Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование регуляторных белков, действующих в сверхмалых дозах, выделенных из сыворотки крови млекопитающих

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Исследование регуляторных белков, действующих в сверхмалых дозах, выделенных из сыворотки крови млекопитающих"

На правах рукописи

Вечеркин Владислав Владиславович

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ БЕЛКОВ, ДЕЙСТВУЮЩИХ В СВЕРХМАЛЫХ ДОЗАХ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03 00 23 биотехнология 03 00 04 биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

иил7000Б

Москва 2008 г

003170005

Работа выполнена в Институте элементорганических соединений им А Н Несмеянова РАН и в Институте биологии развития им Н К Кольцова РАН

Научные руководители

доктор химических наук, проф Игорь Александрович Ямсков доктор биологических наук, проф Виктория Петровна Ямскова

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, проф Синицин Аркадий Пантелеймонович доктор химических наук, проф Варламов Валерий Петрович

Ведущая организация

Институт Биохимии им А H Баха РАН

Защита диссертации состоится " 2008г в /6 часов на заседании

Диссертационного совета Д 501 001 59 при МГУ им M В Ломоносова по адресу Москва, ГСП-1, Ленинские горы

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им

М В Ломоносова

Автореферат разослан »(/тщемгт?

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат химических наук И К Сакодынская

Введение

Актуальность работы Поиск, ¡пучение свойств и возможности использования новых биологически акшвных веществ является агауалы юй проблема"! соврема шых биотехнологии и 61 юхимии. В этом аспекте особый интерес вызывают шмпонапы сыворотки 1фОви, которая одержит широкий агеетр различных веществ, проявляющих разнообразные типы биологической акшвности. Среди таковых следует ошетшъ группу новых эндогенных биораулягоров (РБ), характеризующихся проявлением 61 алогического дейсгвш в сверхматых дозах (СМД), соответствующих 1СГ10—1СГ15 мг балка'мл. Данные биорегуляторы оказывают влияние на важнейшие биологические процессы.

Биологачески акпшные в шсрхмалых дозах РБ данной группы были обнаружены в различных тканях млекопитающих. РБ стимулируют миграцию и адгезию клеток, атияюг на клеточную пролиферацию и диффсренинровку, а также апогтгоз. РБ данной группы представляют собой низкомолекулярные, устойчивые к воздействию различных филю-химических факторов белки, вторичная стругаура которых характеризуется значшельным содержа! пем [клруюур В водных растрах молекулы РБ проявляют тенденцию в образованию наноразмерных ассоциагоа В тканях РБ присутствуют в вцце неояльких отличающихся по заряду фракщш - наиболее представлены фракции кислых и фракции основных белков

Наиболее изученным представителем данной группы биорегуляторов является слабокислый биорегулятор, выделенный из сыворотки крупного рогатого скота. Было показано, что в состав данного биорегулятора входит шшомоле^лярный, высоюэгаикшилировашый белок (остатки манназы и № ацетилппюкозамина) со значеншм р1 в области рН 4,5-5,1 В аминокислопюм сосгаае РБ превалируют остатки д нкарбоновых аминокислот, оергша и глицина В СМД РБ ашоротки крови оказывал влияние на пролиферацию и миграцию фиброблаетов т п1го, проявлял мембранспропное действие в оп кхш ми клеток млекопитающих. Было установлено, что данный РБ сыворсгши крови в госпитальном периоде находится в крови в неаганвном состоянии, в отличие от эмбр!юналыюго периода (первые две трети эмбриогенеза), когда он присутствует в крови в активном состояло!. На основании данного РБ были разработаны новые фармакологические препараты, которые в настоящее время применяются в пршаике медицины: «Адгелон-глазные капли» вофтальмотпп!;<<Адгело11^аствордля инъекций» -оргопедниитравматолопш.

Однако присугсгауквдю в сыворотке 1фови в существенно больших количествах кислые и основные РБ данной группы до настоящей работы не изучались

Цепь и задачи исследования. Цслно данной работы явились выделение и очистка кислых и основных регуляторных белков, акгавных в сверхмалых доаах, из сыворотки 1фовн млекопитающих, изученш их физико-химических свойств и биологической акшвности. Особое внимание в этой работе было уделаю сравнительному исследованию свойств РБ, обнаруженных в сыворотке 1фови млекопитающих. Для этого пред полагалось решить следующие задачи.

1 Исшедоетъашоротаукрошкрушогоро^^ и основных РБ

2 Изучить физико-химические свойства РБ сыворотки крови млекопитающих, провести исследование состава и слруюуры данных белков, исследовать состояние РБ в водных растворах.

3 Идетифзщировт ингибитор сывороточного РБ и изучшь его свойства.

4 ИумтткагевуюдокалгваниюРБатороткикровивпечештм^

5 Исследовать специфическую биологическую активность РБ сыворотки крови в СМД Научная новшна работы. В результате проведенной работы впервые в шворслке крови млекопитающих были идентифицированы и получены в высокоочищенном состоянии новые ранее не изученные кислые и основные РБ, которые проявляли биологическую акшвносгь в СМД Впервые были изучены физико-химические свойства данных белков и показано, что они представляют собой низкомсиекулярные белки, вторичная структура которых представлена, в основном, (кярумурами и неупорядоченными элементами, описываемыми в терминах статистического клубка. Было установлено, что враепюрдадо№1е(ишиобразукл,ганоразмерньге'и КХН20им По физико-химическим свойствам данные балки проявляют сходство с ранее выделенным РБ сыворотки КРС со значением р1 в области рН 4,5-5,1 Впервые было показано, что сывороточный белок, обратимо ингибирующий биологическую акшвносгь РБ сыворотки, представляет собой белок, в выоокой степени гомологичный сывороточному альбумину, и представляет собой его иэоформу Впервые было показано, что в основе обратимой инактивации РБ сыворотки крови лежит взаимодействие с балком-инакшвагором, которое осуществляется по механизму белок-углеводного узнавания Впервые была усгановлеш межклеточная локализация РЬ швороши крови со значением р1 в области р! 143-5,1 в печени назвоненных животные. Впервые на шмх Экспериментальных моделях органного роплерпого кулымзирования кожи амфибии было 1 |родемо1 котировало в СМД ирогекгсрное сгоГклвоизучамых РБ сьпюрогки крови млекопитающих, а ullcлcpшю!aíИDУMкxцecдeйclвиelЫ^ю^впlжxJq>I^^cнщшIЮIiкcшюйpcWhIy мышат т\ъю Практическая значимость. Регулягорные белки сыворсгжи крови в СМД оказывали протекторное действие на ткань кожи амфибий п Шо, а слабокислый регушпорный белок (СРБ) в СМД стимулировал репаративные процессы в ткани кожи и способствовал восстановлению ее гистрострукгуры при экспериме! папьной травме у мышей т шо Можно тлагшь (учтывая отсутствие видовой специфичности у РБ данной группы), что идентифицированные в данной работе кислые и основные РБ сыворотки крови могут бьпь использованы в качестве субстанций для разработки новых фармакологических гцзепаратов, аналогично применяемому в насттшке время эффективному лекарственному средству Адпглон, созданному на основе слабокислого регулягорного белка, а СРБ навдег новое важное прима кние Апробация результатов исследовашш Мат1фиаш диссертации доложены на V Всероссийском научном семинаре и молодежной научной школе «Химия и медицина» Уфа, 5-8 сешября 2005, на XIV школе «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии» Москва, 15 ноября, 2005, наV

ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика» Москва, 14-16 декабря 2005 Структура и объем диссертации.

Диссертати гшожеш на 161 страницах и вкточагг следующие главы введение, где рассмотрены акгуалы гость, новизна, пракпгческая значимость работы, литературный обюр, в котором описай структура тфови, белки ахсияшие в ее оосгав, а также рассмотрены белки, участвующие в процессах регуляции, экспергшипальная часть, в которой описаны материалы и основные метода, с помощио которых было осуществлено исследование, результаты и их обсутмепие - глава, в которой представлены результаты, полученные при исследовании регулягорных бгтюв, выделенных m сыворотки тфови, а также их обсуждение, заключение и выводы Диссертация оодержтгг 6 таблиц, 46 ртсунков, 188 литературных ссылок.

Публикации. По теме дцссерпшщ опубликовано 9 печатных работ, из юэторых 3 являются оригинальными статьями.

Результаты и их обсуждение

1. Выделение и очистка регуляторных белков, выделенных из сыворотки крови КРС

Регуляторные белки (РБ), бтюшчеоад активные в СМД были обнаружил в различных тканях позвоночных животных. В этих работах было установлено, что РБ в тканевых экстрактах присутствуют в виде нескольких фракилй-кислых иосновных бгпгов

Ранее в сывсрогке крови позвоиэчных животных была цдапифиттирована только одна фракция, содержащая РБ, зпаченте гооэлекгрической точки которого наход ится в области рН 4р-5,1, поэтому в данной работе была предпринята попьпка идентификации фракций кислых и оснош шк РБ в сыворотке крови КРС Для этого сыворотку тфови фратшионировали по схеме, ранее разработанной для выделения и очисжи РБ гоучгемой группы (рис 1)

После разделения супернагата сыворотки крови методом шоэлеюрофо^сировшия (ИЭФ) собирали и далее исследовали следующие три фракции, количественные характеристики которых представлены в тайл 1

1 Фракция, собранная в области значений рН менее 3,0ч<ислые регуляторные белки (КРБ),

2 Фракция, собранная в интервале 31 тачений рН 4,5-5,1-слабокт гслые регуляторные белки (СРБ),

3 Фракщтя, собранная в интервале значений рН 8,5-10,0-оа ювные регуляторные белки (ОРБ)

Таблица 1 Характеристики ИЭФ-фракцийРБ,вьщэтенныхтсьторо1т

Наработанная фракция Концентрация белка в растворе (мкг/мл) Общее содержание белка (мг)

КРБ 200 12

СРБ 150 8

ОРБ 150 5

"'данные приведены, исходя из расчета выделения фракций РБ из 20 литров сыворотки крови КРС

Д анные три фракции далее были изучены методом биспесшрования доя идентификаций РЦ биологически активных в СМД

Аналогично из сыворотки крови лошад и были выд елены три фракции с идентичными значениями июэлектричесиэй точки, как и для РБ сыворотки КРС это кислый РБ сыворотки лошади (КРБЛ), слабокислый РБ сыворотки лсшвдт (СРЕД) и ост ювной РБ сыворотки лошади (ОРБЛ). Д анные три фракции были также изучены методом бисгестирования.

2. Исследование мембранотропного действия регуляториых белков

Метод биогесшрования основан на способности РБ данной группы оказывать влияние на вязко упругие свойства и проницаемость плазматической мембраны ютепж млекопитающих (гепагопигов) Однако механизм мембрат кпропной активт юсш РБ остается до сих пор не изученным

Изучение механизма, лежащего в основе метода биотестирования регуляторных белков

Был изучен ряд различающихся по структуре маннозосодержаших олигосахаридов с помощью метод а бюгестирования Была осуществлена попьпка выявигь углеводную компонешу, структура которой наиболее близка к строению олигоманпазигцых пеней РБ дамой группы На рисЗ в качестве примера проявления биологической активности и ее огсуплвия приведены доэовые зависимости акгивносш для моносахарида СНз-аМап (проявление биолоптческой акшвносш) и моносахарида СНз-сОи (отсутствие биологической активности)

В таблице 2 представлены сводные результаты данного исследования. Биологически активными в СМД являются СНгСсМлт. СНт-аСа!, авШАс. но не СНкхИа и СИз-аРис. Из маннозосодержаших олигосахарвдов биологическую активность в СМД проявляли те^ терминальные остатки которых были представлены дисахаридом Мапа1-2Мап и дисахаридом Са1Р14С>ШАс. Мембраштротш активность л их всщсс! в v^paкrepl т ста б! шо ш 1ы юи даювои авии тостью, которая сход и с даювон зависимостью мембраг ютрогп юй акп им юсш исслел) емых РБ (рис 3)

Пспученные данные указьмш на присутствие на поверхности ИМ клегак печени сайтов, сисиифпчески узплоших шипело- и гамктоюсодержащие олигосахарилы. которые содсржа1 терминальные ослики угазанных выше дисахгридов. Кроме того ли сайты оказались чувствительны к

остаткам маннозы, галактозы, Nчшíлилглюкoг.^aминa, итгорыс являются терминальными остатками олигоманнсвилных и цепей смешанного типа

гЬ А

гЬ

гЬ

Ж

тЬ-

-йт

гЬ

гЬ

-гЬ-

5 6 7

9 10

15 16

1*Г

А

Ж

Л

гЬ"-^

А

А

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Рис. 3. Исследование с помощью метода биотестирования мембранотропной активности моносахаридов: А- СН3-аМап и Б - СНгсЮ1и (таблица 3.2.1, структуры №2 и 3). Темный столбик -контроль; светлые столбики - опыт (влияние изучаемого моносахарида). По ординате - МА, мембранотропная активность; по абциссе - X, показатель степени десятикратного последовательного разбавления исходного раствора моносахарида [10х] (исходная концентрация моносахарида равна 1 мг/мл).

*) Отмечены степени разбавления растворов моносахарида, для которых параметр МА статистически достоверно отличается от контроля (р < 0,05).

№ п/п Структура вещества MA"

1 CHj-aGal есть

2 С Н з— a M an есть

3 СНз-aGlc нет

4 С H з— a F и с нет

5 M ana 1 — 2M an есть

6 Manal — ЗМап нет

7 Manal — 6Мап нет

8 Manal — 4M an нет

9 aGalNAc нет

10 aGlcNAc есть

11 Manal ,Manal Manal ® M a n p 1 — 4GlcNAcßl — 4GloNAc-0H Manal нет

12 Manal. , Manal Manal ? M a n ß 1 — 4 G IcN Acß 1 — 4GlcNAc-OH Manal —2 M anal нет

13 Manal —2M ana 1 M ana 1^ Manal 5 M a n ß 1 — 4GlcNAcßl— 4GICNAC-OH / Manal —¡Manal—2Manal есть

14 Manal —2Manal ___3 Manal ^ Manal 2 M a n a 1 ^ ®Manßl — 4GlcNAcßl— 4GlcNAc-OH Manal —2Manal —2Manal ^ есть

15 G a Iß 1 —4 G le N A cß 1 — 2 M a n a 1 ^ 2 M a n ß 1 - 4GlcNAcßl — 4GICNAC — ОН G a Iß 1 —4 G IcN A cß 1 — 2Manol^ есть

16 G а 1—N А с Manal G а 1-N А с ^ ^ M а n ß 1 - 4 G le N А с ß 1 — 4GICNAC— ОН Gal-NAC . ^^ K Manal G а 1 —N А с нет

17 N А N Aa2 —6 G а Iß 1 —4GlcNAcßl —2Manal^g 3 Manßl— 4GlcNAcßl — 4GlcNAc — OH N A N Aa2 —6Galßl —4GlcNAcßl —2Manal^ нет

* все олигосахариды были выделены из различных гл и копротенов и любезно предоставлены для исследования сотрудником ИНЭОС им А Н. Несмеянова РАН Пискаревым В.Е ** МА - мембранотропная активность

Результаты ж>го исследования согласуются с ранее полученными данными, которые показали, что остатки маннозы, галактозы и Ы-ацегилглюкозамина играют принципиальную роль в адгезии геиагогц ггов т уИт.

Исследование мембранотропной активности регуляторных белков,

выделенных из сыворотки крови млекопитающих

С помошью метода биогесгирования было показано, все три фракции РБ, выделенных как из сыворсггки фови КРС так и из сыворотки крови лошади, проявляют мембранотропную активность в СМ Д т.е. содержат изучаемые РБ. На рис. 4. в качестве примера представлены результаты исследования фракций КРБ, выделенных из сыворотки крови КРС. Аналогичные диаграммы полимодальной дозовой зависимости, отражающие мембранотропное действие РБ, были получены и при изучении фракции РБ, выделенных из сыворслки лошади.

Таким образом, в сыворотках крови млекопитающих были идентифицированы две новых фракции РБ, проявляющих биологическую активность в СМД Далее эти фракции кислых и основных РБ были изучены физико-химическими методами совместно с фракцией РБ, р1 которого лежит в интервале рН 4,5 -

I

¡1

"4

А

гЬ

Рис. 4. Исследование мембранотропной активности РБ, выделенного из крови КРС, со значением р] в области рН меньше 3,5 (КРБ) (метод биотестирования). Темный столбик - контроль; светлВе столбики - опыт (влияние изучаемого РБ). По ординате - величина мембранотропного эффекта (МА); по абциссе -показатель степени десятикратного последовательного разбавления исходного раствора олигосахарида [ 10х] (исходная концентрация РБ равна 0,1 мг/мл).

*) Отмечены степени разбавления растворов РБ, для которых параметр МА статистически достоверно отличается от контроля (р < 0,05).

3. Исследование физико-химических свойств регуляторных белков

Изучение регуляторных белков с помощью метода электрофореза в ПААГ

Доя исследования состава фракций РБ, выделенных из сыворотки крови млекопитающих (КРС и лошадь), а также определения значений "кажущейся" молекулярной массы РБ, был проведён электрофорез в ПААГ в присутствии додеиилсульфата натрия (ЦЦСН). Из рис. 5 видно, что основным компонентом каждой изучаемой фракции является низкомолекулярный белок со значением "кажущейся" молекулярной массы менее 14 кДа.

Для получения препаратов биологически активных РБ провод или электрофорез фракций, полученных после !освдектрофокусирования, без добавления ДДСН. Следует также сгшетшь, что в этих условиях картина разделения фракций РБ не изменялась. Было установлено, что биологическую активность проявляла низкомсиекулярная фракция. Полученный результат предполагая; что изучагмые РБ яатяются низкомолекулярными балками.

Помимо метода электрофореза в ПААГ для СРБ был использован метод диализа через полупроницаемые мембраны. После диализа разбавленного раствора СРБ (Ю-6 мг белка/мл) через полупроницаемую мембрану, пропускающую вещества с молекулярным весом до 15 кДа, мембранотропная активность (параметр МА) была обнаружена как во внешнем, так и во внугреннем объемах. Биологическая активность была выявлена при разбавлении фракции внешнего и внутреннего объемов, соответственно, в Кг- Ю7 раз (значения

параметра МА в данном эксперименте составили 133-144% относительно юшроля). При использовании пленки, пропускающей вещества со значением моле^лярной массы до 8 кДа, биологическая актвность была обнаружена только ю фракции внутреннего объема Эти данные согласуются с результатами, полученными при исследовании значения молекулярной массы РБ методом электрофореза в ПААГ. Выяснение точного значения молекулярной массы возможно только после определения первичной структуры РБ.

.4 шшяшяшшш *

43 кД »»»и. <3 «а

30 ¡сД

( 30 *qa 21 кДа

21 кД 1АкДа

14 к Да ■ЭДШйй»

крБ ОРБ тп СРБЛ ОР5л

Рис 5. Исследование трех фракций СРБ, КРБ, ОРБ, выделенных из сыворотки крови КРС (а), а также трех фракций СРБЛ, КРБЛ, ОРБЛ, выделенных из сыворотки крови лошади (б), методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДДСН условиях. Слева представлены маркерные белки.

Изучение вторичной структуры регуляторных белков с помощью метода кругового

дихроизма

Для исследования вторичной структуры РБ сыворотки был применен метод кругового дихроизма (КД). Белки изучали в дальней ультрафиолетовой области (от 185 до 285 нм). Полученные данные, представленные в таблице 3, свидетельствуют о преимущественном содержании [клруктур, а также участков с неупорядоченным состоянием пептидных цепочек РБ в водных растворах, т.е. вторичная

структура таких участков молекул РБ описывается в терминах статистического клубка. Следует отмять, что полученные КД тиары были обработаны с помощью программы КМ и ЯМЧ, в основе которых лежит адащивная магемагичгская мсдепь расчет спектральных данных цюизвсдажя на основе базы данных, полученных для других белков с помощью решгеноструктурного анализа

Таблица 3. Характеристика вторичной структуры молекул, исследуемых регуляторных белков

сыворотки крови

Элементы вторшной структуры Процентное содержание элементов в молекулах РБ

СРБ СРБЛ КРБ КРБЛ ОРБ ОРБЛ

осгцзали 10,0 ±0,5% 8,5 ±0,5% 8,0 ±0,5% 9,7±05% 9,0 ±0,5% 85 ±05%

Аншпарапельные (кжладки 38,0 ±0,5% 443 ±0,5% 40,0 ±0,5% 45,6 ±05% 40,0 ±0,5% 45,7±05%

Парапельные |кхлад41 2,0±Д5% 3,640,5% Я0 ±0,5% 3,7±05% 2,0 ±0,5% 3,7 ±0,5%

¡Ьлзнбы 18,0 ±0,5% 17,710,5% 17,0 ±05% 17,4 ±0,5% 18,0 ±0,5% 17,4 ±0,5%

Стэпу1аистжеск1м клубок 32,0 ИЗ,5% 30,6ИЭ,5% 33,0 ±05% 29^±0,5% 31,0 ±05% 31,1±05%

С помощью метода КД было изучено влияние различных физико-химических факторов на состояние вторичной струиуры РБ в водных растворах. Было показано, что биологическая активность РБ не изменялась после воздействия температуры (например, СРБ сохранял биологическое действие после нагревания его раствора до 100 "С в течение 20-30 минут). РБ данной группы полностью сохраняли биологическую активность после многократных процедур «имсраживание-опаивание», при действии органических растворителей, мочевины. В качестве примера на рисунке 7 предгааанзны значения эллишичносш, отражающей состояние вторичной структуры РБ, выделенных сыворопси крови КРС, при воздействии ЭДГА.

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии изменений ю вторичной структуре РБ три повышении температуры раствора до 100 "С и воздействии хаеггропных агентов по сравнению с исходными растворами РБ. Анашгачные результаты были получены три исследовании РБ, выделенных из сыворотки крови лошади.

Обраиит на себя внимание таг факт, что после обработай ЭДГА наблюдается небольшое изменение зипипичности растворов РБ, причем с увеличением концентрации ЭДГА значение эллишичносш имело тенденцию к большим изменениям. Эш данные указывают на участие ионовСа+2в организации вторичной струиуры РБ В пользу этого предположития свидетельствуют ранее полученные данные при изучении РБ данной группы, выделенных из датах тканей, которые показали, что в оосгав молекулы РБ вход ят ионы Са+2

Рис. 7. КД - спектры РБ сыворотки крови КРС при воздействии ЭДТА. По ординате - б, значение эллиптичности при 222 нм (млдегри); по абсциссе -X, значения показателя десятичной степени

молярной концентрации ЭДТА, 10х (моль/л).

Изучение растворов регуляторных белков с помощью метода атомно-силовой

микроскопии

Полученные регулягорные белки были исследованы с помощью метода агомно-сшговой ммфоскопии (АСМ). На рис. 8 в качестве гримера представлена картина распределения частиц на подложке раствора КРБ.

240С,-

Ц , '

> 1

<у .

Í) ' Г

.-Л' ... : 1 .

Рис 8. Атомно-силовая микроскопия раствора КРБ.

О 1000 2000 ЗОЯ) «О 5000 лт

.Данные, представленные на рисунке 8 показывают, что в водных растворах РБ, выделенных из сыворотки крови, присутствуют в ввде наноразмерных частиц. В результате рассчега с помощью программы FemloScan Online размер частиц варьирует в области: 100Ь20нм для растворов фракции КРБ (концентрация белка 100 мг/мл); 100±20нм для растворов фракции СРБ (концентрация белка 100 мг/мл); бШОнм для растворов фракции ОРБ (концентрация белка 100 мг/мл). Таким образом, методом АСМ было показано образование в водных растворах сывороточных РБ крупных наночасгиц, размер которых находится в пределах от60 до 120нм.

Полученные нами результаты показывают, что в водных растворах РБ, выделенных из сыворотки крови КРС, образуются достаточно крупные частицы. Мы полагаем, что в состав этих частиц входят изучаемые РБ, поскольку полученные ранее данные с привлечением других методов исследования, также указывали на ярко выраженную тенденцию молекул РБ данной группы образовывать межмсшекулярные ассоциаты.

Исследование регуляторных белков, выделенных из сыворотки крови млекопитающих, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии

С целью более детального определения состава фракции РБ сыворотки крови КРС и лошади были исследованы с помощью метода обращенофазовой ВЭЖХ. Нужно спметшь, что ранее были предриюты попыти разделения СРБ тугими хромаотрафическими методами, однако, четкой купины разделения удалось достичь только при применении осраща п ю-фазовой хроматографии в градиенте ацегоншрилл -веда. Все эти данные педжрядаот предположение, выдвинутое в предыдущих разделах, о сложном составе изучаемых фракций РБ сыворотки крови. В качестве примера на рисунке 12 представлена каргина разделения фракции КРБ, выпаленной из сывсрспки крови КРС

гидрофильную - это область удержания со временем выхода от 3 до 4 минут, и гидрофобную - это обюсть удержания со временем выхода от 11 до 14 минут соответственно С помощью метода биотсстирования было установлено, что в препарате КРБ биологически акшвными в СМД были две фракпии, характеризующиеся временем удержания 3,301 и 13,396 мин. В препарате СРБ биологически акшвными в СМД были фракции с времием удержания 3,620 и 11,637 мин. В препарате ОРБ - 3,260 и 13,310 мин удержания. Полученные данные показывают, что РБ сыворотки крови КРС способны проявлял, как гидрофильные, так и гидрофобные свойства, т.е. являются амфифильными веществами. Аналогичные результаты были получены при разделении методом обрашено-фазовой ВЭЖХ фракций РБ, выделенных из сыворотки крови лошади.

Исследование состава фракций регуляторных белков с помощью ядерного магнитного резонанса.

Три РБ, выделенных ш сыворотки крови КРС, были изучены с помощью метода ядерного магнитол) резонанса (рта: 13, в качестве гримера приведен спектр СРБ) Основываясь на литературных данных, позволяющихчастично расшифровал, оосгав иоспегчуемых фракций РБ, можно заключть, что в их состадвхогщ'какупквсдныеахяавляющие это пики изобласш24-26мд,такилигащзые-пики-125и 27 мд Кроме того, следует отмстить сходную каршну (область 24-26 мд с пиками, отвечающими за присутствие углеводов) для всех трех спектров изучаемых РБ И хота оценка состава по спаарам ЯМР носит достаточно приближенный характер, однако такое сходство (особгнно для КРБ и ОРБ) в целом указывает на гомологию углеводных составляющих. Помимо этого, в состав изучаемых РБ входят аминокислоты, которые идентифицируются по различным пикам (30-38 мд.) Полученные результаты указывают на сложный состав РБ, вьвделенных из сыворотки крови КРС

Рис 13 ЯМР-спектр фракций регуляторных белков сыворотки крови А - СРБ, Б - КРБ, В - ОРБ По ординате-е, значение интенсивности (отн ед), по абсциссе - рут, химический сдвиг (в мил дол)

Изучение липидной компоненты фракции среднекислого регуляторного белка

Фракция СРБ была подвергнута длительной обработке серным эфиром. Исследование состава эфирной вытяжки методом масс-спегаромстрпи показало гркутствж в ней таких жирных кислот как даановая, линопевая, хспевая, дезоксихолевая и пальмитиновая (рис.14)

' ú* ' »A* " МЛ ам ам """ U*' ' ' ' ■> ■ ' ' " ■■■ ' 'IT1Z

Рис 14 Изучение липидной фракции методом MALDI TOF масс-спектрометрии По ординате - ь, значение интенсивность (отн ед), по абсциссе - m/z, отношение массы иона к его заряду

ДанньЕ жирные кислоты являются постоянными компонентами сыворотки крови млекспшаюших, однако не выясненным остается вопрос какстарсшьэтихжирш>1хкиелегтвформировании устойчивых наночастиц, которые обнаруживаются в раствсрах РБ сыворспки крови.

Исследование фракции кислыхрегуляторных белков сыворотки методом масс-спектрометрии Electrospray

Данные, представленные в более ранних исследованиях первичной структуры СРБ, проведенных методом MALDI TOF масс-спеюромегрии после дегликсвилирования белка, указывают на низкое значение полученнао молекулярного иона (1338,7Да) При использовании мегодаМА1Х)1 TOF масс-спектрометрии вещество наносится на матрицу В этих условиях птишзилировашые белковые молекулы счал, сильно взаимодействуют с матрицей, что затрудняет применение этого метода для изучения структур тликопреггеинов. В связи с злим было осуществлено химическое депшкшилирование (с помощью трифтормегансульфокислспы), поскольку офабогка белка различными специфическими ферментами не привела к отделению птиксоцдной компоненты. Но в результате такого способа детликозилирования вазможш частичная деградация пепщдной цепи с образованием ее фрагментов, чем и может обьясняегь образование ншкомспекулярного иона. В свет с эптм в настоящем исследовании был использован метод Electrospray масс-спектрометрии, позволяющ ий изучать вещества в растворах.

Результаты проведенного исследования КРБ указывают на наличие низкомолЕкулярного иона (1222 Дэ, рис 15), те. на то, что в состав изучаемого РБ входят нтлкомолекулярные пептидные фрагмешы. Следует отмять, что для определения молекулярной массы вещества необходимо учшывать значение зарда иона, которое дгог белков всяда больше единицы, т е. знажние молекулярной массы КРБ мажет бьпь больше полученного значения. Тем не менее, можно предположить, что молекулярная маоса исследушого РБ не превышает 8 кДа (данные, полученные методом диализа через полупроницаемые мембраны)

Рис. 15. Исследование раствора фракции КРБ методом Electrospray масс-спектрометрии. По ординате -е, значение интенсивность (отн.ед); по абсциссе - m/z, отношение массы иона к его заряду.

VWwsivwMWM.

""' m/z'

4. Изучение локализации в тканях позвоночных животных, а также специфической биологической активности регуляторных белков сыворотки крови

Исследование локализации слабокислого регуляторного белка в печеии тритона

Pleurodeles wähl

Изучение распределения РБ сыворотки крови в тканях позвоночных животных проводили, исследуя СРВ. Локализацию СРБ сыворотки крови изучали на ткани печени тритона Pleurodeles waltl, поскольку, во-первых, болышнство сывороточных белков продуцируются печенью, а во-вторых, известно, что в печени амфибий, помимо синтеза белков сыворотки крови, вдет и кроветворение в постнаильном периоде. В качестве антигена для получения поликпональной антисыворслки был использован белок, полученный после тетарофорегического разделения фракции СРБ в ПААГ. С помощью методов иммуногисгохимии было показано, что СРБ сыворотки крови локализован в межклеточном пространстве гепагоцигов печени тритона, а также на поверхности кроветворных клеток (рис. 16). Полученные данные предполагают, что данный СРБ сыворотки крови может синтезироваться клетками печени, а также может

Рис. 16. Локализация СРБ сыворотки крови в межклеточном пространстве печени тритона (конфакальная флуоресцентная микроскопия) А - в межгепацитарном пространстве; Б - на поверхности клеток кроветворения.

участвовать в процессах кроветворения.

Исследование влияния слабокислого регуляторного белка сыворотки крови на состояние

ткани кожи тритона Pleurodeles waltl при органном культивировании in vitro

В данном разделе исследования изучали протекторное действия трех РБ: КРБ, СРБ и ОРБ сыворотки крови на состояние кожи позвоночных в условиях культивирования in vitro и процессы раназаживления кожи у млекопитающих. Учитывая отсутствие вишвой специфичности биологического действия изучаемых РБ, работа была проведена на рсвшерных органных культурах кожи тритона in vitro, а также на модели кожной раны in vivo. Результаты гистологического исследования органных культур кожи после 14-ти дней культивирования показали значительный протекторный эффект изучаемых регулягорных белков сыворотки крови.

Рис. 17. Органные культуры кожи тритона после 7 дней роллерного культивирования А - интакгная печень тритона; А- контроль; Б - влияние КРБ в концентрации 10'" мг бежа/мл.

На рис. 17а представлен гистологический препарат культуры контрольной серии. Можно огмешть развитие дегенеративных процессов в ткани кожи тритона, покровный эпителий и железы деструктированы, наблюдается тотальная гибель клекж в кориуме.

На данном сроке в культурах опьпной серии (при воздействии РБ сыворотки крови) наблюдали сохранение желёз, которые продолжали секрегировать слизь, на поверхности кожи виден многослойный эпителий, погруженный в большое количество слизи. В кориуме процессы клеточной деградации выражены менее, чаи в контроле, между кориумом и поверхностью фрагмента кожи пигмекшрованные клетки образовали плотный слой (рис. 17в).

Полученные данные указывают на протекторное действие, которое проявляют РБ сыворспки крови в СМД на кожу тритона in vitro. Следует отметить, что значительное увеличение секреции слизи и обновление покровного эпителия, а также увеличение количества пигменшрованных клеток, имеет место во время линьки амфибий или при помещении их в неблагоприятные условия.

Полученные данные нашли подтверждение в результатах, полученных при исследовании специфической биологической активносш СРБ сыворотки ¡фови на модели ранозаживления кожи мыши т

В этом исследовании изучали биологическое действие фракции СРБ, которую дополнительно очишзли с помощью электрофореза в ПААГ. Полученный препфах слабокислого регулягорного белка сыворотки крови шучали в дозе, соответствующей Ю'13 мгбелка'мл

В 1-ой контрольной группе животных (необработанная рана) на сроке 11 дня} после нанесения раны наблюдали практически полную реэпителизацию, незначительное воспаление (рис. 18.а).

Формирование волосяных фолликулов

Протоки желез

Подкожная жировая ткань

Рис. 18. Влияние СРБ после очистки методом электрофореза на ранозаживление кожи мыши (11 сутки после нанесения раны). А -контроль№1, необработанная рана; Б - контроль №2, влияние физ. р-ра; В - влияние СРБ.

В дерме mi юго мелю к капилляров, вспою ы кешапа а располагаются плегп 1ымп тонами параллели ю эпидермису, то есть происходит формирование фиброзного руйта. В подкожной ткали присутствовали жировые клелкп, которые имели неправильную форму и разделялись участками соедишпслыюй ткани Найлюдали небольшое количество восстанавливающихся протоков желез. В подкожной ткани также происходило формирование рубиа, волокна коллагена белее рыхлые, чем в дерме, но почш отсутствовали жировые клетки (рис. 18д)

У мышей 2-ой шпролшой группы, после ежедневной обработки раны физ. р-ром на 11-ые сутки в центральной части раны найлюдали образование очага хронического воспаления и формтдование соедишпетнолкашюго рубиа в дерме; ошечаш отсутствие па^ 186) Очевидно,

что выявление признаков знач|цельного воспалатня у живспиых этой группы, по сравштию с животными первой группы, связало с примет киием водного раствора, представляющим собой бпагоприяптую среду для развшия патогенной микрофлоры.

В 3-ей опьптюй группе иайшодали совершенно ин>то карппту репарации кожи сильное стягивание краев раны и пракшчески полную ее реэпшелизаиию, более выраженную, чем у животных обеих кипральных фупп (восстанавливались все слои шогослойного эптпелия) Отмечали отсутствие очагов воспаления. Структура дермы почти восстатюштена В дерме (особенно под раной) и в подкожной ткани спмечено восси ювла ме многочт icnei шых протоков желез и волосяных фолликулов Жтровая ткаг ь а тыто развита. В отдельных учалгах под раной отмечено частичгюе восстаиоалеште мышечных элементов (рис. 18б)

Полученные данные указывают на исключительно высокую эффективность СРБ в заживлении кожных ран у млекопитающих m víto Дат п ый РБ не только стимулировал perei кропию в кожной ране, тю и способствовал формированию в области травмы морфологически полностью восстановлен юй ткани.

Таким образом, в проведенной экспериментальной серии было показано, что СРБ локализован в межклеточном грхлранстве ткали печени тршиа На основании этих данных высказано предположите о том, что синтез данного РБ сыворотки кропи происходит в печени Изучаемые РБ сыворотки тфови в СМД обладшг протекторным действием в отношении ткани кожи тритона, ^льтивированной m vtíro СРБ участвует в процессах ранозажиаления в коже у млекопитающих m vrm, стимулируя восстановительные и репаративные процзхы. И, наконец, полученные данные указывают на отсутствие видовой специфичности биологического действия у д анных РБ

5. Исследование белка, шгакпширующего мембраногропиое действие слабокислого регуляторного белка сыворотки крови

Для исследования физимэ-химических свойств бжа-инагаиватора с помошыо методов ВЭЖХ, кругового дихроизма (КД), ДЦСН-алектрофореза в ПААГ, а также для проведения аминокислотного анализа использовали фракцию бзша-ипактивагора, полученную после аффинной хроматографию.

Значение молекулярного веса, определенное с помошуо метода ДЦС->1аалекгрофореза, составляло сжало 70кДэ (рис 19) Для этого препарата бэтка4тнак1ивагора с помощью метода шоолекгрофокусирования было установлено значение изоэлектрической точки в интервале рН от 3,9 до 4,0

Молекула БСА облапает сформировавшейся вторичной структурой, которая характеризуется выооким содержанием а-спиралей (около 70%) Выоокое содержание а-спиралей было выявлено и в структуре молекулы ннакшвагора СРБ в результате изучения спектров кругового д ихроизма (рис 20). На это указывает наличие характерных минимумов КД-спеюров три длинах волн, соответственно, 208 и 222 им.

Эиктрофорет,

94,6 кДа •

66,2 кДа *—

45 кДа »._<

31 кДа ~~

21,5 кД1

14,4 кДа —

Инакшвягор

Маркеры

Рис 19 Физико-химические свойства белка-инактиватора (СДС-

электрофорез и обращеннофазовая ВЭЖХ)

Рис 20 КД - спектр белка-инактиватора По ординате - Э, значение эллиптичности при 222 нм (млдегри), по абсциссе - длинна волны (нм)

Длинна волны

На данном этапе работы в результате исследования при помоши метода МАШ1-ТОР масс-спекгрометрии было установлено, что белок-инакптватор сптюсшся к семейству альбуминов, проявляя выоот^ю гомологию с БСА (рис. 21).

е

Рис 21 Исследование белка-инактиватора

методом MALDI-TOF масс-спектрометрии По ординате - е, значение интенсивности

д|. I'

i

•m/z

(отн ед), по абсциссе -m/z, отношение массы иона к его заряду

Очевидца, белок-инактсшагор представляет собой одну из изофорч еуиерсема"клва сывороточных альбуминов, которая, помэжно, образуется в результате альтсрнапшного сплайсинга и имеет, кроме того, высокое сродсто к определенной фракции ловцов сыворотки крови. Данное сродство к лит тем также характерно 11 для изучаемых РБ, что обу словш 1ваег образован! ю у сгоГга шых межмалекулярных ассощ шов Как показано на рис 22 КД-спеюр белка-инактиватора после взаимодействия с СРБ претерпевал' изменения экстремум в области 188 нм становшея более выраженным Полученные данные указывают на изменеиш во вторичной струмуре молекулы балкнпиюиватора после взаимодействия с СРБ Нанбатее вероятен что эти изменения касаются (^-структур, а не склругаур молекулы этого белка, поскольку данная область спектра (188-190 нм) отвечает за состоят к [клруюур в молекуле белка

Как показано на рис 22, взаимодействш БСА с СРБ не оказало влияния на вид КД-спеюра БСА -оба спектра пракпнески не отличаются друг от друга. Можно предположить, что в данном случае, информация молеку лы БСА не изма млась.

Таким образом, полученные данные показывают, что белок-инакшвагор проявляет высокую гомологию с БСА и очевидно, является одним из иэоформ этого балка БСА не оказывает влияния на биолопгческуто акшвность СРБ, КД спектр этого белка оставался без изменений после взаимодействия с

Полученные данные нашли подтверждение в исследовании, проведенном методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ЦСК) Было проведаю изучение ряда параметров, характеризующих состояние трепиной структуры белка-инаюивагора до и после взаимодействия с СРБ

СРБ

Рис 22 КД - спектры белка-инакгиватора, БСА до (а) и после (б) их взаимодействия с СРВ По ординате - 9, значение эллиптичности при 222 нм (млдегри), по абсциссе - длинна волны (нм)

Заключение

В результате проведенного исследования удаюсь идентифицировать в сыворотках крови млекопитающих две фракций РБ - кислых и основных белков, изучить ряд их физико-химических свойств. Важнейшим свойством РБ данной группы, в том числе, выделенных из сыворотки крови млекопитающих, является проявление ими биологической активности в СМД. В настоящем исследовании показано, что в СМД сывороточные РБ проявляют мембраногрогаюе действие, а РБ, значение изоэлектрической точки лежит в интервале р! 145-5,1, проявляет выраженное ранозаживлягацее свойство С помощью методов иммуногисгохимиии была показаш внеклеточная локализация данного РБ сыворотки крови в печени млекопитающих.

Механизм, лежащий в основе биологического действия РБ данной группы, до сих пор остается малоизученным, так же как и для других веществ, проявляющих биологическую активность в СМД В настоящем исследовании был идентифицирован блок, инакшвцэуюший биологическую акшвность РБ со значением изоэлекгрической точки в интервале pH 4,5-5,1 В этом аспекте следует отмелищ что сыворспка крови не проявляет мембраногропной активности три исследовании адгезнометрическим методом, грима шемым для идентификации РБ данной группы

Белок-инакгиватор проявляет высокую гомологию с БСА и, очевидно^ является членом мультисемейства сывороточных альбуминоа При взаимодействии с РБ происходит изменение вторичной и третичной структур белка-инактивалора Полученные результаты предполагают, что в основе образования комплекса меядау этими белками лежит углевод-белковое взаимодействие Возможно, что данный бэток-инакшвагор также взаимодействует с другими сывороточными РБ и регулирует их биологически) активность аналогичным образом. Кроме того, данные этого исследования указывают на определенную малоизученцую роль членов семейства альбуминов, которая заключается в регуляции биологической активности веществ эндогенного происхождения в организме

Выводы.

1 В сыворотках крови крупного рогатого скота и лошади, идентифицированы новые регуляторные белки кислый, основной, действующие в сверхмалых дозах (соответствующих 108 - 10 15 мг/мл), свойства которых сходны со свойствами других регуляторных белков, выделенных из различных тканей млекопитающих

2 Показано, что регуляторные белки сыворотки крови представляют собой низкомолекулярные белки, их вторичная структура характеризуется преимущественным содержанием p-структур и элементов, описываемых в терминах статистического клубка Установлено, что регуляторные белки присутствуют в водных растворах в виде наноразмерных частиц

3 Показано, что в сыворотке крови млекопитающих присутствует белок, обратимо инактивирующий биологическую активность регуляторного белка, значение pl которого находится в интервале рН 4,5-5,1 Белок-инактиватор характеризуется высокой гомологией с альбумином сыворотки крови крупного рогатого скота, но отличается от него аминокислотной последовательностью N-концевого домена и значением изоэлектрической точки (3,9-4,0)

4 Методом кругового дихроизма показана высокая устойчивость изученных регуляторных белков к действию повышенных температур (до 100°С), хаотропных агентов (гуанидинхлорида) Изменение эллиптичности при действии ЭДТА указывают на влияние ионов Са2+ на процесс организации вторичной структуры регуляторных белков

5 Методом кругового дихроизма показано, что при инактивации РБ в присутствии белка-инактиватора и ионов Са2+ происходит изменение конформации молекулы белка-инактиватора

6 Методами иммуногистохимии и конфокальной микроскопии изучена локализация в ткани печени регуляторного белка сыворотки крови, значение pl которого находится в интервале рН 4,5-5,1 Установлено, что данный регуляторный белок расположен в межклеточном пространстве паренхимы печени позвоночных животных

7 Установлено, что регуляторные белки сыворотки крови млекопитающих проявляли в сверхмалых дозах выраженную биологическую активность протекторное действие на ткань кожи амфибий при роллерном органном культивировании, регуляторный белок, значение pl которого находится в интервале рН 4,5-5,1, стимулировал репаративные процессы в коже, способствовал восстановлению ее гистоструктуры при экспериментальной травме у мышей in vivo

Список работ, опубликованных поток диссертации.

1 Ямскова ВП, Рыбакова ЕЮ, Виноградов АА, Вечеркин ВВ, Ямское И А Исследование белка-инактиватора адгезивного гликопротеина из сыворотки крови млекопитающих // Прикладная биохимия и микробиология 2004 т 40, №4, с 407-413

2 М С Краснов, А В Качалина, А В Беляева, Е Ю Рыбакова, В В Вечеркин, В П Ямскова «Изучение влияния фармакологического препарата Адгелон, основанного на сывороточном регуляторном белке, на заживление кожных ран у мышей in vivo » // Онтогенез 2005 т 36 № 5 С 378 - 379 Тезисы докладов XIV школы «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии»

3 ЕЮ Рыбакова, В В Вечеркин «Исследование адгезивных белков сыворотки крови млекопитающих, биологически активных в свсрхмалых дозах» // Онтогенез 2005 т 36 № 5 с 392 Тезисы докладов XIV школы «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии»

4 В В Вечеркин, Е Ю Рыбакова «Изучение физико-химических свойств сывороточных регуляторных белков, проявляющих биологическую активность в сверхмалых дозах » // V Всероссийский научный семинар и Молодежная научная школа Химия и медицина 5-8 сентября 2005 г Уфа Тезисы (сборник тезисов «Новые лекарственные средства Успехи и преспективы» с 112-113)

5 ЕЮ Рыбакова, В В Вечеркин, ВП Ямскова, И А Ямское «Регуляторные белки сыворотки крови млекопитающих, биологически активные в сверхмалых дозах » // V Ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика» 14-16 декабря 2005 г Москва Тезисы (сборник тезисов «Труды V Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН -ВУЗы «Биохимическая физика»» с 88)

6 ЕЮ Рыбакова, В В Вечеркин «Регуляторные белки, идентифицированные в сыворотке крови крупного рогатого скота изучение молекулярной структуры, биологической активности » // Онтогенез 2006 т 37 № 4 с 317 Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им Н К Кольцова РАН 21 декабря 2005 г Москва

7 ВП Ямскова, ЕЮ Рыбакова, В В Вечеркин, BE Пискарев, НА Ямское «Исследование мембранотропной активности сверхнизких концентраций маннозсодержащих олигосахаридов »//Материалы IV Международного Конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 3-7 июля, 2006г

8 VP Yamskova, Е Yu Rybakova, V V Vecherkm, В В Berezin, A G Filatova, I V Blagodatskikh and IA Yamskov "Analysis of regulatory proteins from bovine blood serum that display biological activity at ultra low doses 1 Isolation, purification and physicochemical properties ", pp 57-67 // In the book "Biochemical Physics Frontal Research", Ed by S D Varfolomeev, E В Burlakova, A A Popov and G E Zaikov, Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc, p 160 , 2006

9 VP Yamskova, MS Krasnov, E Yu Rybakova, VV Vecherkm, A V Borisenko, IA Yamskov "Analysis of regulatory proteins from bovine blood serum that display biological activity at ultra low doses 2 Tissue localization and role in wound healing", pp 68-77 // In the book "Biochemical Physics Frontal Research", Ed by S D Varfolomeev, E В Burlakova, A A Popov and G E Zaikov, Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc, p 160,2006

Заказ № 199/04/08 Подписано в печать 23 04 2008 Тираж 100 экз Уел пл 1,25

(^^ ^ ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 уу1 шш с/г ги, е-тай т/о@с/г ги

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Вечеркин, Владислав Владиславович

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Состав, функция и физико-химические свойства крови 9 млекопитающих

Общие положения

Морфология и функция форменных элементов крови

Основные функции крови

1.2. Белки сыворотки крови

1.3. Биологически активный в сверхмалых дозах регуляторный белок, 32 выделенный из сыворотки крови млекопитающих

1.4. Цитокины

1.5. Цитомедины

1.6. Белки S

ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Использованные материалы

2.2. Методы, примененные при выполнении работы

Получение фракций РБ из сыворотки крови млекопитающих

Обработка слабокислого регуляторного белка серным эфиром

Определение концентрациирегуляторных белков

Масс-спектрометрия

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

Электрофорез в полиакриламидном геле

Исследование регуляторных белков с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР)

Спектры кругового дихроизма

Дифференциальная сканирующая калориметрия

Биотестирование фракций белков, полученных в процессе очистки, для определения присутствия регуляторных белков

Определение состояния регуляторных белков в растворах методом 53 АСМ (атомно-силовой микроскопии)

Получение политональной антисыворотки

Роллерное органное культивирование кожи тритонов Pleurodeles 59 waltl

Изучение влияния сывороточного регуляторного белка на go ранозаживление в коже у млекопитающих in vivo

Изучение белка-инактиватора

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Выделение и очистка регуляторных белков, выделенных из 55 сыворотки крови КРС

3.2. Биотестирование фракций регуляторных белков в процессе очистки

Исследование мембранотропной активности РБ, выделенных из gg сыворотки крови млекопитающих

3.3. Исследование физико-химических свойств регуляторных белков, 92 выделенных из сыворотки крови млекопитающих

Оценка значения «кажущейся» молекулярной массы регуляторных белков

Изучение вторичной структуры РБ с помощью метода кругового дихроизма

Изучение растворов РБ с помощью метода атомно-силовой jqq микроскопии

Исследование РБ, выделенных из сыворотки крови млекопитающих, с Ю5 помощью высокоэффективной э/сидкостной хроматографии Исследование состава фракций регуляторных белков с помощью Ю ядерного магнитного резонанса

Изучение липидной компоненты фракции СРБ

Исследование КРБ с помощью метода масс-спектрометрии j ^

Electrospray

3.4. Изучение локализации в тканях позвоночных животных, а также специфической биологической активности регуляторных белков ^^ сыворотки крови

Исследование локализации СРБ в печени тритона Pleurodeles waltl

Исследование влияния РБ на состояние ткани кожи тритона j ^

Pleurodeles waltl при органном культивировании in vitro

Исследование влияния слабокислого регуляторного белка на ^^ ранозаживление кожи мыши in vivo

3.5. Исследование белка, инактивирующего мембранотропное действие ^ СРБ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование регуляторных белков, действующих в сверхмалых дозах, выделенных из сыворотки крови млекопитающих"

Актуальность работы.

Поиск, изучение свойств и возможности использования, новых биологически активных веществ является актуальной проблемой современных биотехнологии и биохимии. В этом аспекте особый интерес вызывают компоненты сыворотки крови, которая содержит широкий спектр различных веществ, проявляющих разнообразные типы биологической активности. Среди таковых следует отметить группу новых эндогенных биорегуляторов (РБ), характеризующихся проявлением биологического действия в сверхмалых дозах (СМД), соответствующих 10"10— 10"15 мг белка/мл [1]. Данные биорегуляторы оказывают влияние на важнейшие биологические процессы.

Биологически активные в сверхмалых дозах РБ данной группы были обнаружены в различных тканях млекопитающих [2, 3, 4, 5]. РБ стимулируют миграцию и адгезию клеток, влияют на клеточную пролиферацию и дифференцировку, а также апоптоз [6, 4, 7]. РБ данной группы представляют собой низкомолекулярные, устойчивые к воздействию различных физико-химических факторов белки, вторичная структура которых характеризуется значительным содержанием структур [5]. В водных растворах молекулы РБ проявляют тенденцию в образованию наноразмерных ассоциатов [4]. В тканях РБ присутствуют в виде нескольких отличающихся по заряду фракций - наиболее представлены фракции кислых и фракции основных белков [5].

Наиболее изученным представителем данной группы биорегуляторов является слабокислый биорегулятор, выделенный из сыворотки крупного рогатого скота [8]. Было показано, что в состав данного биорегулятора входит низкомолекулярный, высокогликозилированпый белок (остатки маннозы и N-ацетилглюкозамина) со значением pi в области рН 4,5-5,1. В аминокислотном составе РБ превалируют остатки дикарбоновых аминокислот, серина и глицина [4]. В СМД РБ сыворотки крови оказывал влияние на пролиферацию и миграцию фибробластов in vitro, проявлял мембранотропное действие в отношении клеток млекопитающих [9, 10]. Было установлено, что данный РБ сыворотки крови в постнатальном периоде находится в крови в неактивном состоянии, в отличие от эмбрионального периода (первые две трети эмбриогенеза), когда он присутствует в крови в активном состоянии [4]. На основании данного РБ были разработаны новые фармакологические препараты, которые в настоящее время применяются в практике медицины: «Адгелон-глазные капли» в офтальмологии; «Адгелон-раствор для инъекций» - ортопедии и травматологии [10, 11].

Однако присутствующие в сыворотке крови в существенно больших количествах кислые и основные РБ данной группы до настоящей работы не изучались.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы явились выделение и очистка кислых и основных регуляторных белков, активных в сверхмалых дозах, из сыворотки крови млекопитающих, изучение их физико-химических свойств и биологической активности. Особое внимание в этой работе было уделено сравнительному исследованию свойств РБ, обнаруженных в сыворотке крови млекопитающих. Для этого предполагалось решить следующие задачи:

• Исследовать сыворотку крови крупного рогатого скота (КРС) и лошади для идентификации кислых и основных РБ.

• Изучить физико-химические свойства РБ сыворотки крови млекопитающих: провести исследование состава и структуры данных белков, исследовать состояние РБ в водных растворах.

• Идентифицировать ингибитор сывороточного РБ и изучить его свойства.

• Изучить тканевую локализацию РБ сыворотки крови в печени млекопитающих.

• Исследовать специфическую биологическую активность РБ сыворотки крови в СМД.

Научная новизна работы.

В результате проведенной работы впервые в сыворотке крови млекопитающих были идентифицированы и получены в высокоочищенном состоянии новые ранее не изученные кислые и основные РБ, которые проявляли биологическую активность в СМД. Впервые были изучены физико-химические свойства данных белков и показано, что они представляют собой низкомолекулярные белки, вторичная структура которых представлена, в основном, 0-структурами и неупорядоченными элементами, описываемыми в терминах статистического клубка. иБыло установлено, что в растворах данные белки образуют наноразмерные частицы диаметром в интервале значений от 60 до 100 им. По физико-химическим свойствам данные белки сходны с ранее выделенным РБ сыворотки КРС со значением pi в области рН 4,5-5,1. Впервые было показано, что сывороточный белок, обратимо ингибирующий биологическую активность РБ сыворотки, представляет собой белок, в высокой степени гомологичный сывороточному альбумину, и представляет собой его изоформу. Впервые было показано, что в основе обратимой инактивации РБ сыворотки крови лежит взаимодействие с белком-инактиватором, которое осуществляется по механизму белок-углеводного узнавания. Впервые был изучен механизм, лежащий в основе биологического тестирования РБ данной группы, и в том числе, РБ сыворотки крови. Исследование мембранотропной активности ряда моно-, ди- и олигосахаридов показало, что из маннозосодержащих олигосахаридов биологическую активность в СМД проявляли те, терминальные остатки которых были представлены дисахаридом Manal-2Man и дисахаридом Gaipi-4GlcNAc. Мембрапотропная активность этих веществ характеризуется полимодальиой дозовой зависимостью, которая сходна с дозовой зависимостью мембранотропной активности исследуемых РБ. Впервые была установлена межклеточная локализация РБ сыворотки крови со значением р! в области рН 4,5-5,1 в печени позвоночных животных. Впервые на новых экспериментальных моделях органного роллерного культивирования кожи амфибий было продемонстрировано в СМД протекторное свойство изучаемых РБ сыворотки крови млекопитающих, а также ранозаживляющее действие на модели экспериментальной кожной рапы у мышей in vivo.

Практическая значимость.

Регуляторные белки сыворотки крови в СМД оказывали протекторное действие на ткань кожи амфибий in vitro, а СРБ в СМД стимулировал репаративные процессы в коже и способствовал восстановлению её гистоструктуры при экспериментальной травме у мышей in vivo. Можно полагать (учитывая отсутствие видовой специфичности у РБ данной группы), что идентифицированные в данной работе кислые и основные РБ сыворотки крови могут быть использованы в качестве субстанций для разработки новых фармакологических препаратов, аналогично применяемому в настоящее время эффективному лекарственному средству Адгелон, созданному на основе слабокислого регуляторного белка, а СРБ найдет новое важное применение.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Вечеркин, Владислав Владиславович

выводы

1. В сыворотках крови крупного рогатого скота и лошади, идентифицированы новые регуляторные белки: кислый, основной, действующие в сверхмалых дозах (соответствующих 10"8 — 10"15 мг/мл), свойства которых сходны со свойствами других регуляторных белков, выделенных из различных тканей млекопитающих.

2. Показано, что регуляторные белки сыворотки крови представляют собой низкомолекулярные белки, их вторичная структура характеризуется преимущественным содержанием p-структур и элементов, описываемых в терминах статистического клубка. Установлено, что регуляторные белки присутствуют в водных растворах в виде наноразмерных частиц.

3. Показано, что в сыворотке крови млекопитающих присутствует белок, обратимо инактивирующий биологическую активность регуляторного белка, значение pi которого находится в интервале рН 4,5-5,1. Белок-инактиватор характеризуется высокой гомологией с альбумином сыворотки крови крупного рогатого скота, но отличается от него аминокислотной последовательностью N-концевого домена и значением изоэлектрической точки (3,9-4,0).

4. Методом кругового дихроизма показана высокая устойчивость изученных регуляторных белков к действию повышенных температур (до 100°С), хаотропных агентов (гуанидинхлорида). Изменение эллиптичности при действии ЭДТА указывают на влияние иопов Са2+ на процесс организации вторичной структуры регуляторных белков.

5. Методом кругового дихроизма показано, что при инактивации РБ в присутствии белка-инактиватора и ионов Са2+ происходит изменение конформации молекулы белка-инактиватора.

6. Методами иммуногистохимии и конфокальной микроскопии изучена локализация в ткани печени регуляторного белка сыворотки крови, значение pi которого находится в интервале рН 4,5-5,1. Установлено, что данный регуляторный белок расположен в межклеточном пространстве паренхимы печени позвоночных животных.

7. Установлено, что регуляторные белки сыворотки крови млекопитающих проявляли в сверхмалых дозах выраженную биологическую активность: протекторное действие на ткань кожи амфибий при роллерном органном культивировании; регуляторный белок, значение pi которого находится в интервале рН 4,5-5,1, стимулировал репаративные процессы в коже, способствовал восстановлению ее гистоструктуры при экспериментальной травме у мышей in vivo.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования удалось идентифицировать в сыворотках крови млекопитающих две фракций РБ - кислых и основных белков, изучить ряд их физико-химических свойств. Важнейшим свойством РБ данной группы, в том числе, выделенных из сыворотки крови млекопитающих, является проявление ими биологической активности в СМД. В настоящем исследовании показано, что в СМД сывороточные РБ проявляют мембранотропное действие, а РБ, значение изоэлектрической точки лежит в интервале рН 4,5-5,1, проявляет выраженное ранозаживляющее свойство. С помощью методов иммуногистохимиии была показана внеклеточная локализация данного РБ сыворотки крови в печени млекопитающих.

Механизм, лежащий в основе биологического действия РБ данной группы, до сих пор остаётся малоизученным, так же как и для других веществ, проявляющих биологическую активность в СМД. В настоящем исследовании был идентифицирован белок, инактивирующий биологическую активность РБ со значением изоэлектрической точки в интервале рН 4,5-5,1. В этом аспекте следует отметить, что сыворотка крови не проявляет мембранотропной активности при исследовании адгезиометрическим методом, применяемым для идентификации РБ данной группы.

Белок-инактиватор проявляет высокую гомологию с БСА и, очевидно, является членом мультисемейства сывороточных альбуминов. При взаимодействии с РБ происходит изменение вторичной и третичной структур белка-инактиватора. Полученные результаты предполагают, что в основе образования комплекса между этими белками лежит углевод-белковое взаимодействие. Возможно, что данный белок-инактиватор также взаимодействует с другими сывороточными РБ и регулирует их биологическую активность аналогичным образом. Кроме того, данные этого исследования указывают на определенную малоизученную роль членов семейства альбуминов, которая заключается в регуляции биологической активности веществ эндогенного происхождения в организме.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Вечеркин, Владислав Владиславович, Москва

1. Ямсков И.А., Ямскова В.П. Фармакологические препараты нового поколения на основе ранее неизвестных биорегуляторов-гликопротеинов клеточного микроокружения //(1998) Российский химический журнал (ЖРХО им. Д.И. Менделеева). Т.42. N3. С. 85-90.

2. Ямскова В.П., Модянова Е.А., Резникова М.М., Маленков А.Г. Высокоактивные тканевоспецифические адгезионные факторы печени и легкого //(1977) Молекулярная биология. Т.П. N5. С. 1 147-1154.

3. Ямскова В.П., Резникова М.М. Низкомолекулярный полипептид сыворотки крови теплокровных: влияние на клеточную адгезию и пролиферацию // (1991) Журнал общей биологии, т.52. №2. 181-191.

4. Ямскова В.П. Роль ионов кальция в стабилизации адгезионного фактора печени крыс //(1978) Биофизика, т.23. С. 428-432.

5. Краснов М.С., Маргасюк Д.В., Ямсков И.А., Ямскова В.П. Действие новых регуляторных белков из растений в сверхмалых дозах //(2003) Радиационная биология и радиоэкология. N3. С.269-272.

6. Ямсков И.А., Виноградов А.А., Даниленко А.Н., Маслова Л.А., Рыбакова Е.Ю., Ямскова В.П. Низкомолекулярный гликопротеин из сыворотки крови крупного рогатого скота: структура и свойства // (2001) Прикладная биохимия и микробиология, т.37. №1. с.36-42.

7. Буеверова Э.И., Брагина Е.В., Резникова М.М., Ямскова В.П., Хрущов Н.Г. Действие адгезионного фактора сыворотки крови на пролиферацию клеток млекопитающих in vitro //(1985) ДАН СССР, т.281, N1, с.158-160

8. Гундорова Р.А., Хорошилова-Маслова И.П., Ченцова Е.В., Илатовская J1.B., Ямскова В.П., Романова И.Ю. Применение адгелона в лечении проникающих ранений роговицы в эксперименте // (1997) Вопросы офтальмологии. Т.113. N2. С. 12-15.

9. Романова И.Ю., Гундорова Р.А.,Ченцова Е.В., Ямскова В.П. Восстановительные процессы в роговице глаза после эрозийного повреждения и влияние на них адгелона.// (2004) БЭБМ. N11. С. 505-507.

10. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуелл В. Биохимия человека том 2. //(1993) Москва. Издательство «Мир», 415с

11. Петровский Б.В. Большая Медицинская Энциклопедия том 12 -Криохирургия. //(1980) Москва. Издательство «Совецкая Энциклопедия», 536с

12. Ткаченко Б.И. Основы физиологии человека. //(1994) СПб.: Междунар. фонд истории науки, Т. 1.

13. Шмидт Р., Тевс Г. Физиология человека. //(1996) Москва.: Мир, Т. 3: Кровь, кровообращение, дыхание.

14. Привес М.Г., Лысенков Н.К. Анатомия человека. //(1999) Санкт-Петербург. Издательство «Гиппократ», 704с.

15. Гончаренко А. И. Пространство сердца как основа сверхсознания. // (1997) Ж. Сознание и физическая реальность, том 2, № 3, с. 25 35.

16. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. //(1987) Москва, «Просвещение», 815с

17. Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Пептиды эпифиза и тимуса в регуляции старения // (2001) СПб. Фолиант, 160.

18. Cistola D.P., Small D.M. Fatty acid distribution in systems modeling the normal and diabetic human circulation. A 13C nuclear magnetic resonance study.//(1991) J. Clin. Invest., vol.87(4):1431-41. vol 87 p. 1431-1441

19. Dengler T.J., Robertz-Vaupel G.M., Dengler H.J. Albumin binding in uraemia: quantitative assessment of inhibition by endogenous ligands and carbamylation of albumin.// (1992) Eur. J. Clin.Pharmocol, vol.43(5):491-9;

20. Mi Z., Burke TG. Differential interactions of camptothecin lactone and carboxylate forms with human blood components.// (1994) Biochemistry, vol.33 (34): 10325-36.

21. Добрецов Г.Е. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине.//(1994) Москва, «Ириус».

22. Kragh-Hansen U. Molecular aspects of ligand binding to serum albumin. //(1981) Pharmacol. Rev. 33 17-53.

23. Carter D.C., Ho J.X. Structure of serum albumin. //(1994) Adv. Protein Chem. vol 45:153-203.

24. Peters T. Jr., All about Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical Applications. //(1996) Academic Press, San Diego, CA.

25. Meloun В Moravek L Kostka V Complete amino acid sequence of human serum albumin.// 1975 FEBS Lett. 58(1): 134-7.

26. Okabe N Yoshida S Thyroxine binding properties of glycosylated human serum albumin as measured by fluorescence.// 1995 Biol Pharm Bull. 18(1): 154-5.

27. Peters T Jr Serum albumin.// 1985 Adv Protein Chem.;37:161-245.

28. He X.M., Carter D.C. Atomic structure and chemistry of human serum albumin. //(1992) Nature, vol. 358:209-215.

29. Eksborg S., Ehrsson H. and Ekqvist B. Protein binding ofanthraquinone glycosides, with special reference to adriamycin. // (1982) Cancer Chemother Pharmacol, vol.10:7-10.

30. Chassany O., Urien S., Claudepierre P., Bastian G. and Tillement J.P. Comparative serum protein binding of anthracycline derivatives. // (1996) Canser Chemother Pharmacol, vol. 38:571-573.

31. Carter D.C., Ho J.X. Structure of serum albumin. // (1994) Advanced Protein Chemistry, vol.45, 153.

32. Souza A. R., Najjar R., Oliveira E., Zyngier S.B. Hepatic functional changes induced by the combined use of isoniazid, pyrazinamide and rifampicin in the treatment of pulmonary tuberculosis // (1997) Met. Based Drugs, vol.4, 39.

33. Howard R. A., Sherwood E., Erck A., Kimball A.P., Bear J.L. // (1977) J. MedChem., vol.20: 7, 943.

34. Santos E.C., Spector A.A. Effect of fatty acids on the binding of 1-anilino-8-naphthalenesulfonate to bovine serum albumin.// 1972 Biochemistry. 11(12):2299-302.

35. Terada H., Hiramatsu K., Aoki K. Heat denaturation of serum albumin monitored by 1-anilino-naphthalene-8-sulfonate.//l 980 Biochim Biophys Acta. 622(2):161-70.

36. Foster J.F. The Plasma proteins.// 1960 Chem. Biol. Interact, vol.1:179-239

37. Sjoberg В., Mortensen K. Interparticle interactions and structure in nonideal solutions of human serum albumin studied by small-angle neutron scattering and Monte Carlo simulation.// 1994 Biophys Chem. 52(2): 13 1-8.

38. Arai K., Madison J., Shimizu A., Putnam F.W. Point substitutions in albumin genetic variants from Asia. //(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,vol.87(l):497-501

39. Peach R.J., Brennan S.O. Structural characterization of a glycoprotein variant of human serum albumin: albumin Casebrook (494 AspCAsn) //1991) Biochimica et Biophysica Acta, vol.l097:49-54.

40. Kragh-Hansen U., Donaldson D., Jensen P. H. The glycan structure of albumin Redhill, a glycosylated variant of human serum albumin. // (2001) Biochimica et Biophysica Acta, vol.1550:20-26.

41. Bonavida В., Sapse А.Т., Sercarz E.E. Specific tear prealbumin: a unique lachrymal protein absent from serum and other secretions. // (1969) Nature, vol.221:375.

42. Janssen P.Т., vanBijsterveld O.P. Tear fluid proteins in Sjogren's syndrome. // (1983) Exp. Eye Res., vol.36:773.

43. Redl В., Holzfeind P., Lottspeich F. cDNA cloning and sequencing reveals human tear prealbumin to be a member of the lipophilic-ligand carrier protein superfamily. // (1992) J. Biol. Chem., vol.267:20282.

44. Hynes R. O. Molecular biology of fibronectin. // (1985) Annu. Rev. Cell Biol., vol.1:67- 90.

45. Hynes R. O. Fibronectins. // (1990) New York: Springer-Verlag, series in Molecular Biology.

46. Yamada К. M. Cell surface interactions with extracellular materials. // Annu. Rev. Biochem. vol.52:761- 799; 1983.

47. Hynes R. O., Yamada К. M. Fibronectin: Multifunctional modular glycoproteins. // (1982) J. Cell Biol. vol.95:369 -377; (1995) vol.16:263-268.

48. Ruoslahti E., Engvall E., and Hayman E. G. Fibronectin: current concepts of its structure and functions. // (1981) Collagen Relat. Res. vol.1:95-128

49. Yamada К. M., and Kennedy D. W. Fibroblast cellular and plasma fibronectins are similar but not identical. // (1979) J. Cell Biol. vol.80:492-498

50. Hayashi M., and Yamada К. M. Differences in domain structures between plasma and cellular fibronectins. // (1981) J. Biol. Chem. vol.256:1 129211300

51. Atherton В. Т., and Hynes R. O. A difference between plasma and cellular fibronectins located with monoclonal antibodies. // (1981) Cell vol.25:133-141

52. Carter W. G., and Hakomori S. Isolation of galactoprotein a from hamster embryo fibroblasts and characterization of the carbohydrate unit. // (1979) Biochemistry vol. 18:730-738

53. Fukuda M., and Hakomori S. Carbohydrate structure of galactoprotein a, a major transformation-sensitive glycoprotein released from hamster embryo fibroblasts. // (1979) J. Biol. Chem. vol.254:545 1-5457

54. Takasaki S., Yamashita K., Suzuki K., and Kohata A. Structural studies of the sugar chains of cold-insoluble globulin isolated from human plasma. // (1980) J. Biochem. (Tokyo) vol.88:1587-1594

55. Fukuda M., Levery S. В., and Hakomori S. Carbohydrate structure of hamster plasma fibronectin. Evidence for chemical diversity between cellular and plasma fibronectins. // (1982) J. Biol. Chem. 257,6856-6860

56. Kornblihtt A. R., Umezawa K., Vibe-Pedersen K., Baralle F. E. Primary structure of human plasma fibronectin: Differential splicingspliced segment of fibronectin via the integrin receptor J) 4 J) 1.11 (1990) Cell vol.60:53- 61.

57. Schwarzbauer J. E., Paul J. I., Hynes R. O. On the origin of species of fibronectin. // (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.82:1424 -1428;. Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.80:137- 141; 1983.

58. Skorstengaard K., Jensen M. S., Petersen Т. E., Magnusson S. Purification and complete primary structures of the heparin-, cell-, and DNA-binding domains of bovine plasma fibronectin. // Eur. J. Bio-chem. vol.154:15- 29; 1986.

59. Mosher D. F. Physiology of fibronectin. // (1984) Annu. Rev. Med. vol.35:561- 575.

60. Riechardt L. Extracellular matrix molecules and their receptors // In: "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins". Eds. Kreis Т., Vale R. 1993. Oxford University Press. P.3-12.

61. Kornblihtt A.R., Vibe-Pedersen K. and Baralle F.E. Isolation and characterization of cDNA clones for human and bovine fibronectins. // 1983, Proc Natl Acad Sci USA, vol.80, 3218- 22.

62. Leahy D.J., Hendrickson W.A., Aukhil I. and Erickson H.P. Structure of fibronectin type III domain from tenascin phased by MAD analysis of the selenomethionyl protein. // (1992), Science, vol. 258, 987- 91.

63. Ruoslahti E. Integrins. // (1991), J Clin Invest, vol.87, 1- 5.

64. Pierschbacher M. D., Ruoslahti E., Cell attachment activity of fi-bronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule. // Nature vol.309:30 -33; 1984.

65. Hiroshi Mohri, Interaction of Fibronectin With Integrin Receptors: Evidence by Use of Synthetic Peptides. //(1997) Peptides vol. 18(6):899- 907.

66. Deal D., Bowlos C., Bourgeosis S. Detection of sugar-binding sites in the fibrillar and the granular components of the nucleolus: an experimental study in cultured mammalian cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V.84. P.1876-1880.

67. Choi M. G., and Hynes, R. O. Biosynthesis and processing of fibronectin in NIL.8 hamster cells. // (1979) J. Biol. Chem. vol.254:12050-12055

68. Takasaki S., Yamashita K., Suzuki K., Iwanaga S., and Kobata A. The sugar chains of cold-insoluble globulin. A protein related to fibronectin. // (1979) J. Biol. Chem. vol.254:8548-8553

69. Fisher S. J., and Laine R. A. Carbohydrate structure of the major glycopeptide from human cold-insoluble globulin. // (1979) J. Supramol. Struct, vol.11:391-399

70. Carter W. G., and Hakomori S.-I. Isolation of galactoprotein a from hamster embryo fibroblasts and characterization of the carbohydrate unit. // (1979) Biochemistry vol.18:730- 738

71. Ruoslahti E. Fibronectin and its receptors. // (1988) Annu Rev Biochem vol.57: 375-413.

72. Mohri H. Fibronectin and integrin interactions. // (1996) J. Invest. Med. vol.44: 3429- 3441.

73. Petersen Т. E., Skorstengaard K. Fibronectins. // (1985) McDonagh, J., ed. Hematology, vol. 5. New York: Dekker:7— 30.

74. Juliano R.L. and Haskill S., Signal transduction from the extracellular matrix. // (1993), J Cell Biol, vol.120, 577- 85.

75. Hanks S.K., Calalb M.B., Harper M.C. and Patel S.K., Focal adhesion protein-tyrosine kinase phos-phorylated in response to cell attachment to fibronectin. // (1992), Proc Natl Acad Sci USA, vol.89, 8487- 91.

76. Schaller M.D. and Parsons J.Т., Focal adhesion kinase and associated proteins. // (1994), Curr Opin Cell Biol, vol.6, 705- 10.

77. Argaves W.S., Dickerson K., Burgess W.H., Rouslathi E. Fibulin, a novel protein that interacts with the fibronectin receptor beta subunit cytoplasmic domain. // (1989) J. Cell Biol. vol. 58:623-629.

78. Argaves W.S., Tran H., Dickerson K., Burgess W.H. Fibulin is an extracellular matrix and plasma glycoprotein with repeated domain structure. // (1990) J. Cell Biol. vol. 1 1 1:3155-3164.

79. Spence S.G., Argaves W.S., Walters L., Hungerford J.E., Little C.D. Fibulin is localized at sites of epithelial-mesenchymal transitions in the early avian embryo. // (1992) Dev. Biol. vol. 151:473-484.

80. Drickammer K. Two distinct classes of carbohydrate-recognition domains in animal lectins. // (1988) J. Biol. Chem., vol 263:9557-9560.

81. Ezekowitz R.A.B., Stahl P.D. The structure and function of vertebrate mannose lectin-like proteins. // (1988) Jornal Cell Science Supple, vol.9:121-133.

82. Sastry K., Zahedi K., Lelias J.M., Whitehead A., and Ezekowitz R.A.B. Molecular characterization of the mouse mannose-binding proteins. The mannose-binding protein A but not С is an acute phase reactant. // (1991) J. Immun. vol.147:692-697.

83. Taylor M.E., Brickell P.M., Craig R.K., and Summerfield J.A. Structure and evolutionary origin of the gene encoding a human serum mannose-binding protein. // (1989) Biochem J. vol 262, 763-771.

84. Colley K.M., Beranek C., and Baenziger J.U. Purification and characterization of the core-specific lectin from human serum and liver. // (1988) Biochem. J. vol.256:61-68.

85. Drickamer K., and McCreary V. Exon structure of a mannose-binding protein gene reflects its evolutionary relationship to the asialoglycoprotein receptor and nonfibrillar collagens. // (1987) J. Biol. Chem. vol 262, 25822589.

86. Taylor M.E., and Summerfield J.A. Carbohydrate-binding proteins of human serum: isolation of two mannose/fucose-specific lectins. // (1987) Biochem. Biophys. Acta vol.915:60-67.

87. Kuhlman M., Joiner K., and Ezekowitz R.A.B. The human mannose-binding protein functions as an opsonin. // (1989) Exp. Med. vol 169, 17331745.

88. Kawasaki Т., Etoh R., and Yamashura I. Isolation and characterization of a mannose/N-acetylglucosamine/fucose-binding protein from rat liver. // (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. vol 81, 1018-1024.

89. Ezekowitz R.A.B. Molecular characterization of the mouse mannose-binding proteins. The mannose-binding protein A but not С is an acute phase reactant. // (1991) Current Biol. vol.1:60-62.

90. Chung D. W., Que B. G., Rixon M. W., Mace Jr. M., Davie E. W. Characterization of complementary deoxyribonucleic acid and genomic deoxyribonucleic acid for the beta chain of human fibrinogen. //(1983) Biochemistry vol. 22, 3244-3250.

91. Usan G., Courtios G.,Stanckovic Z., Crabtree G. R., Marquerie G. Expression of the fibrinogen genes in rat megakaryocytes. // (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. vol 140, 543-549.

92. Weisel J. W., Stauffacher С. V., Bullit E., Cohen C. A model for fibrinogen: domains and sequence. // (1985) Science vol. 230, 1388-1391.

93. Chung D. W. and Davie E.W. Gamma and gamma' chains of human fibrinogen are produced by alternative mRNA processing. // (1984) Biochemistry vol. 23, 4232-4236.

94. Francis C.W., Nachman R.L, Marder V.J. Plasma and platelet fibrinogen differ in gamma chain content. // (1984) Thromb. Haemostas. Vol. 51, 84-88.

95. Alteri D.C., Agbanyo F.R., Plescia J.,Ginsberg M.H., Edgington T.S., Plow E.F. A unique recognition site mediates the interaction of fibrinogen with the leukocyte integrin Mac-1 (CD1 lb/CD18). // (1990) J. Boil. Chem. vol. 256, 12119-12122.

96. Townsend R.R., Hilliker E., Li Y.T., Liane R.A., Bell W.R., Lee Y.G. Carbohydrate structure of human fibrinogen. Use of 300-MHz 1H-NMR to characterize glycosidase-treated glycopeptides. // (1982) J. Biol. Chem. vol 257, 9704-9710.

97. Lewis S.D., Shields P.P., Shafter J.A. Characterization of the kinetic pathway for liberation of fibrinopeptides during assembly of fibrin. // (1985) J. Biol. Chem. vol 260, 10192-10199.

98. Laudano A.D., Doolittle R.F. Influence of calcium ion on the binding of fibrin amino terminal peptides to fibrinogen. // (1981) Science 212, 457-459.

99. Mammen E.F. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. // (1983) Semin. Thromb. Hemostas 9, 1-9.

100. Dang C.V., Bell W.R. and Shuman M. The normal and morbid biology of fibrinogen. // (1989) Am. J. Med/ 87, 567-576.

101. Cheresh D.A., Berliner A.S., Vicene V., Ruggeri Z.M. Recognition of distinct adhesive sites on fibrinogen by related integrins on platelets and endothelial cells. // (1989) Cell 58, 45-953.

102. Altieri D.C., Agbanyo F.R., Pleca J., Ginsberg M.H., Edgington T.S., Plow E.F. A unique recognition site mediates the interaction of fibrinogen with the leukocyte integrin Mac-1 (CD1 lb/CD 18). // (1990) J. Biol Chem 265, 12119-12122.

103. Sottrup-Jensen L., Claeys H., Zajdel M, Petersen Т.Е., Magnusson S. Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis. // (1978) vol. 3, 191209, Raven Press, New York.

104. Claeys H. and Vermylen J. Physico-chemical and proenzyme properties of NH2-terminal glutamic acid and NH2-terminal lysine human plasminogen. Influence of 6-aminohexanoic acid. // (1974) Biochem. Biophys. Acta v. 342, 351-359.

105. McLean H.R., Tomlinson J.E., Kuang W.J., Eaton D.L., Chen E.Y., Fless G.M., Scanu A.M., Lawn R.M. cDNA sequence of human apolipoprotein(a) is homologous to plasminogen. // (1987) Nature v. 300, 132-137.

106. Silverstein R.L., Leung L.L.K., Harpel P.C., Nachman R.L. Complex formation of platelet thrombospondin with plasminogen. Modulation of activation by tissue activator. // (1984) J. Clin. Invest, v. 74, 1625-1633.

107. Salonen E.M., Saksela 0.,Vartio Т., Vaheri A., Nielsen L.S., Zeuthen J. Plasminogen and tissue-type plasminogen activator bind to immobilized fibronectin. // (1985) J. Biol. Chem. v. 260, 12302-12307.

108. Clemmensen I., Petersen L.C., Kluft C. Purification and characterization of a novel, oligomeric, plasminogen kringle 4 binding protein from human plasma: tetranectin. // (1986) Eur. J. Biochem. v. 156, 327-333.

109. Miles L. and Plow E.F. Receptor mediated binding of the fibrinolytic components, plasminogen and urokinase, to peripheral blood cells. // (1988) Fibrinolysis, v.2, 61-71.

110. Preissner К. Specific binding of plasminogen to vitronectin. Evidence for a modulatory role of vitronectin on fibrin(ogen)-induced plasmin formation by tissue plasminogen activator. // (1990) Biochem. Biophys. Res. Communs. v. 168, 966-971.

111. Pannekoek H., Veerman H., Lambers H., Diergaarde P., Verweij C.L., Van Zonneveld A.J., Van Mourik J.A. Endothelial plasminogen activator inhibitor (PAI): a new member of the Serpin gene family. // (1986) EMBO v.5, 25392544.

112. Ny Т., Sawdey M., Lawrence D., Millan J.L., Loskutoff D.J. Cloning and sequence of a cDNA coding for the human beta-migrating endothelial-cell-type plasminogen activator inhibitor. // (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) v.83, 6776-6780.

113. Pralong G., Calendra Т., Glauser M.P., Schellekens J., Verhoef J., Bachmann F., Kruithof E.K.O. Plasminogen activator inhibitor 1: a new prognostic marker in septic shock. // (1989) Thromb. Haemostas. v.61, 459462.

114. Estelles A., Gilabert J., Aznar J., Loskutoff D.J., Schleef R.R. Changes in the plasma levels of type 1 and type 2 plasminogen activator inhibitors in normal pregnancy and in patients with severe preeclampsia. // (1989) Blood, v.74, 1332-1338.

115. Schleef R.R., Wagner N.V., Loskutoff D.J. Detection of both type 1 and type 2 plasminogen activator inhibitors in human cells. // (1988) J. Cell Physiol, v.134, 269-274.

116. Roder M., Philips M., Suenson E., Thorsen S. Increased basic fibroblast growth factor (bFGF) immunoreactivity at the site of focal brain wounds. // (1988) Fibrinolysis, v.2, 225.

117. Cubellis M.V., Wun T.C., Blasi F. Receptor-mediated internalization and degradation of urokinase is caused by its specific inhibitor PAI-1. // (1990) EMBO v.9, 1079-1085.

118. Wohlwend A., Belin D., Vassalli J.D. Plasminogen activator-specific inhibitors produced by human monocytes/macrophages. // (1987) J. Exp. Med. v. 165, 320-339.

119. Ye R.D., Wun T.C., Sadler J.E. Mammalian protein secretion without signal peptide removal. Biosynthesis of plasminogen activator inhibitor-2 in U-937 cells. // (1988) J. Biol. Chem. v.263, 4869-4875.

120. Kruithof E.K.O., Tran-Thang C., Gudinchet A., Hauert J., Nicoloso G., Genton C., Welti H., Bachmann F. Fibrinolysis in pregnancy: a study of plasminogen activator inhibitors. // (1987)Blood v.69, 460-466.

121. Astedt В., Hagerstrand I., Lecander I. Cellular localisation in placenta of placental type plasminogen activator inhibitor. // (1986) Thromb. Haemostas. v.56, 63-65.

122. Wun T.C., Reich E. An inhibitor of plasminogen activation from human placenta. Purification and characterization. // (1987) J. Biol. Chem. v.262, 3646-3653.

123. Leung K.C., Byatt J.A., Stephens R.W. Poly-D-lysine dependent inactivation of tissue plasminogen activator by a class PAI-2 inhibitor (minactivin). // (1987) Thromb. Res. v.46, 755-766.

124. Маленков А.Г., Модянова E.A., Ямскова В.П. Тканевоспецифическое ингибирование синтеза ДНК контактинами-факторами, обладающими тканеспецифической адгезионной активностью // Цитология. 1978. т.20. N8. с.957-962.

125. Гундорова Р.А., Хорошилова-Маслова И.П., Ченцова Е.В., Илатовская Л.В., Ямскова В.П., Романова И.Ю. Применение адгелона в лечении проникающих ранений роговицы в эксперименте // Вопросы офтальмологии. 1997. Т.113. N2. С. 12-15.

126. Краснов М.С., Гурмизов Е.П., Ямскова В.П., Гундорова Р.А., Ямсков И.А. Исследование влияния регуляторного белка, выделенного из хрусталика глаза быка, на катарактогенез у крыс in vitro // Вестник офтальмологии. 2005. Т.121. N1. С. 37-39.

127. Краснов М.С., Гурмизов Е.П., Гундорова Р.А., Ямскова В.П., Капитонов Ю.А. Модель катарактогенеза позвоночных животных in vitro // Офтальмология. 2005. Т.2. N2. С. 43-49.

128. Маргасюк Д.В., Краснов М.С., Ямскова В.П., Григорян Э.Н., Ямсков И.А. Исследование регуляторного белка, выделенного из роговицы глазабыка: выделение, очистка, локализация в ткани и биологическая активность // Офтальмология. 2005. Т.2. N3. С. 81-87.

129. Ямскова В.П., Туманова Н.Б., Логинов А.С. Сравнительное исследование действия экстрактов печени мышей линии С57В1 и СВА на адгезию гепатоцитов // (1990) Бюлл. экспер. биол. и мед. N.3. с.303-306.

130. Ямскова В.П., Резникова М.М. Роль макромолекулярных компонентов клеточной поверхности в специфической адгезии клеток.//Успехи биологической химии. 1979. т.20, с.95-112.

131. Краснов М.С., Ямскова В.П. Идентификация низкомолекулярных S-100 белков в тканевых экстрактах сетчатки и пигментного эпителия глаза быка // Онтогенез. 2000. Т. 31. N4. С. 281-282.

132. Ямскова В.П., Резникова М.М. Адгезин-фактор из сыворотки крови животных и человека // Журнал общей биологии. 1984. т.45, N3, с.373-382.

133. Ямскова В.П., Резникова М.М. Сравнительное исследовние адгезина из эмбриональной сыворотки и сыворотки взрослых особей теплокровных //Журнал общей биологии. 1984. т.46, N5, с.697-703.

134. Туманова- Н.Б., Попова Н.В., Ямскова В.П. Влияние макромолекулярных адгезионных факторов на пролиферацию гепатоцитов в органных культурах эмбриональной печени мышей // Известия Акад. наук, серия биол. 1996. N6. С. 653-657.

135. Wilson С.М. Staining of proteins on gel: comparision of dyes and procedures // Methods in Enzymol. 1983. V. 91. P. 236 247.

136. Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А., Худяков И.В. Воздействие химических агентов в сверхмалых дозах на биологические объекты //(1990) Изв. РАН, серия биол. N2. С.184-193.

137. Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А., Мальцева Е.Л. Сверхслабые взаимодействия химических соединений и физических факторов на биосистемы.//(2004) Биофизика. Т. 49. №. 3. С. 551-564.

138. Сазанов Jl.А., Зайцев С.В. Действие сверхмалых доз (10-18-10-14) биологически активных веществ: общие закономерности, особенности и возможные механизмы //(1992) Биохимия. Т.57(10). С.1443-1459.

139. Гундорова Р.А., Хорошилова-Маслова И.П., Ченцова Е.В., Илатовская J1.B., Ямскова В.П., Романова И.Ю. Применение адгелона в лечении проникающих ранений роговицы в эксперименте // (1997) Вопросы офтальмологии. Т.113. N2. С. 12-15.

140. Гундорова Р.А., Ченцова Е.В., Ямскова В.П., Романова И.Ю. Применение нового фармакологического препарата Адгелон в офтальмологии //(2000) Онтогенез. Т.31. N4. С. 272-273.

141. Каспаров А.А., Розинова В.Н., Ямскова В.П. Питательная среда с Адгелоном для консервации роговицы донора // (2000) Онтогенез. Т.31. N4. С. 273-274.

142. Nicola N. Guidebook to Cytokines and Their Receptor. // (1994) Oxford University Press. O.-Y.-T., 176p. 261.

143. Пальцев M.A. Цитокины и их роль в межклеточных взаимодействиях // (1996) Архив патологии. Т. 58, иом. 6, 3-7.

144. Ковальчук J1.B. Новый класс биологически активных пептидов -иммунноцитокинов в клинической практике // (1997) Российский медицинский журнал, ном. 1, 59-61.

145. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные имуномодуляторы // (1992) СПб. Гиппократ. 256.

146. Хаитов P.M., Манько В.М., Алексеев Л.П., Назаров Ш.Н., Литвинов В.И., Ярилип А.А. Иммуногенетика и иммунология, резистентность к инфекции. // (1991) Ташкент. Изд. им. Ибн Сины. 456.

147. Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы её функционирования в норме и при патологии // (1997) Иммунология, ном. 5, 7-14.

148. Turrin N.P., Plata-Salaman C.R. Cytokine-cytokine interactions and the brain // (2000) Brain Research Bulletin, v.51, №1, 3-9.

149. Krantic S. Peptides as regulators of the immune system: emphasis on somatostatin // (2000) Peptides, v.21, №12, 1941-1964.

150. Dantzer R., Konsmann J.-P., Bluthe R.-M., Kelley K.W. Neural and humoral pathways of communication from the immune system to the brain: parallel or convergent? // (2000) Autonomic Neuroscience. v.85, №1-3, 6065.

151. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Влияние экстрактов из гипотоламуса и эпифиза на некоторые функции организма // (1971) Ленинград. Материалы научной конференции слушателей Военно-мед. академии им. С.М. Кирова. 127-128.

152. Кузник Б.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Цитомедины: 25-летний опыт экспериментальных и клинических исследований // (1998) СПб. Наука. 310.

153. Анисимов В.Н., Мирецкий Г.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Влияние полипептидных факторов тимуса и эпифиза на радиационный канцерогенез // (1982) Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. № 7. 80-82.

154. Анисимов В.Н., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Увеличение продолжительности жизни и снижение частоты опухолей у мышей под влиянием полипептидных факторов тимуса и эпифиза // (1982) Доклад АН СССР. Т. 263, № 3. 742-745.

155. Анисимов В.Н., Дильман В.М., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Снижение порога чувствительности гипотоламо-гипофизарной системы к действию эстрогенов под влиянием экстракта эпифиза у старых самок крыс// (1973) Доклад АН СССР. Т. 213, № 2. 483-485.

156. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Характеристика и изучение механизма действия фактора тимуса (тимарина) // (1978) Доклад АН СССР. Т. 240, № 4. 1004-1007.

157. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Выделение из костного мозга, лимфоцитов и тимуса полипептидов, регулирующих процессы межклеточной кооперации в системе иммунитета // (1981) Доклад АН СССР. Т. 261, № 1. 235-239.

158. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Новый класс биологических регуляторов многоклеточных систем цитомедины // (1983) Успехи современной биологии. Т. 96, № 3(6). 339-352.

159. Малинин В.В., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Пептидные тимомеметики // (2000) СПб. Наука, 158.

160. Короткое A.M., Жуков В.В., Хавинсон В.Х., Дейгин В.И. Влияние тималина и синтетического пептида тимуса на активность ферментов метаболизма пуриновых нуклиотидов в тимоцитах // (1988) Биохимия — медицине. Ленинград. 198-199.

161. Morozov V.G., Khavinson V.Kh. Pharmaceutical preparation for the therapy of immune deficiency conditions. // (1996) United States Patent № 5, 538, 951.

162. Демидов С.В. Молекулярно-генетические и клеточные механизмы фармакологического действия препаратов из тимуса (тималина, тимогеиа, вилозена) // (1991) Автореферат дис. др. мед. наук. Киев. 45.

163. Anisimov V.N., Khavinson V.Kh., Morozov V.G. Effect of synthetic dipeptide Thymogen (Glu-Trp) on life span and spontaneous tumor incidence in rats // (1998) the Gerontologist, V. 38, 7-8.

164. Anisimov V.N., Khavinson V.Kh., Morozov V.G. Immunomodulatory synthetic dipeptide L-Glu-L-Trp slows down aging and inhibits spontaneous carcinogenesis in rats // (2000) Biogerontology, V. 1, 55-59.

165. Анисимов B.H., Соловьев M.B. Эволюция концепций в геронтологии // (1999) СПб. Эскулап, 130с.

166. Хавинсон В.Х., Мыльников С.В. Влияние тетрапептида эпифиза на состояние антиок4сидантной защиты Drosophila melanogaster // (2000) Бюл. Эксперим. Биологии и медицины. Т. 129, № 4. 420-422.

167. Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Попучиев В.В., Южаков В.В., Котлова Л.Н. Влияние пептидов пинеальной железы на нейроэндокринные взаимосвязи после пинеалэктомии // (2001) Арх. патологии. № 3. 18-21.

168. Анисимов В.Н., Рейтер Р. Функция эпифиза при раке и старении // (1990) Вопросы онкологии. Т36, № 3. 259-268.

169. Гончарова Н.Д., Хавинсон В.Х., Лапин Б.А. Регулирующее влияние эпиталона на продукцию мелатонина и кортизола у старых обезьян // (2001) Бюл. Эксперим. Биологии и медицины. Т. 131, № 4. 466-468.

170. Moore В.Е. A soluble protein characteristic of the nervous system. // (1965) Biochem. Biophys. Res. Commun.V. 19(6). P. 739-744.

171. Dannies P.S., Levine L. Structural properties of bovine brain S-100 protein. // (1971) J. Biol. Chem. V. 246. P. 6276-6283.

172. Schafer B.W., Heizmann C.W. The S100 family of EF-hand calcium-binding proteins: function and pathology. // (1996) TIBS. V. 21. P. 134-140.

173. Donato R. Effects of calcium-binding proteins (S-100a(o), S-lOOa, S-100b) on desmin assembly in vitro. // (1996) In 4th European Symposium on Calcium Binding Proteins in Normal and Transformed Cells. Perugia.Italy. 91-92.

174. Zimmer D.B., Cornwall E.H., Landar A., Song W. The S-100 protein family: history, function, and expression.// (1995) Brain Research Bulletin. V. 37. P. 417-429

175. Persechini A., Moncrief N.D., Kretsinger R.H. The EF-hand family of calcium-modulated proteins. // (1989) TINS. V. 12. P. 462-467.

176. Fano G., Biocca S., Fulle S., Mariggio M.A., Belia S., Calissano P. The S-100: A protein family in search of a function // (1995) Progress in Neurobiology. V. 46. P. 71-82.

177. Donato R. Perspectives in S-100 protein biology. // (1991) Cell Calcium, v.12, 713-726.

178. Santella L. The role of calcium in the cell cycle: facts and hypotheses. // (1998) Biochem Biophys Res Commun,. V. 244(2). P. 317-24.

179. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами // М.: Изд. "Наука". 1983. 304с.

180. Практическая химия белка. Под ред. А. Дарбре.// ( 1989) М.: «Мир», с.301 303.

181. Hames B.D. One-dimensional gel electrophoresis of proteins. In Gel Electrophoresis of Proteins.A Practical Approach (B.D. Hames and D. Rickwood, eds.).// (1990) Oxford University Press. New York. 106 P.

182. Andrade M.A., Chacon P., Merelo J.J., Moran F. Evaluation of secondary structure of proteins from UV circular dichroism spectra using anunsupervised learning neural network.// (1993) Prot. Eng. V. 6(4). P. 383390.

183. Ogata A.M., Muramatsu Т., Kobata A.// ( 1977) Arch. Biochem. Biophys. V.181. P. 353-358.

184. Risley J.M., Van Etten R.L.// (1985) J. Biol. Chem. V.260. P. 1548815494.

185. Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C. Measurement of protein using bicinchoninic acid //(1985) Anal Biochem. V. 150. P. 76 85.

186. Вашман А.А., Пронин И.С. Ядерная магнитная релаксационная спектроскопия.// (1986) Москва, Энергоатомиздат.

187. Филонов А.С., Гаврилко Д.Ю., Яминский И.В. Программное обеспечение для обработки трехмерных изображений «ФемтоСкан Онлайн». //(2005) М.: Центр перспективных технологий. 89 с. (http://www.nanoscopy.net).

188. Engvall Е., Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G //(1971) Immunochemistry. V.8. P. 871 874.

189. N. Sharon and Н. Lis. Lectins. //(1989) London New York Chapman and Hall, 127p.

190. Lee H.Y (Ed.). Fundamentals of Adhesion.// (1991) N.Y.: Plenum Press.

191. Olivier J. Drug Transport to Brain with Targeted Nanoparticles // (2005) The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. V.2. P.108-119.

192. Рамис E. К проблеме нуклеации (образования клеток) при самоорганизации наноструктур белка in vitro и in vivo //(2005) Ж. техн. физики. Т.75. С.107-113.

193. Рамис Е. Неравновесное состояние наноструктур белка при его самоорганизации //(2006) Ж. техн. физики. Т.76. С.121-127.

194. Lapillonne A., Clarke S.D., Heird W.C. Polyunsaturated fatty acids and gene expression.//(2004) Curr Opin Clin Nutr Metab Care., 7(2):151-6.

195. Sichel G., Scalia M., Corsaro C. Amphibia Kupffer cells // Microsc. Res. Tech. 2002. V.57. P.477-490.

196. Frangioni G, Borgioli G. Periodic changes in the organs involved in the erythropoiesis of anemic newts //(1987) J. Exp. Zool. V.243. P.409- 416.ч