Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ РУБЦА ВО ВЗАИМОСВЯЗИ С ПРОЦЕССАМИ ПИЩЕВАРЕНИЯ И ВСАСЫВАНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ РУБЦА ВО ВЗАИМОСВЯЗИ С ПРОЦЕССАМИ ПИЩЕВАРЕНИЯ И ВСАСЫВАНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ"



На правах рукописи

ГРУЩКИН Александр Георгиевич

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ РУБЦА ВО ВЗАИМОСВЯЗИ С ПРОЦЕССАМИ ПИЩЕВАРЕНИЯ И ВСАСЫВАНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ

Специальность: 03.00.13 — Физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2002

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии животных Московской сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева

Научные консультанты доктор биологических наук, профессор Н.С. Шевелев, доктор медицинских наук, профессор И.А. Морозов

Официальные оппоненты, доктор биологических наук, профессор Л.Г. Каширина, доктор медицинских наук, профессор В.В. Яглов, докіор биологических наук, старший научный сотрудник И.Ф. Драганов

Ведущее учреждение — Всероссийский научно-исследоватечь-ский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных

Защита диссертации состоится \ИО.ріТ)С{ 2002 г в ¡^час на заседании диссертационного совета Д 220 043 09 в Московской сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева по адресу 127550, Москва, ут Тимирязеская, 49 Ученый совет МСХА

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА

Приглашаем Вас принять участие в работе совета В случае невозможности прибыть на заседание просим Вас отзывы на автореферат в двух экземплярах с заверенными подписями направлять по адресу 127550, г Москва, ут Тимирязевская, " Ученый совет МСХА

Автореферат разослан

- г

Ученый секретарь диссертационного совета 0\~Т.М. Подколзина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность.

Повышение молочной и мясной продуктивности животных в условиях интенсификации производства в значительной степени зависит от развития кормовой базы и сбалансированного кормления.

В этой связи знание процессов метаболизма и усвоения питательных субстратов в организме животных является основой их рационального кормления. Важное значение в превращении и усвоении питательных веществ у жвачных животных имеют преджелудки. Образующиеся в рубце продукты метаболизма в значительных количествах всасываются в кровь и лимфу непосредственно через слизистую оболочку рубца. В связи с этим . изучение процессов образования и транспорта летучих жирных кислот, как основных Рубцовых метаболитов, при переходе их через стенку рубца и влияние на эти процессы кормления имеет важное научное и практическое значение.

До настоящего времени имелись отдельные работы, посвященные изучению изменений структуры слизистой рубца в процессе пищеварения (Курилов Н.В.,1971; Вракин В.Ф.1963; Туревский A.T.1964;Tcachi Sacata, Hideo Tamate,1974), однако они не дают полного представления об изменениях происходящих в слизистой оболочке при переходе Рубцовых метаболитов в кровь и лимфу в динамике абсорбции. Вместе с тем, эти данные необходимы для теоретического обоснования проблемы субстратного ■ обеспечения метаболизма, разрабатываемой отечественными учеными, в том числе на кафедре физиологии и биохимии животных МСХА, в составе отраслевой тематики.

Источником обменной энергии у жвачных животных помимо углеводов являются летучие жирные кислоты. Утилизация большого количества низкомолекулярных жирных кислот, всасываемых непосредственно из преджелудков, — главная особенность тканевого обмена у жвачных животных.

ЦСНТРЛЛЬНАЯ

НАУЧИЛИ Г.-бЛсОТЕКА Моск. солиск------ -----

им. К. A. Инв. No -JJ Сі Ы.

За счет их окисления жвачные животные удовлетворяют до 70% необходимой обменной энергии

Слизистая оболочка рубца активно участвует в процессах всасывания и образования новых веществ Исследование морфо-функционапьного состояния ее эпителия в суточной динамике представляет безусловный научный и практический интерес, поскольку транспорт и обмен метаболитов в слизистой оболочке рубца является сложным физиологическим процессом, существенно влияющим на межуточный обмен.

Цель исследований:

Изучить структурные изменения слизистой оболочки рубца в процессе всасывания питательных веществ в различные интервалы времени после приема животными корма и связь этих изменений с происходящими в рубце биохимическими процессами.

Задачи исследований-

1. Изучить закономерности и взаимосвязи физиолого-биохимических, морфологических процессов, происходящих в рубце жвачных животных при разной интенсивности пищеварения

2. Изучить в суточной динамике влияние разной интенсивности процессов пищеварения и всасывания питательных веществ на морфоструктуру слизистой оболочки рубца из разных отделов

3. Проследить возможные пути транспорта питательных веществ, на примере ЛЖК, через стенку рубца с помощью трейсера коллоидного лантана и их значение в процессах всасывания

4 Исследовать содержание ЛЖК в крови, лимфе в связи с суточной динамикой рубцового пищеварения

5 Исследовать влияние тканевых гормонов на процессы абсорбции и его механизм

Научная новизна.

В нашей работе впервые дана сравнительная морфо-функциональная характеристика слизистой оболочки из разных отделов рубца. Показана взаимосвязь биохимических изменений содержимого рубца и их. влияние на ультраструктуру слизистой до кормления (при условном состоянии натощак) и в разные интервалы времени после приема животными корма. Изучено в суточной динамике влияние продуктов рубцового метаболизма, в процессе их всасывания, на структуру слизистой рубца жвачных животных с использованием методов световой и электронной микроскопии. Показаны: морфофункциональные изменения митохондрий, пластинчатого комплекса Гольджи и межклеточных пространств при разной активности всасывания Рубцовых метаболитов (в том числе ЛЖК), что позволяет судить об интенсивности внутриклеточных процессов и дает представление о путях транспорта питательных веществ из полости рубца в кровь и лимфу.

Впервые показаны с использованием методов электронной микроскопии, пути транспорта питательных веществ в многослойном ороговевающем эпителии слизистой оболочки рубца жвачных животных, а методом электронной гистохимии доказан парацеллюлярн ый транспорт летучих жирных кислот из рубца в кровь и лимфу. Исследованы количественные показатели образования в рубце и поступления ЛЖК в кровь и лимфу. Установлена положительная корреляция между содержанием ЛЖК в слюне и крови,, что ■ позволяет предположить наличие их кругооборота, подобно азотистым веществам, в системе рубец-кровь-слюиа-рубец. Результаты нашей работы раскрывают новые морфо-функциональные аспекты структуры слизистой оболочки рубца жвачных животных связанных с процессами всасывания питательных веществ. На примере тканевых гормонов гистамина и серотонина, экспериментально показан механизм гормональной регуляции процессов транспорта летучих жирных кислот в рубце жвачных животных.

Практическая значимость

Проведенные исследования по изучению морофо-функциональиых изменений эпителия слизистой оболочки рубца во взаимосвязи с суточной динамикой процессов пищеварения и всасывания продуктов рубцового метаболизма представляет безусловный интерес, в связи с важной ролью преджелудков в переваривании клетчатки Полученные результаты могут быть использованы при дальнейшем изучении процессов пищеварения и всасывания питательных веществ у жвачных животных Данные об ультраструктуре слизистой оболочки рубца раскрывают ее морфо-функциональные особенности и позволяют целенаправленно регулировать процессы всасывания и транспорта продуктов метаболизма.

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены на научных конференциях ВНИИФБиП, Боровск (1978-1980), научных конференциях МСХА им К А Тимирязева, Москва (1998, 1999, 2000, 2001), Всероссийской научной конференции «Физиология и патология пищеварения» посвященной 150-летию со дня рождения ИП Павлова. Геленджик (1999), Международной научной конференции Казанской академии ветеринарной медицины «Современные проблемы животноводства», Казань (2000); Третьей международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» Боровск (2000), конференции «Проблемы нейрогуморальной регуляции физиологических функций висцеральных систем», посвященной ЮО-тетию со дня рождения Д~Я Криницина, Омск (2000); конференции академии ветеринарной медицины и биотехнологии им К И Скрябина, Москва (2001), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Физиологическая наука - клинической гастроэнтерологии». Краснодар (2001), Межкафедральное научное заседание зооинженерного факультета МСХА Москва (2001), Восемнадцатом съезде физиологов России Казань (2001)

Структура и объем работы Диссертация изложена на 242 страницах принтерного текста и включает: введение, обзор литературы, описание объекта и методов исследований, результаты собственных исследований, заключение выводы и предложения. Работа содержит: 13 таблиц, 42 рисунка. Список литературы включает 306 наименований, в том числе 137 на иностранных языках.

Основные положения выносимые на защиту

- Сопряженность процессов образования и всасывания ЛЖК в

я

преджелудках жвачных животных в суточной динамике

- Роль крови и лимфы -■ -чщ в транспорте ЛЖК

- Взаимосвязь процессов образования и всасывания ЛЖК с морфоструктурными изменениями в слизистой оболочке рубца

- Пути транспорта ЛЖК в слизистой оболочке рубца, роль межклеточных пространств в этом процессе

- Роль тканевых гормонов в процессах образования и всасывания ЛЖК у жвачных животных

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Условия проведения опыта и характеристика животных

Для выполнения поставленных задач были проведены морфо-физиологические исследования на 6 овцах цигайской породы в возрасте с 3 до 4 лет, живой массой 36-40 кг; 4 валухах породы ромни-марш с 1 до 2 лет, живой массой 50 кг и 6 быках-кастратах черно-пестрой породы в возрасте с 12 до 18 месяцев, живой массой 350-500 кг. Подопытные животные содержались в условиях вивария, кафедры физиологии и биохимии животных МСХА получали сено-концентратно-корнеплодные рационы, сбалансированные по общей питательности, сахаро-протеиновому отношению и минеральным элементам согласно детализированным нормам кормления (ред. Калашников А.П., Клейменов Н.И.,1988). Кормление животных проводили три раза в сутки, поение - без ограничений. Подопытным животным, в зависимости

от цели опыта, предварительно, были наложены фистулы рубца, «лодочки» на сонную артерию, катетеры на рубцовую и воротную вены, желудочный лимфатический проток. Контроль физиологического состояния

животных осуществлялся постоянно Пробы рубцового содержимого, слизистой оболочки рубца, крови, лимфы, слюны и мочи брали за 1 час до утреннего кормления, через 1, 3, 5 и 7 часов после приема животными корма Образцы слизистой оболочки рубца, полученные методом биопсии, обрабатывали для световой микроскопии, электронно-микроскопических и гистохимических исследований по прописям Гайер Г (1974), Миронов А А и др. (1994) Летучие жирные кислоты определяли методом паровой дистилляции в аппарате Маркгамма, хроматографическое раздетение ЛЖК проводили на газожидкостном хроматографе методом, усовершенствованным в лаборатории межуточного обмена ВНИИФБиП (ред Курилов Н В ,1987), (Иконников Н С. и др 1999) Тканевые гормоны гистамин и серотонин определяли методом Герасимовой ЦИ (1977) Для статистической обработки экспериментального материала исполыовали метод Стьюдента (Асатиани В С , 1965)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Динамика процессов рубцового метаболизма в разные временные

интервалы после кормления животных

Исследования рубцовой жидкости, крови, -шмфы и слюны показали, что самый низкий уровень летучих жирных кислот имеет место перед утренним кормлением. После кормления образование ЛЖК значительно усиливается, и их уровень в РЖ повышается в 1,5 раза Максимальное количество низкомолекулярных кислот в рубцовой жидкости обнаружено в интервале 3-5 часов после кормления (пик рубцового пищеварения) Полученные данные хроматографического анализа ЛЖК в РЖ, крови и слюне показывает, что везде преобладает уксусная кислота, на ее долю приходится 50-65% от обшего количества кислот, в то же время всегда имеет место образование значительных количеств пропионовой 20-25% и масляной 10-15% кисют

Схема исследований

Таблица 1

Содержание ЛЖК в рубцовой жидкости овец (чМ/100мл)

> Врем* взятия Общие Уксусная Пропионовая Масляная

п /п проб ЛЖК кислота кислота кислота

1 До кормления 7,95*0,23 5,24*0,21 1.85*0,10 0 85*0,20

2 Через 1 час К.У0±0,17 5,29*0,32 2,60*0 15 1,01 ±0,23

3 Через 3 часа 12,651:0.23 8,37*0,19 2.88±0,27 1,39*0,17

4 Через 5 часов 10,80*0,22 7,26*0,13 2,41*0,24 1,13*0,21

5 Через 7 часов 8,35*0,15 5,44*0.23 2 10*0,18 0,82*0,24

В наших опытах при определении количеств раздельных низкомолекулярных жирных кислот в рубцовой жидкости у овец, содержавшихся на сено-концентрато-корнеплодном рационе, получена картина аналогичная суммарному уровню ЛЖК, когда показатели концентраций ЛЖК достигали максимума также, в пик рубцового пищеварения, то есть через 3-5 часов после кормления.

Всасывание ЛЖК в кровь и чимфу

Для углеводного обмена у жвачных животных характерно, что в кровь и лимфу всасывается не глюкоза, а продукт сбраживания Сахаров -низкомолекулярные жирные кислоты, с чем связано низкое содержание сахара в крови.

Методы катетеризации вен и лимфатических сосудов, выведение под кожу сонной артерии позволили нам получить кровь и лимфу в хроническом эксперименте. Сравнение содержания метаболитов в оттекающей от рубца крови и лимфе с их содержанием в артериальной крови позволило нам судить о степени всасывания и метаболизме ЛЖК в стенке рубца. Определение концентрации ЛЖК в разные часы после кормления позволило судить о динамике пищеварительных процессов в рубце в разные интервалы времени после кормления

Таблица 2

Содержание ЛЖК в крови и лимфе у овец (мМ/л)

Время взятия Проб Рубцовая вена . Воротная вена Желуд. лимф. пр. Сонная артерия Яремная вена

До кормления 0,8040,31 0,88*0,16 0,75*0,09 0,71*0,08 0,54*0,24

Через 1 час 1,30*0,11 1,43*0,23 1,27*0,13 0,93*0,23 0.66*0,21

Через 3 часа 1,494:0,14 1,56*0,14 1,43*0,25 1,25*0,27 0,98*0,13

ЧерезЗ часов 1,32*0,29 1,36*0,07 1,30*0,19 1,19*0,16 0,92*0,18

Через 7 часов 0,95*0,24 1,10*0,16 0,94*0,23 0,88*0,14 0,80*0,11

После кормления животных количество ЛЖК в рубце, крови и лимфе увеличивается. При этом увеличение концентрации ЛЖК в крови и лимфе прямо пропорционально их содержанию в рубцовой жидкости: как правило, высокому уровню концентрации ЛЖК в РЖ соответствует высокий их уровень в оттекающей крови и лимфе (табл. 1,2). Это указывает на интенсивный транспорт ЛЖК слизистой оболочкой из полости рубца в кровь и лимфу. Наибольшей интенсивности процессы пищеварения и всасывании« достигали к 3-5 часу после кормления животных, то есть в пик рубцового пищеварения.

Таким образом, установлено содержание ЛЖК у овец в крови и лимфе: образование ЛЖК (РЖ) - всасывание в кровь (рубцовая и воротная вены) — всасывание ЛЖК в лимфу (желудочный лимфатический проток).

, Поступление ЛЖК во внутреннюю среду организма прямо пропорционально их образованию и концентрации в рубце (Табл.2,3,4). Динамика всасывания низкомолекулярных жирных кислот в кровь и лимфу прямо пропорциональна динамике их образования в рубце.

Как уже отмечалось, среди низкомолекулярных жирных кислот в процентном соотношении преобладает уксусная кислота, утилизация которой в организме жвачных животных обеспечивает наибольшее количество обменной энергии. Всасываясь из преджелудков она мало задерживается печенью и используется как для энергетического обеспечения организма, так и для синтеза

Содержание ЛЖК в крови воротной вены у овец (мМ/л)

Таблица 3

Время взятия Общие Уксусная Пропионовая Масляная

проб ЛЖК кислота кислота кислота

До кормления 0,88*0.16 0 62*0,23 0,17=10,21 0,09*0,27

Через 1 час 1,43*0,23 0.93*0,27 0,33*0 28 0 17*0,11

ЧерезЗ часа 1,56*0.24 1,16*0,13 0,38±1,21 0.19*0,12

Через5 часов 1,ЗЬ±0,07 0 99±0,19 0,27*0,17 0,17*0,09

Через 7 часов 1,10*0,26 0,77*0,24 0 2210,09 0,11*0,15

высокомолекулярных жирных кислот, являясь, в частности, предшественником жира молока Использование уксусной кислоты в тканевом обмене осуществляется путем непосредственного ее окисления без превращения в углеводы В тканях организма она не только подвергается расщеплению, как энергетический продукт, но и используется для синтеза новых, более сложных соединений Например, так называемые липогенные ткани (стенка желудочно-кишечного тракта, печень, легкие, жировая ткань, молочные железы) могут синтезировать из уксусной кислоты липиды

Не менее важным метаболитом является и пропионовая кислота. Несмотря на то, что значительная часть этой кислоты подвергается метаболизму в печени (неоппокогенез), увеличение ее концентрации в содержимом рубца повышает использование азота корма и образование белка в молоке

Большое значение в обмене веществ имеет также и масляная кислота. Нами показано, что масляная и, в меньшей степени, пропионовая кислоты всасываются с относительно большей интенсивностью, чем уксусная кислота, но в меньших абсолютных и процентных количествах (Рис 1,3,4).

Исходя из данных табл. 4, нами было высказано предположение, что увеличение скорости всасывания ЛЖК из смеси кислот, в известной мере, вызвано наличием бутирата, который, по-видимому, используется тканями

рубца в качестве энергетического материала, так как поглощение его не связано с отложением в стенке рубца гликогена или жира..

Таблица 4

Содержание ЛЖК в лимфе общего желудочного протока овец (мМ/л)

Время Взятия проб Общие . ЛЖК Уксусная кислота Пропионовая кислота Масляная кислота

До кормления 0,7540,09 0,54*0,17 0,12*0,15 0,09*0,14

Через 1 час 1,27±0,13 0,93*0,11 0,23*0,09 0,11*0,12

Через 3 часа 1,43*0,25 1,05*0,21 0,29*0,18 0,15*0,13

Через 5 часов 1,30*0,19 0,94*0,14 0,21*0,07 0,15*0,24

Через 7 часов 0,94КМЗ 0,66±0,26 0,16*0,21 0,11*0,06

Уровень ЛЖК в лимфе был в среднем в 1,3 раза ниже, чем в крови воротной вены. Содержание низкомолекулярных жирных кислот в лимфе у подопытных животных составляло: до утреннего кормления - 0,75, в пик пищеварения - 1,43 и 1,30, а к 7-му пищеварения — 0,94 мМ/л. Отсюда можно сделать вывод, что в лимфе закономерности транспорта ЛЖК, прямо пропорциональны процессам в рубцовой жидкости. Летучие жирные кислоты постоянно поступают из пищеварительного тракта в лимфу. Их концентрация также, как и в крови достигает своего максимума в пик рубцового пищеварения. Последнее связано с более интенсивной . микробной ферментацией углеводов корма в 3-5 - часовой период и соответственно образованием большего количества ЛЖК.

• Уксусная кислота из рубца в лимфу всасывается активнее других низкомолекулярных кислот, что связано с прямым транспортом через стенку рубца без каких — либо превращений. Пропионовая и масляная кислоты в лимфу всасываются в меньшей степени (Табл.4), что подтверждает факт их утилизации руменоцитами слизистой оболочки рубца для энергетических целей обеспечивающих транспортные процессы

Содержание ЛЖК в слюне и их кругооборот

В последнее время в работах по физиологии слюнных желез установлена прямая зависимость состава слюны от состава крови. Слюнные железы жвачных, являясь активным звеном в механизме гомеостата сложной метаболической системы преджелудков, способны извлекать из крови минеральные элементы и органические соединения и возвращать их в рубец, поддерживая изотонию и ионный состав рубцовой жидкости по отношению к крови. Нами установлено, что наряду с мочевиной и бикарбонатами в рубец со слюной возвращается и часть летучих жирных кислот, что на наш взгляд, может оказывать определенное влияние на их обмен и использование в организме

Таблица 5

Содержание ЛЯСК в РЖ, крови и слюне у овец

Время взятия проб РЖ мМ/ІООмл. Сонн артер. мМ/л Яремн. вена | Смеш слюна мМ/л | мМ/л

До кормления 7,95±0,33 0,71±0,08 0.54*0.14 1,19*0,11

Через 1 час 8,90±0,17 0,93±0,23 | 0,66*0,21 1,69±0,08

Через 3 часа 12,65±0,33 1,25±0,27 | 0.98±0.23 2,18±0,35

Через 5 часов 10,80±0,22 1,19±0,16 0,92±0,18 1,81±0,15

Через 7 часов 8,35±0.15 0.88±0,14 0 80±0,П [ 1,50±0,07

Проведенные нами исследования показали, что концентрация ЛЖК в слюне овец после кормления повышается, в 1,7 раза в сравнении с состоянием натощак. Максимальное количество этих кислот обнаружено в пик рубцового пищеварения, то есть через 3-5 часов после приема животными корма. Увеличение содержания ЛЖК в слюне происходило параллельно повышению их концентраций в РЖ и крови. Важно при этом заметить, что концентрация летучих жирных кислот в слюне в 1,5 раза превышала их содержание в крови (табл 5,6), из чего можно сделать заключение об активном извлечении ЛЖК

слюнными железами, без существенных изменений в соотношении отдельных низкомолекулярных кислот. Это обстоятельство указывает на более сложный механизм поступления ЛЖК в слюну, чем простая диффузия. Если принять во внимание, что у взрослых овец выделяется в сутки до 15 и сгаоиы, ках в свое время установил (Алиев А.А.,1998), то с ней в рубец может поступить ,30-40 мМ ЛЖК в сутки, которое почти не уступает их количеству, поступающему путем выделения рубцовой стенкой.

В целом складывается довольно сложная картина изменяющегося во времени состава слюны, адаптированного к составу крови в процессе пищеварения и всасывания питательных - веществ. В процессе метаболизма у жвачных животных летучие жирные кислоты, по-видимому, осуществляют, подобно азотистым веществам, кругооборот в системе: рубец — кровь — слюна — рубец.

Таблица 6

Содержание ЛЖК в смешанной слюне овец (мМ/л)

Время взятия проб Общие ЛЖК Уксусная кислота Нропноновая кислота Масляная кислота

До кормления 1,1940,11 0,98*0,17 0,18*0,19 0,03 АО,21

Через 1 час 1,69±0,08 1,42*0,09 0,23*0,18 0,04*0,11

Через 3 часа 2,18±0,35 1,75*0,11 0,38*0,19 0,06*0,18

Через 5 часов 1,81±0,15 1,48*0,23 0,29*0,09 0,04*0,08

Через 7 часов 1,50±0,07 1,20*0,15 0,27*0,14 . 0,03*0,09

Морфологические изменения слизистой оболочки рубца во взаимосвязи с процессами метаболизма и всасывания нутриентов.

Полученные нами, методом световой и электронной микроскопии, данные по изучению слизистой оболочки из разных отделов рубца (латеральных стенок вентрального и дорзального мешков) особых различий не выявили. Однако, в строении руменоцитов верхней стенки дорзального мешка и фундальной части рубца имеются.

В верхней стенке дорзального мешка, где скапливаются рубцовые газы и нет постоянного контакта с пищевыми массами, роговой слой к 3-5 часу после кормления увеличивается по сравнению с предыдущим периодом и выглядит рыхлым с явными следами десквамации. Зернистый слой более однороден и в нем почти отсутствуют клетки с оптически светлым материалом Межклеточные пространства сильно расширяются и производящий слой занимает большую площадь Межклеточные щели базального слоя к 3-5 пасу после приема животными корма более сужены, чем в шиповатом и зернистым слоях Эти морфофункциональные изменения менее выражены, по сравнению с фундальной частью рубца, и проявляются в меньших количествах, так как вызваны сдвигами не в процессе всасывания летучих жирных кислот, а гуморальным обеспечением их через сосудистую систему кровообращения

Увеличение содержания летучих жирных кислот в РЖ и крови идет почти параллельно, и наиболее высокой концентрации летучих жирных кислот в рубцовой жидкости соответствует их высокая концентрация в крови. Все это свидетельствует об их интенсивном транспорте ЛЖК через слизистую оболочку рубца (рис.1) Полученные нами данные убедительно доказывают, что пику рубцового пищеварения соответствует наиболее активная функциональная стадия тканевых структур (Рис 2), ответственных за транспорт питательных веществ из просвета рубца в кровь.

Из всех образующихся рубцовых метаболитов ЛЖК считаются наиболее ответственными за морфологические изменения, происходящие в слизистой рубца. Повышение их концентрации приводит к увеличению числа и размеров митохондрий, что является показателем общей энергетической активности руменоцитов (Рис 2)

Летучие жирные кислоты влияют и на размеры межклеточных пространств, так как одним из условий, обеспечивающих высокую проницаемость эпителиального пласта, является увеличение размеров

межклеточных щелей и гидрофильность низкомолекулярных жирных кислот Наши исследования подтверждают факты, что в слизистой оболочке рубца в зависимости от периода посте приема животными корма меняются размеры межклеточных пространств (рис 2)

мМ/100мл

Рис I Динамика содержания ЛЖК в рубцовой жидкости и крови после кормления.

нм

Рис 2 Изменение размеров митохондрий, комплекса Гольджи и межклеточного пространства после кормления

До кормления они сужены, а в пик рубцового пищеварения, когда процессы абсорбции достегают своего максимума, их размеры увеличиваются более чем в 1,5 раза

Возможные пути транспорта ЛЖК в рубцовой стенке

Исходя из полученных нами результатов можно предположить, что транспорт Рубцовых метаболитов осуществляется тремя путями интерцеллюлярным, (парацеялюдярным)- по межклеточным пространствам, эндоцеллюлярным — от клетки к клетке по пито плазматическим мостикам и смешанным путем (рис 3)

По химической характеристике, летучие жирные кислоты относятся к кислотам средней силы и, следовательно, при физиологических значениях рН в значительной степени диссоциированы. Таким образом, они представлены, как своей молекулярной формой, так и соответствующим анионом.

Рис. 3 Схема путей транспорта Рубцовых метаболитов

1 Ж 1

1 - слизистая оболочка, 2 — базальная мембрана, 3 - капилляры

Летучие жирные кислоты образуют соли с основаниями Бернегеда. Обычно это соли натрия, калия и кальция, которые без ограничений растворимы в воде и образуют довольно прочные водородные связи, как с молекулами воды, так и между собой. Однако, будучи амфолитами, низкомолекулярные жирные кислоты способны растворяться не только в воде, но и в значительно менее полярных средах. Благодаря этому обстоятельству она могут легко проникать через лип иди ые мембраны и межклеточные пространства вместе с током воды.

В литературе рассматривается возможный путь транспорта питательных веществ по межклеточным пространствам, где оговорено, что для всасывания мономеров-моносахаридов, жирных кислот, аминокислот и других

метаболитов необходимы два основных условия: их водо - и липорастворимость и наличие относительно широких межклеточных пространств

Нами была показана прямая зависимость увеличения ширины межклеточных пространств от концентрации ЛЖК в рубцовом содержимом и крови. Исходя из этих данных можно было сделать вывод о транспорте Рубцовых метаболитов по межклеточным пространствам во внутреннюю среду организма Однако прямого морфологического доказательства этого до нашей работы не было

Общепринятой гистологической методикой, описанной во многих руководствах, в препаратах контрастируется целый комплекс органических веществ - белки, нуклеиновые кислоты, липиды и другие вещества Подобный контрастирующий комплекс тонкодисперстного материала выявлен в большом количестве и на наших снимках в просвете рубца и особенно в его пристеночной зоне. Аналогичное по своему строению тонкодисперстное вещество обнаруживается и в межклеточных пространствах защитного слоя ороговевающих клеток Этому проникновению исследуемого вещества вглубь эпителия не препятствуют структуры межклеточных соединений слизистой оболочки рубца жвачных животных, поскольку они не имеют плотных контактов, в отличие от однослойного эпителия кишечного типа, их контакты представлены только десмосомами. Вследствие этого межклеточные контакты проницаемы как для воды, так и для гидрофильных молекул летучих жирных кислот Этот же контрастируемый материал просматривается и в межклеточных пространствах более глубоко лежащих структурах слизистой оболочки производящего слоя.

Мы предполагаем, что обнаруженное мелкодисперсное вещество, по-видимому, состоит из осмиофильных молекул летучих жирных кис тот

(доминирующих среди рубцовых метаболитов) в комплексе с хвостовой частью молекул белка. Таким образом, высказанное ранее предположение, о проницаемости питательных веществ по межклеточным пространствам (парацеллюлярный транспорт) получило в наших опытах морфологическое подтверждение.

Изучение проницаемости слизистой оболочки рубца с помощью

диффузной метки

Проницаемость слизистой оболочки рубца, являющаяся важным показателем ее функциональной активности, меняется в зависимости от уровня процессов рубцового метаболизма. При этом изменение проницаемости касается не только мембран эпителиоцитов, осуществляющих активную транспортную функцию, но и межклеточных пространств, по которым также происходит всасывание питательных веществ из полости рубца в кровь. Для изучения проницаемости слизистой оболочки рубца в качестве диффузной метки использовали трейсер (коллоидный лантан), размер частиц которого составляет около 2 нм. В основе этого метода лежит высокая электронная плотность лантана. Кроме того, лантан является опосредсгвенным индикатором локализации кальция в тканях и клетках.

При гистохимиической обработке стенки рубца быков частицы лантана сорбируются на апикальной поверхности руменоцитов рогового слоя. Это объясняется способностью лантана фиксироваться на плазматической мембране и проникать внутрь клеток только через поврежденную цитолемму. ' Проникновение лантана в - цитоплазму эпителиоцитов свидетельствует о нарушении избирательной проницаемости плазматической мембраны. Причиной этого нарушения может служить усиленное образование кератогиалиновых гранул, деструкции митохондрий и ядерного аппарата и наконец, гибель клеток рогового слоя на той стадии, когда они заканчивают

свой жизненный цикл и десквамируются в просвет рубца быков Скопления частиц лантана обнаружены в расширенных пространствах как защитного, так и производящего слоев Они свободно проникали по межклеточным пространствам вплоть до собственной пластинки слизистой оболочки рубца быков, то есть до просвета кровеносных и лимфатических капилляров Диффузное проникновение лантана в структуры защитного и производящего слоев свидетельствует о том, что межклеточные пространства, не являются препятствием для частиц, размер которых не превышает 2 нм При этом происходит как бы «пропитывание» всех слоев слизистой оболочки рубца в следствии диффузии трейсера Полученные нами результаты позволяют предположить наличие межклеточного транспортного пути по градиенту концентрации не только частиц лантана, но и продуктов рубцового метаболизма с размером молекул не превышающих размеры межклеточных пространств. Для окончательного подтверждения нашей гипотезы о парацеллюлярном транспорте летучих жирных кислот было проведено электронно гистохимическое исследование, которое наглядно показало путь всасывания фиксированных гистохи ми чески окрашенных молекул ЛЖК из полости рубца в просвет кровеносных капилляров по межклеточным пространствам

Для визуализации летучих жирных кислот была применена реакция с образованием гидроксамовых кислот модифицированной по методу Адамса выявления этерифицированных жирных кислот. Положительную реакцию дают лишь гидрофильные фосфолипиды и триглицериды образованные кислотами с короткой цепью Сг-С6, то есть летучими жирными кислотами. Общая схема реакции может быть представлена следующим образом- экзогенный субстрат - исследуемое вещество - нерастворимый продукт реакции — захватывающий агент - электронноплотный материал.

Гормональная регуляция процессов всасывания летучих жирных кислот.

Изучение влияния биогенных аминов в регуляции физиологических функций позволяет объяснить некоторые • детали механизма транспортных процессор л рубце жвачных животных.

Гистамин и серотонин являются' биологически активными веществами (тканевыми гормонами) участвующими в пищеварительных процессах, как на тканевом, так и на внутриклеточном уровне. У млекопитающих животных около 90% всего серотонина и гистамина содержится в желудочно-кишечном тракте (Науменко У.В.,Попова Н.К.,1975).

Проведенные нами исследования показали, что гистамин и серотонин обладают, соответственно, стимулирующим и ингибирующим действием на

2500 2000

ад т

» 1500 Л 1000 500

0 ■ , -,-.

13 5 7 часы после кормления

Рис. 4 Содержание кальция в слизистой оболочке и рубцовом содержимом (СО- слизистая оболочка, РЖ- рубцовая жидкость, РС- рубцовое содержимое).

транспортные процессы (Рис.5,6). Гистамин, обладая высокой активностью, вызывает расширение капилляров стенки ЖКТ и увеличивает проницаемость

-СО

-РЖ -РС

эндотелия Механизм положительного ионотропного действия гистамина связан с повышением проницаемости мембран для ионов Са, а также с усиленным образованием циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) принимающего участие в формировании каналов переноса кальция

Нашими исследованиями установлено, что в пик рубцового пищеварения концентрация кальция достигает своего максимума не только в рубцовом содержимом и его фракциях (Рис 4), но и в руменоцитах слизистой оболочки (около 1,2 г% в сух. в-ве.) При этом интенсивно утилизируются жиры и

Рк;5 Киипрщя пселмчв мтсмз/ма

до 2 4 7 _

Рихб КЬшсшршлия сершишш в ккнс мктУмл

углеводы. Так как основные энергетические процессы клеточного метаболизма и образования АТФ в руменоцитах связаны с митохондриями, то можно принять, что их размер и количество является показателем уровня интенсивности транспорта питательных веществ в слизистой оболочке рубца (Рис 2)

В процессе аэробного обмена активизируются более сотни митохондриальных ферментов, оказывающих влияние не только на процессы всасывания, но и на интенсивность микробиальных процессов в рубце и уровень образования ЛЖК (Машковский М Д , 1977) (Рис 1) Все это указывает

на возможность стимуляции гистамином транспортных процессов через эпителиальный барьер слизистой оболочки рубца (рис.4,5).

Серотонин, в противоположность гястамину тонизирует гладкую мускулатуру и сужает просветы кровеносных капилляров. Ингибирующий эффект серотонина осуществляется, по-видимому, центральными механизмами через монооксидазу (Рис.6). Известно, что под воздействием сильных ингибиторов (типа монооксид азы) повышается уровень серотонина в организме. Некоторые эффекты серотонина как и гистамина, передаются через цАМФ (Айнсон Э.И, 1982; Науменко У.В. .Попова Н.К., 1975).

ВЫВОДЫ

Комплексный морфо-физиологический подход с использованием современных биохимических, гистологических и электронно-гистохимических методов в сочетании с методом физиологической хирургии (катетеризация рубцовой и воротной вен, желудочного лимфатического протока, выведение под кожу сонной артерии, наложение фистул на рубец) позволил в хронических экспериментах изучить суточную динамику образования, абсорбции и пути транспорта через стенку рубца у жвачных животных. Результаты исследований позволяют сделать следующие основные выводы:

1. Наибольшее количество летучих жирных кислот образуется в рубце в период с 3-его до 5-го часа после приема животными корма (пик рубцового пищеварения), когда их уровень повышается в 1,5 раза в сравнении с условным состоянием натощак. Соотношение отдельных ЛЖК в содержимом рубца, а также в крови, лимфе х - показывает во всех случаях преобладание уксусной кислоты, на долю которой приходится 60-70% от общего количества кислот; на долю пропионовой и масляной кислот - (18-20% и 10-15%, соответственно).

2. Концентрация ЛЖК в крови и лимфе, достигают максимума (как и в РЖ) в пик рубцового пищеварения, что свидетельствует о сопряженности

процессов образования и всасывания ЛЖК в преджелудках жвачных животных Наиболее интенсивно они всасываются в кровь; их содержание в лимфе ниже в 1,3 раза, чем в крови

3 Уксусная кислота из рубца в кровь и лимфу всасывается предпочтительнее других низкомолекулярных кислот, что связано с незначительной ее утилизацией в стенке рубца Пропионовая и масляная кислоты всасываются в лимфу в меньшей степени, что подтверждается разным соотношением их концентраций в рубце и лимфе.

4 Интенсивное всасывание бутирата не вызывает отложения гликогена или жира в слизистой оболочке, так как оно связано с потребностью эпителия рубцовой стенки в энергии, которая удовлетворяется за счет утилизации руменоцитами этой кислоты

5 Динамика концентрации летучих жирных кислот в сионе тесно связана с интенсивностью процессов рубцового метаболизма и их содержанием в рубцовой жидкости и крови В пик рубцового пищеварения концентрация ЛЖК в слюне повышается в 1,7 раза в сравнении с условным состоянием натощак Установлен факт активного извлечения ЛЖК слюнными железами из крови и их кумучяции в слюне Содержание ЛЖК в слюне в полтора раза выше чем в крови

6 При максимальной активности метаболических процессов в рубце и соответственно высокой концентрации ЛЖК в рубцовой жидкости увеличиваются размеры руменоцитов и толщина слизистой оболочки в целом, что на наш взгляд, связано с повышением интенсивности транспортных процессов в ней

7 Начальный этап всасывания характеризуется концентрацией питательных веществ, включая ЛЖК, в пристеночной зоне слизистой оболочки рубца, богатой остатками клеточных структур десквамированных руменоцитов, пищевых частиц и микроорганизмов

8. Интенсивность образования и всасывания Рубцовых метаболитов, в том числе ЛЖК, влияет на цитоплазматические мембраны, увеличивая количество и извилистость пальцеобразных выростов цитолеммы. В структуре межклеточных соединений отсутствуют зоны плотных контактов, клетки контактируют посредством десмосом, поэтому межклеточные пространства проницаемы для гидрофильных молекул летучих жирных кислот.

9. Морфометрические показатели ширины межклеточных пространств и размера клеточных органелл, ответственных за процессы всасывания (митохондрии, пластинчатый комплекс Гольджи), достигали максимальных размеров в пик рубцового пищеварения, что свидетельствует о повышении их функциональной активности.

10. Летучие жирные кислоты всасываются из рубца парацелюллярным путем, что подтверждено визуализацией короткоцепочечных жирных кислот (методом электронной гистохимии) в расширенных межклеточных пространствах.

11. При интенсивном всасывании ширина межклеточных пространств достигает 750-1500 нм, что превышает размеры частиц трейсера (коллоидного лантана) и делает возможным его проникновение в сторону базальной мембраны. Это, наряду с методом визуализации ЛЖК, подтверждает наличие парацеллюлярного транспорта питательных веществ в слизистой оболочке рубца жвачных животных.

12. Установлена положительная корреляция концентрации гистамина с изменениями размеров клеточных органелл, осуществляющих транспортную функцию в слизистой оболочке рубца и интенсивностью всасывания ЛЖК. Что позволяет судить о его причастности к регуляции процесса всасывания в рубце.

Предложения и рекомендации

1. Примененный нами в морфо-физиологических исследованиях комплексный подход с использованием современных физиолого-биохимических, гистологических, электронно-гистохимических методов и экспериментальной хирургии, можно рекомендовать, как высоко эффективный для углубленного изучения процессов пищеварения и механизмов всасывания питательных веществ у сельскохозяйственных животных.

2. Полученные данные о количественных параметрах образования ЛЖК в рубце и путях их транспорта могут быть использованы в последующих научных исследованиях по проблеме механизмов абсорбции и субстратного обеспечения метаболизма у жвачных животных, а также в учебном процессе по курсам: «Морфология» и «Физиология» животных

3 Представляется перспективным дальнейшее изучение роли тканевых гормонов в механизме транспортных процессов и регуляции абсорбции питательных веществ в преджелудках жвачных животных.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Грушки н А.Г. Концентрация ЛЖК в рубце и ее связь с гистологическими изменениями слизистой оболочки Бюлл ВНИИФБиП с.-х. животных. Боровск 1978, вып 1(48), с 40-42

2. Грушкин А Г. Ультраструктурные изменения слизистой оболочки рубца

у овец до и после кормления. Бюлл. ВНИИФБиП с.-х. животных Боровск 1978, вып. 3 (50) с. 65-68. 3 Грушкин А Г. Ультраструктурные изменения митохондрий и комплекса Гольджи слизистой оболочки рубца у овец в различные часы после кормления. Бюлл ВНИИФБиП с.-х. животных Боровск, 1980, вып 3(59) с 75-79.

4. Грушкин А.Г. Методы исследования светооптической микроскопии. (Методы изучения биологической фиксации азота воздуха Под общей ред ГС Посыпанова) М Агропромиздат 1991, с. 97-101

5. Грушкин А.Г. Методы исследования электронной микроскопии. (Методы изучения биологической фиксации азота воздуха. Под общей ред. Г.С. Посыпанова) М. Агропромиздат. 1991, с. 101-103.

6. Грушкин АГ., Шемораков A.B. Химический состав и питательность различных видов сена. Информационные указания Калужский ЦНТИ. 1993,№273,с. 1-4.

7. Шемораков A.B., Грушкин А.Г. Корне клубнеплоды, как источник Сахаров в рационах жвачных. Информационные указания Калужский ЦНТИ. 1996, № 232, с. 1-4.

8. Грушкин А.Г., Шемораков A.B. Процессы образования и всасывания JDKK в рубце овец и их влияние на размеры эпителиального слоя. Известия ТСХА, вып. 2.1998, с.185-192.

9. Грушкин АГ. Шемораков A.B. Изменение морфоструктуры рубца овец под влиянием транспорта летучих жирных кислот. Сельскохозяйственная биология. 1998, № 2, с. 96-99.

Ш.Шемораков A.B., Грушкин А.Г. Использование корнеплодов в рационах сельскохозяйственных животных. Информационные указания. Калужский ЦНТИ. 1999, Ks 16, с. 1-4.

П.Шевелев Н.С., Грушкин А.Г. Морфоструктурные изменения слизистой рубца в динамике всасывания летучих жирных кислот. Мат. Всероссийский научной конференции «Физиология и патология пищеварения» посвященной 150-летаю со дня рождения И.П.Павлова. Геленджик. 1999, с.195-197.

12.Шевелев Н.С., Грушкин А.Г., Черемуха Е.Г. К вопросу о механихме всасывания питательных веществ в рубце жвачных. Научный сборник «Доклады ТСХА» вып. 271. М. МСХА, 2000, с.248-251.

13.Шевелев Н.С., Грушкин А.Г., Черемуха Е.Г. Динамика ЛЖК в слюне и крови

> у валухов в связи с процессами пищеварения и всасывания. Материалы

международной научной конференции «Современные проблемы животноводства» Казань 2000, с 293-295

14.Шевелев Н С, Грушкин А.Г, Черемуха Е Г. Образование, всасывание и пути транспорта ЛЖК у овец. Тезисы 3 международной конференции «Актуальные проблемы в биологии и животноводстве» Боровск. 2000, с 253-255

15 Шевелев Н.С , Морозов И. А, Грушкин А Г., Черемуха Е Г. К вопросу о транспорте питательных веществ рубцовой стенкой Научный сборник «Доклады ТСХА» вып 272 М МСХА2000,с 187-190.

16 Шевелев НС., Морозов И А, Грушкин А Г Ультраскопическое исследование путей абсорбции питательных веществ в слизистой оболочке рубца с использованием коллоидного лантана Материалы международной конференции «Проблемы нейрогуморальной регуляции физиологических функций висцеральных систем» Омск 2000, с 106-108.

17.Шевелев НС, Грушкин АГ, Черемуха ЕГ. Динамика транспорта короткоцепочечных жирных кислот в кровь, лимфу и слюну. Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Физиологическая наука - клинической гастроэнтерологии» Краснодар. 2001, с 184-186

18 Шевелев Н С , Мартюшов В М, Грушкин А Г Роль летучих жирных кислот в обмене веществ и энергии у жвачных животных Известия ТСХА. Вып. 2 М.2001, с 160-177.

19 Шевелев НС .Грушкин А Г., Черемуха Е Г. Суточная динамика образования и всасывания ЛЖК в рубце у валухов Материалы методической и научной конференции МГАВМиБ им. К И Скрябина. М 2001, с.192-194

20 ШевелевН С , Морозов И А , Грушкин А Г , Ветрова Л Ю Гормональная регуляция транспортных процессов в слизистой оболочке рубца жвачных животных Известия ТСХА вып 4 М 2001, с 152-159

21. Шевелев Н.С., Грушкин А.Г., Черемуха Е.Г. Метаболизм ЛЖК в организме валухов. Сб. научн. трудов «Современные проблемы в зоотехнии». МГАВМиБ им. К.И. Скрябина. М. 2001 с.34-42.

22.Шевелев Н.С., Грушкин А.Г., Полякова Е.П., Черемуха Е.Г. Образование, всасывание и пути транспорта ЛЖК у овец. Доклады международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве». Боровск.. 2001, с. 215-223.

23.Шевелев Н.С.. Морозов И.А., Грушкин А.Г., Черемуха Е.Г. Визуализация летучих жирных кислот в слизистой рубца овец при использовании методов электронной гистохимии. Доклады ТСХА вып. 273,4.2, М. 2001, с.43-46.

24.Шевелев Н.С., Морозов И.А., Грушкин А.Г., Черемуха Е.Г. Морфо-функциональные изменения слизистой рубца жвачных в динамике всасывания питательных веществ. Тез. докл. 18 съезда физиологичекого общества им. И.П. Павлова. Казань. 2001 г с. 457.

О&ьілі 1 75 п "

Зак 53

I upa*. 100 )ir¡

AHO < Иідатеїьстао МСХА>> 127550 Москва, vi Тимирязевская, 44