Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные белки, выделенные из тканей млекопитающих

Борисенко, Андрей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные белки, выделенные из тканей млекопитающих
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные белки, выделенные из тканей млекопитающих"

На правах рукописи

Борисенко Андрей Владимирович

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ В СВЕРХМАЛЫХ ДОЗАХ РЕГУЛЯТОРНЫЕ БЕЛКИ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ТКАНЕЙ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03 00 02 биофизика 03.00 23 биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

003164173

Работа выполнена в Институте биологии развития им Н К Кольцова РАН и в Институте элементорганических соединений им А Н Несмеянова РАН

Научные руководители

доктор биологических наук Виктория Петровна Ямскова доктор химических наук, профессор Игорь Александрович Ямсков

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Надежда Павловна Пальмина доктор химических наук Вера Александровна Кеменова

Ведущая организация

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита состоится _200^г в ^ часов

на заседании Диссертационного совета Д 002 239 01 при Институте биохимической физики им Н М Эмануэля по адресу 119334, Москва, ул Косыгина, д 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики имени НН Семенова РАН

ЬЧ О/ $

Автореферат разослан "___200»г

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

М А Смотряева

Введение

Актуальность темы

В последние годы наблюдается возрастающий интерес исследователей к действию сверхмалых доз (СМД) биологически активных веществ

Опубликованы данные для разнообразных групп биологически активных веществ (гормонов, эндогенных регуляторных пептидов, ряд веществ не пептидной природы и др) Исследование влияния СМД представляет интерес, так как может привести к созданию новых лекарственных веществ или к выявлению новых существенно важных свойств уже известных Наблюдаемые эффекты возможно объяснить при помощи различных гипотез концентрирование лекарственного вещества, наличие высокоэффективных систем проведения и усиления рецепторного сигнала, "адаптации" рецепторов к действию СМД [Сазанов, Зайцев, 1992, Бурюкова и др, 2004], существованием супервысокоаффинных рецепторов и др [Бурчакова и др, ¡990] Но неоспоримым является факт достоверного воздействия СМД на биологический объект, которые могут совпадать или не совпадать с действием больших доз Для многих веществ было показано, что эффекты сверхмалых доз примерно совпадают по силе и величине с наблюдаемыми при действии больших доз [Sergeeva et а!, ! 996]

Благодаря разработке методов выделения и биотестирования удалось выделить и охарактеризовать ранее не идентифицированные регуляторные факторы, белковой природы, проявляющие биологическую активность в СМД [Ямскова и др , 1978, Ямскова, Резникова, ¡991] Действие регуляторных белков (РБ) данной группы в СМД реализуется в рамках концепции, в основе которой лежат представления о нарушениях регуляции органно-тканевого гомеостаза как первопричины развития любой патологии и об изменении состояния воды в биологических жидкостях под действием РБ в СМД, причем вода является матрицей для переноса регуляторного сигнала [Ямскова и др, 1998, Ямское и dp, 1999, Бурчакова и др, 2004]

Цель и задачи исследования

Исследование мембранотропной, специфической биологической активности регуляторных белков, действующих в сверхмалых дозах, а также некоторых физико-химических свойств В отдельные задачи входили

1 Выделение регуляторных белков из печени, легкого, тонкого кишечника, желчи млекопитающих и получение их в высокоочищенном состоянии

2 Изучение дозовой зависимости мембранотропной активности регуляторных белков

3 Изучение физико-химических свойств регуляторных белков

4 Изучение локализации регуляторных белков в ткани печени позвоночных животных

5 Разработка новой экспериментальной модели роллерного органного культивирования ткани печени тритона in vitro для исследования специфической биологической активности регуляторных белков, выделенных из печени, сыворотки крови и желчи млекопитающих

6 Изучение биологического действия регуляторных белков, выделенных из печени, желчи и сыворотки крови млекопитающих на органной культуре печени тритона т vitro

Научная новизна работы

Впервые в тканях печени, легкого, тонкого кишечника и желчи млекопитающих, были идентифицированы РБ, действующие в СМД Было показано, что в тканях РБ присутствуют в виде нескольких фракций, преобладающими из которых являются фракции кислых и основных белков Изучение физико-химических свойств данных РБ показало, что они представляют собой низкомолекулярные белки, во вторичной структуре которых преобладают В-структуры и статистический клубок Показано, что в водных растворах РБ ассоциированы и присутствуют в виде наноразмерных частиц По физико-химическим свойствам данные белки сходны с РБ, которые были ранее идентифицированы в других тканях млекопитающих Для РБ печени и сыворотки крови была изучена их локализация в ткани печени позвоночных животных и показано, что оба белка являются внеклеточными Впервые была разработана модель роллерного органного культивирования ткани печени тритона, на которой было изучено специфическое действие РБ, выделенных из ткани печени, сыворотки крови и желчи Установлено, что только РБ печени и сыворотки крови проявляют специфическое действие на состояние печени тритона при культивировании РБ печени стимулирует клетки макрофагального ряда, а РБ сыворотки стимулирует клетки кроветворного ряда В отдельном эксперименте была продемонстрирована способность РБ желчи уменьшать размеры частиц желчи человека т vitro Таким образом, благодаря применению различных экспериментальных моделей для изучения специфической активности РБ, выделенных из различных источников, было установлено, что их биологическое действие различается, несмотря на проявление ими сходных физико-химических свойств и мембранотропной активности в СМД

Практическая значимость

В данной работе впервые показано специфическое действие в СМД РБ, выделенных из печени, сыворотки крови и желчи Полученные данные позволяют

поставить вопрос о разработке новых фармакологических препаратов на основе данных РБ Результаты проведенного исследования указывают на проявление РБ печени гепатопротекторных свойств, а также на возможность применения РБ сыворотки крови для лечения некоторых гематопатологий, а РБ желчи - для лечения и профилактики желчекаменной болезни Разработанная роллерная органная культура ткани печени тритона может быть рекомендована в качестве модели для первичного скрининга веществ, для которых предполагается проявление гепатопротекторных свойств В отдельной серии экспериментов была продемонстрирована выраженная лечебно-профилактическая активность РБ тонкого кишечника на развитие инфекции, вызванной высокопатогенным штаммом вируса гриппа птиц A/H5N1 В этом же опыте была показана профилактическая активность РБ сыворотки крови

Апробация результатов исследования

Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых Института биологии развития им Н К Кольцова РАН Москва, 8 декабря, 2004, на V Всероссийском научном семинаре и молодежной научной школе «Химия и медицина» Уфа, 5-8 сентября, 2005, на конференции «Биология стволовых клеток фундаментальные аспекты» 17-18 ноября, 2005, Москва, на конференции молодых ученых Института биологии развития им НК Кольцова РАН Москва, 21 декабря, 2005, на V ежегодной Международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, 14-16 декабря, 2005, на IV Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 3-7 июля, 2006

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 139 страницах и включает следующие главы

Введение, в котором рассмотрены актуальность, новизна, практическая значимость

работы

Обзор читературы, в котором рассмотрены общие положения клеточной адгезии, компоненты внеклеточного матрикса, а также белки участвующих в адгезии по типу "клетка-клетка" Рассмотрена пространственная организация межклеточного пространства в печени млекопитающих Охарактеризованы известные до настоящей работы РБ, биологически активные в СМД, а также адгезиометрические методы исследования РБ из ткани печени

Экспериментальная часть, посвящена описанию материалов и основных методов, с помощью которых было проведено данное исследование

Результаты и их обсуждение, глава, в которой представлены результаты, полученные при идентификации РБ в печени, легком, тонком кишечнике и желчи, а также при исследовании их физико-химических свойств и изучения мембранотропной и специфической активности, проявляемой в СМД.

Заключение - раздел, который также входит в данную главу в котором представлены предположения о возможном механизме биологического действия изучаемых РБ. Выводы. Диссертация содержит 10 таблиц, 17 рисунков, 337 литературные ссылки. Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Результаты и их обсуждение Выделение и очистка регуляторных белков печени, легкого, тонкого кишечника крыс \Vistar, а также желчи КРС

РБ выделяли из ткани печени, легкого, тонкого кишечника, а также из желчи, по методике, разработанной для РБ данной группы, которая исключает механическую и ферментативную обработку ткани и способствует переходу в экстракт секретируемых белков [Ямскова и др., 1977; Ямское и др., 1999]. После высаливания основной массы белков из экстрактов РБ остаются в растворенном состоянии. Полученные супернатанты подвергали фракционированию с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ). В процессе очистки фракции, содержащие РБ, идентифицировали с помощью метода биотестирования, специально разработанного ранее для определения биологически активных в СМД РБ [Ямскова, Резникова, 1991].

Изучение мембранотропной активности фракций регуляторных белков, выделенных из печени, легкого, тонкого кишечника и желчи млекопитающих

Во всех изучаемых тканевы экстрактах, а также в желчи, были обнаружены фракции кислых и основных РБ. Следует отметить, что кислые белки всегда были представлены в больших количествах в сравнении с другими фракциями РБ. На рис. 1 в качестве примера приведена картина разделения супернатанта печени крыс с помощью ИЭФ.

Рис.1. Изоэлектрофокусирование

супернатанта печени крыс \Vistar. По ординате 1-значения рН,

соответствующие номерам фракций. По ординате 2-значения оптической плотности соответствующих фракций при длине волны 280 нм; по абсциссе -номера фракций.

В таблице I представлены данные биотестирования фракций кислых РБ, которые показывают, что идентифицированные РБ проявляют мембранотропную активность в концентрациях, соответствующих 10"12-10"'6 мг белка в мл, аналогичные данные были получены для основных РБ.

Таблица 1. Биотестирование кислых и основных фракций супернагантов содержащих регуляторные белки

исследуемая фракция исходная концентрация мг/мл интервал разбавления фракции, в котором проявляется мембранотропная активность

фракция кислых белков печени 0.08 10,2-10'4

фракция кислых белков легкого 0.02 10"-10ы

фракция кислых белков желчи 0.02 10и,-1012

фракция кислых белков тонкого кишечника 0.06 1010-1012

фракция основных белков печени 0.02 1012-]0н

фракция основных белков легкого 0.08 10»-10ц

фракция основных белков желчи 0.09 1012-10'4

фракция основных белков тонкого кишечника 0.09 107-10"'

Биотестирование РБ показало, что мембранотропиый эффект имеет полимодальную дозовую зависимость, а проявление биологической активности наблюдается как в области низких, так и в области сверхнизких концентраций.

В качестве примера приводится диаграмма биотестирования для кислого регуляторного белка, выделенного из печени (рис. 2).

Рис. 2. Мембранотропное действие кислого регуляторного белка печени (метод биотестирования). По ординате - величина эффекта Эа (%) /Ямскова, Резникова 1999];

по абсциссе - показатель степени десятикратного разбавления.

к - контроль; столбцы - воздействие фракции в разбавлении 10х, где х - показатель степени десятикратного разбавления изучаемого препарата.

При изучении супернатанта печени было идентифицировано четыре фракции содержащих белки, проявляющих мембранотропную активность в СМД: в области рН<3.0 (кислый РБ); в области рН 4.5-5.1 (слабокислый РБ); в области рН 6.7-7.2; в области рН>8.0 (основной РБ) (рис. 1).

Основные характеристики ИЭФ-фракций, содержащих РБ, выделенных из супернатанта печени крыс приведены в табл. 2.

Как видно из таблицы 2, в тканевом экстракте печени кроме кислых и основных РБ присутствуют еще два РБ, проявляющих мембранотропную активность в СМД Можно предположить, что РБ со значением изоэлектрической точки в интервале рН 4 5-5 1, представляет собой РБ, ранее обнаруженный в сыворотках крови позвоночных животных, который характеризовался отсутствием тканевой специфичности мембранотропного действия (т е изменял свойства плазматической мембраны как клеток печени, так и клеток легкого in vitro) [Ячскова, Резникова, 199!, Ямское и др, 2001]

Таблица 2 Характеристики ИЭФ-фракций супернатанта печени, проявляющих биологическую активность в сверхмалых дозах*_

исследуемая фракция объем фракции концентрация мг/мл интервал разбавления фракции, в котором проявляется мембранотропная активность

фракция кислых белков (рН<3 0) 30 0 08 1012-1014

фракция слабокислых белков (рН 4 5-5 1) 20 0 03 ю'Мо15

фракция белков (рН 6 7-7 2) 20 0 03 ю|0-ю12

фракция основных белков (рН >8 0) 10 0 02 10|2-1014

*- данные приводятся для тканевого экстракта, полученного из 230 г влажного веса ткани

Возможно, что данный РБ синтезируется клетками печени, как и многие белки сыворотки крови [Энгельгардт, 1984] Для изучения этого вопроса был поставлен отдельный эксперимент, в котором было проведено сравнительное исследование фракций РБ, собранных в интервале рН 4 5-5 1 после ИЭФ, как тканевых экстрактов печени и легкого крыс, так и их супернатантов (таб 3) Для изучения тканевой специфичности мембранотропного действия фракций, собранных в интервале рН 4 5-5 1, применяли метод биотестирования на органных культурах ткани печени и легкого мышей

Таблица 3 Сравнительное исследование фракций регуляторных белков выделенных из печени и легкого, собранных в области рН 4,5-5,1_

исследуемый образец органная культура ткани

печени легкого

тканевой экстракт печени + -

тканевой экстракт легкого - +

Фракция тканевого экстракта (рН 4 5-5 1) печени + +

фракция тканевого экстракта (рН 4 5-5 1) легкого - -

фракция супернатанта (рН 4 5-5 1) печени + +

фракция супернатанта (рН 4 5-5 1) легкого - -

Было установлено, что фракции РБ, выделенные из тканевого экстракта печени и его супернатанта, в СМД проявляли мембранотропное действие, как на клетки печени, так

и на клетки легкого in vitro, т.е. характеризовались отсутствием тканевой специфичности биологического действия. Фракция РБ, собранная в интервале рН 4.5-5.1, после изоэлектрофокусирования, как тканевого экстракта легкого, так и его супернатанта, была биологически неактивна. Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют в пользу высказанного предположения о том, что в печени позвоночных животных синтезируется РБ сыворотки крови. Эти данные нашли подтверждение в иммуногистохимическом исследовании локализации в ткани печени РБ сыворотки крови.

Фракция в области рН 6.7-7.2, возможно, представляет собой ранее изученный РБ печени, биологически активный в СМД, который характеризовался значением изоэлектрической точки в интервале рН 6.7-7.2, а также отсутствием резистентности к воздействию различных физико-химических факторов (температура, воздействие деионизованной среды, хелатирующих агентов) [Ямскова и др., 1977а; Ямскова, 1978; Ямскова и др., 1978].

Таким образом, в настоящем исследовании были обнаружены ранее не идентифицированные фракции кислых и основных РБ, выделенные из печени, легкого, тонкого кишечника и желчи млекопитающих.

Изучение физико-химических свойств фракций, содержащих регулятораые белки, выделенных из печени, легкого, тонкого кишечника и желчи млекопитающих

Изучение физико-химических свойств РБ проводили на фракциях, полученных после ИЭФ супернатантов тканевых экстрактов.

Методом электрофореза в ПААГ было показано, что основным компонентом изучаемых фракций РБ является низкомолекулярный белок.

На рис. 3 показано разделение кислых и основных РБ при электрофорезе в ПААГ в присутствии додецилеульфата натрия.

Рис. 3. Разделение фракции кислых белков, полученной после изоэлектрофокусирования супернатантов, в 12% ПААГ с добавлением додецилеульфата натрия. Окраска Кумасси G250. На рисунке: маркеры, t- кислый РБ печени; 2- кислый РБ легкого; 3- кислый РБ тонкого кишечника; 4- кислый РБ 4 желчи.

94,6 иДа 66,2 кДа 45 кДа

31 кДа т*«*»

21,5 кДа 14,4 КДа

1 2 3

После электрофореза в ПААГ в отсутствии додецилеульфата натрия, было проведено элюирование из геля фракций, характеризующихся высокой

электрофоретической подвижностью (Н/ 0.90±0.05). Методом биотестирования было установлено, что данные низкомолекулярные РБ проявляли мембранотропную активность вСМД.

При обрспцено-фазовой ВЭЖХ в градиенте вода-ацетонитрил фракции РБ были разделены на две фракции гидрофильную и гидрофобную, соответственно, характеризующиеся временами удержания 3.0-4.0 и 13.0-15.0 мин. На рис. 4 в качестве примера представлена картина разделения кислой фракции РБ легкого.

§ 1

S /« 1 щ]

I / ............ ....../ м

Рис. 4. Разделение кислой фракции регуляторных белков легкого методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. По оси абсцисс - время удержания, мин; по оси ординат интенсивность поглощения при 280 нм, отн. ед.

Было показано, что обе фракции проявляют мембранотропную активность в СМД. Возможно, данные фракции представлены различающимися между собой белками. Однако не исключено, что гидрофильная и гидрофобная фракции представляют собой, соответственно, высокомолекулярные ассоциаты и низкомолекулярную фракции РБ. В пользу этого предположения свидетельствуют ранее полученные данные о проявлении молекулами РБ выраженной тенденции к агрегации [Ямскова, Резникова, 1991].

Методами лазерного динамического светорассеяния и атомно-силовой микроскопии были изучены водные растворы фракций кислых РБ и показано, что в них присутствуют наноразмерные частицы.

Результаты исследования, проведенные методом динамического рассеяния, показали, что распределение частиц во всех кислых фракциях РБ было унимодальным, средний гидродинамический радиус частиц составлял 40-60 нм. На рис. 5 представлена кривая распределения по размеру гидродинамического радиуса частиц, присутствующих во фракции РБ печени.

Следует отметить, что в сравнении с другими белками, например, с белками плазмы крови, а также полисахаридами, которые отличались друг от друга по составу, структуре и молекулярной массе [Armstrong, 2004], РБ имеют большое значение гидродинамического радиуса. Одним из объяснений этого экспериментально

установленного факта может быть выраженная тенденция низкомолекулярных РБ образовывать в водных растворах высокомолекулярные ассопиаты.

1Л

0.8

0.6

0.4

Рис. 5. Кривая распределения частиц регуляторного белка, выделенного из печени, по гидродинамическому радиусу (метод лазерного динамического светорассеяния).

am oí i 10 ico юп iocco юно

Результаты исследования водных растворов РБ, проведенного динамическим лазерным светорассеянием, согласуются с данными, полученными методом атомно-силовой микроскопии. Этим методом показано, что на подложке после удаления растворителя из фракции РБ обнаруживаются частицы, размером 30-100 им (рис. 6).

Полученные результаты, на наш взгляд, важны для объяснения действия РБ в СМД. Можно предположить, что биологическая активность РБ обусловлена их способностью образовывать устойчивые наночастицы. Результаты исследований, проведенные в различных областях науки, свидетельствуют о том, что вещества в виде наноразмерных частиц (10-1000 нм) проявляют уникальные физико-химические свойства и биологическое действие [Cui et al., 2004, Olivier 2005; Рампе, 2005]. Следует отметить сходство между наноразмерными частицами, присутствующими в водно-белковых системах как in vitro, так и in vivo [Рампе, 2005]. Было предположено, что образование таких частиц может быть результатом проявления способности материи к самоорганизации в неравновесных системах [Рамис, 2006].

Как показывают данные литературы, вторичная структура белков, проявляющих тенденцию к образованию высокомолекулярных ассоциатов, характеризуется высоким содержанием (3-структур и неупорядоченных участков полипептидной цепи [Рамис, 2005].

Рис. 6. Атомно-силовая микроскопия фракции регуляторного белка, выделенного из желчи.

Методом кругового дихроизма была охарактеризована вторичная структура кислых РБ (табл 4)

Таблица 4 Исследование вторичной структуры кислых регуляторных белков методом

кислый РБ печени кислый РБ легкого кислый РБ т кишечника кислый РБ желчи

а-спирали 2 2%±0 5% 3 ¡%±0 5% 2 4%±0 5% 2 2%±0 5%

В-складки (антипараллельные) 48 1%±0 5% 47 0%±0 5% 47 8%±0.5% 48 3%±0.5%

В-складки (параллельные) 3 7%±0 5% 3 7%±0 5% 3 7%±0.5% 3 7%±0 5%

В-изгиб 16.7%±0 5% 16.7%±0.5% 16.7%±0.5% 16.7%±0.5%

статистический клубок 29 3%±0 5% 29 5%±0 5% 29 4%±0 5% 29 1%±0 5%

итоговая сумма 100 0%±0 5% 100 0%±0 5% 100 0%±0 5% 100 0%±0 5%

Было показано, что вторичная структура данных белков описывается, в основном, в терминах В-структур и статистического клубка Эти данные полностью совпадают с данными полученными при исследовании вторичной структуры РБ, выделенных из других тканей млекопитающих [Скрипникова и др, 2005, Краснов и др, 2005, 2006, Рыбакова, 2005, Назарова и др 2005, 2006] Следует отметить, что такое состояние вторичной структуры РБ изучаемой группы является их отличительным свойством от других белков, участвующих в процессах регуляции

Исследование локализации кислого РБ печени и слабокислого РБ сыворотки крови

Исследование локализации в ткани было проведено для кислого РБ, выделенного из печени, и для РБ сыворотки крови, характеризующегося значением р1 в области рН 4 55 1 Соответствующие поликлональные антисыворотки были получены по методу Гослинга [Gosllng, 2000] С помощью иммуногистохимической реакции с использованием вторичных Р1ТС-конъюгированных антител была изучена локализация данных белков в ткани печени крысы и тритона Было обнаружено, что РБ печени локализуется в области синусоида печени крысы (рис 7), а РБ сыворотки крови локализуется в межгепатоцитарном пространстве ткани печени тритона (рис 8)

Полученные данные согласуются с представленными выше результатами исследования РБ со значением р1 в области рН 4 5-5 1, обнаруженного в тканевом экстракте печени, а также свидетельствуют в пользу предположения о том, что РБ сыворотки крови синтезируется клетками печени

Рис. 7. Локализация регуляторного белка печени в ткани печени крысы, (ув, ок. х 10, об. х40; зона локализации показана стрелкой).

Рис. 8. Локализация регуляторного белка сыворотки крови в ткани печени тритона, (ув. ок. х!0, об. х40; зона локализации показана стрелкой).

Разработка модели для изучения специфического действия регуляторных белков

Для изучения специфического действия РБ была разработана модель культивирования in vitro ткани печени тритона PL wähl. Ткани хвостатых амфибии проявляют большую способность к регенерации, по сравнению с млекопитающими [Stocum, 1995]. При органном культивировании клетки печени взрослых особей амфибий обладают существенно большей жизнеспособностью, по сравнению с клетками печени взрослых млекопитающих [Trowell, 1959; Campbell, Hales, ¡971]. Ранее было показано, что органные культуры печени взрослых амфибий можно поддерживать в течение длительного времени [Monnickendam, 1972, 1973 а, Ь]. При роллерном типе культивирования тканей амфибий происходит активация клеточных источников регенерации и культура ткани остается жизнеспособной в течение длительного времени [Григорян и др., 2005]. Поэтому было проведено сравнение двух моделей культивирования: роллерная модель и культивирование ткани печени на подложке.

Основное отличие функции печени хвостатых амфибий от млекопитающих заключается в сохранении у них кроветворения во всем постнатальном периоде и присутствии пигментных клеток, которые способны синтезировать меланины и располагаются как в кортикальном слое, так и в паренхиме печени. Согласно литературным данным распределение пигмента в этих клетках печени сезонно изменяется: оно значительно уменьшается ко второй половине зимы и увеличивается весной и летом [Воронцова и др., 1952]. Установлено, что пигментированные клетки

печени амфибий являются аналогами купферовских клеток печени млекопитающих и функционируют как макрофаги, поглощая различные частицы, например, микроорганизмы, вирусы, а также осуществляют детоксикацию различных ксенобиотиков [Sichel et al, 2002] Эти клетки происходят из гемопоэтических стволовых клеток [Sichel et al, ¡997], отличаются от других фагоцитов позвоночных тем, что способны синтезировать меланин в меланосомах, но, в то же время, они не являются меланоцитами, происходящими из клеток нервного гребня [Sichel et al, 2002]

Для оценки состояния ткани определяли следующие параметры площадь кластеров пигментированных клеток и количество митозов в клетках кортикальной области Согласно данным литературы, эти параметры отражают способность ткани печени амфибий реагировать на повреждающие воздействия [Frangioni et al, 2003]

Как показывают результаты этих экспериментальных серий, представленные в табл 5, роллерный способ культивирования ткани печени тритона способствует увеличению площади кластеров пигментированных клеток, по сравнению с тканью печени, культивированной на подложке, а также по сравнению с интактной тканью (р<0 05)

Таблица 5 Оценка состояния интактной ткани печени тритона, а также после органного культивирования_

печень тритона площадь кластеров пигментированных клеток, % количество митозов

интактная печень 8,8±0,3 3,42±0,38

органная культура роллерная культура 11,3±0,4 0,33±0,07

культура на подложке 4,4±0,1 0

Количество митозов в клетках кортикальной области было меньшим, по сравнению с интактной тканью (р<0 05), но большим, по сравнению с тканью печени, культивированной на подложке (р< 0 05) Полученные данные указывают на поддержание жизнеспособности клеток и гистоструктуры печени амфибий при роллерном типе культивирования, по сравнению с культивированием ткани на подложке (рис 9)

Рис. 9. Роллериое культивирование ткани печени тритона в течение 3 суток без добавления каких-либо факторов. А - краевая зона, Б - область сосудов. Об. хЮ; ок. х20.

Не исключено, что в условиях роллерного культивирования происходит увеличение количества пигмента в печеночных меланомакрофагах за счет стимуляции в них метаболитической активности. При культивировании на подложке в ткани печени амфибий происходит угнетение данных процессов и наблюдается массовая гибель клеток во всей ткани (рис. 10).

Рис. 10. Культивирование ткани печени тритона на подложке в течение 3 суток без добавления каких-либо факторов. А - краевая зона, Б - область сосудов. Об. х 10; ок. х20.

Эти предположения нашли подтверждение при изучении специфического действия

РБ. В данной опытной серии были исследованы РБ, выделенные из печени, сыворотки

крови и желчи млекопитающих. Такой выбор был основан па данных литературы,

свидетельствующих о том, что клетки печени синтезируют как компоненты сыворотки

крови и желчи, гак и вещества, обеспечивающие регуляцию гомеостаза печени

[Энгельгард, 1984; Ямскова и др., 1977].

Исследование специфической биологической активности регуляторных белков, выделенных из тканей млекопитающих

При органном культивировании ткани печени на подложке, как в контрольных, так

и в опытных культурах наблюдали развитие процессов деградации ткани. В краевой зоне не обнаруживались митозы соединительнотканных клеток. Эти данные указывают на угнетение клеток кроветворения. Кластеры пигментированных клеток наблюдались в паренхиме. В присутствии РБ сыворотки крови и желчи, соответственно, наблюдали одинаковое уменьшение параметра, отражающего площадь кластеров пигментированных клеток по сравнению с контролем. В присутствии РБ печени, отмечали образование кластеров, площадь которых соответствовала контрольному параметру. Эти результаты указывают на то, что состояние адгезии ткани к подложке является решающим фактором в проявлении биологической активности изучаемых РБ (рис. 11; табл. 6).

л. ь"«г V**. г* . *

-р ч

Ш: ¿V,; Г . ' 1и'

/ г*> 4 , г-« V

*¿М- * Л,.

Рис. II. Культивирование ткани печени тритона на подложке в течение 3 суток с добавлением регуляторных белков. А - влияние РБ печени, Б - влияние РБ сыворотки крови. В - влияние РБ желчи. Об. хЮ; ок. х20.

Совершенно иные результаты были получены при исследовании специфической биологической активности РБ, выделенных из печени, сыворотки крови и желчи

I, .

■ /►

г %

Л 8*

■Ъ | ' 1 '( 1 #У ...

'«У

ш *,, •,. ,

млекопитающих, на экспериментальной модели роллерного органного культивирования

ткани печени тритона. Было показано, что данные РБ различным образом влияют на состояние ткани железы (табл. 6).

Таблица 6. Влияние кислых регуляторных белков на органные культуры печени тритона т у'Нго при различных условиях культивирования_

исследуемый регуляторный белок культивирование роллерное культивирование на подложке

площадь кластеров пигментированных клеток,% кол-во митозов площадь кластеров пигментированных клеток, % кол-во митозов

контроль 11,3±0,4 0,33±0,07 4,4±0,1 0

кислый РБ печени 16,2±1,1* 0,01±0,01* 4,5±0,2 0

кислый РБ сыворотки крови 9,4±0,3* 4,17±0,35* 2,6±0,1* 0

кислый РБ желчи 7,7±0,3* 0,16±0,04* 2,6±0,1 * 0

РБ печени способствовал увеличению площади кластеров пигментированных клеток, но в то же время, угнетал митозы соединительнотканных клеток кортикальной области (табл. 6). Можно предположить, что биологическая активность РБ печени выражается в активации меланомакрофогов и угнетении процессов кроветворения в печени амфибий. Возможно, что РБ печени стимулирует миграцию меланомакрофагов в печени, которая приводит к образованию крупных кластеров (рис. 12).

Рис. 12. Роллерное культивирование ткани печени тритона с добавлением регуляторного белка, выделенного из печени.

А - краевая зона (Об. х 10; ок. х20), Б - область сосудов (Об. хЮ; ок. х!0).

Возможно также, что РБ печени стимулирует биосинтез меланина в данных условиях культивирования, и увеличение количества пигмента в клетках способствует их визуальной идентификации Не исключается и такой вариант объяснения увеличение кластеров пигментированных клеток связано с усилением фагоцитарной активности меланомакрофагов и накоплением ими продуктов деградации гемоглобина, ферритина, гемоседирина Кроме того, возможно также, что РБ печени стимулирует дифференцировку клеток-предшественников макрофагов, которые дифференцировались в зрелые меланомакрофаги Согласно литературным источникам, эти клетки являются рекрутированными макрофагами, относящимися к мононуклеарно-фагоцитарной системе, способны автономно синтезировать меланин [Sichel et al, 2002] Следует отметить, что у пойкилотермных животных в состав плазматической мембраны гепатоцитов входит большое количество ненасыщенных жирных кислот, которые обеспечивают ее высокую текучесть В настоящее время установлено, что меланины проявляют свойства антиоксидантов, действуя как высокоэффективные поглотители иона О2 [Fiangiom et al, 2003]

Суммируя представленные литературные данные, а также результаты исследования специфической активности РБ печени, можно предположить, что этот РБ в СМД проявляет гепатопротекторные свойства

РБ сыворотки крови способствовал увеличению чиста митозов соединительнотканных клеток кортикальной области, а также поддерживал жизнеспособность клеток паренхимы (табл 6) Стимуляцию митозов соединительнотканных клеток при воздействии РБ сыворотки крови можно объяснить способностью данного РБ поддерживать процессы кроветворения в капсулярной области печени амфибий при данном способе культивирования (рис 13) В этом аспекте следует отметить, что ранее полученные данные при исследовании сывороточного РБ данной группы свидетельствовали о его стимуляции пролиферативной активности соединительнотканных клеток млекопитающих т \itro [Буеверова и др, 1985] Изучение этих вопросов явится предметом наших дальнейших исследований

Рис. 13. Роллерное культивирование ткани печени тритона с добавлением регуляторного белка, выделенного из сыворотки крови.

А - область паренхимы, Б - краевая зона, В - область сосудов. Об. хЮ; ок. х20.

В настоящем исследовании было показано, что РБ желчи способствовал уменьшению площади пигментированных клеток в печени тритона, как при роллерном, так и при стационарном способе культивирования (табл. 6). РБ желчи способствовал уменьшению числа митозов соединительнотканных клеток, по сравнению с контролем. Можно высказать предположение о том, что данный РБ обладал угнетающим действием как на меланомакрофаги, так и на клетки краевой зоны печени тритона в условиях in vitro (рис. 14).

Рис. 14. Роллерное культивирование ткани печени тритона с добавлением регуляторного белка, выделенного из желчи.

А - краевая зона, Б - область сосудов. Об. хЮ; ок. х20.

На основании данных, полученных в проведенном исследовании, не представляется возможным предположить механизм, лежащий в основе биологического действия РБ желчи. Поэтому был поставлен отдельный эксперимент по изучению влиянию кислого РБ желчи на размер частиц желчи человека in vitro. Исследование было

проведено совместно с Московской медицинской академией им Сеченова и Российской экономической академией им Плеханова В этом же эксперименте были изучены также РБ, выделенные из сыворотки крови и печени млекопитающих Было показано, что при действии кислого РБ желчи т у/Но средний диаметр частиц статистически достоверно уменьшался приблизительно вдвое по сравнению с контролем (табл 7) РБ, выделенные из сыворотки крови и печени, не оказывали влияние на размер частиц желчи в данном эксперименте Таким образом, на данной модели удалось продемонстрировать специфическое действие кислого РБ желчи

Таблица 7 Изменение размера частиц желчи человека при воздействии регуляторных белков, выделенного из желчи, сыворотки крови и печени млекопитающих т vitro

условия эксперимента размер частиц желчи, нм

желчь человека(контроль 1) 56,9±7, 3

после добавления физ раствора (контроль 2) 54,4 ±8,2

после добавления регуляторного белка желчи 28,9±5,4

после добавления регуляторного белка сыворотки 58,3±6,3

после добавления регуляторного белка печени 53,5 ±5,5

Суммируя полученные результаты можно отметить следующее РБ, выделенные из печени, сыворотки крови и желчи, проявляют специфическую биологическую активность в СМД и, очевидно, представляют собой различающиеся между собой белки, несмотря на то, что все они являются продуктами синтеза клеток печени и проявляют сходные физико-химические свойства

Для ряда регуляторных белков была продемонстрирована противовирусная активность Исследование было проведено совместно с НИИ вирусологии им Д И Ивановского Изучали влияние РБ, выделенных из сыворотки крови и тонкого кишечника млекопитающих, на инфекционные свойства вируса гриппа А/Н5Ш на культуре эмбриональных клеток эпителия почек свиньи (СПЭВ) В качестве препаратов сравнения исследовали РБ, выделенный из тимуса, а также композицию трех РБ в СМД Были поставлены три варианта экспериментов I- препараты РБ вносили в культуральную среду за 1 час до заражения вирусом, 2- в момент инфицирования клеток, 3- через 1 час после заражения культур вирусом гриппа А/Н5М1 Как видно из результатов, приведенных в табл 8, максимальная противовирусная активность препаратов РБ была зарегистрирована при обработке клеточной культуры за 1 час до заражения вирусом

Таблица 8 Противовирусное действие препаратов РБ тимуса, РБ сыворотки крови, «композиция», РБ тонкого кишечника в отношении инфекции, вызванной высокопатогенным вариантом вируса гриппа птиц А/Н5Ы1 в культурах клеток почек эмбрионов свиньи

Способ обработки монослоя клеток Наименование препаратов, используемых для обработки клеток (% жизнеспособных клеток СПЭВ) Контроль вируса

РБ тимуса РБ сыворотки крови «композиция» РБ тонкого кишечника

24 ч п и 48ч п и 72 ч п и 24 ч п и 48 ч п и 72 ч п и 24 ч п и X с з4 эо 72 ч п и 24 ч п и I 48 ч п и 72 ч п и 24 ч п и 48 ч п и 72 ч п и

За 1час до заражения клеток 100 100 30 100 25 0 100 90 0 100 100 0 10 0 0

В момент заражения клеток 50 25 0 70 50 0 80 20 0 100 100 0 10 0 0

Через 1 час после заражения 0 0 0 20 0 0 100 100 0 100 100 0 10 0 0

В этих условиях эксперимента при добавлении в культуральную среду препаратов РБ тимуса или РБ тонкого кишечника в течении 48 часов после заражения вирусом выживало 100% клеток Обработка препаратом «композиция» приводила к сохранению жизнеспособными 90% клеток, и только 25% клеток выживало в случае обработки их препаратом РБ сыворотки крови Внесение в культуральную среду препаратов РБ тонкого кишечника и препарата «композиция» через 1 час после заражения клеточных культур вирусом приводили, соответственно, к 100% защите клеток в течении 48 часов после заражения вирусом Внесение изучаемых препаратов РБ в культуральную среду в момент заражения клеток позволило выявить четкий противовирусный эффект препарата РБ тонкого кишечника Таким образом, изучение противовирусной активности 4-х препаратов на развитие инфекции, вызванной высокопатогенным вариантом вируса гриппа птиц А/Н5Ы1, позволило выявить высокую лечебно-профилактическую активность препаратов РБ тонкого кишечника и «композиция» и профилактическую активность препаратов РБ тимуса, РБ тонкого кишечника и «композиция»

Заключение

Суммируя полученные в данном исследовании результаты, можно заключить следующее

В тканевых экстрактах печени, легкого, тонкого кишечника, а также в желчи, обнаружены РБ, проявляющие биологическую активность в СМД В данных экстрактах РБ обнаруживаются в виде 2-х фракций кислых и основных белков В тканевом экстракте печени обнаружены 4 фракции РБ данной группы Кроме кислых и основных РБ, обнаружены два РБ со значением р! в области рН 4 5-5 1 и рН 6 7-7 2, соответственно

Было проведено сравнительное исследование двух РБ, характеризующихся значением pi в области рН 4 5-5 1, выделенных, соответственно, из сыворотки крови и печени На основании полученных результатов, а также данных изучения локализации сывороточного РБ в ткани печени, было высказано предположение о том, что данный РБ синтезируется клетками печени и, очевидно, является компонентом сыворотки крови

Согласно результатам исследования физико-химических свойств кислых и основных РБ, они представляют собой низкомолекулярные белки, вторичная структура которых характеризуется преобладанием p-структур и статистического клубка Установлено, что в водных растворах молекулы РБ образуют наноразмерные структуры Изучение биологических свойств РБ показало, что дозовая зависимость мембранотропной активности имеет полимодальный характер Было продемонстрировано, что РБ проявляют биологическую активность в концентрациях, соответствующих 10 "-10 17 мг белка в мл Для изучения специфического действия РБ была разработана роллерная органная культура ткани печени тритона Культивирование ткани печени амфибий имеет ряд преимуществ, в силу того, что ткани амфибий проявляют выраженную тенденцию к регенерации, восстановительным и репаративным процессам С помощью оценки таких параметров, как мптотическая активность соединительнотканных клеток и площадь кластеров пигментированных клеток, было охарактеризовано состояние ткани печени амфибий при культивировании

В данном исследовании была изучена специфическая активность трех РБ сыворотки крови, печени и желчи Только на модели органного культивирования печени тритона удалось различить, соответственно, специфическое действие РБ печени и сыворотки крови Специфическая активность РБ желчи была продемонстрирована в экспериментах, в которых была проведена оценка размера частиц желчи человека т vitro

На модели культуры эпителиальных клеток млекопитающих была показана высокоэффективная противовирусная активность РБ тонкого кишечника в СМД

Таким образом, в настоящей работе в тканях печени, легкого, тонкого кишечника, а также желчи, были идентифицированы ранее не изученные РБ, действующие в СМД Было проведено исследование их физико-химических свойств, разработаны новые экспериментальные модели, на которых была изучена специфическая биологическая активность Полученные в этом исследовании результаты показывают, что, несмотря на сходство физико-химических свойств и характера мембранотропного действия изучаемых РБ тканей млекопитающих, они представляют различающиеся между собой белки

Выводы

1 В тканях печени, легкого, тонкого кишечника, а также в желчи, идентифицированы ранее не изученные регуляторные белки, биологически активные в сверхмалых дозах, соответствующих 10 "-10 17 мг белка в мл Показано, что в тканях млекопитающих регуляторные белки присутствуют в виде нескольких фракций, различающихся по заряду

2 Были изучены физико-химические свойства кислых регуляторных белков Показано, что они представляют собой низкомолекулярные белки, во вторичной структуре которых преобладают 13-структуры и статистический клубок, в водных растворах регуляторные белки образуют наноразмерные частицы в диапазоне 30-100 нм

3 Методами иммуногистохимии в ткани печени позвоночных животных изучена локализация 2-х регуляторных белков, выделенных, соответственно, из печени и сыворотки крови млекопитающих Впервые показано, что регуляторный белок печени локализуется в области синусоида, а слабокислый регуляторный белок - в межгепатоцитариом пространстве

4 Разработана экспериментальная модель для изучения специфической биологической активности регуляторных белков млекопитающих - роллериая органная культура ткани печени тритона ш VII/ о

5 Показано специфическое действие регуляторных белков печени, сыворотки крови и желчи регуляторный белок печени способствовал увеличению площади кластеров пигментированных клеток печени, но в тоже время угнетал пролиферативную активность соединительно-тканных клеток в краевой зоне, по сравнению с контролем, регуляторный белок сыворотки крови стимулировал пролиферацию соединительно-тканных клеток в краевой зоне, но способствовал уменьшению площади кластеров пигментированных клеток печени тритона, по сравнению с контролем, при добавлении регуляторного белка желчи наблюдали уменьшение площади кластеров пигментированных клеток и угнетение пролиферативной активности соединительно-тканных клеток в краевой зоне, по сравнению с контролем

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Борисенко А В, Ячскова В Я, Бчагодатских ИВ, Березин Б Б, Краюхина МА , Ямское И А Идентификация регуляторных белков, биологически активных в сверхмалых дозах, и исследование их физико-химических свойств // Биологические мембраны 2007 том 24 №3 С 227- 233

2 А V Borisenko, VP Yamskova, MS K/asnov, /V Blagodatskikh, VV Vecherkin, IA Yamskov "Regulatory pioteins from the mammalian liver that display biological activity at ultra low doses" pp 35-45 // In the book "Biochemical Physics Frontal Research", Ed by S D Varfolomeev, E В Burlakova, A A Popov and G E Zaikov, Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc P 160 2007

3 VP Yamskova, MS Krasnov, EYu Rybakova, VV Vecherkin, A V Borisenko, IA Yamskov "Analysis of regulatory proteins from bovine blood serum that display biological activity at ultia low doses 2 Tissue localization and role in wound healing", pp 61-70//In the book "Biochemical Physics Fiontal Research", Ed by S D Varfolomeev, E В Burlakova, A A Popov and G E Zaikov, Hauppauge NY, Nova Science Publisheis Inc P 160 2007

4 Борисенко AB, Ямскова ВП, Краснов MC, Вечеркин В В, Ямское И А Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные белкп, выделенные из печени млекопитающих // В кн труды V ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗЫ Москва 2005 С 153-165

5 Борисенко А В Изучение тканевой специфичности биологической активности регуляторных белков//Онтогенез 2005 том 36 №3 С 230-231

6 Борисенко А В Влияние регуляторного белка, выделенного из печени крыс, на состояние ткани печени тритона Pleurodeles waltl при органном культивировании in vitro II Сборник тезисов «Биология стволовых клеток фундаментальные аспекты» 2005 С 17-18

7 Борисенко А В Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные белки, выделенные из тканей млекопитающих // Сборник тезисов «Новые лекарственные средства Успехи и перспективы» 2005 С 110-111

8 Борисенко А В , Бчагодатских ИВ, Березин Б Б, Краюхина МА , Пипницкий ЕМ, Лычников Д С, Рубашникова ЕВ, Ямскова ВП , Я исков И А Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные пептиды, выделенные из печени, сыворотки крови и желчи млекопитающих // Сборник тезисов IV Международного Конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» СПб 2006 С 70

9 Борисенко А В Исследование регуляторных белков, выделенных из печени млекопитающих идентификация в ткани, исследование физико-химических свойств и биологического действия//Онтогенез 2006 том 37 №6С 311-312

Заказ № 80/01/08 Подписано в печать 26 01 2008 Тираж 100 эк; Уел п л 15

' - nn ООО "Цифровичок", теч (495) 797-75-76,(495) 778-22-20 www cfr ru , e-mail mfo@cfr rti

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Борисенко, Андрей Владимирович

ГЛАВА 1.ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Пространственно-функциональная организация ткани печени Пространственно-функциональная организация ткани легкого Пространственно-функциональная организация ткани тонкого кишечника

Ультраструктура отдельных компартментов межклеточного пространства в печени позвоночных

Адгезиометрические методы исследования

Молекулярные основы клеточной адгезии

Регуляторные белки, биологически активные в СМД

Биологически активные в сверхмалых дозах адгезионные белки, выделенные из печени млекопитающих

Кислые адгезионные белки печени млекопитающих

Сывороточный регуляторный белок, биологически активный в сверхмалых дозах

Биологическая активность сывороточного регуляторного белка Свойства биологически активных в СМД регуляторных белков

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение экстракта ткани печени, легкого и тонкого кишечника Получение супернатантов экстрактов ткани печени, легкого, тонкого кишечника

Получение супернатанта желчи крупно-рогатого скота

Получение супернатанта сыворотки крови крупно-рогатого скота

Получение фракций соответствующих экстрактов и супернатантов методом изоэлектрофокусирования

Определение концентрации белка

Электрофорез белков в полиакриламидном геле

Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография исследуемых фракций (ВЭЖХ)

Определение вторичной структуры с помощью метода кругового дихроизма

Определение гидродинамического радиуса и формы частиц РБ в водном растворе

Определение радиуса частиц РБ, методом атомно-силовой микроскопии Определение влияния растворов, содержащих РБ, на вязкоупругие свойства мембран гепатоцитов мыши при кратковременном органном культивировании in vitro

Получение кроличьей поликлональной антисыворотки на РБ выделенный из печени и сыворотки крови Иммуноферментный анализ антител (ELISA)

Иммуногистохимическое исследование локализации РБ печени и сыворотки крови с использованием FITC -конъюгированных антител Культивирование печени тритона in vitro

Исследование противовирусной активности регуляторных белков Приготовление гистологических срезов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и очистка регуляторных белков печени, легкого, тонкого кишечника крыс Wistar, а также желчи КРС

Изучение мембранотропной активности фракций РБ, выделенных из печени, легкого, тонкого кишечника и желчи млекопитающих Изучение физико-химических свойств фракций РБ, выделенных из печени, легкого, тонкого кишечника и желчи млекопитающих Исследование локализации кислого РБ печени и слабокислого РБ сыворотки крови

Разработка модели для изучения специфического действия регуляторных белков

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные белки, выделенные из тканей млекопитающих"

Актуальность работы

В последние годы наблюдается возрастающий интерес исследователей к действию сверхмалых доз (СМД) биологически активных веществ. Опубликованы данные для разнообразных групп биологически активных веществ (гормонов, эндогенных регуляторных пептидов, ряд веществ не пептидной природы и др.). Исследование влияния СМД представляет интерес, так как может привести к созданию новых лекарственных веществ или к выявлению новых существенно важных свойств уже известных. Наблюдаемые эффекты возможно объяснить при помощи различных гипотез: концентрирование лекарственного вещества, наличие высокоэффективных систем проведения и усиления рецепторного сигнала, "адаптации" рецепторов к действию СМД [Сазанов, Зайцев, 1992; Бурлакова и др., 2004], существованием супервысокоаффинных рецепторов и др. [Бурлакова и др., 1990]. Но неоспоримым является факт достоверного воздействия СМД на биологический объект, которые могут совпадать или не совпадать с действием больших доз. Для многих веществ было показано, что эффекты сверхмалых доз примерно совпадают по силе и величине с наблюдаемыми при действии больших доз [Sergeeva et al., 1996].

Благодаря разработке методов выделения и биотестирования удалось выделить и охарактеризовать ранее не идентифицированные регуляторные факторы, белковой природы, проявляющие биологическую активность в СМД [Ямскова и др., 1978; Ямскова, Резникова, 1991]. Действие регуляторных белков (РБ) данной группы в СМД реализуется в рамках концепции, в основе которой лежат представления о нарушениях регуляции органно-тканевого гомеостаза как первопричины развития любой патологии и об изменении состояния воды в биологических жидкостях под действием РБ в СМД, причем вода является матрицей для переноса регуляторного сигнала [Ямскова и др., 1998; Ямское и др., 1999; Бурлакова и др., 2004].

Цель и задачи исследования

Исследование, мембранотропной, специфической биологической активности регуляторных белков, действующих в сверхмалых дозах, а также некоторых физико-химических свойств. В отдельные задачи входили:

1. Выделение регуляторных белков из печени, легкого, тонкого кишечника, желчи млекопитающих и получение их в высокоочищенном состоянии.

2. Изучение дозовой зависимости мембранотропной активности регуляторных белков. 6

3. Изучение физико-химических свойств регуляторных белков.

4. Изучение локализации регуляторных белков в ткани печени позвоночных животных.

5. Разработка новой экспериментальной модели роллерного органного культивирования ткани печени тритона in vitro для исследования специфической биологической активности регуляторных белков, выделенных из печени, сыворотки крови и желчи млекопитающих.

6. Изучение биологического действия регуляторных белков, выделенных из печени, желчи и сыворотки крови млекопитающих на органной культуре печени тритона in vitro.

Новизна работы

Впервые в тканях печени, легкого, тонкого кишечника и желчи млекопитающих, были идентифицированы РБ, действующие в СМД. Было показано, что в тканях РБ присутствуют в виде нескольких фракций, преобладающими из которых являются фракции кислых и основных белков. Изучение физико-химических свойств данных РБ показало, что они представляют собой низкомолекулярные белки, во вторичной структуре которых преобладают В-структуры и статистический клубок. Показано, что в водных растворах РБ ассоциированы и присутствуют в виде наноразмерных частиц. По физико-химическим свойствам данные белки сходны с РБ, которые были ранее идентифицированы в других тканях млекопитающих. Для РБ печени и сыворотки крови была изучена их локализация в ткани печени позвоночных животных и показано, что оба белка являются внеклеточными. Впервые была разработана модель роллерного органного культивирования ткани печени тритона, на которой было изучено специфическое действие РБ, выделенных из ткани печени, сыворотки крови и желчи. Установлено, что только РБ печени и сыворотки крови проявляют специфическое действие на состояние печени тритона при культивировании: РБ печени стимулирует клетки макрофагального ряда, а РБ сыворотки стимулирует клетки кроветворного ряда. В отдельном эксперименте была продемонстрирована способность РБ желчи уменьшать размеры частиц желчи человека in vitro. Таким образом, благодаря применению различных экспериментальных моделей для изучения специфической активности РБ, выделенных из различных источников, было установлено, что их биологическое действие различается, несмотря на проявление ими сходных физико-химических свойств и мембранотропной активности в СМД. 7

Практическая значимость

В данной работе впервые показано специфическое действие в СМД РБ, выделенных из печени, сыворотки крови и желчи. Полученные данные позволяют поставить вопрос о разработке новых фармакологических препаратов на основе данных РБ. Результаты проведенного исследования указывают на проявление РБ печени гепатопротекторных свойств, а также на возможность применения РБ сыворотки крови для лечения некоторых гематопатологий, а РБ желчи - для лечения и профилактики желчекаменной болезни. Разработанная роллерная органная культура ткани печени тритона может быть рекомендована в качестве модели для первичного скрининга веществ, для которых предполагается проявление гепатопротекторных свойств. В отдельной серии экспериментов была продемонстрирована выраженная лечебно-профилактическая активность РБ тонкого кишечника на развитие инфекции, вызванной высокопатогенным штаммом вируса гриппа птиц A/H5N1. В этом же опыте была показана профилактическая активность РБ сыворотки крови. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 139 страницах и включает следующие главы.

Введение, в котором рассмотрены актуальность, новизна, практическая значимость работы.

Обзор литературы, в котором рассмотрены общие положения клеточной адгезии, компоненты внеклеточного матрикса, а также белки участвующих в адгезии по типу "клетка-клетка". Рассмотрена пространственная организация межклеточного пространства в печени млекопитающих. Охарактеризованы известные до настоящей работы РБ, биологически активные в СМД, а также адгезиометрические методы исследования РБ из ткани печени.

Экспериментальная часть, посвящена описанию материалов и основных методов, с помощью которых было проведено данное исследование.

Заключение - раздел, который также входит в данную главу в котором представлены предположения о возможном механизме биологического действия изучаемых РБ. Выводы.

Диссертация содержит 10 таблиц, 17 рисунков, 337 литературные ссылки. 8

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Борисенко, Андрей Владимирович

ВЫВОДЫ

1. В тканях печени, легкого, тонкого кишечника, а также в желчи млекопитающих, идентифицированы регуляторные белки, биологически активные в сверхмалых дозах,

11 17 соответствующих 10-10"" мг белка в мл. Показано, что в тканях млекопитающих регуляторные белки присутствуют в виде нескольких фракций, различающихся по заряду.

2. Были изучены физико-химические свойства кислых регуляторных белков. Показано, что они представляют собой низкомолекулярные белки, во вторичной структуре которых преобладают В-структуры и статистический клубок; в водных растворах регуляторные белки образуют наноразмерные частицы в диапазоне 30-100 нм.

3. Методами иммуногистохимии в ткани печени позвоночных животных изучена локализация 2-х регуляторных белков, выделенных, соответственно, из печени и сыворотки крови млекопитающих. Впервые показано, что регуляторный белок печени локализуется в области синусоида, а слабокислый регуляторный белок сыворотки крови -в межгепатоцитарном пространстве.

4. Для изучения специфической биологической активности регуляторных белков млекопитающих разработана экспериментальная модель - роллерная органная культура ткани печени тритона in vitro.

5. Показано, что регуляторный белок печени способствовал увеличению площади кластеров пигментированных клеток печени, но в тоже время угнетал пролиферативную активность соединительно-тканных клеток в краевой зоне, по сравнению с контролем; регуляторный белок сыворотки крови стимулировал пролиферацию соединительнотканных клеток в краевой зоне, но способствовал уменьшению площади кластеров пигментированных клеток печени тритона по сравнению с контролем; при добавлении регуляторного белка желчи наблюдали уменьшение площади кластеров пигментированных клеток и угнетение пролиферативной активности соединительнотканных клеток в краевой зоне по сравнению с контролем.

115

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суммируя полученные в данном исследовании результаты, можно заключить следующее.

В тканевых экстрактах печени, легкого, тонкого кишечника, а также в желчи млекопитающих, обнаружены РБ, проявляющие биологическую активность в

11 17 концентрациях, соответствующих 10" -10" мг белка в мл. В данных экстрактах РБ обнаруживаются в виде 2-х фракций: кислых и основных белков. В тканевом экстракте печени обнаружены 4 фракции РБ данной группы. Кроме кислых и основных РБ, обнаружены два РБ со значением pi в области рН 4.5-5.1 и рН 6.7-7.2, соответственно. Было проведено сравнительное исследование двух РБ, характеризующихся значением pi в области рН 4.5-5.1, выделенных, соответственно, из сыворотки крови и печени. Полученные результаты указывают на возможность синтеза РБ сыворотки крови клетками печени.

Для изучения специфического действия РБ была разработана роллерная органная культура ткани печени тритона. С помощью оценки таких параметров, как митотическая активность соединительнотканных клеток и площадь кластеров пигментированных клеток, было охарактеризовано состояние ткани печени амфибий при культивировании.

В данном исследовании была изучена специфическая активность трех РБ: сыворотки крови, печени и желчи. Только на модели роллерного органного культивирования печени тритона удалось различить специфическое действие РБ печени и сыворотки крови.

На отдельной экспериментальной модели было показано, что РБ желчи в СМД способствует уменьшению размера частиц желчи человека in vitro.

На монослойной культуре эпителиальных клеток млекопитающих in vitro была показана высокоэффективная противовирусная активность РБ тонкого кишечника в СМД.

Таким образом, в настоящей работе в тканях печени, легкого, тонкого кишечника, а также желчи, были идентифицированы ранее не изученные регуляторные белки, действующие в сверхмалых дозах. Было проведено исследование их физико-химических

113 свойств, разработаны новые экспериментальные модели, на которых была изучена их специфическая биологическая активность. Полученные в этом исследовании результаты показывают, что, несмотря на сходство физико-химических свойств и характера мембранотропного действия изучаемых регуляторных белков тканей млекопитающих, они представляют различающиеся между собой белки.

114

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Борисенко, Андрей Владимирович, Москва

1. Архипенко В.И., Гербильский J1.B., Черненко Ю.П., Чуич Г.А. Структура и функции межклеточных контактов // В кн.: Структура и функции биологических мембран. М. Наука. 1975. С.77-95.

2. Банников Г.Ф., Трояновский С.М. Изменения дифференцировки и морфогенеза при неопластической трансформации in vivo и in vitro. Иммунологические аспекты биологии развития//М.: "Наука". 1984. С.107.

3. Блюмельфельд J1.A. Параметрический резонанс, как возможный механизм действия сверхнизких концентраций биологически активных веществ на клеточном и субклеточном уровнях//Биофизика. 1993. Т.38. №1. С.129-132.

4. Бочарова О.А., Модянова Е.А. Изменение межклеточных контактов гепатоцитов в онтогенезе у мышей инбредных линий с высокой (СВА) и низкой (С57В1) частотой спонтанных гепатом // Онтогенез. 1982. Т. 13. N4. С.427-429.

5. Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А., Худяков И.В. Воздействие химических агентов в сверхмалых дозах на биологические объекты // Изв. РАН, серия биол. 1990. N2. С.184-193.

6. Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А., Мальцева E.JI. // «Сверхслабые взаимодействия химических соединений и физических факторов на биосистемы». Биофизика. 2004. Т. 49. №. 3. С. 551-564.

7. Бычков С.М., Кузьмина С.А. Изучение механизма стерического исключения клеток, осуществляемого протеогликанами // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1992. N10. С.360-362.

8. Воронцова М.А., Лиознер Л.Д., Маркелова И.В., Пухальская Е.Ч. Тритон и аксолотль //М.: «Советская наука». 1952. С.295.

9. Гундорова Р.А., Ченцова Е.В., Ямскова В.П., Романова И.Ю. Применение нового фармакологического препарата Адгелон в офтальмологии // Онтогенез. 2000. Т.31. N4. С.272-273.

10. Дольникова А.Э., Сологуб А.А., Строева О.Г., Ямскова В.П. Роль кальций-зависимого и кальций-независимого механизмов в адгезии клеток сетчатки и пигментного эпителия куриных зародышей // Онтогенез. 19856. Т.16. N2.С.149-155.

11. Дольникова А.Э., Ямскова В.П. Молекулярные факторы адгезии клеток нейральных тканей, Са2+-независимая система адгезии. // Онтогенез. 1990. Т.21. N4. С.358-367.116

12. Дольникова А.Э., Ямскова В.П., Сологуб А.А., Строева О.Г. Биохимическая характеристика адгезионных факторов клеток сетчатки куриных зародышей // Онтогенез. 1985а. Т.16. N 5. С.497-506.

13. Дольникова А.Э., Ямскова В.П., Сологуб А.А., Строева О.Г. Исследования специфической и неспецифической адгезии в процессе агрегации клеток сетчатки куриных зародышей// Онтогенез. 1986. Т.17. N6. С.620-626.

14. Дыбан П. Особенности роста и дифференцировки тератокарциномы OCI5SI в сингенных и аллогенных мышах // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1984. Т.1. С.71-72.

15. Каспаров А.А., Розинова В.Н., Ямскова В.П. Питательная среда с «Адгелоном» для консервации роговицы донора // Онтогенез. 2000. Т.31. N4. С.273-274.

16. Котелевцев С.В., Ямскова В.П., Ямсков И.А., Нагдалиев Ф.Ф., Труаре В. Влияние Гепалона и Адгелона на перекисное окисление липидов и монооксидазное окисление в эндоплазматическом ретикулуме печени крыс // Онтогенез. 2000. Т.31, N 4. С.274-276.

17. Краснов М.С. Григорян Э.Н., Ямскова В.П. и др. Исследование адгезивных белков из нейральных тканей глаза 8-дневных куриных эмбрионов // Онтогенез. 2000. Т.31. N5. С.368-373.

18. Краснов М.С., Григорян Э.Н, Ямскова В.П. Модель органотипического культивирования сетчатки вместе с тканями заднего сектора глаза тритона для изучения действия адгезивных гликопротеинов // Изв. Акад. наук, серия биологическая. 20036. N1. С.22-36.

19. Краснов М.С., Маргасюк Д.В., Ямсков И.А., Ямскова В.П. Действие новых регуляторных белков из растений в сверхмалых дозах // Радиационная биология и радиоэкология. 2003а. N3. С.269-272.

20. Маленков А.Г., Модянова Е.А., Ямскова В.П. Тканевоспецифическое ингибирование синтеза ДНК контактинами факторами, обладающими тканеспецифической адгезионной активностью // Цитология. 1978. Т.20. N8. С.957-962.

21. Маленков А.Г. Чуич Г.А. Межклеточные контакты и реакция ткани // М. Медицина. 1979. С.135.

22. Маргасюк Д.В., Григорян Э.Н., Ямскова В.П. Исследование влияния на клеточную пролиферацию в роговице глаза тритона адгезивного белка, выделенного из роговицы глаза быка // Изв. РАН Сер. Биол. 2005а. N 6. С.738 743.

23. Маргасюк Д.В., Краснов М.С., Ямскова В.П., Григорян Э.Н., Ямсков И.А. Исследование регуляторного белка, выделенного из роговицы глаза быка: выделение, очистка, локализация в ткани и биологическая активность // Офтальмология. 2005b. Т.2. №3. С. 81-87.

24. Мелихов И.В. Тенденции развития нанохимии // Росс. Хим. Ж. 2002. T.XLVI. №5. С.7-14

25. Назарова П.А., Ямскова В.П., Краснов М.С., Ямсков И.А. Исследование регуляторного белка, выделенного из предстательной железы быка // Доклады академии наук. 2005. Т.405. N5. С.708-710.

26. Назарова П. А., Краснов М.С., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Регуляторный белок, выделенный из молока крупного рогатого скота // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т.42. N5. С.529-533.

27. Ольшевская J1.B., Модянова Е.А. Влияние ионов кальция и магния на ультраструктуру контактов клеток печени // Цитология. 1971. T.XIII. N.1. С.37-42.118

28. Остерман JI.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами // М.: Изд. "Наука". 1983. С.304.

29. Рамис Е. К проблеме нуклеации (образования клеток) при самоорганизации наноструктур белка in vitro и in vivo // Ж. техн. физики. 2005. Т.75. С. 107—113.

30. Рамис Е. Неравновесное состояние наноструктур белка при его самоорганизации // Ж. техн. физики. 2006. Т.76. С. 121-127.

31. Рыбакова Е.Ю. О возможном механизме, лежащем в основе метода биотестирования in vitro регуляторных белков, проявляющих биологическую активность в сверхмалых дозах. // Онтогенез. 2005. Т.36. N3. С.234.

32. Сазанов Л.А., Зайцев С.В. Действие сверхмалых доз (10"18-10"14) биологически активных веществ: общие закономерности, особенности и возможные механизмы // Биохимия. 1992. Т.57(10). С.1443-1459.

33. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. // 1996. М.: Высшая школа. С.335.

34. Туманова Н.Б., Попова Н.В., Ямскова В.П. Влияние макромолекулярных адгезионных факторов на пролиферацию гепатоцитов в органных культурах эмбриональной печени мышей // Известия Акад. наук серия биол. 1996. N.6. С.653-657.

35. Туманова Н.Б., Ямскова В.П. Нарушение молекулярных механизмов клеточной адгезии в печени мышей при генетической предрасположенности к спонтанному бластомогенезу // Известия Акад. наук серия биол. 1995. N.3. С.261-265.

36. Успенский Ю.П., Мехтиев С.Н. Клиническое значение нарушений реологии желчи и холестаза у больных с гепатобилиарной патологией; общий подход к фармакотерапии // Современная гастроенторология. 2004. N6(20). С.54-65.

37. Ушаков В.Ф. Механическая модель контакта гепатоцитов // Биофизика. 1980. Т.25. N3. С.491-493.

38. Ушаков В.Ф. Механические свойства межклеточных контактов // Киев. Здоров'я. 1982. С.33-53.119

39. Ушаков В.Ф., Палиенко JI.A., Лившиц К.И., Гриша Н.П., Крамарь С.Д., Филимонова JI.A. Состояние клеточной поверхности гепатоцитов при действии четыреххлористого углерода // Архив анат., гистол. и эмбриол. 1990. N12. С.44-48.

40. Ушаков В.Ф., Черненко Ю.П. Адгезионная прочность ультраструктурных элементов контактов гепатоцитов // Биофизика. 1978. Т.23. N3. С.558-559.

41. Филонов А.С., Гаврилко Д.Ю., Яминский И.В. Программное обеспечение для обработки трехмерных изображений «ФемтоСкан Онлайн». // М.: Центр перспективных технологий, 2005. С.89. (http://www.nanoscopy.net).

42. Хасигов П.З., Хасанбаева Г.Ш., Рубачев П.Г., Николаев А.Я., Грачев С.В. Белки базальных мембран//Биохимия. 1996 Т.61(7). С.1152-1168.

43. Хем А., Кормак Д. Гистология // Мир. 1983. Т.4. С. 647-589.

44. Щеголев А., Мишев М. Структурно-метаболитическая характеристика синусоидальных клеток печени//Успехи современной биологии. 1991. Т.111. С.73-82.

45. Энгельгардт Н.В. Иммунохимический анализ // 1968. М. Медицина. С.165-188.

46. Энгельгардт Н.В. Синтез белков плазмы крови и альфа-фетопротеина в онтогенезе // Иммунологические аспекты биологии развития. М. Наука. 1984. С.92-100.

47. Эрайзер Т.Д., Эльгорт Д.Ф., Шипова Л.Я. Продукция альфа-фетопротеина и сывороточного альбумина индивидуальными гепатоцитами в онтогенезе. В кн.: Вопросы молекулярной биологии. Материалы научной конференции. Ереван. 1979. С.42-26.

48. Ямсков И.А., Виноградов А.А., Даниленко А.Н., Маслова JI.A., Рыбакова Е.Ю., Ямскова В.П. Низкомолекулярный гликопротеин из сыворотки крови крупного рогатого скота: структура и свойства// Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т.37. N1. С.36-42.

49. Ямскова В.П., Модянова Е.А., Резникова М.М., Маленков А.Г. Высокоактивные тканевоспецифические адгезионные факторы печени и легкого // Молекулярная биология. 1977b. Т.П. N5. С. 1147-1154.

50. Ямскова В.П. Роль ионов кальция в стабилизации адгезионного фактора печени крыс//Биофизика. 1978. Т.23. С.428-432.

51. Ямскова В.П., Резникова М.М. Роль макромолекулярных компонентов клеточной поверхности в специфической адгезии клеток // Успехи биологической химии. 1979. Т.20. С.95-112.

52. Ямскова В.П., Резникова М.М. Низкомолекулярный полипептид сыворотки крови теплокровных: влияние на клеточную адгезию и пролиферацию // Журнал общей биологии. 1991. Т.52. N2. С.181-191.

53. Ямскова В.П., Туманова Н.Б. Макромолекулярные факторы Са-зависимой адгезии клеток печени // Известия Акад. наук. Серия биол. 1994. N5. С.732-737.

54. Ямскова В.П., Туманова Н.Б., Логинов А.С. Сравнительное исследование действия экстрактов печени мышей линии С57В1 и СВА на адгезию гепатоцитов // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1990. N3, С.303-306.

55. Adams С., Nelson W. Cytomechanics of cadherin-mediated cell-cell adhesion // Curr. Opin. Cell Biol. 1998. V.10. N5. P.572-578.

56. Albrechtsen R., Wewer U.M., Thorgeirsson S.S. De novo deposition of laminin positive basement membrane in vitro by normal hepatocytes and during hepatocarcinogenesis // Hepatology. 1988. V.8. P.538-546.

57. Altmann G.G. Factors involved in the Differentiation of the epithelial cells in the adult rat small intestine // In: Cairnie A.B., Lala P.K., Osmond D.G. (eds.). Stem Cells of Renewing Cell Populations. New York. Academic Press. 1976.

58. Anderson H. Adhesion molecules and animal development // Experientia. 1990. V.46. P.2-13.

59. Andrade M.A., Chacon P., Merelo J.J., Moran F. Evaluation of secondary structure of proteins from UV circular dichroism spectra using an unsupervised learning neural network. 1993. Prot. Eng. V.6(4). P.383-390.

60. Andres J., Stanley K., Cheifetz S., Massague J. // J. Cell Biol. 1989. V.109. P.3137-3145.

61. Armstrong J.K., Wenby R.B., Meiselman H.J. Fisher T.C. The Hydrodynamic Radii of Macromolecules and Their Effect on Red Blood Cell Aggregation // Biophysical Journal. 2004. V.87. P.4259^270.

62. Barni S., Bertone V., Croce A.C., Bottiroli G., Bernini F., Gerzeli G. Increase in liver pigmentation during natural hibernation in some amphibians // J. Anat. 1999. V.195. P.19-25.

63. Behrens J., Mareel M., Van Roy F., Birchmeier W. Dissecting tumor cell invasion: epithelial cells acquire invasive properties after the loss of uvomorulin-mediated cell-cell adhesion // J. Cell Biol. 1989. V.108. P.2435-2447.

64. Bellocq N.C., Pun S.H., Jensen G.S., Davis M.E. Transferrin-containing, cyclodextrin polymer-based particles for tumor-targeted gene delivery // Bioconjug. Chem. 2003. V.14(6). P.l 122-32.

65. Bertolotti R., Rutishauser U., Edelman G. A cell surface molecule involved in aggregation of embryonic liver cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. V.77. N8. P.4831-4835.

66. Bertalanffy F.D., Dynamics of cellular populations in the lung // In: The Lung. Int. Acad. Pathol. Monograph №8. Baltimore. Williams and Wilkins. 1967. P. 19-30.

67. Bevilacqua M., Pober J., Mendrick D., Cotran R., Gimbrone J. Identification of an inducible endothelial-leukocyte adhesion molecule // Proc. Natl. Acad. Sci. 1987. V. 84. P.9238-9242.

68. Bevilacqua M., Spengeling S., Gimbrone J., Seed B. Endothelial leukocyte adhesion molecule 1: an inducible receptor for neutrophils related to complement regulatory proteins and lectins // Science. 1989. V.243. P.l 160-1165.

69. Birchmeier W., Behrens J. Cadherin expression in carcinomas: role in the formation of cell junctions and the prevention of invasiveness // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V.1198. P. 11-26.

70. Birkedal-Hansen H. Proteolytic remodeling of extracellular matrix // Curr. Opin. Cell Biol. 1995. V.7. N5. P.728-735.

71. Birkedal-Hansen H. Proteolytic remodeling of extracellular matrix // Curr. Opin. Cell Biol. 1995. V.7. N5. P.728-735.

72. Birkedal-Hansen H. Proteolytic remodeling of extracellular matrix // Curr. Opin. Cell Biol. 1995. V.7. N5. P.728-735.122

73. Bissell M., Barcellos-Hoff M. Influence of ECM on gene expression // J. Cell Sci. Suppl. 1987. V.8. P.327-343.

74. Bissell M., Hall H., Parry G. How does extracellular matrix direct gene expression? // J. Theor. Biol. 1982. V.99. P.31-68.

75. Bjork I., Lindahl U. Mechanism of the anticoagulant action of heparin // Mol. Cell Biochem. 1982. V.48. P.161-182.

76. Bloom S.R. Gut Hormones // Edinburgh, Churchill. 1978. P.67-123.

77. Boiler K.,Vestweber D., Kemler R. Cell-adhesion molecule uvomorulin is localized in the intermediate junction of adult intestinal epithelial cells // J. Cell Biol. 1985. V.100. P.327-332.

78. Boudreau N., Bissell M. Extracellular matrix signaling: integration of form and function in normal and malignant cells // Curr. Opin. Cell Biol. 1998. V.10. N5. P.640-647.

79. Bourdon M., Ruoslahti E. Tenascin Mediates Cell Attachment through an RGD-dependent Receptor // J. Cell Biol. 1989. V. 108. P. 1149-1155.

80. Boyer J.L. and Thiery J.P. Epithelial cell adhesion mechanisms // J. Membran. Biol. 1989. V.112. P.97-108.

81. Boyer J.L. Tight junction in normal and cholestatic liver: does the paracellular pathway have junctional significance? //Hepathology. 1983. V.3. N4. P.614-617.

82. Brackenbury R., Thiery J.P., Rutishauser U. and Edelman G. Adhesion among neural cells of chick embryo. 1. An immunological assay for molecules involved in cell-cell binding // J. Biol. Chem. 1977. V.252. P.6835-6840.

83. Brady-Kalnay S., Tonks J. Protein tyrosine phosphatases as adhesion receptors // Curr. Opin. Cell Biol. 1995. V.7. N5. P.650-658.

84. Brennan M. Structural alterations in fibronectin correlated with morphological changes in smooth muscle cells // Dev. Biol. 1983. V.97. P.391-397.

85. Brooks S.A., Dwek M.V., Shumacher S.U. // Functional & Molecular Glycobiology. Oxford, UK: Bios. Sci. Publ. Limited. 2002. P.354.

86. Burridge K. Substrate adhesion in normal and transformed fibroblasts: organization and regulation of cytoskeletal, membrane and extracellular matrix components at focal contacts //CancerRev. 1986. V.24. P.68-78.

87. Burridge K., Chzanowska-Wodnicka M. Focal adhesion, contractility, and signaling // Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 1996. V.12. P.453-518.

88. Burridge K., Chzanowska-Wodnicka M., Zhong C. Focal adhesion assembly // Trends Cell Biol. 1997. V.7. P.342-347.

89. Carlsson R., Engvall E., Freeman A., Rouslahti E. Laminin and fibronectin in cell adhesion: enchanced adhesion of cells from regenerating liver to laminin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V.78(4). P.24003-24006.

90. Cepek K., Shaw S., Parker C., Russel G., Morrow J., Rimm D., Brenner M. Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and the aVb7 integrin. // Nature. 1994. V.372. P.190-193.

91. Chakravarti S., Tam M., Chung A. The basement membrane glycoprotein entactin promotes cell attachment and binds calcium ions // J. Biol. Chem. 1990. V.265. P.10597-10603.

92. Chen L., Subirade M. Chitosan/beta-lactoglobulin core-shell nanoparticles as nutraceutical carriers // Biomaterials. 2005. V.26 (30). P.6041-53.

93. Cheng H., Leblond C.P. Origin, differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. I. Columnar cells, Am. Anat. 1974. V.141. P.461.

94. Cicero R, Sciuto S, Chillemi R, Sichel G. Melanosynthesis in the Kupffer cells of Amphibia // Comp Biochem Physiol. 1982. V.73A. P.477-479.

95. Citi S. The molecular organization of tight junctions // J. Cell Biol. 1993. V.121. P.485-489.

96. Clement В., Rescan P.Y., Baffet G., Loreal O., Lehry D., Compion J.P., Guillouzo A. Hepatocytes may produce laminin in fibrotic liver and inprimary culture // Hepatology. 1988. V.8. P.794-803.

97. Collet A.J., Des Biens G. Fine structure of myogenesis and elastogenesis in the developing rat lung // Anat. Rec. 1974. Y.179. P.343.

98. Collet A.J. Evolution of mesenchymal cell in fetal rat lung // Anat. Embryol. 1975. V.147. P.273.

99. Coman D.R. Cellular adhesiveness in relation to invasioness of cancer: electron microscopy of liver perfused with a chelating agent // Cancer res. 1954. V.14. N7. P.519

100. Coman D.R. Adhesiveness and stickiness: two independent properties of the cell surface // Cancer res. 1961. V.21. P.1436-1438.

101. Coman D.R. Decreased mutual adhesiveness, a property of cell from squamous-cell carcinomas // Cancer res. 1944. V.4. P.625-629.

102. Corsaro C., Scalia M., Blanco A.R., Aiello I., Sichel G. Melanins in physiological conditions protect against lipoperoxidation // A study on albino and pigmented Xenopus. Pigment. Cell Res. 1995. V.8. P.279-282.

103. Corsaro C., Scalia M., Leotta N., Mondio F., Sichel G. Characterization of Kupffer cells in some Amphibia // J. Anat. 2000. V.196. P.249-261.

104. Creaser E.H., Russell L.M. Further characterization of a protein promoting aggregation of retina cells // Biochem. J. 1971. V.123(l). P.127-8.

105. Cunningham B. Cell adhesion molecules as morphoregulators // Curr. Opin. Cell Biol. 1995. V.7. N.5. P.628-634.

106. Cunningham B. Structure of cell adhesion molecules // In: The cell in contact. Eds: Edelman G.M. and Thiery J.-P. Aneurosciences Institute Publication. N.Y. Chichester. Brisbane. Toronto. Singapore. John Wiley & Sons. 1985. Ch.9. P.197-217.

107. Damsky C., Richa J., Solter D., Knudsen K., Buck C. Identification and purification of a cell surface glycoprotein mediating intercellular adhesion in embryonic and adult tissue // Cell. 1983. V.34. P.455-456.

108. Damsky C., Knudsen K., Buck C. Integral membrane glycoproteins in cell-cell and cell-substratum adhesion // In: The biology of glycoproteins. R. Ivatt. Ed. 1984. Plenum N.Y. P. 1-64.

109. David H., Freytag G.H. Submikropische Befunde an der Urodelenleber // Acta Biol. Med. Germ. 1963. V.10. P.663-672.

110. De Fougerolles A., Springer T. Intercellular adhesion molecules (ICAMs) // In "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins". Eds. Kreis T. and Vale R. 1993. Oxford University Press. P.58-60.

111. De Persio C., Jackson., Zaret K. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology // Mol. Cell Biol. 1991. V.ll. P.4405125

112. Deal D., Bowlos C., Bourgeosis S. Detection of sugar-binding sites in the fibrillar and the granular components of the nucleolus: an experimental study in cultured mammalian cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V.84. P. 1876-1880.

113. Donato R. Functional roles of SI00 proteins, calcium-binding proteins of the EF-hand type //Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1450. N3. P.191-231.

114. Donato R. S-100 proteins // Cell Calcium. 1986. V.7. P.123-145.

115. Duust R. The cell population of liver tissue and the cytological reference bases // Symp. on liver function. Publ. of the Amer. Inst. Biol. Sci. 1958. V.4. P.3-10.

116. Edelman G. Expression of cell adhesion molecules during embriogenesis and regeneration // Exp. Cell Res. 1985a. V.161. P.l-16.

117. Edelman G. Modulation of cell adhesion during induction histogenesis and perinatal development of the nervous system // Ann. Rev. Neurosci. 1984. V.27. P.339-377.

118. Edelman G., Gallin W., Delouvee A., Cunningham В., Thiery J. Early epochal maps of two different cell adhesion molecules // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1983. V.14. P.4384-4388.

119. Edelman G., Thiery J.-P.(Eds) The cell in contact // N.Y. Chichester. Brisbane. Toronto. Singapore. John Wiley&Sons. 1985. P.508.

120. Elias H. Human hepatocarcinoma and the comparative embryology of the vertebrate liver //J. Natl. Cancer Inst. 1955. V.15. P.1451-1462.

121. Elias H., Sherrick H. Morphology of the liver // N. Y. 1969. P.365.

122. Engel J. Laminins and other strange proteins // Biochemistry. 1992. V.31. P.10643-10651.

123. Engel J. EGF-like domains in extracellular matrix proteins: localized signals for growth and differentiation? // FEBS lett. 1989. V.251. P.l-7.

124. Engvall E. Laminin // In: "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins". Eds. Kreis Т., Vale R. Oxford University Press. 1993. P.66-68.

125. Engvall E., Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochemistry. 1971. V.8. P.871-874.

126. Epstein C.J. Cell size, nuclear content and the development of polyploidy in the mammalian liver//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1966. V.57. P.327-334.

127. Erickson H., Carrell N. Fibronectin in extended and compact conformations. Electron microscopy and sedimentation analysis // J. Biol. Chem. 1983. V.258. P. 14539-14544.

128. Farguhar M.G., Palade G.E. Junctional complexes in various epithelia // J. Cell Biol. 1963. V.17.P.375-412.

129. Farquhar M., Palade G. Junctional complexes in various epithelia // J. Cell Biol. 1963. V.17. P.375-412.

130. Fernandez-Botran R. Soluble cytokine receptors: their role in immunoregulation // FASEB J. 1991. V.5(l 1). P.2567-74.

131. Frangioni G, Borgioli G. Periodic changes in the organs involved in the erythropoiesis of anemic newts // J. Exp. Zool. 1987. V.243. P.409- 416.

132. Frixen U.H., Behrens J., Sachs M., Eberle G., Voss В., Warda A., Lochner D., Birchmeier W. E-cadherin-mediated cell-cell adhesion prevents invasiveness of human carcinoma cells // J. Cell Biol. 1991. V.l 13(1). P. 173-85.

133. Galbraith C., Sheetz M. Forces on adhesive contacts affect cell function // Current Opinion in Cell Biology. 1998. V.10. N5. P.566-572.

134. Gallagher J. The extended family of proteoglycans: social residents of the pericellular zone // Curr. Opinions Cell Biol. 1989. V.l. P.1201-1218.

135. Gallin W., Edelman G., Cunningham B. Characterisation of L-CAM, a major cell adhesion molecule from embryonic liver cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1983. V.80. P.1038-1042.

136. Garrod D. Desmocollins // In: "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins". Eds. Kreis Т., Vale R. 1993. Oxford University Press. P.130-132.

137. Gendrault J.L., Montecino-Rodrigues E., Cinqualbre J. Sinusoidal liver cells // Eds. Knock D.L., Wisse E. Amsterdam: Elsevier Bioched. Press. 1982. P.137.

138. Germain L., Goyette R., Marceau N. Differential cytokertin and alpha-fetoprotein expression in morphologically distinct epithelial cells emerging at the early stages of rat hepatocarcinogenesis // Cancer Rec. 1985. V.45. P.673-681.

139. Giancotti F., Mainiero F. Integrin-mediated adhesion and signaling in tumorigenesis // Boichim. Biophys. Acta. 1994. V.l 198. P.47-64.

140. Glauman H., Ericsson J. Evidence for the participation of the Golgi apparatus in the intercellular trasport of nascent albumin in the liver cell // J.Cell Biol.l971.V.47. P.555-567.

141. Goodenough D. Gilula N. The aplitting of hepatocyte gap junctions and zonula occludentes with hypertonic disaccharides // J. Cell Biol. 1974. V.61. P.575-590.

142. Goodenough D., Revel J. A fine structural analisis of intercellular junctions in the mouse liver//J. Cell Biol. 1970. V.45. P.278-290.

143. Gordon M. Hemopoietic growth factors and receptors: bound and free // Cancer Cells.1991. V.3(4). P.127-33.

144. Gosling J. P. Ed. In: "Immunoassaays: a practical approach". 2000. Oxford University Press, P. 19-36.

145. Gressner A.M., Vassel A. Developmental changes of proteoglican synthesis in rat liver and isolated hepatocytes // Mech. Age. Devel. 1985. V.31. P.307-327.

146. Grumet M., Edelman G. Heterotypic binding between neuronal membrane vesicles and glial cells is mediated by specific cell adhesion molecule // J.Cell Biol. 1984. V.98. P. 17461756.

147. Guan J-L., Hynes R. Lymphoid cells recognize an alternatively spliced segment of fibronectin via the integrin receptor alpha 4 beta 1 // Cell. 1990. V.60. P.53-61.

148. Gucuen-Guillouzo C. Role of homotypic and heterotypic cell interactions in expression of specific functions by cultured hepatocytes, Research in Isolated and cultured hepatocytes. Guillouzo& C. Gucuen-Guillouzo eds. // INSERM. 1986. P.259-284.

149. Guida G., Maida I., Gallone A., Boffoli D., Cicero R. Ultrastructural and functional study of the liver pigment cells from Rana esculenta L. // In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 1998. V.34. P.393-400.

150. Guida G., Gallone A., Maida I., Boffoli D., Cicero R. Tyrosinase gene expression in the Kupffer cells of Rana esculenta L. // Pigment Cell Res. 2000. V.13. P.431-435.

151. Guillouzo A. Plasma protein production by cultured adult hepotocytes. Isolated and cultured hepatocytes // Les Editions Inserm. 1986. P.347-389.

152. Gumbiner B. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis // Cell. 1996a. V.84. P.345-357.

153. Gumbiner B. Signal transduction by (3-catenin // Current Opinion in Cell Biology. 1995. V.7. N5. P.634-641.

154. Gumbiner В., McCrea P. Catenins as mediators of the cytoplasmic functions of adhesion molecules // J. Cell Sci. 1993. V.17(suppl). P.135-158.

155. Gumbiner B.M. Epitheliai morphogenesis // Cell. 1996b. V.84. N2. P.345-357.

156. Gupta A.K., Curtis A.S. Lactoferrin and ceruloplasmin derivatized superparamagnetic iron oxide nanoparticles for targeting cell surface receptors // Biomaterials. 2004. V. 25(15). P.3029-40.

157. Hahn E., Wick G., Pencev D., Timpl R. Distribution of basement membrane proteins in normal and fibrotic human liver: collagen IV, laminin and fibronectin // Gut. 1980. V.21. P.43-71.

158. Hames B.D. One-dimensional gel electrophoresis of proteins // In Gel Electrophoresis of Proteins. A Practical Approach (Hames B.D. and D. Rickwood, eds.) Oxford University Press, New York. 1990. P.106.

159. Hatta K., Okada Т., Takeichi M. A monoclonal antibody disrupting calcium-dependent cell-cell adhesionof brain tissues: possible role of its target antigen in animal pattern formation// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. V.82. P.2789-2793.

160. Hausman R., Moscona A. Purification and characterization of the retina specific cell-aggregating factor // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. V.72. P.916-919.

161. Hay E. Cell biology of extracellular matrix // Ed. Hay E. N.-Y.-L. Plenum press. 1982. P.417.

162. He H.-T., Barbet J., Chain J.-C., Goridis C. Phosphatidylinositol is involved in the membrane attechment of NCAM-120, the smallest component of the neural cell adhesion molecule // EMBO J. 1986. V.5. P.2489-2494.

163. Heath S., Wissing S. Fine structure of the surface of mouse hepatic cells // Am. J. Anat. 1966. V.119. P.97-127.

164. Hedgecock E., Culotti J., Hall D. The unc-5, unc-6, and unc-40 genes guide circumferential migrations of pioneer axons and mesodermal cells on the epidermis in C. elegans//Neuron. 1990. V.4. P.61-85.

165. Hedin U. Plasma fibronectin promotes modulation of arterial smooth-muscle cells from contractile to synthetic phenotype // Differentiation. 1987. V.33. P.239-246.

166. Hedrick L., Cho K., Vogelstein B. Cell adhesion molecuies as tumour suppressors // Trends Cell Biol. 1993. V.3. P.36-39.

167. Hemler M. Integrin associated proteins // Curr.Opin.Cell Biol. 1998. V.10. N5. P.578-586.

168. Hemler M. Integrins // In "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins". Eds. Kreis Т., Vale R. 1993. Oxford University Press. P. 143-145.

169. Henriksen J., Horn T. Christoffersen P. The blood-lymph barrier in the liver. A review based onmorphological and functional concepts of normal and cirrhotic liver // Liver. 1984. V.4. P.221-232.

170. Hoffman S., Edelman G. A proteoglycan with HNK-1 antigenic determinants is a neuron -associated ligand for cytotactin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1987. V.84. P.2523-2527.

171. Holtfreter J.// Arch. Exp. Zellforschung. 1939. V.23. P.169-209.

172. Horn Т., Lyon H., Christoffersen P. The blood hepatocytic barrier: a light microscopical, transmission- and scanning electron microscopic study // Liver. 1986. V.6. P.233-245.

173. Hynes R. Fibronectins // In "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins". Eds. Kreis Т., Vale R. 1993. Oxford University Press. P.56-58.

174. Hynes R. Fibronectins // Springer-Veriag. New York. 1990. P.223.

175. Hynes R. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion // Cell. 1992. V.69. P.ll-25.

176. Ingber D., Folkman J. How does extracellular matrix control capillary morphogenesis? // Cell. 1989b. V.58. P.803-805.

177. Iancu T.C. Ferritin and haemosiderin in pathological tissues // Electron Microsc Rev. 1992. V.5. P.209-229.

178. Ingber D., Folkman J. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix // J. Cell Biol. 1989a. V. 109. P.317-330.

179. Ingber D., Prusty D., Frangioni J., Cragoe E., Lechene C., Schwartz M. Control of intracellular pH and growth by fibronectin in capillary endothelial cells // J. Cell Biol. 1990. V.110. P.1803-1811.

180. Jackson R., Busch S., Cardin A. Glycosaminoglycans: molecular properties, protein interactions, and role in physiological processes // Physiol. Rev. 1991. V.71. P.481-539.

181. Kalomiris E., Bourguigon L. Mouse T lymphoma cells contain a transmembrane glycoprotein (GP85) that binds ankyrin // J. Cell Biol. 1988. V.106. P.319-327.

182. Karecla P., Bowden S., Green S., Kishaw P. Recognition of E-cadherin on epithelial cells by the mucosal T cell integrin aM290(37(aE|37) // Eur. J. Immunol. 1995. V.25. P.825-856.

183. Kartenbeck J., Koch P., Franke W. Desmoglein // In: "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins". Eds. Kreis Т., Vale R. 1993. Oxford University Press. P. 133135.

184. Kirchausen Т., Bonifacino J.S., Riezman H. Linking cargo to vesicle formation: receptor tail interactions with coat proteins // Curr Opin Cell Biol. 1997. V.9. P.488-495.

185. Kleiner D., Stetler-Stevenson W. Structural biochemestry and activation of matrix metalloproteases // Curr. Opin. Cell Biol. 1993. V.5. P.891-897.

186. Kraemer M., Vassy J., Foucrier J., Chalumeau M. Ultrastructural localization of transferrin synthesis in rat hepatocytes during prenatal and postnatal development // Cell. Differ. 1981. V. 10. P.211-217.

187. Krahl V.E. Anatomy of the mammalian lung // In: American Physiological Society: Handbook of Physiology. Baltimore. Williams and Wilkins. 1964. V.l. P.213.

188. Kreuter J. Nanoparticles and nanocapsules-new dosage forms in the nanometer size range // Pharm Acta Helv. 1978. V.53(2). P.33-39.

189. Kuroda Y. Preparation of an aggregation-promoting supernatant from embryonic chick liver cells // Exp. Cell Res. 1968. V.49. P.626-637.

190. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V.227. P.680-685.

191. Lander A. Proteoglycans // In: "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins". Eds. Kreis Т., Vale R. 1993. Oxford University Press. P.12-17.

192. Leenen P.J.M., Campbell P.A. Heterogeneity of mononuclear phagocytes. An interpretative review // In: Horton MA, editor. Blood cell biochemistry, Macrophages and related cells. New York: Plenum Press. 1993.V.5. P.29-85.

193. Lambert M.W. Accessory bronchiolo-alveolar communications // J. Pathol. Bact. 1955. V.70. P.311.

194. Le Bouton A., Masse J. A random arrangement of albumin-containing hepatocytes seen with histo-immunologic methods. Il.Conditions that produse the artefact. Anat. Res. 1980. V.197. P.195-203.

195. Leblond C.P., Cheng H. Identification of stem cells in the small intestine of the mouse // In: Stem Cells of Renewing Cell Populations. New York. Academic Press. 1976.

196. Legrand J-F., Als-Nielsen J., Colman D., Hendrickson W. Structural basis of cell-cell adhesion by cadherins // Nature. 1995. V.374. P.327-337.

197. LeSage G., Glaser S., Alpini G. Regulation of cholangiocyte proliferation // Liver. 2001. V.21(2). P.73-80.

198. Magnani J., Thomas W., Steinberg M. Two distinct adhesion mechanisms in embryonic neural retina cells. 1. A kinetic analysis // Dev. Biol. 1981. V.81. P.96-105.

199. Marcum J., Reilly C., Rosenberg R. // in Biology of Proteoglycans. Ed. Wight Т., Mecham R. Academic Press. San Diego. CA. 1987. P.301-343.

200. Martin G., Sank C. Extracellular matrices, cells, and growth factors // In: "Peptide Groth Factors and Their Receptors". V.2. Eds: Sporn M. and Roberts A. Ed. Springer-Verlag. Berlin. 1990. P.463-477.

201. Martin G.R., Rohrbach D. H., Terranova V.P., Liotta L.A. Structure, function and pathology of basement membranes // In Connective Tissue Diseases. Eds: Wagner B.M. and Fleischmajer R. Ed. Williams & Wilkins. Baltimore. 1983. P.57-69.

202. Martinez-Hernandez A. The hepatic extracellular matrix. Electron immunohistochemical studies in normal rat liver // Lab. Invest. 1984. V.51. P.57-75.

203. Mercurio A. Shaw L. Laminin binding proteins // BioEssay. 1991. V.13. P.469-473.

204. Mercurio A., Woo H.-J. Laminin binding proteins (LBP, CBP35) // In: "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins". Eds. Kreis Т., Vale R. Oxford University Press. 1993. P.68-70.

205. Mirvish S. The carcinogenic action and metabolism of urethane and N-hydroxyurethane // Adv. Cancer Res. 1968. V.ll. P. 1-42.

206. Modjanova E., Malenkov A. Alteration of properties of cell contacts during progression of hepatomes // Exp. Cell. Res. 1973. V.76. P.305-314.

207. Мое H. The goblet cells, Paneth cells and basal granular cells of the epirhelium of the intestine // Int. Rev. Gen. Exp. Zool. 1976. V.3. P.417.

208. Monroy E. New findings related to pinocytosis // Exp Cell Res. 1969. V.59. P. 153-157.

209. Moscona A. Studies of cell aggregation: demonstration of material with selective cell-binding activity // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1963. V.49. P.743-748.

210. Moscona A. A. Cell agregation: properties of specific cell-ligands and their role in the formation of multicellular systems // Develop. Biol. 1968. V.18. P.250-277.

211. Moscona A. Rotation mediated histogenetic aggregation of dissociated cells // Exp. Cell Res. 1961. V.22. P.455-458.

212. Mosher D. (ed.) Fibronectin // Academic Press. New York. 1989.

213. Motta P. A scanning electron microscopy study of the rat liver sinusoid. Endothelial and Kupffer cells // Cell Tiss Res. 1975. V.164. P.371-385.

214. Motta P, Porter K.R. Structure of rat liver sinusoids and associated tissues spaces as revealed by scanning electron microscopy // Cell Tiss Res. 1974. V.148. P.l 11-125.

215. Muller W., Muller I., Zahn R. Species-specific aggragation factor in sponges. IV. Inactivation of the aggregation factor by mucoid cells from another species // Exp. Cell Res. 1976. V.98. P.31-40.

216. Muller W., Muller I., Zahn R. Two different aggregation principles in aggregationprocess of dissociated sponge cell (Geodia cydonium) // Experrientia.1974. V.30. P.899-901.

217. Muller W., Zahn R. Purification and characterization of a species-specific aggregation factor in sponges // Exp. Cell Res. 1973. V.80. P.95-104.

218. Nakagawa S., Takeichi M. Neural crest cell-cell adhesion controlled by seguential and subpopulation-specific expression of novel cadherins // Development. 1995. V.121. P. 13211332.

219. Naito M, Hasegawa G, Takahashi K. Development, differentiation, and maturation of Kupffer cells // Microsc Res Tech 1997. V.39. P.350-364.

220. Nicola N. Guidebook to cytokines and their receptors // A Sambook and Tooze Publication.Oxford University Press. O. N.Y.T. 1994. P.261.

221. Obrink В. C-CAM (Cell-CAM 105) // In: "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins". Eds. Kreis Т., Vale R. 1993b, Oxford University Press. P.123-124.

222. Obrink B. Cell adhesion and cell-cell proteins // In: "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins". Eds. Kreis Т., Vale R. 1993a Oxford University Press. P.109-113.

223. Obrink B. Epithelial cell adhesion // Exp. Cell Res. 1986. V.163. P.l-21.

224. Ocklind C., Forsum U., Obrink B. Cell surface localization and tissue distribution of hepatocyte cell-cell adhesion glycoprotein Cell-CAM 105 // J. Cell Biol. 1983. V.96. N4. P.1168-1172.

225. Ocklind C., Obrink B. Intercellular adhesion of rat hepatocytes. Indentification of a cell surface glycoprotein involved in the initial adhesion process // J. Biol. Chem. 1982. V.257. N12. P.6788-6795.

226. Oda H., Uemura Т., Harada Y., Iwai Y., Takeichi M. A Drosophila homolog of cadherin associated with Armadillo and essential for embryonic cell-cell adhesion // Dev. Biol. 1994. V.165. P.716-726.

227. Oda H., Uemura Т., Shiomi K., Nagafuchi A., Tsukita S., Takeichi M. Identification of a Drosophila homologue ofa-catenin and its association with the armadillo protein // J. Cell

228. Biol. 1993. V.121. P.1133-1140.

229. Ogou S.-I. Yoshida-Noro C., Takeichi M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules common to hepatocytes and teratocarcinoma stemm cells // J.Cell Biol. 1983. V.97. P.944-948.

230. Olivier J. Drug Transport to Brain with Targeted Nanoparticles // The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2005. V.2. P. 108-119.

231. Olsen B.R. Collagen biosynthsis // In: "Cell Biology of Extracellular Matrix". Ed. by Hay E. 1991. New York: Plenum Publishihg. P.177-220.

232. Olsen B.R. New insights into the function of collagens from genetic analysis // Current Opinion in Cell Biology. 1995. V.7. N5. P.720-728.

233. Onuma K., Kanzaki N., Kobayashi N. Association of calcium phosphate and fibroblast growth factor-2: a dynamic light scattering study // Macromol. Biosci. 2004. V.21. P.39—46.

234. Orci L, Pictet R, Rouiller C. Image ultrastructurale de pinocytose dans la cellule de Kupffer du foie de rat // J Microsc 1967. V.6. P.413-418.

235. Overduin M., Harvey Т., Barby S., Tohg K., Yau P., Takeichi M., Ikura M. Solution structure of the epithelial cadherin domain responsible for selective cell adhesion // Science. 1995. V.267. P.386-389.

236. Ozawa M., Engel J., Kemler R. Single amino acid substitutions in one Ca2+ binding site of uvomorulin abolish the adhesive function. // Cell. 1990 Nov 30. V.63(5). P. 1033-8.

237. Paul D. Connexins // In: "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins". Eds. Kreis Т., Vale R. 1993. Oxford University Press. P. 127-130.

238. Paulsson M., Aumailley M., Deutzmann R., Timpl R., Beck K., Engel J. Laminin-nidogen complex // Eur. J. Biochem. 1987. V.166. P. 11-19.

239. Perl A., Wilgenbus P., Dahl U., Semb H., Christofori G. A causal role for E-cadherin in the transition from adenoma to carcinoma // Nature. 1998. V.392. P.190-193.

240. Peters T. The biosynthesis of rat serum albumin. 1. Properties of rat albumin gene expression in chick embryo hepatocytes cultured without hormones and its partial reversal by insulin. //J. Biol. Chem. 1983. V.258. P. 13355-13360.

241. Pickart L, Thayer L, Thaler M. A synthetic tripeptide which increases survival of normalliver cells, and stimulates growth in hepatoma cells // Biochem Biophys Res Commun. 1973. V.54(2). P.562-6.

242. Pickart L, Thaler MM. Tripeptide in human serum which prolongs survival of normal liver cells and stimulates growth in neoplastic liver // Nat New Biol. 1973. V.243(124). P.85-7.

243. Pierson R., Temin H. The partial purification from calf serum of a fraction with multiplication-stimulating activity for chicken fibroblasts in cell culture and with non-suppressible insulin-like activity // J. Cell Physiol. 1972. V.79. P.319-330.

244. Provencher S.W. Secondary structure of the pore-forming colicin A and its C-terminal fragment. Experimental fact and structure prediction // Makromol. Chem. 1985. V.15. P.632.

245. Purrello M., Scalia M., Corsaro C., Di Pietro C., Piro P., Sichel G. Melanosynthesis, differentation and apoptosis in Kupffer cells from Rana esculenta // Pigment Cell Res. 2001. V.14. P.126-131.

246. Pxytycz В., Jozkowicz A. Differential effects of temperature on macrophages of ectothermic vertebrates //J. Leukoc. Biol. 1994. V.56. P.729-731.

247. Reichardt J.K. Genetic basis of galactosemia//Hum. Mutat. 1992. V.l(3) P. 190-6.

248. Rescan P.Y., Clement В., Grimaud J.A., Guillois В., Strain A., Guillouzo A. Participation of hepatocytes in the production of basement membrane components in human and rat liver during the perinatal period // Cell Diff. Dev., 1989, V.26. P.131-144.

249. Riechardt L. Extracellular matrix molecules and their receptors // In: "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins". Eds. Kreis Т., Vale R. Oxford University Press. 1993. P.3-12.

250. Riechardt L., Tomaselli K. Extracellular matrix molecules and their receptors: functions in neural development // Annu. Rev. Neurosci. 1991. V.14. P.531-570.

251. Robinson M.S. Coats and vesicle budding // Trends Cell Biol. 1997. V.7. P.99-102.

252. Rosen S. Selectins // In: "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins". Eds. Kreis Т., Vale R. 1993. Oxford University Press. P.168-171.

253. Rosenman S., John T. CD44 // In: "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins Eds. Kreis Т., Vale R. 1993. Oxford University Press. P.27-30.

254. Ruoslanti E. Subunit structure of a laminin-binding integrin and localization of its binding site on laminin // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 13369-13372.

255. Ruoslanti E. Fibronectin and its receptors //Ann. Rev.Biochem. 1988. V.57. P.375-413.

256. Ruoslanti E., Pierschbacher M. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins // Science. 1987. V.238. P.491-497.

257. Ruoslanti E., Pierschbacher M. Molecular basis of cell-extracellular matrix interaction // In: "The Liver: Biology and Pathology". 1988. 2nd. Ed. New York: Raven. P.739-745.

258. Ruoslanti E., Vaheri A. Cell-to-cell contact and extracellular matrix // Current Opinion in Cell Biology. 1997. V.9. P.603-754.

259. Rutishauser U. Neural cell adhesion molecule (N-CAM) // In: "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins".Eds. Kreis Т., Vale R. 1993. Oxford University Press. P.158-159.

260. Rutishauser U., Jessell T. Cell adhesion molecules in veterbrane neural development // Physiol. Rev. 1988. V.68. P.819-857.

261. Saber M., Novikoff P., Shafritz D. Albumin and collagen mRNA expressionin normal and analbuminemic rodent liver: analyses by in situ hybridization using biotinylated probes // J.Histochem. Cytochem. 1990. V.38(2). P. 199-207.

262. Scalia M., Geremia E., Corsaro C., Santoro C., Sciuto S., Sichel G. The extracutaneous pigmentary system: evidence for the melanosynthesis in Amphibia and Reptilia liver // Сотр. Biochem. Physiol. 1988. V.89B. P.715-717.

263. Schlesinger M. Immunological functions of the thymus // Isr. J Med Sci. 1977. V13(4). P.343-6.

264. Sell S., Osborn K., Leffert H.L. Autoradiography of «oval cells» appearing rapidly in the livers of rats fed N-2-fluorenylacetamide in a chloride devoid diet // Carcinogenesis. 1981. V.2. P.7-14.

265. Sergeeva M.G., Gonchar M.V., Chistyakov V.V., Mevkh A.T. Ultralow concentrations of ibuprofen activate cell prostaglandin synthesis // Appl Biochem Biotechnol. 1996. V.61(l-2). P.167-71.

266. Shapiro L., Fannon A., Kwong P., Thompson A., Lehmann M., Grubel G., Legrand J-F., Als-Nielsen J., Colman D., Hendrickson W. Structural basis of cell-cell adhesion by cadherins //Nature. 1995. V.374. P.327-337.

267. Shapiro S. Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix: biological consequences // Current Opinion in Cell Biology. 1998. V.10. N5. P.602-609.

268. Shashoua V.E., Hesse G.W., Moore B.W. Proteins of the Brain Extracellular Fluid: Evidence for Release of S-100 Protein // J. ofNeurochemistry. 1984. V.42. P.1536-1541.

269. Sichel G., Corsaro C., Scalia M., Di Bilio A.J, Bonomo R.P. In vitro scavenger activity of some flavonoids and melanins against O2 //1991. Free Rad Biol Med V.ll. P. 1-8.

270. Sichel G., Scalia M., Corsaro C. Amphibia Kupffer cells // Microsc. Res. Tech. 2002. V.57. P.477-490.

271. Smedsrad В., Seteternes Т., Sorensen K., Lindhe O"., Sveinbjo"rnsson B. Scavenger endothelial cells // In: Wisse E, Knook DL, de Zanger R, Fraser R, editors. Cells of the hepatic sinusoid. 1999. V. 7. Leiden: Kupffer Cell Foundation. P. 147-152.

272. Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C. Measurement of protein using bicinchoninic acid // Anal. Biochem. 1985. V.150. P.76 85.

273. Sonnenberg A. Integrins and their ligands // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1993. V.184. P.7-35.

274. Springer T. Adhesion receptors of the immune system // Nature. 1990. V.346. P.425-434.

275. Stamenkovic I., Amiot M., Pesando J., Seed B. A lymphocyte molecule implicated in lymph node homing is a member of the cartilage link protein family // Cell. 1989. V.56. P.1057-1062.

276. Stepanek P. Dynamic Light Scattering. The method and some applications // Ed. By Brown W. Oxford: Clarendron Press, 1993. P. 177.

277. Stoolman L. Adhesion molecules controlling lymphocyte migration // Cell. 1989. V.56. P.907-910.

278. Streuli C., Schmidhauser C., Bailey N., Yurchenco P., Skubitz A., Roskelley C., Bissell M. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia // J. Cell Biol. 1995. V.129. P.591-603.

279. Takeichi M. The cadherins: cell-cell adhesion molecules controlling animal morphogenesis//Development. 1988. V.102. P.639-655.

280. Takeichi M. Cadherins: molecular family essential for selective cell-cell adhesion and animal morphogenesis // Trend. Genet. 1987. V.3. P.213-217.

281. Takeichi M. Morphogenetic roles of classic cadherins // Current Opinion in Cell Biology. 1995. V.7(5). P.619-628.

282. Thiery J., Brackenbury R., Rutishauser U., Edelman G. Adhesion among neural cells of chick embryo. II. Purification and characterization of a cell adhesion molecule (CAM) from neural retina // J. Biol. Chem. 1977. V.252. P.6841-6849.

283. Thiery J., Delouvee A., Gallin W., Cunningham В., Edelman G. Ontogenetic expression of cell adhesion molecules: L-CAM is found in epithelia derived from the three primary germ layers // Dev. Biol. 1984. V.102. P.61-78.

284. Thiery J., Tucker G., Aoyama H. Gangliogenesis in avian embryo: migration and adhesion properties of neural crest cells. Molecular basis of neural development // N.Y.Acad. Press. 1985.

285. Thomas W.A., Steinberg M. Two distinct adhesion mechanisms in embryonic neural retina cells. II. An immunological analysis // Dev. Biol. 1981. V.81. P.106-114.

286. Tietz P.S., LaRusso N.F. Cholangiocyte biology // Curr Opin Gastroenterol. 2005. V. 21(3). P. 337-43.

287. Timpl R. Nidogen/Entactin // In: "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins". Eds. Kreis Т., Vale R. 1993a. Oxford University Press. P.116-118.

288. Timpl R., Dziadek M., Fujiwara S., Nowack H., Wick G. // Eur. J. Biochem. 1983. V.137. P.455-465.

289. Troccoli N.M., Hausman R.E. Retina cognin does not bind to itself during membrane interaction in vitro II Cell Differ. 1988. V.22. P.225-232.

290. Tryggvason K. The laminin family // Curr. Opin. Cell Biol. 1993. V.5. P.877-882.

291. Tsukita S., Itoh M., Nagafuchi A., Yonemura S. Submembranous junctional plaque proteins include potential tumour suppressor molecules // J. Cell Biol. 1993. V.123. P. 10491053.

292. Turner R.J. The functional development of the reticulo endothelial system in the toad, Xenopus laevis (Daudin) // J Exp Zool. 1969. V.l70. P.467^180.

293. Turner R.J. Antimicrobial responses in Amphibia // J. R. Soc. Med. 1979. V.72. P.697-701.

294. Turner M.L. Cell adhesion molecules: a unifying approach to topographic biology // Biol. Rev. 1992. V.67. P.359-377.

295. Umbreit J., Roseman S. A requirement for reversible binding between aggregating embryonic cells before stable adhesion // J. Biol. Chem. 1975. V.250. P.9360-9368.

296. Uthne K. Human somatomedins. Purification and some studies on their biological action // Acta Endocrinology (Suppl.) V.175. P.l-35.

297. Van der Rest M., Garrone R. Collagen family of proteins // FASEB J. 1991. V.5. P.2814-2823.

298. Van Golde L.M. Metabolism of phospholipids in the lung // Am. Rev. Respir. 1976. V.l 14. P.977.

299. Van Eijk H.G., De Yong G. The physiology of iron, transferrin, and ferritin // Biol. Trace Elem. Res. 1992. V.35. P. 13-24.

300. Van Furth R., Cohn Z.A., Hirsch J.G., Humphrey J.H., Spector W.G., Langevoort H.L. The mononuclear phagocyte system: a new classification of macrophages, monocytes, and their precursor cells // Bull World Health Org. 1972. V.46. P.845-852.

301. Vasiliev J.M., Gelfand I.M. Morphogenetic reactions and locomotory behaviour of trasformed cells in culture // In: "Fundamental aspects of metastasis". Ed. L.Weiss. Amsterdam. 1976. P.71.

302. Vasiliev J.M., Gelfand I.M., Domnina I.V. Contact inhibition of phagocytosis in epithelial sheets: alterations of cell surface properties induced by cell-cell contacts // Proc. Nat. Sci. USA. 1975. V.72. P.719-722.

303. Venyaminov S. Yu, Yang J.T. "Determination of protein secondary structure" In "Circular Dichroism and the conformational analysis of Biomolecules" // Edited by G.D.Fasman. 1996. New York. Plenum Press. P. 69-107.

304. Victorov I.V., Lyjin A.A., Aleksandrova O.P. // Brain Res. Prot. 2001. V.7. P.30-37.

305. Vleminck K., Vakaet L., Mareel M., Fries W., Van Roy F. Genetic manipulation of E-cadherin expression by epithelial tumor cells reveals an invasion suppressor role // Cell. 1991. V.66. P.107-119.

306. Welsch U. Phagocytosis in the amphibian lung // Anat. Anz. 1981. V.104. P. 319-327.

307. West С., Lanza R. Fibronectin alters the phenotypic properties of cultured chick embryo chondroblasts // Cell. 1979. V.17. P.491-501.

308. Williams A., Barclay A. Cell Adhesion molecules // Ann. Rev. Immunol. 1988. V.6. P.381-405.

309. Williams A., Beyers A. CD2 // In: "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins". Eds. Kreis Т., Vale R. 1993. Oxford University Press. P.118-119.

310. Wilson C.M. Staining of proteins on gel: comparision of dyes and procedures // Methods in Enzymol. 1983. V.91. P.236 247.

311. Yamada K. Adhesive recognition seguences // J. Biol. Chem. 1991. V.266. P.12809-12812.

312. Yamada K. Cell surface interactions with extracellular materials // Ann. Rev. Biochem. 1983. V.52. P.761-799.

313. Yamada K., Miyamoto S. Integrin transmembrane signaling and cytoskeletal control // Curr. Opin. Cell Biol. 1995. V.7. N5. P.681-690.

314. Yap A. The morphogenetic role of cadherin cell adhesion molecules in human cancer: a thematic review // Cancer Invest. 1998. V.16. P.252-261.

315. Yee A.G., Revl J.P. Loss and reappearance of gap junctions in regenerating liver // J. Cell Biol. 1978. V.78. P.554-564.

316. Yocota S., Fahimi H. Immunocytochemical localization of albumin in the secretory apparatus of rat liver parenchymal cells // Proc. Natl. Acad. Sci. 1981. V.78. P.4970-4974.

317. Yurchenko P., O'Rear J. Basal lamina assembly // Curr. Opin. Cell Biol. 1994. V.6. P.674-681.

Информация о работе

Борисенко, Андрей Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные белки, выделенные из тканей млекопитающих - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы