Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль межклеточных диффузионных каналов в регуляции фенотипа дифференцированных клеток
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика
Автореферат диссертации по теме "Роль межклеточных диффузионных каналов в регуляции фенотипа дифференцированных клеток"
московский ордена Ленина, ордена трудового красного знамени и ордена октябрьской революции государственный университет Р Г Б ОД имени м.в.ломоносова
' научно-исследовательский институт
-физико-химической биологии ИМЕНИ а.н.белозерского
Р Г В О Д "Равах РУКОПИСИ
УДК 577:519
шаровская юлия юрьевна
РОЛЬ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ДИФФУЗИОННЫХ КАНАЛОВ В РЕГУЛЯЦИИ ФЕНОТИПА ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ
КЛЕТОК
03.00.02 - Биофизика
Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва -1996 г.
официальные оппоненты: член-корреспондент РАН,
доктор биологических наук, профессор А.Л.Вызов
доктор биологических наук, профессор А.А.Нейфах
доктор биологических наук А.А.Ставровская
ведущая организация:
Институт цитологии РАН, г, Санкт-Петербург
Защита состоится 1996 г. в /^^часов на
заседании диссертационного совета Д.200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292, г. ПущинЪ Московской области, проспект науки, ИТЭБ РАН.
С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Научного центра биологических исследований РАН (г. Пущино, ИТЭБ РАН).
Диссертация в виде научного доклада разослана" /гГ // 1996 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат биологических наук П.А.Нелипович
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1 Актуальность проблемы.
В многоклеточном организме фенотип каждой.клетки определяется, во-первых, ее генотипом, и во-вторых, регулирующими воздействиями остальных членов клеточного сообщества. Такая межклеточная регуляция осуществляется на двух уровнях: дистантного и преимущественно межтканевого взаимодействия при помощи гумморальных факторов (гормоны, факторы роста, морфогены, нейромедиаторы), которое обеспечивается лиганд-рецепторным механизмом, и преимущественно внутритканевого взаимодействия на локальном уровне, при непосредственном контакте соседних клеток друг с другом. Существенная роль второго способа взаимодействия для контроля роста и социального поведения клеток была показана при изучении процессов морфогенеза, дифференцировки и регенерации, в частности, в феноменах эмбриональной индукции и контактного торможения деления и движения клеток в культуре. В качестве механизмов такой регуляции рассматривались процессы адгезии и взаимодействие клеток через внеклеточный матрикс (Васильев Ю.М., Маленков А.Г., "Клеточные поверхности и реакции клеток", Медицина, М., 1968; Тринкаус, "От клеток к органам", Мир, М., 1972).
Открытие проницаемых межклеточных контактов (Loewenstein W.R., Kanno Y. J.Cell Biol., 1964, 22, 565-586), т.е. каналов прямой диффузии веществ между клетками, обнаружило принципиально новый механизм локальных межклеточных взаимодействий, при котором непосредственно между цитоплазмами соседних клеток, несмотря на двойной мембранный барьер, происходит обмен гидрофильными соединениями с молекулярной массой до 1000 Д: неорганическими ионами, клеточными метаболитами (строительный или энергетический материал), сигнальными и регуляторными молекулами. Морфологической основой такой межклеточной диффузионой связи является специализированная структура щелевого контакта (ЩК, gap
junction), представляющего собой кластер из множества гидрофильных каналов - коннексонов.
Функционирование проницаемых контактов проявляется в нескольких феноменах и, соответственно, может бьггь обнаружено несколькими различными методами. 1 - повышенная проницаемость щелевых контактов для небольших неорганических ионов создает высокую электропроводность контактных мембран, которая может быть количественно оценена электрофизиологическими методами с использованием внутриклеточных микроэлектродов (метод оценки межклеточной электрической связи); 2 - проницаемость контактных мембран для более крупных соединений определяется с помощью внутриклеточных инъекций флуоресцентных или радиоактивных меток и последующей регисрацией распространения метки в окружающие клетки; 3 - метаболическая кооперация клеток, при которой межклеточный обмен естественными клеточными метаболитами приводит к изменению фенотипа клеток-реципиентов, клеток-доноров, или и тех и других, исследуется в клеточных культурах при кооперации клеток, деффектных по какому-нибудь свойству, и их нормальных аналогов.
Определение морфологической сгуктуры ЩК (электронно-микроскопическими и иммунологическими методами), или белка, иРНК и гена ЩК также с большой вероятностью свидетельствует о наличие межклеточной диффузионной связи.
К настоящему времени установлено, что взаимодействие клеток при помощи диффузионных межклеточных контактов является фундаментальным свойством живых тканей: такие контакты обнаружены у всех классов животного царства от гидры до млекопитающих и практически во всех видах ткани, как взрослой, так и эмбриональной. Свойства проницаемых контактов и их широкое распространение позволяют рассматривать их как систему регуляции клеточных функций на локальном уровне, дополнительную к нервной и гормональной системам.
Функциональная роль этой системы ясна для возбудимых тканей -здесь высокая проницаемость контактных мембран для неорганических ионов обеспечивает непрерывность и большую скорость процесса распространения возбуждения. Для невозбудимых тканей главное значение такого межклеточного взаимодействия состоит в возможности интенсивного диффузионного обмена большим числом функционально- значимых соединений. Такой обмен может играть
существенную роль в важнейших тканевых процессах: дифференцирован и морфогенеза, регенерации и новообразований, в организации устойчивых тканевых структур.
Одним из наиболее актуальных является вопрос о роли проницаемых контактов в процессе опухолевой трансформации ткани. В первых исследованиях, проведенных Левенштейном и сотрудниками (Loewenstein W.R., Kanno Y., Nature, 1966, 209, 1248-1249) на опухолях желудка, щитовидной железы, гепатомах и на аналогичных им нормальных тканях, было показано полное отсутствие проницаемых контактов между опухолевыми клетками, в то время как нормальные ткани демонстрировали высокий уровень межклеточной связи. Подобный результат был получен также в нескольких линиях культур трансформированных клеток. Авторы пришли к выводу, что отсутствие межклеточных диффузионных каналов может быть как причиной малигнизации, так и маркером злокачественных клеток, позволяющим распознавать рак на клеточном уровне. Ими была также разработана модель саморегуляции клеточного деления, основанная на механизме распространения через проницаемые контакты росгконтролирующих веществ, асинхронно синтезируемых клетками.
Большое значение этих данных, полученных к моменту начала нашей работы, для решения вопроса об этиологии злокачественных опухолей, а также общебиологических вопросов о механизме регуляции клеточной пролиферации и фенотипической устойчивости соматических клеток, требовало более широкого исследования проницаемых межклеточных контактов в различных малигнизирован-ных тканях. Это и определило первоначальную цель настоящего исследования.
1.2 Цель и задачи исследования
Основной целью настоящей работы являлось изучение роли межклеточных диффузионных контактов в регуляции фенотипа дифференцированных соматических клеток в следующих системах: процессы неопластической трансформации печени мышей; взаимодействие нормальных и трансформированных клеток в культуре; ре-экспрессия во взрослых дифференцированных паренхиматозных клетках печени - гепатоцитах раково-эмбрионального сывороточного белка альфа- фетопротеина (АФП).
В соответствии с этим задачи работы заключались в следующем:
1. Сравнительное исследование электрической структуры ткани печени мышей, индуцированных и переваемых гепатом, а также ткани печени в процессе канцерогенеза.
2. Создание структурных моделей и расчет значений удельной проводимости наружных и контактных мембран клеток печени и индуцированных гепатом.
3. Исследование возможности изменения фенотипа опухолевых клеток при их локальном взаимодействии с аналогичными нормальными клетками в культуре.
4. Оценка особенностей метода флуоресцентных меток при работе с культурами эпителиальных клеток.
5. Исследование факторов, модулирующих проницаемость межклеточных контактов: ненасыщенные жирные кислоты.
6. Изучение роли проницаемых межклеточных контактов в процессе индукции и ингибиции синтеза АФП в первичных монослойных культурах гепатоцитов из взрослых интактных мышей и в трехмерных модельных системах.
7. Исследование межклеточных контактов в культурах клеток, трансфицированных генами различных коннексинов.
1.3 Научная новизна работы
В настоящей работе впервые проведено систематическое исследование электрической структуры печени и гепатом различного происхождения и созданы модели этих тканей, позволяющие определять мембранные харектеристики их клеток. Проведен рачет значений удельных сопротивлений наружных и контактных мембран клеток печени и гепатом.
Разработана методика электрофизиологического эксперимента, которая позволяет поддерживать устойчивые значения электрических параметров препарата печени в течение 10-12 часов измерения.
Показано, что в процессе канцерогенеза в печени развитие опухолей может происходить без нарушения проводимости межклеточных контактов для неорганических ионов в основной массе клеток. Высказана гипотеза, что существенное значение могут иметь локальные (по времени и пространственно) изменения проницаемости контактов.
Впервые показано, что трансформированные Ь клетки, растущие в смеси с нормальными фибробластами, становятся чувствительными к токсическому действию канцерогена. Таким образом продемонстриро-
вано изменение фенотипа опухолевых клеток при их локальном взаимодействии с нормальными клетками.
В работе обнаружен новый фактор, индуцирующий межклеточную связь в установившихся линиях эпителиальных клеток, исходно не связанных проницаемыми межклеиочными контактами - облучение клеток светом длиной волны 300-480 нм. Существенно, что условия такого облучения создаются при изучении межклеточной связи широко распространенным методом флуоресцентных меток (dye coupling).
Впервые обнаружен феномен контактного ингибирования синтеза раково-эмбрионального белка альфа-фетопротеина в культуре гепатоцитов и отчетливая обратная корреляция между функционированием проницаемых межклеточных контактов и экспрессией в гепатоцитах альфа-фетопротеина.
Впервые найдено, что трехмерная организация культуры гепатоцитов (при помощи искуственного внеклеточного матрикса или ко-культивирования гепатоцитов с эпителиальными клетками печени) является необходимым и достаточным фактором для ингибиции "эмбрионального" фенотипа гепатоцита.
Проведено исследование действия опухолевых промоторов на проницаемость межклеточных контактов и ре-экспрессию синтеза альфа-фетопротеина в культуре гепатоцитов. Впервые установлена возможность и определены условия, при которых опухолевый промотор ДДТ, уменьшая проницаемость контактов, повышает уровень синтеза альфа-фетопротеина.
Проведено сравнительное исследование межклеточной диффузионной связи в культурах опухолевых клеток HeLa, трансфицированных генами коннексинов Сх32 и Сх26. Обнаружена физиологическая регуляции проницаемости межклеточных контактов у этих клеток и существенные различия в чувствительности контактов к ингибиру-ющему действию СО2 У клеток с различными коннексинами.
1.4 Научно-практическая ценность работы.
Работа относится, в основном, к числу фундаментальных научных исследований. Исследование проведено на стыке биофизики, клеточной биологии и онкологии и поэтому представляет интерес для всех этих дисциплин. Проведено систематическое исследование межклеточных контактов в нормальной печени, гепатомах различного происхождения и ткани печени в процессе канцерогенеза. Получены новые данные об изменении свойств трансформированных клеток при
их локальном взаимодействии с нормальными клетками в культуре. Показано, что межклеточные диффузионные каналы являются существенным звеном в регуляции синтеза раково-эмбрионального белка альфа-фетопротеина во взрослых гепатоцитах. Эти результаты позволяют расширить и конкретизировать наши представления о роли проницаемых межклеточных контактов в процессах регуляции фенотипа дифференцированных клеток и, в частности, в процессах трансформации ткани.
Выяснение механизмов взаимодействия нормальных и опухолевых клеток (нормальные фибробласгы и трансформированные L клетки) имеет большое значение для онкологии, т.к. в организме такое взаимодействие может быть фактором, ограничивающим развитие опухоли. Кроме того, испытание многих противоопухолевых препаратов проводится первоначально в клеточной культуре. Результаты данной работы показывают, что при этом более адекватной моделью является смешанная культура нормальных и трансформированных клеток.
Обнаруженный в настоящей работе феномен индукции межклеточной связи в культуре эпителиальных клеток требует внесения корректировки в метода флуоресцентных меток (dye coupling), который широко используется для изучения межклеточных контактов. Полученная в этой части работы экспериментальная система может быть использована для изучения механизмов образования пронцаемых межклеточных контактов, а также механизмов воздействия коротковолновой части светового спектра на структуру биологических мембран.
Изучение механизмов регуляции проницаемости межклеточных диффузионных контактов в культурах клеток, трансфицированных генами различных коннексинов, позволяет выяснить как свойства каналов, сформированных из конкретных коннексинов, так и их влияние на клеточный фенотип.
1.5 Апробация работы.
Результаты работ, вошедших в диссертацию, представлялись на:
* Всесоюзном симпозиуме Межклеточные взаимодействия в дифференцировке и росте" (Тбилиси, 1968)
* Всесоюзном симпозиуме "Биофизика мембран" (Паланга, 1971);
* IV Международном биофизическом конгрессе (Москва, 1972);
* Всесоюзном совещании: "Локальные взаимодействия клеток и свойства контактных мембран" (Пущино, 1976);
* I, II и III Всесоюзных школах по механизмам взаимодействия клеток (Каунас, 1978; Друскенинкай, 1984; Каунас, 1988),
* Советско-американском семинаре "Кодирование и передача информации в биологических системах" (Суздаль, 1986);
* Всесоюзном совещании "Немышечные формы подвижности" (Чернигов, 1988);
* Всесоюзном совещании "Проблемы детерминации" (Москва, 1988);
* Всесоюзном совещании "Клеточные и молекулярные механизмы канцерогенеза и антиканцерогенеза (Ленинград, 1988);
* II международном симпозиуме "Hepatic Gene Function in Health and Disease" (Cold Spring Harbor, USA, 1989);
* Международном симпозиуме "Sapporo seminars on cancer and differentiation" (Sapporo, Japan, 1989);
* Международной конференции: "XVIII Meeting of the International Society for Oncodevolopmental Biology and Medicine" (Москва, 1990);
* Советско-финском симпозиуме "Сигнальные молекулы и клеточная дифференцировка (Суздаль, 1991);
* Международной конференци "Workshop on intercellular communication" (Pushcino, Russia, 1994);
* Международной конференции "Annual Meeting of the German Biophysics Society" (Osnabrueck, Germany, 1992);
* Семинаре кафедры биофизике Штутгатрского Университета, руководитель проф. Д.Хюльзер (Штутгарт, Германия, 1996).
1.6 Публикации
По материалам диссертационной работы опубликовано 32 работы, в том числе коллективная монография "Высокопроницаемые котактные мембраны" Наука, Москва, 1981 г. и 23 статьи в отечественных и зарубежных журналах и сборниках. Список опубликованных работ приведен в разделе 8.
1.7 Положения, выносимые на защиту
* Результаты сравнительного исследования электрической структуры ткани печени мышей, индуцированных и перевиваемых гепатом.
* Разработка структурных моделей и расчет значений удельной проводимости наружных и контактных мембран клеток печени и гепатом.
* Результаты исследования чувствительности к канцерогенам опухолевых клеток, растущих в смешанной культуре с нормальными клетками.
* Оценка особенностей метода внутриклеточных флуоресцентных меток при работе с культурами эпителиальных клеток.
* Результаты исследования механизма действия арахидоновой кислоты на проницаемость межклеточных контактов.
* Результаты исследования регуляции межклеточных контактов в культурах клеток, трансфицированных различными коннексинами.
* Результаты изучения роли проницаемых межклеточных контактов в процессе ре-экспрессии раково-эмбрионального белка альфа-фетопротеина в первичных монослойных культурах гепатоцитов из взрослых интактных мышей и в трехмерных культуральных системах.
1.8 Благодарности
Прежде всего, мне хочется сердечно поблагодарить Левона Михайловича Чайлахяна - моего руководителя от самой первой научной работы (диплома при окончании МГУ) и до настоящего времени.
С неизменной признательностью и чувством глубоково уважения я благодарю первого руководителя нашей группы Межклеточных взаимодействий в НИИ ФХБ МГУ Сергея Адамовича Ковалева.
Я благодарна И.М.Гельфанду, Ю.М.Васильеву, В.И.Гельштейн, Г.И.Абелеву, А.Л.Вызову за счастливую возможность учиться у них высокому уровню научного ремесла.
Моя искренная благодарность моим коллегам и соавторам по совместной дружной работе на протяжении многих лет: Л.Ю.Бойцовой, Л.А.Митгельману, Л.Б.Марголису, А.С.Глейберману, В.В.Смолянинову, М.Б.Беркинблиту, А.Я.Дуниной-Барковской, Е.И.Кудрявцевой, Е.С.Снегиревской, Я.Ю.Комиссарчику, а также Д.Хюльзеру (Б.Р.Никег, Германия) и всем сотрудникам руководимой им кафедры биофизики Штутгартского Университета, с которыми мне посчастливилось работать в последнее время.
Мне хочется поблагодарить директора нашего Института (НИИ ФХБ им.А.Н.Белозерского МГУ) В.П.Скулачева и всех сотрудников за удивительную атмосферу доброжелательности и свободы научного творчества, которая сохраняется у нас со дня образования корпуса "А" 30 лет назад и по сей день.
2. ЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА ТКАНИ НОРМАЛЬНОЙ ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ И ГЕПАТОМ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ
Цель данной части исследования состояла в сравнении проницаемости межклеточных контактов для неорганических ионов в ткани нормальной печени мышей, в перевиваемых и индуцированных гепатомах мыши, и в ткани печени в процессе канцерогенеза. Прямым показателем такой проницаемости является удельная проводимость (или обратная ей величина удельного сопротивления) контактных мембран. Определение этой величины в тканях со сложной структурой, какими являются печень и гепатомы, включает в себя три этапа: 1) измерение системных электрических параметров ткани: входного сопротивления клеточной системы (гвх) и распределения по ткани потенциала, приложенного внутриклеточно (ЭТП); 2) создание ее структурной модели; 3) расчет искомой характеристики на основе разработанной для возбудимых тканей кабельной теории и теории синцитиальных тканей.
2.1 Материалы и методы
Электрические характеристики нормальной ткани были исследованы на интактной печени мышей (in vivo) и на изолированных фрагментах печени (in vitro). Использование этих двух методик объясняется следующими соображениями. 1) В опытах на интактной печени измерения производятся в условиях, наиболее приближенных к условиям ее нормального функционирования. Однако, на целой печени невозможно осуществить визуальный контроль за положением электродов в клетках. Это обстоятельство может существенно сказываться на точности измерения ЭТП, особенно в точке поляризации (гвх), когда поляризующий и регистрирующий электрод должны находиться в одной клетке. Кроме того, печень в наркотизированном животном движется при движении диафрагмы, что увеличивает повреждение при вкалывании двух электродов. В опытах на изолированных фрагментах печени, отсекаемых от края
печеночной доли, устраняются эти причины ошибки измерения: препарат неподвижен; край печеночной доли представляет собой одно, двух- слойную пластинку, в которой на просвет видны отдельные клетки. 2) In vivo исследованы перевиваемые, a in vitro -индуцированные гепатомы и ткань печени на ранних стадиях канцерогенеза. Данные, полученные на нормальной печени в соответствующих условиях, служат контролем для этих малигнизированных тканей.
Объекты исследования: Опьггы in vivo проводили на нормальной печени беспородных мышей и на медленно растущих штаммах перевиваемых гепатом 46, 48, 49 (Гельштейн, Вопр.онкол.,1964, 10, 7: 65-70), трансплантированных под кожу бедра мышей линии СЗНА (любезно предоставленных В.И.Гельштейн). В опытах in vitro использовали мышей-самцов линии СЗНА, как для исследования нормальной печени, так и для получения гепатом. Индуцированные гепатомы получали путем введения мышам орто-аминоазотолуола (О A AT) 1 раз в месяц подкожно по 10 мг на животное в течение 5-8 месяцев. Использовали небольшие опухолевые узелки, возникающие на краях печеночных долей. Для измерений от края печеночной лопасти отсекали кусочек размером 1,5x1 см (нормальной ткани или с опухолью), который сразу помещали в раствор, в термостатированную рабочую камеру, расположенную вертикально под объективом микроскопа, укрепленного "на спине".
Растворы: в опытах in vivo в качестве омывающего препарат раствора использовали раствор Рингера (156,5 мМ Na+, 5,6 мМ К+, 2,1 мМ Са++, 163,8 мМ CI", 2,5 мМ НСО3-), нагретый до 30-370 С, который наливался в брюшную полость или (для гепатом) в углубление на бедре, образованное кожным лоскутом. В опытах in vitro фрагмент исследуемой ткани помещали в камеру объемом 1,5 мл, в которой поддерживался постоянный проток раствора, состоящего из среды 199 (45%), гидролизата лактальбумина (45%) и сыворотки крупного рогатого скота (10%). Объем циркулирующего раствора был равен 150200 мл. Температура раствора (36-36,5° С) потдерживалась при помощи ультратермостата NBE (VEB Prüfgeräte-Werk Medingen, ГДР) и измерялась в рабочей камере полупроводниковым микротермосопротивлением МТ-54 Карманова (Агрофизическии НИИ, Ленинград).
Измерение системных электрических параметров исследуемых тканей проводилось стандартным методом прямоугольных импульсов
гиперполяризующего тока (Hodgkin et al., Proc. Roy. soc., 1946, B, 133:444-479) с использованием двух стеклянных внутриклеточных микроэлектродов, заполненных 2,8 M раствором KCL. Толщина кончика около 0,5 мкм, сопротивление порядка 10-70 мОм. Между введенным в клетку микроэлектродом и хлор-серебрянным индифферентным электродом, пропускались импульсы тока длительностью 10-30 мсек. и силой 3,0-4,5x10-7 А от генератора прямоугольных импульсов. Другим внутриклеточным микроэлектродом регистрировались изменения мембранного потенциала клеток, расположенных на разных расстояниях от поляризуемой клетки. Один из микроэлектродов мог переключаться из поляризующей цепи в цепь регистрирующую. Оба электрода соединялись со входами катодных повторителей, собранных по схеме Вызова А.Л. и Бонгарда М.М. (Физиол. ж., 1959, 45, 3: 110-113). Далее сигналы подавались на усилители постоянного тока двухлучевого осциллоскопа Universal Disa Indicator и регистрация потенциалов производилась фотографированием с его экрана. Сила тока измерялась по падению напряжения на сопротивлении 200 кОм, включаемом на время измерения последовательно с индифферентным электродом. Измеренные значения потенциалов Ux (х - расстояние от точки поляризации до точки регистрации потенциала в мкм.) относили к величине тока и выражали величиной rx=Ux/io в килоомах. При малых значениях х (не более 10 мкм, оба электрода находятся в одной клетке) гх равно гвх.
Введение электродов в клетки осуществляли при помощи микроманипуляторов ММ-1; в опытах in vivo - под контролем бинокулярного микроскопа, в опытах in vitro - под контролем микроскопа МБИ (увеличение 225х, точность определения расстояния между электродами - I мкм). Положение электродов внутри клеток тестировалось по величине мембранного потенциала (МП).
2.2 Системные электрические характеристики ткани печени и гепатом.
Результаты измерения мембранных потенциалов (МП) и входных сопротивлений в тканях нормальной печени и гепатом представлены в таблице I. В опытах in vivo значение средних величин гвх определялось суммарно по нескольким опытам; в опытах in vitro среднее значение гвх определено в кавдом опыте и приведены данные для опытов с минимальным и максимальным его значениями. Сравнение МП опухолевых и нормальных клеток показывает, что у двух штаммов
гепатом (46 и 48) мембранный потенциал почти в 2 раза ниже, чем МП клеток нормальной печени в тех же условиях: соответственно 19,7; 15,9 и 36,2 мВ. МП клеток штамма 49 (34,4 мВ) достоверно не отличается от МП клеток нормальной печени. Среднее значение МП клеток индуцированных гепатом (43,4 мВ) соответствует значению МП в нормальной печени в условиях in vitro (42,5 мВ). Таким образом, не наблюдается корреляции между типом клеток и величиной их МП: существуют как гепатомы со значительно сниженным значением МП, что может свидетельствовать об изменениях ионных градиентов, так и гепатомы, сохраняющие нормальный уровень МП.
Таблица 1. Мембранные потенциалы и входные сопротивления ткани печени, перевиваемых и индуцированных гепатом мыши.
Вид ткани МП, мВ гвх, кОм кол-во опытов
Нормальная печень 36,2 ± 0,6 81 ± 8 5
(in vivo)
Нормальная печень 42,5 ± 0,4 от 189 ±9 до 613 ± 21
(in viiro) 25
Перевиваемые
гепатомы (in vivó)
штамм 46 19,7 ± 0,5 98 ± 9 7
штамм 48 15,9 ±0,7 110 ± 17 3
штамм 49 34,4 ± 0,8 146 ± 17 4
И ндуцированные 43,4 ± 0,6 от 215 ± 16 до 522 8
гепатомы (in vitro) ±27 и 800 ±46 в одном опыте
Печень в ранние сроки от 151 ±25 до 338 10
канцерогенеза (in vitro) ±83
Среднее значение входных сопротивлений нормальной печени, измеренное in vivo, в несколько раз ниже, а дисперсия регистрируемых значений гвх существенно выше, чем в опытах in vitro. Вероятно, это объясняется описанными выше систематическими ошибками измерения, возникающими в первой случае. Для проверки этого предположения мы провели оценки гвх и спада потенциала на ткани печени in vitro также на объемной части печеночной доли, т.е. вдали от ее края. Согласно этим измерениям, только самые высокие из
зарегистрированных in vivo величин rBX (200 кОм) следует считать истинными значениями, т.е. случаями, когда оба электрода находятся в одной клетке. При этом, спад потенциала в объемной части препарата происходит круче, чем на краю печеночной доли и в гепатомах.
Существенным при сравнении результатов, полученных с помощью этих двух методик, является тот факт, что выделение фрагмента печени из организма животного и работа на этом препарате в условиях разработанной нами методики в течение 7-8 часов, не нарушают метаболическую активность и ионный баланс, присущие клеткам интактной печени, что отражается в сохранении уровня МП, а также не изменяет принципиально структуру межклеточных связей, о чем свидетельствуют результаты измерения входных сопротивлений и ЭТП.
Средние величины гвх у 8 из 9 исследованных индуцированных гепатом соответствуют входным сопротивлениям в нормальной печени in vitro. Измеренное нами в одном опыте увеличение гвх до 800 кОм не свидетельствует о разобщении контактов, т.к. кривая спада потенциала в этом случае не отличалась от таковых на других гепатомах. Существенно не отличаются входные сопротивления перевиваемых гепатом и нормальной печени in vivo.
Значения rI5X на ранних стадиях канцерогенеза соответствуют его величинам в нормальной печени в зимне-весенний период, однако здесь не наблюдается высоких (до 600 кОм) значений, характерных для нормальной печени в летние месяцы. Это может указывать на невосприимчевость клеток печени, подвергшихся воздействию канцерогена, к регулирующим гормональным влияниям.
Распределение по ткани нормальной печени и индуцированной гепатомы потенциала, приложенного внутриклеточно, иллюстрирует рис. 1а, б. Кривые имеют ступенчатый вид, т.к. основная доля спада потенциала на внутреннем сопротивлении ткани происходит на контактных мембранах, а цитоплазма клеток практически эквипотенциальна, что показали наши измерения ЭТП вблизи точки поляризации. Заметное изменение МП в ответ на внутриклеточную поляризацию регистрируется на расстоянии до 14 клеточных размеров от поляризуемой клетки в обоих типах ткани. Это однозначно свидетельствует о резко повышенной проводимости контактных мембран по сравнению с мембранами, обращенными в наружную среду.
а
зоо
ГП.П.п.т
en
\ , е. , а, ■ .
120 180 НО ЗОО 360 '2 О
¡00 -
т
300
13 12
Рис. 1. Распределение электротонического потенциала (ЭТП) по ткани нормальной печени (а) и по ткани индуцированной гепатомы (б) при внутриклеточном пропускании тока. По оси абсцисс - расстояние от точки поляризации до точки регистрации потенциала: верхняя шкала -в ед.среднего диаметра клеток (для а -30 мкм, для б -22 мкм) . По оси ординат - величина ЭТП (в килоомах). Амплитуды ЭТП нормированы по величине поляризующего тока и поэтому имеют размерность сопротивления. Высота отдельного столбика равна средней величине из всех измерений (обозначены точками) ЭТП в данной точке. Для каждого случая приведены данные, полученные в одном опыте in vitro.
о
б
,00
Jflr,
Рис. 2. Распределение по ткани нормальной печени (а) и перевиваемой гепатомы 46 (б) электротонического потенциала. По оси абсцисс - расстояние от точки поляризации до точки регистрации потенциала. По оси ординат -величина ЭТП. Амплитуды ЭТП нормированы по величине поляризующего тока и поэтому имеют
размерность сопротивления. (У) - нормальная печень и (2) - гепатома -средние значения ЭТП для данного расстояния. Каждый график -суммарный результат всех опытов \п vivo.
Кривые распределения ЭТП в ткани перевиваемой гепатомы (штамм 46) и нормальной печени in vivo (рис.2) представляют собой экспоненты, проведенные при помощи метода наименьших квадратов через средние значения ЭТП для данных растояний. Более точно определить характер спада потенциала (ступенчатый или непрерывный) в этих опытах не удается из за дисперсии значений ЭТП, особенно высокой в области поляризации. Сравнение кривых показывает, что затухание ЭТП с расстоянием в нормальной печени и в гепатоме 46 практически не отличается. Сходные кривые распределения потенциала получены и на гепатомах 48 и 49. Из этого следует, что между клетками всех исследованных нами гепатом существует эффективная электрическая связь, как и между клетками нормальной печени. Необходимо также отметить, что затухание электротонического потенциала не зависит от направления перемещения электродов вокруг точки поляризации, т.е. электрическая структура исследованных тканей изотропна.
2.3 Структурные модели ткани печени и индуцированных гепатом мыши.
Полученные экспериментальные данные были использованы для расчета удельных сопротивлений наружных и контактных мембран клеток печени и индуцированных гепатом, проведенного совместно с д.б.н. В.В.Смоляниновым на основе унифицированной теории электрических синцитиев (Смолянинов В.В., Математические модели биологических тканей. М., "Наука", 1980).
Ткань, у которой клетки соединены системой проницаемых межклеточных контактов, можно представить в виде электрического синцития, состоящего из отрезков кабеля, имеющих наружную
мембрану с высоким сопротивлением и проводящий "сердечдечник" (протоплазму и контактные мембраны) с низким сопротивлением. Такие отрезки кабеля состоят из одной или нескольких клеток, последовательно примыкающих друг к другу. В структурной модели синцития схема соединения этих отрезков кабеля в разветвленную сеть выбирается в соответствии с морфологией данной ткани.
Основными параметрами структурной модели синцития являются: размерность сети синцития (п); степень связности клеток (S), т.е. количество клеток, с которыми каждая данная клетка связана проницаемыми контактами; а так же характеристики кабельного элемента. Для обозначения таких моделей используется символ N".
Детальное морфологическое исследование структуры нормальной печени было проведено Элиасом (Elias Н. In: The liver. N.Y.; L., 1964, 1, p.41-87), который показал, что каждая доля печени предсталяет собой единую, широко ветвящуюся сеть печеночных клеток. Исходя из этого и из обнаруженной нами электрической изотропности ткани, в качестве средней модели реальной структуры объемной части паренхимы печени и индуцированных гепатом, имеющих сферическую форму, использовали модели правильной трехмерной сети. Были рассмотрены модели сетей, отличающиеся величиной S и длиной кабельного элемента: N3 - с минимальной степенью связности, равной 3; N4 в которой каждая клетка контактирует с 4 соседними. В этих моделях кабельный элемент сети эквивалентен клетке. На их основе можно строить варианты с более "разреженой" упаковкой, заменяя каждую клетку колонкой из ш клеток.
Однако структура края печеночной доли, на которой проведены основные электрофизиологические измерения на нормальной печени in vitro, значительно отличается от ее объемной части. Самый край лопасти представляет собой пластинку толщиной в одну клетку, которая, постепенно расширяясь, переходит в объемную часть. Поэтому для измерений, проведенных на краю печени, когда поляризующий электрод находится в краевой клетке пластинки, расчет электрических характеристик проводился на основе модели правильной двухмерной сети со степенью связности 6 (N6). Таким образом, при расчетах для ткани печени были использованы две независимые модели.
При выборе характеристик кабельного элемента синцития необходимо знать диаметр клеток и плотность их упаковки, косвенным
показателем которой может служить доля внеклеточного пространства в объеме ткани. Так как гепатомы различного происхождения по морфологии значительно отличаются друг от друга, мы провели морфометрические измерения на ткани тех же гепатом, на которых проводились электрофизиологические опыты, сравнивая морфологию печени и гепатомы (табл. 2). На гистологических препаратах (парафиновые срезы толщиной 13 мкм, содержащие участки нормальной ткани и гепатомы) измеряли следующие величины: N -число клеток в квадратном поле зрения с длиной стороны 225 мкм; <1о -диаметр клеток; а - относительная площадь, занятая клетками. Кроме того, в табл. 2 приведены расчетные величины: Р - "плотность", или число клеток в I мм3, вычисляемая по числу N и объему среза в поле зрения; Рт - максимальная плотность, определяеая как плотность упаковки сферических клеток данного диаметра; а0 - теоретическая оценка доли паренхимного пространства, определяемая как Р/Рт, а так же (1 - диаметр клеток, измеренный в клеточной суспензии.
Таблица 2. Морфометрические характеристики ткани печени и гепатомы
Ткань М* ¿0 мкм 1-а Р Рт 1-ао (1 мкм
Нормальная 80 23,3 0,25 1,22*105 1,51*105 0,2 30
печень
Гепатома 95 18 0,33 1,44*105 3,20* 105 0,55 22,5
Как видно из таблицы, измерения в клеточной суспензии и на срезах дают сходные соотношения диаметров клеток печени и гепатомы. В соответствии с этим в моделях печени (1 = 30 мкм., гепатомы - 22,5 мкм. Определение на гистологических срезах и теоретическая оценка доли паренхимного пространства (а и а0) показывают, что ткань гепатомы организована более рыхло, чем ткань печени.
Модель кабельного элемента сети выбирается так, чтобы его поперечное сечение имело ту же площадь, что и область контакта клеток. Площадь наружной клеточной мембраны распределяется по длине элемента. При расчетах использовали два значения величины площади наружной мембраны клетки, выбор которых основан на следующих предположениях: 1) в области клеточного контакта, кроме небольших участков повышенной проводимости, остальная мембрана
практически не проводит ток из-за слабой утечки его в наружную среду; 2) в другом крайнем случае можно полагать утечку через контактную щель вполне хорошей и относить мембрану этих областей к наружной мембране. Поскольку по литературным данным в клетках печени мыши площадь, занимаемая структурами щелевого контакта, составляет 1,5% от площади всей клеточной мембраны, то в этом случае практически всю поверхность клетки можно считать наружной.
2.4 Расчет удельных сопротивлений наружных и контактных мембран клеток печени и гепатом.
Кабельный элемент синцития определяется двумя характеристическими величинами: р - входное сопротивление полубесконечного кабеля и X - расстояние вдоль кабеля, на котором ЭТП уменьшается в е раз. При произвольной форме поперечного сечения элемента эти величины определяются как:
• ИрА (1)
«1Р± ' " Рх Кб ' л а±
Здесь Ям - удельное сопротивление наружной мембраны, Н.0б -суммарное удельное сопротивление проводящего сердечника кабельного элемента, включающее удельное сопротивление цитоплазмы К.в и контактной мембраны Ик :
Яоб = + 2 Як1/с (2)
где / - длина элемента, е - доля площади проводящего контакта по отношению к площади поперечного сечения. В формулах (1) а± -площадь поперечного сечения элемента, Рх - площадь наружной мембраны на единицу длины кабельного элемента. В общем виде величины а_1_, Р1 и / определяются следующими образом:
ах = сс!2; рх = Ьс1, / = шс! (3)
где с! - линейная характеристика поперечного размера элемента-клетки, с, Ь и ш - коэффициенты, которые зависят отвыбора модели кабельного элемента. Процедура расчета состояла в следующем.
1) По полученной в эксперименте кривой распределения ЭТП определялись значения Б и 1. Для этого экспериментальная кривая сравнивалась с кривыми распределения потенциала, расчитаными при разных значениях X и Б для данной структурной модели синцития. Значения этих величин, при которых наиболее полно совпадали экспериментальная и расчетная кривые, являются искомыми.
2) По измеренной величине г„х определялась величина Я0г>. Для трехмерной однородной сети расчетная формула для
Б -1 сс1 ^
6я
Для рассматриваемой двухмерной сети И0б ~ • (5)
где Г = 1н(2^6л. /1)
3) Удельное сопротивление наружной мембраны вычислялось по формуле: = КобЬА.2/а1. (6) а контактной мембраны - по формуле (2) для всех использованных моделей.
Данные по распределению ЭТП, полученные на краевой зоне печени, удовлетворительно аппроксимируются торетнческой кривой распределения потенциала, рассчитанной для сети М^ при значении Х= 500 мкм (рис. 3).
< с
с в
Рис. 3. Нормированный спад потенциала в пластинке печени при удалении от поляризующего электрода. По оси абсцисс - расстояние от точки поляризации до точки регистрации потенциала (в ед. среднего диаметра клетки - 30 мкм.); по осы ороииат - амплитуда ЭТП, нормированная к величине потенциала в "нулевой " клетке, где производится поляризация. Ломаная личин - теоретическая аппроксимация (см. текст): одинаковыми значками обозначены экспериментальные нормированные средние значения ЭТП для одного опыта.
В объемной части печени экспериментальная кривая спада потенциала интересна тем. что она не может быть описана трехмерной моделью со степенью связности клеток 5 = 8-9, которая вытекает из модели Г.Элиаса. Соответствует экспериментальным данным только модель с меньшей степенью связности: при ).= 500 мкм. Таким образом, дня объемной части печени X = 500 мкм и Б = 4.
Кривая спада ЭТП в гепатоме имеет еще более пологий характер, чем в объемной части печени. Даже при минимальной для трехмерной сети степени связности S = 3, и при Х= оо, расчитанное поле потенциала спадает круче, чем экспериментально измеренное в ткани гепатомы. Поэтому соответствовать экспериментальным данным может только трехмерная сеть с более рыхлой организацией. Поле модели N3 при m
= 2 и X = 600 мкм удовлетворительно аппроксимирует экспериментальные данные. Таким образом, для модели ткани гепатомы S = 3, ш = 2 и 1 = 600 мкм.
Используя найденные для всех трех моделей значения S и X и характеристики их кабельных элементов, расчитывали величины RM и RK. Результаты расчета и значение основных параметров моделей приведены в табл.3. Указанный в таблице разброс величины RM обусловлен описанным выше выбором модели клетки, т.е. учетом доли наружной мембраны.
Для ткани печени обе независимые модели дают близкие значения величин RM и RK. Использование двухслойной модели печеночной пластинки приводит к некоторому занижению величины RM, т.к. в ней не учитывается постепенное увеличение числа клеточных слоев при удалении от края пластинки. Расчитанные нами значения величин RM и R06 совпадают со значениям, полученными позже в работе (Graf et al., J.Physiol., 1978, 284:105-126) на печени мыши в аналогичной экспериментальной системе (микроэлектродный метод и использование расчетной модели) и несколько ниже значений для печени крысы в тех же условиях (Meyer et al., J. Cell Biol., 1981, 91:505-523). Они также подтверждаются результатами измерения RM и RK методом пэтч-кламп на одиночных клетках и двухклеточных агрегатах в культуре гепатоцитов мыши (Плонский и др., Биол. мембраны, 1988, 5:44-50).
Полученная для клеток гепатомы величина RM соответствует ее значениям для клеток печени, а расчетная величина RK не только не выше, но даже несколько ниже, чем в печени, что является результатом более пологой кривой спада ЭТП на ткани гепатомы, чем в объемной части печени.
Важным результатом настоящей модельной работы является тот факт, что удовлетворительную аппроксимацию реальной картины спада потенциала как в печени, так и в гепатоме, удается получить только на основе трехмерных моделей с небольшой степенью связности клеток 5=3-4, в то время как из модели структуры печени, созданной Элиасом на основе классических морфометрических измерений.
следует степень связности 8=8-9. Одним из вариантов решения этого противоречия может быть предположение, что не всякий морфологический контакт между клетками паренхимы печени является электропроводящим.
Таблица 3. Геометрические и электрические характеристики синцитиев ткани печени и гепатомы.
Параметры сцинтиев Нормальная печень Гепатома (объемная структура)
на краю лопасти в объемной части
гвх, Ом 0,4* 106 0,2*10^ 0,35* 106
п 2 3 3
S 6 4 3
1Т1 1 1 2
X ,см 5* 10-2 5*10-2 6* 10-2
R06, Ом* см 1800 1400 590
RM, Ом*см2 1,4-3,6*103 2,4-7,2* 103 3,3-5,6* 103
RK, Ом* см2 при е=1 2,7 2,2 0,66
RK, Ом* см при е=0,03 8*10-2 6,5* 10-2 2*10-2
Таким образом, как качественный анализ кривых распределения ЭТП, так и проведенный расчет удельных сопротивлений контактных мембран клеток показывают, что в исследованных нами гепатомах, а также а процессе канцерогенеза, не происходит генерализованной потери проницаемости межклеточных контактов для неорганических ионов. При этом необходимо отметить, что использованный метод не позволяет обнаружить немногочисленные несвязанные клетки, если они имеются в ткани, или кратковременные нарушения межклеточной связи.
***
Данные, полученные в этой серии экспериментов, доказывают, что существуют опухоли, у которых контакты по проницаемости для неорганических ионов не отличается от контактов соответствующей нормальной ткани. Качественно анлогичный результат был получен в работе Шеридана (Sheridan, J.Cell Biol., 1970,45:91-99): пары электрически связанных опухолевых клеток были обнаружены во всех
типах исследованных им оухолей (3 вида гепатом и 2 вида сарком). Следовательно, отсутствие проницаемых межклеточных контактов не является обязательным свойством опухолевых клеток, возникающим в момент трансформации или в процессе опухолевой прогрессии. Однако, как уже указывалось выше, существуют опухоли и линии трансформированных клеток, у которых полностью утрачивается межклеточная диффузионная связь (см. также: Krutovskikh et al., Int. J. Cancer, 1994, 56: 87-94 - значительная редукция дифузионной связи в первичных опухолях печени человека). При этом такая утрата "коммуникабельности" происходит только у раковых и трансформированных клеток и всегда связана с потерей контроля роста.
Основываясь на этих данных и более общих соображениях о свойствах проницаемых межклеточных контактов, мы высказали предположение (Бойцова и др., 1970), что наиболее существенным является вопрос о проницаемости контактов между нормальными и опухолевыми клетками, а не между клетками внутри гепатомы. Действительно, высокая проницаемость контактов, способствуя усреднению содержимого клеток за счет взаимообмена химическими компонентами, может гасить изменения, возникающие в отдельных клетках или в небольших участках ткани и приводить к тому, что не будет проявляться фенотип трансформированных клеток, т.е. не будет происходить образование опухоли. Условие неконтролируемого роста, в таком случае, будет состоять в нарушении контактной проводимости в самые начальные сроки процесса малигнизации и в небольшом количестве клеток. Возможность передачи через клеточные контакты физиологических метаболитов от клетки, способной к определенной метаболической реакции, к клетке, генегически деффектной по этому признаку (так называемая метаболическая кооперация), была продемонстрирована к этому времени в ряде работ (Subak-Sharpe et al., J.Cell Sei., 1969, 4: 353-367; Cox etal., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1970, 67: 1573-157). Исходя из изложенного предположения, на следующем этапе работы мы исследовали взаимодействие нормальных и трансформированных клеток в культуре.
3. ИЗМЕНЕНИЕ ФЕНОТИПА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ПРИ ИХ ЛОКАЛЬНОМ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С НОРМАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ В КУЛЬТУРЕ
Многие типы неопластических соединительнотканных клеток грызунов значительно более резистентны к токсическому действию канцерогенных полициклических углеводородов, таких как 7,12-диметил-бензо(а)антроцен (ДМБА), чем их нормальные предшественники (Starikova V.B., Vasiliev J.M., Nature, 1962, 195:42-43). Эти различия чувствительности обусловлены тем, что в опухолевых клетках происходит редукция ферментной системы, метаболизирующей эти углеводороды, а токсическим действием обладает не сам углеводород, а какой-то из его метаболитов. При этом метаболиты, накапливающиеся в среде культур чувствительных клеток, не токсичны ни для нормальных, ни для опухолевых клеток. По-видимому, активными являются короткоживущие метаболиты, которые могут действовать лишь в клетке, где они образуются, или в непосредственной близости от нее. По анологии с явлением метаболической кооперации можно ожидать, что активные метаболиты канцерогена могут действовать и на резистентные опухолевые клетки, если эти клетки окажутся в контакте с нормальными клетками, метабилизирующими добавленный в культуру углеводород. Проверка этого предположения и составляла задачу данной части исследования.
3.1 Материалы и методы
Объекты исследования. Использовались два типа клеточных культур: (а) - нормальные эмбриональные фибробласты мыши, чувствительные к канцерогенным углеводородам (НФ) и высоко-резистентные неопластические мышиные фибробласты линии L. Нормальные клетки получали путем трипсинизации 16-18 суточных мышиных эмбрионов и рассаживали в пеницилиновые флаконы на покровные стекла в количестве 4-5х105 клеток на флакон. Через 3 суток с части покровных стекол механически удаляли половину образовавшегося монослоя НФ,
после чего в эти же флаконы высевали 2,5-ЮхЮ4 клеггок Ь. Таким образом, на одном и том же стекле мы имели смешанную культуру НФ и Ь клеток и чистую культуру Ь клеток. Оставшиеся флаконы с НФ служили контрольной чистой культурой НФ, а контрольные культуры Ь клеток высаживали на чистые покровные стекла в тех же концентрациях, что и в смешанных культурах.
Растворы и реактивы. Культуральная среда состояла из 45% среды 199, 45% гидролизата лактальбумина и 10% сыворотки крупного рогатого скота. ДМБА, синтезированный в химической лаборатории ИЭиКО АМН СССР, предварительно растворяли в сыворотке и добавляли в к среде культур в конечной концентрации 1 мкг/мл. Среду меняли через 2-3 суток; после добавления ДМБА среду не меняли до конца опыта.
Для авторадиографических исследований использовали тимидин, меченый тритием (удельная активность 500 млкюри/ммоль). В опытах с предварительно мечеными клетками Ь их культуры выращивали в течение 2 суток с Н3-тимидином (0,1 мккюри/мл). Затем клетки отмывали, суспендировали и в присутствии немеченого тимидина добавляли к культуре НФ, как описано выше. При дальнейшем культивировании клеток к среде добавляли немеченый тимидин в концентрации 2,5 мкг/мл для предотврашения реугелизации метки. В опытах с импульсной меткой Н3-тимидин (0,5 мккюри/мл) добавляли к среде за 1 час до фиксации. Культуры в этих опытах фиксировали, покрывали жидкой эмульсией типа М (НИИХИМФОТО), проявляли в амидоловом проявителе и докрашивали гематоксилином.
3.2 Влияние ДМБА на клеточную плотность в культурах НФ и Ь клеток.
3.2.1 Морфологические изменения в культурах.
В предварительных опытах был проверен эффект ДМБА в чистых (однородных) культурах нормальных фибробластов и клеток Ь. В чистых культурах НФ, инкубированных с ДМБА в концентрации 1 мкг/мл, количество НФ через 3 суток было в 2-3 раза ниже, чем в контрольных культурах, и их морфология заметно менялась. В чистых культурах клеток Ь после инкубации в течение 3 суток с ДМБА плотность клеток отличалась от контроля не более, чем на 10-20% и клетки сохраняли свою исходную морфологию. Таким образом, эти опыты подтвердили описанные ранее существенные различия между
НФ и Ь клетками в чувствительности к ДМ Б А (Андрианов и др., Медицина, Москва, 1971).
В контрольных смешанных культурах Ь клетки интенсивно размножались как в той части культуры, где они росли на монослое нормальных клеток, так и в той, где монослой НФ был предварительно удален. Клетки Ь в таких культурах были легко отличими морфологически от подлежащих нормальных клеток: они были менее распластанными, имели более темноокрашенную цитоплазму и более узкие отростки.
В смешанных культурах, инкубированных в течение 3-5 суток с ДМБА, потность Ь клеток, растущих на стекле, была такой же, как в контрольных культурах. Напротив, в той части культуры, где Ь клетки находились на монослое НФ, их количество резко уменьшалось и они приобретали более вытянутую веретеновидную форму. Плотность нормальных фибробластов в таких культурах также уменьшалась и форма их становилась более вытянутой. При этом было невозможно надежно отдифференцировать НФ от Ь клеток по морфологическим признакам. Поэтому для количественного определения влияния ДМБА на клеточную плотность в смешанной культуре были поставлены опыты с предварительно меченными Н5-тимидином Ь клетками.
3.2.2 Опыты с предварительно меченными клетками Ь.
При размножении предварительно меченых Ь клеток, растущих на стекле, их плотность увеличивалась за 3-5 суток в 3-4 раза. Тем не мене, в таких культурах подавляющее большинство клеток оставалось мечеными (82-95%). Следовательно, интенсивность предварительной метки была достаточной для того, чтобы она обнаруживалась в клетках после нескольких делений.
В смешанных культурах, инкубированных 3-5 суток в присутствии ДМБА, плотность меченых клеток Ь на монослое нормальных фибробластов была в 3-6 раз ниже, чем в контрольных смешанных культурах, не инкубированных с ДМБА (табл. 4). Плотность нормальных немеченых клеток под влиянием ДМБА снижалась в 2-2,5 раза. Количество Ь клеток в той части стекла, где предварительно был удален слой НФ, лишь незначительно отличалось от контрольных культур. Таким образом, опыты с предварительно мечеными Ь клетками подтвердили, что ДМБА резко уменьшает плотность клеток Ь, растущих в непосредственном контакте с нормальными фибробластами, и не влияет на Ь клетки, растущие на том же стекле, в той же среде, но не имеющих такого контакта.
Таблица 4. Влияние ДМБА на плотность клеток в различных частях смешанной культуры.
№ опыта Воздействие Меченые Ь клетки на стекле на слое НФ Немеченые нормальные клетки
1 Контроль 533±76 666±82 2058±189
ДМБА, 484±67 228±21 1057±152
72 час.
2 Контроль 4671±536 2978±166 2019±80
ДМБА, 3612±277 452±55 851+77
120 час.
3 Контроль 2146+151 1687±84 5787±239
ДМБА, 1977±66 330+21 3005+396
72 час.
4 Контроль 3040+422 3619±288 2802±419
ДМБА, 2570±481 905+234 1563±86
120 час.
Результаты представлены в виде среднего (из 3 повторностей) числа клеток в 100 полях зрения микроскопа (7850 мкм2) и средней квадратичной ошибки.
3.3 Влияние ДМБА на синтез ДНК в культурах НФ и Ь клеток
Целью этой серии опытов было выяснение вопроса о том, будет ли ДМБА в смешаной культуре тормозить вхождение клеток Ь в фазу стнтеза ДНК. Как уже говорилось, морфологически отличить нормальные и Ь клетки возможно в контрольных смешанных культурах, но не в культурах, обработанных ДМБА, поэтому в последних определяли лишь суммарный ИМ для обоих типов клеток (табл. 5). Так как контрольные культуры нормальных клеток находились уже в стационарной фазе и фиксировались через 3 суток после смены среды, то ИМ в таких культурах был низким. Столь же низким был ИМ фракции НФ в смешанной контрольной культуре. Напротив, ИМ фракции клеток Ь в такой культуре был таким же высоким, как и в изолированой культуре данного типа. Суммарный индекс метки в смешанных культурах имел промежуточное значение. Трех-суточная инкубация с ДМБА не влияла на клеточную плотность и
ИМ в чистых культурах клеток Ь. В культурах нормальных фибробластов под влиянием ДМБА, так же как в предыдущих опытах, плотность клеток существенно снижалась, и без того низкий ИМ снижался незначительно.
Таблица 5. Влияние ДМБА на синтез ДНК в чистых и смешанной культурах НФ и Ь клеток.
Тип Количество клеток в одно м Индекс метки (%)
культуры поле зрения
контроль ДМБА контроль ДМБА
Чистые культуры:
НФ 13,5+0,7 6,1+0,2 2,4+0,2 1,6±0,3
Ь клетки 4,2±0,4 6,3+0,6 53,0+1,2 51,3+2,1
Смешанная культура:
суммарно 23,6+0,5 8,6+0,2 13,4+0,7 1,4+0,3
НФ 17,5+0,8 - 2,0±0,2 -
Ь клетки 6,1 ±0,6 - 46,2+0,9 -
Индекс метки = процент меченых ядер от всех интерфазных ядер + средняя квадратичная ошибка. ИМ определяли при подсчете 500-2000 клеток в каждой культуре. Данные одного опыта.
Опыты с предварительно меченными Ь клетками, описанные выше, показали, что в смешанных культурах, инкубированных 3 суток с ДМБА, Ь клетки составляют значительную долю всей популяции (1/5 -1/2 часть всех клеток). Если бы ИМ этих клеток оставался столь же высоким, как ИМ клеток Ь в чистых культурах и в контрольных смешанных культурах, то суммарный ИМ в смешанных культурах, обработанных ДМБА, был бы значительно более высоким, чем в чистых культурах НФ, обработанных ДМБА. В действительности в смешанной культуре, подвергшейся действию ДМБА, суммарный ИМ был столь же низкий, как ИМ в культуре нормальных фибробластов. Следовательно, доля клеток Ь, синтезирующих ДНК, среди всей популяции Ь клеток смешанной культуры, подвергшейся действию ДМБА, была намного ниже, чем в контрольной смешанной культуре. Иными словами, ДМБА в смешанной культуре резко тормозил вхождение клеток Ь в фазу синтеза ДНК.
3.4 Специфичность действия ДМБА на Ь клетки в смешанной культуре.
Что является токсическим фактором для Ь клеток: ДМБА и его метаболиты или токсические продукты распада НФ? Для решения этого вопроса мы растили Ь клетки на монослое НФ, предварительно проинкубированных с ДМБА, но при отсутствии канцерогена в культуральной среде. Для этого культуры НФ растили на покровных стеклах, в часть культур (табл.6, группы 2 и 3) на 4-й день при смене среды вносили 1 мкг/мл ДМБА и растили в присутствии канцерогена еще 3 суток. На 7-й день во всех культурах меняли среду на свежую без ДМБА, а на 8-й день во всех культурах удаляли половину слоя НФ и высевали предварительно меченые Н -тимидином Ь клетки. На 9-й день в часть культур (группы 3 и 4) при смене среды вносили 1 мкг/мл ДМБА; в группах 1 и 2 в это время меняли среду на свежую без ДМБА. Еще через 3 суток все культуры фиксировали и готовили радиоавтографы описанным в методике способом.
Таблица 6. Размножение Ь клеток на предварительно обработанном ДМБА монослое нормальных фибробластов.
Воздействие Количество клеток на 100 полей
дни культивирования зрения
1-3 4-6 7-8 9-11 Меченые Ь клетки Немеченые
Группа на стекле на слое нормальные НФ фибробласты
1 _ 2146+151 1687+84 5788±239
2 + 2615+146 1970±95 9781108
3 - + - + 2928±П7 930±110 575112
4 - - - + 1977+66 330±21 3005+396
+: в среду добавлен ДМБА, -: среда без ДМБА.
Как видно из таблицы, степень снижения плотности НФ одинакова после первого и второго добавления в культуру ДМБА. Количество Ь клеток, растущих на поверхности стекла, не обнаруживает статистически значимых различий. Значительное снижение плотности Ь клеток наблюдается только в группах 3 и 4, когда Ь клетки находятся на монослое НФ в присутствии канцерогена, как в случае с предварительным инкубированием НФ с ДМБА - группа 3, так и без него - группа 4. (Более слабый эффект в группе 3 по сравнению с 4 объясняется, очевидно, меньшим количеством подлежащих
нормальных клеток.) В то же время, количество Ь клеток, растущих на монослое НФ, предварительно проинкубированном с ДМБА, но в отсутствии канцерогена (группа 2), не отличается от их количества на ингактном монослое НФ (группа 1).
Известно, что нормальные клетки, проинкубированные с токсичными дозами ДМБА, продолжают гибнуть много дней после удаления канцерогена из культуральной среды (Андрианов и др.,М., Медицина, 1971). Однако мы видим, что монослой таких поврежденных и гибнущих НФ не токсичен для контактирующих с ним Ь клеток, если в среде отсутствует канцероген. Следовательно, токсическое действие ДМБА на Ь клетки, растущие в контакте с НФ, является специфическим действием канцерогена.
3.5 Проницаемость межклеточных контактов.
Проницаемость межклеточных контактов между НФ и Ь клетками была измерена как для неорганических ионов электрофизиологическим методом с использованием двух внутриклеточных электродов (см. 2.1), так и для флуоресцентного красителя трипафлавина с мол.массой 214 методом внутриклеточной инъекции красителя (см. 4.1)
В культуре НФ 67% клеток демонстрируют наличие между ними электрической связи (средний коэффициент связи равен 0,2). В культуре Ь клеток только в одном случае из 24 измерений (4%) была зарегистрирована электрическая связь с коэффициентом К=0,02. В смешанной культуре в 40% случаев наблюдается затекание тока из Ь клеток в НФ (К=0,2). Аналогичные результаты получены в опытах по распространению красителя: в смешанных культурах перетекание трипафлавина из Ь клеток в НФ наблюдалось в 9 случаях из 14 инъекций, в то время как в чистой культуре Ь клеток только в 4 случаях из 26 инъекций краситель обнаруживался в соседних клетках.
Таким образом, Ь клетки, демонстрирующие в чистой культуре почти полное отсутствие проницаемых межклеточных контактов, способны устанавливать такие контакты с нормальными фибробластами в условиях смешанной культуры.
Полученные в этой серии экспериментов данные показывают, что резистентные к действию полициклических углеводородов клетки Ь становятся чувствительными к токсичесому действию ДМБА в том случае, если они выращиваются в контакте с чувствительными нормальными фибробластами. Токсическое действие ДМБА в таких смешанных культурах проявляется в уменьшении плотности клеток Ц
в резком снижении доли клеток, синтезирующих ДНК, среди клеток, остающихся в культуре, в изменении морфологии L клеток. Эти изменения идентичны характерным проявлениям действия ДМБА и других полициклических углеводородов на чувствительные нормальные фибробласты. Степень выраженности этих изменений у L клеток оказывается такой же, или даже несколько большей, чем у НФ. Токсические продукты распада предварительно проинкубированных с ДМБА нормальных фибробластов не оказывают на L клетки подобного действия. Наиболее существенным является то обстоятельство, что L клетки, растущие в той же культуре, но на чистом стекле, остаются резистентными к действию ДМБА. Следовательно, изменение чувствительности L клеток к ДМБА является строго локальным эффектом, т.е. для его проявления необходим непосредственный контакт нормальных и неопластических клеток. Кроме того, между клетками L и НФ устанавливаются проницаемые контакты.
Все эти данные делают наиболее вероятным предположение, что изменение чувствительности L клеток к токсическому действию ДМБА в смешанной культуре обусловлено тем, что токсичные продукты метаболизма этого канцерогена, образующиеся в нормальных клетках, передаются через межклеточные контакты непосредственно в L клетки. Это явление весьма сходно с явлением метаболической кооперации контактирующих клеток. Особенность нашей экспериментальной системы состоит в том, что межклеточная кооперация приводит здесь к патологическому результату, к повреждению и гибели клеток L. Возможно, что такая "летальная кооперация" с окружающими нормальными клетками может существенно изменять чувствительность неопластических клеток к различным токсическим воздействиям in vivo.
Таким образом, эти опыты демонстрируют существенное изменение ("нормализацию") фенотипа опухолевых клеток при их локальном взаимодействии с нормальными клетками в культуре. Вовлеченность проницаемых межклеточных контактов в супрессию роста неопластических клеток и проявления трансформированного фенотипа (как in vitro, так и in vivo), т.е. возможность фенотипичес-кого исправления генетических деффектов, показана в ряде недавних работ, (см. обзор Yamasaki, Carcinogenesis, 1990, 11:1051-1058).
В связи с этим возникает не менее интересный вопрос: реализуется ли подобный механизм регуляции клеточного фенотипа в реальных
физиологических процессах, при функционировании нормальных дифференцированных тканей? Для изучения такой возможности мы исследовали роль межклеточных взаимодействий в регуляции синтеза раково-эмбрионального белка альфа-фетопротеина в паренхиматозных клетках печени - гепатоцитах.
Однако прежде изложения этих результатов рассмотрим действие некоторых физических и химических факторов на межклеточную связь.
4. ФАКТОРЫ, МОДУЛИРУЮЩИЕ ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ КОНТАКТОВ
4.1 Материалы и методы
Объекты исследования. В опытах с индукцией межклеточной связи в культурах эпителиальных клеток использовались три установившихся клеточных линии: FBT из трахеи быка (Machtakova et al., Folia Biol., 1975, 21:117-121), МПТР из почки мыши, трансформированные вирусом ОВ-40 (получены в ОНЦ РАМН) и СПЭВ из почки эмбрионов свиньи (любезно предоставлены И.И.Воробьевым). Клетки этих линий культивировали в среде, содержащей 45% среды Игла, 45% 0,5% гидролизата лактальбумина и 10% сыворотки крупного рогатого скота. Для определения жизнеспособности клеток использовали метод окраски родамином 123 ("Sigma", США) - 10 мкг/мл, 10 мин, как это описано в работе (Jonson et al., Pros.Nat.Acad.Sci.U.S.A., 1980, 77:990994).
Опыты по исследованию действия арахидоновой кислоты (АК) на межклеточные контакта проводили на культурах фибробластоидных клеток опухолевого происхождения (рак молочной железы крысы) линии BICR/MIRk (Rajevsky et al., Eur. J. Immunol., 1972, 2: 445-447). Клетки культивировали в СОг -инкубаторе в модифицированной по Дальбекко среде Игла ("Biochrom КБ", Германия), с 3,7 г/л бикарбоната натрия и 10% неонатальной телячей сыворотки крови ("Biochrom KB", Германия). АК ("Sigma", США) растворяли в физиологическом растворе с фосфатным буфером с кальцием и магнием (PBS++) или в растворе Хенкса путем озвучивания в ультразвуковой ванне Bransonic ("Branson", Франция) в течение 2 мин. Маточный раствор АК (10 мМ в гексане) хранили при -18° С. Перед озвучиванием растворитель высушивали в потоке азота. Альбумин, свободный от жирных кислот ("Sigma"), растворяли в PBS++ в концентрации 1 мг/мл. Состав PBS++ в мМ: 137 NaCl; 2,7 KCI; 6,5 Na2HP04; 1,5 КН2Р04; 0,5 MgCl2; 0,8 MgS04; 0,9 СаС12; рН=7,4.
Определение уровня межклеточной связи осуществлялось- методом внутриклеточных инъекций непроникающих через наружную мембрану флуоресцентных красителей с последующей регистрацией распространения метки в окружающих клетках (метод dye coupling). Микропипетки, изготовленные из стеклянных капиляров ("WPI", США) на горизонтальной микрокузнице PN-3 ("Narishige", Япония) заполняли 4% раствором Люциферового желтого СН ("Sigma") в дистиллированной воде или 0,1 M раствором флуоресцината натрия ("Merck", Германия) в 0,1 M KCL. Микроинъекцию производили при помощи механического микроманипулятора ("ЭЗНП НТО АН СССР", Черноголовка) под водноиммерсионным фазовым объективом 40х, ионофорезом, гиперполяризующими импульсами тока (-20-30 нА, 200 мс, I имп/с.) от электростимулятора ЭС-50-1 (СССР). Длительность инъекции - 30 с. Использовали люминисцентный микроскоп ЛЮМАМ-И2 ("ЛОМО", СССР) с автоматической микрофотонасадкой (МФНЭ-1, "ЛОМО") в режиме фазово-контрастной и эпифлуоресцентной микроскопии. Источники света - лампа накаливания ОП12-ЮО (12В, 100 Вт) и ртутно-кварцевая лампа ДРШ-250-3. Использовался стандартный набор светофильтров возбуждения: БС-8-3, СС-15-2 и СЗС-7 (полоса пропускания 380-460 нм), а также УФС-6 (полоса пропускания 300-390 нм) и. интерференционный фильтр 408 нм. Температуру в световом пятне измеряли микро-термистром ("ЛОМО"), а мощность светового потока - фотокатодом. Опыты проводили при комнатной температуре. Уровень межклеточной диффузионной связи оценивали, подсчитывая количество клеток, в которые краситель распространился через 2 минуты после инъекции.
Измерение внутриклеточного pH проводили микрофлуоримег-рическим методом, при помощи pH-чувствительного флуоресцентного красителя ацетоксиметилового эфира 2',7'-бис(2-карбоксиэтил)-5(6)-карбоксифлуоресцеина ("Molecular Probes", США), используя метод, описанный в работе (Paradiso et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1984, 81 : 7436). Испльзовался фотомикроскоп ("Zeiss", Германия) оборудованный фотометрической приставкой ФМЕЛ-2("ЛОМО"). _ Внутриклеточную концентрацию кальция определяли методом поточной флуориметрии (Kachel, Clinical Cytometry, 1986, 468:28-44; Valet et al., Naturwissenschaften, 1985, 72: 600-602) с использованием Са2+-чувствительного индикатора INDO-I ("Molecular Probes", США). Измерения проводили в поточном флуориметре FACS Analyser ("Beckton-Dickinson", Германия), соединенном с компьютером Hewlett
Packard. Концентрацию кальция измеряли у 10 ООО клеток в контрольных условиях, у 20 ООО клеток в присутствии АК и у 10 ООО клеток при добавлении альбумина.
Для сканирующей электронной микроскопии препараты клеток фиксировали 2%-ным глутаровым альдегидом ("Merck") в фосфатном буферном растворе, рН 7,4, обезжиривали с помощью ацетона в возрастающих концентрациях и высушивали в критической точке С02. Наблюдение проводили на сканирующем электронном микроскопе ("Hitachi" S-405A, Япония).
4.2 Индукция межклеточной связи в культуре эпителиальных клеток.
Как уже упоминалось, проницаемость межклеточных контактов для более крупных соединений, чем ионы, ответственные за явление электрической связи, определяется методом внутриклеточных инъекций непроникающих через наружную мембрану флуоресцентных красителей с последующей регистрацией распространения метки в окружающих клетках (метод dye coupling). Мы обнаружили, что само наблюдение за клетками в режиме флуоресцентной микроскопии может индуцировать возникновение межклеточной диффузионной связи в культуре исходно не связанных эпителиальных клеток. Появлению проницаемых контактов предшествуют характерные морфологические изменения.
Клетки трех исследованных эпителиальных клеточных линий (FBT, МПТР и СПЭВ - см. 4.1) образуют пласты с хорошо видимыми при фазово-контрастной микроскопии светлыми межклеточными границами. При инъекции Люцифера желтого или флуоресцината натрия в одну из клеток, краситель не обнаруживался в соседних клетках по крайней мере в течении 1 часа, при условии, что контроль за введением и распространением красителя проводился при очень коротком (5-10 сек.) освещении ртутно-кварцевой лампой ДРШ-250-3 (рис. 4 а, Ь).
Однако, если наблюдение за клетками в режиме флуоресцентной микроскопии в процессе инъекции красителя продолжалось 1 -5 минут, то через 10-60 минут происходили существенные изменения морфологии клеток, экспонированных в поле зрения микроскопа. Межклеточные границы уплотнялись и становились черными при фазово-контрастном изображении, резко выделялись ядра клеток, вся клеточная поверхность наблюдалась в одной фокальной плоскости.
Рис. 4. Морфология и распространение красителя Люциферового желтого в культуре эпителиальных клеток РВТ. (а), (Ь) - контрольные клетки; (с), (с!) - клетки через 20 минут после 2 минут воздействия света с длиной волны 300-390 нм и мощностью 290 мВт/см2, (а),(с) - фазово-контрастная микроскопия и (Ь), (¡1) ■ флуоресцентная микроскопия тех же полей зрения. Бар - 10 мкм.
Размер морфологически измененного участка клеточного пласта строго соответствовал размеру освещенной области монослоя. При инъекции красителя в любую клетку этого участка через 2 минуты
окрашивались все окружающие клетки, а нередко и контактирующие с ними клетки второго кольца (рис. 4 с, (1). При этом наружная клеточная мембрана оставалась непроницаемой для Люцифера желтого: если электрод прикасался к клетке, но не был введен внуть нее, поступающая из электрода краска не окрашивала ни эту, ни соседние клетки, т.е. распространение красителя могло происходить только через межклеточные контакты. За пределами морфологически измененной области все клетки оставались несвязанными.
Определение характеристик эффективной засветки показало, что при использовании стандартного набора светофильтров (полоса пропускания 380-460 нм) мощность излучения, измеренная в фокальной плоскости микроскопа, равна 100-380 мВт/см2 для объективов 10х и 40х соответственно. При использовании стеклянного светофильтра УФС-6 (полоса пропускания 300-390 нм, мощность - 300 мВт при объективе 40х) требовалось более короткое время экспозиции для возникновения морфологических изменений в клеточном монослое.
Освещение препарата светом длиной волны более 490 нм в течение 15 минут не приводило к изменению морфологии и межклеточной связи в последующие 2,5 часа наблюдения, а 30' минутное подобное воздействие вызывало гибель клеток.
Несмотря на значительные морфологические изменения, клетки не казались поврежденными: они оставались прикрепленными к субстрату до 25 суток после облучения; через 1-7 суток (в разных опытах) "черные" границы между клетками исчезали, и хотя клетки не двигались, они могли образовывать небольшие ламеллы. Потенциал митохондрий в клетках облученных областей не изменялся по сравнению с контрольными окружающими клетками, что было показано при окраске родамином 123, накапливаемым в митохондриях по градиенту потенциала. Более детальное исследование морфологического эффекта было проведено с использованием сканирующей и трансмиссионной микроскопии (последняя выполнена Е.С.Снегиревской в Институте цитологии АН СССР). Было найдено, что основными ультраструктурными изменениями в облученных клетках является значительное снижение количества ворсинок на апикальной поверхности, выравнивание складчатости латеральных клеточных мембран, локальные сужения межклеточных щелей. В некоторых случаях обнаруживались структуры, сходные со структурой щелевого контакта. Наблюдалось просветление матрикса и набухание
большинства клеточных органелл: митохондрий, эндо-плазмати-ческого ретикулума, ядер.
Межклеточные контакты в облученных областях становились более резистентными к механическим воздействиям, что видно по характеру разрывов, возникающих иногда при приготовлении препаратов для сканирующей микроскопии. В контрольных образцах разрывы, проходящие вдоль клеточных контактов, разделяли плазматические мембраны соседних клеток, в то время как в облученных областях мембраны двух соседних клеток оставались сцепленными (подобно замку "молнии"), а разрыв проходил по цитоплазме вдоль клеточной границы.
Набухание облученных клеток позволяло предположить в качестве причины описанного эффекта нарушение осмотического равновесия. Действительно, при уменьшении тоничносги культуральной среды в 2 раза происходило набухание клеток и возникала морфологическая картина сближения клеточных границ, сходная с описанной для облученных клеток. Однако эти изменения были кратковременными и не приводили к возникновению межклеточной диффузионной связи.
Другим действующим фактором могло бы быть локальное нагревание клеток в поле зрения микроскопа при освещении от ртутно-кварцевой лампы. Однако измерение в световом пчтне в фокальной плоскости микроскопа показали, что температура сохраняется стабильной (+ 0,1 0 С). Более того, нагревание клеток до 45° С в течение 10 минут не индуцировало морфологических изменений.
Для различных клеточных систем показано соответствие между эффективностью межклеточной связи и внутриклеточным рН: закисление цитоплазмы приводит к подавлению межклеточной связи (см. обзор: Bennet et al., In "Gap Junctions", Eds.: Hertzberg E.L., Johnson R.C., N.Y.:Alan R.Liss., Inc., 1988, p.287-304). При сравнении величин внутриклеточного рН интактных и облученных клеток FBT мы обнаружили, что в связанных благодаря облучению клетках происходит защелачивание цитоплазмы примерно на 0,4 единицы рН (от 6,4-6,6 до 6,8-7,0 соответственно), которое может способствовать возникновению межклеточной связи.
Сводится ли действие облучения только к установлению между клеточными мембранами устойчивого во времени тесного контакта, при котором в области сблизившихся мембран латерально диффундирующие полуканалы могут формировать полные коннексины, или действие света опосредованно какими-то
дополнительными эффектами, например, индукцией перекисного окисления лнпидов? Эти вопросы требуют дальнейшего изучения.
Существенный вывод из полученных экспериментальный данных состоит в том, что мониторинг межклеточных контактов методом dye coupling с использованием люминисцентного микроскопа в некоторых случаях может индуцировать перетекание красителя в исходно несвязанных клетках. Следовательно, во избежании возможных артефактов, при использовании этой техники для анализа проницаемых межклеточных контактов гребуется соответствующий контроль за клеточной морфологией.
4.3 Действие арахндоновой кислоты на проводимость межклеточных контактов.
Арахидоновая кислота (АК) является важным компонентом клеточных мембран, так как она входит в состав ряда фосфолипидов (фосфашдилхолин, фосфатидилинозит, фосфатидилэтаноламин), участвующих в передаче сигнала с клеточной поверхности в цитоплазму. Связывание многих лигандов на клеточной поверхности приводит к активации фосфолипаз, которые либо непосредственно высвобождают АК: либо гидролизуют фосфолипид до диацилглицерина, и АК высвобождается уже в процессе метаболизма последнего. С другой стороны, недавно было показано, что АК вызывает угнетение проницаемости межклеточных контактов (Giaume et al„ Pflugers Arch., 1989: 413, 273-279). Положение АК на пересечении важнейших путей клеточного метаболизма, ее участие в сигнальных каскадах внутриклеточных реакции и активность АК в отношении межклеточных контактов позволяет предположить, что АК может быть одним из эндогенных физиологических регуляторов контактной проницаемости.
Совместно с кафедрой биофизики Штутгартского Университета (Германия) мы исследовали эффект АК на проницаемые контакты в культуре фибробластоидных клегок опухолевого происхождения (рак молочной железы крысы) линии BICR/MIR^ и возможное участвие вторичных мессенджеров (Н+ и Са2+), модулирующих проницаемость межклеточных каналов, в механизме действия АК.
Параллельные измерения межклеточного перетекания красителя люциферового желтого и внутриклеточного рН (рНв) показали, что через 30 минут инкубации клеток в присутствии 100 мкМ АК происходит полное блокирование межклеточной связи и небольшое, но
статистически достоверное снижение рНв- от - 7,2 в контроле до ~ 7,0 после обработки А К (рис. 5 I, II, III). Последующая инкубация клеток в среде с сывороткой в течение 30 мин. вызывала восстановление межклеточной связи и увеличение рН выше контрольного уровня (рис. 5 IV).
Для определения рН-чувствительности межклеточной диффузионной связи в культуре BICR/MIR была проведена серия экспериментов, в которых снижение внутриклеточного рН достигалось путем обработки клеток физиологическим раствором, закисленным до рН = 6,5 с помощью MES. Инкубация клеток в таком растворе в течение 30 мин. приводила к такому же снижению рН , что и обработка АК. Однако проницаемость межклеточных контактов для люциферового желтого при этом не изменяется (рис. 5 V, VI).
Рис. 5. Действие АК на внутриклеточный рН (рНв) и межклеточную диффузионную связь в культуре клеток линии ВЮЯУМЖ^. Ось ординат: слева - рНв, справа - N ■ среднее (из 8-10 инъекций) число окрашенных соседних клеток через 2 мин. после инъекции красителя в одну из клеток монослоя. I - контроль в растворе Хенкса с рН 7,4; II и III - АК (100 мкМ в растворе Хенкса) вызывает небольшое снижение рН и угнетает межклеточную диффузию красителя (II - через 15 мин. и III - через 30 мин. от начала инкубации); IV - отмывка средой Дульбеко с 10% эмбриональной телячьей сыворотки; V - контроль в растворе Рингера с рН 7,2; VI - раствор Рингера с рН=6,5 через 30 мин. от начала инкубации вызывает тот же сдвиг рНв, что и АК (II и III), но не влияет на межклеточную передачу красителя.
Для измерения концентрации внутриклеточного кальция ([Са2+]в) с помощью метода поточной флуориметрии клетки сначала переводили
в суспензию, и затем измеряли [Са2+]в до обработки АК, в присутствии 100 мкМ АК и при отмывки средой с добавлением 1 мг/мл альбумина. В контроле [Са2+]в составляла в среднем 80 нМ, через 2-3 мин. после добавления АК происходило повышение [Са2+]в до 100-200 нМ и восстанавливление до контрольного уровня в растворе с альбумином.
Таким образом, проведенные нами измерения показали, что арахидоновая кислота обратимо блокирует межклеточную диффузионную связь, и что этот эффект сопровождается небольшим (на 0,1-0,2 единицы рН) снижением внутриклеточного рН и незначительным увеличением концентрации внутриклеточного кальция. Однако такой же сдвиг рНв, вызванный инкубацией клеток в физиологическом растворе с рН = 6,5, не влиял на межклеточную связь. Вместе с тем, и обнаруженного нами повышения концентрации свободного Са2+ в цитоплазме недостаточно для разобщения клеток, т.к. для полной блокады межклеточных контактов требуется увеличение [Са2+]в до сотен мкМ (Spray et al„ Proc.Nat. Acad.Sci.USA, 1982, 79:441-445). Основываясь на полученных данных, можно полагать, что АК действует непосредственно на контактную мембрану, приводя к ее реорганизации и в результате к блокированию контактов.
Мы не можем исключить, что какие-то иные факторы опосредуют действие АК на контактную проницаемость. Однако в пользу высказанного предположения свидетельствуют такие факты, как увеличение содержания АК в клеточных мембранах при обработке клеток экзогенной АК кислотой (G.Zempel, неопубликованные данные); обратимость эффекта АК после экстракции альбумином (этот белок связывается именно со свободными жирными кислотами, извлекая из мембраны скорее поступившую туда АК, а не какие-то ее метаболиты). Необходимо отметить и тот факт, что другие жирные кислоты оказывают угнетающее действие на межклеточную связь примерно в тех же концентрациях, что и АК.
Поскольку свободная АК появляется в клеточных мембранах в процессе регуляции функций клетки, то независимо от правильности высказанной гипотезы о механизме действия АК, можно полагать, что АК является одним из эндогенных физиологических регуляторов межклеточных контактов.
5. РЕГУЛЯЦИЯ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ КОНТАКТОВ В КУЛЬТУРАХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК, ТРАНСФИЦИРОВАННЫХ ГЕНАМИ КОННЕКСИНОВ
Одной из перспективных экспериментальных моделей, широко используемых в настоящее время для исследования структуры и функции межклеточных диффузионных контактов, являются культуры клеток, трансфицированных генами различных коннексинов. Как уже упоминалось, коннексины (Сх) - белки, формирующие каналы щелевых контактов (ЩК), морфологическую основу межклеточной диффузионной связи. Такой методический подход создает возможность провести более детальный анализ влияния межклеточных контактов, сформированных из конкретных, исходно заданных коннексинов, на различные клеточные функции. Так, в работе группы Дмасаки из Международного агентства по изучению рака в Лионе (Mesnil et al., Cancer research, 1995, 55: 629-639) показано, что трансфекция деффектных по ЩК опухолевых клеток человека линии HeLa геном коннексина Сх26 (но не Сх40 или Сх43) приводит к восстановлению негативного контроля роста: клетки полученных клонов утрачивают опухолеродность при прививке мышам бестимусной линии и показывают существенное замедление скорости роста в мягком агаре по сравнению с родительскими HeLa клетками. При этом устойчивая межклеточная связь (dye coupling) регистрируется во всех этих трансфицированных клеточных линиях.
Мы провели на кафедре биофизики Штутгартского Университета (Германия) сравнительное исследование диффузионной межклеточной связи в культурах клеток HeLa, трансфицированных генами коннексинов Сх32 и Сх26, и некоторых возможных механизмов ее физиологической регуляции в этих клонированных клеточных линиях.
5.1 Материалы и методы; ■
Культура клеток HeLa. Клетки HeLa (эпителиоидные клетки карциномы человека) были трансфицированы генами Сх26 и Сх32 в
лоборатории проф. К. Виллеке доктором К. Эльфганг (Бонский университет, лаборатория генетики, Германия). Клетки культивировали при 37° С в атмосфере 8 % СОг в среде ДМЕМ в присутствии 10% эмбриональной сыворотки телят и 0,5 мкг/мл пуромицина ("Sigma", США). Для проведения опытов клетки растили в 60 мм пластиковых чашках Петри в среде без пуромицина.
Растворы. Измерения межклеточной связи проводили при комнатной температуре в стандартном физиологическом растворе с кальцием и магнием и фосфатным буфером (PBS++). Состав PBS++ в мМ: 130 NaCl; 5 KCl; 0,5 MgCl2; 0,9 СаС12; 8 Na2HP04; 1,5 КН2Р04; pH 7,4. Использовались также растворы PBS++ с pH 5,5 и 6,0, которые получали, меняя соотношение количеств КН2Р04 и Na2HP04 в стандартном PBS++ (Wissenschaftliche Tabellen, Geigy, 1979, p: 61-62). При исследовании эффектов С02 использовали физиологический раствор с бикарбонатным буфером (состав основных солей тот же, что и в PBS++) с различными концентрациями ЫаНСОз (см. таблицу 7 в тексте). В этих опытах через камеру для измерения межклеточной связи при помощи перистальтического насоса осуществлялся проток раствора, обогащенного С02, a pH измерялся в режиме непрерывной регистрации цифровым рН-метром непосредственно в вытекающем из рабочей камеры растворе.
Эффективность межклеточной диффузионной связи определяли методом dye coupling (см. раздел 4.1), используя Люциферовый желтый СН ("Sigma", США).
Плотность клеток определяли в тех же культуральных чашках Петри, в которых проводили измерение межклеточной связи. Клетки суспензировали и подсчитывали их количество на автоматическом проточном счетчике ("Coulter electronics LTD. LUTON", Англия).
5.2 Зависимость уровня межклеточной связи от клеточной плотности в культурах клеток HeLa Сх32 и HeLa Сх26.
В отличие от родительских нетрансфицированных клеток HeLa, у трансфектантов на криосколах обнаруживаются характерные структуры щелевых контактов, которые иногда сопровождаются плотными контактами. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток HeLa Сх32 антителами к коннексину Сх32 выявляет крупные иммунореактивные пятна в областях межклеточных контактов, причем характер окрашивания одинаков в монослоях с низкой (20 000 кл/см2 ) и средей (100 000 клУсм2) плотностью клеток.
В монослойных культурах клеток HeLa Сх32 с различной исходной плотностью (19 ООО, 9 500, 4 600 кл/см2 при посеве) мы тестировали межклеточную диффузионную связь в течение 4 дней культивирования без смены культуральной среды. В первые 3 суток повышение уровня связи происходило во всех трех вариантах культур (рис. 6).
Рис. 6. Динамика величины диффузионной связи в процессе культивирования. Культуры с различной исходной плотностью: 1 - плотность при посеве - 19000 кл/см2 , 2 и 3 -соответственно 1/2 и 1/4 от плотности 1. По оси абсцисс: продолжительность культивирования, сутки; по оси ординат: среднее (из 7-10 инъекций) количество окрашенных соседних клеток за инъекцию (N).
Рис. 7. Зависимость эффективности межклеточной диффузии красителя Люциферового желтого от локальной клеточной плотности в культуре клеток НеЬа-Сх32. Фазово-контрасгные (а, б) и соответствующие им флуоресцентные (б, г) микрофотографии.
Максимальные средние значения степени связи (25-33 окрашенных соседних клеток за одну инъекцию) регистрировалось при достижении клеточной плотности, равной 100 000-200 000 кл/см2. Однако при средней плотности в 200 000 кл/см2 наблюдалась значительная морфологическая неоднородность в пределах одной культуральной чашки Петри. В то время как одни участки культуры представляли собой монослой распластанных клеток (рис. 7 а, б), в других ее областях образовывался монослой плотно упакованных сжатых клеток, линейный размер которых в фокальной плоскости был существенно снижен. Раздельное измерение межклеточной связи в таких морфологически разнородных участках показало, что в плотном монослое уровень связи примерно в 2 раза ниже, чем в монослое распластанных клеток (18±3 и 40±4 соответственно). Дальнейшее увеличение локальной плотности приводило к полной потере обмена Люциферовым желтым (рис. 7 в, г). Такая же практически полная потеря связи наблюдалась в культурах клеток этого клона со средней плотностью, превышающей 400 000 кл/см2. Необходимо подчеркнуть, что наблюдаемое снижение связи коррелировало именно с увеличением клеточной плотности и различиями в морфологии клеток, а не со сроками культивирования: на 4 сутки в культуре с низкой начальной плотностью (4 600 кп/см2) регистрировалось максимальное среднее значение величины диффузи-онной связи, в то время как в культуре с высокой начальной плотностью (19 000 кл/см2) межклеточная связь почти полностью утрачивается (рис. 6).
Аналогичные изменения электрической проводимости контактных мембран в этих культурах были обнаружены в параллельных опытах (на клетках из тех же культуральных чашек Петри), проведенных А.Я.Дуниной-Барковской.
Таким образом, в культуре клеток НеЬа Сх32 уровень межклеточной связи существенно зависил от клеточной плотности. Какой механизм лежит в основе этой зависимости? Является ли изменение клеточной: морфологии непосредственной причиной изменения степени связи (например, за счет различной площади контактных мембран, перестройки цитоскелета и т.д.) или основную роль играют какие-то иные факторы, например меняющийся состав культуральной среды?
График на рис. 8 а демонстрирует изменение диффузионной связи и рН культуральной среды при увеличени клеточной плотности в монослое клеток субклона НеЬа Сх32 НО-2, а на рис. 8 б - для культуры клеток НеЬа Сх26. Картина зависимости межклеточной
связи от клеточной плотности идентична как для обоих клонов трансфектантов HeLa Сх32, так и для линии HeLa Сх26. Некоторым отличием субклона HeLa Сх32 HG-2 от исходных клеток является то, что максимальные и минимальные значения межклеточной связи регистрируются здесь при более низких значениях величины клеточной плотности, чем в исходном клоне (около 100 ООО кл/см2 и около 200 000кл/см2 соответственно). Существенно отметить, что в культуре HeLa Сх26 скорость клеточного роста была ниже, чем в культуре HeLa Сх32 HG-2, и клетки не достигали плотности более высокой, чем 150 000 кл/см2- Затем часть клеток погибала и плотность их снижаелась при дальнейшем культивировании. Этот результат согласуется с данными, приведенными в цитированной выше работе группы Ямасаки.
рн
35 30 25 20 15 10 5 О
X \
\
\
7,6
7,4
7,2
7
6,8
37000 1
66000 2
176000 3
215000 кл/см2 4 сутки
РН
20
15
10
\
7,6
7,4
72
6,8
6,6
Рис. 8. Динамика клеточной плотности, рН и межклеточной диффузионной связи в течение 4 - 5 суток культивирования: а - в культуре HeLa Сх32 НО-2; б - в культуре HeLa Сх26. По оси абсцисс: верхняя шкала -клеточная плотность,
нижняя - время культивирования; по оси ординат: слева среднее количество окрашенных соседних клеток за инъекцию (N1), справа - рН. Столбики -степень связи (Ы); ломаная линия - рН культуральной среды.
29000 60000 108000 143X0 11400Э кпЫ2
6.6
Как видно из графиков, рН культуральной среды снижался параллельно возрастанию плотности культуры также для обеих клеточных линий. Так как для многих клеточных систем показана рН-зависимость межклеточных контактов, т.е. подавление контактной проводимости при внутриклеточном закислении (наример, Spray et al..
J.Cell Biol., 1986, 103:135-144), то можно полагать, что обнаруженная зависимость межклеточной связи от клеточной плотности является результатом закисления культуральной среды.
Действительно, при смене культуральной среды на свежую (3 раза в течение 4 дней культивирования) культура клеток HeLa Сх32 HG-2 достигала на 4 сутки плотности 450 ООО кл/см2 и при этом сохраняла высокий, уровень межклеточной связи и рН = 6,9, что косвенно подтверждает высказанное выше предположение (рис. 9).
30 25 20 15 10 5 О
30 25 20 15 10 5
рН
39000 1
7.4
7.2
6.6
100000 2
190000 3
6,4
202000 кл\см2 4 сутки
РН
39000 100000 1 2
240000 3
7,4 7,2 7 6,8 6,6 6,4
450000 кл\см2
Рис. 9 Влияние смены среды на клеточную плотность, рН и межклеточную связь в культуре клеток НеЬа Сх32 1-Ю-2: а -контроль, без смены среды в течении всего срока культивирования; б - трехкратная смена среды (на вторые, третьи и четвертые сутки). По осям то же, что и рис. 3. Столбики -степень связи (Ы); ломаная линия - рН культуральной среды.
4
сутки
X
8
о
Однако, при замене культуральной среды на РВ8++, рН которого был доведен с помощью 10 мМ фосфатного буфера до 6,2 - 6,0 - 5,6, мы не обнаружили угнетения контактной проницаемости и, более того, при замене среды в трех-суточной культуре на раствор с рН = 5,6 обнаружилось существенное увеличение уровня межклеточной связи (см. рис. 10 и 11).
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
7,4
7,2
6,8
6,6
6,4
1
рН=6,2
Рис. 10 Замена культуральной среды на растворы PBS++ с различными рН в культуре HeLa Сх32 HG-2. Ось абсцисс: верхняя шкала - возраст культур (в сутках), в которых произведена смена среды; нижняя шкала - величины рН в растворах PBS++. Ось ординат: слева - среднее количество окрашенных соседних клеток за инъекцию (N); справа - рН.
2 3 сутки
рН=6,0 рН=5,6
Светлые столбики - уровень межклеточной связи (N) в контроле, заштрихованные - в растворах PBS++. Ломаная линия - величины рН в культуральной среде перед ее заменой на PBS++. До момента измерения связи клетки инкубировались в растворах PBS++ по 5 - 6 часов в термостате.
1,5
2
2 0,5
Рис. 11. Замена культуральной среды на растворы РВБ++ с различными рН. 1 - культура НеЬа Сх32 ЬЮ-2; 2 - НеЬа Сх26. По оси абсцисс: рН использованных растворов; по оси ординат: отношение среднего количества окрашенных соседних клеток за 1 инъекцию в экспериментальных чашках Петри (Ыэк) к этому же показателю в контроле (Икон). Использовались односуточные культуры. Измерение связи проводили без предварительной инкубации клеток в указанных растворах.
5,5
Следовательно, повышение в культуральной среде концентрации Н+ ионов само по себе не подавляет проницаемость контактов. Легко предположить, что в культуральной среде накапливаются какие-то факторы кислой природы, продуцируемые самими клетками в процессе их жизнедеятельности, которые и ингибируют межклеточную связь. В таком случае эффект увеличения связи в трех-суточной культуре при замене среды на физиологический раствор с фосфатным буфером (рН = 5,6) объясняется отсутствием в нем этих веществ.
Наиболее очевидным претендентом на роль такого фактора является С02 или другие слабые органические кислоты, которые, как известно, являются модуляторами межклеточной связи (Turin 1., Warner А.Е., J.Physiol., 1980, 300:489-504). Предпологаемый механизм их действия состоит в том, что в недиссоциированном виде эти молекулы легко проникают внутрь клетки, где их диссоциация вызывает снижение внутриклеточного рН (рНв). Непосредственной причиной перехода межклеточного канала из открытого состояния в закрытое является прямое протонирование коннексина и его последующие конформационные изменения.
Однако полученыев работе (Муравьева и др., Биол. мембраны, 1993, 10:527-534) данные позволяют предположить существование иного механизма разобщающего действия С02 (и, возможно, других слабых' кислот), который состоит в прямом взаимодействии этих веществ с мембранными липидами и/или с белками межклеточных каналов: так как слабые кислоты в недиссоциированной форме хорошо растворимы в мембране, то они могут влиять на контктную проводимость, либо взаимодействуя с каналами непосредственно, либо воздействуя на мембранные липиды, подобно липофильным агентам.
Поэтому при исследовании действия С02 на межклеточную связь в культурах трансфицированных клеточных линий мы провели измерение уровня связи в растворах, обогащенных С02, меняя независимо или рН раствора или концентрацию в нем недиссоциированной угольной кислоты ([Н2 СО3 ]).
5.3 Эффект С02 •
Растворы, использованные в этой серии экспериментов, получали, добавляя в стандартный физиологический раствор (см. 5.1) различные количества бикарбоната натрия и перфузируя их 100% С02, доводя рН до 6,5 или 6,1. При добавлении бикарбоната количество NaCl соответственно уменьшалось. Концентрацию недиссоциированной угольной кислоты в этих растворах расчитывали по уравнению Хендерсона- Хассельбаха:
pH=pK+lg^ (1) или [НА] = 18РК-Рн[а-] (2)
где рК = lgK, К - константа диссоциации слабой кислоты, [А'] и [НА] концентрации. . анионов и недиссоциированной . кислоты соответственно. Для нашего случая: [h2co3] = iopk-ph[hco3-].
Состав растворов приведен в таблице N 8. В таблице также показан качественный результат измерения межклеточной связи в этих растворах для культур клеток НеЬа Сх32 Нв-2 и НеЬа Сх26. Количественно результаты отражены в последующих графиках.
Таблица N 8
Номер рН [ЫаНСОз] [Н2СО3] Межклеточная связь
раствора шМ шМ НеЬа Сх32 НеЬа Сх26
1 6,5 5 2 + +
2 6,5 12,5 5 + -
3 6,5 20 8 + -
4 6,1 2 2 + -
5 6,1 5 5 + -
6 6,1 10 ¡0 -
+ : среднее количество окрашенных соседних клеток за 1 инъекцию в экспериментальных чашках Петри (Иэк) равно или больше этого показателя в контроле (Ык), т.е. Ыэк/Ык > 1.
- : отношение Ыэк/Ык = 0,01-0,04 в течении всего периода измерения, т.е. 2-45 минут после • замены культуральной среды на экспериментальный раствор;
+ : отношение Иэк/Ык = 0,8-1,0 в первые 10 минут после смены среды и 0,08-0 в течении последующих 35 минут измерения.
На рисунке 12 приведена зависимость уровня межклеточной связи от концентрации недиссоциированной угольной кислоты в наружном растворе ([Н2 СОз]н) при постоянном рН: рис. 12 а - при рН = 6,5 и рис. 12 б - при рН = 6,1. Зависимость межклеточной связи от изменения рН наружного раствора, обогащенного СО2, при постоянной концентрации угольной кислоты ([Н2 СО3] = 5 мМ) демонстрирует рис. 13. Стабильность рН и концентрации угольной кислоты в этих растворах достигается соответствующим изменением в них концентрации бикарбоната ([ЫаНСОз]), поэтому на графиках для оси абсцисс указано и это значение. Необходимо отметить, что ингибирующий эффект СО2 был полностью обратим: при замене каждого из использованных растворов, обогащенных С02, па стандартный РВБ++ с рН =7,4, или даже с рН = 6,5, величина межклеточной связи восстанавливалась до уровня контроля.
1,4 1.2 1
0.8 0,6 0,4 0,2 О
5 12,5
8 тМ Н2СОЗ 20тМ ЫаНСОЗ
□ Сх32
□ Сх26
10 тМ Н2СОЗ 10 шМ ИаНСОЗ
Рис. 12. Зависимость межклеточной связи от концентрации угольной кислоты в наружном растворе при постоянной величине рН в культурах НеЬа Сх32 НС-2 и НеЬа Сх26. а - рН = 6,5; б - рН = 6,1. Ось абсцисс: верхняя и нижняя шкалы - соотетсгвен-но концентрации угольной кислоты и бикарбоната в наружном растворе; ось ординат - отношение среднего количества окрашенных соседних клеток за 1 инъекцию в экспериментальных чашках Петри (№к) к этому же показателю в контроле (№он). Использовались культуры с плотностью около 100 000 кл/см2, т.е. с максимальным уровнем диффузионной связи.
1.2 1
1.0,8
6,1 тмгеооз
5 тММэЮЗЗ
Рис. 13. Зависимость межклеточной связи от изменения рН в растворах с постоянной концентрацией Н2СО3, обогащенных СО2. Ось абсцисс: верхняя шкала - рН, нижняя - концентрация бикарбоната в растворе. Ось ординат - то же, что на рис. 19. Культуры НеЬа Сх32 в-2 и НеЬа Сх26; плотность около 100 000 кл/см2.
Приведенные графики показывают, что межклеточные контакты в культуре клеток НеЬа, трансфицированных геном коннексина 26, обладают значительно более высокой чувствительностью к ингибирующему действию СО2, чем в культуре клеток НеЬа, трансфицированных геном коннексина 32. Так, в культуре НеЬа Сх26
полная блокада диффузионной связи происходила через 10 минут от начала перфузии раствора N 1, содержащего 2 мМ Н2СО3 при рН = 6,5, а в культуре HeLa Сх32 HG-2 такой же эффект наблюдался только в растворе N5, содержащим 5 мМ Н2СО3 при рН = 6,1 (рис.12 а, б).
Во-вторых, ингибирующий эффект СО2 в обеих клеточных линиях зависит как от концентрации в наружном растворе недиссоцииро-ванной угольной кислоты при постоянном рН (рис. 12 а для клеток HeLa Сх26 и 12 б для HeLa Сх32 HG-2), так и от рН, т.е. концентрации протонов, при постоянной pi2C03] (рис.13).
Рассмотрим этот последний ряд полученных данных с точки зрения двух изложенных выше гипотез о механизме ингибирующего действия СО2 на межклеточную диффузионную связь. Гипотеза первая: эффект СО2 состоит в увеличении внутриклеточной концентрации протонов [Н+] и прямом протонировании коннексинов. В таком случае, при постоянной концентрации бикарбоната в наружном растворе ((Ъ1аНСОз]н), ингибирующий эффект будет усиливаться при увеличении концентрации СО2 и происходящим одновременно снижение как рНн, так и рНв, что и показано для различных клеточных систем (например: Morley et al., Biophys. J., 1996, 70: 1294-1302). Однако в наших экспериментах концентрация СО2 возрастала при стабильном рН наружного раствора. При этом ингибирующий эффект также усиливался при увеличении концентрации СО2 ([Н2СО3]): для клеток HeLa Сх26 это видно при рН = 6,5 (рис.12 а), а для HeLa Сх32 HG-2 при рН = 6,1 (рис. 12 б). Так как стабильность рНн достигалась за счет увеличения концентрации бикарбоната в наружном растворе, то, строго говоря, эти графики можно рассматривать и как обратную зависимость межклеточной связи от [№НСОз]н.
Что происходит при увеличении NaHC03]H? Если полагать, что за время проведения измерений (40-45 минут для каждой чашки Петри) внутриклеточная концентрация бикарбоната ([НСОз"]вн ) существенно не изменяется, то этим параметром можно пренебречь, и в таком случае рНвн будет снижаться пропорционально увеличению концентрации СО2, в то время как рНн остается стабильным. Следовательно, мы должны предположить независимость (или слабую зависимость) величины рНвн от рН наружного раствора, по крайней мере в пределах производимых нами сдвигов рН. Такое же предположение приходится сделать при использовании гипотезы 1 и в случае, когда закисление наружного раствора производилось при помощи фосфатного буфера (растворы PBS++ - рис. 10 и 11): здесь
снижение рНн до 5,5 не вызывает нарушения диффузионной связи, что должно было бы происходить, если рНвн снижается при таком существенном сдвиге наружного рН. Однако для других клеточных систем показана зависимость рНвн от рН наружного раствора (Smith et al., J.Biol. Chem., 1989,264:8723-8728).
Если же мы предположим, что при увеличении концентрации бикарбоната в наружном растворе увеличивается и [НСОз*]вн, то это будет приводить к стабилизации внутриклеточного рН, как это и происходит в наружном растворе (см. уравнение 1). И, следовательно, ингибирующее действие С02 не должно усиливаться при увеличении его концентрации в наружном растворе, так как не увеличивается (или слабо увеличивается) концентрация протонов внутри клетки. Однако это противоречит нашим экспериментальным данным.
Кроме того, в растворах со стабильной концентрацией Н2СОз в наружном растворе (рис.13), ингибирующий эффект усиливается при снижении рН и пропорциональном снижении [ЫаНСОз]н. Это можно объяснить только при предположении, что рНвн и/или [МаНСОз]вн существенно зависят от рНн и/или от [ЫаНСОз]н, 4X0 не согласуется с изложенными выше соображениями.
Таким образом, попытка объяснить полученные нами экспериментальные данные, исходя из гипотезы, что механизм действия С02 сводится к увеличению рНвн и последующему протонированию коннексина, приводит к серьезным противоречиям.
Вторая гипотеза предполагает, что механизм действия С02 на проницаемость межклеточных контактов состоит в прямом взаимодействии слабой кислоты (Н2СОз) с мембранными липидами и/или с белками межклеточных каналов. В таком случае, эффективность действия раствора, обогащенного С02, зависит в первую очередь от концентрации в нем недиссоциированной угольной кислоты, а не от его способности снижать внутриклеточный рН. Полученные нами данные о зависимости ингибирующего действия С02 от концентрации недиссоциированной угольной кислоты в наружном растворе при постоянном рН хорошо согласуются с этим предположением. Однако зависимость' эффекта от рНн при постоянной концентрации Н2СОз требует некоторых дополнительных допущений.
В заключение необходимо отметить, что приведенные выше результаты и разработанная экспериментальная система позволяют спланировать эксперимент, который даст возможность выяснить рассмотренные выше противоречия. Для этого необходимо измерить
внутриклеточный рН (например, микрофлуориметрическим методом) в тех же условиях, в которых были получены настоящие данные. В результате мы получим информацию как о механизме закисляющего цитоплазму действия СС>2, так и о механизме ингибирующего действия СО2 на межклеточные диффузионные каналы.
Рассмотрев, таким образом, некоторые факторы и механизмы регуляции диффузионной межклеточной связи, вернемся к вопросу об участи проницаемых межклеточных контактов в определении фенотипа взрослых паренхиматозных клеток печени - гепатоцитов.
6. ПРОНИЦАЕМЫЕ МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ КОНТАКТЫ И ЭКСПРЕССИЯ РАКОВО-ЭМБРИОНАЛЬНОГО БЕЛКА АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА В КУЛЬТУРАХ ВЗРОСЛЫХ ГЕПАТОЦИТОВ
6.1 Предпосылки к постановке задачи.
Альфа-фегопротеин (АФП), эмбриоспецифический сывороточный белок млекопитающих, синтезируется в эмбриональной печени и при развита гепатоцеллюлярных опухолей (Abelev, Advan.Cancer Res., 1971, 14: 295-358), в связи с чем в клинической онкологии АФП широко используется как иммунологический маркер для ранней и весьма надежной диагностики гепатоцеллюлярного рака (Abelev, Transplant. Rev., 1974, 20:3-37). Во взрослом организме синтез АФП наблюдается при регенерации печени после частичной гепатэктомии или отравления гспатотоксинами. Показано, что при этом происходит ре-экспрессия АФП во взрослых дифференцированных предсуществу-ющих гепатоцитах (Engelhardt et al., Nature, 263:146-148) и что возобновление синтеза эмбрионального белка во взрослых клетках не зависит ни от их пролиферативного статуса, ни от стадии дифференцировки или плоидности (Лазарева, Бюл.эксп.биол.мед., 1977, 84:97-101).
Морфологические закономерности появления АФП-продуцирующих клеток в регенерирующей печени мышей привели к предположению, что ре-экспрессия АФП в этом случае связана с локальными нарушениями структуры ткани, с временной "индивидуализацией" гепатоцитов и выходом их из под контороля окружающих клеток (Abelev, In: "Cell Differentiation and Neoplasia", Ed.Saunders, Raven Press, N.Y., 1978; Gleiberman et al., Int. Rev. Cytol.,1985, 95:229-266). Подтверждением этого представления является тот факт, что ферментативная диссоциация ткани печени взрослых мышей с последующей эксплантацией гепатоцитов в монослойную культуру является мощным стимулом ре-экспрессии АФП (Глейберман, Бюл. эксп. биол.мед., 1982, 93:55-58).
Как отмечалось выше (глава 2), исследование проницаемых межклеточных контактов в ткани печени и гепатом привело нас к
мключению, что в процессе опухолевой трансформации нарушения межклеточной связи могут носить локальный характер и, в таком :лучае, они не могут быть обнаружены в экспериментах по измерению электрической связи на целом органе. Поэтому первичная культура гепатоцитов представлялась нам весьма интересной моделью, которая тозволяла исследовать роль межклеточных контактов в регуляции ;интеза раково-эмбрионального белка во взрослых гепатоцнтах и, в эолее общем плане, в регуляции фенотипа дифференцированных клеток. В соответствии с этим мы провели сравнительное исследование проницаемых межклеточных контактов и синтеза АФП в первичной культуре гепатоцитов из интактной печени взрослых мышей при различных условиях культивирования.
5.2 Материалы и методы.
Объекты исследования, а) монослойные культуры гепатоцитов. Суспензию гепатоцитов получали по методу, описанному в работе (Глейберман, Бюлл. эксп.биол.мед., 1982, 93: 55-58), из интактной печени взрослых мышей-самок линии С57В1/6 после двух-этапной перфузии in situ растворами ЭГТА ("Serva", ФРГ) и коллагеназы ("Boehringer-Mannheim", Австрия). Суспензию клеток помещали в пластиковые чашки Петри диамегром 40 мм, на субстрат из сухой желатины ("Sigma", тип I, США), и культивировали в среде Лейбовича L-15 ("Flow", UK) с 10% фетальной гелячей сыворотки (Ин-т Гамалеи, СССР), с добавлением глютамина и антибиотиков.
б) ко-культуры гепатоцитов с крысиными эпителиальными клетками печени линии ИАР-20 (любезно предоставленными Г.Банниковым из ОНЦ РАМН) получали по методике, описаной в работе (Guguen-Guillouzo et all., Expt. Cell Res., 1983, 143: 47-54), с некоторыми модификациями (в среду не добавляли глюкокортикостероиды и уменьшили клеточную плотность). В культуральные чашки диаметром 40 мм вносили около 250 тысяч гепатоцитов и после их прикрепления на подложке из сухой желатины добавляли 500-600 тысяч клеток ИАР-20. При этом для клеток ИАР-20 формировали градиент клеточной плотности (в центре чашки - зона повышенной плотности) путем легкой ротации чашек при внесении этих клеток в культуру. Среду меняли 2-3 раза в неделю.
с) культуры с использованием коллагенового геля. Коллагеновый гель готовили из раствора уксуснокислого коллагена, выделенного из
хвостовых сухожилий крыс, смешивая его в соотношении 4:1 с 5-кратной средой Дальбекко, содержащей 0,125 М NaOH и 0,26 М NaliCOj. Для полимеризации чашки с этой смесью помещали в термостат при 37° С на несколько минут. При культивировании внутри коллагенового геля после прикрепления гепатоцитов к коллагеновому субстрату в чашки вносили дополнительную порцию смеси и после окончания полимеризации вносили полную среду для культивирования.
Проницаемость межклеточных контактов определяли методом внутриклеточных инъекций флуоресцентного красителя (dye coupling), используя Люциферовый желтый СН ("Sigma", США) - см. раздел 4.1.
Иммуногистохимические методы. Помимо синтеза АФП, в качестве дифференцировочных маркеров гепатоцитов использовалась локализация домен-специфических мембранных антигенов гепатоцитов мыши: антигена желчных капиляров (АГ 1) и рецептора к асиалогликопротеинам (РАГП), а также характер распределения актиновых филаментов. Выявление перечисленных антигенов проводили непрямыми иммунофлуоресцентным и иммунопероксидаз-ным методами (Глейберман, Бюлл. эксп.биол.мед., 1982, 93: 55-58). Культуру фиксировали 10-15 мин в 10% формалине на забуференном физиологическом растворе с добавлением 0,05% сапонина для пермеабилизации клеток. После отмывки в физиологическом растворе с сапонином клетки обрабатывали последовательно первыми и вторыми антителами. Актин выявляли с помощью фаллоидина, коныогированного с TRITC (Faulstich et al., Expt. Cell Res., 1983, 144:73-82).
Антитела, использованные в работе. Для выявления АФП использовали кроличьи аффинно очищенные антитела; для РАГП -кроличью моноспецифическую антисыворотку, любезно предоставленную Д.М.Беленьким (Rosenfeld et al., Biochim. Biophys. Acta, 1986, 883: 306-312). В качестве второго реагента в обоих случаях использовали овечьи аффинно очищенные антитела к IgG кролика, коньюгирован-ные с пероксидазой хрена (RZ 3-0; "Serva" ФРГ)- АГ 1 выявляли последовательно крысиными моноклональными антителами В 10 (Рудинская и др., Биол. мембр., 1987, 4:194-207), любезно предоставленными Н.И.Куприной и Т.Д.Рудинской (ВОНЦ РАМН), кроличьими антителами к IgG крыс и овечьими антителами к IgG кролика, коньюгированными с пероксидазой
6.3 Поницаемые межклеточные контакты и экспрессия ЛФП в монослойных культурах гепатоцитов.
Опыты проводили в культурах гепатоцитов из интактной печени взрослых мышей при плотности 2-4-105 клеток на чашку Петри диаметром 40 мм. Первые случаи перетекания красителя наблюдались спустя 4-5 часов после выделения гепатоцитов, несмотря на то, что многие клетки находились в морфологическом контакте сразу после их прикрепления к культуральной подложке. Уровень межклеточной связи быстро нарастал и достигал максимума к 24-48 часам культивирования, после чего происходило резкое падение обоих измеряемых показателей контактной проницаемости:- 1 - степени связи, т.е. числа клеток, в которые распространяется краситель в течение 2 минут после инъекции и 2 - процента "положительных" инъекций (в которых наблюдалось перетекание красителя в соседние клетки) от общего числа инъекций. АФП-содержащие клетки обнаруживались, как правило, через 48 часов культивирования и их количество увеличивалось в последующие дни параллельно снижению уровня межклеточной связи (рис 14). При этом в культуре происходили существенные морфологические изменения: гепатоциты вытягивались, приобретали морфологию активно движущихся клеток, образовывали полислой.
20
15 <и
?
™ й? * °
10 и 5 ч £
У 5
с
5 в
<
0
4 24 48 72 96 время в культуре (часы)
Рис. 14. Динамика межклеточной связи и синтеза АФП в монослойной культуре гепатоцитов. 1 - степень связи, т.е. среднее (из 7-10 инъекций) количество окрашенных соседних клеток за инъекцию (N1); 2 - количество АФП-положительных клеток (%).
Однако в этих культурах наблюдалась значительная неоднородность в распределении АФП-содержащих клеток и уровня диффузионной связи как внутри каждой культуральной чашки, так и между опытами, что не позволяло определить, происходит ли утрата межклеточных контактов и синтез АФП в одних и тех же клетках. Мы предположили,
что подобный разброс связан с локальными колебаниями клеточной плотности. Поскольку создать равномерную плотность в культурах гепатоцитов практически невозможно, мы постарались упорядочить ее неоднородность и разработали систему создания в этих культурах градиента клеточной плотности.
6.4 Контактное торможение синтеза АФП в культурах гепатоцитов.
Для создания градиента клеточной плотности около Ю5 гепатоцитов помещали в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм и в первые 20 мин. чашки слегка вращали. В результате этого часть клеток собиралась в центре, где после прикрепления и распластывания они образовывали участок плотного монослоя диаметром 3-5 мм. По периферии монослоя располагался более разряженный слой клеток, а на всей остальной поверхности чашки находились небольшие гепатоцитарные островки и отдельные клетки.
Измерение межклеточной связи, проведенное раздельно для центральной и периферической частей монослоя, показало (рис. 15 а), что через 24 часа после прикрепления практически все клетки обладают межклеточными диффузионными каналами: 100% положительных инъекций регистрировалось в обоих морфологических популяциях клеток. Однако уже на вторые сутки на периферии монослоя происходило снижение, а затем резкое падение измеряемых показателей межклеточной связи, и к 5 суткам межклеточная связь утрачивалась здесь полностью. В то же время, в плотной центральной части монослоя уровень связи, снижаясь между 2 и 5 сутками, сохранялся достаточно высоким в течение всего срока культивирования.
АФП-положительные клетки в первые двое суток отсутствовали во всех морфологических областях культуры. Начиная с 3 суток в периферической части монослоя появлялось значтельное количество (около 20%) АФП-положительных клеток. К 5 суткам их количество возрастало до 50-75% в различных опытах. При этом в центральной части монослоя вплоть до 5 суток находились лишь единичные АФП-содержащие клетки (рис. 15 б и рис. 16).
В различных по плотности областях клеточной культуры наблюдалась существенная морфологическая неоднородность. На периферии монослоя гепатоциты, уже на 1 сутки значительно более
2Э 18
г 14
512 Ш
О 10 .0
5 8
С £ 6
° 4
2
0
100
арида в ку/ыуре ('-псь(
центр
Рис. 15. Межклеточная связь (а) и количество АФП-про-дуциругощих клеток (6) в культуре гепатоцитов с градиентом клеточной плотности. а - среднее количество (из 8-20 инъекций красителя) окрашенных соседних клеток за инъекцию (Ы) в центре (/) и на периферии (2) культуры. б - процент АФП-поло-жителькых клеток в центре и на периферии; в каждом случае просчитывали по500-800 гепатоцитов.
и край
50
в <
1 2 3 4 5
время в культуре (сутки)
Рис. 16. АФП-содержа-шие клетки в культуре гепатоцитов с градиентом клеточной плотности на 4 сутки. Иммуно-пероксидазное окрашивание, контрастнрован-ное гематоксилином. В плотной центральной части культуры большинство клеток АФП-негативные; в разреженной периферии более половины клеток АФП-положительные (клетки с темными отложениями в цитоплазме). Бар -
б
распластанные, чем в его центре, после 2 суток культивирования вытягивались, становились фибробластоподобными, в дальнейшем образовывали полислой. В плотной центральной части сохранялась морфология эпителиального клеточного пласта, а гепатоциты обладали присущими им in vivo полигональной формой. В культурах с аналогичным количеством клеток, не организованных в плотный монослой и состоящих из отдельных небольших островков, межклетотчая связь утрачивалась практически полноестью после 2 суток культивирования. К 5 суткам обычно до 50-70% клеток были АФП-положительными.
Таким образом, создание культуры с градиентом клеточной плотности позволило сгруппировать однородные по своим свойствам клетки: расположенные в плотном эпителиальном монослое гепатоциты сохраняли исходную морфологию и проницаемые контакты и оставались АФП-негативными, а в участках культуры с исходно более низкой плотностью происходило изменение морфологии, потеря межклеточной связи и возобновление синтеза АФГ1. Иными словами, было показано что ре-экспрессия АФП происходит только в гепатоцитах, утративших межклеточные диффузионные контакты и характерную для них эпителиальную форму, т.е. было выявлено строгое соответствие этих трех процессов в одних и тех же клетках.
Обнаруженный нами в этой серии экспериментов феномен "контактного торможения" синтеза АФП однозначно указывает на вовлеченность межклеточных взаимодействий в механизм регуляции фенотипа гепатоцита. Четкая корреляция между потерей проницаемых межклеточных контактов и ре-экспрессией АФП позволяет предполагать их причинную взаимосвязь. В таком случае, восстановление межклеточной связи должно приводить к ингибированию синтеза АФП. Проверку этого предположения мы осуществили в ко-культуре гепатоцитов с эпителиальными клетками печени.
6.5 Стабилизация взрослого фенотипа гепатоцита при трехмерной организации клеточной культуры.
6.5.1 Ко-культуры.
Совместное культивирование гепатоцитов с эпителиальными клетками печени дает возможность сохранять функции зрелых гепатоцитов в течение длительного времени (Guguen-Guillouzo et. al.,
Exp. Cell Res., 1983, 143:47-54). Мы использовали в качестве партнеров для ко-культивирования с гепатоцитами мыши нетрансформирован-ные крысиные эпителиальные клетки линии ИАР-20. При этом мы создавали в культуралыюй чашке градиент плотности клеток ИАР-20, в то время как гепатоциты распределялись по возможности равномерно.
В 1 - 2 сутки культивирования, пока количество клеток ИАР-20 еще невелико, распластывание гепатоцитов происходило как в стандартной монослойной культуре. При этом гепатоциты оставались АФП-негативными и демонстрировали высокий уровень межклеточной связи. Среди клеток ИАР-20 также регистрировалось 100% положительных инъекций в течении всего периода культивирования. Существенно отметить, что перетекание красителя никогда не наблюдалось между гепатоцитами и клетками ИАР-20, т.е. гетерогенные проницаемые контакты в этой клеточной системе не образуются. К третьим суткам дальнейшему распластыванию гепатоцитов начинали препятствовать активно пролифирирующне клетки ИАР-20, а так как их плотность уменьшалась от центра культуры к периферии, создавалась возможность наблюдать различный харатер эволюции гепатоцитарных островков.
В участках с наивысшей плотностью клеток ИАР-20 уже на 3-4 сутки возникали гепатоцитарные островки (островки 1 типа), состоящие из полигональных клеток, которые обладали отчетливо выраженной системой межклеточных контактов (рис. 17 е, f) и оставались АФП-негативными в течении 10-15 дней культивирования. В них также сохранялись и остальные черты взрослого фенотипа гепатоцита: типичные желчные капиляры с соответствующим антигеном (АГ I), локализация рецептора к асиалогликопротеинам на синусоидальной поверхности гепатоцитов, распределение актина в виде тонкой внутриплазматической сети филламентов и подмембранного кортикального слоя, многократно усиленного вокруг желчных капиляров.
Наиболее интересным было поведение гепатоцитов в областях культуры с первоначально невысокой плотностью клеток ИАР-20. Здесь на 3-5 сутки распластывание гепатоцитов еще не было ограничено и происходящие измепиения соответствовали обычной монослойной культуре того же срока: гепатоциты приобретали подвижность, утрачивали эпителиальную морфологию и проницаемые контакты (рис. 17 g, h) и возобнавляли синтез АФП.
Рис. 17. Межклеточная диффузия красителя Люциферового желтого в культуре гепатоцитов. (а), (г), (с), - фазовый контраст; ф), (d), (/), (h) - соответствующие флуоресцентные изображения, (а) и ф) - высо-кий уровень межклеточной связи (dye coupling) в органотипических трабекулах внутри коллагенового геля и (<.') и if) - в гепатоцитарных островках I типа при ко-культивировании с клетками ИАР-20. (с) и (d) -отсутствие межклеточной связи в измененных трабекулах внутри коллагенового геля и (я) и (h) - в островках II типа в ко-культурах. Увеличение 200х.
Домен-специфические маркеры взрослого гепатоцита сначала теряли присущую им in vivo локализацию, а затем исчезали с клеточной мембраны. Наблюдалось распределение актина, типичное для фибробластоподобных клеток - в цитоплазме появлялись яркие пучки актина. Однако под действием увеличивающейся со временем плотности клеток ИАР-20 происходила реверсия этих гепатоцитарных островков II типа в описанные выше островки I тип. Полностью восстанавливалась межклеточная связь, исчезали АФП-положительные клетки, восстанавливалась картина распределения антигенов и актина, т.е. происходило возвращение к взрослому фенотипу гепатоцита.
В участках культуры с наименьшем плотностью клеток ИАР-20 островки из вытянутых АФП-продуцирующих гепатоцитов, не связанных между собой диффузионными контактами, сохранялись вплоть до 10 дней культивирования.
При помощи инъекций Lucifer yellow в одну из клеток ИАР-20 мы показали (рис. 18), что в островках. ! типа геиатоциты были не только окружены клетками ИАР-20 на уровне культуральной подложки, но и покрыты сверху непрерывным пластом этих клеток: инъекция красителя в одну из клеток ИАР-20, при высоком уровне связи между ними, делала хорошо заметным расположение большого числа окружающих ее клеток. То есть в этих островках возникала трехмерная система культивирования гепатоцитов. В то же время, островки из ползущих, АФП-со держащих гепатоцитов не имели этого покрывающего клеточного пласта. Существенно отметить, что в ко-культурах происходило интенсивное отложение компонентов внеклеточного матрикса между гепатоцитами и клетками ИАР-20.
Рис. 18. Выявление клеток ИАР-20 на поверхности гепатоцитарных островков I типа при микроинъекции Люциферового желтого. (а) - фазово-контрастное и (б) - флуоресцентное изображение. Увеличение 200х.
Таким образом, эти эксперименты показывают, что синтез АФП подавляется до тех пор, пока островки гепатоцитов сохраняют эпителиальную морфологию и высокий уровень межклеточной связи, характерные для них in vivo. Более того, восстановление утраченной морфологии под действием формирующегося монослоя клеток ИАР-20, приводит к возобновлению межклеточной связи и повторному ингибированию синтеза АФП.
Какой элемент этой клеточной системы является непосредственной причиной супрессии АФП? В работе (Mesnil et al., Exp.Cell.Res., 1987, 173, 524-533) показано, что экспрессия специфических дифференциро-вочных генов и морфология взрослых крысиных гепатоцитов сохраняется в течении длительного времени при их культивировании с эпителиальными клетками желчных капиляров. При этом проницаемые контакты между клетками этих двух типов отсутствуют. Авторы приходят к выводу, что необходимым условием сохранения специфических гепатоцитарных функций является морфологический контакт, но не взаимодействие через проницаемые контакты, между гепатоцитами и клетками желчных капиляров.
В то же время, в работах группы Рейд (Reid et al., Isolated and Cultured Hepatocytes, Guillouzoo A. & Guguen-Guillouzo C. (eds.), 1986, 225-258, INSERM, Paris; Spray et al., J.Cell Biol., 1987, 105, 541-551) показано, что добавление в культуру гепатоцитов компонентов внеклеточного матрикса, и особенно специфического для печени гепаран-сульфат протеогликана, приводит к восстановлению спектра экспрессируемых тканеспецефических белков, включая белок щелевых контактов - коннексин.
Данные, полученные в исследованных нами клеточных системах, позволяют предположить, что именно эволюция морфологии гепатоцитарных островков от эпителиальной к фибробластоидной является первопричиной двух других процессов - падения уровня межклеточной связи и ре-экспрессии АФП, а роль плотного монослоя как гомогенных клеток - гепатоцитов, так и гетерогенных клеток ИАР-20 состоит в предотвращении такой эволюции, т.е. в сохранении органотипической балочной морфологии островка. Возможно, что и внеклеточный матрикс также оказывает свое влияние на фенотип гепатоцита в качестве структурообразующего фактора. Для проверки этого предположения мы провели исследование в культуре, трехмерная организация которой создавалась за счет белкового компонента внеклеточного матрикса - коллагена.
6.5.2 Культивирование гепатоцитов внутри коллагенового геля.
При культивировании гепатопитов между двумя слоями геля из полимеризованного коллагена 1 типа распластывание клеток было в. значительной степени ингибировано. При этом гепатоциты уже через двое суток выстраивались в разветвленные трабекулярные структуры из клеток полигональной формы с типичными желчными капилярами между ними, идентичные печеночной балке взрослой печени. В этих органотипических структурах, которые сохранялись вплоть до 9-10 суток, регистрировалась 100% межклеточная связь и полностью отсутствовали АФП-содержащие клетки (рис. 11 а, Ь). Локализация домен-специфических мембранных антигенов и распределение актина соответствовали наблюдаемым в интактной взрослой печени, т.е. гепатоциты в таких органотипических трабекулах сохраняли все признаки взрослого фенотипа.
Однако, в некоторых участках культуры можно было наблюдать локальные повреждения в структуре балок. Это было связано, повидимому, с повреждением слоя полимеризованного коллагена, покрывающего гепатоциты, или же с отлипанием верхнего слоя коллагена от слоя, находящегося под клетками. В этом случае происходило изменение морфологии гепатоцитарных агрегатов -клетки теряли свою полигональную форму, вытягивались, исчезали структуры желчных капиляров между ними. Межклеточная связь полностью утрачивалась (рис. 11 с, (1), а синтез АФП возобнавлялся во многих клетках. Все это сопровождалось утратой домен-специфических мембранных маркеров и перестройкой цитоскелета.
Необходимо отметить, что культивирование гепатоцитов на подложке из коллагенового геля, но не внутри него, не приводило к описанным выше результатам. В этом случае в первые 2 суток распластывание гепатоцитов существенно замедлялось, но начиная с 3 суток поведение гепатоцитов на слое из полимеризованного коллагена ничем существенно не отличалось от стандартной монослойной культуры на подложке из желатины.
Таким образом, результаты, полученные в данной экспериментальной системе, как и в ко-культурах гепатоцитов с клетками ИАР-20, показывают, что сохранение (и восстановление) взрослого фенотипа гепатоцита требует трехмерном организации культуры: в случае геля это трехмерный коллаген, в случае ко-культур - это сочетание трехмерной организации клеток-партнеров и внеклеточного матрикса.
Такая трехмерная система обеспечивает существование органо-типических структур, идентичных балкам взрослой печени.
Тот факт, что эпителиальные клетки печени могут быть заменены искуственным внеклеточным матриксом, позволяет полагать, что ключевым звеном в стабилизации взрослого фенотипа гепатоцита является взаимодействие между самими гепатоцитами, которое может осуществляться только в опеределенным образом организованной морфологической структуре. Действительно, межклеточное взаимодействие существенно зависит от таких морфологических параметров, как степень сближения двух соседних клеток, определяющая возможность образования специализированных межклеточных контактов; площадь контактной мембраны между двумя соседними клетками; величина связности, т.е. количество клеток, с которыми каждая данная клетка связана проницаемыми контактами.
Если высказанное предположение верно, то воздействия, блокирующие межклеточный обмен через проницаемые контакты, должны приводить к усилению синтеза АФП в гепатоцитах. Одним из таких блокирующих контакты факторов являются опухолевые промоторы. В связи с этим мы исследовали их действие на межклеточную связь и синтез АФП в культурах гепатоцитов из взрослой интактной печени мышей.
6.6 Влияние опухолевых промоторов на проницаемость межклеточных контактов и синтез АФП.
Как известно, канцерогенез является многоступенчатым процессом, в котором выделяют три основных стадии: инициации, промоции и прогрессии (см.,например, Банников, в "Явления индукции и дифференцировки при опухолевом росте", 1981, Наука, М., с. 4-69). На кратковременной стадии инициации под воздействием мутагенов происходит необратимое наследуемое превращение клетки в премалиг-низированную (генотипическое изменение). На более длительной и обратимой стадии промоции образуются клоны инициированных клеток, из которых на стадии прогрессии формируется автономная опухоль. В соответствии с этим в процессе химического канцерогенеза рассматривается два класса веществ: инициаторы и промоторы. Опухолевые промоторы - это соединения, которые не способны вызывать опухоли, но усиливают и ускоряют их образование при предварительном воздействии инициирующего агента. Свойства промоторов проявляются только при хроническом действии, а их
эффект, в противоположность действию инициаторов - канцерогенов, обратим.
Одним из наиболее характерных признаков опухолевых промоторов является их способность снижать проницаемость межклеточных контактов (см. обзор Yamasaki, 1990, Carcinogenesis, 11:1051- 1058). Предпологается, что именно этим и обусловлено их действие при развитии опухоли. При изучении ингибирующего действия промоторов на межклеточные контакты часто используется наиболе активный промотор кожного канцерогенеза in vivo - форболовый эфир 12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат (ТФА), который также резко увеличивает эффективность трансформации во многих клеточных стстемах in vitro.
Мы провели сравнительное исследование действия ТФА в первичной монослойной культуре гепатоцитов и в культуре эпителиальных клеток печени линии ИАР-20. Исследовали также действие специфического промотора гепатоканцерогенеза in vivo ДДТ (1,1-бис(4-хлорофенил)-2,2,2 трихло-роэтан) в культурах гепатоцитов при различных условиях культивирования. Во всех случаях культуры получали из печени мышей линии С57В1/6. Использовали раствор ТФА ("Sigma") в этаноле и раствор ДДТ ("Sigma") в DMSO. Конечная концентрация растворителя в. рабочем растворе или в культуральной среде не превышала 0,1%.
Мы обнаружили, что ТФА не оказывал ингибирующего действия на диффузионную межклеточную связь в монослойной культуре гепатоцитов даже в концентрации !0'6 г/мл, в то время как для клеток ИАР-20 эффективная концентрация ТФА, при которой полностью блокировалось рапросграненне красителя, составляла 5-Ю"9 г/мл (таб. 7). (Для многих исследованных клеток действующая концентрация ТФА составляет 10"7 г/мл.) Интересно отметить, что клетки ИАР-20 демонстрировали присущий действию ТФА эффект потери чувствительности к нему при длительной (48 часов) инкубации клеток с ТФА. Добавление свежей порции ТФА на 30 мин не приводило к изменению уровня межклеточной связи. В настоящее время хорошо известно, что явление рефрактерности к действию ТФА связано с потерей чувствительности к нему протеинкиназы С, являющейся внутриклеточным рецептором ТФА (Blackshear et al., J. Biol. Chem., 1985, 260: 13304-13315). Мы не обнаружили также изменения уровня синтеза АФП в культуре гепатоцитов, подвергшейся действию ТФА.
Таблица 7. Действие ТФА на межклеточную диффузионную связь в первичной культуре гепатоцитов и в культуре клеток И АР-20.
тип культуры
ИАР-20
концентрация ТФА (г/мл) и время воздействия
10-9 1 час
510-9 30 мин.
5-10-9 48 час
10-8 30 мин.
10-7 2 час.
10-7 ю-6 4 час. 1час
контроль опыт
гепатоциты контроль
опыт
37±2* 36+2 36+2 24±2
(9/9) (9/9) (9/9) (15/16)
38+3 0 60+3 0
(И/11) (0/7) (7/7) (0/7)
1±\ (8/8) 6±1 (7/7)
12±1 15±2
(11/11) (7/7)
12±1 12±2
(9/9) (12/13)
* - среднее количество окрашенных соседних клеток через 2 минуты после внутриклеточной инъекции красителя. В скобках - отношение количества "положительных" инъекций (при которых регистрировалось перетекание красителя) к общему количеству инъекций в опыте.
Исследование действия ДДТ на межклеточную связь и синтез АФП проводилось в обычных монослойных культурах гепатоцитов, в культурах с градиентом клеточной плотности и в культурах гепатоцитов внутри коллагенового геля.
В 1-2-3 суточной монослойной культуре при инкубации клеток с ДДТ в концентрации 5-10"6 г/мл в течение 24 часов средний уровень межклеточной связи снижался в 2-3 раза по сравнению с контролем, а количество АФП-положительных клеток увеличивалось в двухсуточной культуре с 6,5% до 15%, в четырех-суточной культуре с 39% до 60% (данные одного опыта). Существенно отметить, что более длительная инкубация этой культуры в присутствии ДДТ (30 и более часов) приводила как к полной потере межклеточной связи, так и к снижению количества АФП-синтезирующих клеток в сравнении с контролем.
В культуре с градиентом клеточной плотности ДДТ в концентрации 5-10-10"6 г/мл, внесенное в одно -двухсуточные культуры, на 3 сутки приводило к практически полному разобщению клеток в периферической части культуры, где клетки образуют неплотную клеточную сеть. В
то же время в центральной части, представляющей собой сплошной монослой плотно упакованных клеток, проводимость межклеточных контактов для красителя сохранялась, а иногда и превышала таковую в контроле. Количество АФП-лоложительных клеток в периферичес-кой части монослоя увеличивалось в 2-3 раза. В плотной центральной части монослоя количество АФП-продуцирующих клеток не превышало, как и в контроле, нескольких процентов, однако площадь плотной части монослоя в опытных чашках уменьшалась. Инкубация гепатоцитов с более высокой концентрацией ДДТ - 2010~6 г/мл приводила к потере межклеточной проводимости как в центре, так и на периферии монослоя и к полному отсутствию АФП-положитель-ных клеток.
Кльтивирование гепатоцитов внутри коллагенового геля приводит, как уже говорилось (5.5.2), к образованию органо-типических структур, характерных для интактной печени, в которых вплоть до 910 суток сохраняется высокий уровень межклеточной связи и практически отсутствуют АФП-содержащие клетки. При внесении в такую культуру на 4 сутки ДДТ в концентрации 15-10"6 г/мл в течение последующих 3-4 суток происходило локальное изменение морфологии гепатоцитарных пластов, клетки распластывались, приобретали вытянутую форму, выползали из состава балок, утрачивали межклеточную диффузионную связь. В таких измененых структурах регистрировалось до 50% АФП-положительных клеток. На 8 сутки только в небольшой наиболее плотной части культуры сохранялись органотнпические структуры с высоким уровнем межклеточной связи и свободные от АФП-продуцирующих клеток. В контрольных культурах незначительное количество АФП-содержащих клеток наблюдалось только в местах с нарушенной структурой гепато-цитарных балок, как правило, при повреждении слоя коллагенового геля, покрывающего гепатоциты. Необходимым условием ре-экспрессии синтеза АФП в этой системе являлась смена купьтуральной среды через каждые 15-20 часов, с повторным внесением той же дозы ДДТ сразу или через сутки.
Таким образом, в трех культуральных системах мы обнаружили, что специфический промотор гепатоканцерогенеза ДДТ снижал проводимость межклеточных контактов и значительно увеличивал количество гепатоцитов, синтезирующих АФП. Этот эффект наблюдался только в строго определенных рамках концентраций ДДТ, при действии которых проводимость межклеточных контактов сохранялась в морфологически устойчивых областях клеточной культуры и
утрачивалась в периферических зонах, т.е. увеличивался градиент связи между морфологически различными участками клеточного пласта. Более высокие дозы, или большее время инкубации без смены среды, приводящие к полной потере мажклеточной связи, также полностью ингибировали и синтез АФП. Необходимо отметить, что и в этой системе утрата межклеточной связи и усиление синтеза АФП происходили одновременно с изменением формы клеток от полигональной с эпителиальной полярностью в распластанную, фибробласто-подобную форму.
Не специфичный для печени в процессе канцерогенеза in vivo опухолевый промотор ТФА не влиял на уровень межклеточной связи. Данные о специфичности ингибирующего действия промоторов на межклеточные контакты приведены в работе (Klaunig et all., Cancer Letters, 1987, 36: 161-168). Показано, что в культуре гепатоцитов промотор гепатоканцерогенеза фенобарбитал (ФБ) оказывает ингибируклцее действие на межклеточные контакты клеггок из мышей
только тех линий, для которых он является промотором in vivo.
***
Полученные в этой части работы результаты, в совокупности с закономерностями ре-экспрессии АФП в регенерирующей после отравления четыреххлористым углеродом печени и в постнатальном развитии печени мышей (Gleiberman et al., Int. J. Cancer, 1983, 32: 8592), убедительно свидетельствуют, что синтез АФП регулируется на тканевом уровне локальными межклеточными взаимодействиями. Полученные нами данные позволяют также полагать, что проницаемые межклеточные контакты, наряду с сохранением эпителиальной формы гепатоцита, являются одним из основных механизмов, с помощью которого осуществляется эта регуляция. Подержание полигональной формы осуществляется, в свою очередь, как с помощью межгепатоцитарных взаимодействий, так и контактом клеток с трехмерным внеклеточным матриксом. При этом наличие проницаемых межклеточных контактов является надежным маркером сохранения взрослого фенотипа гепатоцитов и органотипической структуры гепатоцитарных островков в культуре.
7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Проведенное нами исследование электрической структуры ткани нромалыгой печени и гепатом мышей показало, что и в процессе канцерогенеза, и в исследованных нами перевиваемых и индуцированных гепатомах проницаемость контактных мембран для неорганических ионов практически не отличается от нормальной ткани. Следовательно, генерализованная потеря проницаемых межклеточных контактов не является обязательным условием малигнизации, как это предполагалось авторами первых иследований этого вопроса.
В то же время, при изучении взаимодействия нормальных и неопластических клеток в культуре мы обнаружили существенное изменение (нормализацию) фенотипа неопластических клеток L, если они растут в контакте с нормальными клетками. Весьма вероятно, что это изменение обусловлено передачей через проницаемые межклеточные контакты в L клетки продуктов метаболизма нормальных клеток. Таким образом, этот результат позволяет полагать, что межклеточные диффузионные контакты могут служить фактором супрессии трансформированного фенотипа и роста неопластических клеток.
В культурах гепатоцитов из взрослой интактной печени мышей при различных условиях культивирования наблюдается строгая обратная корреляция между ре-экспрессией раково-эмбрионального белка и уровнем диффузионной межклеточной связи. Специфический промотор гепатоканцерогенеза ДДТ в этих культурах вызывает снижение уровня связи и увеличение синтеза АФП в одних и тех же клетках. Эти результаты позволяют рассматривать проницаемые межклеточные контакты, наряду с эпителиальной формой клетки, в качестве одного из основных элементов системы тканевого уровня регуляции синтеза АФП в гепатоцитах.
При этом необходимо отметить следующее обстоятельство. При воздействии ДДТ эффективными в отношении синтеза АФП являются только такие дозы промотора, при которых межклеточная диффузионная связь сохраняется в плотных, морфологически более устойчивых, областях клеточной культуры и утрачивается в разреженной периферии, т.е. когда возникает градиент межклеточной связи. Это происходит при использовании низких доз ДДТ и длительного его воздействия (сутками), т.е. в условиях, аналогичных действию промотора in vivo. При более высоких дозах, вызывающих
общее (и обратимое) разобщение клеток, синтез АФП ингибируется. Также и в монослойных культурах с градиентом клеточной плотности наибольший синтез АФП наблюдается на границе плотного монослоя, сохраняющего проницаемые контакты, и разреженной зоны, где происходит потеря межклеточной связи, т.е. в условиях возникновения градиента связи как в пространстве, так и во времени. Аналогичная морфологическая закономерность ре-экспрессии АФП наблюдается в регенерирующей после отравления четыреххлорисгым углеродом печени мышей - здесь синтез АФП возобновляется в узком перинекротическом слое клеток. Во всех этих случаях происходит выход (выползание) клеток из клеточного пласта.
Мы полагаем, что эти данные свидетельствуют о том, что в механизме влияния межклеточных контактов на синтез АФП существенным является не ингибирование межклеточной связи по механизму перехода каналов щелевого контакта из открытого в закрытое состояние, а нарушение целостности каналов при нарушении дифинитивной структуры ткани.
Проницаемые межклеточные контакты в невозбудимых тканях традиционно рассматриваются как пути диффузии функционально значимых веществ из клетки в клетку. И это, очевидно, составляет их бесспорную функцию. Однако из перечисленных выше фактов возникает представление, что коннексоны на клеточной мембране могут также играть роль своеобразного клеточного рецептора к соседним клеткам, при помощи которых клетка может получать позиционную информацию о наличии и количестве гомологичных (а может быть и гетерологичных) соседних клеток. В норме, при сохранении структурной целостности ткани, полуканалы (коннексоны) каждой клетки состыкованы с полуканалами соседних клеток. При локальных нарушениях тканевой структуры на мембране появляются свободные коннексоны, которые, как известно, связаны с элементами цитоскелета и, следовательно, информация об изменении их состояния может передаваться внутрт клетки. Помимо этого, коннексоны становятся доступными воздействиям извне, от которых они были изолированы при сохранении структуры целого канала. В пользу такого представления свидетельствуют данные, полученные в работе группы Ямасаки (Krutovskikh et ai., Int. J. Cancer, 1994, 56:87-94). Здесь показано, что в большинстве из 20 исследованных первичных опухолях печени человека снижение уровня межклеточной связи происходило без изменения уровня экспрессии гена и белка коннексина 32, и без
уменьшения интенсивности окрашивания при иммунной реакции, с антителами к Сх32. Однако, если в нормальной ткани и в доброкачественных опухолях сх32 обнаруживался в области контакта с соседними клетками, то в малигнизированных опухолях он находился, главным образом, в областях плазматической мембраны, свободных от контакта с соседними клетками.
В нашей работе рассмотрены также некоторые физиологические регуляторы межклеточной связи - арахидоновая кислота и СОг- Они оказывают быстрое (минуты) обратимое ингибирующее действие на межклеточные контакты. При этом реализуется, очевидно, именно механизм регуляции контактной проводимости за счет перехода кокалов из открытого в закрытое состояние.
Мы надеемся, что полученные нами данные конкретизируют и подтверждают представление о вовлеченности диффузионных межклеточных контактов как в регуляцию фенотипа дифференцированных клеток, так и в процессы малигнизации.
8. ВЫВОДЫ
1. Электротонический потенциал, приложенный внутриклеточно, распространяется равномерно во все стороны от точки поляризации на расстояние до 12-14 клеточных диаметров как в ткани нормальной печени мышей, так и в трех штаммах перевиваемых гепатом и в индуцированных канцергеном гепатомах мышей. Расчет значений проводимости наружных и контактных мембран клеток, проведенный на основе разработанных структурных моделей, обнаружил идентичность этих величин в нормальной и опухолевых тканях. Следовательно, в исследованных гепатомах не происходит потери проницаемости межклеточных контактов для неорганических ионов в основной массе клеток.
2. Неопластические мышиные фибробласты линии Ь, в отличие от нормальных фибробласгов мыши, высоко резистентны к токсическому действию канцерогенного углеводорода ДМБА. Те же Ь клетки становятся чувствительными к токсическому действию канцерогена, если они растут в смеси с нормальными фибробласта-ми: в смешанной культуре ДМБА значительно снижает количество Ь клеток и синтез ДНК в оставшихся клетках Ь. Эти изменения идентичны изменениям, наблюдаемым в культуре нормальных фибробластов при действии ДМБА.
3. Изменение чувствительности к канцерогену у Ь клеток в смешанной культуре является строго локальным эффектом: Ьклетки, растущие в той же культуре, но не контактирующие с нормальными фибробластами, остаются резистентными к ДМБА. Между нормальными фибробластами и Ь клетками образуются проницаемые межклеточные контакты, в то время как они отсутствуют в однородной культуре Ь клеток.
4. Обнаружен новый фактор, индуцирующий межклеточную связь в установившихся линиях эпителиальных клеток, исходно не связанных проницаемыми межклеточными контактами - облучение клеток светом длиной волны 300-480 нм и интенсивностью 100-300 мВт/см2. Условия такого облучения создаются при изучении межклеточной связи широко распространенным методом внутриклеточных флуоресцентных меток.
5. Арахидоновая кислота обратимо блокирует межклеточную диффузионную связь в культуре опухолевых клеток. Эффект сопровождается снижением внутриклеточного рН на 0,1-0,2 единицы и повышением концетрации внутриклеточного кальция до 100-200 нМ. Такое незначительное изменение концентраций этих внутриклеточных регуляторов межклеточных каналов не может объяснить ингибирующее действие АК на межклеточную связь. Высказывается гипотеза, что эффект А К состоит в ее непосредственном действии на контактную мембрану.
6. Исходно не образующие проницаемых межклеточных контактов опухолевые клетки НеЬа, трансфицированные генами коннексинов Сх32 и Сх2б, демонстрируют высокий уровень межклеточной диффузионной связи. В культурах НеЬа Сх32 и НеЬа Сх26 уровень связи зависит от клеточной полотности и изменения состава среды по мере культивирования. Межклеточные контакты клеток НеЬа Сх26 значительно более чувствительны к ингибирующему действию С02 - физиологического регулятора межклеточной связи, чем клеток НеЬа Сх32.
7. В первичной монослойной культуре гепатоцитов из интактной печени взрослых мышей наблюдается отчетливая обратная корреляция между уровнем межклеточной диффузионнной связи и количеством клеток, синтезирующих раково-эмбриональный белок альфа-фетопротеин (АФП). Морфологические закономерности обнаружения АФП и проницаемых контактов в культурах с градиентом клеточной плотности позволяют говорить о феномене
контактного торможения синтеза АФП, который сопровождается сохранением межклеточной связи в областях культуры с высокой плотностью.
Трехмериная организация культуры гепатоцитов при помощи искусственного внеклеточного матрикса или ко-культивирования гепатоцитов с эпителиальными клетками печени приводит к сохранению (и восстановлению) в культуре взрослого фенотипа гепатоцита. В образующихся органотипических трабекулах наблюдается эпителиальная- форма клеток, локализация домен-специфических антигенов и актина, характерная для взрослой ткани, 100% уровень межклеточной связи, отсутствие АФП-положительных клеток.
. В культурах гепатоцитов специфический промотор гелатоканцеро-генеза ДДТ снижает проводимость межклеточных контактов и значительно увеличивает количество АФП-продуцирующих гепатоцитов. Этот эффект наблюдается при длительном действии низких концентраций ДДТ, при которых проводимость межклеточных контактов сохраняется в морфологически устойчивых областях клеточной культуры и утрачивается в периферических зонах.
1. Рассмотрена гипотеза о возможной роли коннексинов в процессе обеспечения клеки позиционной информацией.
Э. ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРИАЦИИ
1. Божкова В.П., Бойцова Л.Ю., Ковалев С.А., Митгельман Л.А., Чайлахян Л.М., Шаровская Ю.Ю., Шилянская Э.Н. (1970) Высокая проницаемость контактных мембран - возможный механизм межклеточного взаимодействия. В сб.: "Межклеточные взаимодействия в дифференцировке и росте". Наука, Москва, стр. 183-193.
2. Бойцова Л.Ю., Ковалев С.А., Чайлахян Л.М., Шаровская Ю.Ю. (1970) Сравнительное исследование электрической связи клеток нормальной печени и гепатом. Цитология, т. 12, стр. 1256-1265.
3. Бойцова Л.Ю., Ковалев С.А., Митгельман Л.А., Потапова Т.В., Рывкин E.H., Чайлахян Л.М., Шаровская Ю.Ю. (1971) Сравнительное исследование проницаемости поверхностных и контактных мембран нормальных и трансформированных фибробластов в культуре ткани. В сб.: "Биофизика мембран". Каунас, т.1, стр.175-184.
4. Потапова Т.В., Шаровская Ю.Ю., Ковалев С.А., Митгельман Л.А., " Чайлахян Л.М. (1972) Влияние ионного состава окружающей среды
на мембранный потенциал клеток L. Цитология, т. 14, N 11, стр. 1335-1341.
5. Mittelman L.A.. Sharovskava Ju.Ju.. Vasiliev Ju.M. (1972) Toxic effect of 7,12-dimethylbenz-anthracene on neoplastic cells grown in mixed cultures with normal fibroblasts. Int. J. Cancer, v. 10, pp. 667-674,
6. Митгельман Л.А., Шаровская Ю.Ю. (1972) Изменение чувствительности к 7,12-диметип-бензо(а)антрацену L клеток, растущих в связи с нормальными фибробластами. Тезисы докладов 4 Международного биофизического конгресса, т.З, EXY, а2/3.
7. Васильев Ю.М., Митгельман Л.А., Шаровская Ю.Ю. (1973) Токсическое действие 7,12-диметилбензоОантрацена на неопластические клетки штамма L, выращенные в смешанной культуре с нормальными клетками. Цитология, т.15, N 1, стр. 67-72.
8. Шаровская Ю.Ю., Митгельман Л.А., Смолянинов В.В. (1975) Электрическая структура ткани нормальной печени. Цитология, т.17, N 12, стр. 1376-1382.
9. Беркинблит М.Б., Божкова В.П., Бойцова Л.Ю., Митгельман Л.А., Потапова Т.В., Чайлахян Л.В., Шаровская Ю.Ю. (1981) Высокопроницаемые контактные мембраны. Наука, Москва. 464 стр.
10. Шаровская Ю.Ю., Митгельман Л.А., Смолянинов В.В., Чайлахян Л.М. (1981) Высокопроницаемые контакты и электрические характеристики ткани нормальной печени и гепатом. I.Высокопроницаемые контакты в индуцированных гепатомах мыши. Цитология, т.23, N 10, стр. 1142-1148.
11. Шаровская Ю.Ю., Митгельман Л.А., Смолянинов В.В., Чайлахян Л.М. (1982) Высокопроницаемые контакты и электрические характеристики ткани нормальной печени и гепатом. II Структурная модель и рачет проницаемости мембран клеток индуцированных гепатом мыши. Цитология, т.24, N1, стр. 26-34.
12. Шаровская Ю.Ю., Марголис Л.Б. (1985) Образование высокопроницаемых контактов и морфологические изменения в культуре эпителиальных клеток. ДАН СССР, т.281, N 1, стр. 233-235.
13. Шаровская Ю.Ю., Марголис Л.Б., Комиссарчик Я.Ю., Снегирев-ская Е.С., Чайлахян Л.М. (1987) Индукция высокопроницаемых межклеточных контактов в культуре эпителиальных клеток. Биол. Мембр., т.4, N 3, стр. 298-314.
14. Глейберман A.C., Левин С.А., Чайлахян Л.М., Шаровская Ю.Ю. (1987) Синтез а-фетопротеина и высокопроницаемые межклеточные
контакты в культуре взрослых мышиных гепатоцитов. ДАН СССР, т.. 296, N 5, сггр. 1243-1245.
15. Sharovskaia Yu.Yu., Chailakhjan L.M., Margolis L.B. (1988) Induction of intercellular communications in epithelial cell culture. Exp. Cell Res., v. 175, N 2, pp. 404-408.
16. Шаровская Ю.Ю., Бойцова Л.Ю., Чайлахян Л.М. (1988) Высоко-нроннцаемые контакты и электрические характеристики ткани нормальной печени и гепатом. III. Отсутствие влияния опухолевого промотора фенобарбитала на межклеточные контакты в печени мыши. Цитология, т.ЗО, N 6, стр. 678-684.
17. Глейберман А.С., Шаровская Ю.Ю.. Кудрявцева Е.И. (1988) Регуляция синтеза альфа-фетопротеина в культурах гепатоцитов взрослых мышей. Цитология, т.ЗО, N 9, стр. 1126.
18. Gleiberman A.S., Sharovskaya Yu.Yu.. Chailakhjan L.M. (1989) "Contact inhibition" of -a-fetoprotein synthesis and junctional communication. Exp. Cell Res., v. 184, pp. 229-234.
19. Gleiberman A.S., Kudrjavtseva E.I., Sharovskaya Yu.Yu., Abelev G.I. (1989) Synthesis of alpha-fetoprotein in hepatocytes is co-ordinately regulated with cell-cell and cell-matrix interactions. Mol. Biol. Med., v. 6, pp. 95-107.
20. Gleiberman A.S., Kudrjavtseva E.I., Sharovskaya Yu.Yu., Abelev G.I. (1989) Cell-cell and cell-matrix interactions are involved in the regulation of alpha-fetoprotein synthesis in hepatocytes. In: Regulation of liver gene expresión, Cold Spring Harbor, New York, p. 209.
21. Gleiberman A.S., Kudrjavtseva E.I., Sharovskaya Yu.Yu., Abelev G.I. (1989) Regulation of alpha-phetoprotein synthesis in mouse hepatocytes in vitro. In: "89 Sapporo cancer seminars", Sapporo, p. 50.
22. Глейберман А.С. и Шаровская Ю.Ю. (1990) Высокопроницаемые контакты и экспрессия феталыюго фенотипа во взрослом гепатоците. В кн. "Механизмы детерминации", ред. А.И.Зотин, Наука, Москва,
23. Gleiberman A.S., Kudrjavtseva E.I., Sharovskaya Yu.Yu. and Abelev G.I. (1990) Tissue mechanisms involved in the regulation of AFP synthesis. In: Abstract Book of XVIII Meeting of the International Society for Oncodevelopment Biology and Medicine, Moscov, p.7.
24. Sharovskaya Yu.Yu.. Gleiberman A.S., Kudrjavtseva E.I. (1991) Intercellular communication and alpha-fetoprotein synthesis in adult hepatocyte culture. In: Intercellular communication, Ed.: F.Bucauskas, Manchester University Press, Manchester and New York, p. 91-106.
25. Staroverov D.B., Krutovskikh V.A., Kudryavtseva E.I., Sharovskava Yu.Yu., Gleiberman A.S. (1991) Gap junctional communication and production of alpha-fetoprotein in adult mouse liver. Онтогенез, т.22, N 4, стр.427-428.
26. Zempel G., Dunina-Barkovskaya A.Y., Muravyova O.V., Sharovskaya Yu.Yu., Margolis L.B., Weber M, Hlser D.F. (1992) Polyunsaturated fatty acids reversibly reduce gap junctions communication by direct lipid-protein interactions. Abstr. Book, of the Annual Meeting of the German Biophysics Society, Osnabrueck, Germany, p.131.
27. Zempel G., Reuss B.,Suhr D., Hlser D.F, Sharovskava Yu.Yu.. Muravjova O.V., Dunina-Barkovskaya A., Margolis L.B. (1993) Aracliidonic acid reversibly reduces gap junctional permeability. Abstracts, International Meeting on Gap Junctions, Hiroshima, Japan, p. 115.
28. Хюльзер Д., Цемпель Г., Ройс Б., Зур., Шаровская Ю.Ю., Муравьева О.В., Дунина-Барковская А.Я., Марголис Л.Б. (1994) Арахидоновая кислота обратимо блокирует высокопроницаемые межклеточные контакты. Биологич.мембраны, т.11, N 1, стр.50-61
29. Sharovskava Yu.Yu., Gleiberman A.S., Chailakhyan L.M. (1994) Effect of tumor promoters on the intercellular communication and alpha-fetoprotein synthesis in primary culture of mouse hepatocytes. Abstracts, Workshop on intercellular communication, Pushcino, Moskow region, Russia, p.82.
30. Zempel G.,Reuss В., Suhr D., Huelser D.F., Sharovskava Yu.Yu.. Muravjova O.V., Dunina-Barkovskaya A.Ya., Margolis L.B. (1995) Arachidonic acid reversibly reduces gap-junctional permeability. Progress in Cell Research. Intercellular Communication through Gap Junctions. Elsevier, Amsterdam - Lausanne - New York - Oxford -Shannon - Tokyo, Vol.4, pp.447-450.
31. Ecker R, Dunina-Barkovskaya A.Y., Sharovskava Y.Y.. Krisciukaitis A., Hlser D.F. (1995) Regulation of mouse Cx32 transfected into a human cell line. Abstracts, 1995 Cap junction conference, France.
32. Дунина-Барковская А.Я., Шаровская Ю.Ю.. Эккерт P., Хюльзер Д.Ф. (1995) Регуляция межклеточных контактов в культуре клеток, трансфицированных геном коннексина Сх32. Молекулярная биология, т.29, стр. 1349-1358.
СОДЕРЖАНИЕ
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ..................................... 1
1.1 Актуальность проблемы...........-.................................................1
1.2 Цель и задачи исследования......................................................3
1.3 Научная новизна работы...........................................................4
1.4 Научно-практическая ценность работы...................................'5
1.5 Апробация работы.....................................................................6
1.6 Публикации................................................................................7
1.7 Положения, выносимые на защиту...........................................7
1.8 Благодарности...........................................................................8
2. ЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА ТКАНИ НОРМАЛЬНОЙ ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ И ГЕПАТОМ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ..................................................................................9
2.1 Материалы и методы.................................................................9
2.2 Системные электрические характеристики ткани печени п гепато.м............................................................................................. II
2.3 Структурные модели ткани печени и индуцированных гепатом мыши.................................................................................. 15
2.4 Расчет удельных сопротивлений наружных и контактных мембран клеток печени и гепатом...................................................18
3. ИЗМЕНЕНИЕ ФЕНОТИПА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ПРИ ИХ ЛОКАЛЬНОМ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С НОРМАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ В КУЛЬТУРЕ..........................23
3.1 Материалы и методы.................................................................23
3.2 Влияние ДМБА на клеточную плотность в культурах НФ
и Ь клеток.........................................................................................24
3.2.1 Морфологические изменения в культурах.........................24
3.2.2 Опыты с предварительно меченными клетками Ь............25
3.3 Влияние ДМБА на синтез ДНК в культурах НФ и Ь клеток................................................................................................26
3.4 Специфичность действия ДМБА на Ь клетки в смешанной культуре............................................................................................28
3.5 Проницаемость межклеточных контактов...............................29
4. ФАКТОРЫ, МОДУЛИРУЮЩИЕ ПРОНИЦАЕМОСТЬ
МЕЖКЛЕТОЧНЫХ КОНТАКТОВ................................................32
4.1 Материалы и методы.................................................................32
4.2 Индукция межклеточной связи в культуре эпителиальных клеток................................................................................................34
4.3 Действие арахидоновой кислоты на проводимость межклеточных контактов.................................................................38
5. РЕГУЛЯЦИЯ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ КОНТАКТОВ В КУЛЬТУРАХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК, ТРАНСФИЦИРОВАННЫХ ГЕНАМИ КОННЕКСИНОВ.........41
5.1 Материалы и методы.................................................................41
5.2 Зависимость уровня межклеточной связи от клеточной плотности в культурах клегок НеЬа Сх32 и НеЬа Сх26.................42
5.3 Эффект С02...............................................................................48
6. ПРОНИЦАЕМЫЕ МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ КОНТАКТЫ И ЭКСПРЕССИЯ РАКОВО-ЭМБРИОНАЛЬНОГО БЕЛКА АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА В КУЛЬТУРАХ ВЗРОСЛЫХ ГЕПАТОЦИТОВ.............................................................................54
6.1 Предпосылки к постановке задачи...........................................54
6.2 Материалы и методы.................................................................55
6.3 Поницаемые межклеточные контакты и экспрессия АФП
в монослойных культурах гепатоцитов..........................................57
6.4 Контактное торможение синтеза АФП в культурах гепатоцитов......................................................................................58
6.5 Стабилизация взрослого фенотипа гепатоцита при трехмерной организации клеточной культуры...............................60
6.5.1 Ко-культуры.......................................................................60
6.5.2 Культивирование гепатоцитов внутри коллагенового геля...............................................................................................65
6.6 Влияние опухолевых промоторов на проницаемость межклеточных контактов и синтез АФП........................................66
7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ...............................................................................71
8. ВЫВОДЫ..........................................................................................73
9. ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ..............................75
-
Шаровская, Юлия Юрьевна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 1996
-
ВАК 03.00.02
- Гидродинамические параметры растительных тканей
- Влияние механической стимуляции на фенотип артериальных гладкомышечных клеток
- Иммуногистохимическое исследование фенотипа и инвазивного потенциала опухолей поджелудочной железы
- Биохимические аспекты формирования барьерного фенотипа эндотелиоцитов человека при совместном культивировании с аллогенными астроцитами
- Влияние звездчатых клеток печени на фенотип мезенхимных стволовых клеток крысы in vitro
