего это относится к апикальной мембране, одному из основных барьеров проницаемости эпителиального пласта. Показано, что апикальная мембрана клеток плотного эпителия мочевого пузыря лягушки имеет инвертированное но отношению к апикальной мембране энтероцитов распределение ВМЧ, представляющих собой интегральные мембранные белки. Апикальная мембрана энтероцитов, как и большинство клеточных

мембран, содержи г большое количество ВМЧ на Р-поверхности и малое -па Е-повсрхиости

Другие морфологические различия выше названных эпителиев проявляются в структуре апикальной и латеральной поверхностей клеток. Для клеток пропинаемых эпителиев характерно более ярко выраженное по сравнению с плотными эпнтслиями развитие щеточной каймы, терминального сплетения и специализированных промежуточных контактов, а также пнтердпгшацнн, образующих базолатеральпое сцепление клеток. Специализированные плотные контакты, напротив, практически не отличаются по структуре в этих двух типах эпителиев.

Полученные в работе новые данные по изменениям ультраструктуры клеток при изменении трпнеэншелпалыюй проницаемости помогли расшифровать ряд экпюв клеточного ответа па факторы, регулирующие транспортные процессы п клетках и тканях. (3 частности, наблюдаемые изменения в распределении ВМЧ (эпителий топкой кишки крысы) или их количестве (эпителий мочевого пузыря лягушки) в апикальной мембране клеток при индукции транспортных процессов служат серьезным доказательством участия этих доменов плазматической мембраны эпителиоцпгов в трансмембрапном переносе веществ. В свою очередь, констатация наличия трансмсмбранною переноса веществ является одним из свидетельств трапецеллюлярното транспорта изучаемых веществ через проницаемый (глюкоза) и плотный (вода) эпителии.

В работе проанализирован один из спорных вопросов - об участии в трансэпителиальном транспорте веществ специализированных

межклеточных контактов. Результаты работы демонстрируют, что структурная организация плотных контактов не изменяется при стимуляции транспортных процессов, что подтверждает его барьерную функцию в этих условиях. Межклеточное пространство ниже зоны соединительного комплекса расширяется, по-видимому, за счет высокого гидравлического давления жидкости, выходящей пз клеток.

Полученные данные по изменению внутриклеточных структур при стимуляции изотонического транспорта жидкости, содержащей глюкозу, через эпителий тонкой кишки крысы и воды через эпителий мочевого пузыря лягушки показываю!, что наиболее реактивной органеллой в условиях усиления транспортных процессов является аппарат Гольджи (Рис. 18). Впервые высказывается предположение об осморегулнрующей функции аппарата Гольджи в полярных эпителиальных клетках. Крайним выражением этой роли аппарата Гольджи можно считать обнаружение в гранулярных клетках плопюго эпителия мочевого пузыря лягушки в условиях больших водных потоков крупных вакуолей, возникающих из его цис-нистерп н аналогичных сократительным вакуолям простейших. Возможно, "сократительные" вакуоли гранулярных клеток принимают

участие в транспорте гипотонической жидкости через цитоплазму клеток. Роль транспортных элементен цптоскелста выполняют микрофиламенты и микрогрубочкп, примыкающие к мембранам крупных вакуолей. Обнаружение "сократительных" вакуолей в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки заставляет пересмотреть существующее мнение об ограниченном распространении эюй структуры лишь среди низших представителей жпвомтых—живущих в прссноГгводе~(простейшиеггубки).~ Возникновение крупных вакуолей из элементов аппарата Гольджи свидетельствует о наличии огромных адаптационных возможностей амфибий, нуждающихся в запасании воды в условиях засухи. Вполне возможно, что Э1П выводы могут быть экстраполированы и на другие плотные осморегулпрующие эпителии, в частности, эпителий собирательных трубок ночки млекопитающих, функциональным аналогом которых является эпителий мочевого пузыря амфибий.

1'мс 18. Схематическое изображение динамики изменений структуры

аппарата Гольджи плотных (А-Г) и проницаемых ( Б, В) эпнтелиев при стимуляции транспорта глюкозы через проницаемый эпителий и воды - через плотный. А - аппарат Гольджи клеток плотного эпителия, обладающего крайне низкой водной проницаемостью, представлен стопками сильно уплощенных параллельных мембранных цистерн. Б - в клетках контрольных проницаемых эпнтелиев и клетках плотных эпителиев,

транспортирующих небольшие водные потоки, цистерны аппарата Гольджи слегка расширены. В- при транспорте

изотонической жидкости в проницаемом эпителии и небольших водных потоков в плотном эпителии набухают цис-цистерны. I" - при транспорте больших потоков воды, стимулируемых АДГ в плотном эпителии, цнс-цпстерпы аппарата Гольджи

формируют крупные вакуоли, с мембранами которых связаны

ЭПИТеЛИП микрогрубочкп и микрофиламенты.

В гранулярных клетках мочевого пузыря лягушки наряду с обычными мнкрог рубочками (20 пм) обнаружен новый тип "толстых"

П

Л

О

Т

ы

и

микротрубочек с диаметром 35-40 им. В отличие от 20 им микротрубочек, центром организации которых и клетке является центросома, инициация полимеризации "толстых" микрогрубочек происходит в одном из пулов многочисленных специфических гранул эпителиальных клеток. Полимеризация мономерного тубулнна, находящегося в этих гранулах в клетках при исходно низкой водной проницаемости, невозможна из-за аккумулируемых ими ионов кальция, высокие концентрации которого, как известно, ппгибнруют процессы сборки микротрубочек. Процесс инициации полимеризации запускается на одном из этапов клеточного ответа на гидроосмотичсское деистиве АДГ, когда целостность мембран гранул нарушается п часть их мембран, содержащих водные поры, встраивается в апикальную плазматическую мембрану. При этом ионы Са выходят в цитоплазм)', осуществляя роль вюрпчиого мессенджера в цепи клеточных реакций па АДГ. В свою очередь, резкое повышение концентрации ионов Са2+ внутри клетки способствует фрагментации кортикальных актнновых фнламентов и подходу специфических гранул к апикальной мембране. Таким образом, специфические гранулы эпителиальных клеток мочевого пузыря лягушки представляют собой дериваты аппарата Гольджн, ответственные за несколько этапов ответа клеток на АДГ. они являются депо ионов и мономерного тубулина, а их мембраны обогащены белком водных пор, встраваюшихся в апикальную мембрану.

Анализ процесса поглощения и аккумуляции макромолекулярных питательных веществ - желточных белков ооцитами комара продемонстрировал все стадии типичного рецептор-опосредованного эндоцитоза: шперпализпция комплексов лиганд-рецептор через окаймленные ямки, одновременная локализация комплексов в ранних эндосомах и их диссоциация при переходе ранних эндосом в поздние. Впервые на ультраструктурном уровне получены доказательства возвращения рецептора и плазматическую мембрану ооцита. Лиганд накапливается в поздних эндосомах, которые в ходе развития ооцита становятся желточными телами.

Принципиально важным вопросом является вопрос о поведении высокопроницаемых щелевых контактов, осуществляющих обмен между клетками ионами и метаболитами. Данные но наличию корреляции между количеством щелевых контактов и степенью связанности клеток культуры подтверждают существующую точку зрения об участии щелевых контактов в межклеточном обмене попами и малыми молекулами. Кроме того, щелевой контакт обнаружен в смешанном сенсомоторном синапсе лягушки, в котором регистрируется наличие электротонической связи. Использование ПХ для мечеппя сеисомоторного синапса лягушки позволило провести электрофизиологическое и ультраструкгурное

исследование одной и тон же пары - первичное афферентное волокно-мотопейрон и показа!ь наличие структурных коррелятов электрической и химической передачи сигнала. На примере двух-клеточной стадии простейших, сизигии грегарииы, показано, что септированный контакт, находящийся между двумя особями сизигия не участвует в межклеточной коммуникации, по т раст существенную роль в адгезии клеток._

В заключение следует отметить, что получению надежных результатов способствовало использование широкого спектра элекгронномпкроскоипческих методов. В частности, принципиально новая информация о многих этапах реакции клетки на физиологические воздействия, получена с помощью одного из наиболее современных методов электронной микроскопии - иммуиоцитохимии на срезах материала, залитого в смолу (ро.ч1си1Ьес1с1п^) и на замороженных срезах. При анализе иммунолокализашш белков в клетках методом ро51етЬес1с1тц была разработана ме тодика амплификации иммунного сигнала.

Проведенное исследование поставило ряд вопросов, требующих своего анализа в будущем. Одним из наиболее важных вопросов, связанных с механизмами траисмембранпого транспорта, является вопрос о наличии белков водных каналов, аквапорпнов, в апикальных мембранах эпителиальных клеток. В связи с этим большой интерес представляет собой изучение локализации аквапорпнов в плазматической мембране, процессов их синтеза, обработки н сортировки в аппарате Гольджи. Для разрешения проблемы создания и поддержания полярности эпителиальных клеток и участия в этих процессах транс-ссти Гольджи представляется очень важным также вопрос о локализации сигнальных молекул С-белков, участвующих, по совремемипым представлениям, в сортировке мембранных белков и их направленном транспорте к разным доменам плазматической мембраны. Обнаружение в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки специфических гранул, содержащих эпитопы тубулина, ставит вопрос о возможности депонировании мономерного тубулина в клетке и об условиях инициации его полимеризации.

7. Выводы

В результат проведенных морфо-функцнональных исследований может быть сделано несколько выводов о вкладе клеточных структур в транспортные процессы:

1) Установлено наличие корреляции между структурой апикальных мембран клеток и исходной проницаемостью эпителия: в проницаемых эпителпях большое количество ВМЧ на Р-поверхностн апикальной мембраны н малое - па Е-поверхности и инвертированное распределение ВМЧ в апикальной мембране трапулярмых клеток плотного эпителия мочевого пузыря лягушки.

2) Показано, что перенос нзоюнпческой жидкости в проницаемом и воды в плотном эпшелия.х осуществляется преимущественно трансцеллюлярным путем. Доказательствами этого являются обнаруженные в работе перестройки структурной организации апикальных мембран, сопутствующие изменениям транеэптпелиалыюй проницаемости, и отсутствие изменений в эт.х условиях структуры плотных контактов.

3) Пересмотрена существующая точка зрения об источниках водопроницаемых участков мембран, встраивающихся в апикальную мембрану гранулярных клеток мочевого пузыря лягушки в ответ на гидроосмотический стимул (воздействие АДГ, отмывка аутакоидов). Обнаружено, что не "агрефоры". а мембраны специфических гранул, формирующихся в аппарате Гольджи, сливаются с апикальной мембраной, поставляя в нее белки водных каналов, необходимых для реализации действия гормона в клетке. В миграции гранул к апикальной мембране участвуют, по-видимому, окружающие их акпшоиые филаменты.

4) Продемонстрировано участие аппарата Гольджи во внутриклеточной осморегуляции в проницаемых п плотных эпителпях. Крайним выражением этой функции являю!ся крупные вакуоли гранулярных клеток эпителия мочевою пузыря лягушки, возникающие из цистерн аппарата Гольджи в условиях больших водных потоков.

5) Получено морфологическое подтверждение участия микрофиламентов и микротрубочек в клеточном ответе плотного эпителия на пшроосмотическое действие аптидиурсгического гормона: деполимеризация кортикального актинового цитоскелета и многократное увеличение количества микротрубочек.

6) Обнаружен новый тип "толстых" мнкрогрубочек (35 им), тубулиновая природа которых идентифицирована иммупоцитохимически. Центрами организации эт.х мнкрофубочек являются специфические гранулы эпителиальных клеток, мембраны которых несут водные каналы.

7) Впервые пп олектронномпкроскопнческом уровне полностью прослежена судьба комплекса лиганд-рспептор в процессе рецептор-опосредованною эидоцитоза в ооцитах комара: обнаружены интернализация комплекса лиганд-рецептор через окаймленные ямки, диссоциация комплекса при переходе ранних эндосом в поздние и возвращение рецептора в плазматическую мембрану.

-8)—Получены—новые—подтверждения участия щелевых контактов в~ межклеточном обмене ионами и метаболитами на клеточных культурах и смешанном сепсомторпом синапсе спинного мозга лягушки. Показана корреляция между количеством щелевых контактов и степенью электрической связанности клеток.

9) Структурный анализ взаимоотношений мембран соседних клеток сизигия грегарип показал наличие в них единственного контакта септированного типа. Благодаря найденной модели удалось показать, что этот контакт не участвует и межклеточных коммуникациях, а обеспечивает лишь механическую связь между клетками.

8. Публикации но теме диссертации :

1. Сиигиревская П С. Септпрованные контакты в сизигии грегарииы ürezarinci polymorphei (Protozoaj. ДАН СССР, 1974. Т. 214, № 5: 11871188.

2. Комиссарчик >1.10., Сиигиревская П.С.. Виипичепко Л.Н., Ивановская Е.П. Роль катионов и поверхностных мембранных протеидов в адгезии паренхнмных клеток печени крысы. I. Влияние различных сроков перфузии на структуру клеточных контактов. Цитология, 1975. Т. 17, № 1: 35-41.

3. Комиссарчик Я.10., Сиигиревская Е.С.. Винниченко Л.Н., Ивановская Е.И. Роль катионов и поверхностных мембранных протеидов в адгезии паренхнмных клеток печени крысы. 11. Влияние ионов кальция на структуру клеточных контактов. Циюяогня, 1976. Т. 18, № 5: 575-579.

4. Сиигиревская П.С., Попиюва Т.В., Комиссарчик Я.Ю., Чайлахяп Л.М. Структурно-функциональное исследование септ нровапных контактов грегарпны. Цитология, 1977. Т. 19, № 4: 342-349.

5. Комиссарчик Я.10., 11аючпп Ю.В., Сиигиревская Е.С.. Винниченко Л.Н. Роль кальция в структурной и функциональной целостности плотного контакта эпителия мочевого пузыря лягушки. В кн.: Молекулярные основы структуры и функциональной активности клетки. 1978. Л.: 78-81.

6. Комиссарчик Я.10., Сиигиревская Е.С.. Шахматова Е.И., Наточин Ю.В. Электропномикроскоппческое изучение образования гликокаликса при различных функциональных состояниях клеток мочевого пузыря лягушки. Цитология, 1978. Т. 20, № 8: 891-895.

7. Сиигиревская Е.С.. Потапова Т.В., Комиссарчик Я.10., Чайлахяп Л.М. Ультраструктура специализированных межклеточных контактов в культуре L-клеток, обработанных низкими концентрациями лантана. Цитология, 1979. Т.21,№ 8: 882-887.

8.Сиигиревская Е.С., Комиссарчик Я.Ю. Ультраструктура специализированных межклеточных контактов. Цитология, 1980. Т. 22, №9: 1011-1136.

9. Komissarehik Ya.Yu., Korolev E.V., Sniniievskaya E.S. Investigation of membrane complexes of myelin and gregarine pellicle by freeze-drying and freeze-etcliing methods. Acta histochcm., 1981. Sappl. XX111: 275-281.

10. Сиигиревская E.C.. Комиссарчик Я.10., Наточин Ю.В., Шахматова Е.И. Электронномикроскопическое исследование вакуолярной системы гранулярных клеток мочевого пузыря лягушки при действии АДГ. Цитология, 1982. Т. 24, № 3: 252-256.

11. Комиссарчик Я.Ю, Паючнп Ю.В., Сиигиревская ЕС.. Шахматова Е.И. Реорганизация тубуло-вакуолярной системы клеток при стимуляции транспорта воды вазопрссспном. ДАН СССР, 1982. 'Г. 265. № 4: 999-1000.

12. Снигиревская Ii.С. Сравнительный анализ структуры вакуолярной системы гранулярных клеток мочевого пузыря лягушки и комплекса сократительной вакуоли простейших. Цитология, 1983. Т. 25, № 8: 889895.

13. Комиссарчнк Я.10., Сннгпрсвская ЕС.. Романов В.И. Анализ

.структурных_изменений апикальной мембраны и вакуолярной

системы эпителиальных клеток мочевого пузыря лягушки при стимуляции транспорта воды. Цитология. 1984. Т. 26, № 9: 1071-1072.

14. Комиссарчнк Я.Ю., Сннгпрсвская Е С.. Романов В.И., Сабинин Г.В. Анализ ультраструктурных изменений апикальной мембраны гранулярных клеток мочевою пузыря лягушки при стимулированном АДГ осмотическом потоке воды. Бнол. Мембраны, 1985. Т. 2, №6: 630-641.

15. Снш нревская Е.С.. Комиссарчнк Я.10. Рентгеновский микроанализ гранулярных клеток моченого пузыря лягушки в условиях усиленного транспорта воды. Груды Всес. Симп. "Криогенные методы в электронной микроскопии", 1984: 62-64.

16. Komissarchik Ya.Yii., Natocliiii Yu.V., Snmirevskava E.S.. Shakhmatova E.I. Specific vacuolalion of frag urinary bladder granular cell after ADH-stimulation of water transport. Gen. Physiol. Biopliys., 1985. Vol.4: 557-572.

17. Сннгиревская E.C.. Комиссарчнк Я.10. Структурно-функциональная аналогия между вакуолярной системой гранулярных клеток гранулярных клеток мочевого пузыря лягушки при индуцированном транспорте воды и системой сократительной вакуоли. Мат. Конф., посвященной 100-летию А.А.Заварзина. Цитология, 1986. Т. 28, № 10: 64-73.

18. Снигиревская Е.С.. Комиссарчнк Я.10. Обнаружение глобулярных структур, ассоциированных с мнкротрубочками, в гранулярных клетках мочевого пузыря лягушки при стимуляции транспорта воды. ДАН СССР, 1986. Т.290, № 5: 1245-1244.

19. Снигиревская Е.С.. Комиссарчнк Я.10. Анализ структурных изменений цитоскелета гранулярных клеток мочевого пузыря лягушки при стимуляции водного транспорта. Цитология, 1987. Т. 29, № 2: 150-156.

20. Комиссарчнк Я.Ю., Марголис Л.Б., Снигиревская Е.С., Шаровская 10.И., Чайлахян Л.М. Индукция высокопроницаемых контактов в культуре эпителиальных клеток. Бнол. мембраны, 1987. Т. 4, № 3: 298-314.

21. Чмыхова U.M., Шаповалов A li., Ширяев Б.И., Комиссарчнк Я.Ю., Снигиревская Е С. Ультраструктурный анализ физиологически идентифицированног о и маркированного перохеидазой хрена сенсомоторного синапса. ДАН СССР. 1987. Т. 293, № 1: 250-251.

22. Снигиревская Е.С.. Комиссарчнк Я.Ю. Изменение структуры аппарата Гольджи при стимуляции транспорта воды в эпителиальных клетках мочевого пузыря лягушки. Цитология, 1987. Т. 29, № 2: 163-169.

23. Комиссарчик Я.Ю., Романом ВН., Снигиревская Е.С.. Шахматова Е.И., Нагочнн Ю.В. Улы раструктура апикальной плазматической мембраны гранулярных клеток моченого пузыря лягушки при снижении эффекта вазопреесипа ионами кобальта. Цшологня, 1988. T.3I, № 5: 515-522.

24. Комиссарчик Я.10., Снигиревская Е.С. У.чыраструшурный анализ механизмов встраивания агрегатов внутримембранных частиц в апикальную мембрану гранулярных клеток мочевого пузыря лягушки. Бпол. Мембраны, 1990. Т. 7, № 8: 895-908.

25. Снигиревская Е С. Изменение улыраструктуры клеток вазопрессин-чувствительиых эпнтелиев при стимуляции транспорта воды. Цитология, 1990. Т.32, № 9: 766-794.

26. Комиссарчик Я.Ю., Снигиревская Е.С. Элек|ронномикросконический анализ механизмов встраивания доменов высокой водной проницаемое!пв апикальную мембрану эпителиальных клеток. Цитология, 1990. Т. 32,№ II: 1081-1087.

27. Комиссарчик Я.10., Снигиревская Е.С. Участие внутриклеточных мембран в формировании высоконроницаемых участков плазматической мембраны эпителиальных клеток при стимуляции вазопрессином транспорта воды. Цитология, 1990. Т. 32, № 11: 135-149.

28. Снигиревская Е С., Кевср JI.B., Комиссарчик Я.10. Особенности ультраструктурпой организации апикальной мембраны эпителиальных клеток, секретирующнх ионы водорода. Цитология, 1990. Т. 32, № 11: 1088-1090.

29. Снигиревская ЕС., Комиссарчик Я.Ю. Ультраструктура специализированных межклеточных контактов. Гл. в кн.: Комиссарчик Я.10., Миронов Л. Д. Электронная микроскопия клеток и тканей. 1990.

30. Комиссарчик Я.10., Снигиревская Е.С. Электропномикроскоиический анализ механизмов встраивания доменов высокой водной проницаемости в апикальную мембрану клеток мочевого пузыря лягушки. Бпол. Мембраны, 1991.Т. 8, № 11: 1216-1217.

31. Снигиревская Е С.. Комиссарчик Я.Ю. Элекчронномикросконический и иммуноцитохнмическнн анализ распределения тубулина в гранулярных

клетках мочевого пузыря лягушки при стимуляции транспорта воды вазопрессином. ДАН, 1991, Т. 320,№ 3: 721-723.

32. Комиссарчик Я.Ю.. Снигиревская ЕС.. У гол ев A.M. Анализ распределения акгпнювых филаментов » эитерошпах тонкой кишки крысы в процессе всасывания нутрпентов (иммупоэлектронномикроскопическое исследование). ДАН СССР, 1992. 'Г. 322, №4: 795-797.

33. Sniuirevskaya Г- S , Komissarcliik Ya.Yii. A novel type of microtubules in the frog urinary bladder epithelium stimulated by vasopressin. J.Submicrosc. Cytol. Pathol. 1993. Vol. 25: 389-396.

34. Korolev E.V.. Nikonov A.V.. Brudnaya M.S., Sniuirevskaya E.S., Sabinin G.V., Koniissarcliik Ya.Yii., Ivanov Р.1., Borclisenius S.N. Tubular structures of Mycoplasma ^a/liscpliciiiii and tlieir possible participation in cell motility. Microbiology, 1994,' 140: 671-681.

35. Багров Я.10., Комиссарчик Я.10., Манусова H.И., Спигиревская Е.С. Спонтанная и индуцированная проницаемость плотных контактов эпителия

мочевого "пузыр5Глягушки^(Ш(/7га)/7от/т^ 44т54.

36. Koniissarcliik Ya.Yu., Sniuiicvskaya ES. Two types of microtubules in the IVog urinary bladder epithelium stimulated by vasopressin. In: Proc. of Fourth Europ. Congress of Cell Biology (Prague). Cell Biol.Intrnat., ISSN, 1994:1065-1066. Vof 18: 437.

37. Koniissarcliik Ya.Yu., Snimrcvskava E.S. linmunocytochemical analysis of microtubules in frog urinary bladder epitlieliocytes. In: ICEM-13 Proc. (Paris), 1994:47-48.

38. Ugolev A.M., Koniissarcliik Ya.Yu., Gromova L.V., Grusdkov A.A., SnitHrevskava E.S.. Brudnava M.S. Structural and functional analysis in glucose absorption mechanism in the rat small intestine in vivo. Gen. Physiol. Biophys. 1995, Vol. 14: 405-417.

39. Сннгнревекая E.C.. Комиссарчик Я.10. Морфо-функциональный анализ изменений аппарата Гольджп в эпитслиоцптах мочевого пузыря лягушки

при вазопрессин-стимулируемом транспорте воды. Цитология, 1995. Т. 37,№ 12: 1216-1222.

40. Комиссарчик Я.Ю., Наючпн 1С).В., Шахматова Е.И., Брудная М.С., Спигиревская Е.С.. Королев Е.В., Парнова РГ. Особенности ультраструктуры клеток эпителия мочевого пузыря лягушки при действии вазопрессипа и при вазопрессии-псзависимом увеличении проницаемости для воды. Цитология, 1996. Т.38, № 1:14-27.

41. Комиссарчик Я.10., Макареикова Е.В.. Спигиревская Е.С.. Шахматова Е.И., Брудная М.С., Нагочип 10.В. Исследование ультраструктуры апикального цитоскелета клеток эпителия мочевого пузыря лягушки при АДГ-зависимом п независимом увеличении водной проницаемости. Цитология, 1996. Т. 38, № 9: 927-933.

t 42. Natochin Y.V., Parnova R.G., Schakhinatova Е.1., Koniissarcliik Ya.Yu., Brtidnaya M.S., Sniuirevskaya U.S. AVP-indepcndent liigli osmotic water permeability of frog urinary bladder and autocoids. Pflugers Arch. Eur. J. Physiol., 1996. Vol.433: 136-145.

43. Snmirevskava E.S.. Hays A.R., and Raihkel A.S. Secretory and internalization pathways of mosquito volk proteins. Cell & Tissue Res., 1997. Vol. 290: 129-142.

44. Sniuirevskava E.S.. Sappington T.W., and Raikhel A.S. Internalization and recycling of vitellogenin receptor in mosquito oocytes. Cell & Tissue Res., 1997. Vol. 290: 175-183.

45. Kokoza V.A., Snimrevskava E.S.. and Raikhel A.S. Clathrin heavy chain; analysis of the cDNA and developmental expression in the mosquito oocytes. Insect Molecular Biology. 1997. Vol. 6: 1-12.

46. Raikhel A.S., and Sniuirevskava E.S. Vitellogenesis. In: Microscopic Anatomy of lnvertebtares. Insecta. (F.W.I larrison and M.Locke, editors). 1998.Vol. 11C: 933-955, Wiley-liss, Inc.

Благодарности.

Прежде всего мне хочется с глубокой признательностью вспомнить недавно ушедшего из жизни Виктора Федоровича Машанского, в течение многих лет возглавлявшего нашу лабораторию и создавшего в ней творческую и демократическую обстановку. С большой благодарностью я вспоминаю также совместную работу с такими крупными учеными, как А.М.Уголев, А.И.Шаповалов и П.П.Румянцев.

Мне хочется сердечно поблагодарить Якова Юрьевича Комиссарчика, который 25 лет назад увлек меня исследованиями структурных основ функционирования клетки и совместная работа с которым продолжается и в настоящее время.

Я приношу свою искреннюю благодарность моим коллегам и соавторам по совместной работе: Ю.В.Наточину, Е.И.Шахматовой, Р.Г.Парновой, М.С.Брудной, Е.В.Королеву, А.А.Груздкову, Л.В.Громовой, Л.М.Чайлахяну, Ю.Б.Шаровской, Т.В.Потаповой, А.П.Погорелову, а также А.С.Райхелю (США), в лаборатории которого мне посчастливилось работать в последние годы.

Мне хочется сердечно поблагодарить Георгия Владимировича Сабинина за помощь в выполнении иллюстративной части работы.

Моя искренняя благодарность директору нашего Института Н.Н.Никольскому и всем сотрудникам за атмосферу доброжелательности и свободы научного творчества, которая сохраняется со времен А.С.Трошина, при котором я начала работать в Институте.

Содержание

1. Общая характеристика рабопл....................................................1

1.1. Актуальность проблемы............................................................1

1.2. Цель и задачи исследовании ....................................................2

1.3. Научная новизна рабом.1.........................................................2

1.4. Научно-нракшческое значение работы ..................................3

1.5. Положения, выносимые назащшу.........................................3

1.0. Апробация работы...................................................................4

1.7. Публикации...............................................................................5

2. Материал и методы......................................................................5

2.1. Стандартные методы элсктрониомпкроскопического

исследования...........................................................................5

2.2. Криометоды..............................................................................6

2.2.1. Замороженные ультраюнкнс срезы..................................7

2.2.2. Метод замораживания-замещения....................................7

2.2.3. Метод заморажпвапня-скалыванпя..................................7

2.2.4. Сканирующая электронная микроскопия.........................7

2.2.5. Рентгепо-спектральный анализ........................................7

2.3. Иммунная электронная микроскопия.....................................8

2.3.1. Иммуноцитохимическне реакции на ультратонких срезах

материала, залитого в смолы и на замороженных срезах... 8

3. Барьерная роль транспортирующих эпителиев в диффузии веществ между внешней средой н ннтерстицпалыюп жидкостью...! 1

3.1. Морфологические изменения проницаемых эпителиев при различных физиологических нагрузках................................... 11

3.1.1. Постановка экспериментов............................................... 13

3.1.2. Барьерная роль плотных контактов в печени крысы...... 14

3.1.3. Особенности структуры эпителия тонкой кишки крыс ...15 3.1.4. Структурные изменения плазматической мембраны

энтероцитов при всасывании путрисптов.......................17

3.1.5. Особенности структуры аппарата Гольджи энтероцитов в

контроле и при всасывании глюкозы................................................18

3.1.6. Анализ распределения Р-акшна в апикальной области

энтероцитов.........................................................................................19

3.1.7. Заключение..........................................................................20

3.2.Проницаемость плотного эпителия мочевого пузыря амфибий для воды.........................................................................................23

3.2.1. Постановка физиологического эксперимента...................25

■ 3.2.2. Особенности структурной организации мембран с низкой

водной проницаемостью....................................................26

3.2.3. Динамика изменении структуры апикальной мембраны клеток плошы.ч эшпелнеи при действии ЛДГ и многократной смены раствора Рипгера................................27

3.2.4. Состояние вакуолярной системы клеток, участвующей в стимулируемом АДГ транспорте воды.....................................30

3.2.5. Участие цптоскелета во внутриклеточном транспорте воды...........................................................................................33

3.2.6. Заключение........................................................................35

4.Поглощение питательных вещееiв клеткой посредством реиептор-опосредоваппого эндошпоза...........................................................41

4.1. Постановка экснернмешов......................................................41

4.2. Судьба комплекса рецептор-вптеллогепин на ранних стадиях эндоцитоза......................................................................................42

4.3. Диссоциация комплекса лнгапд-рецепюр и возвращение рецептора в плазматическую мембрану........................................43

4.4. Заключение.............................................................................44

5.Участие специализированных межклеточных контактов в межклеточном обмене попами и метаболшамп........................................................46

5.1. Постановка экспериментов....................................................48

5.2. Высокопроппцаемый комнопеш сепсомоторного синапса лягушки............................................................................................49

5.3. Усиление межклеточного обмена в культуре L-клеток при обработке лантаном..............................................................................................51

5.4. Индукция высокопронпцасммх контактов в культуре эпителиальных клеток...................................................................................................52

5.5. Струюура и функция септ ироваиных контактов грегарин . 55 5.6.Заключение................................................................................56

6.Общее заключение...........................................................................58

7.Вывод ы............................................................................................63

8. Публикации по теме диссертации.................................................65