Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые адгезивные биорегуляторы растительного происхождения

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Новые адгезивные биорегуляторы растительного происхождения"

На правах рукописи

005013715

Куликова Ольга Геннадьевна

Новые адгезивные биорегуляторы растительного происхождения

03.01.02 биофизика 03.01.06 биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 мдр Ж1

Москва 2012

005013715

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Игорь Александрович Ямсков доктор биологических наук, профессор Виктория Петровна Ямскова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Надежда Павловна Пальмина доктор биологических наук, профессор Владимир Леонидович Воейков

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится 4 апреля_2012 г. в 12 часов

на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 при Федеральном государственном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля по адресу: 119334, Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения науки Института химической физики им. H.H. Семенова РАН

Автореферат разослан "j/" AfüflTja^lO 12 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 002.039.01

кандидат химичеких наук

Мазалецкая Л.И.

Введение

Актуальность работы

Растения являются традиционным источником получения различных биологически активных веществ и лекарственных средств, однако к настоящему времени недостаточно изучены и охарактеризованы. Во многих случаях не выявлены вещества, ответственные за проявление фармакологического действия. Поэтому поиск новых биологически активных веществ растительного происхождения остается актуальной проблемой современной науки. В этом аспекте особого внимания заслуживает выявление в растениях мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов (МГТБ), которые были обнаружены ранее в различных тканях позвоночных животных. МГТБ отличаются, прежде всего, способностью влиять на основные биологические процессы: адгезию, дифференцировку, апоптоз, миграцию и пролиферацию клеток, причем биологическая активность характеризуется наличием тканевой, но отсутствием видовой специфичности и проявляется наиболее ярко в сверхмалых дозах (СМД), соответствующих 10"-10"" мг белка/мл. Все члены данной группы биорегуляторов проявляют сходные физико-химические свойства. В связи с этим для их выделения и очистки применяется экспериментальный подход, включающий в себя определенную методику их экстракции из тканей и последующую очистку. Изучение МГТБ животного происхождения показало, что они имеют сложный состав, включающий в себя пептиды, белки, ионы Са2+, углеводы и липиды. Было показано, что МГТБ локализованы внеклеточно в соответствующей ткани.

В настоящей работе была предпринята попытка идентификации данной группы биорегуляторов в тканях растений, изучения их биологического действия и установления их некоторых физико-химических свойств.

Целью данной работы являлись идентификация новой группы биорегуляторов в тканях растений, изучение их структуры, физико-химических свойств, мембранотропной и специфической активности, а также их локализации в растительных тканях. В отдельные задачи исследования входили:

1. Выделение и очистка биорегуляторов новой группы из ряда растений;

2. Изучение мембранотропной активности биорегуляторов растительного происхождения;

3. Изучение некоторых физико-химических свойств растительных биорегуляторов с помощью современных методов биохимического анализа: электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), динамического лазерного светорассеяния, МАЬЭ1-ТОР масс-спектрометрии, обращснно-фазовой высокоэффективной хроматографии (ВЭЖХ), изоэлектрофокусирования (ИЭФ), аминокислотного анализа;

4. Изучение специфической активности растительных биорегуляторов на моделях органотипического культивирования тканей животных in vitro, а также в экспериментах на мышах in vivo; изучение влияния данных биорегуляторов на рост и развитие семян различных растений;

5. Изучение локализации данных биорегуляторов в тканях растений.

В качестве основных объектов исследования изучали листья подорожника большого (Plantago major L), укропа пахучего (Anelhum graveolens L.), а также луковицы лука репчатого (Allium сера L.) и чеснока (Allium sativum L.). Отдельные исследования были проведены также с биорегуляторами, выделенными из лимона (Citrus limon L.), алоэ древовидного (Aloe arborescens M), кориандра посевного (Coriandrum sativum L.), которые использовали в сравнительном аспекте в экспериментах по изучению биологического действия растительных биорегуляторов. Новизна работы

Впервые в тканях растений были обнаружены новые биорегуляторы, которые по характеру мембранотропного действия и ряду физико-химических свойств проявляют сходство с МГТБ животного происхождения. Было показано, что биологически активной компонентой биорегулятора, выделенного из лука, являлся пептид с молекулярной массой 4036±2 Да Установлена 18-членная С-концевая последовательность этого пептида. С помощью соответствующей базы данных Uniprot показана уникальность данной С-концевой последовательности, поскольку при сравнении с последовательностями известных пептидов гомологов не обнаружено.

Впервые на примере исследования биорегуляторов, выделенных из подорожника и чеснока, установлен тот факт, что биорегуляторы растений локализованы внеклеточно подобно МГТБ животного происхождения.

На примере исследования биорегулятора, выделенного из подорожника, в настоящей работе впервые была установлена корреляции между биологической активностью биорегулятора и лекарственным действием растения - источника его выделения, а именно, биорегулятор, выделенный из подорожника, проявлял в СМД выраженное ранозаживляющее действие.

Впервые показано, что растительные биорегуляторы в СМД оказывают влияние на рост и прорастание семян. Установлена способность биорегулятора, выделенного из подорожника, стимулировать клеточный иммунитет.

Практическая значимость

На основе биорегуляторов, выделенных из подорожника, алоэ, лука, чеснока и лимона возможна разработка новых фармакологических препаратов или БАДов, которые могут быть использованы для профилактики и коррекции работы иммунной системы, а также обладающих ранозаживляющим действием. Биорегуляторы, выделенные из лука и укропа, также могут быть применены в сельском хозяйстве. Структура и объем диссертации

Работа имеет традиционную структуру, она состоит из 3-х основных глав: литературного обзора, в котором рассмотрены строение растительной клетки, ткани высших растений, их характеристика и химический состав, а также основные результаты исследования МГТБ животного происхождения;

экспериментальной части, в которой представлены основные методы исследования растительных биорегуляторов;

результатов и их обсуждения, в которой рассмотрены результаты настоящего исследования и представлена их интерпретация в соответствии с имеющимися литературными данными; а также из введения, заключения и выводов.

Диссертационная работа содержит 105 страниц, 24 рисунка, 6 таблиц, 183 литературные ссылки.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на: VIII международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, 11-13 ноября, 2008; IV Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз», Москва, 2008; I Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, Донецк, 2008; V Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 29 июня - 3 июля, 2009; V Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 29 июня - 3 июля, 2009; II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», 15-16 сентября, Казань, 2008; X Ежегодной международной молодежной конференции «Биохимическая физика» ИБХФ РАН-ВУЗы, Москва, 8-10 ноября, 2010; VI Международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов», Алушта, 20-24 сентября, 2010; XI Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика». Москва, 9-11 ноября, 2011.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из которых 3 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень Высшей аттестационной комиссии, 6 в сборниках научных трудов, 5 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Результаты и их обсуждение

1. Выделение, очистка и изучение физико-химических свойств растительных биорегуляторов

С применением экспериментального подхода, разработанного для выделения и исследования МГТБ животного происхождения, биорегуляторы данной группы были получены из лука репчатого, укропа пахучего, чеснока, лимона, алоэ древовидного и кориандра посевного. Для исследования были взяты именно выше упомянутые растения, поскольку известно, что они способны оказывать различное лекарственное действие. Биологическое действие лекарственных растений находит применение при создании препаратов для профилактики и лечения различных заболеваний. Так, например, известно, что препараты из листьев подорожника весьма успешно используют в качестве ранозаживляющего средства, а препараты, полученные на основе лука, эффективно применяются при различного рода заболеваниях кишечника.

Аналогично МГТБ животного происхождения биорегуляторы, выделенные из растений, оставались в растворенном состянии в насыщенном растворе сернокислого аммония. Это было показано исследованием мембранотропной активности надосадочных жидкостей и осадков, которые получали путем высаливания соответствующих растительных экстрактов. На рис.1, в качестве примера приведена диаграмма, отражающая мембранотропное действие супернатанта, полученного из экстракта чеснока. Метод мембранотропной активности, который является методом биотестирования МГТБ животного происхождения, был использовании и для идентификации растительных биорегуляторов. Биологически активные супернатанты растительных экстрактов далее разделяли методами ИЭФ, обрашенно-фазовой ВЭЖХ, электрофореза в ПААГ. Полученные фракции биорегуляторов идентифицировали методами биотестирования, изучали МАЬ01-ТОР масс-спектрометрией, динамическим лазерным светорассеянием. В отдельных экспериментальных сериях изучали специфическую активность растительных биорегуляторов.

При ИЭФ растительные биорегуляторы так же, как и МГТБ животного происхождения были определены во фракции кислых белков (рН<3,0). На рис.2, представлена картина

разделения супернатанта, полученного из экстракта подорожника при И ЭФ в градиенте рН 3,0-10,0.

Полученные данные указывают, что наиболее количественно представленной ГОФ-фракцией супернатанта растительного экстракта является фракция кислых белков. На рис.3, представлена диаграмма, отражающая мембранотропное действие ИЭФ-фракции.

Ма (%)

КЗ 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 /5/*б

Рис. 1. Мембранотропное действие супернатанта экстракта чеснока, по оси ординат ~ величина мембранотропного эффекта, Ма (%); по оси абсцисс - степень 10-кратного последовательного разведения изучаемого препарата, №; К -контроль; Биологически активные разведения отмечены темным цветом; (р< 0,05).

Исходная концентрация препарата составляла 0,1 мг белка/мл.

4

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 N фракции

Рис. 2. Картина разделения супернатанта экстракта подорожника методом И ЭФ

По оси ординат I- значения рН; по оси ординат 2- Э28о; по оси абсцисс - номера фракций.

Ма (%)

К 3 4 5 6 7

9 10 11 12 13 14 15

, №

Рис. 3. Мембранотропное действие ИЭФ-фракций супернатанта экстракта подорожника рН <3.0. по оси ординат - величина мембранотропного эффекта. Ма (%); по оси абсцисс - степень 10-кратного последовательного разведения изучаемого препарата, №; К - контроль; Биологически активные разведения отмечены темным цветом; (р<0,05); Исходная концентрация препарата составляла 0.1мг белка/мл.

На рис.4, представлена картина разделения супернатанта экстракта лука методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиенте вода-ацетонитрил. Наиболее представленной является фракция, элюированнная при 9% концентрации ацетонитрила. Методом биотестирования также было установлено проявление данной фракцией мембранотропной активности, характерной для МГТБ.

Рис. 4. Разделение супернатанта экстракта лука с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Колонка Jupiter С5 (2x150 мм). Элюцию осуществляли в градиенте концентрации ацетонитрила (0-70%) в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте (рН 2,2) со скорость 0,3 мл/мин в течение 70 мин. Детекцию проводили при 210 нм.

Методом МАЬОЬТОР масс-спектрометрии было установлено, что основным компонентном данной ВЭЖХ-фракции являлся пептид, молекулярная масса которого составила 403 6±2 Да (рис.5.).

2000 4000 6000

12000 14000

Рис. 5. MALDI-TOF масс-спектр ВЭЖХ-фракции супернатанта экстракта лука.

Используя ферментативный гидролиз (карбоксипептидазой Y) изучаемого пептида с последующим MALDI-TOF масс-спектрометрическим анализом реакционной смеси, была установлена его 18-членная С-концевая аминокислотная последовательность:

-GlyPheGlyGluGlyAlaTyrThrGIyAlaValAlaAlaGlyThrGluGlyArg. Уникальность структуры данного пептида была продемонстрирована при сравнительном анализе полученной С-концевой аминокислотной последовательности в базе данных Uniprot (http:// www.uniprot.org) полипептидов.

Исследование супернатантов растительных экстрактов методом динамического лазерного светорассеяния показало присутствие в водных растворах растительных биорегуляторов наноразмерных частиц. Следует отметить, что данная особенность является одной из характеристик МГТБ животного происхождения.

Для биорегуляторов растительного происхождения было показано существование в водных растворах частиц размером 88-110 нм (табл. 1).

Таблица 1. Результаты исследования методом динамического лазерного рассеяния растворов супернатантов растительных экстрактов (концентрация 0,08-0,1 мг белка/мл)

Объект исследования Значение гидродинамического радиуса частиц (нм)

Подорожник большой 110 ±5,5

Лук репчатый 99,2 ±4,9

Чеснок 101,7+5,1

Укроп пахучий 88 ±4,4

Полученные результаты показывают, что в изучаемых фракциях, содержащих растительные биорегуляторы, несмотря на незначительное содержание белка (концентрация 0,08-0,1 мг белка/мл), образуются достаточно крупные наночастицы, размер которых соответствует размеру частиц МГТБ животного происхождения.

Методом МАЬЭМО" масс-спектрометрии для всех супернатантов растительных экстрактов было показано присутствие небольших пептидов (табл.2).

Таблица 2. Идентификация пептидов, входящих в состав супернатантов растительных экстрактов, методом МАЬМ-ТОР масс-спектрометрии

Объект исследования М (т/г) Концентрация (мг белка/мл)

Подорожник большой 2374, 2963 0,064

Лук репчатый 4036, 8079 2,69

Чеснок 3061, 4367, 8743 0,79

Укроп пахучий 1100, 1391, 2229 1,37

Данные МАЬ01-Т0Р масс-спектрометрии подтверждаются результатами исследования, проведенного методом электрофореза в ПААГ. На примере исследования ИЭФ-фракции, выделенной из подорожника, было показано, что основным компонентом является пептид с молекулярной массой приблизительно 2100 Да, который проявлял мембранотропную активность в СМД, характерную для МГТБ животного происхождения (рис.6,7).

94кДа 45кДа 67кД а

ЗОкДа

21,5кДа 14,4кДа

3,5цЦи

Рнс. 6. БОБ-электрофорез в 7,5% ПААГ ИЭФ-фракции (рН<3,0) супернатанта экстракта подорожника.

В качестве маркеров были использованы: окисленная В-цепь инсулина из поджелудочной железы быка - 3,5 кДа, а-лактальбумин - 14,4 кДа, соевый ингибитор трипсина -21,5 кДа, карбоангидраза - 31 кДа, овальбумин - 45 кДа, бычий сывороточный альбумин - 66,2 кДа и фосфорилаза Ь - 94,6 кДа.

160 140 120 100 80 60 40 20 0

Рис. 7. Мембранотропное действие низкомолекулярной (<3,5кДа) фракции супернатанта экстракта подорожника по оси ординат - величина мембранотропного эффекта, Ма (%); по оси абсцисс - степень 10-кратного последовательного разведения изучаемого препарата, №; К - контроль; Биологически активные разведения отмечены тенмым цветом; (р<0,05).

К 3 4 5 6 7 8 9 10 и 12 13 14 15

№

Методом ЯМР-спектроскопии при исследовании супернатанта экстракта лука было показано, что в состав растительного биорегулятора входит лактат (8=1,22 м.д), углеводная компонента: р-глюкоза (8 = 3,14 м.д.) и а-глюкоза (8 = 3,48 м.д.). Также были обнаружены аланин (5 = 1,41 м.д.), ацетооацетат (8 = 2,15 м.д.) и ТЯ-ацетил гликопротеина 5 = 1,95; 2,05 м.д. Широкий слабый сигнал, отвечающий липидной компоненте, был отмечен при 8 = 1,15 м.д. (рис.8.).

Таким образом, аналогично МГТБ животного происхождения растительные биорегуляторы, согласно результатам ЯМР-анализа, так же содержат углеводную и липидную компоненты.

I

(1! Г

Ч 1

аМ ( |

Рис. 8. ЯМР'Н - спектр супернатанта экстракта лука Таким образом, суммируя результаты проведенного исследования можно заключить, что, в растениях присутствуют ранее неизученные биорегуляторы, сходные по физико-химическим свойствам с МГТБ животного происхождения. Так же, как и МГТБ, растительные биорегуляторы находятся в растворенном состоянии в насыщенном растворе соли, в водном растворе присутствуют в состоянии достаточно крупных наноразмерных частиц, а в их состав входят биологически активные пептиды с небольшими молекулярными массами, углеводы, а также липиды.

2. Исследование локализации биорегуляторов, выделенных из подорожника, чеснока и лука, в листьях и луковицах растений

С помощью иммуногистохимической реакции с использованием вторичных ПТС-

конъюгированных антител были изучены локализации биорегуляторов, выделенных из подорожника, чеснока и лука в тканях соответствующих растений. Для изучения локализации биорегуляторов в листьях подорожника, чеснока и лука были получены

11

поликлональные антисыворотки у кроликов, которые использовали в качестве первичных антител к растительным биорегуляторам. В качестве антигенов для иммунизации использовали биологически активную ИЭФ-фракцию кислых белков подорожника, а также супернатанты экстрактов чеснока и лука. Установлено, что растительные биорегуляторы локализованы внеклеточно.

Рис.8, демонстрирует внеклеточную локализацию в ткани листа подорожника биорегулятора, выделенного из листьев подорожника. Яркое свечение на рисунке относится к неспецифическому свечению и принадлежит хлоропластам. На рис.9, так же приведена внеклеточная локализация в ткани луковицы лука биорегулятора, выделенного из луковицы лука. Результаты исследования биорегулятора, выделенного из луковицы чеснока, показали, что в листьях чеснока он локализован на поверхности клеток губчатого мезофилла и эпидермиса (рис.10). На рис.11, представлен гистологический срез ткани листа чеснока, который наглядно демонстрирует расположение клеток, на поверхности которых локализован биорегулятор. На рис.12, и рис.13, соответственно, приведены внеклеточная локализация в луковице чеснока биорегулятора, выделенного из чеснока, а также гистологический срез ткани данного растения. На рис.9, так же приведена внеклеточная локализация в ткани луковицы лука биорегулятора, выделенного из луковицы лука. Рис.8, демонстрирует внеклеточную локализацию в ткани листа подорожника биорегулятора, выделенного из листьев подорожника. На рис.11, и 13 представлены гистологические срезы тканей соответствующих растений, которые наглядно демонстрируют строение тканей данных растений.

Полученные данные представляются весьма важными в аспекте проводимого нами сравнения МГТБ животного происхождения и растительных биорегуляторов, поскольку и те и другие биорегуляторы локализованы внеклеточно, что позволяет предполагать об аналогии выполняемой ими функции, соответственно, в животных и растительных тканях.

Следует отметить, что в отличие от тканей животного происхождения адгезивные молекулы, а также различные макромолекулы межклеточного состава тканей растений мало изучены. На основании этого можно заключить, что полученные данные являются важными для понимания механизмов клеточной адгезии и проведения регуляторного сигнала в тканях растений. В этом аспекте весьма интересны результаты, полученные при изучении локализации биорегулятора, выделенного из чеснока. Была показана его локализация в области меристемы (группы образовательных тканей, отвечающих за гистологическое разнообразие тела растения), по сути, представляющей собой зону роста растения. Такая локализация растительного биорегулятора предполагает его участие в процессах роста (регенерации) растения. В связи с этим можно предположить о существовании еще одной

12

аналогии, возможно наиболее принципиальной в плане сравнения функций растительных биорегуляторов и МГТБ животного происхождения, для которых была продемонстрирована способность влиять на клеточные источники регенерации в тканях и тем самым, стимулировать процессы восстановления и регенерации.

Рис. 8. Локализация биорегулятора, выделенного из листьев подорожника, в ткани листа подорожника (увеличение об. "100, ок. * 10). Стрелками отмечена локализация биорегулятора. Наиболее яркое свечение принадлежит хлоропластам.

Рис.10. Локализация биорегулятора, выделенного из луковиц чеснока, в ткани листа чеснока (увеличение об. *40, ок. *10). Стрелками отмечена локализация биорегулятора.

4 ч

5 \Л

200|ш

1

Рис.12. Локализация биорегулятора, выделенного из луковиц чеснока, в ткани луковицы чеснока (увеличение об. *40, ок. хЮ). Стрелками отмечена локализация биорегулятора.

Рис.11. Гистологический срез ткани листа чеснока (увеличение об. *40, ок. *10). Стрелками отмечены клетки, на поверхности которых локализован биорегулятор, выделенный из луковицы чеснока.

Рис.1 Э. Гистологический срез ткани луковицы чеснока (увеличение об. *40, ок. *10). Стрелками отмечены клетки, на поверхности которых локализован биорегулятор, выделенный из луковицы чеснока.

3. Изучение специфической активности биорегуляторов, выделенных из подорожника и алоэ, на модели роллерного культивирования кожи тритона in vitro

Для изучения специфической активности МГТБ ранее были разработаны новые модели роллерного органотипического культивирования тканей тритона (Pleurodeles waltl). Проведение этой серии экспериментов было обусловлено тканеспецифическим, но не видоспецифическим характером биологического действия МГТБ. В проведенных опытах

было установлено протекторное действие биорегуляторов животного происхождения на ткань за счет дополнительной стимуляции в ней клеточных источников регенерации.

Известно, что подорожник и алоэ обладают ранозаживляющим действием. В связи с этим в данном исследовании была также использована модель роллерного органотипического культивирования кожи тритона. В эксперименте исследовали два биорегулятора, выделенные из подорожника и алоэ, соответственно, в виде ИЭФ-фракций (рН<3,0), в концентрациях, соответствующих 10"12 мг белка/мл. Результаты показали, что оба биорегулятора оказывали протекторное действие на ткань, которое после 7-суточного культивирования выражалось в поддержании структуры кожи, сохранении покровного эпителия, жизнеспособности и функций клеток желез. На данном сроке культивирования в культурах контрольной серии (без добавления биорегуляторов) обнаруживались явные признаки развития деструктивных процессов: наблюдали деградацию клеток эпидермиса (рис.146).

Рис. 14. Гистологические срезы кожи тритона: а - нативная кожа, б - роллерная органная культура на 7 сутки культивирования без добавления биорегулятора подорожника (контроль), в - роллерная органная культура на 7 сутки культивирования с добавлением биорегулятора подорожника (опыт), г - роллерная органная культура на 7 сутки культивирования с добавлением биорегулятора алоэ (опыт).

В культурах опытных серий (при добавлении фракций изучаемых биорегуляторов) было обнаружено, что многослойный эпителий в составе активно секретируемой слизи

покрывал поверхность фрагмента кожи (рис.14в,г). На границе эпителия и кориума отмечалось большое количество пигментированных клеток, число которых увеличивалось при неблагоприятных условиях в качестве защитной реакции организма. В кориуме были «идентифицированы фибробласты, развитая сеть пигментных клеток, недеструктирующие железы; состояние ткани было приближено к нативному (рис.14а,в,г). Оба растительных биорегулятора способствовали усиленному образованию слизи, и, следовательно, слущиванию эпителия (рис.14в,г). В опытной группе распределение пигмента было равномерным, в отличие от контроля, где пигмент был представлен в виде глыбок и плотных скоплений под эпидермисом, что свидетельствует о более неблагоприятных условиях в контрольной среде и нарушении распределения меланофоров в кориуме.

Таким образом, характер специфической активности, проявляемый растительными биорегуляторами, проявляет аналогию с активностью МГТБ животного происхождения, например, с биорегулятором, выделенным из сыворотки крови: действие в СМД, поддержание структуры ткани и сохранение межклеточных адгезионных взаимодействий, увеличение жизнеспособности клеток и сохранение их функций.

4. Изучение специфической активности биорегуляторов, выделенных из подорожника и алоэ, на модели кожной раны мыши in vivo Наиболее выраженное протекторное действие биорегуляторов, выделенных из подорожника и алоэ, было продемонстрировано на модели экспериментальной травмы кожи мыши in vivo. У всех экспериментальных животных на спине наносили стандартную рану. Через 11 сутки после операции у всех экспериментальных животных наблюдали практически полную реэпителизацию раневой поверхности, незначительное воспаление в субэпидермальной зоне. У мышей контрольной группы (необработанная рана) происходило образование фиброзного рубца - отмечено параллельное эпидермису расположение коллагеновых волокон в виде плотных тяжей (рис. 15а) При обработке раны физиологическим раствором также наблюдали образование соединительно-тканного рубца, однако в центральной части раны отсутствовало полное заживление и реэпитализация, поскольку образовался очаг хронического воспаления. В подкожной ткани практически не наблюдали жировых клеток; волокна коллагена были более рыхлые, чем в дерме (рис.15б). У мышей опытных групп (действие биорегуляторов, выделенных соответственно из подорожника и алоэ) наблюдали восстановление субэпидермальных слоев (рис. 16а,б). Следует отметить комплексный характер репаративных процессов, протекающий при воздействии растительных биорегуляторов, по сравнению с контролем: наблюдали практически полное восстановление эпителия и дермы, в которой были отмечены кровеносные сосуды, а расположение волокон в дерме было более рыхлым, чем в контроле.

16

Помимо этого, при воздействии фракций подорожника в подкожной жировой ткани отмечали интенсивное разрастание жировой ткани и восстановление протоков желез; в контроле на месте повреждения не происходило восстановления жировой ткани, а также не было восстановления протоков желез. Восстановление протоков потовых желез говорит о возобновлении их активности в данном участке кожи, а восстановление рыхлой структуры коллагеновых волокон в дерме свидетельствует о появлении эластичности кожи.

Рис. 15. Ранозаживление кожи мыши на 1 [ сутки после нанесения раны, а - без обработки раны (контроль); б -действие физиологического раствора.

Рис. 16. Влияние ИЭФ-фракции (рН<3,0) растительных биорегуляторов на ранозаживление кожи мыши на 11 сутки после нанесения раны: а - подорожник; б - алоэ.

Полученные данные показывают, что фракции, выделенные из подорожника, в СМД стимулируют ранозаживление у мышей in vivo, способствуя восстановлению нормальной морфологии кожи, без образования рубцовой ткани (рис. 16).

В проведенном исследовании впервые было показано, что в тканях подорожника и алоэ присутствуют ранее неизученные биорегуляторы, которые проявляли свойственное данным лекарственным растениям биологическое действие.

5. Изучение специфической активности растительных биорегуляторов на модели проращивания семян

Отдельной задачей исследования растительных биорегуляторов является определение их функции собственно в растениях. Результаты исследования локализации растительных биорегуляторов, приведенные выше, показали, что в сформировавшемся листе подорожника биорегулятор обнаруживается в межклеточном пространстве ткани, в то время как при интенсивном росте листьев чеснока растительный биорегулятор локализован в меристеме. В настоящей работе для оценки влияния растительных биорегуляторов на рост растений была применена модель проращивания семян. В данном исследовании нами были взяты супернатанты растворов биорегуляторов, выделенных из лука и укропа, в концентрации, соответствующей 10"'4 и 10"12 мг белка/мл соответственно. Результаты эксперимента оценивали по биометрическим параметрам: высота побега, длина корня, вес побега, вес корня, всхожесть. В отдельных случаях комбинация параметров варьировалась в зависимости от возможности адекватного фиксирования того или иного параметра. Результаты данного исследования показали, что биорегулятор, выделенный из укропа, в СМД оказывал стимулирующее действие на семена фасоли, кориандра и укропа. Эффект варьировался от 3 до 86%. Как показано, в табл.3, наибольший эффект на вес стебля, вес корня и количество взошедших семян биорегулятор, выделенный из укропа, оказывал на

семена фасоли и укропа; действие на семена кориандра было не столь эффективным, но оставалось достоверным (р<0,05) (табл.5).

Иные результаты были получены при исследовании биорегулятора, выделенного из лука, на рост семян гороха, чеснока, укропа и лука (р<0,05). В табл.4 приведены данные, которые показывают, что при воздействии данного биорегулятора наблюдали уменьшение веса корня и количества взошедших семян гороха, всхожести семян чеснока, длины и веса стебля, всхожести семян укропа, высоты побега и всхожести семян лука (р<0,05). Из табл.6, видно, что в отдельных случаях ингибирование роста семян достигало 31%.

Следует отметить, что как при стимулирующем действии биорегулятора, выделенного из укропа, так и при ингибирующем влиянии биорегулятора, выделенного из лука, отмечали изменение комбинации различных биометрических параметров семян: например, изменение длины корня, веса стебля, всхожесть и т.д. Однако общая тенденция при действии растительных биорегуляторов сохранялась, которая выражалась в достоверном изменении определенных параметров.

Таким образом, на основании результатов проведенного исследования можно заключить, что растительные биорегуляторы оказывают влияние на рост и всхожесть семян. Их действие может быть охарактеризовано как стимулирующее, так и ингибирующее. Очевидно, что это связано с источником выделения растительного биорегулятора и объектов его воздействия. Полученные данные указывают на актуальность более детального исследования данного вопроса. Можно предположить, что выбор пар «биорегулятор-мишень» для ряда растений позволит использовать эти знания для стимуляции одних видов растений и ингибирования других при полной экологической безопасности.

Таблица 3. Результаты проращивания семян при действии биорегулятора, выделенного из укропа, в концентрации, соответствующей 10"12 мг белка/мл, на 12 сутки культивирования

Семена растения Биометрический параметр Контроль Опыт Эффект %

Фасоль (Phaseolus L.) Вес стебля (мг) 411 ±4,73 764 ± 4,87 86

Вес корня (мг) 537 ±5,16 725 ± 5,25 35

Всхожесть (шт) 13 ±2 22 ±3 69

Кориандр (Coriandrum sativum L.) Высота побега (см) 5,86 ±0,4 6,03 ± 0.4 3

Вес побега (мг) 167 ±3,25 210 ±3.69 25

Всхожесть (шт) 91 ±2 97 ±2 6

Укроп (Anethum graveolens L.) Высота побега (см) 4,41 ±0,5 7.81 ± 0.6 78

Вес побега (мг) 450 ± 0,48 560 ±0,49 24

Всхожесть (шт) 44 ±2 61 ±3 38

Таблица 4. Результаты проращивания семян при действии биорегулятора, выделенного из лука, в концентрации, соответствующей Ю"1'1 мг белка/мл, на 12 сутки культивирования

Семена растения Биометрический параметр Контроль Опыт Эффект %

Горох (Plsum sativum L.) Вес корня (мг) 127 ±1,9 118 ±3,6 3

Всхожесть (шт) 62 ±2 43 ±3 31

Укроп (Anethum graveolens LJ Высота побега (см) 5,2 ± 0,2 4,75 ±0,2 9

Вес побега (мг) 10,2 ± 0,03 8,9 ±0,03 13

Лук (Allium сера L.) Высота побега (см) 8,9 ± 0,2 7,8 ± 0,2 12

6. Исследование растительных препаратов на реакцию гиперчувствительности замеделенного типа (ГЗТ)

Реакция гиперчувствительности замедленного типа является одной из форм клеточного иммунного ответа организма. В данном исследовании на реакцию ГЗТ изучали биорегуляторы, полученные из алоэ, подорожника, лука, чеснока и лимона. В ходе эксперимента наблюдали увеличение реакции ГЗТ в опытных группах. Данный факт свидетельствует о стимуляции клеточного иммунитета: происходит активация СЭ4 Т-клеток воспаления (ТЫ клеток) и макрофагов, которые продуцируют цитокины. Все эти процессы, направленные на изоляцию патогена (или какого-либо иного антигена), завершаются за 2448 часов формированием воспалительного очага.

Результаты исследования показывают, что на первый день измерения лап мышей биорегулятор, выделенный из подорожника, в данных условиях эксперимента усиливает сенсибилизацию к модельному антигену (гемоцианину), что выражается в увеличении реакции ГЗТ и воспалении примерно в 2 раза (рис.Па). Биорегуляторы, выделенные из других выше перечисленных растений имеют тенденцию к усилению реакции ГЗТ, однако, при статистической обработке оказались недостоверно отличимыми от группы с контрольной реакцией ГЗТ. На второй день измерения картина активности не менялась, биорегулятор, выделенный из подорожника, по-прежнему достоверно отличался от контрольного значения параметра (рис.176). На рис. 17в видно, что на третий день ответ иммунной системы на действие антигена нивелировался, реакция воспаления пропадала.

б

1,3 0,8 0,3 -0,2

а Е! га И Й Й О

V №2 М3 т Ш Мб--------Уа7

2,1 1,6 1,1

0,6 0,1 -0,4

№1

Ш , ¡±з , ......

М>2 №3 №4_____М'5______№6___№7

Рис. 17. Диаграмма, отражающая результаты эксперимента по проведению реакции ГЗТ.

По оси абсцисс отложены номера групп, №; по оси ординат - М (средняя разница суммы правой и левой

лап у мышей в группе).

а - первый день эксперимента, б - второй день эксперимента, в - третий день эксперимента. Обозначение групп: №1-контроль, №2- ГЗТ. №3-биорегулятор, выделенный из алоэ, №4-биорегулятор, выделенный из подорожника, №5-биорегулятор, вьшеленный из лука, №6-биорегулятор, выделенный из чеснока, №7-биорегулятор, выделенный из лимона; данные достоверно отличимые от контрольной группы ГЗТ отмечены тенмым цветом; (р<0,05).

Следует отметить, что, не смотря на то, что гиперчувствительность замедленного типа указывает на активацию Т-клеток, инфекция при этом не всегда ликвидируется, т.е.

защитный иммунитет и гиперчувствительность замедленного типа не обязательно совпадают. Поэтому некоторые лица с гиперчувствительностью замедленного типа могут оставаться незащищенными от возможной инфекции.

Таким образом, данное исследование показывает, что биорегулятор, выделенный из подорожника, достоверно усиливается реакцию ГЗТ, т.е. способствует активации клеточного иммунитета.

Заключение

Анализ полученных в данном исследовании результатов позволяет заключить следующее. На примере изучения ряда растений было показано, что в их тканях присутствует новая группа биорегуляторов, проявляющая сходные физико-химические свойства с МГТБ животного происхождения. Растительные биорегуляторы проявляют биологическое действие, характер которого сходен с МГТБ животного происхождения. Так, например, было показано, что биорегуляторы, выделенные из подорожника и алоэ, в сверхмалых дозах (10'8-10'15 мг белка/мл) проявляют ранозаживляющее свойство, которое выражается в поддержании структуры ткани межклеточных адгезионных взаимодействий, увеличении жизнеспособности клеток. Таким образом, показано, что биорегуляторы отражают биологическое действие растений, из которых они были выделены.

Так же, как и МГТБ растительные биорегуляторы, очевидно, имеют сложный состав: они содержат биологически активные пептиды (молекулярная масса не более 8 ООО Да), углеводы и липиды. Для биорегулятора, выделенного из лука, было показано, что в его состав входит биологически активный пептид с молекулярной массой 4036±2 Да. Для данного пептида была определена 18-членная С-концевая аминокислотная последовательность. Физико-химическими методами было показано, что молекулы биорегуляторов, выделенных из растений, аналогично биорегуляторам животного происхождения способны образовывать в водных растворах довольно крупные агломераты размером до 110 нм.

Используя экспериментальную модель проращивания семян, было продемонстрировано влияние биорегуляторов, выделенных из укропа пахучего и лука репчатого, на рост семян ряда культурных растений. Показано, что биорегуляторы, полученные из укропа и лука, проявляли стимулирующее и ингибирующее действия, соответственно.

Было продемонстрировано свойство биорегулятора, выделенного из подорожника, способствовать активации клеточного иммунитета.

Иммуногистохимическими методами была определена внеклеточная локализация биорегуляторов, выделенных из подорожника большого, чеснока и лука репчатого. А

22

именно, биорегуляторы, выделенные из листьев подорожника, луковицы и листа лука, а также из луковицы чеснока, локализованы в межклеточном пространстве соответствующей ткани растения, из которого были выделены. Биорегулятор, выделенный из чеснока, был локализован в межклеточном пространстве меристемы. Полученные результаты по внеклеточной локализации совпадают с данными, полученными при изучении локализации МГТБ.

Суммируя полученные результаты, можно заключить, что в растениях присутствует группа биорегуляторов, принципиально сходная с группой биорегуляторов, обнаруженной в различных тканях позвоночных животных.

ВЫВОДЫ

1. Впервые было показано, что в тканях ряда растений (подорожник большой, лук репчатый, чеснок, укроп пахучий, алоэ древовидное, кориандр посевной и лимон) присутствуют биорегуляторы, физико-химические свойства которых сходны с биорегуляторами, выделенными из тканей животных: они растворимы в насыщенном растворе сернокислого аммония, в их состав входят биологически активные пептиды, в водных растворах они присутствуют в виде наноразмерных частиц (до 110 нм);

2. Биорегуляторы растительного происхождения проявляют мембранотропную активность, которая характеризуется полимодальной дозовой зависимостью и проявлением в концентрациях, соответствующих 10"4 - 10'" мг белка/мл;

3. Показано, что в состав биорегулятора, выделенного из лука, входит биологически активный пептид с молекулярной массой 4036±2 Да, 18-членная С-концевая последовательность которого является уникальной и представляет собой: -GlyPheGlyGluGlyAlaTyrThrGlyAlaValAlaAlaGlyThrGluGlyArg;

4. Установлено, что биорегуляторы, выделенные из подорожника и алоэ, оказывают в концентрации, соответствующей 10"'2 мг белка/мл, свойственное данным растениям протекторное действие на ткань кожи тритона (Pleurodeles wall!) in vitro при роллерном органном культивировании, которое выражалось в поддержании нормальной морфологии ткани кожи тритона, секреции желез, увеличение жизнеспособности клеток по сравнению с контролем;

5. Показано, что биорегуляторы, выделенные из подорожника и алоэ, в концентрации, соответствующей 10"12 мг белка/мл, оказывают ранозаживляющее действие на кожу на модели экспериментальной раны у мышей in vivo.

6. Показано, что биорегуляторы, выделенные из лука репчатого и укропа пахучего, в концентрациях, соответствующих 10'14 и 10"'2 мг белка/мл, оказывают влияние на рост и

развитие семян ряда растений, причем характер этого действия может быть как ингибирующим, так и стимулирующим, соответственно;

7. Методами иммуногистохимии показано, что растительные биорегуляторы локализованы внеклеточно: в листе подорожника биорегулятор, выделенный из подорожника, локализован в межклеточном пространстве ткани этого растения; биорегулятор, выделенный из луковиц чеснока, в листьях чеснока локализован на поверхности клеток губчатого мезофилла и эпидермиса; биорегуляторы, выделенные из луковиц лука и чеснока, также локализованы внеклеточно в тканях луковиц соответствующего растения;

8. С помощью реакции на гиперчувствительность замедленного типа показана способность биорегулятора, выделенного из подорожника большого, стимулировать клеточный иммунитет.

Список публикаций

1. Ямсков И.А., Маргасюк Д.В., Куликова О.Г., Березин Б.Б., Битко С.А., Ямскова В.П. Растительные регуляторные белки, активные в сверкмалых дозах // Труды VII ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика». Москва. 12-14 ноября. 2007. С.289-293.

2. Куликова О.Г., Ямскова В.П., Маргасюк Д.В., Березин Б.Б., Битко С.А., Ильина А.П., Ямсков И.А. Изучение новой группы биорегуляторов, выделенных из растений II Материалы I международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. Донецк. 2008. С.274-275.

3. Маргасюк Д.В., Ямскова В.П., Куликова О.Г., Битко С.А., Березин Б.Б., Краснов М.С., Ямсков И.А. Биологически активные в сверхмалых дозах биорегуляторы, выделенные из растений И Материалы IV Международного симпозиума «Механизмы действия сверхмалых доз». Москва. 2008. С.69-70.

4. Маргасюк Д.В., Ямскова В.П., Куликова О.Г., Битко С.А., Березин Б.Б., Ильина А.П., Краснов М.С., Ямсков И.А. Изучение новой группы активных в сверхмалых дозах растительных биорегуляторов // Труды VIII международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика». Москва. 11-13 ноября. 2008. С.140-143 .

5. Куликова О.Г., Ямскова В.П., Маргасюк Д.В., Березин Б.Б., Битко С.А., Ямсков И.А. Наноразмерные биорегуляторы, выделенные из лимона, чеснока и лука // Материалы II Международной научно-практической конференции. Казань. 15-16 сентября. 2008. С.64-65.

6. Ямскова В.П., Скрипникова B.C., Куликова О.Г., Ильина А.П., Маргасюк Д.В., Краснов М.С., Ямсков И.А. Наноразмерное состояние эндогенных биорегуляторов определяет их способность проявлять активность в сверхмалых дозах и «мнимых» растворах

// Тезисы V Международного конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург. 29 июня -3 июля. 2009. С.21.

7. Куликова О.Г., Ильина А.П., Маргасюк Д.В., Березин Б.Б., Любченко М.Ю., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Новая группа наноразмерных биорегуляторов обнаружена в тканях растений и грибов И Тезисы V Международного конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург. 29 июня - 3 июля. 2009. С. 1U.

8. Куликова О.Г., Ямскова В.П, Ильина А.П., Маргасюк Д.В., Ямсков И.А. Изучение свойств биорегулятора, выделенного из лука репчатого Allium Сера L. // Сборник научных трудов «Факторы экспериментальной эволюции организмов». - К.: Логос. 2010. Т.9. С. 293302.

9. Краснов М.С., Ямскова В.П., Рыбакова Е.Ю., Куликова О.Г., Маргасюк Д.В., Ямсков И.А.. Активные в сверхмалых дозах биорегуляторы, выделенные из подорожника и алоэ, оказывают протекторное действие на кожу в системах in vitro и in vivo // Сборник научных трудов «Факторы экспериментальной эволюции организмов». К.: Логос. 2010, Т.9. С.285-289.

10. Куликова О.Г. , Ямскова В.П., Ильина А.П., Молявка A.A. , Ямсков И.А. Изучение влияния сверхмалых доз новых растительных биорегуляторов на развитие семян растений И Труды X ежегодной международная молодежная конференция «Биохимическая физика» ИБХФ РАН-ВУЗы. Москва. 8-10 ноября. 2010. С.55-57.

11. Краснов М.С., Ямскова В.П., Куликова О.Г., Ильина А.П., Маргасюк Д.В., Рыбакова Е.Ю., Ямсков И.А.. Изучение новой группы биорегуляторов, выделенных из подорожника большого // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. №2. С. 146-153.

12. Ильина А.П., Куликова О.Г., Мальцев Д.И., Краснов М.С., Рыбаков Е.Ю., Скрипникова B.C., Кузнецова Е.С., Буряк А.К., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Идентификация новых пептидов из межклеточного пространства методом MALDI-TOF масс-спектрометрии // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т.47. №2. С. 135-140.

13. Куликова О.Г., Ямскова В.П., Ильина А.П., Маргасюк Д.В., Молявка A.A., Ямсков И.А. Идентификация в луке репчатом нового биорегулятора, действующего в сверхмалых дозах // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т.47. №4. С. 1-5.

14. Куликова О.Г., Ильина А.П., Краснов М.С., Маргасюк Д.В., Рыбакова Е.Ю., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Исследование новых растительных биорегуляторов // Труды XI ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика». Москва. 9-11 ноября. 2011. С. 122-126.

Подписано в печать: 27.02.12

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 76 Отпечатано в типографии «Реглет» 105005, г. Москва, ул. Бауманская д.ЗЗ (495) 979-96-99; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Куликова, Ольга Геннадьевна, Москва

Посвящается моим дорогим родителям

Куликову Геннадию Евгеньевичу

и

Куликовой Надежде Николаевне

61 12-3/758

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭЛЕМЕНТООРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ им. А.Н. НЕСМЕЯНОВА

на правах рукописи

Куликова Ольга Геннадьевна

Новые адгезивные биорегуляторы растительного

происхождения

03.01.02 биофизика 03.01.06 биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Профессор, доктор химических наук Ямсков И. А. Профессор, доктор биологических наук Ямскова В.П.

Москва 2012

Оглавление

Введение................................................................................................................................................................................................................................................5

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Новая группа биорегуляторов - мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов..............................................................................................9

1.1.1. Методика исследования МГТБ............................................................................................................М

1.1.2. Биорегулятор, выделенный из сыворотки крови

млекопитающих........................................................................................................................................................17

1.1.3. Биорегуляторы, выделенные из различных тканей млекопитающих.. 22

1.2. Характеристика объектов, использованных для выделения ^

биорегуляторов.......................................................................................

1.3. Химический состав объектов исследования..............................................................................................29

1.4. Известные биорегуляторы растительного происхождения..................................................30

1.5. Действие различных препаратов растительного происхождения................................32

1.6. Ткани высших растений............................................................................................................................................................$$

1.6.1. Меристема..................................................................................................................................................................^

1.6.2. Постоянные ткани....................................................................................................................................36

1.7. Строение и биохимические особенности растительной клетки......................................39

Глава 2. Материалы и методы..............................................................................................................................................44

2.1. Получение экстрактов тканей растений........................................................................................................45

45

2.2. Высаливание растительных экстрактов....................................................

2.3. Разделение супернатантов растительных экстрактов методом изоэлектрофокусирования.........................................................................

2.4. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография..............46

2.5. Определение концентрации белка..............................................................

2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле..........................................................................................................46

47

2.7. Аминокислотныи анализ...........................................................................

2.8. Масс-спектрометрическии анализ..............................................................

2.9. Установление С-концевой аминокислотной последовательности.................. 47

2.10. Метод динамического лазерного светорассеяния...................................... 47

2.11. Исследование супернатанта экстракта лука методом ядерного магнитного резонанса......................................................................................... 49

2.12. Определение влияния растворов, содержащих биорегуляторы, на вязкоупругие свойства мембран гепатоцитов мыши при кратковременном органном культивировании in vitro.......................................................... 49

2.13. Роллерное органное культивирование кожи тритона (Pleurodeles waltl) in vitro...................................................................................................... 50

2.14. Изучение ранозаживляющего действия биорегулятора, выделенного из подорожника, на экспериментальной модели кожной раны у мыши in vivo.. 51

2.15. Приготовление гистологических срезов..................................................... 5/

2.16. Получение кроличьей политональной антисыворотки.............. .................. 51

2.17. Иммуноферментный анализ антител (Elisa)............................................. 52

2.18. Иммуногистохимическое окрашивание с использованием FITC-меченых вторичных антител................................................................................ 53

2.19. Изучение специфической активности биорегуляторов............................... 53

2.20. Исследование растительных биорегуляторов на реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).................................... 53

Глава 3. Результаты и их обсуждение........................................................... 55

3.1. Выделение, очистка и изучение физико-химических свойств растительных биорегуляторов......................................................................................... 55

3.2. Исследование локализации биорегуляторов, выделенных из подорожника, чеснока и лука, в листьях и луковицах растений.......................................... 73

3.3. Изучение специфической активности биорегуляторов, выделенных из подорожника и алоэ, на модели роллерного культивирования кожи тритона

in vitro..................................................................................................... 77

3.4. Изучение специфической активности биорегуляторов, выделенных из подорожника и алоэ, на модели кожной раны мыши in vivo.......................... 79

3.5. Изучение специфической активности растительных биорегуляторов на модели проращивания семян...................................................................... 81

3.6. Исследование растительных препаратов на реакцию ГЗТ......................... 83

3.7. Общее обсуждение...........................................................................

ВЫВОДЫ........................................................................................... 91

Список литературы

Введение

Актуальность работы

Растения являются традиционным источником получения различных биологически активных веществ и лекарственных средств, однако к настоящему времени недостаточно изучены и охарактеризованы. Во многих случаях не выявлены вещества, ответственные за проявление фармакологического действия. Поэтому поиск новых биологически активных веществ растительного происхождения остается актуальной проблемой современной науки. В этом аспекте особого внимания заслуживает выявление в растениях мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов (МГТБ), которые были обнаружены ранее в различных тканях позвоночных животных. МГТБ отличаются, прежде всего, способностью влиять на основные биологические процессы: адгезию, дифференцировку, апоптоз, миграцию и пролиферацию клеток, причем биологическая активность характеризуется наличием тканевой, но отсутствием видовой специфичности и проявляется наиболее ярко в сверхмалых дозах (СМД), соответствующих 10"8-10"15 мг белка/мл. Все члены данной группы биорегуляторов проявляют сходные физико-химические свойства. В связи с этим для их выделения и очистки применяется экспериментальный подход, включающий в себя определенную методику их экстракции из тканей и последующую очистку. Изучение МГТБ животного происхождения показало, что они имеют сложный состав, включающий в себя пептиды, белки, ионы Са2+, углеводы и липиды. Было показано, что МГТБ локализованы внеклеточно в соответствующей ткани.

В настоящей работе была предпринята попытка идентификации данной группы биорегуляторов в тканях растений, изучения их биологического действия и некоторых физико-химических свойств.

Целью данной работы являлись идентификация новой группы биорегуляторов в тканях растений, изучение их структуры, физико-химических свойств, мембранотропной и специфической активности, а также их локализации в растительных тканях.

В качестве основных объектов исследования изучали листья подорожника большого (Plantago major L.), укропа пахучего (Anethum graveolens L.), а также луковицы лука репчатого (Allium сера L.) и чеснока (Allium sativum L.). Отдельные исследования были проведены также с биорегуляторами, выделенными из плодов лимона {Citrus limon L.), листьев алоэ древовидного (Aloe arborescens M), кориандра посевного (Coriandrum sativum L.), которые использовали в сравнительном аспекте в экспериментах по изучению биологического действия растительных биорегуляторов.

Новизна работы

Впервые в тканях растений были обнаружены новые биорегуляторы, которые по характеру мембранотропного действия и ряду физико-химических свойств проявляют сходство с МГТБ животного происхождения. Было показано, что биологически активной компонентой биорегулятора, выделенного из лука, являлся пептид с молекулярной массой 4036±2 Да. Установлена 18-членная С-концевая последовательность этого пептида. С помощью соответствующей базы данных Цшрго! показана уникальность данной С-концевой последовательности, поскольку при сравнении с последовательностями известных пептидов гомологов не обнаружено.

Впервые на примере исследования биорегуляторов, выделенных из подорожника и чеснока, установлен тот факт, что биорегуляторы растений локализованы внеклеточно подобно МГТБ животного происхождения.

На примере исследования биорегулятора, выделенного из подорожника, в настоящей работе впервые была установлена корреляции между биологической активностью биорегулятора и лекарственным действием растения - источника его выделения, а именно, биорегулятор, выделенный из подорожника, проявлял в СМД выраженное ранозаживляющее действие.

Впервые показано, что растительные биорегуляторы в СМД оказывают влияние на рост и прорастание семян. Практическая значимость

На основе биорегуляторов, выделенных из подорожника, алоэ, лука, чеснока и лимона могут быть разработаны новые фармакологические препараты или БАДы, которые могут быть использованы для профилактики и коррекции работы иммунной системы, а также обладающие ранозаживляющим действием. Биорегуляторы, выделенные из лука и укропа, также могут быть практически применены в сельском хозяйстве. Структура и объем диссертации

Работа имеет традиционную структуру, она состоит из 3-х основных глав: литературного обзора, в котором рассмотрены строение растительной клетки, ткани высших растений, их ботаническое описание и химический состав, а также основные результаты исследования МГТБ животного происхождения;

экспериментальной части, в которой представлены основные методы исследования растительных биорегуляторов;

результатов и их обсуждения, в которой рассмотрены результаты настоящего исследования и представлена их интерпретация в соответствии с имеющимися литературными данными;

а также из введения, заключения и выводов.

Диссертационная работа содержит 105 страниц, 25 рисунков, 5 таблиц, 183 литературные

ссылки.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из которых 3 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень Высшей аттестационной комиссии, 6 в сборниках научных трудов, 5 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Список сокращений

МГТБ-С-МГТБ -

ВКМ-СМД-ПМ-

мк-пэ-

ИЭФ-

вэжх-кд-

АСМ-ЭДТА -ЭГТА -N-CAM-

ПААГ-ЯМР-ДМСО-РНК-

MALDI-TOF

мембранотропные гомеостатические тканеспецифические биорегуляторы

мембранотропный гомеостатический тканеспецифический биорегулятор, выделенный из сыворотки крови крупного рогатого скота

внеклеточный матрикс сверхмалые дозы плазматическая мембрана межклеточные контакты пигментный эпителий изоэлектрофокусирование

высокоэффективная жидкостная хроматография

круговой дихроизм

атомно-силовая микроскопия

этилендиаминотетрауксусная кислота

этиленгликольтетрауксусная кислота

адгезивный белок, обнаруженный в тканях нейрального происхождения

полиакриламидный гель

ядерно-магнитный резонанс

диметилсульфоксид

рибонуклеиновая кислота

matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight

MMP-

матриксные металлопротеазы

Глава 1. Литературный обзор 1.1. Новая группа биорегуляторов - мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов

Известно, что состояние межклеточных адгезионных взаимодействий является важнейшим фактором, определяющим ход и направленность основных биологических процессов [Turner, 1992; Anderson, 1990]. В настоящее время многие молекулы адгезии идентифицированы, определены гены, кодирующие их биосинтез, изучена их локализация в тканях, показана их основная функция [Ямскова, Резникова, 1991; Ямсков и др., 1999; Краснов и др., 2003а; Margasyuk et al., 2007; Krasnov et al., 2007; Borisenko et al., 2007; Yamskova et al., 2007]. Поиск адгезивных молекул производился методами иммунохимии. Новый экспериментальный подход для изучения адгезивных молекул и механизмов клеточной адгезии, был разработан на основе оригинальных адгезиометрических методов, позволяющих производить оценку мембранотропного действия молекул адгезии, определяя параметр, характеризующий вязкоупругие свойства ткани [Ямскова, Модянова и др., 1977; Ямскова и др., 1977; Ямскова, Резникова, 1991; Ямскова, Туманова и др., 1990]. С помощью данного подхода в различных тканях млекопитающих были обнаружены ранее неизученные адгезивные молекулы [Ямскова и др., 1977; Ямскова, Модянова и др., 1977; Ямскова, 1978], которые, как показали результаты дальнейших исследований, оказывали влияние не только на межклеточные адгезионные взаимодействия, но и на пролиферацию, дифференцировку, миграцию клеток и апоптоз [Краснов и др., 2003а]. Более того, было установлено, что эти молекулы адгезии стимулируют процессы репарации в поврежденных тканях [Гундорова и др., 1997; Margasyuk et al., 2007; Krasnov et al, 2007; Borisenko et al., 2007; Yamskova et al., 2007; Nazarova et al., 2007]. Полученные данные показали, что эти адгезивные молекулы проявляют свойства факторов регуляции в тканях. На основании сходства физико-химических свойств и биологического действия эти биорегуляторы животного происхождения были выделены в отдельную группу, получившую название мембранотропных гомеостатических тканеспецифичных биорегуляторов - МГТБ. Результаты проведенных исследований позволили заключить о единстве молекулярных механизмов, лежащих в основе биологического действия МГТБ, которые функционируют в организме как «тонкие настройщики» органно-тканевого гомеостаза [Ямскова и др., 2009].

В литературном обзоре рассмотрены данные, полученные при исследовании физико-

химических свойств и биологического действия МГТБ. В следующем разделе будут

представлены основные положения экспериментального подхода, разработанного для

9

изучения МГТБ.

1.1.1. Методика исследования МГТБ

МГТБ экстрагировали из тканей млекопитающих водно-солевым раствором при низкой температуре. Полученные тканевые экстракты, содержащие соответствующие МГТБ, фракционировали путем высаливания сернокислым аммонием: при создании насыщенного раствора соли примесные белки переходили в осадок, а МГТБ оставались в надосадочной жидкости - супернатанте. Следует отметить, что данное свойство оставаться в растворенном состоянии в насыщенном растворе соли характерно и для белков S100, которые представляют собой Са+2-связываюшие, слабокислые белки с молекулярной массой 21 - 25 кДа [например, Donato, 1986]. S100 белки были обнаружены в цитоплазме клеток и межклеточном пространстве различных тканей [Moore et al, 1965; Moore, 1982; Fano et al., 1995]. Методом кругового дихроизма (КД) было показано, что вторичная структура характеризуется наличием 40% а-спиралей, 30% ß-спиралей и 30% статистического клубка. Белки S100 денатурируют при нагревании до 90°С [Schafer, Heizmann, 1996]. Физико-химические свойства, проявляемые S100 белками, весьма отличаются от свойств МГТБ. Для МГТБ животного происхождения было показано, что вторичная структура биорегуляторов представлена в основном ß-структурами (60-70%) и статистическим клубком (40-30%).

Следует отметить, что МГТБ тканей заднего отдела глаза (радужка, сетчатка, пигментный эпителий, стекловидное и цилиарное тела) ведут себя иначе: в условиях насыщенного раствора сернокислого аммония МГТБ переходили в осадок [Скрипникова и

др., 2009]. И только после воздействия ЭДТА часть МГТБ преходила в супернатант.

2+

Полученные данные указывают на принципиальную роль ионов Ca в поддержании целостности МГТБ, выделенных из тканей заднего отдела глаза. Аналогичные данные были получены при изучении МГТБ, выделенных из других тканей животных, например, из крови. А именно, было показано, что ионы Са2+ играют принципиальную роль в поддержании структуры сывороточного МГТБ [Ямскова, Рыбакова и др., 2004; Yamskova, Rybakova Vecherkin et al, 2007].

Для дальнейшей очистки МГТБ использовали метод изоэлектрофокусирования (ИЭФ) и обращенно-фазовую высокоэффективную хроматографию (ВЭЖХ). При ИЭФ супернатантов, полученных из экстрактов различных тканей животных, были выделены две фракции МГТБ - фракции основных (pl>8,5) и кислых белков (рКЗ,5), кроме супернатантов, выделенных из сыворотки крови и молока, в которых были обнаружены дополнительно и фракции слабокислых белков (pl 4,5-5,6) [Nazarova et al, 2007; Yamskova, Vecherkin et al., 2007; Ямскова, Рыбакова, 2004].

Обычно при обращено-фазовой хроматографии супернатантов или ИЭФ-фракций, содержащих МГТБ, в градиенте вода-ацетонитрил наблюдали сходную картину разделения: элюирование гидрофильных фракций (низкое содержание ацетонитрила - до 5%) и фракций, элюируемых при более высокой концентрации ацетонитрила - более 30% [Скрипникова и др., 2009]. Методами биотестирования и масс-спектрометрией установле