Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гидродинамические параметры растительных тканей

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Гидродинамические параметры растительных тканей"

На правах рукописи

СИБГАТУЛЛИН Тимур Анварович

ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЕЙ: ИССЛЕДОВАНИЕ ИМПУЛЬСНЫМ МЕТОДОМ ЯМР

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2010

1 8 Г>)С? ">П

003491957

Работа выполнена в лаборатории биофизики транспортных процессов Учреждения Российской академии наук Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

профессор

Александр Васильевич Анисимов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор

Абдуллазян Абдулкадырович Зялалов (ИПЭН АН РТ, Казань)

доктор физико-математических наук, старший научный сотрудник Николай Викторович Котов (КГУ, Казань)

Ведущая организация: Московский государственный университет

имени М.В. Ломоносова, Москва

Защита состоится ¿>2010 г. в часов на заседании диссертационного

совета Д002.005.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Казанском институте биохимии и биофизики КазНЦ РАН по адресу: 420111, г. Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31, а/я 30, тел/факс (843)2927347.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Казанского научного центра РАН.

Автореферат разослан года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Б. Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Постановка проблемы и ее актуальность. Проблема транспорта воды в растениях включает в себя вопросы идентификации путей переноса воды и определения условий их переключения, механизмов движущих сил, транспортных характеристик барьерно-регуляторных структур (клеточные стенки, мембраны, плазмодесмы, цитоскелет, сосудистая система), стоящих на пути движения воды. Решение этих вопросов позволит определить механизмы, обеспечивающие устойчивость растений к условиям водного дефицита - фактору, оказывающему наибольшее влияние на рост и продуктивность растений (Kramer, 1983). Наряду с этим, выявление механизмов регуляции водного транспорта позволит повысить эффективность обезвоживания растительных тканей в процессах переработки и хранения биологической продукции. Однако решение этих вопросов осложняется тем, что вода в растительной ткани движется по различным путям, взаимосвязанным между собой и регулируемым в зависимости от характера движущих сил (Steudle, 2002). Многофакторность проблемы транспорта, воды, в свою очередь, определяет повышенные требования к методам исследования, задачам и объекту. При этом следует учитывать, что для экспериментального изучения транспорта воды необходимы методы, работающие на атомно-молекулярном уровне и ненарушающие функционирование водных транспортных каналов, в идеале работающие на интактных растениях. К числу немногих адекватных методов относятся импульсные методы ядерного магнитного резонанса (ЯМР), которые занимают особое место благодаря своей высокой чувствительности и возможности неразрушающего прямого контроля переноса воды и структурных параметров клеток (Анисимов и Раткович, 1992; Van As, 2007). До настоящего времени в большинстве экспериментов применительно к исследованию растений импульсные методы ЛМР используются как «брутго-методы» - в эксперименте регистрируется полный сигнал от всех молекул воды образца. Это приводит к вынужденному игнорированию различий клеток в разных областях образца ткани, в частности, по размеру, форме и степени вакуолизации. В свою очередь, эти параметры определяют время гидравлической релаксации клеток, эффективную трансклеточную проводимость, скорость релаксации ядерной намагниченности воды в компартментах клетки. Таким образом, . применение «брутто-метода» приводит к усреднению экспериментально измеряемых характеристик по объему образца ткани, что допустимо только для однородных объектов, а в противном случае - зачастую приводит к многовариантности при интерпретации данных. Пространственное разрешение сигнала ядерной намагниченности, ставшее возможным с применением магнитно-резонансной томографии (МРТ), снимает, в определенной степени, проблему усреднения. Однако использование техники МРТ сопряжено с рядом трудностей, связанных с широким спектром гетерогенности растительных тканей, как по структурным, так и

функциональным параметрам. При исследовании транспорта воды ситуация усложняется динамичностью процессов водного переноса. В результате, на сегодняшний день методам МРТ при исследовании большинства тканей не хватает пространственного разрешения для достижения клеточного уровня и временного разрешения для фиксации быстро меняющихся процессов водного переноса. И, наконец, ограниченная доступность специализированной для исследования растений техники МРТ и, как следствие, недостаточное развитие методик обработки данных диффузионно-взвешенной МРТ усложняет интерпретацию полученных результатов на уровне физиологии растений. Таким образом, наряду с техникой МРТ необходимо развивать селективные методы ЯМР для контроля водного переноса в тканях. С одной стороны, это расширит возможности метода МРТ применительно к растительным объектам. С другой стороны, позволит на более простом и доступном по сравнению с МРТ оборудовании решать широкий круг задач на клеточном и субклеточном уровнях.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось:

Селективное исследование гидродинамических параметров в отдельных компартментах растительных тканей импульсным методом ЯМР.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка методов исследования гидродинамических и структурных параметров компартментов клетки и межклеточных транспортных путей в растительных тканях на основе импульсных методов ЯМР.

2. Определение методом математического моделирования условий применимости метода ЯМР-диффузометрии для измерения диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в растительной ткани.

3. Селективное исследование методом ЯМР-диффузометрии трансляционной подвижности воды в компартментах вакуолизированной клетки.

4. Исследование анизотропии диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в тканях корнеплода моркови (Daucus carota).

5. Проведение сравнительного анализа температурной зависимости диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в корнях растений (Pennisetum americanum и Zea mays), различающихся по устойчивости к водному стрессу, в норме и в условиях осмотического стресса.

Научная новизна работы. Предложено уравнение, позволяющее в общем случае описать зависимость коэффициента диффузии воды от времени диффузии в пористых (био-)системах и определить параметры, необходимые для расчета диффузионной проницаемости. Продемонстрирована возможность формализации процесса обработки экспериментальных данных ЯМР-диффузометрии, что необходимо для исследования диффузионной проницаемости методом МРТ и для серийных исследований.

Предложен метод оценки скорости потока воды в цитоплазме вакуолизированной клетки с использованием ЯМР-диффузометрии. Определена скорость потока воды в цитоплазме клеток паренхимы яблока.

Получены карты диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в растительной ткани с использованием диффузионно-взвешенной МРТ на примере корнеплода моркови (Daucus carota).

На основе карт диффузионной проницаемости установлено различие тканей корнеплода моркови по диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей и обнаружена анизотропия диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей.

При сравнении зерновых культур (кукуруза и просо), различающихся по устойчивости к дефициту воды, в условиях осмотического стресса обнаружено различие кортикальной паренхимы первичных корней: 1) по вкладу симпластного пути в суммарный межклеточный диффузионный перенос воды; 2) по температурной зависимости суммарной диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей и диффузионной проницаемости симпластного пути.

Научно-практическая значимость работы. Разработанные методы анализа трансляционной подвижности воды и полученные в результате исследований данные позволяют проводить исследование функционирования межклеточных водных транспортных путей на уровне ткани, группы клеток, компартментов клетки на интактных растениях. Полученные в ходе работы данные об особенностях температурной регуляции проницаемости межклеточных водных транспортных путей представляют интерес для специалистов в области биофизики и физиологии растений. Изучение реакции симпластного и трансклеточного переноса в ответ на сдвиг водного равновесного состояния осмотическим воздействием позволяет сфокусировать внимание на структурах и регуляторных ответах клеток, отвечающих за приспособляемость растений к дефициту воды. Понимание причин и следствий изменения проницаемости в ответ на изменение уровня водного дефицита создает перспективы для разработки новых технологических приемов оптимизации процесса обезвоживания при переработке и консервации биологической продукции.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на 15 зарубежных и российских конференциях, в частности лично автором диссертационной работы на следующих конференциях: XIII Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем» (Йошкар-Ола, 2006); VI съезд общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007); International conference "Modem developments in magnetic resonance imaging and spectroscopy in medicine" (Kazan, 2007); International Conference "Modern Development of Magnetic Resonance" (Kazan, 2007); European Magnetic Resonance Conference EUROMAR (St. Petersburg, 2008); XVI Международная конференция "Математика. Компьютер.

Образование" (Пущино, 2009); итоговые конференции Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2004, 2006, 2008, 2009).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликованы 22 работы, в том числе 3 статьи в центральных российских научных журналах и 4 статьи в рецензируемых сборниках трудов конференций.

Структура и объем. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. В работе представлено 6 таблиц и 50 рисунков. Список литературы включает 135 источников, из них 14 - отечественных.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во Введении обоснована актуальность и практическая значимость работы, сформулированы цели и задачи исследования. В Главе 1 диссертации (обзор литературы) приведены основные представления о межклеточном транспорте воды в растениях и импульсных методах ЯМР, рассмотрены публикации, касающиеся строения и функционирования отдельно взятых путей водного транспорта растений, а также особенностей исследования (био-) пористых систем методом ЯМР.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для проведения экспериментов был выбран ряд растительных объектов, различающихся по сложности строения и функциональной активности метаболизма. Простые однородные запасающие паренхимные ткани, состоящие из изотропных клеток, позволяют отработать методы определения размера клетки и проницаемости межклеточных транспортных путей. Образцы, состоящие из различных тканей с ярко выраженной дифференциацией клеток, представляют больший интерес с точки зрения функционирования межклеточных водных транспортных путей, но требуют применения техники МРТ или селективных методов. Для оценки границ применимости метода ЯМР-диффузометрии при измерении проницаемости межклеточных водных транспортных путей, прогнозирования результатов и интерпретации полученных экспериментальных данных привлечена методика математического моделирования. 1.1. Приготовление образцов

Плод яблони (Malus domestica, сорт Granny Smith). Использовались цилиндрические образцы размером ~ 30 мм3 из внешней части зрелого плода на глубине около 1 см. Размер клеток по результатам микроскопии: 150 - 200 мкм. Температура образца в ходе эксперимента 25±1°С.

Морковь (Daucus carota). Использовались сегменты длинной 2-3 см и диаметром 3-5 см, вырезанные на полувысоте зрелых корнеплодов. Температура образца в ходе эксперимента 20± 1 °С.

Кукуруза (Zea mays); африканское просо (Penniseium americanum). В опытах использовались 10-12 дневные проростки, выращенные на гидропонике при непрерывной аэрации, температуре 25°С и 16-часовом фотопериоде. Сегменты длинной 1 см были приготовлены непосредственно перед измерениями из зоны всасывания первичного корня. Температура образцов в ходе эксперимента задавалась в интервале от 5°С до 35°С с шагом 10°С.

Для создания осмотического стресса коркебая1 система целого растения в течение 24 часов непосредственно перед ЯМР экспериментом помещалась в раствор полиэтиленгликоля ПЭГ-6000, осмотический потенциал которого составлял —0.5 МПа (Money, 1989). Для селективного подавления сигнала от апогагастной воды сегменты корней в ходе ЯМР эксперимента помещались в раствор комплекса парамагнитного иона Gd-ДТПА (диэтилен-триамин-пентауксусная кислота) в концентрации 30 мМ в присутствии маннитола в концентрации 200 мМ.

1.2. Диффузионные и релаксационные измерения. Эксперименты проводились на ЯМР спектрометрах с резонансной частотой на протонах 16МГц и;'30МГц. Для измерения времени спин-спиновой релаксации (Тг) использовалась -стандартная импульсная последовательность Карра-Парселла-Мейбума-Гилла (КПМГ). Для исследования корреляции времени Т2 и коэффициента самодиффузйй (КСД) (RDCOSY) использовалась модифицированная последовательность «Стимулированное Эхо» (van Dusschoten et al., 1996). В этом случае после диффузионного кодирования сигнала включалась серия рефокусирующих 180°-ых РЧ-импульсов, позволяющая проследить релаксацию поперечной намагниченности стимулированного эхо-сигнала. Для измерения времени спин-решеточной релаксации (Г|) определялось время прохождения намагниченности через нуль (нуль-метод) и/или использовался метод инверсии-восстановления намагниченности (ИВ-КПМГ). Корреляция времен TrT2 (RRCOSY) получена методом ИВ-КПМГ.

1.3. Магнитно-резонансная томография. Исследования проводились на МРТ системе (Bruker, Karlsruhe, Germany) с резонансной частотой на протонах 128 МГц в поле сверхпроводящего магнита (Magnex, Oxford, UK). Диффузионно-взвешенные карты плотности протонного сигнала с размером матрицы в плоскости поперечного сечения корнеплода 64x64 точки (разрешение 0.625x0.625 мм) получены с использованием последовательности ТигЬо-СТЭ - комбинация стимулированного эхо и турбо-спин эхо (Scheenen et al., 2001).

1.4. Математическое моделирование. Диффузионный процесс моделировался в рамках двумерной модели случайных блужданий точечных частиц (метод Монте-Карло) в системе регулярно расположенных «клеток» прямоугольной формы (рис. 1), состоящих из двух компартментов, ограниченных полупроницаемыми мембранами. Межклеточное пространство для упрощения модели не рассматривалось. По результатам моделирования определялось среднеквадратичное смещение молекул в

продольном и поперечном направлениях клетки. Учитывая различие скорости релаксации намагниченности в цитоплазме и вакуоли клетки, рассчитывался КСД воды, ожидаемый в ЯМР-экспери менте. Для определенности считалось, что за время диффузии намагниченность затухает за счет спин-спиновой релаксации, что соответствует измерению диффузии импульсной последовательностью Хана.

2.1. Теоретическое описание зависимости коэффициента самодиффузии воды от времени диффузии в биосистемах

В полупроницаемых пористых, мембранных (био-)системах в пределе больших времен диффузии наблюдаемый коэффициент самодиффузии (КСД) воды, уменьшаясь за счет ограничивающего действия мембран, стремится к постоянному значению Д., зависящему от проницаемости и размеров ограничений. Однако в растительных объектах в большинстве случаев значение D„ невозможно определить экспериментально, так как доступный диапазон времен диффузии ограничен процессами релаксации ядерной намагниченности.

На основе работ R.R. Valiullin et al. (1997), R.R. Valiullin and V.D. Skirda (2001) в настоящей работе предложено уравнение, позволяющее описать поведение наблюдаемого КСД жидкости в пористых (био-)системах во всем диапазоне времен диффузии через истинный КСД жидкости D0, КСД жидкости в пределе больших времен диффузии Dm и размер ограничений R

Это уравнение позволяет в общем случае определить все параметры, необходимые для расчета проницаемости ограничений, и, используя аппроксимацию экспериментальных данных методом наименьших квадратов, формализовать процесс обработки результатов диффузометрии, что особенно необходимо при работе с большими массивами данных (в частности в исследованиях методом МРТ).

В приближении системы плоскопараллельных мембран проницаемость ограничений определяется в соответствии с уравнением (Crick, 1970)

где (1 - расстояние между мембранами - связано с размером ограничений Л через коэффициент пропорциональности, зависящий от геометрии ограничений. В случае растительных объектов определяемая таким образом проницаемость отражает диффузионную проницаемость преграды, разделяющей внутриклеточное пространство двух соседних клеток. Далее в работе, если не оговорено специально,

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

(1)

где Dl/2(td) = R2/2tc

d •

(2)

под проницаемостью следует понимать суммарную диффузионную проницаемость межклеточных водных транспортных путей, соединяющих соседние клетки. Смысл этой величины отражается в уравнении Р = как объем воды V,

проходящий через единицу площади поверхности клетки 5 за единицу времени I. 2.2. Математическое моделирование результатов ЯМР-диффузометрии в растительной клетке

Для оценки влияния релаксации намагниченности протонов воды на определяемое методом ЯМР-диффузометрии значение проницаемости клеточных мембран проведено сравнение результатов математического моделирования трансляционной подвижности молекул воды . в системе однородных вакуолизированных клеток для двух случаев: 1) компартменты клетки не различаются по времени релаксации намагниченности; 2) время релаксации намагниченности в вакуоли клетки больше, чем в цитоплазме. По результатам моделирования получены зависимости КСД воды, ожидаемого в ЯМР-эксперименте, от времени диффузии (Рис.1).

Аппроксимируя функцией (1) зависимости КСД воды, усредненного по компартментам клетки (среднего КСД) (рис. 1), и, используя уравнение (2), определены значения суммарной диффузионной проницаемости' мембран, разделяющих соседние клетки (табл. 1). Показано, что различие компартментов клетки по времени релаксации намагниченности может приводить к существенному искажению определяемых значений проницаемости мембран.

Цифрами обозначены: 1 - цитоплазма клетки (а\ = 500 мкм, Ь\ = 50 мкм); 2 - вакуоль клетки (а2 = 490 мкм, ¿2 = 40 мкм); 3 - тонопласт; 4 - плазмалемма.

Символы соответствуют различ-ным значениям проницаемости тонопласта (Р/'°") и плазмалеммы (?/'):

(*)-РГя = РГ = 0;

(•) - Р/"" = Р£"' = 10 мкм/с; (А) - Р/т = 40 мкм/с, РГ = 10 мкм/с;

(Т) - РГ" = 1000 мкм/с, РГ = 10 мкм/с.

Рис. 1. Математическая модель растительной ткани и зависимости среднего КСД воды в поперечном направлении. клетки от времени диффузии, промоделированные в условиях отсутствия релаксации намагниченности (Тг""- Тг"т = (открытый символ) и в условиях различия компартментов по времени спин-спиновой релаксации намагниченности воды (Г2ма' = ] с> = о.2 с) (закрытый символ).

Табл. 1. Значения диффузионной проницаемости по результатам аппроксимации зависимостей КСД от времени (рис. 1).___■

Входные параметры математической модели Результаты аппроксимации

у2»* = т2т"' = оо 'р^ак ^ р^ит

/>/*, мкм/с Р<Г", мкм/с ' Р}, мкм/с Р^,мкм/с " Р^ ,мкм/с

10 10 3.33 3.5±0.2 0.4±0.2

10 40 6.67 б.7±0.3 2.7±0.3

10 100 8.33 6.9±0.4 4.0±0.5

10 200 9.09 7.0±0.5 4.9±0.5

10 1000 9.80 7.3±0.6 5.9±0.6

Суммарная проницаемость Р^ рассчитывалась:

* - по уравнению Р* - ({Р")"' + 2{Р"°")'1)"';"- по уравнению (2).

Установлено, что, чем меньше скорость диффузионного обмена воды между компартментами клетки (за счет большего размера клетки и вакуоли или меньшей проницаемости тонопласта), тем больше относительная разница между экспериментальным (в условиях Т{ак > 7У'1"") и реальным (заданным) значениями проницаемости. При медленном обмене (Р/'°" = 10мкм/с) в условиях Г/™ > Т{'™ затухание намагниченности неэкспоненциальное. Вода, проходящая через слой цитоплазмы с = 0.2 Т{аг\ быстро теряет намагниченность, а основной вклад в сигнал ядерной намагниченности при больших относительно времени 7У1™ временах диффузии дают молекулы воды, не выходившие из вакуоли за время наблюдения. В результате, наблюдаемое значение проницаемости меньше реального почти на порядок. При быстром обмене (Р/ои = 1000мкм/с) намагниченность затухает моноэкспоненциально со скоростью, равной средневзвешенному скоростей релаксации намагниченности воды в вакуоли и цитоплазме. Все внутриклеточное пространство можно описать одним временем релаксации. В результате, экспериментально наблюдаемое значение проницаемости приближается к реальному значению.

Если в модель клетки ввести третий компартмент - межклеточное пространство, характеризующееся, как правило, наименьшим временем релаксации намагниченности, то определяющим фактором станет скорость обмена воды между вакуолью и апопластом, но принципиально, с точки зрения измерения проницаемости, ситуация не изменится.

Из результатов моделирования следует, что рост скорости диффузионного обмена воды между компартментами клетки приводит к снижению влияния релаксации намагниченности протонов воды на измерение диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в растительной ткани методом ЯМР-диффузометрии.

2.3. Селективное исследование трансляционной подвижности воды в компартментах вакуолизированной клетки

Детальное изучение функционирования водных транспортных путей растения требует предварительного исследования особенностей трансляционной подвижности воды селективно в каждом компартменте клетки. Метод ЯМР позволяет проводить такие исследования только в условиях медленного обмена воды между компартментами клетки, различающимися по времени релаксации намагниченности. Поэтому для решения данной задачи объектом исследования выбрана паренхима плода яблони (Malus domestica), поскольку клетки паренхимы сравнительно однородны по размеру, характеризуются медленным относительно времен релаксации обменом воды между компартментами, а неэкспоненциальность релаксационного затухания намагниченности связана с различием компартментов клетки по времени спин-спиновой релаксации воды (Snaar and Van As, 1992).

Для качественной оценки скорости диффузионного обмена воды между компартментами клетки проведен анализ корреляции времен спин-спиновой и спин-решеточной релаксации. Двумерная карта корреляции ТГТ2 показывает, что каждой Т2-компоненте соответствует свое значение времени T¡ (рис. 2 А). Данный факт свидетельствует об отсутствии быстрого диффузионного обмена между компартментами клетки в масштабе времени спин-решеточной релаксации.

Рис. 2. Карты корреляции для клеток паренхимы яблока: (А) - времен спин-спиновой (Т2) и спин-решеточной (Т0 релаксации ядерной намагниченности; (Б) - времени спин-спиновой релаксации намагниченности (Тг) и КСД (О) воды. Карты корреляции получены с помощью обратного преобразования Лапласа данных эксперимента по методам: А) инверсия-восстановление намагниченности (1ЖС05У, последовательность ИВ-КПМГ); Б) модифицированный метод «Стимулированное Эхо» (ЛОСОЗУ, последовательность СТЭ-КПМГ при времени диффузии б мс).

Диффузионные измерения проведены в пределах времен диффузии порядка времени спин-решеточной релаксации воды в вакуоли (наибольшего Ti), Отсутствие быстрого обмена позволило из анализа корреляции Т2-диффузия определить при коротких временах диффузии КСД воды в каждом компартменте клетки (рис. 2 Б). Различие компартментов по наблюдаемому коэффициенту диффузии воды, главным образом, связано с различной геометрией компартментов (форма, размер).

При коротких временах диффузии наибольшее значение КСД, близкое по величине к КСД чистой воды, характеризует вакуолярную воду. Наблюдаемый КСД воды в вакуоли уменьшается с увеличением времени диффузии, что соответствует режиму ограниченной диффузии (рис. 3, 4). В коротковременном режиме, когда молекулы воды не успевают выйти за пределы вакуоли, наблюдаемый КСД воды в вакуоли линейно зависит от квадратного корня из времени (Mitra et al., 1993)

Наклон этой зависимости (рис. 3) определяется соотношением площади поверхности клетки S к объему клетки V. Для сферы S/V = 6/d, где d - диаметр сферы. В приближении сферической формы клетки полученное значение отношения S/V соответствует диаметру клетки 172±4 мкм, что хорошо согласуется с результатами микроскопии.

(3)

1,8x10®-

S7V = 35*103 М1 |

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Рис. 3. Зависимость КСД воды в вакуоли клетки паренхимы яблока от квадратного корня из времени диффузии. Прямая соответствует аппроксимации начального участка зависимости функцией (3).

Рис. 4. Экспериментальные зависимости наблюдаемого КСД воды в вакуоли (•) и в цитоплазме (■) клеток паренхимы яблока от времени диффузии в логарифмической (А) и линейной (Б) шкалах. (А) Сплошная линия соответствует теоретической зависимости D{td ), рассчитанной по уравнению (1) при Д0 = 1.67-10"9 м2/с и Д = 0.38-10"9 м2/с; пунктир соответствует Д. = 0.38-10"9 м2/с. (Б) Прямая соответствует аппроксимации линейного участка зависимости D(td ) функцией (4).

Аппроксимируя экспериментальную зависимость КСД воды в вакуоли от времени диффузии функцией (1) определены Д, = (1.67±0.01)-10'9 м2/с, Д, = (0.38±0.04)-10"9 м2/с и диаметр клетки d = 170±8 мкм (рис. 4 А). В соответствии с уравнением (2) суммарная диффузионная проницаемость межклеточных водных транспортных путей Р = (2.9±0.6)-10"6 м/с. Это почти на порядок меньше значения проницаемости мембран клеток яблока (2.44-10"5 м/с), полученного J.E.M. Snaar and Н. Van As (1992) методом парамагнитного допинга. В согласии с результатами моделирования, полученное несоответствие значений проницаемости объясняется различием комппартментов клетки по времени релаксации намагниченности в условиях медленного диффузионного обмена.

В цитоплазме используемый в данной работе метод анализа Тг-диффузионной корреляции позволил обнаружить аномальное увеличение КСД воды со временем диффузии на фоне уменьшающегося КСД воды в вакуоли (рис. 4 Б). Такую зависимость невозможно объяснить только диффузионным обменом, так как при td > 0.5 с КСД воды в цитоплазме становится больше, чем в вакуоли. Увеличение КСД воды с ростом времени диффузии интерпретируется проявлением цитоплазматического течения; Если в цитоплазме клеток существует поток воды с некоторой средней линейной скоростью V, тогда среднеквадратичное смещение АХ2 молекул воды в цитоплазме выражается суммой квадратов смещений за счет диффузии и за счет потока

AX2(td) = 2D0td+(Vtd)2.

В результате, наблюдаемый коэффициент диффузии воды в цитоплазме линейно растет со временем и определяется уравнением

Ц|и,Л) = Д> + К2 t„. (4)

Используя уравнение (4), по наклону зависимости Д,,„„(/с/) в паренхиме яблока определена скорость потока воды цитоплазмы V = 15±1 мкм/с (рис. 4 Б). Полученное значение скорости потока сопоставимо с диапазоном скоростей, оцененных в растительных объектах другими методами (Tominaga et al., 2003; Vorob'ev et al., 2004). Таким образом, цитоплазматическое течение фиксируется методом ЯМР и может вносить существенный вклад в ускорение трансляционного движения воды по симпластному пути, по крайней мере, на внутриклеточном этапе транспорта.

2.4. Анизотропия диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в тканях корнеплода Daucus carota

Исследована связь между функциями тканей и проницаемостью межклеточных водных транспортных путей на примере корнеплода моркови (Daucus carota). В этом объекте за счет крупных размеров даже при сравнительно низком пространственном разрешении МРТ возможны локализация и идентификация тканей корнеплода.

Карта распределения плотности протонного сигнала (рис. 5, А) отражает интенсивность сигнала протонов воды и, соответственно, содержание воды в тканях и при высоком разрешении позволяет получить подробную информацию об анатомии корнеплода. Карта времени спин-спиновой релаксации (рис. 5, Б) содержит дополнительную информацию по физиологически важным параметрам. Как правило, большему значению Ti соответствуют, с одной стороны, клетки с большим размером, а с другой стороны - клетки с меньшей проницаемостью мембран. Но для того, чтобы определить один из этих параметров, необходимо знать значение другого. В этом случае целесообразно привлечения метода ЯМР-диффузометрии, позволяющего определить оба параметра одновременно.

Рис. 5. Карта плотности протонного сигнала (А) и карта времени спин-спиновой релаксации (Б) в корнеплоде моркови

(поперечное сечение).

Разрешение карт (А) и (Б) -156 мкм :< 156 мкм.

Ксилема Ксилема' Камбий Флоэма Кортекс

Рис, 6. Тз-взвешенная карта плотности протонного сигнала (0) и выделенные области корнеплода моркови: (1) - водонасыщенная часть ксилемы, (2) - слабооводненная часть ксилемы. (3) - зона камбиальных клеток. (4) - флоэма, (5) - кортекс.

§ $

а-.

а.._

-г-1 —г— 4 ■

~й-2 -»-5!

Тт»

Г»,

ч

Рис. 7. Зависимость коэффициента диффузии от времени диффузии для различных областей корнеплода моркови (обозначения как на рис. 6) в продольном (А) и поперечном (Б) направлениях.

С целью определения ограничивающего действия мембран клетки на трансляционную подвижность воды в клетках корнеплода в продольном и поперечном направлениях были получены серии диффузионно-взвешенных карт плотности протонного сигнала при различных значениях градиента, прикладываемого в соответствующем направлении, и временах диффузии (от 15 мс до 1 с). В каждой точке матрицы по зависимости амплитуды от градиента определен КСД воды. Далее, аппроксимируя зависимость КСД от времени функцией (1), в каждой точке матрицы был оценен размер клеток и проницаемость. Для уменьшения погрешности определения этих параметров была проведена процедура выделения областей (рис. 6), характеризующихся близкими значениями интенсивности сигнала, КСД, времени спин-спиновой релаксации. Для этих областей анализировалось поведение среднего по области коэффициента диффузии.

Приведенные на рис. 7 зависимости КСД от времени диффузии однозначно свидетельствуют о различии областей (тканей) корнеплода по характеру трансляционной подвижности воды. Для каждой области по уравнению (1) определен средний размер клеток в продольном и поперечном направлениях (табл. 2). Значения согласуются с результатами .микроскопии (МсОаггу. 1995). Для зоны камбия продольный размер клеток примерно в 1.8 раза превышает размер в поперечном направлении. В других тканях (ксилема, флоэма, кортекс) клетки в среднем

изодиаметричны, так как основной объем этих областей в зрелом корнеплоде представлен паренхимными клетками.

Из приведенных на рис. 8 карт проницаемости межклеточных водных транспортных путей в продольном (А) и поперечном (Б) направлениях корнеплода моркови следует, что для всех тканей корнеплода характерна анизотропия диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей. Наибольшая степень анизотропии проницаемости наблюдается в области водонасьнценной ксилемы, несмотря на отсутствие ярко выраженной в среднем по этой области анизотропии формы клеток (табл. 2).

Табл. 2. Диффузионная проницаемость межклеточных водных транспортных путей (Р), размер клеток (й) и относительное уменьшение наблюдаемого КСД воды (Д,-Д,)/Ц, в тканях корнеплода моркови в продольном (¡1) и поперечном (±) направлениях корнеплода.

Ксилема Камбий Флоэма Кортекс

(Дл-ДлУЦ,, 0,! 7±0,03 0,39±0,05 0,50±0,02 0,32±0,08

(Д^-Ц.л/Ц^ 0.44±0.02 0,73±0,03 0,62±0,03 0,43±0,03

/?, мкм 30.0±7,0 41.6±5,5 17,9±1,0 18,3±5,2

„ к,. мкм З1.б±2.1 23,5±1,0 19.9±1,0 21,7±1,4

1,0±0,3 1,8±0,3 0,9±0,1 0,8±0,3

Рь 10"4 м/с 1,40±0,б0 0,30±0,09 0,3 8±0,04 0,86±0,45

Р1; !0'4 м/с 0,32±0,04 0,11 ±0,01 0,21 ±0.02 0.4б±0.06

4.4±2,4 2,7±1,1 1,8±0,4 1,9±1,2

1е-5 1е-4 1е-3 I 1е-5 1е-4 1е-3

Рис. 8. Карты проницаемости межклеточных водных транспортных путей в продольном (А) и поперечном (Б) направлениях корнеплода моркови (значения проницаемости для каждой области см. в табл. 2).

При сравнении тканей между собой, наблюдается различие по проницаемости кортекса и флоэмы. Значительно ниже, по сравнению с другими тканями, проницаемость в зоне камбиальных клеток, что, по-видимому, способствует контролю водного статуса ксилемы корнеплода. Таким образом, ткани различаются по диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в зависимости от функций.

При сравнении результатов двух методов анализа данных диффузионно-взвешенной MPT: 1) в каждой точке и 2) по выделенным областям - получено, что для каждой области средневзвешенное по точкам этой области значение параметра совпадает в пределах погрешности со значением параметра, определенного для области, как целого. При этом погрешность второго метода меньше за счет большего отношения сигнал/шум, что позволяет более точно определять диффузионную проницаемость межклеточных водных транспортных путей в интересующей области растительной ткани. В итоге, использование этого метода позволило установить различие между тканями корнеплода моркови по диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей и обнаружить анизотропию диффузионной проницаемости.

2.5. Межклеточный водный транспорт в корнях проса (Pcnnhetum americanum) и кукурузы (Zea mays) в норме и в условиях осмотического стресса

Представляет интерес исследование особенностей транспорта воды по апопластному, симпластному, трансклеточному путям и оценить их вклад в суммарный водный транспорт в растениях, различающихся устойчивостью к дефициту воды. Как следствие, ожидаются различия в реакции растений на изменение температуры окружающей среды и воздействие осмотического стресса.

В предыдущей главе на корнеплоде моркови показано, что ткани могут различаться по диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в зависимости от их функций. Таким образом, при исследовании корней проса и кукурузы было решено провести определение проницаемости селективно по областям (тканям) корня.

Клетки корней проса и кукурузы с меньшим размером и большей проницаемостью мембран, по сравнению с клетками паренхимы яблока, характеризуются быстрым диффузионным обменом воды между компартментами. Поэтому наблюдаемая многокомпонентаость спин-спиновой релаксации может быть связана не с многокомпартментностью клетки, а с различием клеток корня по размеру.

Г- ■ - Контроль j I Осм. Страсс!

г

6

0

* ш

8 i — ._ s

1 О

а

с _т/с

35 » 15 8

3.2 3.3 3.4 3.5 36

Б ю'/т.к-1

Рис. 9. Температурная зависимость проницаемости в Аррениусовых координатах для кортикальной паренхимы корней проса (А) и кукурузы (Б) в норме (и) и в условиях осмотического стресса (А).

Действительно, в механически отделенном кортексе корня кукурузы (так называемый рукавчик) основную долю сигнала составляет медленнорелаксирующая компонента, которая отнесена к сравнительно крупным паренхимным клеткам. Стель характеризуется более коротким временем спин-спиновой релаксации. В связи с этим для корней кукурузы и проса оценку проницаемости на уровне тканей целесообразно проводить с помощью более быстрого и менее трудоемкого по сравнению с МРТ метода Т2-диффузионной корреляции.

При анализе результатов двухмерного Т2-диффузионного эксперимента на целых корнях кукурузы и проса на основании времени спин-спиновой релаксации суммарный сигнал образца разделялся на два компонента:

1) медленнорелаксирующий, соответствующий кортикальной паренхиме;

2) быстрорелаксирующий, соответствующий остальным тканям корня.

С целью определения проницаемости в кортикальной паренхиме корня - ткани, контролирующей радиальный транспорт воды и наиболее однозначно выделяющейся по времени Т2, исследована зависимость средне-эффективного КСД воды от времени диффузии. В соответствии с результатами математического моделирования измеряемая диффузионная проницаемость в условиях быстрого диффузионного обмена воды между компартментами клетки близка к реальным значениям. У проса с увеличением температуры меняется не только значение коэффициента диффузии воды, но и характер его зависимости от времени диффузии. Анализ зависимости КСД от времени диффузии показал, что под воздействием осмотического стресса у корней кукурузы не происходит видимых изменений проницаемости в кортикальной паренхиме, тогда как у проса воздействие осмотического стресса при всех исследованных температурах приводит к уменьшению проницаемости (рис. 9). При этом у проса по сравнению с кукурузой проницаемость заметно растет с температурой.

- ■ - Контроль

- Осм Стресс

35_25_15_5

•-- 1 - I---1---I-'-г*

3.2 3.3 3,4 3.5 3.8

Д 10а / Т. К '1

— т/с

3.4 3.5

ю'/т, К''

-Т,°с

3,4 3,5

1о'/т, к-'

Рис. 10. Температурная зависимость проницаемости параллельных межклеточных водных транспортных путей (симпластный путь - (•); трансклеточный путь - (А)) и суммарной проницаемости (■) в Аррениусовых координатах для кортикальной паренхимы корней проса (А) и кукурузы (Б) в условиях осмотического стресса.

Для определения путей, ответственных за увеличение проницаемости в кортексе проса с ростом температуры, исследован вклад каждого пути в суммарную проницаемость. Для определения роли симпласта в межклеточном транспорте воды сигнал от внеклеточной воды подавлялся введением в межклеточное пространство парамагнитного комплекса Gd-ДТПА, который не проходит через мембраны внутрь клетки. В результате методом ЯМР наблюдается транспорт воды только по путям, не включающим межклеточное пространство, то есть только по симпласту (метод парамагнитного допинга).

После воздействия осмотического стресса в присутствии Gd-ДТПА определена проницаемость симпластного пути. У кортикальной паренхимы проса при всех исследованных температурах, кроме 5°С, проницаемость симпластного пути совпадает в пределах погрешности с суммарной проницаемостью (рис. 10). У кукурузы проницаемость симпластного пути в 2-3 раза меньше суммарной.

В присутствии Gd-ДТПА в межклеточном пространстве методом парамагнитного допинга определены времена обмена между внутриклеточной и межклеточной жидкостями. По значению времени обмена оценена проницаемость трансклеточного пути (рис. 10). Полученные значения энергии активации проницаемости трансклеточного пути (10.8±6.7 кДж/моль для проса и 9.1±2.2 кДж/моль для кукурузы), согласуясь с данными литературы (Morillon and Lassalles, 1999), свидетельствуют в пользу преимущественного переноса по аквапоринам.

Таким образом, при увеличении температуры межклеточный транспорт воды в кортикальной паренхиме корней проса осуществляется преимущественно по симпластному пути, тогда как у ¡слеток кортекса корней кукурузы вклады параллельных водных транспортных путей сравнимы между собой и отсутствует

существенная температурная зависимость как суммарной проницаемости, так и проницаемости отдельно взятых путей.

Учитывая априори более высокую, чем у кукурузы, устойчивость африканского проса к засухе, полученные данные наводят на мысль, что, по крайней мере, одним из механизмов, отвечающих за формирование устойчивости к дефициту воды, является особенность переноса воды по симпластной системе. Таким образом, определена точка приложения сил в дальнейших исследованиях механизмов чувствительности к обезвоживанию и намечен характеристический параметр для экспресс-оценки потенциальной устойчивости растений к обезвоживанию.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Транспорт воды в растении является сложным динамическим процессом, изучение которого встречает ряд серьёзных методических трудностей. Основным требованием для проведения подобных исследований является работа с неповрежденным растением, сохраняющим все свои функциональные характеристики. В то же время для получения более полной информации необходимы методики селективного контроля подвижности воды как в отдельной клетке и ткани, так и в целом растении. Реализация Такого методического подхода способна внести существенный вклад в развитие исследований в области транспорта воды, что в свою очередь позволит решить заявленные в статье «Геномика: биология растений в 2010 году» в журнале «Science» (Somerville and Dangl, 2000) задачи «...системного анализа поглощения, транспорта,-запасания ионов и метаболитов».

Для решения поставленных задач наиболее адекватным подходом является использование методов ЯМР и техники МРТ. К сожалению, на сегодняшний день классическое применение ЯМР не позволяет проводить селективный контроль над водным транспортом по параллельным путям и определять размерные параметры клеток, а уровень развития техники МРТ не дает требуемого пространственного разрешения и ограничен числом методик наблюдения за динамическими процессами, такими как водный перенос. В связи с этим, необходимо развивать методы ЯМР для селективного исследования водного транспорта по тканям и компартментам клетки растения, чему и посвящена настоящая работа.

В данной работе предложены методы исследования диффузионного переноса воды в растительных тканях на основе измерения зависимости наблюдаемого коэффициента диффузии воды от времени диффузии методом ЯМР. В зависимости от условий эксперимента эти методы позволяют исследовать как межклеточный транспорт воды, так и перенос по отдельным компартментам клетки.

С помощью математического моделирования были определены границы целесообразности использования метода ЯМР-диффузометрии. В частности, выявлены условия и причины возможного отклонения измеряемых методом ЯМР-

диффузометрии величин проницаемости и размеров клеток от определяемых другими методами значений. При этом для определения размеров клеток необходимо использовать именно метод ЯМР, поскольку в этом случае, в отличие от использования методов микроскопии, не происходит разрушения путей водного транспорта.

Используя анализ корреляции релаксационных и диффузионных спадов намагниченности в условиях медленного (в масштабе времени спин-спиновой релаксации намагниченности воды) диффузионного обмена воды между компартментамн клетки, продемонстрирована возможность исследовать цитоплазматическое течение в вакуолизированных клетках.

С помощью метода диффузионно-взвешенной МРТ экспериментально показано, что диффузионная проницаемость зависит от функционального назначения клеток. Одновременно с этим в тканях, отвечающих за направленный перенос воды вдоль корня, обнаружена анизотропия диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей, способствующая более свободному транспорту воды в аксиальном направлении корня по сравнению с радиальным.

Совместное использование метода ЯМР-диффузометрии и метода парамагнитного допинга позволило выявить роль каждого пути межклеточного водного транспорта и их доли в суммарном транспорте воды. Сравнивая растения, различающиеся по устойчивости к засухе, установлено, что зависимость интенсивности радиального диффузионного переноса воды по симпласту от осмотического стресса и температуры более выражена для кортекса корней проса по сравнению с кукурузой. Данные, полученные в ходе этого эксперимента, позволяют заключить, что, по крайней мере, часть механизмов обеспечения устойчивости растений к осмотическому стрессу связана с особенностями процесса межклеточного транспорта по симпласту.

Таким образом, в настоящей работе не только представлена методическая база для исследования транспорта воды селективно по растительным тканям и компартментам клетки, но и продемонстрирована возможность их использования для решения конкретных физиологических задач.

ВЫВОДЫ

1. На основе диффузионно-взвешенной магнитно-резонансной томографии разработан метод получения карт диффузионной проницаемости пористых (био-)систем. Впервые получена карта диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в растительной ткани.

2. Разработан метод оценки скорости цитоплазматического течения в вакуолизированкой клетке на основе ЯМР-диффузометрии.

3. Методом математического моделирования показано, что в условиях быстрого диффузионного обмена воды между компартментами клетки различие компартментов клетки по скорости релаксации намагниченности протонов воды оказывает наименьшее влияние - на значение диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей, измеряемое методом ЯМР-диффузометрии. Снижение скорости обмена приводит к увеличению^ влияния релаксации намагниченности на измерение проницаемости. /'

4. Методом диффузионно-взвешенной магнитно-резонансной томографии установлено различие тканей! ¡'корнеплода моркови по диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей. Обнаружена анизотропия диффузионной проницаемости в тканях корнеплода. : !

5. Установлено, что клетки кортекса корней кукурузы и проса' существенно различаются по температурной зависимости диффузионной проницаемости симпластного пути и суммарной проницаемости межклеточных водных транспортных путей.

6. Обнаружено, что в условиях осмотического стресса у клеток кортекса корней проса симпласт является преимущественным путем для диффузионного переноса воды, тогда как у клеток кортекса корней кукурузы диффузионная проницаемость симпластного пути сравнима с проницаемостью трансклеточного и апопластного путей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. DARTS: diffusion and displacement analysis by relaxation time separated PFG NMR / T. Sibgatullin. P.A. de Jager, F.J. Vergeldt et al. // Abstracts / Prague, 2002. -PA 78.

2. DARTS: diffusion and displacement analysis by relaxation time separated PFG NMR / T. Sibgatullin, P.A. de Jager, F.J. Vergeldt et al. // Abstracts / Montecatini Terme, 2002.-P. 73.

3. Сибгатуллин, Т.А. Совместный анализ: диффузионного и релаксационного поведения воды в клетках мякоти яблока методом 1Н ЯМР с ИГМП / Т.А. Сибгатуллин // Сб. тезисов / ИФМК УНЦ РАН - Уфа, 2002. - С. 151.

4. Does asymptotic single compartment diffusion trace compartment size, membrane permeabiblity and tissue hydraulics? A double DARTS approach / H. Van As, P.A. de Jager, T. Sibgatullin et al. // Abstract / Magnetic Resonance Imaging. - 2003. -V.2I.-P.4I7.

5. Анисимов, A.B. Оценка относительной плотности распределения плазмодесм в продольном к поперечному направлению клеток растений по данным спин-эхо метода ЯМР / A.B. Анисимов, Т.А. Сибгатуллин, A.B. Романов // Тезисы докл. / КарНД РАН. - Петрозаводск, 2004. - С. 10.

6. Анисимов, A.B. Особенности исследования диффузии воды в биологических тканях спин-эхо методом ЯМР / A.B. Анисимов, A.B. Романов, Т.А. Сибгатуллин // Тезисы докл. / Воронежский госуниверситет. - Воронеж, 2004. -Т. 1.-С. 612-613.

7. Van As, Н. Combined relaxometry and duffusometry lo estimate cell compartments, membrane permeability and cell-to-cell transport / H. Van As, T. Sibgatullin, F.J. Vergeldt // Proceedings I Veldhoven, 2005. - P. 313.

8. Сибгатуллин, Т.А. Межклеточный водный транспорт растений по данным ЯМР-микротомографии / Т.А. Сибгатуллин, Ф.Дж. Вергельт, X. Ван Ас // Сб. статей / ИФМК УНЦ РАН. - Уфа, 2006. - Вып. XIII, Ч. 2. - С. 211-215.

9. Микропотоки воды в растительной клетке. Исследование методом ЯМР ИГМП / Т.А. Сибгатуллин, Ф.Дж. Вергельт, A.B. Анисимов, X. Ван Ас // Сб. статей / ИФМК УНЦ РАН. - Уфа, 2006. - Вып. XIII, Ч. 2. - С. 216-220.

10. Динамика цитозоля клетки как среды распространения сигнальных молекул / Т.А. Сибгатуллин, Ф.Дж. Вергельт, A.B. Анисимов, X. Ван Ас // Тезисы докл. / Изд-во «ФизтехПресс» КФТИ КазНЦ РАН. - Казань, 2006. - С. 203-204.

11. Трансляционная динамика воды в цитоплазме клеток паренхимы плода Malus domestica. Исследование импульсным методом ЯМР / Т.А. Сибгатуллин, Ф.Дж. Вергельт, A.B. Анисимов, X. Ван Ас // Доклады РАН. - 2006. - Т. 411. -N3.-С. 427-429.

12. Совместный анализ диффузионного и релаксационного поведения воды в клетках мякоти яблока / Т.А, Сибгатуллин, A.B. Анисимов, P.A. de Jager и др. // Биофизика. - 2007. - Т. 52. - N 2. - С. 268-276.

13. Сибгатуллин, Т.А. Межклеточный транспорт воды в растениях: моделирование результатов ЯМР-диффузометрии методом Монте Карло / Т.А. Сибгатуллин, В.Н. Воробьев // Сб. статей / ТГГПУ, ООО «Фолианть». - Казань, 2007.-С. 410-415.

14. Роль симпластного переноса воды в устойчивости растений к засухе: сравнительный анализ корней кукурузы и проса импульсными методами ЯМР / Т.А. Сибгатуллин, F.J. Vergeldt, A.B. Анисимов, Н. van As // Сб. статей / РИО НЦ PBX СО РАМН. - Иркутск, 2007. - С. 247-250.

15.Анизотропия водопроницаемости клеток корнеплода Daucus carota по данным ЯМР томографии / Т.А. Сибгатуллин, F.J. Vergeldt, A.B. Анисимов, Н. van As // Тезисы докл. / Коми НЦ УрО РАН. - Сыктывкар, 2007. - Часть 1, С. 137-138.

16. Межклеточный транспорт воды в корнях Zea mays и Pennisetum americanum в условиях осмотического стресса. Сравнительный анализ импульсными методами ЯМР / Т.А. Сибгатуллии, F.J. Vergeldt, В. Venne и др. // Тезисы докл. / Коми НЦ УрО РАН. - Сыктывкар, 2007. - Часть 2, С. 366-367.

17.Sibgatullin, Т.A. Quantitative imaging of the cell membrane permeability I T.A. Sibgatullin, F.J. Vergeldt, H. van As // Abstracts / ООО «Окей» - Kazan, 2007. - P. 39.

18. Sub-cellular water transport in plants: potential of T2-D correlation analysis and diffusion-weighted MRI / T.A. Sibgatullin, F.J. Vergeldt, P.A. de Jager et al. // Abstracts / Изд-во «ФизтехПресс» КФТИ КазНЦ РАН. - Kazan, 2007. - P. 241243.

19. Water transportation in plants: NMR insight on the subcellular level / T.A. Sibgatullin, F.J. Vergeldt, P.A. de Jager et al. II Abstracts / КМУ ОУП ФФ СП6ГУ - St. Petersburg, 2008. - P. 265.

20. Метод ЯМР в исследовании водного переноса в растениях на субклеточном уровне / Т.А. Сибгатуллии, F.J. Vergeldt, А.В. Анисимов, Н. van As // Аграрная Россия. - 2009. - Спец. выпуск. - С. 101-102.

21. Sibgatullin, T.A. Noninvasive detection of cytoplasmic streaming: peculiarities of plant and animal cells I T.A. Sibgatullin, S.V. Abramova, E.A. Mishagina // Сб. тезисов / НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика». - Москва-Ижевск, 2009. -Вып. 16,4. 1,-С. 220.

22. Quantitative permeability imaging of plant tissues / T.A. Sibgatullin, F.J. Vergeldt, E. Gerkema, H. Van As // Eur. Biophys. J. - 2010. - V. 39. - N. 4. (in press) DOl: 10.1007/s00249-009-0559-l.

/

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 2S.0I.2016г. Печл. 1,5 Заказ № К-6831. ТиражПО экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография. ,

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сибгатуллин, Тимур Анварович

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ В ТЕКСТЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕЖКЛЕТОЧНОМ

ТРАНСПОРТЕ ВОДЫ В РАСТЕНИЯХ.

1.1 .Классификация и строение растительных тканей и клеток.

1.2.Регуляция межклеточного транспорта воды в растениях.

1.2.1. Роль апопласта.

1.2.2. Плазмодесмы — регуляторы симпластного пути.

1.2.3. Трансклеточный путь.

1.3.Движение цитоплазмы растительной клетки.

1.4.Неинвазивные методы ЯМР исследования динамических характеристик воды в растениях.

1.4.1. ЯМР-релаксометрия.

1.4.2. Диффузометрия.

1.4.3. Методы анализа корреляции ЯМР-релаксации и диффузии.

1.4.4. Методы оценки проницаемости мембран.

1.4.5. Магнитно-резонансная томография.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1.Объекты исследования.

2.1.1. Паренхима плода яблони Malus domestica.

2.1.2. Корнеплод моркови Daucus carota.

2.1.3. Корни проса Pennisetum americanum и кукурузы Zea mays

2.2.ЯМР-релаксометрия и диффузиметрия.

2.3.Магнитно-резонансная томография.

2.4.Математическое моделирование результатов ЯМР-диффузометрии

ГЛАВА 3. ВОДНЫЙ ПЕРЕНОС НА УРОВНЕ КЛЕТКИ. ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КОМПАРТМЕНТОВ КЛЕТКИ.

3.1. Математическое моделирование результатов ЯМР-диффузометрии в растительной клетке.

3.2.Спин-спиновая релаксация воды в компартментах клеток паренхимы яблока.

3.3.Корреляция времен спин-спиновой и спин-решеточной релаксации для воды в клетках паренхимы яблока.

3.4.Исследование трансляционной подвижности воды по компартментам клетки.

3.5.Определение структурных характеристик клетки по данным

ЯМР-диффузометрии.

3.6.Оценка проницаемости межклеточных водных транспортных путей клетки.

3.7.Оценка скорости движения воды в цитоплазме.

3.8.Краткие выводы по главе.

ГЛАВА 4. МЕЖКЛЕТОЧНЫЙ ВОДНЫЙ ТРАНСПОРТ В ТКАНЯХ КОРНЯ ПО ДАННЫМ МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНОЙ

ТОМОГРАФИИ.

4.1 .ЯМР-микроскопия корнеплода моркови.

4.2. Диффузионный контраст тканей.

4.3.Проницаемость межклеточных водных транспортных путей в тканях корнеплода.

4.3.1. Анализ по выделенным областям.

4.3.2. Анализ в каждой точке матрицы.

4.3.3. Сравнение методов анализа.

4.4.Краткие выводы по главе.

ГЛАВА 5. ПРОНИЦАЕМОСТЬ РАДИАЛЬНЫХ ВОДНЫХ ТРАНСПОРТНЫХ ПУТЕЙ. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КОРНЕЙ ПРОСА И КУКУРУЗЫ.

5.1.Спин-спиновая релаксация воды в тканях корней кукурузы и проса.

5.2.Диффузия воды в тканях корней кукурузы и проса.

5.3 .Влияние осмотического стресса на диффузионную проницаемость межклеточных водных транспортных путей.

5.4.Температурная зависимость проницаемости межклеточных транспортных путей в тканях корней кукурузы и проса.

5.5.Сравнение межклеточных транспортных путей в корнях кукурузы и проса по диффузионной проницаемости.

5.6. Краткие выводы по главе.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гидродинамические параметры растительных тканей"

Постановка проблемы и ее актуальность.

Проблема транспорта воды в растениях включает в себя вопросы идентификации путей переноса воды и определения условий их переключения, механизмов движущих сил, транспортных характеристик барьерно-регуляторных структур (клеточные стенки, мембраны, плазмодесмы, цитоскелет, сосудистая система), стоящих на пути движения воды. Решение этих вопросов позволит определить механизмы, обеспечивающие устойчивость растений к условиям водного дефицита — фактору, оказывающему наибольшее влияние на рост и продуктивность растений (Kramer, 1983). Наряду с этим, выявление механизмов регуляции водного транспорта позволит повысить эффективность обезвоживания растительных тканей в процессах переработки и хранения биологической продукции. Однако решение этих вопросов осложняется тем, что вода в растительной ткани движется по различным путям, взаимосвязанным между собой и регулируемым в зависимости от характера движущих сил (Steudle, 2002). Многофакторность проблемы транспорта воды, в свою очередь, определяет повышенные требования к методам исследования, задачам и объекту. При этом следует учитывать, что для экспериментального изучения транспорта воды необходимы методы, работающие на атомно-молекулярном уровне и ненарушающие функционирование водных транспортных каналов, в идеале работающие на интактных растениях. К числу немногих адекватных методов относятся импульсные методы ядерного магнитного резонанса (ЯМР), которые занимают особое место благодаря своей высокой чувствительности и возможности неразрушающего прямого контроля переноса воды и структурных параметров клеток (Анисимов и Раткович, 1992; Van As, 2007). До настоящего времени в большинстве экспериментов применительно к исследованию растений импульсные методы ЯМР используются как «брутто-методы» - в эксперименте регистрируется полный сигнал от всех молекул воды образца. Это приводит к вынужденному игнорированию различий клеток в разных областях образца ткани, в частности, по размеру, форме и степени вакуолизации. В свою очередь, эти параметры определяют время гидравлической релаксации клеток, эффективную трансклеточную проводимость, скорость релаксации ядерной намагниченности воды в компартментах клетки. Таким образом, применение «брутто-метода» приводит к усреднению экспериментально измеряемых характеристик по объему образца ткани, что допустимо только для однородных объектов, а в противном случае — зачастую приводит к многовариантности при интерпретации данных.

Пространственное разрешение сигнала ядерной намагниченности, ставшее возможным с применением магнитно-резонансной томографии (МРТ), снимает, в определенной степени, проблему усреднения. Однако использование техники МРТ сопряжено с рядом трудностей, связанных с широким спектром гетерогенности растительных тканей, как по структурным, так и функциональным параметрам. При исследовании транспорта воды ситуация усложняется динамичностью процессов водного переноса. В результате, на сегодняшний день методам МРТ при исследовании большинства тканей не хватает пространственного разрешения для достижения клеточного уровня и временного разрешения для фиксации быстро меняющихся процессов водного переноса. И, наконец, ограниченная доступность специализированной для исследования растений техники МРТ и, как следствие, недостаточное развитие методик обработки данных диффузионно-взвешенной МРТ усложняет интерпретацию полученных результатов на уровне физиологии растений.

Таким образом, наряду с техникой МРТ необходимо развивать селективные методы ЯМР для контроля водного переноса в тканях. С одной стороны, это расширит возможности метода МРТ применительно к растительным объектам. С другой стороны, позволит на более простом и доступном по сравнению с МРТ оборудовании решать широкий круг задач на клеточном и субклеточном уровнях.

Цель и задачи исследования.

Целью работы являлось: селективное исследование гидродинамических параметров в отдельных компартментах растительных тканей импульсным методом ЯМР.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка методов исследования гидродинамических и структурных параметров компартментов клетки и межклеточных транспортных путей в растительных тканях на основе импульсных методов ЯМР.

2. Определение методом математического моделирования условий применимости метода ЯМР-диффузометрии для измерения диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в растительной ткани.

3. Селективное исследование методом ЯМР-диффузометрии трансляционной подвижности воды в компартментах вакуолизированной клетки.

4. Исследование анизотропии диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в тканях корнеплода моркови (Daucus car ota).

5. Проведение сравнительного анализа температурной зависимости диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в корнях растений (Pennisetum americanum и Zea mays), различающихся по устойчивости к водному стрессу, в норме и в условиях осмотического стресса.

Научная новизна работы.

Предложено уравнение, позволяющее в общем случае описать зависимость коэффициента диффузии воды от времени диффузии в пористых (био-)системах и определить параметры, необходимые для расчета диффузионной проницаемости. Продемонстрирована возможность формализации процесса обработки экспериментальных данных ЯМР-диффузометрии, что необходимо для исследования диффузионной проницаемости методом МРТ и для серийных исследований.

Предложен метод оценки скорости потока воды в цитоплазме вакуолизированной клетки с использованием ЯМР-диффузометрии. Определена скорость потока воды в цитоплазме клеток паренхимы яблока.

Получены карты диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в растительной ткани с использованием диффузионно-взвешенной МРТ на примере корнеплода моркови (Daucus carota).

На основе карт диффузионной проницаемости установлено различие тканей корнеплода моркови по диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей и обнаружена анизотропия диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей.

При сравнении зерновых культур (кукуруза и просо), различающихся по устойчивости к дефициту воды, в условиях осмотического стресса обнаружено различие кортикальной паренхимы первичных корней: 1) по вкладу симпластного пути в суммарный межклеточный диффузионный перенос воды; 2) по температурной зависимости суммарной диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей и диффузионной проницаемости симпластного пути.

Научно-практическая значимость работы.

Разработанные методы анализа трансляционной подвижности воды и полученные в результате исследований данные позволяют проводить исследование функционирования межклеточных водных транспортных путей на уровне ткани, группы клеток, компартментов клетки на интактных растениях. Полученные в ходе работы данные об особенностях температурной регуляции проницаемости межклеточных водных транспортных путей представляют интерес для специалистов в области биофизики и физиологии растений. Изучение реакции симпластного и трансклеточного переноса в ответ на сдвиг водного равновесного состояния осмотическим воздействием позволяет сфокусировать внимание на структурах и регуляторных ответах клеток, отвечающих за приспособляемость растений к дефициту воды. Понимание причин и следствий изменения проницаемости в ответ на изменение уровня водного дефицита создает перспективы для разработки новых технологических приемов оптимизации процесса обезвоживания при переработке и консервации биологической продукции.

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы были представлены на 15 зарубежных и российских конференциях, в частности лично автором диссертационной работы на следующих конференциях: XIII Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем» (Йошкар-Ола, 2006); VI съезд общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007); International conference "Modern developments in magnetic resonance imaging and spectroscopy in medicine" (Kazan, 2007); International Conference "Modern Development of Magnetic Resonance" (Kazan, 2007); European Magnetic Resonance Conference EUROMAR (St. Petersburg, 2008); XVI Международная конференция "Математика. Компьютер. Образование" (Пущино, 2009); итоговые конференции Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2004, 2006, 2008, 2009).

Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликованы 22 работы, в том числе 3 статьи в центральных российских научных журналах и 4 статьи в рецензируемых сборниках трудов конференций.

Структура и объем.

Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. В работе представлено 6 таблиц и 50 рисунков. Список литературы включает 135 источников, из них 14 — отечественных.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Сибгатуллин, Тимур Анварович

ВЫВОДЫ

1. На основе диффузионно-взвешенной магнитно-резонансной томографии разработан метод получения карт диффузионной проницаемости пористых (био-)систем. Впервые получена карта диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в растительной ткани.

2. Разработан метод оценки скорости цитоплазматического течения в вакуолизированной клетке на основе ЯМР-диффузометрии.

3. Методом математического моделирования показано, что в условиях быстрого диффузионного обмена воды между компартментами клетки различие компартментов клетки по скорости релаксации намагниченности протонов воды оказывает наименьшее влияние на значение диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей, измеряемое методом ЯМР-диффузометрии. Снижение скорости обмена приводит к увеличению влияния релаксации намагниченности на измерение проницаемости.

4. Методом диффузионно-взвешенной магнитно-резонансной томографии установлено различие тканей корнеплода моркови по диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей. Обнаружена анизотропия диффузионной проницаемости в тканях корнеплода.

5. Установлено, что клетки кортекса корней кукурузы и проса существенно различаются по температурной зависимости диффузионной проницаемости симпластного пути и суммарной проницаемости межклеточных водных транспортных путей.

6. Обнаружено, что в условиях осмотического стресса у клеток кортекса корней проса симпласт является преимущественным путем для диффузионного переноса воды, тогда как у клеток кортекса корней кукурузы диффузионная проницаемость симпластного пути сравнима с проницаемостью трансклеточного и апопластного путей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Транспорт воды в растении является сложным динамическим процессом, изучение которого встречает ряд серьёзных методических трудностей. Основным требованием для проведения подобных исследований является работа с неповрежденным растением, сохраняющим все свои функциональные характеристики. В то же время для получения более полной информации необходимы методики селективного контроля подвижности воды как в отдельной клетке и ткани, так и в целом растении. Реализация такого методического подхода способна внести существенный вклад в развитие исследований в области транспорта воды, что в свою очередь позволит решить заявленные в статье «Геномика: биология растений в 2010 году» в журнале «Science» (Somerville and Dangl, 2000) задачи «.системного анализа поглощения, транспорта, запасания ионов и метаболитов».

Для решения поставленных задач наиболее адекватным подходом является использование методов ЯМР и техники МРТ. К сожалению, на сегодняшний день классическое применение ЯМР не позволяет проводить селективный контроль над водным транспортом по параллельным путям и определять размерные параметры клеток, а уровень развития техники МРТ не дает требуемого пространственного разрешения и ограничен числом методик наблюдения за динамическими процессами, такими как водный перенос. В связи с этим, необходимо развивать методы ЯМР для селективного исследования водного транспорта по тканям и компартментам клетки растения, чему и посвящена настоящая работа.

В данной работе предложены методы исследования диффузионного переноса воды в растительных тканях на основе измерения зависимости наблюдаемого коэффициента диффузии воды от времени диффузии методом ЯМР. В зависимости от условий эксперимента эти методы позволяют исследовать как межклеточный транспорт воды, так и перенос по отдельным компартментам клетки.

С помощью математического моделирования были определены границы целесообразности использования метода ЯМР-диффузометрии. В частности, выявлены условия и причины возможного отклонения измеряемых методом ЯМР-диффузометрии величин проницаемости и размеров клеток от определяемых другими методами значений. При этом для определения размеров клеток необходимо использовать именно метод ЯМР, поскольку в этом случае, в отличие от использования методов микроскопии, не происходит разрушения путей водного транспорта.

Используя анализ корреляции релаксационных и диффузионных спадов намагниченности в условиях медленного (в масштабе времени спин-спиновой релаксации намагниченности воды) диффузионного обмена воды между компартментами клетки, продемонстрирована возможность исследовать цитоплазматическое течение в вакуолизированных клетках.

С помощью метода диффузионно-взвешенной МРТ экспериментально показано, что диффузионная проницаемость зависит от функционального назначения клеток. Одновременно с этим в тканях, отвечающих за направленный перенос воды вдоль корня, обнаружена анизотропия диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей, способствующая более свободному транспорту воды в аксиальном направлении корня по сравнению с радиальным.

Совместное использование метода ЯМР-диффузометрии и метода парамагнитного допинга позволило выявить роль каждого пути межклеточного водного транспорта и их доли в суммарном транспорте воды. Сравнивая растения, различающиеся по устойчивости к засухе, установлено, что зависимость интенсивности радиального диффузионного переноса воды по симпласту от осмотического стресса и температуры более выражена для кортекса корней проса по сравнению с кукурузой. Данные, полученные в ходе этого эксперимента, позволяют заключить, что, по крайней мере, часть механизмов обеспечения устойчивости растений к осмотическому стрессу связана с особенностями процесса межклеточного транспорта по симпласту.

Таким образом, в настоящей работе не только представлена методическая база для исследования транспорта воды селективно по растительным тканям и компартментам клетки, но и продемонстрирована возможность их использования для решения конкретных физиологических задач.