Мембранотропные тканеспецифические биорегуляторы, выделенные из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих

Рыбакова, Елена Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Мембранотропные тканеспецифические биорегуляторы, выделенные из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Мембранотропные тканеспецифические биорегуляторы, выделенные из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих"

На_правах рукописи

Рыбакова Елена Юрьевна

МЕМБРАНОТРОПНЫЕ ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ БИОРЕГУЛЯТОРЫ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ И КОСТНОЙ ТКАНИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.01.02 биофизика 03.01.06. биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

~ / ВД 2072

Москва 2012

005045314

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН и Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Виктория Петровна Ямскова доктор химических наук, профессор Игорь Александрович Ямсков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Мальцева Елена Львовна

доктор биологических наук, профессор Максимов Георгий Владимирович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится в '/¿¿^ часов

на заседании Диссертационного совета Д002.039.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу:

119334, г. Москва, ул. Косыгина, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической физики им. H.H. Семёнова РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат химических наук Мазалецкая Л.И.

Введение

Актуальность работы. Реализация физиологических и биохимических процессов в различных тканях обусловлена действием множества регуляторных молекул. Регуляция происходит как внутри клетки с участием цитоплазматических белков, так и со стороны межклеточного пространства посредством взаимодействия различных лигандов с рецепторами клеточной поверхности. Изучению биорегуляторов в науке вообще и в биофизике и биотехнологии в частности уделяется большое внимание. Это связано с тем, что, полученные о структуре и механизме действия биорегуляторов, знания являются основой для понимания сущности процессов, происходящих в живых системах. В биотехнологии различные биорегуляторы широко используются, прежде всего, в качестве лекарственных средств.

Настоящее исследование посвящено изучению эндогенных биорегуляторов, которые на основании своеобразия их свойств и активности, выделены в отдельную группу мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов (МГТБ).

В качестве объектов исследования были выбраны МГТБ сыворотки крови и костной ткани млекопитающих. Несмотря на то, что сывороточный биорегулятор ранее был выделен, были изучены некоторые его свойства и на его основе разработаны два фармакологических препарата имеющиеся сведения о его структуре и свойствах, оказались недостаточными. Поэтому в настоящей работе продолжено исследование его свойств и, особенно, его специфической биологической активности. Биорегулятор, выделенный из костной ткани, в настоящей работе изучен впервые.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось исследование биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих.

В отдельные задачи исследования входило:

1. Выделить биорегулятор из костной ткани млекопитающих и изучить некоторые физико-химические свойства биорегулятора, выделенного из костной ткани (вторичная структура, наноразмерное состояние, а также значение мол. массы).

2. Выделить МГТБ из сыворотки крови млекопитающих и исследовать ряд его физико-химических свойств.

3. Изучить условия инактивации сывороточного биорегулятора.

4. Разработать новые экспериментальные модели для изучения специфической активности биорегуляторов, выделенных из костной ткани и сыворотки крови млекопитающих.

Новизна работы. Впервые из костной ткани крыс был выделен МГТБ, который проявляет физико-химические свойства и активность, характерные для всех биорегуляторов данной группы. Впервые показано, что в состав МГТБ сыворотки крови входят биологически активные пептиды и белок, модулирующий их активность, который представляет собой ранее неизученную изоформу преальбумина сыворотки крови. Определены фрагменты первичных структур пептида и белка-модулятора, входящих в состав МГТБ сыворотки крови.

Для исследования специфической биологической активности биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих, были разработаны новые модели роллерного органотипического культивирования кожи и регенерата хвоста тритона Pleurodeles waltl. Впервые показано, что оба биорегулятора оказывают протекторное действие на ткани кожи и хряща, которое выражается в поддержании жизнеспособности клеток и структуры этих тканей.

Практическая значимость. Результаты, полученные при исследовании ранозаживляющего действия биорегулятора, выделенного из сыворотки крови, указывают на перспективность разработки на его основе новых препаратов для применения в травматологии и хирургии, особенно, челюстно-лицевой. Эти препараты следует использовать при травмах, ожогах кожи как высокоэффективные ранозаживляющие средства, которые будут способствовать восстановлению структуры кожи. Кроме того, представляется актуальной разработка препаратов на основе биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани, для применения в ортопедии и травматологии при лечении переломов, заболеваний суставов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на конференции «Эндогенные соединения в морфогенезе и восстановительных процессах -интегрирующие и регуляторные системы: теория и практика» Москва, 1-2 декабря 1999 г.; на XIII зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва. 7-9 февраля 2001 г.; на конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Москва, 8 декабря, 2004 г.; на XIV Школе «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии» Звенигород, 28 февраля - 4 марта 2005 г.; на V Всероссийском научном семинаре и молодежной научной школе «Химия и медицина» Уфа, 5-8 сентября 2005 г.; на конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты», Москва, 17 - 18 ноября 2005 г.; на V ежегодной Международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, 14-16 декабря 2005 г.; на конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова

РАН, Москва, 21 декабря 2005 г.; на IV Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 3-7 июля 2006 г.; на конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Москва, 29 ноября 2006 г.; на симпозиуме с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза», Москва, 9-11 октября 2007; на VII Ежегодной международной молодёжной конференции ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика». Москва, 12 - 14 ноября 2007 г.; на конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Москва, 12-13 декабря, 2007; на IV Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» Москва, 28-29 октября 2008; на XV Школе «Актуальные проблемы биологии развития». Звенигород. 20-24 октября 2008; на V Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 29 июня - 3 июля, 2009.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ, из них 6 статей в журналах, входящих в Перечень ВАК РФ, 3 статьи в книгах и сборнике, 16 тезисов докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах и включает следующие главы:

Введение, в котором рассмотрены актуальность, новизна, практическая значимость работы.

Обзор литературы посвящен описанию и систематизации результатов исследования группы мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов (МГГБ).

Экспериментальная часть посвящена описанию материалов и основных методов, с помощью которых было проведено данное исследование.

Результаты и их обсуждение, глава, в которой представлены результаты, полученные при идентификации МГТБ в сыворотке крови и в костной ткани млекопитающих, а также при исследовании их физико-химических свойств и изучении мембранотропной и специфической активности, проявляемой в сверхмалых дозах (СМД), а также заключение, содержащее анализ полученных данных.

Выводы.

Диссертация содержит 6 таблиц, 38 рисунков, 147 литературных ссылок.

Результаты и их обсуждение Выделение из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих МГТБ и их

очистка

МГТБ выделяли из сыворотки крови крупного рогатого скота (50 л) - стерильный, инактивированный коммерческий препарат, используемый в качестве добавки в ростовую среду клеточных культур, производства ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН».

МГТБ выделяли из бедренных и больших берцовых костей крыс после удаления эпифизов и костного мозга путём экстракции ткани в физиологическом растворе в течение 3-4 часов при +4°С.

Высаливание сыворотки крови и экстракта костной ткани осуществляли в насыщенном растворе сернокислого аммония. Фракции надосадочных жидкостей -супернатанты разделяли изоэлектрофокусированием (ИЭФ) в градиенте рН 3,5 - 10,0 (рис. 1). Все фракции собирали и исследовали методом биотестирования, основу которого составляет оценка мембранотропной активности биорегуляторов данной группы. В сыворотке крови были обнаружены 2 биологически активные фракции, а в экстракте костной ткани - 1. Основные характеристики этих фракций представлены в таблице 1

номера фракимй

Рис.1. Изоэлекгрофокусирование фракции супернатанта экстракта костной ткани крыс \\'151аг. По абсциссе — номер фракций; по ординате 1 - значения рН, соответствующие номерам фракций; по ординате 2 — значения оптической плотности соответствующие номерам фракций.

Далее были изучены некоторые физико-химические свойства, а также биологическое действие данных фракций.

Таблица 1. Характеристики ИЭФ-фракций супернатантов, выделенных из сыворотки крови

КРС и костной ткани крыс

Название фракции Интервал значений рН, в котором собирали фракцию Концентрация белка, мг/мл Степень разведения фракции, при которой обнаружена мембранотропная активность (Ма)

Фракции, выделенные из сыворотки крови

БРС1 до 3,0 0,42±0,07 105;107; 10' - 1013; Ю20

БРС2 4,5-5,1 0,48±0,1 104 -105; Í09; 10n - 1017

Фракция, выделенная из экстракта костной ткани

БРК до 3,0 1,0±0,01 1013; 1015-1017

Изучение состава биорегуляторов и их физико-химических свойств

Исследование состава ИЭФ-фракций биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови, методом ядерного магнитного резонанса показало, что в их состав входят аминокислоты, которые идентифицируются по различным пикам (3.0 - 3.8 м.д.), кроме того, обнаруживаются углеводные составляющие: это пики из области 2.4 - 2.6 м.д., а также липидные: пики - 1.25 и 2.7 м.д. Полученные результаты указывают на сложный состав биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови КРС.

Методом электрофореза в ПААГ было показано, что ИЭФ-фракции биорегуляторов содержат компоненты с высокой электрофоретической подвижностью (Rf 0,92±0,05) (рис.3). Поскольку низкомолекулярные компоненты окрашивались Кумасси, можно заключить, что в состав изучаемых фракций входят пептиды. Действительно, при исследовании данных фракций сывороточного МГТБ ранее было показано, что в их состав входят пептиды с мол. массой 1222,1 Да и 1338,7 Да, соответственно, (методы идентификации - MALDI-TOF и Electrospray масс-спектрометрия) [Ямское и др., 2001; Yamskova, Rybakova at al., 2007]. Более того в этих работах было показано, что именно пептиды ответственны за биологическое действие МГТБ, выделенного из сыворотки крови. Полученные результаты полностью согласуются с результатами исследования состава МГТБ, выделенных из других тканей млекопитающих: за их биологическое действие отвечает, именно, белковая компонента. Следует отметить, что, кроме низкомолекулярного компонента во всех изучаемых фракциях, особенно, в БРС2 присутствовал белок с молекулярной массой около 60000 Да.

94,6і 66,2

94,6кДа 66,2 Ща 45,0 кДа 36,0 кДа 29,0 кДа 24,0 кДа . 20,0кДа

14,2 кДа і 6,5 кДа

йї

Рис.3. Электрофорез в ПААГ ИЭФ-фракций биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани: а), б) 1 - маркерные белки: апротинин из легкого быка - 6,5 кДа ; а-лактальбумин -14,2 кДа; соевый ингибитор трипсина - 20,0 кДа; трипсиноген из поджелудочной железы быка -24,0 кДа; карбоангидраза — 29,0 кДа; глицерапьдегид-3-фосфатгидрогеназа - 36,0 кДа; овальбумин - 45,0 кДа; бычий сывороточный альбумин - 66,2 кДа; фосфорилаза Ь - 94,6 кДа; 2а - БРС2; За -БРС1; 26 - БРК.

Для изучения биологической активности отдельных компонентов, входящих в состав изучаемых фракций биорегуляторов, был проведен электрофорез в ПААГ в отсутствии детергента. Полученные фракции элюировали из геля, исследование их мембранотропной активности показало, что низкомолекулярные фракции являются биологически активными.

Методом кругового дихроизма было показано, что в растворе белковые компоненты фракций обоих биорегуляторов содержат преимущественно Р-структуры, а также участки с неупорядоченным состоянием - статистический клубок, (табл. 2), аналогично тому, как это было обнаружено для фракций МГТБ, выделенных из других тканей.

Таблица 2. Характеристика вторичной структуры пептид-белковых компонентов,

Количество структур, определенных ВС фракции Название структуры

а - спирали р - структуры статистический клубок

антипараллельные параллельные изгибы

БРК 6,3 ± 0,5 40,8 ± 0,5 3,6 ± 0,5 17,2 ±0,5 32,7 ± 0,5

БРС1 8,0 ± 0,5 40,0 ±0,5 2,0 ± 0,5 18,0 ±0,5 33,0 ±0,5

БРС2 10,0 ±0,5 38,0 ±0,5 2,0 ±0,5 17,0 ±0,5 32,0 ± 0,5

Данные литературы указывают на тенденцию молекул белков, вторичная структура которых содержит преимущественно Р-структуры, в водных растворах образовывать межмолекулярные ассоциаты [/?oss, Poirier, 2004; Рамис, 2005; Рамис, 2006].

При исследовании водных растворов фракций БРС1, БРС2 и БРК методом динамического лазерного светорассеяния было установлено, что в их растворах содержатся крупные наноразмерные частицы (табл. 3).

Таблица 3. Кажущиеся величины гидродинамических радиусов (1*1,) частиц, обнаруженных водных в растворах ИЭФ-фракций биорегуляторов._

БРС1 БРС2 БРК

62,05±3,0 нм 55,8±1,3 нм 87,7±4,4 нм

Исследование фракций БРС1, БРС2 и БРК методом обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте ацетонитрил - вода на колонке С8 показано, что БРС1, БРС2 и БРК разделяются на гидрофильную, характеризующуюся временем удерживания 3-5 мин., и гидрофобную с временем удерживания 11-14 мин. фракции. Методом биотестирования было установлено, что обе ВЭЖХ-фракции оказались активными в СМД: для БРС1 со временем удержания 3,3 и 13,40 мин; для БРС2 с временем удержания 3,6 и 11,6 мин, выделенных из сыворотки крови, а также для БРК, с временем удержания 3,85 и 13,95 мин.

Методом MALDI-TOF масс-спектрометрии в супернатантах сыворотки крови и экстракта костной ткани были обнаружены пептиды с молекулярными массами: для супернатанта сыворотки - 1666±2, 1812±3, 1915±2, 2016±2 Да; для супернатанта экстракта костной ткани - 4301 ±2 Да.

Таким образом, суммируя полученные данные при изучении фракций БРС1, БРС2 и БРК, можно заключить, что проявляемые ими физико-химические свойства характерны для аналогично полученных фракций МГТБ, выделенных из других тканей млекопитающих, и изученных ранее.

Белок, модулирующий активность сывороточного биорегулятора (белок-модулятор)

Ранее было показано, что биорегулятор присутствует в сыворотке крови взрослых особей и эмбрионов млекопитающих в различном состоянии: во всём постнатальном периоде он находится в неактивном состоянии, а в первые две трети эмбрионального развития биорегулятор присутствует в сыворотке крови в активном состоянии. Было показано, что инактивация сывороточного биорегулятора в последней трети эмбриогенеза происходит постепенно: в течение этого периода наблюдалось снижение его активности

до полной инактивации к моменту рождения особи [Ямскова, Резникова 1991]. Можно было предположить, что инактивация биорегулятора связана с образованием комплекса с каким-то компонентом сыворотки.

Активность биорегулятора появлялась во фракции супернатанта после высаливания основной массы сывороточных белков. Модулятор был выделен из осадка при дробном высаливании белков: он присутствовал во фракции, соответствующей 70-90%-ного насыщения соли и флотирующей после центрифугирования на 105000 g. Активность белка-модулятора оценивали по исчезновению мембранотропной активности БРС1 и БРС2 после инкубации с соответствующей белковой фракцией осадка.

Для исследования механизма, лежащего в основе процесса инактивации сывороточного биорегулятора, был применён метод аффинной хроматографии. Применение данного метода было связано с тем обстоятельством, что по данным углеводного анализа МГТБ содержал маннозу и 1Ч-ацетил-0-глюкозамип. Поэтому для связывания маннозосодержащей компоненты была применена СопА-сефароза 4В, а для связывания лектиноподобной компоненты - сорбент, содержащий О-маннозу , связанную с сефарозой 4В через дивинилсульфон (шап-сефарозе 4В). На СопА-сефарозе 4В проводили аффинную хроматографию фракций БРС1 или БРС2. На шап-сефарозе 4В хроматографировали фракцию осадка, полученную после центрифугирования при 105000 g. Оба компонента сывороточного биорегулятора после взаимодействия с указанными сорбентами элюировали раствором, содержащим а-метилманнозид и исследовали мембранотропную активность элюатов. В результате проведённого исследования было показано, что компонент биорегулятора, который взаимодействовал с СопА-сефарозой 4В проявлял мембранотропную активность в СМД, а после дегликозилирования трифторметансульфокислотой представлял собой пептид с мол. массой 1338,7 Да [Ямское и др., 2001]. Он получил название регуляторного пептида. Компонент биорегулятора, взаимодействующий с тап-сефарозой 4В, представлял собой белок, который проявлял способность обратимо ингибировать мембранотропную активность гликопептида, элюированного с сорбента СопА-сефароза 4В. Были изучены физико-химические свойства этого белка.

Методами обращённо-фазовой ВЭЖХ в градиенте ацетонитрил-вода и Ж,? -фореза в ПААГ было показано присутствие одного белка, «кажущееся» значение молекулярной массы которого составляло 66000 - 67000 Да (рис. 6), а. методом ИЭФ было определено значение его р1, которое находится в интервале рН 3,90-3,93. Масс-спектрометрией было определено значение мол. массой, которое составило 67854 Да.

Аминокислотный состав белка-модулятора представлен в табл. 4. Использование алгоритма PR.OPSEAR.CH (база данных 8\у1ззРгсЛ) проведён поиск структурно-функциональных гомологов среди известных белков, который показал, что белок-модулятор относится к группе преальбуминов сыворотки крови млекопитающих (табл. 4).

94,6 кДа 66,2 кДа 45 кДа

31 кДа

21,5 кДа 14,4 кДа

Рис. 6. Электрофорез в ПААГ. 1- маркерные белки: а-лактальбумин - 14,4 кДа; соевый ингибитор трипсина - 21,5 кДа; карбангидраза - 31 кДа; овальбумин - 45 кДа; бычий сывороточный альбумин - 66,2 кДа; фосфорилаза Ь - 94,6 кДа. 2— белок-модулятор

Аминокислота Содержание в белке-модуляторе, %

Ала 8.97

Асп+Асн 9.83

Глу+Глн 15.38

Фен 4.70

Гли 3.85

Гис 2.99

Иле 2.56

Лиз 10.26

Лей 10.68

Мет 0.85

Про 5.13

Apr 4.27

Сер 5.56

Тре 5.98

Вал 5.98

Тир 2.99

Таблица 4. Аминокислотный состав сывороточного белка-модулятора

Определение Ы-концевой последовательности путём секвенирования по Эдману показало, что данный белок представляет собой не изученную форму преальбумина сыворотки крови быка [Ямскова, Рыбакова и др., 2004].

Таким образом, установлено, что ИЭФ-фракции биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих имеют сложное строение, в их состав входит пептид (гликопептид для сывороточного биорегулятора) и высокомолекулярный белок, модулирующий активность пептида (белок-модулятор).

Отдельное исследование было посвящено изучению условий образования комплекса между регуляторным пептидом и белком-модулятором. В этом аспекте следует отметить, что сыворотка крови КРС не проявляет мембранотропную активность. После проведения

ИЭФ сыворотки крови мембранотропная активность была обнаружена во фракции, собранной в области рН <3,0.

Известно, что одним кислых белков сыворотки является AGP, или оросомукоид, который представляет собой гликопротеин, углеводная компонента которого содержит N-гликаны [Schmid, 1950; Schmid, 1953; Schmid, 1977; Yoshima et al., 1981]. Следует отметить тот факт, что мол. масса AGP составляет 45000 Да (рис. 7).

Gaipi-4GlcNAcfSl Gaipi-4GlcNAc(?l Gal(31-4GlcNAcpi Gaipi-4GlcNAcpi

Manal

Мапр 1 -4GlcNAcp 1 -4GlcNAc-OH

Рис. 7. Асиалированный N-гликан AGP.

Можно было предположить, что мембранотропная активность фракции кислых белков сыворотки крови связана с присутствием в ней AGP, поскольку давно была показана принципиальная роль остатков маннозы и галактозы в адгезии гепатоцитов млекопитающих [Weigel Р.Н. et al., 1978; Weigel Р.Н. et al., 1979; Weigel, 1980] и который, в принципе, может взаимодействовать с СопА-сефарозой. Однако проведённые исследования показали отсутствие мембранотропной активности AGP, не проявляла активности и его олигосахаридная цепь (рис. 8).

а) "

111 11111111111 II III II II I I I I I I

б)

É i É Í I É 11 É i I É , i

:aiBiiaiiiiBBa

Рис.8. Мембранотропная активность (а) оросомукоида (AGP) и (б) N-гликана, выделенного из оросомукоида. По абциссе - х - показатель степени последовательного 10-тикратного

разведения исходного препарата; по ординате - Ма, % - величина параметра, отражающего мембранотропную

активность. Исходная концентрация оросомукоида- 1,0 мг белка/мл; N-гликана - 3,0 мг/мл.

ИЭФ-фракция сыворотки крови, собранная в интервале рН 4,5-5,1, не проявляла мембранотропной активности; она появлялась в супернатанте данной фракции только после высаливания (табл. 5).

Таблица 5. Исследование мембранотропной активности ИЭФ-фракций, выделенных из сыворотки крови КРС._

Концентрация Степень разведения

белка в фракции, при которой

Название фракции Условия получения фракции исходном препарате, мг/мл обнаружена мем бранотропная активность (Ма)

ИЭФ-фракция До высаливания 1,0 107 - 108; 101и

сыворотки

крови КРС После высаливания 0,5 107-10!2; 10"

(рН<3,0)

Супернатант сыворотки крови (БРС1) 0,4 105; 107; 109 — 1013; Ю20

ИЭФ-фракция До высаливания 1,1 Не обнаружена

сыворотки

крови КРС После высаливания 0,5 102-106

(рН 4,5-5,1)

Супернатант сыворотки крови (БРС2) 0,5 104 -105; 109; 1012 - 1017

В то же время, высаливание белков сернокислым аммонием не оказывало влияния на проявление активности ИЭФ-фракции сыворотки крови КРС (рН<3,0). Здесь следует отметить, что метод оценки мембранотропной активности является скорее качественным, чем количественным. Из-за полимодального характера дозовой зависимости мембранотропной активности биорегуляторов данной группы не представляется возможным введения единицы активности МГТБ. В данном случае метод биотестирования позволяет сделать заключение о присутствии биорегуляторов изучаемой группы в той или иной фракции. Тем не менее, очевидно, изменение степени разведения фракции, при которой обнаруживается её мембранотропное действие, позволяет сделать вывод об увеличении или об уменьшении биологической активности в процессе очистки. Для выяснения влияния условий образования комплекса гликопептида с белком-модулятором его мембранотропную активность, было проведено отдельное исследование.

Его результаты приведены в табл. 6, которые показывают, что важнейшими условиями образования неактивной формы сывороточного биорегулятора являются определённое соотношение пептида и модулятора, а именно последний должен быть в значительном избытке по сравнению с пептидом, а также присутствие ионов кальция; значение температуры не оказывало влияние на образование комплекса. На основании полученных данных можно предположить, что две исследуемые фракции сывороточного биорегулятора различаются по составу: ИЭФ-фракция сыворотки крови КРС (рН<3,0) содержит, в основном, гликопептиды, а ИЭФ-фракция сыворотки крови, собранная в интервале рН 4,5-5,1 - представляет собой частично неразрушенный комплекс «гликопептид - белок-модулятор». Согласно данным биотестирования, обе фракции проявляют сходную мембранотропную активность. Представлял отдельный интерес изучить их специфическую активность.

Таблица 6. Исследование условий образования комплекса «гликопептид - белок-

Условия образования комплекса Дополнительные условия Наличие мембранотропной активности*

гликопептид+белок- модулятор (соотношение 1:1) 10"2М р-р СаС12,20°С, 20 часов есть

гликопептид+белок- модулятор (соотношение 1:10) 10"2М р-р СаСЬ 20°С, 20 часов нет

4°С, 20 часов нет

20°С, 2 часа есть

4°С, 2 часа есть

гликопептид+белок- модулятор (соотношение 1:10) без 10"2М р-р СаС12 20°С, 20 часов есть

* - наличие мембранотропной активности указывает на то, что комплекс не образовался.

Изучение специфической активности МГТБ, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих

При разработке экспериментальных моделей для изучения специфического действия биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих принималось во внимание следующее. Во-первых, действие МГТБ проявляется только при сохранении целостности организации межклеточного пространства тканей и характеризуется отсутствием видовой, но наличием тканевой

специфичности. Во-вторых, биорегуляторы данной группы оказывали протекторное действие на ткани при культивировании in vitro, особенно при роллерном культивировании. Было показано, что в этих условиях (при устранении адгезивного сигнала со стороны подложки) происходит активация клеточных источников регенерации в ткани, а биорегуляторы дополнительно активируют стволовой отдел тканей. В-третьих, активность биорегуляторов характеризуется проявлением в СМД и наличием полимодальной дозовой зависимости.

В качестве объектов исследования были взяты тритоны Pleurodeles wait! -хвостатые амфибии, т.к. многие ткани этих животных обладают высокой способностью к регенерации в течение всего онтогенеза.

Исследование влияния сывороточного биорегулятора на состояние кожи тритона при роллерном культивировании in vitro

В данном исследовании изучали действие ИЭФ-фракций биорегулятора, выделенного из сыворотки крови КРС. Были поставлены следующие опытные серии: серия №1 (контрольная) - без добавления в питательную среду биорегулятора; серия №2 (опытная) - добавляли БРС1, доза - 10"" мг; серия №3 (опытная) - добавляли БРС2, доза - 10"13 мг.

На 7-е сутки культивирования в коже контрольной серии можно наблюдать развитие деструктивных процессов: деградация клеток эпидермиса и кориума, в железах содержится немного слизистого секрета (рис 96).

На этом сроке культивирования в культурах всех опытных серий наблюдалась совершенно иная картина состояния ткани: многослойный эпителий в составе активно секретируемой слизи покрывал поверхность фрагмента кожи. На границе эпителия и кориума отмечалось большое количество пигментированных клеток, число которых увеличивается при неблагоприятных условиях в качестве защитной реакции организма. В кориуме были идентифицированы фибробласты ((здесь и далее указано их количество) -фрагмент нативной кожи тритона - 48,56±12,74; №1 контрольная серия - 40,11±9,85; №2 опытная серия - 79,56±19,83; №3 опытная серия - 71,44±15,29; р<0,05) (рис. 9вг).

К 14-му дню культивирования протекторное действие всех изучаемых фракций биорегулятора, выделенного из сыворотки крови, оказалось ещё более выраженным. На рис. 10а представлен гистологический препарат культуры контрольной серии, на котором отмечается значительная деградация ткани кожи тритона. Покровный эпителий и железы деструктированы, наблюдается тотальная гибель клеток в кориуме. На данном сроке в культурах опытных серий наблюдали сохранение желёз, которые продолжали секретировать слизь, на поверхности кожи виден многослойный эпителий, погруженный в

большое количество слизи. В кориуме процессы клеточной деградации выражены менее, чем в контроле, между кориумом и поверхностью фрагмента кожи пигментированные клетки образовали плотный слой (рис.Юбв). Обе фракции способствовали поддержанию жизнеспособности фибробластов (фрагмент нативной кожи тритона - 48,56±12,74; №1 контрольная серия - 43,44±12,86; №2 опытная серия - 82,89±19,83; №3 опытная серия -71,89±16,74; р<0,05) и кожных желёз. Полученные данные показывают, что фракции сывороточного биорегулятора в СМД проявляют протекторное действие на кожу тритона in vitro.

. j:-т ЯШ/

: f)

В)

Рис.9. Влияние ИЭФ - фракций сывороточного биорегулятора на состояние кожи тритона на 7-е сутки роллерного культивирования in vitro, а) гистологический срез интактной кожи тритона; б) №1 контрольная серия; в) №2 опытная серия; г) №3 опытная серия. Увеличение ок. х10, об. х20.

б)

Рис. 10. Влияние ИЭФ-фракций сывороточного биорегулятора на состояние кожи тритона на 14-е сутки роллерного культивирования in vitro, а) №1 контрольная серия; б) №2 опытная серия; в) №3 опытная серия. Увеличение ок. х 10, об. х20

Исследование влияния МГТБ, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих, на состояние регенерата хвоста тритона при роллерном культивировании in vitro

У взрослых тритонов Pleurodeles walti обоего пола под наркозом ампутировали хвосты на расстоянии 2,0 см от кончика (весеннее-летний период). Через 40 дней после операции у тритонов в образовавшихся регенератах хвостов (рис. 11аб) были обнаружены следующие элементы: хорошо выраженная хрящевая ткань, спинной мозг, мышечные волокна, сосуды, формируются подкожные железы, пигментированные клетки звездчатой формы, расположенные под многослойным эпителием кожи, а также множество недифференцированных мезенхимных клеток. На данном сроке у тритонов хирургически удаляли регенераты хвостов на стадиях IV-V, которые далее культивировали в течение 14 дней при 22°С в питательной среде для амфибий, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, используя роллер (Assistant RM5, Германия) со скоростью вращения 35 об/мин. Смену питательной среды производили каждые 72 часа, при этом во флаконы опытных серий в среду культивирования добавляли ИЭФ-фракции биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих в соответствующих концентрациях, а в контроле - в питательную среду ничего не добавляли. Были поставлены следующие опытные серии:

серия №1 (контрольная) - без добавления в питательную среду биорегуляторов; серия №2 (опытная) - в питательную среду добавляли БРС2, доза - 10"13 мг; серия №3 (опытная) - в питательную среду добавляли БРС1, доза - 10"11 мг; серия №4 (опытная) - в питательную среду добавляли БРК, доза - 10"14 мг.

Рис. 11. Регенерат хвоста тритона на 40-й день после ампутации, а) общий вид; б) гистологический срез. Увеличение ок. хЮ, об. х10.

После культивирования состояние регенератов в контроле существенно отличалось от состояния регенератов хвостов, развившихся у тритонов на 40-й день после ампутации (интактный регенерат) (рис. 116; рис. 12а). Можно отметить выраженные процессы деградации хрящевой ткани: клетки хряща апоптирующие, недифференцированные,

хондроциты отсутствуют. Идёт дифференцировка мышечных волокон. Под эпителием расположено много пигментированных клеток (граница с дермой). В кориуме выявлены малодифференцированные клетки. По сравнению с интактными регенератами, в кориуме культивируемых регенератов (рис. 12в-д) под многослойным эпителием кожи наблюдаются зрелые подкожные железы, наполненные секретом, пигментные клетки образуют плотные скопления, хорошо представлены мышечные волокна. Следует отметить тканеспецифический характер действия биорегулятора, выделенного из костной ткани (рис. 12е), проявляющийся в поддержании целостности хрящевой ткани. Обе фракции сывороточного биорегулятора оказывали влияние на состояние тканей регенерата хвоста в целом, сохраняя гистоструктуру и их жизнеспособность, (рис.12в-д).

Исследование действие разных доз биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих

Исследование было проведено на модели роллерного культивирования 40-дневных регенератов хвостов тритонов Pleurodeles wait! in vitro; условия проведения эксперимента были аналогичны условиям предыдущего опыта. Приготавливали следующие опытные серии:

серия №1 (контрольная) - без добавления в питательную среду биорегуляторов; серия №2 (опытная) - в питательную среду добавляли БРС1, доза - 10"4 мг; серия №3 (опытная) - в питательную среду добавляли БРС1, доза - 10"" мг; серия №4 (опытная) - в питательную среду добавляли БРК, доза - 10"8 мг; серия №5 (опытная) - в питательную среду добавляли БРК, доза - 10"14 мг. Исследование гистологических срезов культур регенератов после 14 дней культивирования показало, что биологическое действие биорегуляторов во всех сериях опытов различалось (рис. 12г-ж).

При воздействии сывороточного биорегулятора в СМД (рис. 12г) наблюдали в целом сохранение структуры хряща, однако, в некоторых его областях имела место частичная деградация данной ткани, выражавшаяся в гибели хондроцитов, сегментация хряща плохо выражена. Как в контрольной серии, элементы нервной трубки плохо выражены, пигментные клетки образуют плотные тяжи под эпителием, а эпителиальный пласт кожи отходит, как при линьке, железы в кориуме не сильно выражены, представлены мышечные волокна и скопления малодифференцированных клеток. При воздействии сывороточного биорегулятора в дозе, соответствующей 10^* мг (рис. 12д) не наблюдали гибели хондроцитов, структура хряща полностью сохранялась, наблюдали сегментацию хряща характерную для данной стадии, элементы спинного мозга и мышечные волокна хорошо выражены, зрелые железы вырабатывают много секрета, в

кориуме много малодифференцированных клеток, пигментные клетки образуют небольшие скопления. Таким образом, биорегулятор, выделенный из сыворотки крови, в высокой концентрации оказал протекторное действие на регенерат хвоста тритонов, выраженное в сохранении хрящевой, мышечной тканей, а также структуры кожи и подкожных желёз. В СМД протекторный эффект этого биорегулятора на ткани регенерата хвостов тритонов сохранялся, но был значительно менее выражен, чем в высокой дозе.

Рис. 12. Влияние ИЭФ-фракций биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани, на состояние регенерата хвоста тритона на 14-е сутки роллерного органного культивирования in vitro: а) интактный регенерат; б) №1 контрольная серия; в) БРС2, доза - 10"13 мг; г) БРС1, доза - 10"" мг; д) БРС1, доза - 10"4 мг; е) БРК, доза - 10"'4 мг; ж) БРК, доза - 10"8 мг. Ув. ок. х10, об. х20.

Биорегулятор, выделенный из костной ткани, в СМД (рис. 12е) проявлял тканеспецифическое протекторное действие: поддерживал жизнеспособность клеток хрящевой ткани, способствовал сохранению её структуры, наблюдали начало сегментации хряща, характерное для данной стадии. Под многослойным эпителием в кориуме видны зрелые железы с секретом, а пигментированные клетки, в отличие от контроля, образуют небольшие скопления, а не протяженные структуры. Хорошо выражены мышечные волокна, присутствуют малодифференцированные клетки.

При действии высокой дозы (рис. 12ж) данного биорегулятора в хрящевой ткани наблюдали развитие процессов деградации: хондроциты практически отсутствовали, на их месте присутствовали скопления клеток с пикнотическими ядрами. В отличие от контроля, хорошо были выражены структура и клетки спинного мозга, а также подкожные железы, наполненные секретом. Пигментные клетки присутствовали в виде скоплений под эпителием. Мышечные волокна хорошо развиты. Таким образом, действие биорегулятора, выделенного из костной ткани, в двух концентрациях различалось: только в СМД он проявлял тканеспецифическое протекторное действие, поддерживая жизнеспособность клеток и структуру хряша. В обеих концентрациях этот биорегулятор оказывал сходный протекторный эффект на другие ткани регенерата, отличный от контроля. Таким образом, в настоящем исследовании было показано, что действие биорегуляторов в СМД и в высоких дозах принципиально различается.

Исследованиеранозаживляющего действия сывороточного биорегулятора

Исследование проводили на модели кожной раны у мышей in vivo. Животные, которым под наркозом стандартно были нанесены раны в область спины, разделяли на 4-е группы: 1-я группа (контрольная) - рану после нанесения ничем не обрабатывали; 2-я группа (контрольная) - рану после нанесения обрабатывали физ. раствором; 3-я группа (опытная) - рану обрабатывали раствором БРС1, доза - Ю"10 мг; 4-я группа (опытная) -рану обрабатывали раствором БРС2, доза - 10"'2 мг.

Раны животных в группах 2-4 обрабатывали растворами ежедневно. Состояние раны оценивали визуально и гистологически на 11-е сутки после травмы.

В 1-ой группе животных (необработанная рана) наблюдали практически полную реэпителизацию, незначительное воспаление (рис. 136). В дерме много мелких капилляров, волокна коллагена расположены плотными тяжами параллельно эпидермису, т.е. наблюдали формирование фиброзного рубца. В подкожной ткани присутствовали жировые клетки, которые имели неправильную форму и разделялись участками соединительной ткани. Наблюдали небольшое количество восстанавливающихся

протоков желез. В подкожной ткани также происходило формирование рубца, волокна коллагена более рыхлые, чем в дерме, но почти отсутствовали жировые клетки.

У мышей 2-ой группы, в центральной части раны наблюдали образование очага хронического воспаления и формирование соединительнотканного рубца в дерме, отмечали отсутствие полной реэпитализации (рис. 13в)

В 3-ей и 4-ой группах наблюдали совершенно иную картину репарации кожи: сильное стягивание краев раны и практически полную ее реэпителизацию, более выраженную, чем у животных обеих контрольных групп (восстанавливались все слои многослойного эпителия). Отмечали отсутствие очагов воспаления. Структура дермы почти восстановлена. В дерме (особенно под раной) и в подкожной ткани отмечено восстановление многочисленных протоков желез и волосяных фолликулов. Жировая ткань сильно развита. В отдельных участках под раной отмечено частичное восстановление мышечных элементов (рис. 13ж-к). Здесь следует отметить, что действие двух фракций сывороточного биорегулятора различаются: в отличие от БРС2 БРС1 стимулировала образование сальных желёз и волосяных фолликулов в области раны (рис. 13жз). Отмечаются также эпителиальные структуры волосяных фолликулов, которые мигрируют к эпидермису и встраиваться в него. При этом эпителиальные клетки пролиферируют, мигрируют, наползают друг на друга, в результате чего поверхность эпидермиса становится «бугристой». Создаётся впечатление, что при действии БРС2 репаративные процессы протекают более упорядоченно: отмечается образование многослойного эпителия на поверхности раны, очевидно, за счет влияния этой фракции на клетки базального слоя, которые мигрируют, пролиферируют и затягивают поверхность раны. В этой серии наблюдается восстановление потовых желёз и формирование волосяных фолликулов, но можно отметить отсутствие образования большого количества сальных желёз. Эти различия в действии двух фракций сывороточного биорегулятора предполагают, что мишенью для них являются разные ниши стволовых клеток кожи. Полученные данные указывают на исключительно высокую эффективность биорегулятора сыворотки крови в заживлении кожных ран у млекопитающих irt vivo. Данный биорегулятор не только стимулировал регенерацию в кожной ране, но и способствовал формированию в области раны морфологически полностью восстановленной ткани.

Рис. 13 Модель экспериментальной кожной раны у мышей in vivo-, а), б) - интактная кожа мыши; в), г) - 1-я группа - рану ничем не обрабатывали; д), е) - 2-я группа-рану обрабатывали физ. раствором; ж), з) - 3-я группа-рану обрабатывали БРС1, доза - 10"'° мг; и), к) - 4-я группа-рану обрабатывали БРС2 доза - 10"12 мг. Ув. ок. * 10, об. х20; ок. х 10, об. *40.

Выводы

1. Из костной ткани млекопитающих впервые был выделен и очищен биорегулятор, в составе которого были обнаружены пептид с мол. массой 4301±2 Да и белок с мол. массой 66000-67000 Да.

2. С помощью КД-спектроскопии показано, что вторичные структуры белковых компонент биорегуляторов, выделенных из костной ткани и сыворотки крови, в растворе сходны и характеризуются преимущественным содержанием (^-структур (57 - 61,6%) и участков статистического клубка (32 - 33%). По данным лазерного динамического светорассеяния, изучаемые МГТБ, присутствуют в растворах в виде наноразмерных частиц (55,8 - 87,7 нм).

3. Показано, что белковая компонента сывороточного биорегулятора, ответственная за проявление им биологической активности, содержит гликопептиды и ранее не изученный белок, гомологичный преальбумину быка, взаимодействие с которым приводит к образованию неактивного комплекса по механизму углевод-белкового узнавания.

4. Впервые разработана новая экспериментальная модель роллерного культивирования кожи тритона in vitro, при использовании которой было изучено биологическое действие двух фракций сывороточного биорегулятора, различающихся по составу. Обе фракции сывороточного биорегулятора способствовали сохранению структуры ткани, а также увеличению жизнеспособности соединительнотканных элементов кожи.

5. На экспериментальной модели кожной раны у мыши in vivo показано, что обе фракции сывороточного биорегулятора стимулировали репаративные процессы в ране, способствовали восстановлению структуры ткани.

6. Впервые разработана новая экспериментальная модель роллерного культивирования регенератов хвостов амфибий in vitro, при использовании которой была изучена специфичность биологического действия двух фракций сывороточного биорегулятора, а также фракции биорегулятора, выделенного из кости крыс.

7. На данной экспериментальной модели было показано, что обе фракции сывороточного биорегулятора в СМД (соответствующей 10""- 10"13 мг белка) способствовали сохранению структуры всех тканей регенерата, а фракция биорегулятора, выделенного из костной ткани, в СМД (соответствующей 10~14 мг белка) оказывала протекторное действие на хрящевую ткань, т.е. проявляла тканеспецифическую активность.

8. Показано, что действие исследуемых биорегуляторов в более высоких дозах (10"4 -10"8 мг белка) принципиально различаются, а именно: сывороточный биорегулятор, оказывал морфогенетическое действие на состояние всех тканей регенерата хвоста тритона; биорегулятор, выделенный из костной ткани, проявлял протекторное свойство в отношении тканей регенерата, но не оказывал влияния на хрящевую ткань.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ямское И.А., Ямскова В.П., Даниленко А.Н., Клеменкова З.С., Антипов Б.Г., Черников Ф.Р., Гусынина М.М., Рыбакова Е.Ю. Экспериментальные доказательства роли физико-химических факторов в механизме биологического действия сверхмалых доз. //Российский химический журнал (ЖРХО им. Д.И. Менделеева), 1999. т.43, №5, с.34-39.

2. Рыбакова Е.Ю., Виноградов A.A., Ямскова В.П., Ямское И.А. Белок-инактиватор сывороточного адгезивного гликопротеина.// Онтогенез. 2000. т.31, №4, с.278-279.

3. Рыбакова Е.Ю., Ямскова В.П., Ямское И.А. Новый адгезивный гликопротеин и его инактиватор, выделенные из сыворотки крови млекопитающих.// Тезисы докладов XIII зимней международной молодежной научной школы « Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 7-9 февраля 2001 г., с. 12.

4. Ямское H.A., Виноградов A.A., Даниленко А.Н., Маслова Л.А., Рыбакова Е.Ю., Ямскова В.П. Низкомолекулярный гликопротеин из сыворотки крови крупного рогатого скота: структура и свойства.// Прикладная биохимия и микробиология. 2001. т.37, №1,с. 36-42.

5. Ямскова В.П., Рыбакова Е.Ю., Виноградов A.A., Вечёркин В.В., Ямское И.А. Исследование белка-инактиватора адгезивного гликопротеина из сыворотки крови млекопитающих.// Прикладная биохимия и микробиология. 2004. т.40, №4, с.407-413.

6. Рыбакова Е.Ю. «О возможном механизме, лежащем в основе метода биотестирования in vitro регуляторных белков, проявляющих биологическую активность в сверхмалых дозах» // Онтогенез. 2005 т.36. № 3. с.234. Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. 8 декабря 2004 г. Москва.

7. Краснов М.С., Качалина A.B., Беляева A.B., Рыбакова Е.Ю., Вечёркин В.В., Ямскова В.П. «Изучение влияния фармакологического препарата Адгелон, основанного на сывороточном регуляторном белке, на заживление кожных ран у мышей in vivo.» II Онтогенез. 2005. т. 36. № 5. С. 378 - 379. Тезисы докладов XIV школы «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии».

8. Рыбакова Е.Ю., Вечёркин В.В. «Исследование адгезивных белков сыворотки крови млекопитающих, биологически активных в сверхмалых дозах» // Онтогенез. 2005. т. 36. № 5. с. 392. Тезисы докладов XIV школы «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии».

9. Вечёркин В.В., Рыбакова Е.Ю. «Изучение физико-химических свойств сывороточных регуляторных белков, проявляющих биологическую активность в сверхмалых дозах» // V Всероссийский научный семинар и Молодежная научная школа Химия и медицина. 5-8 сентября 2005 г. Уфа. Тезисы (сборник тезисов «Новые лекарственные средства. Успехи и перспективы» с. 112-113).

10. Рыбакова Е.Ю. «Изучение регуляторного белка, выделенного из костной ткани млекопитающих» // V Всероссийский научный семинар и Молодежная научная школа Химия и медицина. 5-8 сентября 2005 г. Уфа. Тезисы (сборник тезисов «Новые лекарственные средства. Успехи и перспективы» с. 119-120).

11. Рыбакова Е.Ю., Вечёркин В.В., Ямскова В.П., Ямское И.А. «Регуляторные белки сыворотки крови млекопитающих, биологически активные в сверхмалых дозах» // V Ежегодная международная молодёжная конференция ИБХФ РАН — ВУЗы «Биохимическая физика». 14-16 декабря 2005 г. Москва. Тезисы (сборник тезисов «Труды V Ежегодной международной молодёжной конференции ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика»» с. 88).

12. Рыбакова Е.Ю., Вечёркин В.В. «Регуляторные белки, идентифицированные в сыворотке крови крупного рогатого скота: изучение молекулярной структуры, биологической активности» // Онтогенез. 2006 т.37. № 4. с.317. Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва. 21 декабря 2005 г.

13. Ямскова В.П., Рыбакова Е.Ю., Вечёркин В.В., Пискарёв В.Е., Ямское И.А. «Исследование мембранотропной активности сверхнизких концентраций маннозсодержащих олигосахаридов» // Материалы IV Международного Конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 3-7 июля, 2006 г. с.82.

14. Yamskova V.P., Rybakova E.Yu., Vecherkin V.V., Berezin B.B., Filatova A.G., Blagodatskikh I. V. and Yamskov I.A. "Analysis of regulatory proteins from bovine blood serum that display biological activity at ultra low doses: 1. Isolation, purification and physicochemical properties.", pp. 61-70 // In the book "Biochemical Physics Frontal Research". Ed. by S.D. Varfolomeev, E.B. Burlakova, A.A. Popov and G.E. Zaikov, Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc. 2007.

15. Yamskova V.P., Krasnov M.S., Rybakova E.Yu., Vecherkin V.V., Borisenko A.V., Yamskov I.A. "Analysis of regulatory proteins from bovine blood serum that display biological activity at ultra low doses: 2. Tissue localization and role in wound healing", pp. 71-78 // In the book "Biochemical Physics Frontal Research". Ed. by S.D. Varfolomeev, E.B. Burlakova, A.A. Popov and G.E. Zaikov, Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc. 2007.

16. Рыбакова Е.Ю. Исследование влияния ряда регуляторных белков на репаративные процессы в коже и кости позвоночных in vitro и in vivo. II Онтогенез, 2007, т. 38, №4, с. 317-318. Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. 29 ноября 2006 г. Москва

17. Краснов М.С., Маргасюк Д.В., Борисенко А.В., Рыбакова Е.Ю., Ямскова В.П. Роль факторов адгезии в регуляции поведения клеток при органотипическом культивировании in vitro. // Тезисы симпозиума с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза», Москва, 9-11 октября 2007., с. 95-97.

18. Рыбакова Е.Ю., Краснов М.С., Ямскова В.П., Ямское И.А. Биологически активный в сверхмалых дозах регуляторный белок, выделенный из костной ткани млекопитающих, и его влияние на хрящевую ткань in vitro. И VII Ежегодная международная молодёжная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика». Москва, 12.11. - 14.11.2007. Тезисы (сборник тезисов «Труды VII Ежегодной международной молодёжной конференции ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика»», с. 242-246).

19. Рыбакова Е.Ю., Краснов М.С., Ямскова В.П., Ямское И.А. Действие разных доз биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих, на состояние регенератов хвостов тритонов Pleurodeles waltl in vitro.ll Тезисы IV Международного симпозиума «Механизмы действия сверхмалых доз». Москва. 2008. С. 95-96.

20. Рыбакова Е.Ю., Краснов М.С., Ямскова В.П., Ямское И.А. Изучение влияния регуляторного белка, выделенного из сыворотки крови быка, на состояние регенератов хвостов тритонов PI. waltl при роллерном культивировании in vitro. II Тезисы XV Школы «Актуальные проблемы биологии развития». Звенигород. 2008. С. 86-88.

21. Рыбакова Е.Ю., Краснов М.С., Ямскова В.П., Ямское И.А. Изучение влияния регуляторного белка, выделенного из кости крысы, на состояние регенератов хвостов тритонов PL waltl при роллерном культивировании in vitro.ll Тезисы XV Школы «Актуальные проблемы биологии развития». Звенигород. 2008. С. 88-90.

22. Рыбакова Е.Ю., Краснов М.С., Ямскова В.П., Ямское И.А. Исследование действия разных доз биорегуляторов на состояние регенератов хвостов тритонов Pleurodeles waltl при роллерном культивировании in vitro II Тезисы V Международного конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 29 июня - 3 июля, 2009, с. 118.

23. Ямское И.А., Благодатских ИВ., Краснов М.С., Борисенко A.B., Маргасюк Д.В., Вечёркин В.В., Скрипникоеа B.C., Назарова П.А., Битко С.А., Березин Б.Б., Яминский И.В., Мешков Г.Б., Грачев С.А., Серебрякова М.В., Рыбакова Е.Ю., Ямскова В.П. Физико-химические свойства биологически активных в микродозах регуляторных белков, выделенных из различных тканей млекопитающих // Изв.АН Сер. Хим. 2009. № 3. С. 623628.

24. Рыбакова Е.Ю., Краснов М.С., Ямскова В.П., Маргасюк Д.В., Битко С.А., Ямское И.А. Новый биорегулятор, выделенный из костной ткани крыс: физико-химические свойства, влияние на хрящевую ткань in vitro II Доклады Академии наук. 2009. т. 427. №1. С. 136-138.

25. Ильина А.П., Куликова О.Г., Мальцев Д.И., Краснов М.С., Рыбакова Е.Ю., Скрипникоеа B.C., Кузнецова Е.С., Буряк А.К., Ямскова В.П., Ямское И.А. Идентификация новых пептидов из межклеточного пространства методом MALDI-TOF масс-спектрометрии // Прикладная биохимия и микробиология, 2011, Т. 47, №2, С. 135-140.

Заказ № 91-П/05/2012 Подписано в печать 21.05.2012 Тираж 125 экз. Усл. п.л.1,25

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таП: info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рыбакова, Елена Юрьевна, Москва

61 12-3/1341

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт

биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН

На правах рукописи

Рыбакова Елена Юрьевна

03.01.02 биофизика 03.01.06. биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

Москва 2012

Содержание

Стр.

Список использованных сокращений 5

Введение 7

Глава 1. Литературный обзор 11

Мембранотропные гомеостатические тканеспецифи- ^

ческие биорегуляторы

1.1. Экспериментальный подход, разработанный для исследования МГТБ

1.2. Физико-химические свойства и строение МГТБ 40

Глава 2. Материалы и методы 52

2.1. Выделение и очистка биорегуляторов из сыворотки крови КРС и экстракта костной ткани крысы 52

2.1.1. Высаливание сыворотки крови и экстракта костной ткани

2.1.2. Выделение белка-модулятора из сыворотки крови и его очистка

2.1.3. Изоэлектрофокусирование фракций супернатантов и сывороточного белка-модулятора

2.1.4. Аффинная хроматография сывороточного биорегулятора

2.1.5. Определение концентрации белка 56

2.1.6. Электрофорез белковых фракций в полиакриламидном геле

2.1.7. Обращённо-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

2.1.8. Масс-спектрометрическое изучение биорегуляторов

2.2. Изучение физико-химических свойств биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих

2.2.1. Исследование биорегуляторов с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) 60

2.2.2. Исследование биорегуляторов с помощью метода кругового дихроизма 60

2.2.3. Определение размеров частиц методом динамического лазерного светорассеяния

2.2.4. Определение аминокислотного состава.

2.2.5. Определение фрагментов первичных структур пептида и белка-модулятора, входящих в состав биорегулятора сыворотки крови

60 62

2.2.6. Изучение липидной компоненты биорегулятора, выделенного из сыворотки крови 63

2.2.7. Изучение углеводной компоненты биорегулятора, выделенного из сыворотки крови 63

2.3. Изучение мембранотропной активности белков, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих.

2.3.1. Мембранотропная активность биорегуляторов 64

2.3.2. Биотестирование оросомукоида и его гликозидной

цепи

2.3.3. Изучение механизма инактивации сывороточного биорегулятора. 66

2.4. Изучение специфической биологической активности биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих. 67

2.4.1. Исследование влияния сывороточного биорегулятора на состояние кожи тритона при роллерном культивировании in vitro. 67

2.4.2. Исследование влияния биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих, на состояние регенерата хвоста тритона при роллерном культивировании in vitro 68

2.4.3. Морфометрическая оценка гистологических срезов 69

2.4.4. Исследование влияния сывороточного биорегулятора на ранозаживление кожной раны у мышей in vivo 69

Глава 3. Результаты и их обсуждение 71

3.1. Выделение МГТБ из сыворотки крови и костной ^ ткани млекопитающих и их очистка

3.2. Изучение состава биорегуляторов и структуры их ^ отдельных компонентов

3.3. Белок, модулирующий активность сывороточного биорегулятора (белок-модулятор)

3.4. Изучение специфической активности биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих 115

3.4.1. Исследование влияния сывороточного биорегулятора на состояние кожи тритона при роллерном культивировании in vitro 116

3.4.2. Сравнительное исследование влияния сывороточного биорегулятора и биорегулятора, выделенного из костной ткани млекопитающих, на состояние регенерата 122

хвоста тритона при роллерном культивировании in vitro

3.4.3. Исследование влияния сывороточного биорегулятора на ранозаживление кожной раны у мышей in vivo 132

Выводы 140

Список литературы 142

Список использованных сокращений

АСМ - атомно-силовая микроскопия БР - биорегулятор

БРК - ИЭФ-фракция биорегулятора, выделенного из костной ткани, и собранная в интервале значений рН <3,0

БРС1 - ИЭФ-фракция биорегулятора, выделенного из сыворотки крови, и, собранная в интервале значений рН <3,0

БРС2 - ИЭФ-фракция биорегулятора, выделенного из сыворотки крови, и собранная в интервале значений рН 4,5 - 5,1 БСА (В S А) - бычий сывороточный альбумин ВКМ - внеклеточный матрикс

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИПРФ (IGF) - инсулиноподобный ростовой фактор

ИФМ - интерфоторецепторный матрикс

ИЭФ - изоэлектрофокусирование

КД - круговой дихроизм

КРС - крупный рогатый скот

Ma - мембранотропная активность

МБК - морфогенетические белки кости (вопе morphogenetic proteins (BMP) МГТБ - мембранотропные гомеостатические тканеспецифические биорегуляторы

МК - межклеточные контакты мол. масса - молекулярная масса ПААГ - полиакриламидный гель ПМ - плазматическая мембрана ПЭ - пигментный эпителий РП - регуляторный пептид

СМД - сверхмалые дозы, соответствующие диапазону концентраций

вещества в растворе 10"8-10"15 мг/мл

ТФМС - трифторметансульфокислота

ТФУ - трифторуксусная кислота

ЭДТА - этилендиаминотетрауксусная кислота

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

AGP - оросомукоид

сАМР - циклический аденозинмонофосфат cGMP - циклический гуанозинмонофосфат

ConA-сеф. 4В - конканавалин А, иммобилизованный на сефарозе 4В FGF - фактор роста фибробластов

HEPES - Ы-2-гидроксиэтилпиперазин-КГ'2-этансульфокислота man-сеф. 4В - манноза, иммобилизованная на сефарозе 4В NO - монооксид азота ОР - остеопонтин

TGF{3 - трансформирующий фактор роста

Введение

В качестве объектов исследования были выбраны МГТБ сыворотки крови и костной ткани млекопитающих. Несмотря на то, что сывороточный биорегулятор ранее был выделен, были изучены его свойства и на его основе разработаны два фармакологических препарата, однако, имеющиеся сведения о его структуре и свойствах не дают полного представления о механизме его биологического действия. Поэтому в настоящей работе продолжено исследование его свойств и, особенно, его специфической биологической активности. Биорегулятор, выделенный из костной ткани, в настоящей работе изучен впервые.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих.

В отдельные задачи исследования входило:

1. Выделить биорегулятор из костной ткани млекопитающих и исследовать его физико-химические свойства.

2. Выделить биорегулятор из сыворотки крови млекопитающих и исследовать его физико-химические свойства.

3. Изучить условия инактивации сывороточного биорегулятора.

4. Разработать новые экспериментальные модели для изучения действия биорегуляторов, выделенных из костной ткани и сыворотки крови млекопитающих.

Для исследования активности биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих, были разработаны новые модели роллерного органотипического культивирования кожи и регенерата хвоста тритона Р1еигос1е1е8 м?аШ. Впервые показано, что оба биорегулятора оказывают протекторное действие на ткани кожи и хряща, которое выражается в поддержании жизнеспособности клеток и структуры этих тканей. Впервые было изучено биологическое действие обоих биорегуляторов в высоких дозах и показано, что оно принципиально отличается от действия этих биорегуляторов в сверхмалых дозах (СМД).

челюстно-лицевой. Эти препараты следует использовать при травмах, ожогах кожи как высокоэффективные ранозаживляющие средства, которые будут способствовать восстановлению структуры кожи. Кроме того, представляется актуальной разработка препаратов на основе биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани, для применения в ортопедии и травматологии при лечении переломов, заболеваний суставов. Новые модели роллерного органотипического культивирования кожи и регенерата хвоста тритона Pleurodeles waltl, разработанные для исследования специфической биологической активности биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих, могут быть использованы для биотестирования других тканеспецифических биологически активных веществ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах и включает следующие главы:

Введение, в котором рассмотрены актуальность, новизна, практическая значимость работы.

Литературный обзор содержит описание и систематизацию результатов исследования группы мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов (МГТБ).

Материалы и методы включает в себя описание материалов и основных методов, с помощью которых было проведено данное исследование.

Результаты и их обсуждение, глава, в которой представлены данные, полученные при выделении МГТБ из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих, их очистке, а также при исследовании их физико-химических свойств и изучении биологической активности на новых экспериментальных моделях роллерного органотипического культивирования тканей кожи и регенератов хвоста амфибий in vitro, и заключение, содержащее анализ полученных результатов.

Выводы.

Диссертация содержит 6 таблиц, 38 рисунков, 147 литературных ссылок.

Глава 1. Литературный обзор Кровь и костная ткань являются разновидностями соединительной ткани, которые отличаются друг от друга составом и соотношением клеток, волокон и физико-химическими свойствами межклеточного вещества [.Афанасьев и др., 1999]. Соединительные ткани развиваются из мезенхимы. Их гистогенез продолжается в течение всего онтогенеза особи. В эмбриональный период мезенхима приобретает черты тканевого строения раньше закладки других тканей; для этого периода характерны высокие темпы размножения клеток и волокнообразования. Гистогенез постэмбрионального периода направлен на поддержание тканевого гомеостаза, пролиферацию малодифференцированных клеток и замену ими отмирающих клеток. Эти процессы протекают под влиянием межклеточных внутритканевых взаимодействий, различных регуляторных факторов таких как, интегрины, адгезивные молекулы, гормоны, цитокины, наличие малодифференцированных клеток и др. Например, у человека на долю соединительных тканей в организме приходится более 50% массы тела. Они участвуют в формировании стромы органов, прослоек между другими тканями, дермы кожи, скелета. Полифукциональность соединительных тканей определяется сложностью их состава и организации. Для соединительной ткани характерно значительное количественное преобладание межклеточного вещества над клеточными элементами. Межклеточное вещество является, по существу, информационной системой, которая испытывает регулирующее воздействие со стороны клеток соединительной ткани, в свою очередь, оказывает такое же воздействие на них и на клеточные системы других тканей и органов [Поликар, Колле, 1966; Серое, Шехтер, 1981; Афанасьев и др., 1999]. Подобное взаимодействие основано, вероятно, на обратной связи, оно поддерживает гомеостаз в организме, регулирующий осуществление функций соединительной ткани и приспособительные изменения, возникающие при старении и патологических

процессах. Межклеточное вещество, несмотря на специфическую роль каждого из своих компонентов, при осуществлении основных функций выступает как единое целое, причём играет значительную, а иногда и ведущую роль.

Кровь - жидкая соединительная ткань, осуществляющая в организме транспорт веществ (в том числе кислорода), который обеспечивает протекание биохимических процессов в клетках и межклеточных пространствах различных тканей. Кроме того, кровь выполняет защитную, регуляторную, терморегуляторную, экскреторную и гомеостатическую. [Марри и др., 1993]. Кровь представляет собой коллоидно-полимерный раствор плазмы и взвешенных в ней форменных элементов: эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. Сыворотка крови представляет собой внеклеточный матрикс (ВКМ) этой ткани, а ее белки - являются компонентами ВКМ. Основными белками сыворотки крови являются альбумины и глобулины, фибриноген, а также фибронектин - один из основных компонентов ВКМ различных тканей. Белки сыворотки крови, выполняют важные функции, а именно: они способствуют поддержанию коллоидно-осмотического, водного, кислотно-основного, а также иммунного гомеостазов в организме; они участвуют в процессах свертывания крови; связываясь с различными веществами (липидами, аминокислотами, углеводами и др.), они обеспечивают строительным материалом клетки всего организма, а также участвуют в выводе из него метаболитов; они выполняют - основную функцию крови - перенос различных веществ, в том числе тех, с помощью которых организм защищается от воздействий окружающей среды или регулирует функции отдельных органов. К таким регуляторам гомеостаза в организме относятся многочисленные сигнальные молекулы. Сигнальные молекулы, секретируемые в организме, циркулируют и переносятся кровью. Это очень большая группа веществ, которая включает в себя гормоны, нейромедиаторы, цитокины [Марри и др., 1993; Ашмарин, Стукалов и др., 1996; Хаеинсон и др., 2003; Nicola, 1994]. В организме эти

вещества опосредуют межклеточные взаимодействия. Они осуществляют контроль над основными биологическими процессами, происходящими в различных тканях, со стороны трех важнейших систем организма: нервной, иммунной и эндокринной. В качестве примера таких молекул можно рассмотреть ряд аспектов биологического действия пептидов семейства инсулиноподобных ростовых факторов \Dulak, Тетт, 1973; РауеИс, Маф'еую, Кпегеук, 2007]. На примере последних можно рассмотреть состав и строение системы этих ростовых факторов. В её состав входят во-первых, пептидные гормоны - инсулиноподобные ростовые факторы типа 1 - ИПРФ-1 и типа 2 - ИПРФ-2, а также связывающие эти гормоны белки - ИПРФ-СБ 16; во-вторых, рецепторы клеточной поверхности - инсулиновый рецептор ИР (Ж) и рецепторы инсулиноподобных ростовых факторов типа 1 - ИПРФ-Р1 и типа 2 - ИПРФ-Р2.

ИПРФ являются митогенами, т.е. изменяют статус клеточной пролиферации, дифференцировки и влияют на апоптоз. Действие ИПРФ опосредовано через их рецепторы, которые запускают сигнальные каскады, регулирующие эти биологические процессы. Оба ИПРФ-фактора были выделены в 1970-е годы \Dulak, Тетт, 1973; ШпйегкпесЫ , НитЪе1, 1978]. Они представляют собой небольшие пептиды, состоящие из 70 (ИПРФ-1) и 67 (ИПРФ-2) аминокислотных остатка, и имеющие мол. массу около 7,5 кДа, они на 70% идентичны и на 50% схожи с проинсулином. ИПРФ-1 присутствуют в крови в высокой концентрации. Основным источником ИПРФ-1 в сыворотки крови является печень, но многие другие ткани синтезируют его и чувствительны к действию ИПРФ-1, особенно, в пос�

Информация о работе

Рыбакова, Елена Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.02

Диссертация

Мембранотропные тканеспецифические биорегуляторы, выделенные из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы