Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование биологически активных в сверхмалых дозах регуляторных белков, выделенных из предстательной и молочной желез, а также молока

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование биологически активных в сверхмалых дозах регуляторных белков, выделенных из предстательной и молочной желез, а также молока"

На I

ва\ рукописи

V'

Назарова Полина Андреевна

Исследование биологически активных в сверхмалых дозах регуляторных белков, выделенных из предстательной и молочной желез, а также молока

03 00 02 биофизика 03 00.25 цитология, гистология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007 г

003071475

Работа выполнена в Институте элементорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН и в Институте биологии развития им Н К. Кольцова РАН

Научные руководители доктор химических наук, проф Игорь Александрович Ямсков и

доктор биологических наук Виктория Петровна Ямскова

Официальные оппоненты д б н Е лена Ивановна Доморацкая и

д х н Анатолий Сергеевич Кабанкин

Ведущая организация: Институт биохимии им А Н Баха РАН

Защита диссертации состоится 29 мая 2007 г в_часов на заседании Диссертационного

совета Д 002 238 01 при Институте химической физики им Н Н Семенова РАН по адресу 119991, Москва, ул Косыгина д 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им НН Семенова РАН

Автореферат разослан

2007г

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук

Л А Радкевич

Введение.

Актуальность темы.

В настоящее время одной из наиболее актуальных задач современной биофизики является изучение механизмов, лежащих в основе биологического действия эндогенных биорегуляторов, обеспечивающих поддержание органо-тканевого гомеостаза в организме млекопитающих В этом аспекте особое значение имеют исследования, касающиеся функционирования желез внешней и внутренней секреции Ввиду того, что основной функцией этих органов является секреция, то, несомненно, важно изучить состав секретов желез на предмет наличия в них новых биологически активных веществ Функционирование таких органов, как молочная и предстательная железа, достаточно хорошо изучено Известно множество факторов действующих в молочной железе, -гормонов, медиаторов, факторов роста, молекул внеклеточного матрикса и т д, которые модулируют важнейшие клеточные процессы (пролиферациию, миграцию, дифференцировку) в различные периоды функционирования молочной железы эмбриональный, постнатальный, пубертатный периоды, а также во время беременности, лактации, инволюции Молоко, являясь секретом молочной железы, имеет сложный, до конца не изученный состав Усиленно исследуются, в основном, питательные свойства данной уникальной биологической жидкости, а также способность иммуноглобулинов молока усиливать иммунитет потомства (Arnold, et al 1977, Bastian et al, 2001, Baumrucker, Erondu, 2000) Однако о наличии биологически активных регуляторных молекул в составе молока известно не так много При этом до конца не решена проблема усвоения молочных продуктов как младенцами, находящимися на искусственном вскармливании, так и взрослыми, потребляющими переработанное коровье молоко (Walker, 2004, Oddy, 2002, Hoppu, et al, 2001, Pourpak, 2004) Возможно, ключ к пониманию данной проблемы необходимо искать, исследуя биорегуляторы, входящие в состав молока

Основной функцией предстательной железы является поддержание определенного репродуктивного статуса организма Секрет, вырабатываемый предстательной железой, исключительно важен для сохранения жизнеспособности сперматозоидов — носителей генетической информации В состав секрета простаты входят разнообразные вещества витамины, белки, ферменты, а также простасомы, обеспечивающие функционирование сперматозоидов Тем не менее, до настоящего времени состав секрета остается не до конца выясненным (Abrahamsson, Lilja 1990, Chang et al, 1999, Davis et al, 2001)

Таким образом, представлялось целесообразным осуществить поиск новых биорегуляторов в предстательной, молочной железах, а также в молоке, изучить их специфическую активность, а также физико-химические свойства

Данная работа выполнена с помощью разработанного ранее нового методического подхода к исследованию эндогенных биорегуляторов, который включает комплекс адгезиометрических методов исследования тканей взрослых млекопитающих, а также метод выделения и очистки белков внеклеточного пространства, проявляющих биологическую активность в сверхмалых дозах (СМД) (Ямскова и др, 1977, Ямскова, Резникова, 1991, Ямсков и др , 1999) С помощью данного экспериментального подхода в различных тканях млекопитающих были обнаружены и далее исследованы низкомолекулярные, гликозилированные белки клеточного микроокружения (Ямскова и др , 1977, Ямскова, Резникова, 1991, Ямсков, Ямскова, 1998, Краснов 2003) Регуляторные белки (РБ) этой группы обладают целым рядом свойств, отличающих их от уже известных эндогенных биорегуляторов Было установлено, что данные белки оказывают влияние на клеточную адгезию, миграцию, пролиферацию, увеличивают жизнеспособность клеток при культивировании in vitro (Ямскова, Резникова, 1991, Ямскова, Туманова, 1994, Ямскова, Туманова, 1996, Ямсков, Ямскова, 1998) РБ данной группы оказывают влияние на работу основных ферментных систем в тканях и биосинтез белка Биологическая активность РБ проявлялась в СМД только в условиях сохранения контактных и адгезионных взаимодействий между клетками в ткани, а также пространственной организации межклеточного пространства (Ямскова и др, 1994, Ямскова, Туманова, 1994) Было установлено, что биологическая активность РБ не изменялась после воздействия различных физико-химических факторов изменения в широком диапазоне значений рН, температуры их растворов, а также действия протеаз, хелатирующих агентов, органических растворителей (Ямскова, Резникова, 1991, Ямсков и др, 1999) В водных растворах РБ образуют высокомолекулярные агрегаты На основании результатов, полученных при исследовании физико-химических свойств и биологической активности РБ, была разработана концепция создания фармакологических препаратов нового поколения (Ямсков, Ямскова, 1998) Однако РБ молока, молочной и предстательной желез до настоящего исследования не изучались Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилась идентификация новых РБ из предстательной, молочной желез и молока КРС, действующих в СМД, а также изучение их физико-химических и биологических свойств В отдельные задачи входили

1) Идентификация биологически активных в СМД РБ в предстательной и молочной железах, а также в молоке КРС

2) Исследование физико-химических свойств РБ, выделенных из молочной и предстательной желез, а также молока КРС

3) Изучение дозовой зависимости биологической активности исследуемых РБ с помощью метода биотестирования, в основе которого лежит мембранотропное действие РБ данной группы на клетки печени млекопитающих

4) Разработка новой экспериментальной модели т vitro для исследования специфической биологической активности РБ, выделенных из предстательной железы быка

5) Определение локализации исследуемых РБ в тканях предстательной и молочной желез млекопитающих

Научная новизна работы

В результате проведения данного исследования в ткани предстательной и молочной желез, а также в цельном молоке КРС были идентифицированы ранее не известные белки, проявляющие биологическое действие в СМД (10'8 — 10~'7 мг белка/мл) Из тканей желез данные белки были выделены, соответственно, в виде двух фракций - кислых и слабокислых белков с молекулярной массой менее 10 кДа, вторичная структура белков представлена, в основном, [i-структурами и статистическим клубком В растворах данные белки образуют наноструктуры с размером частиц от 100 до 400 нм По физико-химическим свойствам данные белки сходны с РБ, которые были идентифицированы в других тканях млекопитающих Для слабокислых РБ, выделенных из предстательной железы и молока, показана их внеклеточная пристеночная локализация в протоках и секретах соответствующих желез Для изучения специфической биологической активности идентифицированных кислого и слабокислого РБ предстательной железы быка была разработана новая экспериментальная модель роллерного органного культивирования ткани предстательной железы мыши in vitro, на которой было продемонстрировано стимулирующее действие на выработку секрета Практическая значимость.

Слабокислый РБ молока не был обнаружен в таких молочных продуктах, как сухое молоко и «Нутрилон 1», предназначенный для детского питания Эти данные показывают, что в процессе переработки молока происходит потеря РБ Учитывая тот факт, что РБ данной группы способны оказывать влияние на ход и направленность важнейших биологических процессов в тканях и организме млекопитающих, можно заключить, что приготовленные молочные продукты питания не содержат этого эффективного биорегулятора Представляется актуальной постановка вопроса о возможном

использовании слабокислого РБ молока в качестве биологически активной добавки при изготовлении молочных продуктов питания для людей разного возраста На основе кислого РБ предстательной железы быка разработан фармакологический препарат, который может быть использован в андрологии для улучшения репродуктивной функции у мужчин в качестве стимулятора образования секрета простаты, который исключительно важен для поддержания жизнеспособности и сохранения функции сперматозоидов

Апробация результатов исследования.

Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых Института биологии развития им Н К Кольцова РАН Москва, 8 декабря, 2004, на V Всероссийском научном семинаре и молодежной научной школе «Химия и медицина» Уфа, 5-8 сентября 2005, на конференции молодых ученых Института биологии развития им Н К Кольцова РАН Москва, 21 декабря, 2005 Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 139 страницах и включает следующие главы 1) Введение, 2) Литературный обзор, в котором рассмотрены изучаемые объекты молочная и предстательная железы с точки зрения их строения, структур ВКМ и функций Кроме того, отдельное внимание уделено свойствам и составу секрета молочной железы (молока) и предстательной железы Молоко в данной работе является самостоятельным объектом изучения Особое внимание обращено на многокомпонентность молока, являющегося сложной коллоидной системой, 3) Методическую часть, содержащую описание реактивов и методик, использованных в работе, результаты собственного исследования и их обсуждение, 5) Заключение и выводы Диссертация содержит 6 таблиц, 44 рисунка, 346 литературных ссылок

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из которых 3 являются оригинальными статьями

Результаты и их обсуждение.

В данной работе из молока, молочной и предстательной желез КРС были выделены и охарактеризованы с точки зрения физико-химических и биологических свойств РБ, действующие в СМД

Регуляторные белки молока, молочной и предстательной желез крупного рогатого скота• выделение и очистка. Первый этап данной работы относился к получению тканевых экстрактов молочной и предстательной желез КРС, которые получали стандартно, как это описано в предшествующих работах (Ямскова и др, 1977, Ямсков и др, 1999) исключая

механическую и ферментативную обработку ткани, что способствовало переходу в экстракт секретируемых белков (ЙЬазНоиа е1 а1, 1984) Данная методика является универсальной для получения биологически активных в СМД РБ из животных и растительных тканей (Краснов и др, 20036) Как правило, РБ содержатся во фракции надосадочной жидкости, получаемой после высаливания тканевых экстрактов и осаждения примесных белков Далее в настоящей работе исследовали супернатанты, полученные из соответствующих тканевых экстрактов Необходимо отметить, что для молока разработанная ранее методика отличается тем, что первый этап не включает в себя стадию получения тканевого экстракта, так как, по сути, молоко является одновременно биологической жидкостью организма и секретом молочной железы, но не тканью Таким образом, непосредственно в выдоенное коровье молоко добавляли сульфат аммония до получения насыщенного раствора соли Проведение данного этапа обусловлено тем, что до высаливания изучаемая группа РБ из разных тканей находится в связанном с белками-модуляторами состоянии, а после высаливания комплекс РБ-белок-модулятор распадается, и изучаемые белки переходят в супернатант (Ямскова, Резникова, 1984, Ямскова и др, 2004) При этом большинство примесных высокомолекулярных белков переходит в осадок (Ямскова, Резникова, 1991, Ямсков и др, 1999, Ямскова и др , 2004) Для идентификации в молоке РБ, биологически активных в СМД, было применено двукратное высаливание молока коровы сульфатом аммония и последующее изоэлектрофокусирование супернатанта, содержащего белки, растворимые в насыщенном растворе соли, а также последующая очистка надосадочной жидкости Аналогично производили высаливание препарата сухого молока и детского питания «Нутрилон 1» предварительно приготавливая растворы этих препаратов и получая фракции Таблица 1 Биологическая активность супернатантов тканевых экстрактов, молока, препаратов сухого молока и детского питания *)

Объект Степень разбавления Величина биологического эффекта (Эд%)**

Молоко 10" 137,33±8,07 (р<0,05)

Предстательна я железа 10ю 131,26*7,43 (р<0,05)

«Нутрилон 1» Не активен Не активен

*)В таблице приведены данные одного эксперимента из серии опытов для каждой исследуемой фракции **) величина биологического эффекта была определена методом биотестирования (см раздел 2 10 диссертации)

супернатантов После диализа и удаления соли из препарата, все полученные на этой стадии очистки супернатанты были исследованы методом биотестирования Было показано, что супернатанты тканевого экстракта предстательной железы и цельного молока проявляли биологическую активность в СМД (см Табл 1)

Супернатант из препарата детского питания «Нутрилон 1» оказался биологически неактивным Было предположено, что в тканевом экстракте предстательной железы и цельном коровьем молоке присутствуют РБ, биологически активные в СМД, а в препарате детского питания «Нутрилон 1» они не содержатся Полученные супернатанты молока, молочной и предстательных желез далее подвергали разделению с помощью ИЭФ, метода, условия которого были отработаны для РБ данной группы (Ямсков, и др, 1999) Картина разделения для супернатанта предстательной железы (Рис 1) представлена ниже Характер разделения супернатантов молока, молочной железы и сухого молока был

аналогичен

Рис. 1 Изоэлектрофокусирование в градиенте концентрации сахарозы и рН от 3,5 до 10,0 супернатанта предстательной железы быка По ординате 1-значения рН, соответствующие номерам фракций По ординате 2-значения оптической плотности соответствующих фракций при длине волны 280 нм, по абсциссе - номера фракций

После ИЭФ собирали фракции кислых (рН=1,5-1,8), слабокислых (рН=4,5-5,6) и основных белков (рН=8,2-12,3), поскольку ранее было показано, что именно эти фракции проявляют биологическую активность в СМД (Ямсков и др, 1999, 2001) Таким образом, на данном этапе очистки были получены и далее изучены следующие белковые фракции фракции кислого, слабокислого и основного РБ предстательной железы, фракция кислого, слабокислого и основного РБ молочной железы фракции кислого, слабокислого и основного РБ молока,

Были определены концентрации изучаемых препаратов, при которых наблюдалось мембранотропное действие В данном исследовании биологическая активность, определяемая методом биотестирования, не была обнаружена во всех полученных фракциях основных белков, поэтому эти фракции далее не изучали На основании результатов, полученных при применении метода биотестирования, можно сделать заключение о принадлежности содержащихся в исследуемых фракциях белков к определенной группе РБ, проявляющих биологическую активность в СМД (Ямскова, Резникова, 1991, Ямсков и др 1999) Данные по биологической активности указывают на отсутствие белков данной группы в препаратах сухого молока и детского питания «Нутрилон 1» В процессе переработки молока коровы, в частности, нагрева до высоких температур, некоторые биологически активные адгезивные факторы просто разрушаются, например, фибронектин (Sato, Hayashi, 1985) Можно предположить, что при получении сухого молока и «Нутрилона 1» из молока коровы могут инактивироваться и другие биологически активные факторы Предпринятая в данном исследовании попытка идентифицировать в сухом молоке и в смеси для детского питания РБ, проявляющие биологическую активность в СМД показала, что РБ данной группы в исследуемых пищевых продуктах отсутствуют Возможно, что при проведении технологического процесса, включающего стадии пастеризации, сгущения и сушки, РБ безвозвратно теряются и не обнаруживаются в конечном продукте В таблице 2 представлены основные характеристики получаемых в процессе очистки РБ-содержащих фракций

Таблица 2. Характеристики фракций РБ, полученных в процессе очистки

Объект Фракция Объем (мл) Концентрация (мг/мл)

Супернатанта 200 Не идентифицировалась

Цельное Слабокислого РБ 5 0,075

молоко Кислого РБ 8 0,40

Цельное молоко без высаливания Слабокислого РБ 5 Не определяли

Супернатанта 200 Не идентифицировалась

Предстательная Слабокислого РБ 2,5 1,0

железа Кислого РБ 3 1,0

Супернатанта 200 Не идентифицировалась

Молочная железа Слабокислого РБ 4,5 1,0

Кислого РБ 2 0,11

Следует отметить, что ВО фракциях супернатантов с помощью применяемого количественного метода не удалось определить концентрацию белка и растворе. Данный эксперименгаиьно установленный факт, очевидно. отражает свойство, присущее РБ данной группы, которое связано си способностью РБ присутствовать » раствощ е виде ассоциатов.

Фракции слабокислой) РБ молока и слабокислого РБ предстательШй железы изучали далее ввиду того, ч ш рапсе обнаруженный биологически активный в СМД сывороточный слабокислый РБ имеет уникальные биологические п физико-химические свойства (Яйсков и др. 2001).

Локали зации слабокислого PU молоки и слабокислого РБ предстательной железы н тканях молочной к предсматеЖШой жн и es, соответственно. Для проведения данного эксперименту первоначально были получены антисыворотки кролика, содержащие полпклональные антитела к слабокислому РБ молока и слабокислому :):> предстатслы сой железы. Иопо'н.зуя потикао! пльные антитела, удалось обнаружить пристеночную локализацию слабокислого РБ молока во внутреннем просвете протока лакгируюшей молочной железы крыей (Рис. 2а.). Выбор молочной железы крысы не имеет принципиальной) чпачеиия. гак как ранее было показано, что исследуемые РБ не обладают видовой специфичностью (>1мскоип и др., 19776: Я «скова, Резникова, 1991; Краснов и др., 2003а).

Рис. 2а. Рис. 26.

Ряс. 2, Локализация слабокислых РБ молока и предстательной железы в тканях .'¡актирующей железы крысы (2а) и предстательной железы мыши (26). соответственна {указаны стрелкой; ув. ок. \ 10. об. х 40).

Слабокислый РБ предстательной железы, как выяснилось, также имел пристеночную локализации и протоках данной железы (Рис. 26.). Результаты, полученные при исследовании локализации слабокислого i'ij молока и слабокислого РБ п ре летательной железы в соответствующих пеанах, позволяют сделать вывод о том, что исследуемые РБ являются секретпреемыми белками и входят и качестве биологически активных факторов

в состав соответствующих секретов Общим для данных секретов является присутствие в них белков сыворотки крови, а именно сывороточного альбумина, который не синтезируется данными железами, а проникает как в молоко, так и в секрет простаты из сыворотки крови (Burgoyne, Duncan, 1998, Shennan, Peaker, 2000, Monks, Neville, 2004, Kim, et al, 2004) Обращает на себя внимание тот факт, что значения изоэлектрической точки двух РБ, выделенных из молока и предстательной железы, находятся в интервале рН 4,5-5,6 И именно в этом диапазоне значений рН лежат значения изоточек сывороточного альбумина и РБ, выделенного из сыворотки крови (Ямскова, Резникова, 1991)

Исследование влияния в СМД кислого и слабокислого регуляторных белков, выделенных из предстательных желез КРС, на состояние предстательных желез мышей в условиях роллерного культивирования in vitro В настоящее время существуют различные способы исследования состояния ткани простаты m vi tro используют различные культуры клеток железы, в том числе, и самостоятельные линии малигнизированных клеток простаты, последние, как правило, являются, производными трех линий РС-3, DU 145, и LNCaP (Peehl, 2005) Превалирующая тенденция в этих экспериментах направлена, прежде всего, на выяснение механизма канцерогенеза Однако для этого необходимо понимание функционирования ткани простаты в норме Для выяснения этих механизмов были разработаны различные способы культивирования клеток и ткани простаты Сложность культивирования простаты состоит в ее гетерогенности, определяемой на органном и клеточном уровнях Например, по современной классификации, эпителий простаты включает в себя несколько фенотипов клеток (Parnsh, et al, 2002) На данный момент сформулирована общая концепция относительно того, что результаты, полученные при изучении клеточных культур, не могут в полной мере отражать функционирование целостного органа ввиду утраты межклеточных адгезивных взаимодействий, присущих данной ткани, в частности, стромально-эпителиальных (Parrish, et al, 2002) Таким образом, наиболее перспективным и правильным является исследование органа с максимальным приближением создаваемых условий культивирования к условиям его функционирования in vivo Данная концепция была принята во внимание в настоящей работе, в которой осуществляли органное культивирование целых долей простат взрослых особей мышей Настоящее исследование имело своей целью изучение влияния в СМД РБ предстательной железы КРС на состояние простат взрослых особей мышей при культивировании in vitro При культивировании целых, не разделенных на фрагменты, долей простат сохранялась структура данного органа, для каждой экспериментальной точки существовал свой контроль, то есть у мыши

брали две передние доли предстательной железы, одну долю помещали в контрольный флакон со средой, а другую в опытный Таким образом, нивелировались внутривидовые и индивидуальные отличия животных Следует также отметить, что из всех существующих способов культивирования было выбрано именно роллерное культивирование При помещении флакона со средой и органной культурой на вращающийся роллер, ткань лишается возможности длительно адгезионно взаимодействовать с подложкой (стенками и дном флакона) Таким образом, данный тип адгезии отсутствует В литературе представлено большое количество данных, свидетельствующих о том, что клеточная адгезия является важнейшим регуляторным фактором, определяющим ход и направленность основных биологических процессов клеточной миграции, пролиферации и дифференцировки (например, Anderson, 1990, Turner, 1992)

Нами изучалось влияние в СМД РБ, выделенных из простаты, на состояние ткани этой железы in vitro Для этой цели использовали модель органотипического культивирования предстательной железы мыши т vitro Эта модель была выбрана на основании ранее полученных результатов, которые показали, что биологическая активность РБ данной группы проявляется только в условии сохранения структуры межклеточного пространства ткани (Ямскова и др , 1990, Ям скова и др, 1994) Был выбран срок культивирования долей простат мышей, соответствующий 24 часам За этот период времени в культивируемой ткани предстательной железы наблюдали значительную гибель клеток секреторного эпителия (контроль), тем не менее, ткань продолжала оставаться жизнеспособной, особенно в краевых зонах, сохраненной оставалась структура отдельных желез и протоков В контрольных культурах (Рис 4а) наблюдалось отсутствие выработки секрета При добавлении в питательную среду в СМД кислого РБ и слабокислого РБ предстательной железы, соответственно, наблюдали совершенно иную картину в ткани происходила активная выработка секрета В органных культурах железы, которые культивировали с кислым РБ (Рис 46 ), ткань усиленно продуцировала секрет однородной консистенции, при добавлении слабокислого РБ (Рис 4в) вырабатываемый секрет был гранулярным Мы предполагаем, что стимулирующее влияние изучаемых РБ на секреторную функцию эпителиальных клеток простаты настолько сильное, что оно вызывает истощение и приводит гибели секреторных клеток в условиях органного культивирования железы in vitro Таким образом, данная модель позволила выявить такое свойство РБ, выделенных из предстательной железы, как стимуляция секреторной функции клеток простаты

* \

РИС. 4n,

[>ILC. Ал. Put. 46.

Рис. 4. Поперечные срезы простат мышей, культивированных и течение 24 ч (а -контроль, без добавления препаратов РЬ: б- с добавлением кислогб РБ предстательной железы (10 111 мг/мл); и - с добавлеНЙЁм слабокислого PB предстательной железы (10 ~ mi/мл)). Увеличение: окуляр I Ох. объектив 20х.

Исследование РБ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии Слабокислый РБ молока и слабокислый РН предстательной желечы были изучены е помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. I ïpft обращенно-фазовой хроматографии разделение происходит по Принципу гидрофобного взаимодействия белков с неподвижной фазой, го есть результат разделения зависит от структуры и экепонированности гидрофобных доменов белка (Остерман, i985), lia Рис, 5. представлена картина обращен но-фазббЬй хроматографии фракции слабокислого РБ молока. Характер разделения слабокислого РН предстательной железы аналогичен

Ski

.-î

■ К

Рис; 5. Хроматограмма разделения слабокислого РБ молока.

При хроматографии обеих фракции были идентифицированы пики разной интенсивности, однако, необходимо отметить, что все они как бы Подразделяются на две основные фракции - гидрофильную, характеризующуюся временем удержания 3-4 мин, и гидрофобную с временем удержания 11-14 мин. Фракции слабокислого РБ молока идентифицированные с помощью В')ЖХ были Собраны и изучены с помощью метода

биотестирования Было установлено, что мембранотропную активность проявляют фракции РБ молока, время удержания которых составляет, соответственно, 3,60 мин и 5,19 мин (см Табл 3) Методом обращенно-фазовой ВЭЖХ была исследована низкомолекулярная фракция слабокислого РБ предстательной железы, полученная после электрофореза в ПААГ, проведенного в условиях, исключающих денатурацию белка Собранные фракции также исследовали с помощью биотестирования и биологически активные фракции характеризовались временем удержания 3,20 мин, и 11,46 мин, соответственно (см Табл 3) В аспекте высказанного предположения о связи слабокислых РБ, обнаруженных в молоке и тканевом экстракте предстательной железы с РБ сыворотки, последний был изучен методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в тех же условиях (препарат РБ сыворотки был любезно предоставлен аспирантом ИНЭОСа им А Н Несмеянова РАН Вечеркиным В В ) Было показано, что ИЭФ-фракция РБ сыворотки крови, значение р1 которого лежит в интервале значений рН 4,5-5,1, при обращенно-фазовой хроматографии в аналогичных условиях разделялась на две биологически активные фракции, соответственно, характеризующиеся временами удержания 3,39 и 13,58 мин Полученные результаты указывают на различия сравниваемых этим методом хроматографии фракций РБ, выделенных из молока и предстательной железы, соответственно, с фракцией РБ сыворотки крови Самое главное отличие между ними заключается во времени удержания биологически активных ВЭЖХ фракций (Табл 3 ) Таблица 3 Характеристики биологически активных ВЭЖХ-фракций, выделенных из

молока и предстательной железы

Изучаемая фракция Время удержания ВЭЖХ-фракций (мин) Степень разбавления ВЭЖХ-фракции в которой проявляется ее биологическая активность* Величина биологического эффекта (Эд%)*

Слабокислый РБ молока 3,60 107 146± 19% (р<0,05)

5,19 109 154±10% (р<0,05)

Слабокислый РБ предстательной железы, полученный после электрофореза в ПААГ 3,20 103 140±18% (р<0,05)

11,46 103 137±12% (р<0,05)

*) Величина биологической активности была определена методом биотестирования (см раздел 2 10 диссертации)

Эти данные указывают на различия в составе биологически активных компонентов сравниваемых фракций РБ Обращает на себя внимание тот факт, что биологически активной была гидрофильная фракция, время удержания которой характеризуется интервалом 3-4 мин Очевидно, что фракция, элюируемая в отсутствие ацетонитрила представляет собой белковый компонент, тем более, что идентификацию ВЭЖХ-фракций проводили при 280 нм

Исследование гидродинамического радиуса частиц РБ в водных растворах С помощью метода динамического светорассеяния были исследованы растворы слабокислого РБ молока, слабокислого и кислого РБ предстательной железы Для растворов фракций данных РБ были экспериментально определены гомодинные автокорреляционные функции В качестве примера приведена корреляционная функция рассеяния света слабокислого РБ молока (Рис 6 )

Рис 6 Корреляционная функция рассеяния света слабокислого РБ молока, измеренная под углом 60 градусов

После обработки полученных корреляционных функций с помощью программы СОИТШ

были получены распределения по кажущимся величинам Пример

распределения для раствора слабокислого РБ молока приведен на рис 7

01 > 10 1С0 1ГО0 1000)

R, nm

Рис. 7. Кривая распределения значений К(Ь) частиц в растворе слабокислого РБ молока

Были определены средние значения коэффициента диффузии (О) и Яь при значениях углов рассеяния от 40 до 130° Для определения истинной величины Яи были построены графики У/К/, = /(.пп2&2') с использованием программы Ог^ш 7 0 Графическое экстраполирование усредненных данных позволяет оценить размеры частиц при величине угла рассеяния 0° Таким образом, усредненное значение гидродинамического радиуса для слабокислого РБ молока составило Яь=87,8 нм, для слабокислого РБ предстательной железы - 1^=69,3 нм, для кислого РБ предстательной железы 1^=114,4 нм В качестве примера приведено определение для слабокислого РБ молока (Рис 8 )

Рис 8 Определение Rh при 0 = 0° для слабокислого РБ молока Значения гидродинамического радиуса частиц водных растворов РБ значительно превышают показатели, измеренные для других, более крупных, белков Так гидродинамический радиус мономерной формы актина, имеющей молекулярную массу 42 кДа, составляет 2,8±0,1 нм (Kanzaki et al, 2006), для IgG (молекулярная масса 150 кДа) -5,29 нм, для IgA (молекулярная масса 162 кДа) - 6,5 нм (Armstrong et al, 2004)

Молекулярная масса низкомолекулярных фракций РБ, оцениваемая как 8-10 кДа ниже тех значений, которые имеют белки, описанные выше, тогда как величина гидродинамического радиуса у РБ больше, чем у этих белков Величина Rh, рассчитанная для РБ, свидетельствует о существовании в водных растворах ассоциатов молекул данных белков Кроме того, размеры этих ассоциатов намного превышают размеры, характерные для биомолекул, образующих, так называемые, наноструктуры Как известно, одним из свойств наноструктур, в частности, наноструктур белковых молекул является способность к самосборке (Рамис, 2005, 2006) Процесс самосборки наноструктур исследуемых РБ в секретах соответствующих желез является предметом отдельного исследования Особенно этот процесс интересен ввиду того, что, по литературным данным, ряд веществ, ассоциаты которых являются наноразмерными 10-100 нм по данным химических исследований (Сш et al, 2004) и 10-1000 нм по данным биологических исследований (Olivier, 2005), обладают уникальными физико-химическими характеристиками и биологическим действием (Рамис, 2005) Такие особенности свойств веществ, проявляемых их наночастицами, соотносятся с некоторыми обнаруженными особенностями физико-химических свойств, проявляемых РБ Присутствие РБ в водных растворах в виде наночастиц, очевидно, обусловливают проявление ими таких свойств, как резистентность к действию различных физико-химических факторов (повышенная температура, экстремальные значения рН и т д ), а также проявление биологической активности в СМД Следовательно, дальнейшее изучение способности изучаемых РБ к проявлению указанных выше свойств, обусловленных, вероятно, способностью образовывать крупные ассоциаты, находится в русле общих тенденций науки в изучении самоорганизации наночастиц Таким образом, проведенные эксперименты позволяют сделать вывод о присутствии в водных растворах наноразмерных ассоциатов РБ, а именно РБ, выделенных из молока и предстательной железы КРС При этом значения гидродинамического радиуса варьируют в области от 69 нм (для слабокислого РБ предстательной железы) до 114 нм (для кислого РБ предстательной железы) Далее предпринималась попытка подтвердить данные, полученные методом динамического светорассеяния, с помощью другого метода -атомно-силовой микроскопии

Исследование состояния РБ с помощью атомной силовой микроскопии Предметом исследования нанохимии являются соединения существующие в виде наноразмерных частиц Среди основных объектов нанохимических исследований можно отметить фуллерены (кристаллы, растворы), молекулы белков (растворы, кристаллы), молекулы полимеров (золи, гели), нанокристаллы неорганических веществ и др (Мелихов, 2002) Одним из перспективных направлений современной фармакологии

является разработка на основе нанотехнологий новых фармакологических препаратов, характеризующихся, к отличие от применяемых в настоящее время лекарственных средств. проявлением специфических, ргшее ис известных свойств. Ранней было высказано предположение о возможном применении паночастин лекарственных веществ как препаратов, Обладающих сверхточной доставкой к органу-мишени п. кроме того, проявляющих новые свойства за счет своего напоразмерпого состояния (Кгеикг, 1978). Наночастмщз изучают с помощью различных физико-химических методов. Одним из современных методов исследования веществ в виде паночастин является атомная силовая микроскопия. В настоящей работе с помощью данного метода оценивались распределение и размер частиц, присутствующих в растворе слабокислого РЕ молока (Рис. У.}.

IIII1 ЛЛ] <П, Чц ЧВгп

Рис. У. Надочастнцы слабокислого РБ молока па подложке (слюде).

При анализе данных, а именно профиля поверхности после нанесения на скол слюды

раствора слабокислого РЬ молока можно отметить, что размеры видимых в микроскоп

частиц различны и варьируют от 40 до 140 нм. Не имея данных по значениям

гидродинайическото радиуса частиц исследуемых РБ, мйжш-, было бы предположи^ чщ

молекулы РЬ собираются в наноструктуры после нанесения на подложку. Однако,

оценивая данные полученные динамическим свегорассенваннем можно сказать, что

частицы слабокислого РБ молока присутствуют и виде наноструктур со средним

диаметром 100 и более нанометров, именно находясь в растворенной форме. Обращает на

себя внимание упорядоченность полученных структур (Рис, 9.). Вероятно, молекулы

изучаемых РБ при нанесечки на подложку проявляют тенденцию к образованию

организованной «сеточки». На основании данных проведенного исследования, можно

предположить, что состав идентифицированных в растворах наночастиц, очевидно,

сложный, а именно, кроме белкового фрагмента в I'fi входят углеводы и диинды. Ранее

было показано, что фракции Р!> выделенные из различных тканей млекопитающих.

содержат в своем составе олпгомаппотдпые цепи (Ямсков и др., 2001). Методом

биотестирования, было показано, что биологическую активность в СМД проявляли только те олигосахариды, которые содержали терминальные остатки маннозы со связью а(1-2) (Рыбакова, 2005) На основании результатов, полученных при обращенно-фазовой ВЭЖХ, можно высказать предположение о присутствии липидов в обнаруженных наночастицах Поэтому представляется вероятным, что РБ содержат липиды и олигасахариды определенной структуры

Исследование РБ с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) Для определения значений молекулярной массы слабокислых РБ молока и предстательной железы был проведен электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях Было установлено, что основным компонентом данных фракций являются низкомолекулярные белки со значением «кажущейся» молекулярной массы менее 10 кДа В качестве примера на Рис 10 приведена элеетрофореграмма разделения слабокислого РБ предстательной железы

кДа 1 2

94 67 45

30

20

14 4

Рнс. 10. Электрофореграмма разделения белков в 15%-ном полиакриламидном геле слабокислого РБ предстательной железы 1 - маркерные белки, 2 - белок предстательной железы

Как видно, доминирующим компонентом фракции является низкомолекулярный белок Низкомолекулярные фракции слабокислого РБ молока и слабокислого РБ предстательной железы были препаративно наработаны путем элюирования из гелей фракций белков, характеризующихся значением ЯГ 0,90±0,05 после проведения электрофореза в условиях, исключающих денатурацию белка Эти фракции также исследовали методом биотестирования Слабокислые РБ предстательной железы и молока, полученные после электрофореза в ПААГ проявляли биологическую активность в 1012 (ЭА%= 130,8% ± 15,55) и 1015 (ЭА%= 150,9% ± 25,36) степенях разбавления, соответственно Далее полученные методом электрофореза в ПААГ РБ исследовали с помощью таких методов, как, круговой дихроизм и ядерный магнитный резонанс

Исследование вторичной структуры слабокислого РБ предстательной железы и слабокислого РБ молока с помощью кругового дихроизма

Для исследуемых РБ, полученных после электрофореза, была определена вторичная структура методом кругового дихроизма Результаты обсчета полученных данных показали, что все исследуемые фракции содержат белки, вторичная структура молекул которых сходна и относится к (3-типу (более 20%) (Табл 5 ) Таблица 5 Характеристики структур изучаемых РБ

РБ а- спираль р-складки (антипараллельные) Р-складки (параллельн ые) Р-изгибы Статистический клубок

Слабоки слый РБ молока 6,2 ± 0,5 % 45,7 ± 0,6% 3,6 ±0,8% 16,0 ± 1,1 % 28,5 ± 3,2 %

Слабоки слый РБ предстат ельной железы 6,4 ± 0,1% 47,1 ±0,2% 3,7 ± 0,3 % 14,1 ±0,1 % 28,7 ±1,5%

Обращает на себя внимание большое сходство изученных РБ Следует также отметить, что РБ, полученные из других тканей позвоночных животных, имели сходный тип вторичной структуры (Ямсков и др, 2001)

Исследование РБ с помощью ядерного магнитного резонанса Полученные после электрофореза в ПААГ слабокислые РБ молока и РБ предстательной железы были исследованы методом спектроскопии ЯМР'Н В качестве примера на Рис 11 приведен ЯМР'Н -спектр слабокислого РБ предстательной железы

1 1 ...__У 1 \ 1

Рис. 11. ЯМР'Н -спектр слабокислого РБ предстательной железы (бООмГц)

При подробной расшифровке полученных ЯМР'Н-спектров подтвердились

предположения о присутствии в составе изучаемых РБ липидных компонентов (общее для

РБ молока и РБ простаты значение химического сдвига соответствует 8 1,22 мд), углеводных компонентов (значения химических сдвигов 5 3,47 м д - для РБ молока и б 3,90 м д - для РБ простаты) и некоторых аминокислот (аланин (б 1,46 м д ), глицин (3,54 м д ), лейцин (3,69 м д) - для РБ молока и лизин (8 1,48 м д), глутамин (2,09 м д ), пролин (3,45 м д), тирозин (6,87 м д) - для РБ простаты) Оба РБ сходны по составу, но не идентичны Было проведено также сравнительное исследование ЯМР'Н -спектров РБ, выделенных, соответственно, из молока и предстательной железы и ЯМР'Н -спектра, полученного для сывороточного РБ, характеризующегося значением pi в области рН 4,55,1 (Ямскова, Резникова, 1991, Ямсков и др , 2001) После расшифровки данного спектра сложилось впечатление относительно того, что сывороточный РБ является более сложным по составу белком, но мотивы, обнаруженные в структуре сывороточного РБ сходны с мотивами, обнаруженными в структурах РБ молока и простаты Изучаемые РБ характеризуется, по данным электрофореза, высокой подвижностью в ПААГ, что свидетельствует о низком значении молекулярной массы — приблизительно 1 кДа, однако при диализе с использованием мембран с диаметром пор, соответствующих молекулярной массе 8-10 кДа, не происходит выхода РБ из диализуемого раствора, результаты исследований растворов РБ методами динамического светорассеивания и атомно-силовой микроскопии показали присутствие в растворах РБ наноразмерных частиц, содержащих белки, детектируемых при длине волны 280 нм, по данным обращенно-фазовой ВЭЖХ в изучаемых фракциях РБ присутствуют белки, обладающие выраженными гидрофильными и гидрофобными свойствами Логично предположить, что именно эти белки входят в состав наночастиц, обнаруженных в растворах РБ Преобладание во вторичной структуре РБ p-структур обусловливает способность данных белков к образованию межмолекулярных ассоциатов (Ross, Poirier, 2004) Более того, наблюдаемые в растворах РБ наночастицы весьма крупны в сравнении с размерами наночастиц, образуемых другими белками (Armstrong et al, 2004, Cui et al, 2004) Следует отметить, что ранее при исследовании РБ, выделенного из сыворотки крови быка, была также продемонстрирована способность этого низкомолекулярного белка (молекулярная масса менее 15 кДа) образовывать в растворах высокомолекулярные ассоциаты с массой более 200 кДа (Ямскова, Резникова, 1991) Возможно, что именно существованием РБ в виде высокомолекулярных ассоциатов объясняется их резистентность к воздействию различных физико-химических факторов Обращает на себя внимание картина разделения растворов РБ методом электрофореза в 15%-ном ПААГ с добавлением додецилсульфата натрия Известно, что в данных условиях разделение белков преимущественно происходит по значению их молекулярной массы (Laemmli, 1970) Аномальная

подвижность РБ в электрофорезе, на наш взгляд, объясняется неординарной первичной структурой данных белков Мы полагаем, что своеобразие физико-химических свойств РБ можно объяснить уникальными свойствами их наночастиц Ранее была предпринята попытка определить первичную структуру РБ, выделенного из сыворотки крови КРС, но в силу определенных причин это не удалось (Ямсков и др, 2001) Таким образом, определение первичной структуры изучаемых РБ нуждается в разработке нового экспериментального подхода В предшествующих работах РБ, выделенные из тканей глаза млекопитающих, сравнивались с белками S100 (Краснов и др, 2003), обнаруженными в различных тканях млекопитающих и участвующих в клеточной адгезии, миграции, пролиферации, дифференцировке (Donato, 1999) Общим для белков обеих групп является свойство оставаться в растворенном состоянии в насыщенном растворе сернокислого аммония Белки S100 характеризуются молекулярной массой около 25 кДа, термолабильностью, Са2+-связывающей активностью, преимущественным наличием а-спиралей (40%) (Fano et al, 1995), внутриклеточной локализацией Таким образом, белки S100 принципиально отличаются от РБ Ранее в научной литературе встречались данные, касающиеся индивидуальных регуляторных эндогенных пептидов (Анисимов, 2000) Следует отметить, что в отличие от указанных пептидов, для которых подобные исследования не были проведены, изучаемые в настоящей работе РБ проявляли специфическую активность, во-первых, в СМД, а во-вторых, в экспериментах in vitro в условиях достаточно длительного культивирования тканей млекопитающих Эндогенные пептиды и цитомедины имеют, вероятно, сходство с изучаемыми РБ относительно значения молекулярной массы (для цитомединов Мм=1-10кДа) и предполагаемого механизма действия Тем не менее, на наш взгляд, исследуемые РБ являются новой группой биологически активных белковых факторов, проявляющих уникальные биологические и физико-химические свойства в растворах в СМД

Заключение

Анализ полученных данных показывает, что исследуемые РБ относятся к секреторным низкомолекулярным белкам, возможно, пептидам, проявляющим биологическую активность в СМД Вторичная структура исследуемых белков описывается в терминах р-структур, и статистического клубка В водных растворах исследуемые РБ образуют структуры, подобные наноструктурам других известных биомолекул Результаты исследования РБ, выделенных из других тканей млекопитающих, продемонстрировали способность влиять на важнейшие процессы жизнедеятельности клеток клеточную адгезию, миграцию, пролиферацию, дифференцировку, апоптоз Данные, полученные в настоящей работе, показали также способность РБ, выделенных из предстательной

железы, стимулировать образование секрета в этой железе Исследование молока как секрета молочной железы показало присутствие в нем одного РБ, очевидно, переходящего в состав секрета из сыворотки крови РБ, выделенные из молочной, предстательной желез являются секретируемыми (о чем свидетельствует метод их выделения из тканей, а также их локализация) Поэтому можно предположить, что данные РБ модулируют свойства секретов этих желез В одном случае это может касаться повышения ценности молока, как источника жизненно важных веществ для потомства, а в другом - изменения реологических и биологических свойств секрета предстательной железы, принципиально значимых для репродуктивной функции организма Мы полагаем, что изученные РБ входят в ранее не известную группу эндогенных биорегуляторов, обнаруженных в тканях млекопитающих, действующих в СМД

Выводы

1 Показано, что в молочной и предстательной железах КРС присутствуют регуляторные белки, способные проявлять биологическую активность в сверхмапых дозах, соответствующих 10 s-10 17 мг/мл

2 Установлено, что данные РБ являются низкомолекулярными белками, вторичная структура которых характеризуется преимущественным содержанием р-структур Показано, что РБ присутствуют в водном растворе в виде наноразмерных частиц, в состав которых входят липидная, углеводная и белковая компоненты

3 Для изучения специфической активности РБ, выделенных из предстательных желез КРС, разработана новая экспериментальная модель роллерного органотипического культивирования долей простаты мыши in vitro Показано, что слабокислый и кислый РБ предстательной железы в СМД стимулируют выработку секрета

4 Определена локализация РБ в тканях предстательной и молочной желез Установлено, что исследуемые РБ локализованы в протоках предстательной и молочной желез, и входят в состав секретов данных желез

5 Показано, что в цельном молоке крупного рогатого скота в активном состоянии присутствует РБ, характеризующийся значением pi в области рН 4,5-5,6 Данный РБ отсутствует в препаратах сухого молока и детского питания

Список работ, опубликованных по теме диссертации. 1 Назарова П А Исследование регуляторного белка, выделенного из предстательной железы быка физико-химические свойства, биологическая активность, локализация в ткани Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им Н К Кольцова РАН // Онтогенез 2005 т 36 № 3 С 235

2 Назарова П А , Ямскова В П , Краснов М С , Ямсков И А Исследование регуляторного белка, выделенного из предстательной железы быка // Доклады академии наук 2005 т 405 №5 С 708-710

3 Назарова П А Исследование регуляторных белков, выделенных из молока крупного рогатого скота физико-химические свойства и локализация в ткани лактирующей молочной железы крысы Тезисы докладов XIV школы «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии» // Онтогенез 2005 т 36 № 5 С 385-386

4 Назарова ПА Исследование регуляторных белков, выделенных из желез внутренней секреции // «Новые лекарственные средства Успехи и перспективы» Тезисы докладов V Всероссийского научного семинара и молодежной научной школы «Химия и медицина», Уфа, 5-8 сентября, 2005 С 108-109

5 Назарова П А Новый регуляторный белок, выделенный из предстательной железы быка // Сборник научных трудов I съезда физиологов СНГ, 2005 Том 2 С 22

6 Назарова П А Изучение регуляторных белков, выделенных из тканей желез млекопитающих и их секретов (предстательная, молочная железы, молоко) физико-химические свойства и локализация в ткани Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им Н К Кольцова РАН П Онтогенез 2006 т 37 № 4 С 235-236

7 Назарова П А , Ямскова В П, Краснов М С , Филатова А Г, Ямсков И А Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные белки, выделенные из желез млекопитающих и их секретов // Труды V Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», 2005 С 258-265

8 Назарова П А, Краснов М С , Ямскова В П, Ямсков И А Регуляторный белок, выделенный из молока крупного рогатого скота // Прикладная биохимия и микробиология 2006 т 42 №5 С 529-533

Заказ № 188/04/07 Подписано в печать 19 04 2007 Тираж 100 экз Уел пл 1,5

.. - ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 с/г ги , е-тай т/о@с/г ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Назарова, Полина Андреевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Регуляторные белки, биологически активные в сверхмалых дозах

1.2. Анатомическое и клеточное строение молочной и предстательной желез 16 Молочная железа 16 Структура ВКМ молочной железы 18 Предстательная железа 23 Структура ВКМ предстательной железы в норме и при патологии

1.3. Состав и свойства секретов молочной и предстательной желез 26 Молоко 26 Молоко как коллоидная система 38 Транспорт компонентов молока в клетках молочной железы 46 Состав секрета предстательной железы

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1. Используемые реактивы и оборудование

2.2. Получение тканевых экстрактов

2.3. Высаливание тканевых экстрактов сернокислым аммонием

2.4. Получение фракций супернатантов молока, а также препаратов сухого молока и детского питания

2.5. Изоэлектрофокусирование фракций супернатантов

2.6. Высокоэффективная жидкостная хроматография

2.7. Исследование препаратов регуляторных белков с помощью метода кругового дихроизма

2.8. Электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.9. Определение концентрации белка во фракциях регуляторных белков

2.10. Определение влияния исследуемых гликопротеинов на вязкоупругие свойства мембран гепатоцитов мыши при кратковременном органном культивировании in vitro

2.11. Получение поликлональной кроличьей антисыворотки

2.12. Иммуноферментный анализ антител (ELISA)

2.13. Роллерное органное культивирование предстательной железы мыши in vitro

2.14. Гистологическое исследование органных культур простат мышей после воздействия регуляторных белков, выделенных из предстательных желез быков

2.15. Исследование локализации регуляторных белков в тканях иммуногистохимическим методом

2.16. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) исследуемых РБ

2.17. Определение гидродинамического радиуса частиц РБ в водном растворе

2.18. Исследование РБ с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР)

Глава 3. Результаты и их обсуждение

3.1. Регуляторные белки молока, молочной и предстательной желез крупного рогатого скота: выделение и очистка

3.2. Локализация слабокислого РБ молока и слабокислого РБ предстательной железы в тканях молочной и предстательной желез, соответственно

3.3. Исследование влияния в СМД кислого и слабокислого регуляторных белков, выделенных из предстательных желез КРС, на состояние предстательных желез мышей в условиях роллерного культивирования in vitro

3.4. Исследование РБ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии

3.5. Исследование гидродинамического радиуса частиц РБ в водных растворах

3.6. Исследование состояния РБ с помощью атомной силовой микроскопии

3.7. Исследование РБ с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ)

3.8. Исследование вторичной структуры пептидных фракций слабокислого РБ предстательной железы и слабокислого РБ молока с помощью кругового дихроизма

3.9. Исследование РБ с помощью ядерного магнитного резонанса 103 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 112 ВЫВОДЫ 113 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВКМ - внеклеточный матрикс

РБ - регуляторный белок

СМД - сверхмалые дозы

ПМ - плазматическая мембрана

БМ - базальная мембрана

J1H - ламинин

ММП - матриксная металлопротеиназа

GlyCAM-1 - молекула клеточной адгезии, зависимая от гликозилирования

MadCAM-1 - молекула клеточной адгезии слизистого адрессина

ПСА - простатоспецифический антиген

МЖШ - мембрана жировых шариков

ИЛ - интерлейкин

ФНО - фактор некроза опухоли

ТФР - трансформирующий фактор роста

ЭФР - эпидермальный фактор роста

ИПФР - инсулиноподобный фактор роста

ИПФРБ - белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ДЦС-Na - додецилсульфат натрия

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИЭФ - изоэлектрофокусирование

ПААГ - полиакриламидный гель

КРС - крупный рогатый скот

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование биологически активных в сверхмалых дозах регуляторных белков, выделенных из предстательной и молочной желез, а также молока"

Актуальность темы.

Жизнедеятельность высших животных, в частности, млекопитающих, возможна благодаря функционированию в их организмах нескольких систем, а именно: нервной, пищеварительной, дыхательной, кровеносной, выделительной, репродуктивной, иммунной и эндокринной. Слаженная работа этих систем возможна благодаря деятельности особых биологически активных веществ: гормонов, медиаторов, нейротрансмиттеров и др. В большинстве своем данные вещества представляют собой молекулы белковой природы, способные действовать в разных концентрациях, опосредуя межклеточные сигналы, и инициируя внутриклеточные каскады реакций, стимулируя или ингибируя, в конечном итоге, экспрессию определенного гена (ов) (Miller, Cuatrecasas, 1978; Nicola, 1994; Gagnoux-Palacios et al., 2001). Следует отметить, что ряд регуляторных молекул может «передавать» сигнал в клетку, взаимодействуя не только с рецепторами, расположенными на плазматической мембране, но и с молекулами внеклеточного матрикса (ВKM) (Bissell et al., 1982). В настоящее время одной из наиболее актуальных задач современной биохимии является поиск и изучение новых эндогенных биорегуляторов, а также исследование механизма их биологического действия. В этом аспекте особое значение занимают исследования, касающиеся функционирования желез внешней и внутренней секреции. Ввиду того, что основной функцией этих органов является секреция, то, несомненно, важно изучить состав секретов желез на предмет наличия в них новых биологически активных веществ.

В системе функционирования таких органов, как молочная и предстательная железа, уже многое изучено. Известно множество факторов действующих в молочной железе, гормонов, медиаторов, факторов роста, молекул ВКМ и т.д. Причем их огромное множество и все они разнообразно модулируют важнейшие клеточные процессы (пролиферациию, миграцию, дифференцировку) в различные периоды функционирования молочной железы: эмбриональный, постнатальный, пубертатный периоды, а также во время беременности, лактации, инволюции. Также многое известно относительно предстательной железы, как в норме, так и патологии (Abrahamsson, Lilja. 1990; Chang et al., 1999; Davis et al.,2001).

Молочная железа во время лактации продуцирует молоко. Молоко, являясь секретом молочной железы, имеет очень сложный, до конца не изученный состав. Усиленно исследуются, в основном, питательные, иммуногенные свойства данной уникальной биологической жидкости (Arnold, et. al. 1977; Bastian et al., 2001; Baumrucker, Erondu, 2000).

Однако о иаличии биологически активных регуляторных молекул в составе молока известно не так много. При этом до конца не решена проблема усвоения молочных продуктов как младенцами, находящимися на искусственном вскармливании, так и взрослыми, потребляющими переработанное коровье молоко .(Walker, 2004; Oddy, 2002; Hoppu, et al., 2001; Pourpak, 2004).

Возможно, ключ к пониманию данной проблемы необходимо искать, исследуя РБ, входящие в состав молока.

Основной функцией предстательной железы является поддержание определенного репродуктивного статуса организма. Иными словами, предстательная железа необходима для сохранения жизнеспособности сперматозоидов - носителей генетической информации. Определяющую роль играет состав и свойства секрета предстательной железы. Однако состав секрета, с точки зрения наличия в нем регуляторных белковых факторов, полностью не установлен.

Таким образом, представляется целесообразным исследовать влияние регуляторных белков, выделенных из предстательной, молочной желез и молока на функционирование соответствующих тканей как in vivo, так и in vitro.

Данная работа выполнена с помощью разработанного ранее методического подхода, основу которого составляет комплекс методов исследования тканей взрослых млекопитающих, а также методы выделения и очистки белков, участвующих в модулировании клеточных процессов (Ямскова и др., 1977; Ямскова, Резникова, 1991; Ямсков и др., 1999). С помощью этого экспериментального подхода были обнаружены и исследованы низкомолекулярные, гликозилированные белки клеточного микроокружения многих тканей: печени, легкого, сыворотки крови (Ямскова и др., 1977; Ямскова, Резникова, 1979; Ямскова, Резникова, 1984; Буеверова и др., 1985; Ямскова, Резникова, 1991; Ямсков, Ямскова, 1998). Регуляторные белки (РБ) этой группы обладают целым рядом свойств, отличающих их от уже известных биологически активных РБ и белков ВКМ. Было установлено, что идентифицированные гликозилированные белки участвовали в процессах клеточной адгезии, опосредуя, вероятно, контакты клетка-клетка и клетка-ВКМ, воздействуя на белки межклеточного пространства (Ямскова, Туманова, 1994; Ямскова, Туманова, 1996). Эти гликозилированные белки оказались способными вызывать в сверхмалых дозах (СМД) различные биологические эффекты: регулировать биосинтез белка, клеточное деление, миграцию, жизнеспособность клеток (Ямскова, Резникова, 1991; Ямскова, Туманова, 1994; Ямскова, Туманова, 1996; Ямсков, Ямскова, 1998). Исследование биологической активности и физико-химических свойств этих молекул показало, что они обладают высокой устойчивостью к различным воздействиям: изменениям рН, температуры, действию хелатирующих агентов, протеаз, могут образовывать агрегаты, а также присутствовать в водных растворах в СМД в виде наночастиц (Ямскова, Туманова, 1994; Ямскова, Туманова, 1996). Биологическая активность обнаруженных гликопротеинов проявлялась при использовании их в СМД и только в условиях сохранения целостности адгезивных контактных взаимодействий между клетками в тканях (Ямскова и др., 1994).

На основании данных исследования биологической активности и физико-химических свойств идентифицированных РБ была разработана концепция создания фармакологических препаратов нового поколения (Ямсков, Ямскова, 1998). Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования явилась идентификация новых РБ из предстательной, молочной желез и молока КРС, действующих в СМД, а также изучение их физико-химических и биологических свойств. В отдельные задачи входили:

1) Идентификация биологически активных в СМД РБ в предстательной и . молочной железах, а также в молоке КРС.

2) Исследование физико-химических свойств РБ, выделенных из молочной и предстательной желез, также молока КРС.

3) Изучение дозовой зависимости биологической активности исследуемых РБ с помощью метода биотестирования, в основе которого лежит мембранотропное действие РБ данной группы на клетки печени млекопитающих.

4) Разработка новой экспериментальной модели in vitro для исследования специфической биологической активности РБ, выделенного из предстательной железы быка.

5) Определение локализации исследуемых РБ в тканях предстательной и молочной желез млекопитающих.

Научная новизна работы.

В результате проведения данного исследования в ткани предстательной и молочной желез, а также в цельном молоке КРС были идентифицированы ранее не известные белки, о in проявляющие биологическое действие в СМД (10" - 10" мг белка/мл). Из тканей желез данные белки были выделены, соответственно, в виде двух фракций - кислых и слабокислых белков, с молекулярной массой менее 10 кДа, вторичная структура которых представлена, в основном, 0-структурами и статистическим клубком. В растворах данные белки образуют наноструктуры с размером частиц от 100-400 нм. По физико-химическим свойствам данные белки сходны с РБ, которые были идентифицированы в других тканях млекопитающих. Для слабокислых РБ, выделенных из предстательной железы и молока, показана их внеклеточная пристеночная локализация в протоках и секретах соответствующих желез.

Для изучения специфической биологической активности идентифицированных кислого и слабокислого РБ предстательной железы быка была разработана новая экспериментальная модель роллерного органного культивирования ткани предстательной железы мыши in vitro, на которой было продемонстрировано стимулирующее действие на выработку секрета.

Практическая значимость.

Слабокислый РБ молока не был обнаружен в таких молочных продуктах, как сухое молоко и «Нутрилон 1», предназначенный для детского питания. Эти данные показывают, что в процессе переработки молока происходит потеря РБ. Учитывая тот факт, что РБ данной группы способны оказывать влияние на ход и направленность важнейших биологических процессов в тканях и организме млекопитающих, можно заключить, что приготовленные молочные продукты питания не содержат этого эффективного биорегулятора. Представляется актуальной постановка вопроса о возможном использовании слабокислого РБ молока в качестве биологически активной добавки при изготовлении молочных продуктов питания для людей разного возраста. На основе кислого РБ предстательной железы быка разработан фармакологический препарат нового поколения, который может быть использован в апдрологии для улучшения репродуктивной функции у мужчин в качестве стимулятора образования секрета простаты, который исключительно важен для поддержания жизнеспособности и сохранения функции сперматозоидов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Назарова, Полина Андреевна

Выводы.

1. Показано, что в молочной и предстательной железах КРС присутствуют регуляторные белки, способные проявлять биологическую активность в

Q | Щ сверхмалых дозах, соответствующих 10" -10" мг/мл.

2. Установлено, что данные РБ являются низкомолекулярными белками, вторичная структура которых характеризуется преимущественным содержанием ^-структур. Показано, что РБ присутствуют в водном растворе в виде наноразмерпых частиц, в состав которых входят липидная, углеводная и белковая компоненты.

3. Для изучения специфической активности РБ, выделенных из предстательных желез КРС, разработана новая экспериментальная модель роллерного органотипического культивирования долей простаты мыши in vitro. Показано, что слабокислый и кислый РБ предстательной железы в СМД стимулируют выработку секрета.

4. Определена локализация РБ в тканях предстательной и молочной желез. Установлено, что исследуемые РБ локализованы в протоках предстательной и молочной желез, соответственно, и входят в состав секретов данных желез.

5. Показано, что в цельном молоке крупного рогатого скота в активном состоянии присутствует РБ, характеризующийся значением pi в области рН 4,5-5,6. Данный РБ отсутствует в препаратах сухого молока и детского питания.

Заключение

Анализ полученных данных показывает, что исследуемые РБ относятся к секреторным низкомолекулярным белкам, возможно, пептидам, содержащим липидные и углеводные компоненты, проявляющим биологическую активность в СМД. Вторичная структура исследуемых белков описывается в терминах (3-структур, и статистического клубка. В водных растворах исследуемые РБ образуют структуры, подобные наноструктурам других известных биомолекул.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Назарова, Полина Андреевна, Москва

1. Анисимов В.Н. Средства профилактики преждевременного старения (геропротекторы) // Успехи геронтологии. 2000. Вып. 4. С. 55-74.

2. Афанасьев Ю.И, ЮринаН.А. Гистология. М.: Изд. «Медицина». 2001. с.

3. Бочарова О.А., Модянова Е.А. Изменение межклеточных контактов гепатоцитов в онтогенезе у мышей инбредных линий с высокой (СВА) и низкой (С57В1) частотой спонтанных гепатом // Онтогенез. 1982. Т. 13. N4. С. 427-429.

4. Буеверова Э.И., Брагина Е.В., Резникова М.М., Ямскова В.П., Хрущов Н.Г. Действие адгезионного фактора сыворотки крови на пролиферацию клеток млекопитающих in vitro //ДАН СССР.1985. Т.281. N1. С.158-160.

5. Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов. Спб.: Изд. ГИОРД. 2004. 320 С.

6. Грачев И.И., Галанцев В.П. Физиология лактации, общая и сравнительная. // Л. Ленингр. отд.: Изд. "Наука". 1973.590 С.

7. Григорян Э.Н., Поплинская В.А. Обнаружение внутренних источников регенерации нейральной сетчатки после ее отслойки у тритонов. И. Радиоавтографическое исследование // Изв. АН. Сер. биол. 1999. № 5. С. 583-591.

8. Гундорова Р.А., Хорошилова-Маслова И.П., Ченцова Е.В., Платовская JJ.B., Ямскова В.П., Романова И.Ю. Применение адгелона в лечении проникающих ранений роговицы в эксперименте // Вопросы офтальмологии. 1997. Т.113. N2. С. 12-15.

9. Гундорова Р.А., Ченцова Е.В., Ямскова В.П., Романова И.Ю. Применение нового фармакологического препарата Адгелон в офтальмологии //Онтогенез. 2000. Т.31. N4. С. 272-273.

10. Дольникова А.Э., Ямскова В.П. Молекулярные факторы адгезии клеток нейральных тканей, Са2+-независимая система адгезии. Онтогенез. 1990. Т.21. N4. С. 358-367.

11. Дольникова А.Э., Ямскова В.П., Сологуб А.А., Строева О.Г. Биохимическая характеристика адгезионных факторов клеток сетчатки куриных зародышей // Онтогенез. 1985а. Т.16. № 5. С. 497-506.

12. Дольникова А.Э., Сологуб А.А., Строева О.Г., Ямскова В.П. Роль кальций-зависимого и кальций-независимого механизмов в адгезии клеток сетчатки и пигментного эпителия куриных зародышей // Онтогенез. 19856. Т. 16. № 2. С. 149155.

13. Дольникова А.Э., Ямскова В.П., Сологуб А.А., Строева О.Г. Исследования специфической и неспецифической адгезии в процессе агрегации клеток сетчатки куриных зародышей // Онтогенез. 1986. Т.17. №6. С.620-626.

14. Каспаров А.А., Розинова В.Н., Ямскова В.П. Питательная среда с Адгелоном для консервации роговицы донора // Онтогенез. 2000. Т.31. N4. С. 273-274.

15. М.Краснов М.С., Маргасюк Д.В., Ямское И.А., Ямскова В.П. Действие новых регуляторных белков из растений в сверхмалых дозах // Радиционная биология и радиоэкология. 20036. N3. С. 269-272.

16. Краснов М.С., Григорян Э.Н., Ямскова В.П., Богуславский Д.В., Ямское И.А. Регуляторные белки тканей глаза позвоночных // Радиционная биология и радиоэкология. 2003в. N3. С.265-268.

17. Краснов М.С., Гурмизов Е.П., Ямскова В.П., Гундорова Р.А., Ямское И.А. Исследование влияния регуляторного белка, выделенного из хрусталика глаза быка, на катарактогенез у крыс in vitro // Вестник офтальмологии. 2005а. Т.121. N1. С. 37-39.

18. Краснов М.С., Гурмизов Е.П., Гундорова Р.А., Ямскова В.П., Капитонов Ю.А. Модель катарактогенеза позвоночных животных in vitro // Офтальмология. 20056. Т.2. N2. С. 43-49.

19. Маленков А.Г., Модянова Е.А., Ямскова В.П. Тканевоспецифическое ингибировапие синтеза ДНК контактинами-факторами, обладающими тканеспецифической адгезионной активностью // Цитология. 1978. Т.20. N8. С. 957-962.

20. Маленков А.Г., Чуич Г.А. Межклеточные контакты и реакция ткани // М. Медицина. 1979. 135С.

21. Маргасюк Д.В., Краснов М.С., Ямскова В.П., Григорян Э.Н., Ямское И.А. Исследование регуляторного белка, выделенного из роговицы глаза быка: выделение, очистка, локализация в ткани и биологическая активность // Офтальмология. 2005. Т.2. N3. С. 81-87.

22. Маргасюк Д.В., Григорян Э.Н., Ямскова В.П. Исследование влияния на клеточную пролиферацию в роговице глаза тритона адгезивного белка, выделенного из роговицы глаза быка // Изв. РАН Сер. Биол. 20056. N5. С. 738-743.

23. Мелихов И.В. Тенденции развития нанохимии // Росс. Хим. Ж. 2002. Т. XLVI. №5. С. 7-14.

24. Модянова Е.А., Бочарова О.А., Ушаков В. Ф. Механические свойства межклеточных контактов гепатоцитов у мышей инбредных линий и предрасположенность к спонтанным гепатомам // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1980. Т.89. N4. С.459-462.

25. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Пептидные биорегуляторы в профилактике и лечении возрастной патологии // Успехи геронтологии. 1997. Вып. 1. С. 74-79.

26. Остерман JI.A. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Изд. "Наука". 1983. 304с.

27. Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Изд. "Наука". 1985. 536с.

28. Рамис Е. К проблеме нуклеации (образования клеток) при самоорганизации наноструктур белка in vitro и in vivo II Ж. техн. физики. 2005. Т. 75. С. 107-113.

29. Рамис Е. Неравновесное состояние наноструктур белка при его самоорганизации // Ж. техн. физики. 2006. Т. 76. С. 121-127.

30. Резникова М.М., Ямскова В.П. Получение и свойства неспецифического адгезионного фактора из сыворотки крови теплокровных животных и человека // Журнал общей биологии. 1985. Т. 46. №3. С. 389-400.

31. Рыбакова Е.Ю. О возможном механизме, лежащем в основе метода биотестирования in vitro регуляторных белков, проявляющих биологическую активность в сверхмалых дозах. // Онтогенез. 2005. Т.36. N3. С. 234.

32. Рыбакова Е.Ю., Виноградов А.А., Ямскова В.П., Ямское И.А. Белок-инактиватор сывороточного адгезивного гликопротеина //Онтогенез. 2000. Т.31. N4. с. 278-279.

33. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. // 1996. М.: Высшая школа. 335с.

34. Тиктинскш О.Л. Руководство по андрологии. JI.: Изд. «Медицина», 1990. 312с.

35. Туманова Н.Б., Ямскова В.П. Нарушение молекулярных механизмов клеточной адгезии в печени мышей при генетической предрасположенности к спонтанному бластомогенезу // Известия Акад. наук, серия биол. 1995. N3. С. 261-265.

36. Туманова Н.Б., Попова Н.В., Ямскова В.П. Влияние макромолекулярных адгезионных факторов на пролиферацию гепатоцитов в органных культурахэмбриональной печени мышей // Известия Акад. наук. Серия биол. 1996. N6. С. 653-657.

37. Филонов А.С., Гаврилко Д.Ю., Яминский И.В. Программное обеспечение для обработки трехмерных изображений «ФемтоСкан Онлайн». // 2005. М.: Центр перспективных технологий. 89 с. (http://www.nanoscopy.net).

38. Хэм А., КормакД. Гистология: пер. с англ. // 1983. М.: Мир, Т. 5., С. 173-180.

39. Чупин В.В. Роль липидов в структурной организации мембран и взаимодействии с белками. Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук. -М., 1997.

40. Энгельгардт Н.В. Иммунохимический анализ // 1968. М.: Медицина, С. 165-188.

41. Ямскова В.П., Модянова Е.А., Резникова М.М., Маленков А.Г. Высокоактивные тканевоспецифические адгезионные факторы печени и легкого // Молекулярная биология. 19776. Т.П. N5. С. 1147-1154.

42. Ямскова В.П. Роль ионов кальция в стабилизации адгезионного фактора печени крыс // Биофизика. 1978. Т.23. С. 428-432.

43. Ямскова В.П., Резникова М.М. Роль макромолекулярных компонентов клеточной поверхности в специфической адгезии клеток // Успехи биологической химии. 1979. Т.20. С.95-112.

44. Ямскова В.П., Резникова М.М. Адгезин-фактор из сыворотки крови животных и человека //Журнал общей биологии. 1984. Т.45. N3. С. 373-382.

45. Ямскова В.П., Туманова Н.Б., Логинов А. С. Сравнительное исследование действия экстрактов печени мышей линии С57В1 и СВА на адгезию гепатоцитов // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1990. N3. С. 303-306.

46. Ямскова В.П., Резникова М.М. Низкомолекулярный полипептид сыворотки крови теплокровных: влияние на клеточную адгезию и пролиферацию // Журнал общей биологии. 1991. Т.52. N2. С. 181-191.

47. Ямскова В.П., Туманова Н.Б. Макромолекулярные факторы Са-зависимой адгезии клеток печени // Известия Акад. наук. Серия биол. 1994. N5. С. 732-737.

48. Ямскова В.П., Туманова Н.Б. Роль межклеточной адгезии гепатоцитов в процессах спонтанного гепатобластомогенеза // Успехи Современной Биологии. 1996. Т. 116. Вып.2. С. 194-205.

49. Ямсков И.А., Ямскова В.П. Фармакологические препараты нового поколения на основе ранее неизвестных биорегуляторов-гликопротеинов клеточного микроокружения // Рос. хим. ж. (ЖРХО им. Д.И. Менделеева). 1998. Т.42. N3. С. 85-90.

50. Ямсков И.А., Виноградов А.А., Даниленко А.Н., Маслова JI.A., Рыбакова Е.Ю., Ямскова В.П. Низкомолекулярный гликопротеин из сыворотки крови крупного рогатого скота: структура и свойства // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т.37. N1. С. 36-42.

51. Ямскова В.П., Рыбакова Е.Ю., Виноградов А.А., Вечеркин В.В., Ямсков И.А. Исследование белка-инактиватора адгезивного гликопротеина из сыворотки крови млекопитающих.// Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т. 40. N4. С. 407413.

52. Abrahamsson P., Lilja Н. Three predominant prostatic proteins I I Andrologia. 1990. V.l. P. 122-131.

53. Alford D., Taylor-Papadimitriou J. Cell adhesion molecules in the normal and cancerous mammary gland // J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1996. V. 1. P. 207-218.

54. Allen J.C., Keller R.P., Archer P., Neville M.C. Studies in human lactation: milk composition and daily secretion rates of macronutrients in the first year of lactation // Am J ClinNutr. 1991. V. 54(1). P. 69-80.

55. AokiN. Regulation and functional relevance of milk fat globules and their components inthe mammary gland // Biosci Biotechnol Biochem. 2006. V. 70(9). P. 2019-27.

56. Arienti G., Carlini E., Saccardi C., Palmerini C. Role of human prostasomes in the activation of spermatozoa // J. Cell. Mol. Med. 2004. V.8 (1). P. 77-84.

57. Armstrong J.K., Wenby R.B., Meiselman H.J., Fisher T.C. The Hydrodynamic Radii of Macromolecules and Their Effect on Red Blood Cell Aggregation // Biophysical Journal. 2004. V. 87. P. 4259-4270.

58. Arnold R.R., Cole M.F., et. al. A bactericidal effect for human lactoferrin // Science. 1977. V. 197. P. 263-5.

59. Asakura H. Fetal and neonatal thermoregulation // J Nippon Med Sch. 2004. V. 71(6). P. 360-70.

60. Baker E.N., Baker H.M. Molecular structure, binding properties and dynamics of lactoferrin // Cell Mol Life Sci. 2005. V. 62(22). P. 2531-9.

61. Bantchev G.B., Schwartz D.K. Structure of beta-casein layers at the air/solution interface: atomic force microscopy studies of transferred layers // Langmuir. 2004. V. 20(26). P. 11692-7.

62. Barcellos-Hojf M.H. Mammary epithelial reorganization on extracellular matrix is mediated by cell surface galactosyltransferase // Exp Cell Res. 1992. V. 201. P. 225-234.

63. Baumrucker C.R., Erondu N.E. Insulin-like growth factor (IGF) system in the bovine mammary gland and milk//J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2000. V. 5. P. 53-64.

64. Baveye S., Elass E., et. al Lactoferrin: a multifunctional glycoprotein involved in the modulation of the inflammatory process //Clin Chem Lab Med. 1999. V. 37. P. 281-6.

65. Baxter R.C. Insulin-like growth factor (IGF)-binding proteins: interactions with IGFs and intrinsic bioactivities //Am J Physiol Endocrinol Metab. 2000. V. 278. P. 967-76.

66. Behrens J. Cadherins and catenins: role in signal transduction and tumor progression // Cancer Metast. Rev. 1999. V. 18. P. 15-30.

67. Berkhout В., Floris R., et al. The antiviral activity of the milk protein lactoferrin against the human immunodeficiency virus type 1 //Biometals. 2004. V. 17(3). P. 291-4.

68. Berseth C.L., Lichtenberger L.M., Morriss F.H. Comparison of the gastrointestinal growth-promoting effects of rat colostrum and mature milk in newborn rats in vivo // Am J Clin Nutr. 1983. V. 37. P.52-60.

69. Bissel M.J. and Barcellos-Hoff M.H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message? // Journal of Cell Science. Suppl. 1987. V. 8. P. 327-343.

70. Bissel M.J., Hall E.G. and Parry G. How does the extracellular matrix direct gene expression? //Journal of theoretical Biology. 1982. V. 99. P. 31-68.

71. Blum J.W., Hammon H.M. Colostrum effects on the gastrointestinal tract, and on nutritional, endocrine and metabolic parameters in neonatal calves // Livestock Prod Sci. 2000. V. 66. P. 151-9.

72. Bode L., Beermann С., Mank M., Kohn G., Boehm G. Human and bovine milk gangliosides differ in their fatty acid composition // J Nutr. 2004. V. 134(11). P. 3016-20.

73. Boehm G., Jelinek J., Stahl В., van Laere K., Knol J., Fanaro S., Moro G., Vigi V. Prebiotics in infant formulas // J Clin Gastroenterol. 2004. V. 38. P. 76-9.

74. Bouhallab S., Bougie D. Biopeptides of milk: caseinophosphopeptides and mineral bioavailability // Reprod Nutr Dev. 2004. V. 44(5). P. 493-8.

75. Brandtzaeg P. Mucosal immunity: integration between mother and the breast-fed infant. 2003 // Vaccine. V.21. P. 3382-3388.

76. Brock J.H. Lactoferrin in human milk: its role in iron absorption and protection against enteric infection in the newborn infant//Arch Dis Child.1980. V. 55. P. 417-21.

77. Burgoyne R.D., Duncan J.S. Secretion of milk proteins // J. Mammary Gland Biology and Neoplasia. 1998. V. 3. P. 275-286.

78. Camilleri P. Use of proteomic methodology for the characterization of human milk fat globular membrane proteins //Anal Biochem. 2002. V. 301. P. 314-24.

79. Calandra R.S., Rulli S.B., Frungieri M.B., Suescun M.O., Gonzalez-Calvar S.I. Polyamines in the male reproductive system // Acta Physiol Pharmacol Ther Latinoam. 1996. V. 46(4). P. 209-22.

80. Carver J.D. Advances in nutritional modifications of infant formulas // Am J Clin Nutr. 2003. V. 77(6). P. 1550-1554.

81. Cavaletto M., Giuffrida M.G., et al. Multiple forms of lactadherin (breast antigen BA46) and butyrophilin are secreted into human milk as major components of milk fat globule membrane //J. Dairy Res. 1999. V. 66. P. 295-301.

82. Cavaletto M.,. Giuffrida M.G. et.al. The proteomic approach to analysis of human milk fat globule membrane //Clinica Chimica Acta. 2004. V. 347. P. 41-48.

83. Cell biology of extracellular matrix. Ed. E.D. Hay. N.-Y.-L: Plenum press, 1982, 417 p. Guidebook to the Extracellular Matrix and Adhesion Proteins. Ed. T. Kreis, R.Vale, O.-Y.-T., Oxford University Press, 1993, 176 p.

84. Chan P.S.F., Chan L.W., Xuan J.W., Chin J.L., Choi H.L. and Chan F.L. In situ hybridization study of PSP94 (prostatic secretory protein of 94 amino acids) expression in human prostates // Prostate. 1999. V. 41. P. 99-109.

85. Chang W.Y., Wilson M.J., Birch L. and Prins G.S. Neonatal Estrogen Stimulates Proliferation of periductal fibroblasts and alters the extracellular matrix composition in the rat prostate // Endocrinology. 1999. V. 140. 405-415.

86. Chappie D.S., Mason D.J., et. al. Structure-function relationship of antibacterial synthetic peptides homologous to a helical surface region on human lactoferrin against Escherichia coli serotype 0111 //Infect Immun. 1998. V. 66. P. 2434-40.

87. Chen L, Subirade M. Chitosan/beta-lactoglobulin core-shell nanoparticles as nutraceutical carriers // Biomaterials. 2005. V. 26(30). P. 6041-53.

88. Chipman D.M., Sharon N. Mechanism of lysozyme action // Science. 1969. V. 165(892). P. 454-65.

89. Clare D.A., SwaisgoodH.E. Bioactive Milk Peptides: A Prospectus//J. Dairy Sci. 2000. V. 83. P. 1187-1195.

90. Clarke S.M., Merchant D.J. Primary cultures of human prostatic epithelial cell from transurethral resection specimens // Prostate. 1980. V. 1(1). P. 87-94.

91. Clarke R.B., Spence K., Anderson E., Howell A. Okano H., Potten C.S. A putative human breast stem cell population is enriched for steroid receptor-positive cells // Dev Biol. 2005. V. 277. P. 443^56.

92. Conneely O.M. Antiinflammatory activities of lactoferrin // J Am Coll Nutr. 2001. 20. P. 389-397.

93. Costello L.C., Fadika G., Franklin R.B. Aconitase activity, citrate oxidation, and zinc inhibition in rat ventral prostate // Enzyme. 1981. V. 26. P. 281-285.

94. Costello L.C., Franklin R.B. Concepts of citrate production and secretion by prostate. Hormonal relationships in normal and neoplastic prostate // Prostate. 1991. V. 129(3). P. 181-205.

95. Costello L.C, Franklin R.B. The clinical relevance of the metabolism of prostate cancer; zinc and tumor suppression: connecting the dots // Mol Cancer. 2006. V. 15. P. 517.

96. Costello L.C., Liu Y., Franklin R.B. Testosterone stimulates the biosynthesis of m-aconitase and citrate oxidation in prostate epithelial cells // Mol Cell Endocrinol. 1995. V.l 12(1). P. 45-51.

97. Cowin P., Burke B. Cytoskeleton-membrane interactions // Curr. Opin. Cell Biol. 1996. V. 8. P. 56-65.

98. Crosa J.H. Genetics and molecular biology of siderophore-mediated iron transport in bacteria //Microbiol Rev. 1989. V. 53. P. 517-30.

99. Cui S., Arosio D., Doherty K.M., Brosh R.M., Falaschi A., Vindigni A. Analysis of the unwinding activity of the dimeric RecQl helicase in the presence of human replication protein A // Nucleic Acids Researches. 2004. V. 32. P. 2158-2170.

100. Daly S.E.J., Kent J.C., Owens R.A., andHartmann P.E. Frequency and degree of milk removal and the short-term control of human milk synthesis. 1996 // Exp Physiol. V. 81. P. 861-875.

101. Daniel C., Strickland P., Friedmann Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth // Dev Biol. 1995. V.169. P. 511-551.

102. Dannies P.S., Levine L. Structural properties of bovine brain S-100 protein // J. Biol. Chem. 1971. V. 246. P. 6276-6283.

103. Dev B.C., Sood S.M., Wind S., Slattery C. W. Characterization of human k-casein purified by FPLC // Prep. Biochem. 1993. V. 23. P. 389.

104. Dev B.C., Sood S.M., Wind S., Slattery C.W. k-Casein and b-caseins in human milk micelles: structural studies // Arch. Biochem. Biophys. 1994. V. 314. P. 329.

105. Dial E.J., Hall L.R., et. al. Antibiotic properties of bovine lactoferrin on Helicobacter pylori//Dig Dis Sci. 1998. V. 43. P. 2750-6.

106. Dial E.J., Lichtenberger L.M. Effect of lactoferrin on Helicobacter felis induced gastritis//Biochem Cell Biol. 2002. V. 80. P. 113-7.

107. Donato R. S-100 proteins // Cell Calcium. 1986. V. 7. P. 123-145.

108. Donato R. Functional role of S-100 proteins, calcium-binding proteins of the EF-hand type // Biochimica et Biophysica Acta (BBA). 1999. V. 1450. P. 191-231.

109. Durbeej M., Ekblom P. Dystroglycan and laminins: glycoconjugates involved in branching epithelial morphogenesis // Exp Lung Res. 1997. V. 23. P. 109-118.

110. Eglinton B.A., Roberton D. M. & Cummins A.G. Phenotype of T cells, their soluble receptor levels, and cytokine profile of human breast milk. 1994 // Immunol. Cell Biol. V. 72. P. 306-313.

111. Ekblom P., Lonai P., and Talts J.F. Expression and biological role of laminin-1 // Matrix Biol. 2003. V. 22. P. 35-47.

112. Elass-Rochard E., Roseanu A., et. al. Lactoferrin-lipopolysaccharide interaction: involvement of the 28-34 loop region of human lactoferrin in the high-affinity binding to Escherichia coli 055B5 lipopolysaccharide// Biochem J. 1995. V. 312. P. 839-45.

113. Elenius K., Salmivirta M., Inki P., Mali M., Jalkanen M. Binding of human syndecan to extracellular matrix proteins // J Biol Chem. 1990. V. 265. P. 17837-17843.

114. El-Nimr A., Hardee G.E., Perrin J.H. A fluorimetric investigation of the binding of drugs to lysozyme // J Pharm Pharmacol 1981; 33(2) 117-8.

115. Engvall E., Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochemistry. 1971. V.8. P. 871 874.

116. Erdem Y.K., Yuksel Z. Sieving Effect of Heat-Denatured Milk Proteins During Ultrafiltration of Skim Milk. I. The Preliminary Approach // J. Dairy Sci. 2005. V. 88. P. 1941-1946.

117. Fair W.R., Couch J., Wehner N. Prostatic antibacterial factor. Identity and significance // Urol. 1976. V.7. P. 169-77.

118. Fano G., Biocca S., Fulle S., Mariggio M.A., Belia S., Calissano P. The S-100: A protein family in search of a function // Progress in Neurobiology. 1995. V. 46. P. 71-82.

119. Farguhar M.G., Palade G.E. Junctional complexes in various epithelia // J. Cell Biol. 1963. V. 17. P. 375-412.

120. Faraldo M.M., Deugnier M.A., Thiery J.P., Glukhova M.A. Development of mammary gland requires normal beta 1-integrin function // Adv Exp Med Biol. 2000. V. 480. P. 169-74.

121. Farrell H.MJr., Kumosinski T.F., Pulaski P., Thompson M.P. Calcium-induced associations of the caseins: a thermodynamic linkage approach to precipitation and resolubilization // Arch Biochem Biophys. 1988 V. 265(1). P. 146-58.

122. Fata J.E., Leco K.J., Moorehead R.A., Martin D.C., Khokha R. Timp-1 is important for epithelial proliferation and branching morphogenesis during mouse mammary development // Dev Biol. 1999. V. 211. P. 238-254.

123. Fata J.E, Werb Z, Bissell M.J. Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes // Breast Cancer Res. 2004. V. 6. P. 1-11.

124. Field C.J. The immunological components of human milk and their effect on immune development in infants // J Nutr. 2005. V.135 (1). P.l-4. Review.

125. Filteau S. M. Milk components with immunomodulatory potential // Adv. Nutr. Res. 2001. V. 10. P. 327-350.

126. Floris R., Redo I., Berkhout В., Visser S. Antibacterial and antiviral effects of milk proteins and derivatives thereof//Curr Pharm Des. 2003. V. 9(16). P. 1257-75.

127. Flynn A. Minerals and trace elements in milk // Adv Food Nutr Res. 1992. V. 36. P. 209-52.

128. Fowler J.E. Jr. Secretory immunity of the prostate gland // Infection. 1991. V. 19 Suppl 3. P. 131-7.

129. Furtmuller P.G., Zederbauer M, Jantschko W., Helm J., Bogner M., Jakopitsch C., Obinger C. Active site structure and catalytic mechanisms of human peroxidases // Arch Biochem Biophys. 2006. V. 445(2). P. 199-213.

130. Garabedian E.M., Humphrey P.A., Gordon J.I. A transgenic mouse model of metastatic prostate cancer originating from neuroendocrine cells // PNAS. 1998. V. 95. P. 15382-15387.

131. Garde S., Sheth A., Porter A.T., Pienta K.J. Effect of prostatic inhibin peptide (PIP) on prostate cancer cell growth in vitro and in vivo И Prostate. 1993. V.22. P. 225233.

132. Gerson C., Sabater J., Scuri M., Torbati A., Coffey R., Abraham J. W., Lauredo I., Forteza R. The lactoperoxidase system functions in bacterial clearance of airways // Am J Respir Cell Mol Biol. 2000. V. 22. P. 665-71.

133. Ghibaudi E., Laurenti E. Unraveling the catalytic mechanism of lactoperoxidase and myeloperoxidase // Eur J Biochem. 2003. V. 270(22). P. 4403-12.

134. Giancotti F.G., Ruoslahti E. Integrin signaling // Science. 1999. V. 285(5430). P. 1028-32.

135. Gifford J.L., Hunter H.N., Vogel H.J. Lactoferricin: a lactoferrin-derived peptide with antimicrobial, antiviral, antitumor and immunological properties // Cell Mol Life Sci. 2005. V. 62(22). P. 2588-98.

136. Gill H.S., Doull F., Rutherfurd K.J., Cross M.L. Immunoregulatory peptides in bovine milk // Br J Nutr. 2000. V. 84. P. 111-7.

137. Gleizes P.E., Munger J.S., Nunes I., Harpel J.G., Mazzieri R., Noguera I., Rifkin D.B. TGF-b Latency: Biological Significance and Mechanisms of Activation // Stem Cells. 1997. V. 15. P. 190-197.

138. Goudemand M. Plasma fibronectin // Rev Fr Transfus Immunohematol. 1983. V. 26(3). P. 279-98.

139. Greene D.R., Fitzpatrick J.M., Scardino P.T. Anatomy of the prostate and distribution of early prostate cancer // Semin Surg Oncol. 1995. V. 11(1). P. 9-22.

140. Grosvenor C.E., Picciano M.F., Baumrucker C.R. Hormones and growth factors in milk // Endocr Rev. 1993. V.14. P. 710-28.

141. Groves M.L., Gordon W.G. The major component of human casein: a protein phosphorylated at different levels //Arch Biochem Biophys. 1970. V. 140(1). P. 47-51.

142. Guilloteau P., he Ниёгои-Ьигоп I., Toullec R., Chayvialle J.A., Zabielski R., Blum J.W. Gastrointestinal regulatory peptides and growth factors in young cattle and sheep //J Vet Med A. 1997. V. 44. P. 1-23.

143. Gupta A.K., Curtis A.S. Lactoferrin and ceruloplasmin derivatized superparamagnetic iron oxide nanoparticles for targeting cell surface receptors // Biomaterials. 2004. V. 25(15). P. 3029-40.

144. Hadom U., Hammon H., Bruckmaier R., Blum J. W. Delaying colostrum intake by 1 day has important effects on metabolic traits and on gastrointestinal and metabolichormones in neonatal calves //J Nutr. 1997. V. 127. P. 2011-23.

145. Hames B.D. One-dimensional gel electrophoresis of proteins. In: Gel Electrophoresis of Proteins. A Practical Approach. New York: Oxford University Press; 1990. P. 106.

146. Hammon H„ Blum J.W. Enhanced xylose absorption in neonatal calves by prolonged colostrum feeding // J Anim Sci. 1997. V. 75. P. 2915-9.

147. Hanson L.A., Korotkova M. The role of breastfeeding in prevention of neonatal infection//Semin Neonatol. 2002. V. 7(4). P. 275-81.

148. Hanson L.A., Korotkova M., Lundin S., Haversen L., Siljverdal S.A., Mattsby-Baltzer /., Strandvik B. & Telemo E. The transfer of immunity from mother to child // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2003. V. 987. P. 199-206.

149. Holden H.M., Rayment I., Thoden J.B. Structure and function of enzymes of the Leloir pathway for galactose metabolism // J Biol Chem. 2003. V. 278(45). P. 43885-8.

150. Holt C., Wahlgren N.M., Drakenberg T. Ability of a beta-casein phosphopeptide to modulate the precipitation of calcium phosphate by forming amorphous dicalcium phosphate nanoclusters // Biochem J. 1996. V. 314 (Pt 3). P. 1035-9.

151. Holt C., Sawyer L. Primary and predicted secondary structures of the caseins in relation to their biological functions // Protein Eng. 1988. V. 2(4). P. 251-9.

152. Hoppu U., Kalliomaki M., Laiho K, Isolauri E. Breast milk—immunomodulatory signals against allergic diseases // Allergy. 2001. V. 56. Suppl 67. P. 23-26.

153. Host A., Halken S. Hypoallergenic formulas-when, to whom and how long: after more than 15 years we know the right indication! // Allergy. 2004. V. 59 Suppl. 78. P. 45-52.

154. Hunziker W. and Kraehenbuhl J-P. Epithelial transcytosis of immunoglobulins. // J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1998. V. 3. P. 287-302.

155. Huppertz Т., Fox P.F., de Kruif KG., Kelly A.L. High pressure-induced changes in bovine milk proteins: a review // Biochim Biophys Acta. 2006. V. 1764(3). P. 593-8.

156. Hynes R.O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines // Cell. 2002. V. 110. P. 673-687.

157. Ibrahim H.R. On the novel catalytically-independent antimicrobial function of hen egg-white lysozyme: a conformation-dependent activity // Nahrung. 1998. V. 42. P. 18793.

158. Ichihara I. Some ultrastructural effects of testosterone and insulin on the ventral prostate of rats in organ culture // Cell Tissue Res. 1977. V. 181(3). P. 327-37.

159. Islam M.A., Kato H., Hayama M., Kobayashi S., Igawa Y., Ota H., Nishizawa 0. Are neuroendocrine cells responsible for the development of benign prostatic hyperplasia? // Eur Urol. 2002. V. 42. P. 79-83.

160. Jan C., Bellaton C., Greenland Т., MornexJ-F. Mammary transmission of caprine arthritis encephalitis virus: a 3D model for in vitro study // Reprod. Nutr. Dev. 2005. V. 45. P. 513-523.

161. Janne J., Alhonen L„ Leinonen P. Polyamines: from molecular biology to clinical applications// Ann Med. 1991. V. 23(3). P. 241-59.

162. Janne J., Alhonen L„ Pietila M., Keinanen T.A. Genetic approaches to the cellular functions of polyamines in mammals // Eur J Biochem. 2004. V. 271(5). P. 877-94.

163. Jensen R.G., Lammi-Keefe C. The anticarcinogenic conjugated fatty acid c9, tl 1-cl8:2, or rumenic acid, in human milk: amounts and effects // Adv. Exp. Med. Biol. 2001. V. 501. P. 153-156.

164. Johnson G.B. Enzyme polymorphism and metabolism. Science. 1974. V. 184(132). P. 28-37.

165. Jolles P, Jolles J. What's new in lysozyme research? Always a model system, today as yesterday // Mol Cell Biochem. 1984. V. 63. P. 165-89.

166. Kalirai H., Clarke R.B. Human breast epithelial stem cells and their regulation // J Pathol. 2006. V. 208. P. 7-16.

167. KanzakiN. Uyeda T.Q., Опита K. Intermolecular interaction of actin revealed by a dynamic light scattering technique // J Phys Chem В Condens Matter Mater Surf Interfaces Biophys. 2006. V. 110(6). P. 2881-7.

168. Keenan T.W., Patton S. The structure of milk: implication for sampling and storage. The milk lipid globule membrane. In Jensen RG, editor. Handbook of milk composition. San Diego: Academic Press; 1995. p. 5 62.

169. Kellokumpu-Lehtinen P., Santti R.S., Pelliniemi L.J. Development of human fetal prostate in culture // Urol Res. 1981. V. 9(2). P. 89-98.

170. Kienber F., Ebner A., Gruber H.J., Hinterdorfer P. Molecular Recognition Imaging and Force Spectroscopy of Single Biomolecules // Acc. Chem. Res. 2006. V. 39. P. 29-36.

171. Kilara A, Panyam D. Peptides from milk proteins and their properties // Crit Rev Food Sci Nutr. 2003. V. 43(6). P. 607-33.

172. Kim Y., Fung L., Michael G., Spencer G. and Duncan M. A Comprehensive characterization of the peptide and protein constituents of human seminal fluid // The Prostate. 2004. V.61. P. 171-181.

173. Kim S.K., Keeney S.E., Alpard S.K. & Schmalstieg F.C. Comparison of L-selectin and CD1 lb on neutrophils of adults and neonates during the first month of life. // Pediatr. Res. 2003. V.53.P. 132-136.

174. Kinbara H., Cunha G.R., Boutin E., Hayashi N. and Kawamura J. Evidence of stem cells in the adult prostatic epithelium based upon responsiveness to mesenchymal inductors // Prostate. 1996. V.29. P. 107-116.

175. Kinsella J.E., Whitehead D.M. Proteins in whey: chemical, physical, and functional properties // Adv Food Nutr Res. 1989. V. 33. P. 343-438.

176. Kirshner J., Hardy J., Wilczynski S., Shively J.E. Cell-cell adhesion molecule CEACAM1 is expressed in normal breast and milk and associates with betal integrin in a 3D model of morphogenesis // J Mol Histol. 2004. V. 35(3). P. 287-99.

177. Kirsty A.G., Leif R.L. ECM degrading proteases and tissue remodelling in the mammary gland // BioEssays. 2005. V. 27. P. 894-903.

178. Klinowska T.C., Soriano J.V., Edwards G.M., Oliver J.M., Valentijn A.J., Montesano R., Streuli C.H. Laminin and betal integrins are crucial for normal mammary gland development in the mouse // Dev Biol. 1999. V. 215. P. 13-32.

179. Knox J.D., Cress A.E., Clark V, Manriquez L., Affinito K.S., Dalkin B.L., Nagle R.B. Differential expression of extracellular matrix molecules and the alpha 6-integrins in the normal and neoplastic prostate // Am J Pathol. 1994. V. 145(1). P. 167-74.

180. Knudsen K.A., Wheelock M.J. Cadherins and the Mammary Gland // Journal of Cellular Biochemistry. 2005. V.95. P. 488^196.

181. Kontopidis G., Holt C., Sawyer L. The ligand-binding site of bovine beta-lactoglobulin: evidence for a function? // J Mol Biol. 2002. V. 318(4). P. 1043-55.

182. Kontopidis G., Holt C., Sawyer L. Invited review: beta-lactoglobulin: binding properties, structure, and function // J Dairy Sci. 2004. V. 87(4). P. 785-96.

183. Kovacs A., Funke S„ Marosvolgyi Т., Burus I., Decsi T. Fatty acids in early human milk after preterm and full-term delivery // J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2005. V. 41(4). P. 454-9.

184. Kreis Т., Vale R. Eds. In: Guidebook to the Extracellular Matrix and Adhesion Proteins//Oxford University Press. 1993. 176p.

185. Kreuter J. Nanoparticles and nanocapsules-new dosage forms in the nanometer size range // Pharm Acta Helv. 1978. V. 53(2). P. 33-9.

186. Kulski J.K., Hartmann P.E. Changes in human milk composition during the initiation of lactation//Aust J Exp Biol Med Sci. 1981. V. 59(1). P. 101-14.

187. Kuwasako K., Kida 0., Kitamura K., Kato J., Eto T. Plasma adrenomedullin in cerebrovascular disease: a possible indicator of endothelial injury // Int Angiol. 1997. V. 16(4). P. 272-9.

188. Lin M.F., Clinton G.M. Human prostatic acid phosphatase has phosphotyrosyl protein phosphatase activity // Biochem J. 1986. V. 235(2). P. 351-7.

189. Lindberg Т., Ohlsson K., Westrom B. Protease inhibitors and their relation to proteases in human milk // Pediatr Res. 1982. V. 16. P. 479-83.

190. Liu Y., Franklin R.B., Costello L.C. Prolactin and testosterone regulation of mitochondrial zinc in prostate epithelial cells // Prostate. 1997. V.30 (1). P. 26-32.

191. Lombardo D. Bile salt-dependent lipase: its pathophysiological implications // Biochim Biophys Acta. 2001. V. 1533(1). P. 1-28.

192. Lonnerdal B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins // Am J Clin Nutr. 2003. V. 77(6). P. 1537-1543.

193. Lonnerdal B. Human milk proteins: key components for the biological activity of human milk// Adv Exp Med Biol. 2004. V. 554. P. 11-25.

194. Lyubchenko Y.L., Sherman S., Shlyakhtenko L.S., Uversky V.N. Nanoimaging for protein misfolding and related diseases // J Cell Biochem. 2006. V. 99(1). P. 52-70.

195. Maga E.A., Anderson G.B., Cullor J.S., Smith W., Murray J.D. Antimicrobial properties ofhuman lysozyme transgenic mouse milk// J Food Prot. 1998. V. 61. P. 52-6.

196. Magi В., Ietta F., Romagnoli R., et al. Presence of macrophage migration inhibitory factor in human milk: evidence in the aqueous phase and milk fat globules // Pediatr Res. 2002. V. 51. P. 619-24.

197. Malinda K.M., Kleinman H.K. The laminins // Int. J. Biochem Cell Biol. 1996. V. 28. P. 957-959.

198. Mao F.C., Bremel R.D., Dentine M.R. Serum concentrations of the milk proteins alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin in pregnancy and lactation: correlations with milk and fat yields in dairy cattle // J Dairy Sci. 1991. V. 74(9). P. 2952-8.

199. Margolis L., Hatfill S., Chuaqui R., Vocke C., Emmert-Buck M„ Linehan W.M., Duray P.H. Long term organ culture of human prostate tissue in a NASA-designed rotating wall bioreactor// J Urol. 1999. V. 161(1). P. 290-7.

200. Marker P.C., Donjacour A.A., Dahiya R., Cunha G.R. Hormonal, cellular, and molecular control of prostatic development // Developmental Biology. 2003. V. 253. P. 165-174.

201. Marshall K. Therapeutic applications of whey protein // Altera Med Rev. 2004. V. 9(2). P. 136-56.

202. Martin R.H., Glass M.R., Chapman C., Wilson G.D., Woods K.L. Human alpha-lactalbumin and hormonal factors in pregnancy and lactation // Clin Endocrinol (Oxf). 1980. V. 13(3). P. 223-30.

203. Martin-Sosa S., Martin M.J., Garcia-Pardo L.A., Hueso P. Sialyloligosaccharides in human and bovine milk and in infant formulas: variations with the progression of lactation // J Dairy Sci. 2003. V. 86(1). P. 52-9.

204. Mather I.H. A review and proposed nomenclature for major proteins of the milk fat globule membrane //J. Dairy Sci. 2000. V. 83. P. 203^17.

205. Mather I.H., Keenan T. W Origin and secretion of milk lipids // JAMA. 1998. V.3. P. 259-273

206. Matthews S.B., Waud J.P., Roberts A.G., Campbell A.K. Systemic lactose intolerance: a new perspective on an old problem // Postgrad Med J. 2005. V. 81(953). P. 167-73.

207. McGuffey M.K., Epting K.L., Kelly R.M., Foegeding E.A. Denaturation and aggregation of three alpha-lactalbumin preparations at neutral pH // J Agric Food Chem. 2005. V. 53(8). P. 3182-90.

208. McMinn J.E., Baskin D.G., Schwartz M.W. Neuroendocrine mechanisms regulating food intake and body weight // Obes Rev. 2000. V. 1(1). P. 37-46.

209. McNeal J.E. The prostate gland: morphology and pathology // MonogrUrol. 1983. V. 4. P. 3.

210. Meisel H. Multifunctional peptides encrypted in milk proteins // Biofactors. 2004. V. 21(1-4). P. 55-61.

211. Meisel H., FitzGerald R.J. Biofunctional peptides from milk proteins: mineralbinding and cytomodulatory effects // Curr Pharm Des. 2003. V. 9(16). P. 1289-95.

212. Menard D., Pothier P. Radioautographic localization of epidermal growth factor receptors in human fetal gut. // Gastroenterology. 1991. V.101. P.640-9.

213. Meredith D. and Boyd C.A.R. Oligopeptide transport by epithelialcells // J Membr Biol. 1995. V. 145. P. 1-12.

214. Michalski M.C., Briard V., Michel F„ Tasson F„ Poulain P. Size distribution of fat globules in human colostrum, breast milk, and infant formula // J Dairy Sci. 2005. V. 88(6). P. 1927-40.

215. Miller R.J., Cuatrecasas P. Enkephalins and endorphins. Vitam Horm. 1978. V. 36. P. 297-382.

216. Miller J.B., Bull S., Miller J., McVeagh P. The oligosaccharide composition of human milk: temporal and individual variations in monosaccharide components // J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1994. V. 19(4). P. 371-6.

217. Monks J., Neville M.C. Albumin transcytosis across the epithelium of the lactating mouse mammary gland//J Physiol. 2004. Oct 1. 560 (Pt 1). P. 267-80.

218. Moore B.E. A soluble protein characteristic of the nervous system // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1965. V. 19(6). P. 739-744.

219. Moore B.W. Chemistry and biology of the S-100 proteins 11 Scand. J. Immunol. (Suppl.). 1982. V. 9. P. 53-74.

220. Moore B.W., McGregor D. Chromatographic and electrophoretic fractionation of soluble proteins of brain and liver// J. Biol. Chem. 1965. V. 240. P. 1647-1653.

221. Murakami K., Lagarde M., Yuki Y. Identification of minor proteins of human colostrum and mature milk by two-dimensional electrophoresis //Electrophoresis. 1998. V. 19. P. 2521-7.

222. Muschler J., Levy D., Boudreau R., Henry M., Campbell K., Bissell M.J. A role for dystroglycan in epithelial polarization: loss of function in breast tumor cells // Cancer Res. 2002. V. 62. P. 7102-7109.

223. Naidu S.S., Svensson U„ et. al. Relationship between antibacterial activity and porin binding of lactoferrin in Escherichia coli and Salmonella typhimurium // Antimicrob Agents Chemother. 1993. V. 37. P. 240-5.

224. Nakano Т., Sugawara M., Kawakami H. Sialic acid in human milk: compositionand functions // Acta Paediatr Taiwan. 2001. V. 42(1). P. 11-7.

225. Nakata R. Alpha lactalbumin // Nippon Rinsho. 2004. V. 62 Suppl 11. P. 288-90.

226. Nichols B.L., McKee K.S., Henry J.F., Putman M. Human lactoferrin stimulates thymidine incorporation into DNA of rat crypt cells // Pediatr Res. 1987. V. 21. P. 563-7.

227. Nicholson J.K., Foxall P.J., Spraul M., Farrant R.D., Lindon J.C. 750 MHz 1H and 1H-13C NMR spectroscopy of human blood plasma // Anal Chem. 1995. V. 67(5). P. 793-811.

228. Nicola N.A. Cytokine pleiotropy and redundancy: a view from the receptor // Stem Cells. 1994.12 Suppl l.P. 3-12.

229. Nishimura T. Expression of potential lymphocyte trafficking mediator molecules in the mammary gland // Vet. Res. 2003. V. 34. P. 3-10.

230. Nukumi N., Iwamori Т., Naito K., Tojo H. Whey acidic protein (WAP) depresses the proliferation of mouse (MMT) and human (MCF-7) mammary tumor cells // J Reprod Dev. 2005. V. 51(5). P. 649-56.

231. Ogundele M.O. Inhibitors of complement activity in human breast-milk: a proposed hypothesis of their physiological significance //Mediat Inflamm. 1999. V. 8. P. 69-75.

232. Oddy W. The impact of breast milk on infant and child health // Breastfeed Rev. 2002. V. 10. N. 3. P. 5-18.

233. Olivier J.-C. Drug Transport to Brain with Targeted Nanoparticles // The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2005. V. 2. P. 108-119.

234. Ollivier-Bousquet M. Transferrin and prolactin transcytosis in the lactating mammary epithelial cell. 1998 // J Mammary Gland Biol Neoplasia. V. 3. P. 303-313.

235. O'neill В., Magnolato D., and Semenza G. The electrogenic and Na-dependent iodide transport system in plasma membrane vesicles from thyroid glands // Biochim Biophys Acta. 1987. V. 896. P. 263-274.

236. Опита K, Kanzaki N., Kobayashi N. Association of calcium phosphate and fibroblast growth factor-2: a dynamic light scattering study // Macromol. Biosci. 2004. V. 21. P. 39-46.

237. Osserman E.F., Canfield R.E., Beychok S. Lysozyme. Academic Press, New York and London, 1974.

238. Parrish A.R., Sallam K., Nyman D. W., Orozco J., Cress A.E., Dalkin B.L., Nagle

239. R.B,, Gandolfi A.J. Culturing precision-cut human prostate slices as an in vitro model of prostate pathobiology // Cell Biol Toxicol. 2002. V. 18(3). P. 205-19.

240. Peaker M. and Wilde C.J. Feedback control of milk secretion from milk 11 J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1996. V. 1. P. 307-315.

241. Peehl D.M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development // Endocr Relat Cancer. 2005. V. 12(1). V. 19-47.

242. Pellegrini A., Thomas U., von Fellenberg R., Wild P. Bactericidal activities of lysozyme and aprotinin against gram-negative and gram-positive bacteria related to their basic character//J Appl Bacteriol. 1992. V. 72(3). P. 180-7.

243. Persechini A., Moncrief N.D., Kretsinger R.H. The EF-hand family of calcium-modulated proteins // TINS. 1989. V. 12. P. 462-467.

244. Peterson J.A., Patton S., Hamosh M. Glycoproteins of the human milk fat globule in the protection of the breast-fed infant against infections //Biol Neonate. 1998. V. 74. P. 143- 62.

245. Petricoin E.F., Ornstein D.K., Liotta L.A. Clinical proteomics: Applications for prostate cancer biomarker discovery and detection // Urol Oncol. 2004. V. 22(4). P. 3228.

246. Pickart L., Thaler M.M. Tripeptide in human serum which prolongs survival of normal liver cells and stimulates growth in neoplastic liver // Nat New Biol. 1973. V. 243(124). P.85-7.

247. Pierson R., Temin H. The partial purification from calf serum of a fraction with multiplication-stimulating activity for chicken fibroblasts in cell culture and with non-suppressible insulin-like activity//J. Cell Physiol.1972. V. 79. P. 319-330.

248. Pitelka D.R., Hamamoto S.T., Duafala J.G., Nemanic M.K. Cell contacts in the mouse mammary gland // J Cell Biol. 1973. V. 56. P. 797-818.

249. Pourpak Z., Farhoudi A., Mahmoudi M., Movahedi M., Ghargozlou M., Kazemnejad A., Eslamnoor B. The role of cow milk allergy in increasing the severity of atopic dermatitis // Immunol. Invest. 2004. V. 33. N. 1. P. 69-79.

250. Provencher S. W. И Makromol. Chem. 1985. B.82. №15 P. 632.

251. Rackley R.R., Yang В., Pretlow T.G., et al. Differences in the leucine aminopeptidase activity in extracts from human prostatic carcinoma and benign prostatic hyperplasia // Cancer. 1991. V.68 (3). P. 587-93.

252. Randa M., Hamade L. et al. Anti-a-Galactosyl Immunoglobulin A (IgA), IgG, and IgM in Human Secretions //Clinical and diagnostical laboratory immunology. 1995. V.3. P. 125-131.

253. Reiter В. Review of the progress of dairy science: antimicrobial systems in milk // J Dairy Res. 1978. V. 45(1). P. 131-47.

254. Reiter B. in The Lactoperoxidase System, Chemistry and Biological Significance (Pruitt K.M., Tenovuo J.O., ed.), Marcel Dekker, New York, 1985. pp. 123.

255. Reya Т., Morrison S.J., Clarke M.F., Weissman I.L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells // Nature. 2001. V. 414. P. 105-111.

256. Romas N.A., Kwan D.J. Prostatic acid phosphatase; biomolecular features and assays for serum determination // Urol Clin North Am.1993. V.20 (4). P. 581-8.

257. Ronquist G., Nilsson B.O. The Janus-faced nature of prostasomes: their pluripotency favours the normal reproductive process and malignant prostate growth // Prostate Cancer and Prostatic Diseases. 2004. V.7. P. 21-31.

258. Rosen J.M., Li S., Raught В., Hadsell D. The mammary gland as a bioreactor: factors regulating the efficient expression of milk protein-based transgenes // Am J Clin Nutr. 1996. V. 63(4). P. 627-32.

259. Roy-Burman P., Wu H., Powell W.C., Hagenkord J. and Cohen M.B. Genetically defined mouse models that mimic natural aspects of human prostate cancer development // Endocrine-Related Cancer. 2004. V. 11. P. 225-254.

260. Santella L. The role of calcium in the cell cycle: facts and hypotheses // Biochem Biophys Res Commun. 1998. V. 244(2). P. 317-24.

261. Sato T.N., Hayashi M. Purification and characterization of bovine milk fibronectin //J Dairy Res. 1985. V. 52(4). P. 507-11.

262. Sava G., Ceschia V., Zabucchi G. Evidence for host-mediated antitumor effects of lysozyme in mice bearing the MCa mammary carcinoma // Eur J Cancer Clin Oncol. 1988. V. 24. P. 1737-43.

263. Scibior D., Czeczot H. Catalase: structure, properties, functions // Postepy Hig Med Dosw. 2006. V. 60. P. 170-80.

264. Schafer B.W., Heizmann C.W. The SI00 family of EF-hand calcium-binding proteins: function and pathology // TIBS. 1996. V. 21. P. 134-140.

265. Shahani K.M., Herper W.J., Jensen R.G., Parry R.M. Jr., Zittle C.A. Enzymes in bovine milk: a review // J Dairy Sci. 1973. V. 56(5). P. 531-43.

266. Sharom F.J., Lehto M.T. Glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins: structure, function, and cleavage by phosphatidylinositol-specific phospholipase С // Biochem Cell Biol. 2002. V. 80(5). P. 535-49.

267. Shashoua V.E., Hesse G. W, Moore B. W. Proteins of the Brain Extracellular Fluid: Evidence for Release of S-100 Protein // J. of Neurochemistry. 1984. V. 42. № 6. P. 1536-1541.

268. Schlesinger D.H., Pickart L., Thaler M.M. Growth-modulating serum tripeptide is glycyl-histidyl-lysine // Experientia. 1977. V. 33(3). P. 324-5.

269. Schlimme E., Meisel H. Bioactive peptides derived from milk proteins. Structural, physiological and analytical aspects //Nahrung. 1995. V. 39. P. 1-20.

270. Schryvers A.B., Bonnah R., et. al. Bacterial lactoferrin receptors //Adv Exp Med Biol. 1998. V. 443. P. 123-33.

271. Shennan D.B, Grant T.A., Ramsay R.R., Burns C., and Zammit V.A. Characteristics of L-carnitine transport by lactating rat mammary tissue // Biochim Biophys Acta. 1998. V. 1393. P. 49-56.

272. Shennan D. В., Peaker M. Transport of Milk Constituents by the Mammary Gland //Physiol. Rev. 2000. V. 80(3). P. 925-951.

273. Shillingford J.M., Calvert D.T., Beechey R.B., and Shennan D.B. Phosphate transport via Na+-Pi cotransport and anion exchange in lactating rat mammary tissue // Exp Physiol. 1996. V. 81. P. 273-284.

274. Shukeir N., Arakelian A., Kadhim S., Garde S., Rabbani S. Prostate secretory protein PSP-94 decreases tumor growth and hypercalcemia of malignancy in a syngenic in vivo model of prostate cancer // Cancer Res. 2003. V. 63 (9). P. 2072-2078.

275. Smalley M., Ashworth A. Stem cells and breast cancer: a field in transit // Nature Rev Cancer. 2003. V. 3. P. 832-844.

276. Smith-Kirwin S.M., O'Connor D.M., Johnston J., de Lancey E., Hassink S.G., and Funanage V.L. Leptin expression in human mammary epithelial cells in breast milk // J Clin Endocrinol Metab. 1998. V.83. P. 1810-1813.

277. Sood S.M., Herbert P.J., Slattery C.W. The pH-dependent Dissociation of fa-Casein from HumanMilk Micelles: Role of Electrostatic Interactions // J Dairy Sci. 1998. V. 81. P. 3149-3153.

278. Sood S.M., Slattery C.W. Suspension of the Calcium-Sensitive Human ^-Caseins by Human к-Casein // J. Dairy Sci. 2002. V. 85. P. 1353-1356.

279. Sood S.M., Slattery C.W. The Use of Lithium Chloride to Study Human Milk Micelles // J. Dairy Sci. 2003. V. 86. P. 78-85.

280. SoodS.M., Erickson G., Slattery C.W. лг-Casein Interactions in the Suspension of the Two Major Calcium-Sensitive Human /^-Caseins // J. Dairy Sci. 2003. V. 86. P. 2269-2275.

281. SoodS.M., Herbert P.J., Slattery C.W. Structural Studies on Casein Micelles of Human Milk: Dissociation of b-Casein of Different Phosphorylation Levels Induced by Cooling and Ethylenediaminetetraacetate // J Dairy Sci. 1997. V. 80. P. 628-633.

282. Sood S.M., Erickson G., Slattery C. W. Formation of reconstituted casein micelles with human beta-caseins and bovine kappa-casein // J Dairy Sci. 2002. V. 85(3). P. 4727.

283. Soukka Т., Tenovuo J., et al. Agglutination of Streptococcus mutans serotype С cells but inhibition of Porphyromonas gingivalis autoaggregation by human lactoferrin // Arch Oral Biol. 1993. V. 38(3). P. 227-32.

284. Stepanek P. Dynamic Light Scattering. The method and some applications // Ed. By Brown W. Oxford: Clarendron Press, 1993. P. 177.

285. Sternlicht M.D., Werb Z. How matrix metalloproteinases regulate cell behavior // Annu Rev Cell Dev Biol. 2001. V. 17. P. 463-516.

286. Stingl J., Raouf A., Emerman J.T., Eaves C.J. Epithelial progenitors in the normal human mammary gland // J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2005. V. 10. P. 49-59.

287. Streuli C. Extracellular matrix remodelling and cellular differentiation // Curr Opin Cell Biol. 1999. V. 11(5). P. 634-40.

288. Streuli C., Schmidhauser C., Kobrin M., Bissel M., Derynck R. Extracellular matrix regulates expression of the TGF-|3l gene // J. Cell Biol. 1993. V.120. P.253-260.

289. Streuli C., Schmidhauser C., Bailey N. Yurchenco P., Skubitz A., Roskelley C., Bissell M. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia // J. Cell Biol. 1995. V.129. P.591-603.

290. Stridsberg M., Fabiani R., Lukinius A., Ronquist G. Prostasomes are neuroendocrine-like vesicles in human semen // Prostate. 1996. V.29. P. 287-295.

291. Swaisgood H.E. Symposium: genetic perspectives on milk proteins: comparatives studies and nomenclature // J Dairy Sci. 1993. V. 76. P. 3054-3061.

292. Tenovuo J.O. in The Lactoperoxidase System, Chemistry and Biological Significance (Pruitt K.M., Tenovuo J.O., ed.), Marcel Dekker, New York, 1985. pp. 101.

293. Thorpe, L. W., Rudloff, H.E., Powell, L.C. & Goldman, A.S. Decreased response of human milk leukocytes to chemoattractant peptides // Pediatr. Res. 1986. V.20. P. 373— 377.

294. Tran C.P., Lin C„ Yamashiro J. and Reiter R.E. Prostate stem cell antigen is a marker of late intermediate prostate epithelial cells // Mol Cancer Res. 2002. V.l. P. 113121.

295. Triplett A.A., Sakamoto K., et al. Expression of the whey acidic protein (Wap) isnecessary for adequate nourishment of the offspring but not functional differentiation of mammary epithelial cells//Genesis. 2005. V. 43(1). P. 1-11.

296. Tsuda H., Sekine K., et. al. Cancer prevention by bovine lactoferrin and underlying mechanisms-a review of experimental and clinical studies // Biochem Cell Biol. 2002. V. 80. P. 131-6.

297. Turner M.L. Cell adhesion molecules: a unifying approach to topographic biology //Biol. Rev. 1992. V. 67. P. 359-377.

298. Uthne K. Human somatomedins. Purification and some studies on their biological action // Acta Endocrinology (Suppl.) 1973. V. 175. P. 1-35.

299. Utleg A.G., Eugene С., Tao X., Shannon P., White J., Goodlett D., HoodL., Lin B. Proteomic analysis of human prostasomes // The Prostate. 2003. V.56. P. 150-161.

300. Uzgare A.R., Xu Y„ Isaacs J.T. In Vitro Culturing and Characteristics of Transit Amplifying Epithelial Cells From Human Prostate Tissue // Journal of Cellular Biochemistry. 2004. V. 91. P. 196-205.

301. Volenti P., Antonini G. Lactoferrin: an important host defence against microbial and viral attack // Cell Mol Life Sci. 2005. V. 62(22). P. 2576-87.

302. Van de Perre P. Transfer of antibody via mother's milk // Vaccine. 2003. V. 21(24). P. 3374-6.325. van der Strate B.W., Beljaars L., et al. Antiviral activities of lactoferrin // Antiviral Res. 2001. V. 52. P. 225-39.

303. Vesa Т.Н., Marteau P., Korpela R. Lactose intolerance // J Am Coll Nutr. 2000. V. 19(2 Suppl). P. 165-175.

304. Vidal K, van den B. P., Lorget F. & Donnet-Hughes A. Osteoprotegerin in human milk: a potential role in the regulation of bone metabolismand immune development // Pediatr. Res. 2004. V. 55. P. 1001-1008.

305. Viverge D., Grimmonprez L., Cassanas G., Bardet L., Solere M. Variations in oligosaccharides and lactose in human milk during the first week of lactation // J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1990. V. 11(3). P. 361-4.

306. Vogel W.F. Collagen-receptor signaling in health and disease // Eur J Dermatol. 2001. V. 11. P. 506-514.

307. Wada J., Makino H. Galectins, galactoside-binding mammalian lectins: clinicalapplication of multi-functional proteins // Acta Med Okayama. 2001. V. 55(1). P. 11-7.

308. Walker W. The dynamic effects of breastfeeding on intestinal development and host defense//Adv. Exp. Med. Biol. 2004. V. 554. P. 155-70.

309. Wang В., Brand-Miller J., McVeagh P., Petocz P. Concentration and distribution of sialic acid in human milk and infant formulas // Am J Clin Nutr. 2001. V. 74(4). P. 510-5.

310. Warfield P.R., Makker P.N., Raz A., Ochieng J. Adhesion of human breast carcinoma to extracellular matrix proteins is modulated by galectin-3 // Invasion Metastasis. 1997. V. 17. P. 101-112.

311. Wendrinska A, Addey C. V.P., Orange P.R., Boddy L.M., Hendry K.A.K., and Wilde C.J. Effect of a milk fat globule membrane fraction on cultured mouse mammary cells (Abstract) // Biochem Soc Trans. 1993. V. 21. P. 220.

312. Wilson C.M. Staining of proteins on gels: comparison of dyes and procedures // Methods in Enzymol. 1983. V. 91. P. 236-247.

313. Wiseman B.S., Werb Z. Stromal effects on mammary gland development and breast cancer// Science. 2002. V. 296(5570). P. 1046-9.

314. Wiseman B.S., Sternlicht M.D., LundL.R., Alexander C.M., Mott J., et al. Site-specific inductive and inhibitory activities of MMP-2 and MMP-3 orchestrate mammary gland branching morphogenesis // J Cell Biol. 2003. V. 162. P. 1123-1133.

315. WongN.P., LaCroix D.E., AlfordJ.A. Mineral content of dairy products. I. Milk and milk products // J Am Diet Assoc. 1978. V. 72(3). P. 288-91.

316. Woodward W.A., Chen M.S., Behbod F., Rosen J.M. On mammary stem cells // Journal of Cell Science. 2005. V. 118. P. 3585-3594.

317. Yalcin A.S. Emerging therapeutic potential of whey proteins and peptides // Curr Pharm Des. 2006. V. 12(13). P. 1637-43.

318. Yamauchi K., Tomita M., et.al. Antibacterial activity of lactoferrin and a pepsin-derived lactoferrin peptide fragment //Infect Immun. 1993. V. 61. P. 719-28.

319. Yang J.P., Finkelman M.A. and Clarke M. W. Detection of PSP94 and its specific binding sites in the prostate adenocarcinoma cell line LNCaP // J. Urol. 1998. V.160. P. 2240-2244.

320. Zimmer D.B., Cornwall E.H., Landar A., Song W. The S-100 protein family: history, function, and expression // Brain Research Bulletin. 1995. V. 37. P. 417-429.

321. Zhurinsky J., Shtutman M., Ben-Ze'ev A. Plakoglobin and b-catenin: protein interactions, regulation and biological roles // Journal of Cell Science. 2000. V. 113. P. 3127-3139.