Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ультраструктурные основы трансэпителиальной проницаемости

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Снигиревская, Екатерина Сергеевна, Санкт-Петербург

Работа выполнена в Институте цитологии РАН.

Официальные оппоненты:

академик,профессор Л.Н.ИВАНОВА Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

члеи-корр. РАМН,профессор В.А.ОТЕЛЛИН, НИИ экспериментальной медицины РАМЫ, С-Петербург

доктор биол. наук, С. А. КРОЛЕНКО, Институт цитологии РАН С.-Петербург

Ведущее учреждение - И биохим"!* ИМ. И.М.С

"1ЦИОННОЙ физиологии и . С.-Петербург

Защита состоится « Диссертационного

по адресу: ? 940и-

!3 часов на заседании л гута цитологии РАН ихорецкий пр., 4

С диссертаци

блиотеке Института

Автореферат разослан IV октября 1997

г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биол. наук

У л

Л.Н.ПИСАРЕВА

41 о / л, ...

у / -

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Институт цитологии

н.1 пр:ш;!\ рукописи УДК 5*2.232-576.316:576.353.7

СИ11П1РЕНСКАЯ 'Л1 Г' ^

Екатерина Сергеевна нд

УЛЫРАСТРУК1 УРПЫЕ ОСНОВЫ ТРАНСЭШПЕЛНАЛЬНОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ (трансцеллюлярпый н парацеллюлярпым транспорт веществ)

па соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Санкт-Петербург 1997

1. Общая характеристика работы

1.1 Актуальность проблемы

Эпителии представляют собой наиболее ярко выраженный тип тканей, сформированных полярными клетками. Выстилая полости всех внутренних органов и механически защищая их, эпителии регулируют гомеостаз ионов, неэлектролитов и воды в разных компартментах организма и участвуют в продукции экстрацеллюлярных компонентов тканей. Проблема трансэпителиальной проницаемости является одной из центральных фундаментальных проблем клеточной биологии. Несмотря на то что процессы транспорта веществ через различные эпителии исследуются уже со второй половины XIX столетия, до сих пор в этой проблеме остается много спорных вопросов, решение которых важно не только для фундаментальной науки, но и для ряда медицинских проблем. Для объяснения механизмов транспорта питательных веществ, воды и ионов в желудочно-кишечном тракте и в осморегулирующих органах млекопитающих предлагались альтернативные точки зрения (трансцеллюлярный пли парацеллюлярный путь транспорта), поочередно доминирующие в литературе в зависимости от получения новых фактов.

Большой прогресс в понимании путей и механизмов трансэпителиального транспорта был сделан за последние 30 лет. Сочетание современнных физиологических и морфологических подходов позволило до некоторой степени приблизиться к разрешению ряда вопросов. Так, были открыты явления рецептор-опосредованного эндоцитоза для поглощения макромолекулярных питательных веществ (Goldstein et al., 1985); примембранного пищеварения в тонкой кишке млекопитающих (Уголев, 1962); расшифрованы на биохимическом уровне механизмы регуляции вазопрессином транспорта воды в плотных эпителиях (см. Иванова, Наточин, 1987); открыто явление межклеточной коммуникации (Loevvenstein, Kanno, 1964); обнаружены белки водных каналов - аквапорины (Agre et al., 1993) и каналов, осуществляющих межклеточный обмен ионами и метаболитами - коннексины (Goodenough, Musil, 1993). Однако, многие вопросы о морфологических путях транспорта веществ через эпителии еще ждут своего разрешения.

Экспериментальная стимуляция транспорта веществ через различные кани дает возможность изучать процессы, связанные с поглощением и переносом веществ через клетку, такие, как рецепция лиганда, проведение •.•-папа через плазматическую мембрану и через клетку, ответ клетки на i физиологические воздействия. Эксперименты, позволяющие дозировать i нагрузку и количественно регистрировать всасывание и транспорт расследуемых веществ, обеспечивает проведение структурных исследований |в строго определенных физиологических условиях.

В настоящее время в мире существует всего несколько исследовательских групп, занимающихся структурно-функциональным анализом транспортирующих эпителиев ( группа проф. Бурге во Франции, группы проф. Хепса, проф. Венда и проф. Панпенгеймера в Америке). Каждая из этих групп занимается изучением одного типа эпителия с применением одного-двух методов элекгронной микроскопии. В связи с этим представляется актуальным комплексный подход к изучению проблемы проницаемости эпителиев с использованием разных объектов исследования и широкого спектра многообразных структурных методов.

1.2. Цель и задачи исследовании

Целью настоящей работы было выявление путей транспорта различных веществ (мало- и крупномолекулярных питательных веществ, изотонической жидкости, воды) через разные типы эпителиев (проницаемые и плотные), клеточные культуры , ооциты насекомых, клетки простейших.

Для решения проблемы трапеэпителнальной проницаемости был поставлен ряд задач:

1) изучить роль апикальной мембраны полярных эпителиальных клеток и плазматической мембраны одиночных клеток - ооцитов при стимуляции транспортных процессов;

2) оценить вклад межклеточных контактов в транспорт веществ между соседними клет ками и через эпителиальные слои;

3) исследовать участие внутриклеточных органелл - элементов цитоскелета и вакуолярной системы клеток в трансцеллюлярном транспорте веществ;

4) проследить судьбу комплекса лиганд-рецептор в процессе вителлогенеза ооцита комара.

1.3. Научная новизна работы

Впервые проведено сравнительное исследование апикальных мембран двух типов эпителия: проницаемого - тонкой кишки крыс и плотного - мочевого пузыря лягушки и установлены существенные различия в их струкгурной организации.

Получены абсолютно новые данные о возможности стимуляции водных потоков в плотном эпителии мочевого пузыря лягушки не только антидиуретическим гормоном, но и отмывкой из эпителия физиологически активных веществ липидной природы, аутакоидов, способствующих сохранению низкого уровня водной проницаемости мочевого пузыря в норме. При стимуляции водного транспорта обоими способами обнаружены одни и те же изменения апикальной мембраны, свидетельствующие о встраивании в неё доменов с высокой водной проницаемостью.

Получена новая информация о перераспределении мембранных белков апикальной мембраны полярных клеток проницаемого и плотного эпителиев при стимуляции транспортных процессов через эпителии.

Впервые на электронномикроскопическом уровне полностью прослежена судьба комплекса лиганд-рецепгор при поглощении питательных веществ развивающимися ооштгами комара, в частности, продемонстрированы процессы диссоциации рецептора и лиганда и возвращение рецептора в плазматическую мембрану ооцита.

Параллельные морфологические и физиологические исследования явления межклеточной коммуникации позволили обнаружить увеличение количества щелевых контактов при индукции межклеточной связи в клеточных культурах и наличие их в смешанном сенсомоторном синапсе лягушки.

Впервые на объекте, обладающем лишь одним типом специализированных межклеточных контактов, сизигии грегарин, показано, что септировапный контакт не участвует в межклеточной связи, а играет адгезионную роль.

1.4. Научно-практическое значение работы

Полученные в настоящей работе данные по структуре клеточных мембран, специализированных межклеточных контактов и внутриклеточных органелл в условиях всасывания и транспорта различных веществ разными типами клеток вносят существенный вклад в решение фундаментальной проблемы клеточной биологии - трансэлителиальной проницаемости. Обнаруженные изменения ультраструктуры исследуемых клеток дают новый уникальный материал для вскрытия механизмов трансмембранной, трансцеллюлярной и межклеточной проницаемости.

Наряду с общебиологическим значением представленные результаты могут быть использованы в учебных целях и в медицине при исследовании функциональных нарушений проницаемости пищеварительных и осморегулирующих органов. Известно, что в основе многих патологических изменений функций органов лежат нарушения в клеточном ответе на регуляторные факторы, выражающиеся в изменениях ул ьт ра стру к I-)' р ы к л сто к.

Изучение особенностей развития ооцитов комара открывает новые возможности для разработки биологических методов борьбы с комарами, являющимися переносчиками ряда заболеваний, на ранних стадиях их развития.

1.5. Положения, выносимые на защит}'

1) Проведенный в работе сравнительный анализ изменений ультраструюуры основных барьеров проницаемости эпителиев: апикальной мембраны и плотных контактов позволил высказать предположение о том,

что основной путь транспорта веществ через проницаемые и плотные эпителии - трансцеллюлярный, а вклад парацеллюлярного пути очень мал.

2) В работе высказано предположение об участии аппарата Гольджи в регуляции клеточного объема при транспорте изотонической жидкости и воды через проницаемые и плотные эпителии.

3) Постулируется участие специфических гранул эпителиальных клеток, формирующихся в аппарате Гольджи во встраивании белков водных каналов в апикальную мембрану.

4) Отмечается существенная роль микрофиламентов и микротрубочек в ответе клеток плотного эпителия на гидроосмотическое действие гормона.

5) В работе оценивается участие межклеточного пространства в транспорте изотонической жидкости и воды в проницаемых и плотных эпителиях - минимальная проницаемость зоны плотных контактов и проведение потоков жидкости в кровь по латеральным межклеточным щелям;

6) Анализируются особенности рецептор-опосредованного эндоцитоза в ооцитах комаров: иитернализация комплексов лиганд-рецептор через окаймленные ямки, диссоциация комплексов при переходе ранних эндосом и поздние, возвращение рецептора в плазматическую мембрану, накопление лиганда в желточных телах.

7) Обсуждается корреляция между количеством щелевых контактов и степенью связанности клеток.

8) Функция септированного контакта ограничивается участием в адгезии клеток.

1.6. Апробация работы

Материалы работы доложены или представлены на VIII- XVI Всесоюзных (Российских) конференциях по Электронной Микроскопии (1971, 1976,1982, 1988, 1992, 1996), съездах АГЭ (1972, 1981) ; на ХШ Междунар. Копф. по Электронной Микроскопии (Париж, 1994); на VI и VIII конф. по "Водно-солевому обмену и функции почек" (1981, 1990); на Всесоюзных съездах протозоологов (1976), физиологов (1983); на Междунар. Конф. "Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины" (1988); Междунар. Симп. "Межклеточная коммуникация» (1994); на научных семинарах в Сиенском Университете (Италия, 1991), Бернском Университете (Швейцария, 1991), на 4-х семинарах в Мичиганском Университете (США, 1994,1996); доклады на семинарах Института цитологии.

1.7. Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 46 статей, в том числе 2 обзора, глава в монографии Комиссарчика Я.10. и Миронова А.А. «Электронная микроскопия клеток и тканей: замораживание-скалывание-травление», 1992, глава в атласе «Microscopic Anatomy of Invertebrates» и около 30 тезисов.

2. Материал и методы

В настоящей работе представлен анализ изменений ультраструктуры клеток двух типов эпителиев при различных физиологических воздействиях: проницаемого эпителия тонкой кишки крысы и плотного эпителия мочевого пузыря лягушки. Морфологические особенности поглощения макромолекулярных питательных веществ исследовались на ооцптах комара, межклеточной коммуникации на клеточных культурах (L и FBT), сенсомоторном синапсе спинного мозга лягушки и двухклеточной стадии жизненного цикла простейших грегарин - сизигии.

Наряду со стандартными методами электронной микроскопии в настоящей работе были использованы следующие методы ультраструктурного анализа: замораживание-скалывание, замораживание-замещение, замораживание-высушивание, низко-температурная заливка в акриловые смолы, иммунная электронная микроскопия на срезах материала, залитого в различные смолы (postembedding) и на ультратонких замороженных срезах, рентгеноспектральный анализ.

Ультратонкие срезы и реплики, полученные методом замораживания-скалывания просматривались в просвечивающих электронных микроскопах JEM-7, JEM-100U, JEM-100C; JEM-100CX, Pliilips-CMIO; поверхность клеток изучалась в сканирующем микроскопе JSM-35; для рентгеновского микроанализа использовался сканирующий электронный микроскоп JSM-U3.

Описание использованных физиологических методов приводится а разделах соотвествующих глав "Постановка экспериментов". 2.(.Стандартные методы элсктроппомнкросгсопнческого исследования применялись для изучения особенностей морфологии клеток и тканей. Они включали в себя фиксацию материала 2,5% раствором глютар-альдегида, постфиксацию 1% раствором OsO^, дегидратацию в спиртах повышающейся концентрации и заливку в эпоксидные смолы.

В настоящей работе для приготовления фиксаторов использовались веронал-ацетатный, какодилатный и фосфатный буферы с рН - 7,2-7,4 и тоничностыо, соответствующей осмоляльности интерстициальной жидкости исследуемых объектов. Фиксация быстро вырезанного кусочка ткани анестезированного животного производилась при комнатной

температуре (К Г), сначала глютар-альдегидом и течение 40 мин-1 ч, потом OsO.1 - в течение 1 ч. После продолжительной дегидратации (1,5-2 ч) и пропитки в заливочной среде материал заливался в Аралдит, Эпон, смесь Аралдита с Эпопом или LR-White. Полимеризация эпоксидных и акриловых смол осуществлялась в термостате при + 58-60°С в течение 2-х суток. Ультрагонкие срезы материала, залитого в смолы, приготавливались на ультрамикротомах LKB 8800 и Reihert-Jimg стеклянными и алмазными ножами. Срезы из эпоксидных смол окрашивались сначала спиртовым раствором уранил-ацетата (¡0 мин), затем цитратом свинца по Рейнолдсу (5 мин). Срезы материала, залитого в акриловые смолы, окрашивались водным раствором уранил-ацетата (5 мин) и цитратом свинца (1-2 мин).

2.2. Криометоды. В связи со сходством ряда процедур все использованные в работе низкотемпературные методы объединены в группу криометодов.

2.2.1. Замороженные ультра топкие срезы использовались для целей иммуно-локализашш клеточных белков. Перед криофиксацией делалась предварительная префиксация материала 2% раствором формальдегида с добавлением 0,05% глготар-альдегида в течение 30-40 мин при комнатной температуре. Для предотвращения образования кристаллов льда в клетках объекты пропитывались растворами сахарозы повышающейся концентрации (0,5, 1,5, 2,3 M сахарозы) при +4°С на мешалке в течение суток. Криофиксация осуществлялась самым простым способом -быстрым погружением кусочков материала, закрепленных на держателях, в пропан, охлажденный до температуры -190°С жидким азотом. Образцы могут храниться в жидком азоте в течение нескольких месяцев. Замороженные срезы приготавливались сухими стеклянными ножами при -90°С по методу Tokuyasu, 1986. Оптимальный угол наклона ножа 6°, оптимальная скорость резки 2 мм/сек. Перед резкой замороженный объект с держателем затачивался в камере микротома охлажденным металлическим стержнем. Срезы с сухой поверхности ножа снимались тонкой металлической петлей (диаметр - 2мм), содержащей каплю 2,ЗМ сахарозы, и монтировались на покрытую пленкой никелевую сеточку. Сетки со срезами помещались на поверхность 2% желатины, залитой в чашку Петри, и хранлись в холодильнике. Перед проведением иммуноцитохимической реакции сахароза отмывалась инкубацией срезов в ФБ при КТ. Контрастирование замороженных срезов отличается от такового срезов смолы. Их окрашивание производилось в два этапа: 1) 1 ч в нейтральном 2% растворе уранил-ацетата, содержащем 0,15 M оксалата калия (рН 7,2 доводится 10% аммиаком), 2) срезы промывались водой и переносятся в 2% кислый уранил-ацетат (рН 5,8), содержащий 1,8% метил-целлюлозу.

2.2.2. Метол замораживания-замещения, сочетающий криофиксациго материала и его заливку в смолы, способствует хорошей сохранности как ультраструктуры клеток, так и антигенных свойств его химических компонентов. В качестве криофиксации в настоящей работе была использована методика быстрого замораживания объекта на охлажденном металлическом блоке (зеркале). Объекты могут храниться в жидком азоте длительное время. При таком способе замораживания 5-10 мкм поверхности ткани, контактирующей с зеркалом, практически не содержат видимых в электронном микроскопе кристаллов льда. После криофиксации производилось замещение верифицированной воды раствором ацетона, содержащем OsOA при -95°С в течение 3-х дней. Затем ткань медленно согревали до комнатной температуры (КТ) и заливали в одну из смол.

2.2.3. Метод замораживания-скалывания. Для предотвращения образования в ткани кристаллов льда мы использовали предварительную химическую фиксацию объекта пногар-альдегидом и его пропитку 25% глицерином. Объект замораживался в золотом держателе, после чего помещался в установку с высоким вакуумом, где раскалывался при температуре -150°С и напылялся углем и платиной. Все эти процедуры проводятся в высоком вакууме при температуре жидкого азота. После растворения ткани ги