Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электрогенез в невозбудимых многоклеточных системах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Асланиди, Константин Борисович, Пущино

инсти/гут"' Ш01%т§£(аО |/ БИОФИ,

(решение

IX рукопиби

Г., № ^

На

Константин Борисови

ЭЛЕКТРОГЕНЕЗ В НЕВОЗБУДИМЫХ МНОГОКЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМАХ

03.00.02 - Биофизика

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

ПУЩИНО 1998

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук, профессор

Ф.И.Атауллаханов

Доктор физико-математических наук, профессор

Ю.М.Романовский

Доктор биологических наук, профессор

Л.С.Ягужинский

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ - Институт цитологии РАН,

г. Сан кт-П етер бу р г

Защита состоится с^-а 1998 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д200.22.01 Институте

теоретической и эксперир г " й АН по

адресу: 142292, Московсг г . ,Н.

С диссертацией в; можно

ознакомиться в библ1 <». ..кой и

экспериментальной биос

Диссертация в виде научног о д. , ,

1998г.

ГОСУДД РСШьНЬ БИБЛИОТЕКА

ННДЯ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По современным представлениям живая клетка является открытой неравновесной термодинамической системой, пространственная структура которой поддерживается потоком энергии из внешней среды (Haken. 1978, Caplan, Essing.1983). Материальным эквивалентом потока энергии в гетеротрофной клетке являются потоки метаболитов через плазматическую мембрану. Молекулярные механизмы, осуществляющие сопряженный перенос метаболитов и неорганических ионов через плазматическую мембрану, были постулированы в 1961 году. Фактически Крейн и Митчелл независимо разработали гипотезу сопряженного транспорта Сахаров: Na+/ глюкоза котранспорт в животных клетках (Crane et al.1961) и Я+ /галактоза котранспорт у Escherichia coli (Mitchell. 1961), - положившую начало хемио-осмотической концепции в биоэнергетике. Развитие принципа энергетического сопряжения и открытие проницаемых контактов (ПК) между электроневозбудимыми клетками (Loewenstein, Kanno,1964) позволили предположить существование принципиально новых механизмов кооперативного поведения многоклеточных систем (Беркинблит и др. 1981 ).

К началу наших исследований существовало представление В.П. Скулачева (1978) о том, что "А/хМа может использоваться в качестве транспортабельной формы энергии, перемещающейся вдоль внешней мембраны клетки и даже от одной клетки к другой через так называемые щелевые контакты внешних клеточных мембран", а также первые экспериментальные подтверждения этого феномена, полученные на трихомах цианобактерий (Chailakhyan et al.1982). Однако соответствующие экспериментальные результаты для эука-риот отсутствовали; помимо этого, не были сфорулированы ^вические принципы энергетического взаимодействия кон-•ггирующих клеток посредством ионных потоков через проницаемые контакты. Отсутствовали и достаточно общие л^едставления о связи мембранного электрогенеза различных многоклеточных систем с метаболизмом отдельных кле-Ьк. Экспериментально не была продемонстрирована функциональная и метаболическая гетерогенность отдельных кле-;ж в популяции.

Решению этих проблем и посвящена диссертация.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании роли межклеточных электрохимических взаимодействий в самоорганизации невозбудимых многоклеточных систем, связанных проницаемыми контактами. В процессе проведенной работы были решены следующие задачи:

• На ансамблях клеток различных организмов экспериментально продемонстрирована возможность межклеточных энергетических взаимодействий посредством ионных потоков через проницаемые контакты.

• Сформулированы основные принципы упомянутых взаимодействий и на основе этих принципов построены математические модели самоорганизующихся клеточных ансамблей.

• Разработаны модели ионно-осмотического гомеостаза животных клеток, связанных через проницаемые контакты.

• Экспериментально зарегистрирована функциональная и метаболическая гетерогенность отдельных клеток в макроскопически однородных многоклеточных ансамблях.

• Проанализированы возможные механизмы надклеточной самоорганизации.

Объекты. Для выявления общих закономерностей самоорганизации многоклеточных систем были отобраны таксоно-мически различные объекты, далеко отстоящие друг от друга в филогенетическом плане. В качестве основных объектов в работе использовались трихомы синезеленных водорослей Anabaena variabilis ( АТСС 29413 ) и Phormidium uncynatum, два штамма мицелиальных грибов Neurospora crassa (R-2 и WC-1), а также несколько линий культивируемых клеток млекопитающих (первичные эмбриональные фибробласты человека и мыши, фибробластоподобные клетки хомяка ВНК-21, клетки глиомы крысы С-6, трансформированные клетки эпителия почки собаки М DC К, трансформированные человеческие кератиноциты SVK14, клетки почки мартышки Vero.). Метаболическая гетерогенность отдельных клеток, кроме перечисленных объектов, исследовалась на листьях и корневых волосках разных видов высших растений, на различных водорослях обрастания, на клетках асцитной гепатомы Зайделя

и асцитной опухоли Эрлиха, а так же на глиальных клетках в органотипической культуре мозга 1 -3 дневных крыс.

Методы. В работе использовались различные модификации стандартных и специально разработанных электрофизиологических методов, известные и вновь разработанные методы микроспектрального анализа, пламенно-эмиссионный анализ, компьютерные методы анализа и обработки изображения микрообъектов, а также методы математического моделирования.

Научная новизна. Работа является первым систематическим исследованием, в котором на широком круге объектов, включая цианобактерии, мицелиальные грибы и клетки млекопитающих, формализованы правила самоорганизации невозбудимых многоклеточных систем, связанных проницаемыми контактами.

Новизна использованного системного подхода заключается в совмещении электрофизиологических методов регистрации мембранных потенциалов отдельных клеток или внеклеточных электрических токов, компьютерных методов анализа изображения, позволяющих определять геометрические размеры и кинетику их изменений для различных многоклеточных систем, методов микроспектрального анализа, выявляющих локальную биохимическую специализацию отдельных клеток, а также методов математического моделирования клеточного синцития в виде распределенной эквивалентной электрической схемы соответствующей геометрической размерности, что позволяет связать значения пространственных параметров клеточной системы с электрическими характеристиками плазматических мембран и межклеточных проницаемых контактов.

Научно-практическая значимость работы обусловлена возможностью применения полученных в ней результатов в дальнейших теоретических и экспериментальных исследованиях потоков веществ и энергии в отдельных клетках и тканях.

Разработанные методы могут использоваться для решения прикладных задач в медицине.биотехнологии и охране окружающей среды:

• метод регистрации спектральных характеристик поглощения и флуоресценции клеток и их органел в температурном диапазоне 77-300 К при различных режимах охлаждения и нагревания;

• метод определения устойчивости клеток и клеточных органел к развитию перекисного стресса, основанный на выделении сигнала флуоресценции продуктов перекисного окисления липидов;

• метод определения функционального состояния растений по спектрам флуоресценции хлорофилла.

Кроме того, полученные результаты определяют диапазон оптимальных размеров фрагментов трихомов водорослей, гиф мицелиальных грибов и колоний животных клеток, обуславливающих максимальую скорость прироста биомассы при культивировании в промышленных условиях.

Апробация работы Результаты работы были представлены на International symposium "Functions of neurogllia", Tbilisi, 1984, I Всесоюзном совещании "Биофизика рака", Черноголовка, 1987, III Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение", Юрмала, Латвия, 1988, ill Всесоюзной конференции по морской биологии, Севастополь, 1988, V Всесоюзном съезде геронтологов и гериатров, Тбилиси, 1988, IV Всесоюзном съезде патофизиологов, Кишинев, 1989, International conference "Regulation of free radical reaction", Varna, Bulgaria, 1989, XIX FEBS Simposium, Roma, 1989, IV International Mycological Congress, Regensburg, Germany, 1990, Workshop on Cellular Networks, Palanga, Lithuania, 1992, International Meeting on Gap Junction, Hirosima, Japan, 1993, Fourth European Cell Biology Congress, Prague, Czech Republic, 1994, V International Mycological Congress, Vancouver, Canada, 1994, Symposium on Intercellular Communication, Pushchino, 1994, International symposium "Biological Motility", Pushchino, 1994, International symposium "Criteria of Self-organization in Physical, Chemical and Biological Systems", Suzdal, 1995, Pushchino workshops on nonlinear models of the membranes, "Bioferroelectricity and related phenomena", Pushchino, 1995, XIV Рабочем совещании "Консервация генетических ресурсов", Пущино, 1996г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 37 статей. 4

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ МЕМБРАННОГО ТРАНСПОРТА И АДАПТАЦИОННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ МНОГОКЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМ

В этой главе приведены результаты анализа изменений мембранных потенциалов отдельных клеток и внеклеточных электрических токов, возникающих в многоклеточных системах благодаря ионным потокам через ПК, при экспериментальных воздействиях.

1.1. Блокада активного транспорта у части клеток в многоклеточной системе

В качестве объекта, допускающего экспериментальную блокаду активного транспорта у части клеток в многоклеточной системе, были выбраны смешанные культуры животных клеток с различной чувствительностью к уабаину. Выбор этой экспериментальной модели был определен уникальной резистентностью клеток грызунов к этому растительному гли-козиду и их способностью образовывать гетеротипные ПК с клетками других млекопитающих (Согзаго,М1деоп.1977).

До начала наших исследований было известно, что чувствительные к уабаину клетки, при культивировании с клетками грызунов, выглядели нормально и оставались на стекле через сутки после обработки уабаином только в том случае, если чувствительные клетки примыкали непосредственно к уабаинрезистентным клеткам (Потапова, Фетисо-ва.1981).

Поддержание ионно-осмотического гомеостаза животных клеток при блокаде ионных насосов. Исследовались чистые и смешанные культуры первичных эмбриональных фибробластов человека и мыши, фибробластопо-добные клетки хомячка линии ВНК-21, клетки крысиной глиомы линии С-6, трансформированные клетки почечного эпителия собаки линии МОСК.

Оценка диффузионного обмена через ПК проводилась по изучению перетекания флуоресцирующих красителей между клетками. Все исследованные клеточные линии образуют в смешанной культуре хорошие гетеротипные контакты. Во всех исследованных культурах диффузионная связь увеличивалась с ростом плотности клеток. Наиболее эффективной

оказалась связь между клетками человека и хомячка. При оптимальной плотности смешанной культуры (44- 104 клеток/см2 ) до 83% инъекцированных клеток были диффузионно связаны с клетками своего или другого типа. Электрические взаимодействия через ПК оценивались по изменениям величины мембранного потенциала при образовании гетеротипных ПК и после 2 часов инкубации в присутствии 1 мкМ уабаина. Величину мембранного потенциала определяли с помощью внутриклеточного стеклянного микроэлектрода.

¿ Чисп1ь1с куньтуры

Щ.

■31 ±1 -3711

20 60 го во

-51*2

То

20 60 мВ

Смешанные культуры

гогГцт-г

10

-чпг

аЛ

-40*2 -5Д4.7

20 60 20 60

го 60 го. 60 м»

-10*?

-ЧП2

го ьа го б в

го 60 го 60 ив

Рис.1.1. Зависимость величины мембранного потенциала от обработки уабаином (1мкМ, 2 ч) для клеток человека (косая иггриховка), собаки (горизонтальная штриховка) и хомячка (светлые столбцы) в чистых и смешанных культурах. По горизонтали - мембранный потенциал. По вертикали - число клеток. Над каждой гистограммой указано среднее значение мембранного потенциала и стандартная ошибка.

Как следует из гистограмм, представленных на рис.1.1., средняя величина мембранного потенциала фибробластов человека, непосредственно примыкающих к клеткам ВНК-21 в смешанной культуре, превысила значение, характерное для

чистой культуры (-38± 1мВ), и составила -47±2мВ, что идентично значениям мембранного потенциала клеток хомячка, контактирующим с человеческими фибробластами. После 2 ч обработки уабаином среднее значение мембранного потенциала фибробластов человека, контактирующих с клетками хомячков, составило -37±2мВ, а клеток ВНК-21 - 42±2мВ.

На смешанных культурах трансформированных клеток почечного эпителия собаки МйСК и ВНК-21, плохо образующих связь через гетеротипные проницаемые контакты, описанный эффект не проявлялся. Действие уабаина на смешанных культурах приводило к деполяризации клеток собаки от -40±2 мВ до уровня -18±2 мВ, что однако, меньше уровня деполяризации этих клеток в чистой культуре (-8+1 мВ). Внутриклеточное содержание ионов определяли методом пламенно-эмиссионной фотометрии. Результаты приведены в таблицах 1.1 и 1.2.

Таблица 1.1

Влияние 1мкМ уабаина на содержание ионов [К\\ и [А!а\ в клетках человека и грызунов

Тип культуры Плотность культуры х 104 клеток/ см2 Контроль Уабаин

га,- мМ/г белка мМ/г белка [К],- [АЧ [К]/ мМ/г белка [АЧ- мМ/г белка [А-[ЛЧ-

Человеческие фибробласты 3.5 0.76 0.14 5.3 0.24 0.58 0.4

Человеческие фибробласты 4.0 0.76 0.17 4.3 0.27 0.63 0.4

Человеческие фибробласты 8.0 0.65 0.14 4.8 0.15 0.96 0.2

Фибробласты мыши 12.0 . 0.72 0.12 6.1 0.68 0.11 6.3

Фибробласты хомячка ВНК-21 44.0 0.90 0.10 9.0 0.93 0.10 9.0

Глиома крысы С-6 11.0 0.73 0.12 6.1 0.71 0.11 6.3

Из табл. 1.1. следует, что причиной деполяризации фиб-робластов человека под действием уабаина являлось значительное уменьшение [К]г и увеличение [Иа],. Особо сильные изменения наблюдались для [К],-/[АЩ. Резистентность клеток грызунов к уабаину проявлялась в сохранении ионного состава цитоплазмы. В смешанных культурах (табл. 1.2.) влияние уабаина на чувствительные клетки значительно ослаблялось. Ионный состав в смешанных культурах изменялся незначительно. При высокой плотности клеток и хорошей электрической связи (тип 2 в табл.1.2.) изменений ионного состава обнаружить не удалось.

Таблица 1.2

Влияние 1мкМ уабаина на содержание ионов [К], и [Na]\ в смешанных культурах клеток человека и грызунов

Плот- Соотноше-

ность ние

Тип х 104 клеток/ см2 доноров и реципиентов Степень Контроль Уабаин

культуры по числу клеток по белку связи % [К], мМ/г белка [лч мМ/г белка [ЛЧ [Kl ,мМ/г белка [ЛЧ- мМ/г белка га, [лч

1 9.0 1:3 1:15 - 0.63 0.12 5.2 0.61 0.12 5.0

2 44.0 1:5 1:2 83 0.90 0.14 6,4 0.94 0.15 6.4

3 14.5 1:3 1:1 30 0.71 0.10 7.4 0.45 0.27 1.7

1 - Фибробласты человека + Фибробласты мыши

2 - Фибробласты человека + Фибробласты хомячка ВНК-21

3 - Фибробласты человека + Глиома крысы С-б

Таким образом, в наших экспериментах подобраны условия, при которых фибробласты грызуна поддерживают значения мембранных потенциалов и внутриклеточных ионных концентраций в клетках человека с блокированными ионными насосами. Это означает, что клетки грызуна являются донорами энергии в виде градиентов электрохимических потенциалов неорганических ионов, а клетки человека -реципиентами.

Отметим, что общее содержание ионов ([£],■+[ЛГа]г), нормированное на клеточный белок, после 2 ч обработки уабаином не изменялось, что свидетельствует о малых изменениях клеточного объема.

Проведенные исследования позволяют заключить, что эффективность связи через ПК (зависящая от типа клеток и суммарной плотности культуры), а также соотношение доноров и реципиентов в смешанных культурах оказывали влияние на электрофизиологические характеристики клеток и внутриклеточное содержание ионов [К\\ и [ЛЭД.

Детальный анализ экспериментальных результатов проводился с помощью модели, описанной в следующем параграфе.

Принципы описания ионно-осмотического гомеостаза клетки. Для описания ионно-осмотического гомеостаза электроневозбудимой животной клетки нами была модифицирована извбстная система уравнений Бойля и Конвея, отвечающая мембране, проницаемой для воды и ионов калия, натрия и хлора. Градиенты электрохимических потенциалов для всех ионов поддерживались в модели только активностью №+/К+-АТР-азы. Отношение кажущихся проницаемо-стей для ионов Ыа+ и К+ не зависело от потенциала на плазматической мембране.

[К]1+[Ыа}1-[С1\-г- = О

V

[/а+[АЧ+[с/],-+-=Х[с]0

тры _ Р и V- — 1 Тс

ЕЙ [К]0 ~[К], ехр(-ЕЕ/ЯТ)

ят

¿Г = 2

-ехр (-ЕР/ЯГ)

-.3

(1-1) (1.2)

(1-3)

[К]с

[К]0+к3(\ + [Ма]0/к4)

[К]0

[АТР]N

[К]0+к5(1 + ^а]0/к6)

]*« = = 2/3 = 2/3/ ЯТ [К]; +2РЫа/ЗРК[Ма],

([АТР] + к )РК

таа ' №

Е = — 1п

Р [К]0+2Рш/ЗРк[Ма]

(1.4)

(1.5)

(1.6)

РОССИЙСКАЯ

ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛЙОШСА

(1.7)

Здесь [Ali ,[Na\ \C/\h[K\0 ,[Na]0 ,[CI\0 - активности соответствующих ионов в клетке и во внешней среде; X [С1о " осмотичность среды; А - количество непроникающих анионов внутри клетки; v - объем клетки; z -средняя валентность непроникающих анионов; к1 - к6 и к* - кажущиеся константы диссоциации комплексов ионов и АТР с соответствующими центрами Ыа+/К+-АТР-азы ; N - поверхностная плотность ионных насосов; Jp™, JPN™ и J™', J^l ~ соответственно, пассивные и активные потоки ионов К+ и Na+; Ядй и РК - кажущиеся проницаемости мембраны для соответствующих ионов, Е - электрический потенциал на мембране; R, Т, F имеют обычный термод