Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуногистохимическое исследование фенотипа и инвазивного потенциала опухолей поджелудочной железы

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Гуревич, Лариса Евсеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Эмбриогенез и гистогенез эпителиальных тканей поджелудочной железы.

1.2 Клетки — предшественницы экзокринной ткани поджелудочной железы.

1.3 Клетки - предшественницы эндокринной ткани поджелудочной железы.

1.4 Фенотип экзокринных клеток поджелудочной железы.

1.4.1 Фенотип клеток протокового эпителия.

1.4.2 Фенотип эндокринных клеток поджелудочной железы.

1.4.3 Роль полипотентных клеток в неопластической трансформации эпителиальных тканей ПЖ.

1.5 Адгезивные свойства клеток и роль адгезивных молекул в нормальном функционировании и неопластической трансформации ткани.

1.5.1 Свойства и функции адгезивных молекул.

1.5.2 Молекулы нейроадгезии.

1.5.2.1 Молекулы С056, или ЫСАМ (Ы-САМ).

1.5.2.2 Молекулы Ыг-САМ.

1.5.2.3 Роль молекул нейроадгезии в канцерогенезе ПЖ.

1.5.3 Кадхерины.

1.5.3.1 Е-кадхерин.

1.5.3.2 Ы-кадхерин.

1.5.3.3 Роль молекул кадхеринов в неопластической трансформации.

1.5.3.4 Роль кадхеринов в неопластической трансформации клеток ПЖ.

1.5.4 Адгезивные молекулы Ер-САМ.

1.5.5 Адгезивные молекулы семейства СБ44.

1.5.5.1 .Физиологическаяроль СИ44.

1.5.5.2 Роль молекул СВ44 во взаимодействиях клеток с ЕСМ.

1.5.5.3 Экспрессия СЭ44 в нормальных тканях ПЖ.

1.5.5.4 Роль СИ44 в канцерогензе.

1.5.5.5 Роль СИ44 в опухолях ПЖ.

1.6 Межклеточные взаимодействия и роль экстрацеллюлярного матрикса в норме и при патологии.

1.6.1 Роль металлопротеиназ в регуляции тканевого гомеостаза.

1.6.2 Роль металлопротеиназ в ангиогенезе.

1.6.3 Роль металлопротеиназ в новообразованиях различного генеза.

1.6.4 Роль металлопротеиназ 2 и 9 в гомеостазе тканей и неопластической трансформации.

1.6.5 Роль металлопротеиназ в обеспечении инвазивного потенциала новообразований ПЖ

1.7 Факторы, участвующие в регуляции клеточного цикла.

1.7.1 Семейство протеинов Ьс1-2.

1.7.2 Роль протеинов семейства Ьс1-2 в канцерогенезе.

1.7.3 Роль регуляторных протеинов в канцерогенезе ПЖ.

1.7.4 Экспрессия протеинов р53 и К-гав в новообразованиях ПЖ.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Материал исследования.

2.2 Методы исследования.

2.2.1 Морфологические методы исследования.

2.2.1.1 Гистологический метод.

2.2.1.2 Иммуногистохимический метод.

2.2.2 Системы оценки экспрессии различных ИГХ маркеров.

2.2.3 Статистический метод.

3. ИЗУЧЕНИЕ ФЕНОТИПА КЛЕТОК ОПУХОЛЕЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ.

3.1 Изучение фенотипа экзокринных опухолей ПЖ.

3.1.1 Исследование фенотипа муцинозно-кистозных опухолей.

3.1.2 Исследование фенотипа внутрипротоковых опухолей.

3.1.3 Исследование фенотипа аденокарцином.

3.1.4 Изучение фенотипа анапластических опухолей ПЖ.

3.1.5 Исследование фенотипа клеток солидно-псевдопапиллярных опухолей.

4 3.2 Исследование фенотипа нейроэндокринных новообразований.

3.2.1 Исследование фенотипа клеток инсулином, глюкагном, смешанно- клеточных и нефункционирующих опухолей.

3.2.2 Исследование фенотипа нефункционирующих НЭОПЖ.

3.3 Исследование фенотипа клеток гастрином.

4. ИЗУЧЕНИЕ ФАКТОРОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

4.1 Определение пролиферативной активности опухолей поджелудочной железы.

4.2 Изучение экспрессии протеинов, регулирующих клеточный цикл.

4.2.1 Изучение экспрессии протеинов, регулирующих апоптоз - ВАХ и Вс1Х.

4.2.2 Определение "коэффициента апоптоза".

4.2.3 Изучение экспрессии протеина р53.

4.3 Изучение особенностей экспрессии трансформирующего фактора роста - TGFfi.

5. АДГЕЗИВНЫЕ СВОЙСТВА КЛЕТОК ОПУХОЛЕЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

5.1 Экспрессия молекул нейроадгезии (CD56) в опухолях поджелудочной железы.

5.2 Экспрессия молекул кадхеринов.

5.2.1 Экспрессия N-кадхерина.

5.2.2 Экспрессия Е-кадхерина.

5.2.3 Экспрессия молекул CD44 (CD44H).

6. Взаимодействие и соотношение компонентов экстрацеллюлярного матрикса и паренхимы опухолей поджелудочной железы различного генеза.

6.1 Экспрессия компонентов ЕСМ.

6.1.1 Экспрессия коллагена IV типа.

6.1.2 Экспрессия ламинина.

6.2 Экспрессия матриксных металлопротеиназ ММР-2 и ММР-9.

6.2.1 Экспрессия ММР-2.

6.2.2 Экспрессия ММР-9.

7. ПРЕДОПУХОЛЕВЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЭНДОКРИННОЙ И ЭКЗОКРИННОЙ ТКАНИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ.

7.1 Опухолеподобные изменения в ткани поджелудочной железы при экзокринных опухолях

7.2 Опухолеподобные изменения в ткани поджелудочной железы при эндокринных опухолях.

7.3 Опухолеподобные изменения во внеопухолевой ткани поджелудочной железы при гастриномах.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммуногистохимическое исследование фенотипа и инвазивного потенциала опухолей поджелудочной железы"

Актуальность проблемы.

Поджелудочная железа (ПЖ) человека и млекопитающих является уникальным органом - одновременно экзокринным и эндокринным, что определяет многообразие его опухолевой патологии. До недавнего времени более 90% опухолей ПЖ относили к опухолям протокового происхождения, в первую очередь, к аденокарциномам. Применение современных методов морфологических исследований позволило верифицировать эти опухоли и выделить новообразования с более благоприятным прогнозом. Однако при определении степени злокачественности и прогноза смешанных экзо-эндокринных опухолей ПЖ, общепринятые в онкоморфологии критерии злокачественности часто не пригодны.

В последние годы рядом ведущих европейских патологов разработаны критерии оценки прогноза НЭОПЖ [98,171,202,312], на основе которых в 2000 г группой экспертов ВОЗ была разработана новая гистологическая классификация этих опухолей, дополненная рубрикой "опухоли с неопределенным потенциалом злокачественности" для медленно растущих, но потенциально способных к метастазированию новообразований. Тем не менее, диагностическая ценность некоторых из предложенных критериев злокачественности остается спорной, поэтому нужны дополнительные, более четкие критерии дифференциальной диагностики и прогнозирования опухолей ПЖ.

Все клетки ПЖ происходят от единой полипотентной клетки, имеющей протоковый фенотип [81-86,247,247,364]. Это делает ПЖ удобной моделью для изучения общих закономерностей опухолевого роста и инвазивного потенциала опухолевых клеток. Происхождение клеток всех эпителиальных тканей органа от единого предшественника позволяет предположить, что фенотип клеток опухолей является отражением этапов ^ дифференцировки клеточных компонентов ПЖ в онтогенезе. Исследование фенотипа клеток различных опухолей ПЖ позволит не только ответить на этот вопрос, но и разработать ИГХ критерии их злокачественности.

Одними из самых неблагоприятных по прогнозу новообразований человека являются протоковые АК ПЖ, которые составляют 85-90% всех опухолей этого органа. Смертность от этих опухолей почти равна частоте их обнаружения и занимает пятое место среди причин смерти от рака в США и второе (после рака толстой кишки) среди новообразований желудочно-кишечного тракта. В клетках 70-90% аденокарцином ПЖ и в 8% ацинарно-клеточных карцином, в отличие от НЭОПЖ, наблюдается сверхэкспрессия онкогена К-гаэ [289,302], в 90% аденокарцином и только в 7% НЭОПЖ - экспрессия онкопротеина с-егЬВЗ. Сверхэкспрессия регуляторного протеина р53 в результате мутации гена-супрессора опухолей р53, наблюдается в 40-60% аденокарцином, в 8% НЭОПЖ и не играет никакой роли в патогенезе солидно-псевдопапиллярных и ацинарно-клеточных карцином ПЖ [112].

Инвазивные свойства опухолевых клеток и их способность формировать метастазы в конечном итоге и определяет прогноз новообразований. Эти свойства опухолевые клетки приобретают в результате ряда последовательных мутаций, затрагивающих фундаментальные молекулярно-биологические механизмы - обмен веществ и информации с окружающей средой, Чр рост, размножение и гибель. Миграция клеток опухоли за пределы первичного очага, то есть их способность к инвазии, является ключевым этапом опухолевого роста. Формирование метастазов происходит в результате ряда последовательных и независимых событий -новообразования сосудов, инвазии, эмболизации сосудов, миграции, адгезии к стенкам сосудов, пенетрации эндотелия сосудов, формирования собственного микроокружения и пролиферации клеток в органе-мишени. На каждом этапе канцерогенеза важную роль играют различные регуляторные факторы [91,212,213]. Важная роль в неопластической трансформации клеток и прогрессировании злокачественных новообразований принадлежит адгезивным молекулам М

175,273,309], компонентам ЕСМ [76,89-91,357], матриксным металлопротеиназам и их ингибиторам [92,278,344], факторам, стимулирующим ангиогенез в опухоли тромбоспондинам, фактору роста эндотелия (УЕСР) и некоторым другим [101,330], инактивации регуляторных протеинов, контролирующих апоптоз [316]. Роль всех этих факторов для прогноза новообразований ПЖ изучена еще не достаточно, имеющиеся данные противоречивы и дальнейшие исследования в этом направлении позволят пролить свет на молекулярно-биологические механизмы, лежащие в основе неопластической трансформации клеток ПЖ. Актуальной также является проблема изучения фоновых и предраковых изменений в ткани ПЖ. Таких работ пока мало и они во многом противоречат друг другу.

Важным направлением современной онкологии является разработка оптимальных схем 'М лечения онкологических больных. Использование достаточно широкого спектра специфических

ИГХ маркеров для определения фенотипа клеток опухолей ПЖ позволит разработать объективные критерии прогнозирования инвазивного потенциала клеток опухолей, а на их основе рекомендовать адекватный объем операции и тактику лечения пациентов.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы - изучить особенности фенотипа клеток различных опухолей ПЖ, которые отличают доброкачественные новообразования от инвазивных злокачественных и которые могут служить факторами прогноза этих новообразований.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. изучить фенотип клеток различных эпителиальных опухолей ПЖ;

2. определить экспрессию протеинов, участвующих в регуляции клеточного цикла клеток новообразований ПЖ;

3. сравнить особенности экспрессии в клетках опухолей ПЖ адгезивных молекул и определить их связь с инвазивным потенциалом клеток;

4. изучить роль межклеточных взаимодействий и компонентов ЕСМ и определить их связь с инвазивным потенциалом клеток;

5. исследовать характер изменений во внеопухолевой ткани ПЖ, которые предшествуют и/или сопутствуют неопластической трансформации клеток;

6. разработать критерии прогноза инвазивного потенциала новообразований ПЖ на основе определения их фенотипических особенностей и степени дифференцировки опухолевых клеток.

Научная новизна исследования.

Изучены некоторые молекулярно-биологические механизмы, которые лежат в основе инвазии и прогрессирования различных новообразований ПЖ.

На основе ИГХ исследования фенотипа клеток опухолей ПЖ, межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий в работе впервые:

1. показана роль полипотентных клеток поджелудочной железы в неопластической трансформации;

2. определены основные фенотипические характеристики клеток опухолей поджелудочной железы и разработан алгоритм для определения степени дифференцировки и злокачественного потенциала этих опухолей;

3. установлена уникальность фенотипа клеток гастрином поджелудочной железы, что позволило выделить эти опухоли в отдельную группу экзо-эндокринных новообразований;

4. доказана непосредственная связь экспрессии в клетках опухолей поджелудочной железы хорионического гонадотропина человека с низкой степенью дифференцировки и протоковым фенотипом этих клеток;

5. выявлена прямая связь между пролиферативной активностью клеток доброкачественных и злокачественных опухолей поджелудочной железы и экспрессией в их клетках ингибитора апоптоза Вс1Х и обратная связь - с экспрессией в них индуктора апоптоза ВАХ;

6. показано значение нормальных и аномальных типов экспрессии некоторых адгезивных молекул как критериев прогноза инвазивного потенциала клеток опухолей поджелудочной железы;

7. получены данные, свидетельствующие о важной роли компонентов экстрацеллюлярного матрикса и базальных мембран в инвазии опухолей;

8. установлено, что быстрая инвазия наиболее злокачественных протоковых новообразований поджелудочной железы обеспечивается способностью их клеток продуцировать металлопротеиназы матриксного типа, разрушающие компоненты экстрацеллюлярного матрикса;

9. доказано, что полипотентными свойствами и пластичным фенотипом обладают не только протоковые, но и ацинарные клетки поджелудочной железы, способные к изменению фенотипа в зависимости от микроокружения. Именно такие изменения в ткани поджелудочной железы могут быть пусковым механизмом неопластической трансформации.

Научно-практическая значимость.

Работа открывает новое научное направление в изучении молекулярно-клеточных механизмов, лежащих в основе неопластической трансформации и прогрессирования опухолей поджелудочной железы эпителиального происхождения.

Полученные в работе данные могут быть использованы при верификации диагноза, для ^ более точной и объективной оценки инвазивного потенциала и прогноза новообразований поджелудочной железы и оптимизации их лечения.

Практическая ценность работы определяется предложенным нами алгоритмом исследования фенотипа опухолевых клеток, позволяющим использовать его в практике морфологической диагностики опухолей ПЖ.

Результаты работы могут быть использованы научно-исследовательскими и педагогическими учреждениями Москвы, Московской области и РФ (ГУ научно-исследовательским институтом морфологии человека РАМН, ГУ Российским онкологическим научным центром им. Н.Н.Блохина РАМН, Московской медицинской академией им. И.М. Сеченова, Институтом хирургии им. A.B. Вишневского РАМН), хирургическими и терапевтическими отделениями онкологической направленности, кафедрами биологии, гистологии, патологической анатомии человека и онкологии. На основе полученных данных могут быть разработаны оптимальные схемы терапевтического и хирургического лечения пациентов с новообразованиями поджелудочной железы.

Основные положения, выносимые на защиту.

В поджелудочной железе всегда имеются популяции клеток с пластичным фенотипом и полипотентными свойствами, которые способны к разнонаправленной диффренцировке.

1. Дифференцировка полипотентных клеток складывается из многих этапов, которым соответствует изменение фенотипа клеток и чему соответствует фенотип и уровень дифференцировки клеток различных новообразований поджелудочной железы.

2. Определение фенотипа клеток новообразований поджелудочной железы позволяет определить степень их дифференцировки и прогноз новообразований.

Апробация диссертационного материала.

Результаты работы доложены на 2 и 3 Всероссийских школах по '■щ иммуногистохимической диагностике опухолей человека (Казань, 2000, 2002), на IV

Российском симпозиуме: "Хирургия эндокринных желез" (Уфа, 26-28 сентября 1995), на III Всероссийском съезде эндокринологов "Актуальные проблемы эндокринологии" (Москва, 4-7 июня 1996); на 1 съезде онкологов стран СНГ (Москва, 3-6 декабря 1996); на 5-ай Общеевропейской неделе гастроэнтерологии (5-th UEGW) (Париж, 2-6 ноября 1996); на Национальном Всероссийском съезде по клинической и лабораторной диагностике (Москва,

1997); на IV научной конференции "Новые методы и разработки в онкоморфологии" (Москва, 4-6 февраля 1998); на 2-м конгрессе ассоциации хирургов им. Н.И. Пирогова (Санкт-Петербург, Н

1998); на VII (IX) Российском Симпозиуме по хирург, эндокринологии: "Современные аспекты хирургической эндокринологии" (Липецк, 16-18 сентября 1998); на Юбилейной конференции, посвященной 60-летию эндокрин. службы республики Беларусь "Актуальные вопросы эндокринологии" (Минск, 1999); на 3-й Всероссийской конференции "Актуальные проблемы эндокринологии" (Пермь, 2000); на IX (XI) Российском симпозиуме по хирургической эндокринологии: «Современные аспекты хирургической эндокринологии" (Челябинск, 2000), на Научной конференции по патологической анатомии, посвященной памяти И.К. Есиповой и В.Н. Таланкина (Москва, 2001); на VI Съезде эндокринологов Украины (Киев, 23-25 мая 2001); на IV Всероссийском Конгрессе эндокринологов «Актуальные проблемы современной эндокринологии" (Санкт-Петербург, 2001), на Конференции "Новые направления и разработки $ в онкоморфологии", РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (Москва, 25-27 апреля 2001); на Науковопрактичной концеренци "Проблеми онкогенетики: науков1 та при клади i аспекта" (Киев, 2002); на X (XII) Российском симпозиуме по хирургической эндокринологии: "Современные аспекты хирургической эндокринологии" (Смоленск, 2002); на IX конференции "Новые направления и разработки в онкоморфологии" в рамках Российско-американского общества онкологов, РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (Москва, 16-18 апреля 2003); на XI (XIII) Российском симпозиуме с международным участием по хирургической эндокринологии (Санкт-Петербург, 15-18 июля, 2003), на 11-ой Общеевропейской неделе гастроэнтерологии (11-th UEGW) (Мадрид, 1-5 ноября 2003).

Публикации.

Результаты исследований по теме диссертации опубликованы в печатных работах, включающих главы в 2 монографиях и работ в центральной печати, в том числе 5 за рубежом.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 218 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, общей характеристики материалов и методов исследования, пяти глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 22 таблицами, 45 рисунками, из которых 40 монтажей из 198 микрофотографий. Библиография включает 51 отечественный и 317 зарубежных источников.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Гуревич, Лариса Евсеевна

ВЫВОДЫ

1. В протоках поджелудочной железы всегда присутствует популяция полипотентных клеток, которые имеют фенотип клеток протокового эпителия. Фенотип клеток эпителиальных опухолей поджелудочной железы соответствует различным уровням и направлениям дифференцировки полипотентных клеток-предшественниц, подвергшихся неопластической трансформации, и отражает биологический потенциал и степень злокачественности новообразований.

2. Для фенотипа клеток протокового типа и полипотентных предшественников характерна экспрессия цитокератина 7, а цитокератин 19 является маркером не только протоковых клеток, но и эндокринных предшественников.

3. Фенотип всех протоковых опухолей поджелудочной железы - муцинозно-кистозных, внутрипротоковых и аденокарцином характеризует стабильная экспрессия маркеров промежуточных филламентов - цитокератинов 7, 19, реже - цитокератина 20, а также эпителиально-мембранного и карцино-эмбрионального антигенов. Протеин р53 экспрессируется в клетках большинства аденокарцином, редко во внутрипротоковых и муцинозно-кистозных опухолях и не встречается в недифференцированных, солидно-псевдопапиллярных и нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы.

4. Инвазивный потенциал аденокарцином и анапластических опухолей поджелудочной железы коррелирует с увеличением пролиферативной активности опухолевых клеток, возникающим в ответ на смещение баланса регуляторных протеинов в сторону сверхэкспрессии ингибитора апоптоза Вс1Х при ингибиции индуктора апоптоза ВАХ, что сочетается с аномальным распределением этих протеинов в клетках.

5. Увеличение инвазивного потенциала аденокарцином и анапластических опухолей поджелудочной железы сопровождается прогрессивным уменьшением числа клеток с нормальным мембранным типом экспрессии адгезивных молекул эпителиального типа — Е-кадхеринов и увеличением количества клеток с аномальной экспрессией этих молекул -мембранно-редуцированным, диффузно-цитоплазматическим, мелко-гранулярным и комковатым типами и клеток, в которых экспрессия вообще отсутствует.

6. Инвазивный потенциал аденокарцином поджелудочной железы увеличивается при сверхэкспрессии адгезивных молекул С044Н в клетках опухоли, локализованных в зоне инвазии и эпителиально-мезенхимальных контактов, что сопровождается уменьшением содержания коллагена IV типа в экстрацеллюлярном матриксе и сверхэкспрессией в опухолевых клетках матриксной металлопротеиназы 2 типа.

7. Неблагоприятным прогностическим признаком, характеризующим агрессивный фенотип клеток аденокарцином и анапластических опухолей ПЖ, является экспрессия в ламинина в их цитоплазме.

8. Фенотип клеток большинства опухолей поджелудочной железы с протоковой дифференцировкой, особенно аденокарцином и гастрином, характеризуется экспрессией хорионического гонадотропина.

9. Диффренциально-диагностическими признаками муцинозно-кистозных опухолей поджелудочной железы является очаговая экспрессии ЦК20 и ламинин-содержащая строма, а солидно-псевдопапиллярных опухолей - экспрессия виментина и СЭ56.

10. Фенотип клеток доброкачественных нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы характеризуется экспрессией маркеров нейроэндокринной дифференцировки (синаптофизина, хромогранина А, нейрон-специфической энолазы и СЭ56) и островково-клеточных гормонов при отсутствии экспрессии цитокератинов 7, 19 и 20, эпителиально-мембранного, карциноэмбрионального антигенов, эктопических гормонов, хорионического гонадотропина, сверэкспрессией ВАХ, нормальной мембранной экспрессией Е-кадхерина, отсутствием экспрессии матриксной металлопротеиназы 2, при индексе пролиферации Кл67 и РСЫА менее 5%.

11. Фенотип клеток злокачественных нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы характеризуется экспрессией антигенов, свойственных эндокринно-клеточным предшественникам: цитокератина 19, эпителиально-мембранного и карциноэмбрионального антигенов и гормонов, в норме не продуцируемых островковыми клетками - гастрина, АКТГ, серотонина и некоторых других. Потенциально злокачественными нейроэндокринными новообразованиями поджелудочной железы являются опухоли с коэкспрессией в клетках сразу нескольких гормонов, аномальной экспрессией Е-кадхерина и с индексом пролиферации Кл67 и РСЫА более 5%.

12. Гастриномы представляют собой особую группу новообразований поджелудочной железы, в фенотипе клеток которых сочетаются признаки эндокринной и экзокринной дифференцировки и коэкспрессия протоковых и нейроэндокринных маркеров: ЦК19 и 20, эпителиально-мембранного и карцино-эмбрионального антигенов, хромогранина А, синаптофизина, нейрон-специфической энолазы, СЭ56, а также гастрина и хорионического гонадотропина. Клетки гастрином экспрессируют ЦК20, а не ЦК7 и представляют собой единственный тип опухолей этого органа с фенотипом клеток эпителия кишечного типа.

13. Важным критерием оценки инвазивного потенциала новообразований поджелудочной железы, имеющим прогностическое значение, является экспрессия в клетках опухолей матриксной металлопротеиназы 2 типа.

• В аденокарциномах экспрессия металлопротеиназы 2 типа увеличивается по мере снижения степени дифференцировки опухолевых клеток.

• В нейроэндокринных опухолях и гастриномах экспрессия металлопротеиназы 2 типа свидетельствует о злокачественном фенотипе опухолевых клеток и их происхождении от полипотентных предшественников.

• Фенотип клеток доброкачественных опухолей и опухолей низкой степени злокачественности (нейроэндокринных, муцинозно-кистозных, внутрипротоковых) характеризуется слабой экспрессией матриксной металлопротеиназы 9, а коэкспрессия в опухолевых клетках ММР-2 и ММР-9 является неблагоприятным прогностическим фактором.

14. Фоновыми или предшествующими аденокарциномам изменениями внеопухолевой ткани поджелудочной железы являются атипичная протоковая гиперплазия и трансдифференцировка ацинарных клеток в клетки с протоковым фенотипом.

15. Мутации, ведущие к развитию аденокарцином и внутрипротоковых опухолей поджелудочной железы, могут быть мультифокальными, что сопровождается сверхэкспрессией протеина гена-супрессора опухолей р53 не только в клетках опухолей, но и в эпителии протоков внеопухолевой паренхимы.

16. Фоновыми или предшествующими нейроэндокринным опухолям изменениями внеопухолевой ткани поджелудочной железы являются микроаденоматоз эндокринных островков, кистозная и трабекулярная трансформация микроаденом, незидиобластоз, аденоматозная и слизистая гиперплазия эпителия внутридольковых и междольковых протоков с очаговой пролиферацией эндокринных клеток-предшественниц в междольковых протоках и окружающей их междольковой строме.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из самых сложных проблем онкоморфологии остается определение инвазивных свойств и метастатического потенциала опухолей человека, в том числе и эпителиальных новообразований ПЖ. В настоящее время уже не вызывает сомнения существование в нормальной ткани ПЖ полипотентных клеток, но по-прежнему мало известно о фенотипе и специфических маркерах этих клеток. Онкологическая патология ПЖ, отражающая морфофункциональную многокомпонентность этого органа, представляет уникальную возможность для изучения свойств полипотентных клеток, фенотипической изменчивости экзо-и эндокринных клеток и трансформации одних клеточных типов в другие.

В разделе 3 проводилось исследование фенотипа клеток различных эпителиальных опухолей ПЖ. Определение экспрессии цитокератинов в опухолевых клетках является важным инструментом при верификации эпителиальных новообразований различного генеза [297].

Хорошо известно, что аденокарциномы ПЖ отличаются крайне агрессивным клиническим течением с коротким сроком выживания пациентов [311]. В Японии, например, по статистике заболеваемость раком ПЖ увеличиваются после 4-й декады жизни и в настоящее время занимают 5 место среди причин смерти от рака. Результаты хирургического лечения этих опухолей из-за высокой частоты рецидивов остаются неудовлетворительными, хотя и в лечении этого тяжелого заболевания наметился некоторый прогресс.

В связи с этим предпринимаются все новые попытки выработать гистологические и клинические критерии оценки степени злокачественности и стадии аденокарцином ПЖ [12,201,202,226,236]. Кроме гистологического деления на высоко-, умеренно- и низкодифференцированные опухоли, аденокарциномы ПЖ дифференцируют в соответствии со степенью их злокачественности [236]. Для этой цели предложено использовать систему Broder, по которой аденокарциномы делят в на 4 группы по степени атипии опухолевых клеток. Так, опухоли высокой степени злокачественности чаще имеют более крупные размеры, венозный тромбоз и метастазы, чем опухоли низкой степени злокачественности. Mannell и соавт. [231] показали, что существует прямая зависимость между степенью атипии опухолевых клеток и снижением сроков выживания пациентов. Полагают, что основным фактором плохого прогноза для аденокарцином ПЖ являются метастазы в печень, а следующими по значению - степень дифференцировки опухолевых клеток и адекватность выполненной резекция (в пределах здоровых тканей) [226]. Solcia С. и соавт. [311] придерживаются другой системы оценки злокачественности аденокарцином, которая основана на учете целого комплекса гистологических и цитологических особенностей опухоли, а также митотической активности клеток. Если по гистологическому строению опухоль неоднородна и в ней имеются участки клеток с разной степенью дифференцировки и митотической активности (что, по их данным, встречаются в 30% аденокарцином), то диагноз основывается на учете компонента с более высокой степенью злокачественности. Использование этой системы позволило получить корреляцию между временем выживания и установленной степенью злокачественности как независимого прогностического критерия.

Все эти системы оценок часто не однозначны, не дают полной информации, иногда противоречат друг другу, а главное, не позволяют объяснить крайне агрессивный потенциал этих опухолей. Результаты, полученные в разделе 3 при исследовании фенотипа клеток аденокарцином, свидетельствуют о том, что наиболее характерным маркером клеток с протоковой дифференцировкой является ЦК7. Наличие в большинстве аденокарцином участков с разной степенью дифференцировки клеток, а также нескольких компонентов, отличающихся и по гистологическому строению, и по степени дифференцировки и по фенотипу опухолевых клеток свидетельствует в пользу гипотезы о существования и монофокального, и мультифокального механизмов канцерогенеза подобных опухолей: Полученные результаты показывают, что в отдельных аденокарциномах высоко-, низко - и даже недифференцированный компоненты (клетки которого коэкспрессировали виментин и цитокератины протокового типа - 7 и 19) были интимно связаны, а переходные формы отсутствовали. Весомым аргументом в пользу этого предположения являются и результаты, описанные в разделе 7 - о наличии в протоках внеопухолевой ткани ПЖ очаговой экспрессии протеина р53, а в самой опухоли участков, в которых экспрессия этого протеина отсутствует.

Данные, полученные при определении фенотипа клеток различных новообразований ПЖ, свидетельствует о том, что основными маркерами протоковых клеток являются цитокератины 7 и 19. Цитокератину 19 отводят роль "переключателя" дифференцировки для клеток, сохранивших способность к выбору направления дифференцировки [82-88]. В процессе дифференцировки клетки-предшественницы проходят ряд промежуточных этапов, когда в их фенотипе сочетаются признаки дифференцированных клеток разных типов: экспрессия цитокератинов - ЦК 7, 8, 18, 19, а также ЭМА и маркеров нейроэндокринной дифференцировки - синаптофизина, хромогранин А, нейрон-специфической энолазы, СЭ56 и стадию коэкспрессии нескольких гормонов [85-88,225]. Низкий уровень дифференцировки клеток анапластических опухолей и, вероятно, полипотентных предшественников этих опухолей характеризуется коэкспрессией цитокератинов и виментина. Следовательно, для фенотипа полипотентных протоковых клеток характерна экспрессия ЦК7, а для полипотентных эндокринных клеток-предшественниц - коэкспрессия ЦК 19 и маркеров нейроэндокринной дифференцировки.

Основываясь на полученных данных, можно сделать вывод, что фенотип клеток аденокарцином, особенно низкодифференцированных, более всего соответствуют фенотипу гипотетических полипотентных протоковых клеток ПЖ. Коэкспрессия в клетках анапластических, недифференцированных опухолей ПЖ, а также в клетках недифференцированных компонентов аденокарцином виментина и цитокератинов (в том числе, протоковых цитокератинов ЦК 7 и 19), свидетельствует о том, что источником этих опухолей является не полипотентные протоковые клетки, а еще менее дифференцированные предшественники. Такой предшественник может теоретически возникнуть и при дедифференцировке полипотентных клеток протоков или его источником являются еще менее дифференцированные резервные клетки [358]. В норме виментин экспрессируется в мезенхимальных, а не эпителиальных клетках, но удалось показать, что существует этап островкового морфогенеза, когда пролиферирующие полипотентные протоковые клетки коэкспрессируют виментин и цитокератин 19 [85]. Виментин экспрессировали при культивировании эпителиальные клетки, изолированных из ПЖ и печени взрослых, а при регенерации печени - протоковые и овальные клетки, которые предположительно обладают полипотентными свойствами [75]. Эти данные представляют большой интерес и могут свидетельствовать о существовании маркера морфогенетической активности или "активности" полипотентных протоковых клеток ПЖ. Коэкспрессия в клетках опухолей промежуточных филламентов, типичных для клеток разных тканей - виментина и цитокератинов можно считать критерием низкой степени дифференцировки или анаплазии опухолевых клеток и очень плохого прогноза новообразования.

Еще одним важным выводом является то, что экспрессия ЦК20 характерна для фенотипа клеток только трех типов опухолей ПЖ - муцинозно-кистозных, аденокарцином и гастрином. ЦК20 является маркером дифференцированных энтероцитов кишечника и протоковых клеток печени [130,294], но не экспрессируется клетками нормальных протоков ПЖ. ЦК20 в настоящее время широко используют в качестве дифференциально-диагностического маркера, позволяющего определить гистогенез новообразований с неизвестной первичной локализацией. С помощью этого маркера дифференцируют опухоли из протоков ПЖ, печени, желудка от опухолей кишечника и яичников [130,140,294,359].

Впервые получены данные, свидетельствующие о том, что уникальность фенотипа клеток гастрином с коэкспрессией экзо - и эндокринных маркеров позволяет отнести их в отдельную группу опухолей ПЖ, которая занимает промежуточное положение между экзо - и эндокринными новообразованиями. Клетки гастрином экспрессируют ЦК8, 19 и 20, ЭМА, карциноэмбриональный антиген (КЭА) и маркеры нейроэндокринной дифференцировки -хромогранин А, синаптофизин, нейрон-специфическую энолазу и С05б. Проводилось сравнение фенотипа клеток гастрином ПЖ, желудка, 12-ти перстной кишки, печени и фенотипа различных нейроэндокринных опухолей ПЖ. Оказалось, что клетки гастрином не экспрессируют ЦК7 - наиболее стабильный маркер клеток протокового эпителия ПЖ, но экспрессируют ЦК20 - маркер дифференцированных энтероцитов кишечника, то есть по существу являются опухолями ПЖ кишечного типа.

Известно, что гастриномы чаще всего возникают именно в ПЖ, хотя в норме островковые клетки гастрин не продуцируют. Этот факт долго не находил объяснения, но теперь удалось доказать, что на определенном этапе развития гастрин экспрессируют клетки эмбриональных островков ПЖ, в которых активированы все гормон-специфические гены. Такие клетки были обнаружены в ПЖ эмбрионов и новорожденных крыс, но не встречались у животных старше 20 дней [82]. Оказалось, что функции гастрина значительно шире, чем полагали раньше, и кроме трофического действия на слизистую желудочно-кишечного тракта, этот гормон обладает активностью фактора роста и может стимулировать рост эпителия нормальной и неопластически трансформированной слизистой желудочно-кишечного тракта, в том числе опухолей прямой и толстой кишки, желудка, поджелудочной железы, печени и почек. На культурах клеток опухолей желудочно-кишечного тракта, в частности аденокарцином ПЖ и печени, показано, что гастрин и его предшественники могут стимулировать рост островковых клеток [99,103,163,354]. Сверхэкспрессия TGFa и гастрина в ПЖ трансгенных мышей вызывала метаплазию протокового эпителия и пролиферацию островковых клеток из эпителия протоков [253].

Полученные данные свидетельствуют о том, что клетки практически во всех исследованных гастрином, части МКО, ВПО и большинства АК экспрессируют ХГ. Очевидно, что в канцерогенезе этому гормону принадлежит важная, но еще не достаточно понятная роль. Известно, что a-субъединицу ХГ продуцируют клетки многих эпителиальных опухолей, в частности злокачественные опухоли ПЖ, легких, матки, мочевого пузыря [166,223]. Показано, что в сыворотке большинства пациентов с функционально активными злокачественными НЭОПЖ, в отличие от доброкачественных, уровень а- и р- субъединиц ХГ повышен. ХГр имеет некоторое структурное подобие с членами семейства факторов роста и, вероятно, обладает аналогичным действием: он может влиять на дифференцировку клеток нормальных и злокачественно трансформированных тканей, обладает активностью ингибитора апоптоза и, вероятно, контролирует действие промоторов апоптоза - р53 и ВАХ. Для опухолей, клетки которых секретируют этот гормон, вероятно, это может служить критерием плохого прогноза.

Нейроэндокринные опухоли ПЖ, которые были верифицированы как инсулиномы, глюкагономы, нефункционирующие опухоли по фенотипу клеток отличались от гастрином и были ЦК 19, ЭМА, КЭА-негативными и хромогранин А - и синаптофизин-позитивными. Что касается эпителиального мембранного антигена (ЭМА), то его роль в эмбриогенезе ПЖ изучена не достаточно. Известно, и это подтверждают и наши данные, что этот маркер в норме интенсивно экспрессируют дифференцированные ацинарные клетки ПЖ, а в эпителии протоков реакция слабая или вообще отсутствует. При неопластической трансформации эпителия ПЖ интенсивность экспрессии цитокератинов обычно существенно не меняться, но наблюдается сверхэкспрессия ЭМА, что свидетельствует о возможности реактивации соответствующего гена [218,334]. Сверхэкспрессия ЭМА в гастриномах является еще одним аргументом в пользу экзокринного происхождения гастрином. Гипотеза о протоковом происхождении гастрином jg», находит все больше подтверждений [256]. Bouwens L. [86] придерживается точки зрения, что основным механизмом регенерации ПЖ во взрослом организме является дедифференцировка или трансдифференцировка ацинарных и протоковых клеток. Этот механизм был изучен in vitro и in vivo на различных культурах тканей млекопитающих. На модели экспериментального панкреатита у животных, вызванного перевязкой протоков или хроническим воспалением, ацинарно-протоковая трансдифференцировка или ацинарно-клеточная метаплазия возникала в результате формирования протоковых комплексов. Клетки в таких комплексах состояли из смешанных дедифференцированных ацинарных и протоковых клеток, которые невозможно W было отличить ни на морфологическом, ни на иммуногистохимическом уровнях. Клетки приобретали промежуточный протоково-эндокринный фенотип с коэкспрессией ЦК20 (свойственного клеткам протокового эпителия крыс) и инсулина, инсулина и амилазы, проинсулина и проамилазной РНК, как это наблюдается в клетках ПЖ эмбрионов и новорожденных крысят [355]. Возможно, что при различных патологиях в ПЖ взрослых организмов, в том числе при неопластической трансформации, за счет трансдифференцировки ацинарных клеток может происходить увеличение популяции клеток с протоковым фенотипом [79,81,86,128,163]. При этом не исключено, что часть аденокарцином ПЖ могут происходить непосредственно от таких дедифференцированных ацинарных клеток. Известно, что в экспериментальных моделях такую "редифференцировку" ацинарных клеток в клетки с ■ф* протоковым фенотипом стимулируют некоторые факторы роста - TGFa, EGF, IGF-1 (инсулинподобный фактор роста 1 типа) [354].

Гастриномы могут возникать не только в ПЖ [4,5,29,39], но и в желудке, кишечнике и печени [10,12,15,20,22,26,36,37,41,47,127,228,229,232]. Одну из гастрином в наших наблюдениях мы расценили как первичную гастриному печени. Гипотеза о том, что печень и ПЖ имеют общую по происхождению и фенотипу стволовую клетку в последнее время находит все больше подтверждений. Эксперименты по пересадке эпителиальных клеток из ПЖ в печень доказали, что они трансформируются в гепатоциты и приобретают характерный для этих клеток фенотип. Это подтверждается и существованием первичных гастрином печени и билиарных протоков [75,117,216,228,229].

Результаты, полученные при исследовании фенотипа клеток различных опухолей ПЖ, позволили нам впервые схематически представить алгоритм, в соответствии с которым изучение фенотипа клеток опухолей с использованием достаточно широкого спектра маркеров позволяет определить уровень дифференцировки клеток по отношению к уровню дифференцировки гипотетических полипотентных клеток (рис. 17).

В разделе 4 показано, что пролиферативная активность клеток различных опухолей ПЖ зависит от интенсивности экспрессии в них протеинов, регулирующих апоптоз - ВАХ и BclX и она тем выше, чем более интенсивна экспрессия ингибитора апоптоза - BclX. В аденокарциномах ПЖ, особенно низкокодифференцированных, клетки защищены от апоптоза, поэтому нарушен баланс между пролиферацией и апоптозом и меняется, по сравнению с нормой, локализация в клетках иммунореактивности к этим регуляторным протеинам. В большинстве участков высокодиффренцированных аденокарцином, муцинозно-кистозных, внутрипротоковых и солидно-псевдопапиллярных опухолях ПЖ, напротив, наблюдалась сверхэкспрессия индуктора апоптоза ВАХ при нормальной локализации иммунореактивности к ^ этому регуляторному протеину. Во всех злокачественных опухолях, в том числе и НЭОПЖ, интенсивность экспрессии ВАХ несколько уменьшалась, а интенсивность экспрессии BclX увеличивалась.

В опухолях ПЖ функции генов, регулирующих апоптоз и клеточный цикл, изучены мало. Полагают, что исключительно злокачественный характер роста аденокарцином ПЖ и их резистентность к любой противораковой терапии связана с особенностью фенотипа клеток этих опухолей. Имеются данные, что пациенты с опухолями, в клетках которых наблюдалась сверхэкспрессия ВАХ, жили дольше, а сверхэкспрессию этого протеина некоторые исследователи считают критерием более благоприятного прогноза раков ПЖ, в то время как сверхэкспрессию BclX - критерием плохого прогноза [183,224,335]. Это является еще одним важным аргументом в пользу того, что все клетки протокового эпителия можно рассматривать в качестве "дремлющих" или потенциально "стволовых" клеток. Они способны проявлять активность полипотентных клеток и поэтому экспрессируют ингибиторы апоптоза (bcl-2, BclX), защищены от апоптоза и способны к быстрому росту и делению [84,317,335].

Пролиферативная активность клеток НЭОПЖ, по сравнению с клетками АК, достаточно низкая. Это согласуется с данными различных авторов о том, что увеличение индекса пролиферации Ki67 и PCNA в НЭОПЖ коррелирует с метастатическим потенциалом клеток этих опухолей [190,266]. Высокий индекс пролиферации Ki67 и PCNA был только в эндокринных карциномах (20% и 28%), что объясняется низкой степенью дифференцировки клеток таких опухолей и коэкспрессией в них экзо-и эндокринных маркеров (как было показано в разделе 3). Это позволило нам расположить эти опухоли в соответствии со степенью дифференцировки и фенотипом образующих их клеток достаточно близко к полипотентным протоковым клеткам, но ниже, чем аденокарциномы (рис. 17).

В опухолях ПЖ с менее инвазивным, чем АК, потенциалом - СППО, МКО, ВПО и большинстве НЭОПЖ, пролиферативная активность клеток существенно ниже [190,247,253,321], а увеличение пролиферативной активности в большинстве случаев позволяет прогнозировать их метастатический потенциал [53,54,152,252]. Пролиферативная активность 4£> клеток всех исследованных опухолей ПЖ была тем выше, чем более интенсивно они экспрессировали BclX.

Во многих исследованиях in vitro и in vivo показано, что клетки злокачественных эпителиальных опухолей ПЖ в результате многочисленных мутаций могут сверхэкспрессировать различные онкопротеины, протеины генов-супрессоров, факторы роста и рецепторы к ним, которые могут регулировать пролиферацию и апоптоз, обеспечивая опухолевым клеткам повышенную жизнеспособность и способность к размножению [284]. Такие мутации ведут к сверхэкспрессии в клетках мутантной формы регуляторного протеина ^ р53, онкопротеинов K-ras и HER/neu. В клетках 40% протоковых карцином ПЖ наблюдается сверхэкспрессия рецепторов к эпидермальному фактору роста c-erbB2 (HER/neu). Увеличение индекса KÍ67, сверхэкспрессия р53 и с-егЬВ2 можно использовать при дифференцировке злокачественных и доброкачественных изменений протоков ПЖ [119,186]. Важную роль в канцерогенезе протоковых опухолей отводят протеину р53. Считают, что экспрессия р53 в клетках наиболее злокачественных опухолей является причиной их резистентности к любой противораковой терапии и связана с ухудшением прогноза. По всей вероятности, в раках ПЖ имеет место активация анитиапоптозных факторов, что определяет жизнеспособность клеток опухолей и их резистентность к воздействиям. Для того чтобы обеспечить способность первичной опухоли к инвазии и метастазированию достаточно очень небольшой популяции ^ опухолевых клеток с более злокачественным, чем у остальных клеток опухоли, фенотипом.

Доминирование и усиленный рост такой популяции клеток может быть обеспечен локальным ответом на активацию-инактивацию различных факторов роста, цитокинов и различных сигналов, полученных от микроокружения, которые модулируют такие их свойства, как жизнеспособность, подвижность и адгезивность.

В разделе 5 нами получены результаты, которые свидетельствует о том, что нормальная мембранная экспрессия CD44 наблюдается в клетках муцинозно-кистозных новообразований ПЖ. В клетках высокодифференцированных аденокарцином экспрессия CD44 отсутствует, а в клетках опухолевых комплексов, локализованных в участках мезенхимально-эпителиальных контактов низкодифференцированных и части умереннодифференцированных аденокарцином, наблюдается аномальная, крупно-гранулярная сверхэкспрессия С044. Один из важных выводов, который получен нами, является то, что такая аномальная сверхэкспрессия С044, может служить критерием агрессивного злокачественного фенотипа клеток аденокарцином, и что она связана с активным разрушением ЕСМ. Экспрессия СБ44 меняется в зависимости от типа, гистогенеза и локализации опухоли [299]. Считают, что экспрессия клетками С044, является эпифеноменом, который связан с дифференцировкой, межклеточной адгезией и коммуникациями клеток, а роль различных изоформ этой молекулы больше зависит от природы опухолевых клеток, их микроокружения и происхождения, чем от других факторов.

В экспериментах доказано, что снижение интенсивности или аномальная экспрессия молекул Е-кадхерина ведет к трансформации высокодифференцированных аденом в инвазивные карциномы ПЖ [268,269], коррелирует с увеличением инвазивного и метастатического потенциала аденокарцином ПЖ и снижением сроков выживания пациентов [74]. Для некоторых типов злокачественных опухолей показано, что сверхэкспрессия С044 коррелирует с повышенным потенциалом метастазирования и неблагоприятным прогнозом [168,168,299,145,203].

Роль адгезивных молекул N. Е-кадхерина и С044 в прогнозе новообразований ПЖ изучена еще не достаточно. Показано, что клетки внутрипротоковых опухолей ПЖ редко экспрессируют СБ44, а клетки аденокарцином, которые экспрессируют эти молекулы на базальной мембране, обладают повышенной пролиферативной активностью, подвижны и способны к миграции и формированию печеночных метастазов [145,309].

Полученные в разделе 5 результаты, свидетельствуют о том, что аномальные типы экспрессии молекул Е-кадхерина, как отсутствие их экспрессии, а также сверхэкспрессия молекул С044Н являются важными критериями плохого прогноза и характеризуют наиболее злокачественные опухоли ПЖ - аденокарциномы и анапластические опухоли. Роль, которую играют различные типы адгезивных молекул в неопластической трансформации клеток и в инвазивном потенциале новообразований, в настоящее время активно изучается. В то же время дисперсионный анализ показал, что между степенью дифференцировки клеток АК и аномальной экспрессией молекул клеточной адгезии имеется связь, хотя необходимы дальнейшие исследования на более обширном материале. Полагают, что использование антител к С044 может стать перспективным методом иммунотерапии для предотвращения метастазирования.

Данные, полученные в разделе 6, свидетельствуют о том, что важным прогностическим маркером инвазивного потенциала новообразований ПЖ протокового происхождения, особенно АК, является экспрессия в клетках матриксной металлопротеиназы ММР-2, которая обеспечивает им возможность к миграции. Экспрессия ММР-2 в НЭОПЖ и гастриномах может быть использована в качестве прогностического критерия, характеризующего злокачественный, ("метастатический") фенотип клеток, что обычно характерно для коэкспрессии маркеров нейроэндокринной и протоковой дифференцировки. Слабая экспрессия одной ММР-9 характерна для мало инвазивного фенотипа клеток СППО, МКО и большинства НЭОПЖ, а коэкспрессия ММР-2 и ММР-9 в НДАК является, вероятно, очень неблагоприятным прогностическим признаком. Это согласуется с данными, полученными в ряде подобных исследований, которые свидетельствуют о том, что сверхэкспрессия ММР-2 и способность к протеолитической деградации компонентов ЕСМ является одним из основных свойств инвазивного фенотипа наиболее агрессивных раков ПЖ [137]. Имеются данные, что сверхэкспрессия в клетках опухолей ММР-2 и 9 коррелирует с уменьшением содержания коллагенов в строме и базальных мембранах опухолей [274,164].

В разделе 7 мы впервые показали, что трансдифференцировка ацинарных клеток в протоковые имеет место во внеопухолевой ткани ПЖ, граничащей с аденокарциномой (рис. 41 А, Б). Нам удалось показать трансформацию ацинарного фенотипа клеток в протоковый, которая сопровождалась уменьшением интенсивности экспрессии ЭМА и увеличением интенсивности экспрессии протоковых цитокератинов - ЦК7 и 19. Возможность же прямой ацинарно-эндокринной трансформации, хотя и обсуждалась, но до сих пор не было убедительных данных, способных подтвердить существование такого механизма. Данные, полученные нами в разделе 7, позволили доказать возможность прямой ацинарно-эндокринной трансформации (рис. 43 А-Г)> поэтому нам представляется вполне вероятным, что некоторые злокачественные или пограничные нейроэндокринные опухоли могут возникать в процессе непосредственной ацинарно - эндокринной трансформации.

Существуют доказательства того, что протоковые клетки ПЖ могут происходить от островковых полипотентных предшественников или при трансдифференцировке зрелых островковых клеток [81-88,353,355]. Удалось также доказать, что инвазивные аденокарциномы ПЖ, клетки, которых имеют протоковый фенотип, могут происходить от полипотентных клеток, локализованных в островках Лангерганса [277]. Наличие выраженной пластичности ацинарных клеток ПЖ также предполагает наличие у них свойств полипотентных стволовых клеток. Полагают, что, по крайней мере, часть аденокарцином возникают не из клеток протоков, а путем трансдифференцировки (дедифференцировки, ретродифференцировки) ацинарных клеток в протоковые или непосредственно из ацинарных клеток [218]. Существование экзо-эндокринного взаимодействия убедительно продемонстрировано при некоторых патологиях ПЖ, особенно при раке ПЖ. На модели индуцированных опухолей ПЖ у хомячков, которые в морфологическом, молекулярно-биологическом и клиническом аспектах мало отличались от опухолей человека, показано, что уже на ранних этапах канцерогенеза экзокринных опухолей появляются популяции эндокринных клеток, которые сначала локализуются в базальных отделах гиперплазированных и неопластически трансформированных протокоподобных структур [276,277]. Показано также, что клетки некоторых аденокарцином ПЖ человека имеют нейроэндокринно-подобную дифференцировку [275,337], что согласуется и с полученными нами данными. Накапливается все больше данных, которые свидетельствуют о том, что протоковые клетки могут происходить от островковых стволовых предшественников или при трансдифференцировке зрелых островковых клеток [11,23,25,26]. Все это доказывает, что гены, кодирующие экзо - и эндокринную функции тесно взаимосвязаны.

В экспериментальных опухолях ПЖ наблюдали формирование в островках большого числа периинсулярных и интраинсулярных (около - и внутриоостровковых) протоков (дуктул), что, как полагают, является одним из наиболее ранних изменений, связанных с трансформацией островково-клеточного фенотипа. Постепенно эти интраинсулярные дуктулы формировались в большинстве островков, в результате чего островки становились похожими на микрокистозные структуры, скорее напоминающие серозные цистоаденомы, или трансформировались в структуры, полностью замещающие островки и напоминающие атипичный эпителий злокачественных аденокарцином. При гистологическом исследовании ПЖ по поводу различных других патологий подобные карциномы in situ обычно являются случайными находками [217,277]. Эти данные подтверждают имеющиеся данные, что формирование кистозных структур из солидных островков является 2-х стадийным процессом: первым шагом такой островково-протоковой трансформации является апоптоз эндокринных клеток, в результате которого уменьшается их количество при одновременной пролиферации протоково-подобных клеток на периферии островков, а вторым - трансдифференцировка этих клеток под воздействием промоторов ЕСМ [353]. Как показано в разделе 7, нам удалось наблюдать все стадии подобного процесса, включая формирование из островка карциномы in situ. Таким образом, убыль клеток в центре островков свидетельствует о том, что факторы ЕСМ в первую очередь воздействуют именно на те клетки островков, которые расположены по периферии и являются резервными, полипотентными клетками. Под воздействием различных факторов (выделяемых, например, клетками растущей опухоли) эти клетки способны трансформироваться в клетки с протоковым фенотипом, а в ряде случаев и подвергаться злокачественной трансформации [71,275,277]. Получены веские доказательства существования на периферии островков таких клеток промежуточного типа. Так, в клетках, локализованных на границе ацинарной ткани и эндокринных островков, наблюдается экспрессия промежуточного филламента нестина, который хорошо известен как маркер стволовых клеток центральной нервной системы [182]. В этих же участках мы в большинстве случаев наблюдали скопления ЦК-19-позитивных, но гормон-негативных клеток, не формировавших протоко-подобных структур. Такие клетки промежуточного типа на периферии эндокринных островков были описаны Ю.К. Елецким и В.В. Ягловым [17,50,51]. Важное доказательство, свидетельствующее в пользу этого вывода, получено при изучении фенотипа не только клеток первичной злокачественной нейроэндокринной опухоли, но и клеток 9 метастазов этой опухоли в печень. Первичная опухоль представляла собой глюкагон-продуцирующую опухоль, глюкагоному, а клетки трех метастазов этой опухоли продуцировали инсулин и глюкагон, двух - глюкагон, еще двух — инсулин, глюкагон и гастрин, одного - глюкагон и панкреатический полипептид, а клетки 9-го метастаза вообще не синтезировали ни одного из перечисленных гормонов. Это наблюдение свидетельствует о том, что клетки первичной опухоли обладали свойством полипотентности и в соответствующем микроокружении (в данном случае в печени) были способны формировать клоны клеток с различным фенотипом.

Пролиферация экзокринной и эндокринной ткани ПЖ, в результате которой происходит активация неогенеза полипотентных клеток, на любом из этапов может дать сбой и стать пусковым механизмом для возникновения нейроэндокринных, протоковых и смешанных экзо-эндокринных новообразований ПЖ [62;191,215,217,277,362]. Доказательством существования такого механизма является и наличие смешанных экзо-эндокринных карцином (которые раньше назывались протоково-островковыми карциномами), клетки которых имеют промежуточный экзо-эндокринный фенотип [199,211,276]. Данные, полученные нами в разделе 3, при изучении фенотипа НЭОПЖ свидетельствуют о том, что клетки некоторых нейроэндокринных опухолей коэкспрессируют несколько гормонов, в том числе инсулина, а в части опухолей встречались ассоциированные эндокринно-протоковые комплексы. Наши данные мало отличаются от данных Deshapande V. et al. [120]: 15,4% и 16,3% ассоциированных протоково-эндокринных комплексов соответственно. По мнению вышеприведенных авторов, протоковые клетки в таких комплексах возникают путем трансформации (трансдифференцировки) эндокринных клеток. Такие ассоциированные с эндокринно-клеточным компонентом протоко-подобные структуры при ИГХ исследовании выявляются по экспрессии в их клетках маркеров протоковых клеток - ЦК 19 и 7 и не свидетельствуют о злокачественном потенциале НЭОПЖ, в то время как коэкспрессия в клетках маркеров экзо - и эндокринной дифференцировки - является критерием более низкой степени их дифференцировки.

Следовательно, нейроэндокринные опухоли ПЖ представляют собой целый спектр опухолей с различным биологическим потенциалом клеток, в том числе и с наследственными или спорадическими мутациями [63,96,261,282], а группа "доброкачественных" макроаденом и пограничных опухолей включает и потенциально злокачественные новообразования. Исследование фенотипа клеток НЭОПЖ и учет всех других критериев (размеры опухоли, митотический индекс клеток, сосудистая инвазия, наличие некрозов, метастазов и ядерного полиморфизма) позволяют максимально точно определить прогноз таких новообразований.

Таким образом, полученные нами данные впервые позволили выделить следующие ИГХ критерии злокачественности НЭОПЖ: 1) наличие коэкспрессии в клетках маркеров нейроэндокринной и экзокринной дифференцировки; 2) наличие коэкспрессии нескольких гормонов в клетках; 3) секреция клетками гастрина и других, не свойственных островковым клеткам гормонов. Наличие в опухоли только одних ассоциированных эндокринно-протоковых комплексов позволяет отнести их в группу пограничных или опухолей с неопределенным потенциалом злокачественности, а при сочетании с перечисленными выше - к опухолям низкой степени злокачественности.

Многочисленные генные мутации и суммарные молекулярные изменения, в результате которых происходит злокачественная трансформация низкодифференцированных полипотентных клеток или более дифференцированных клеточных типов в менее дифференцированные являются причиной агрессивного потенциала аденокарцином и анапластических опухолей ПЖ и их резистентности к любым лечебным воздействиям. Результаты, полученные в работе, помогают лучше понять механизмы, которые лежат в основе не только канцерогенеза ПЖ, но и тех, которые лежат в основе гиперплазии и регенерации тканей органа, а в ближайшем будущем, возможно, позволит и управлять ими.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Гуревич, Лариса Евсеевна, Москва

1. Аруин Л.И., Зверков И.В., Виноградов В.А. Эндокринные клетки поджелудочной железыЖлин. мед. -1987. №7. -с.22-30.

2. Банина В.Б., Кафадаров Р.Н., Хмельницкий Г.А. К морфологии инсулином. //Вопросы эндокринологии. Труды МОНИКИ. М. -1974. - Т. 111. - С.193-195.

3. Белохвостов A.C., Румянцев А.Г. Онкомаркеры. Молекулярно-генетические, иммунохимические, биохимические анализы. Москва, Макс Пресс, 2003. - 91 с.

4. Булгаков Г.А., Савина Т.В. Гормон-продуцирующие карциноиды печени. //Сб: Очаговые поражения печени и поражения печеночных протоков. 1994. - С. 21-22.

5. Булгаков Г.А. Синдром Золлингера-Эллиссона. Обзор литературы. //Хирургия. 1997. -№6.-С. 72-89.

6. Буриев И.М., Цвиркун В.В., Лебедева А.Н. и соавт. "Карциноидные опухоли" поджелудочной железы (новый взгляд на проблему). //Анналы хир. гепатологии. 1997. -Т. 2. - С. 73-80.

7. Гистологическая классификация опухолей эндокринной системы.//ВОЗ. Женева. -1983.

8. Гитель Е.Т., Фадеев В.В. Диагностика и лечение гастроэнтеропанкреатических эндокринных опухолей. //Пробл. эндокринологии. -1996. №6. -С. 34-40.

9. Головин Д.И., Никонов A.A. АПУД-клетки и апудомы.//Арх. пат. -1981. -№10. -с.3-11.

10. Головин Д.И., Хмельницкий O.K. Инкреторные гранулоцитомы (апудомы). (Вопросы гистологии, гистогенеза, морфологической диагностики). Л., Медицина. -1983, 125с.

11. Гуревич Л.Е., Исаков В.А. Использование в иммуногистохимических исследованиях метода восстановления антигенной специфичности воздействием микроволн на ткани, фиксированные формалином и заключенные в парафин //Арх. патол. -1999. № 2. - С. 4850.

12. Данилов М.В., Федоров В.Д. Хирургия поджелудочной железы. М., Медицина. 1995. -510с.

13. Дерижанова И.С. О гистологической классификации карциноидных опухолей различной локализации. //Арх. патол. -1979.- №3. С. 18-24.

14. Дерижанова И.С., Резникова Г.Д. Клинико-анатомическая характеристика карциноидных опухолей панкератодуоденальной зоны. //Хирургия. -1981.- №4. С. 56-59.

15. Дерижанова И.С. Опухоли диффузной эндокринной системы карциноиды. - Ростов-на-Дону, 1991.-285 с.

16. Зверков И.В., Виноградов В.А., Смагин В.Г. Иммуноморфологические методы идентификации клеток APUD-системы органов пищеварения. //Арх. патол. -1986.- №7. -С. 85-87.

17. Елецкий Ю.К., Яглов В.В. Эволюция структурной организации эндокринной части поджелудочной железы позвоночных. М. Наука, 1978. С. 101-120.

18. Иммуногистохимическая диагностика опухолей человека. Под ред. Райхлина Н.Т., C.B. Петрова. Казань, 1999.

19. Иммуногистохимическая диагностика опухолей человека. Под ред. C.B. Петрова, А.П. Киясова. Казань, 1998.

20. Калашников С.А., Клочков Н.Д. К дифференциальной диагностике ульцерогенных опухолей, инсулином и карциноидов.//Арх. пат. -1977. -№5. -с.42-68.

21. Калинин А.П., Радбиль О.С., Нурманбетов Д.П. Гормонально-активные опухоли поджелудочной железы.//Пробл. эндокр. -1986. -т.32. -№2. -с.40-46.

22. Калинин A.B. Новое в онкогенезе, диагностике и лечении нейроэндокринных опухолей желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы. //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1998. - №6. - С. 13-17.

23. Кветной И.М., Райхлин Н.Т. Клиническая патология APUD-системы (апудопатии). //Арх. патол. 1987. -№11.- С. 15-22.

24. Климов П.К., Фокина A.A. Физиология поджелудочной железы. Л., Наука. -1987. -с.151-156.

25. Крутовских В.А. Роль нарушений меклеточных щелевых контактов в генезе рака и других патологических состояний. //Арх. патол. 2000. - №1. - с. 3-7.

26. Кузин Н.М., Егоров A.B. Нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы. Руководство для врачей. М, Медицина. -2001. - 207с.

27. Николаев О.В., Вейнберг Э.Г. Инсулома. М., Медицина. -1968.

28. Пальцев М.А., Демура С.А., Коган Е.А. и соавт. Мелкоклеточный рак и карциноиды легких: морфология апоптоза и экспрессия биомолеклярных маркеров опухолевого роста. //Арх. патол. 2000. - №5. - С. 11-17.

29. Паталого-анатомическая диагностика опухолей человека. Т. 2. Под ред. H.A. Краевского, A.B. Смолянникова, Д.С. Саркисова. М„ Медицина. -1993. -с.114-136.

30. Пожарисский K.M., Леенман Е.Е. Значение иммуногистохимических методик для определения характера лечения и прогноза опухолевых заболеваний. //Арх. патол. 2000. - №5. - С. 3-11.

31. Радбиль О.С., Калинин А.П., Нурманбетов Д.П. Гормонально-активные опухоли поджелудочной железы и множественные эндокринные аденоматозы //Серия "Онкология". Москва, 1986. - №3.

32. Раевский А.Ю., Калашников С.А., Архипов В.Ф. Морфологическая диагностика инсулиномы.//Арх. патол. -1995. -№5. -с.42-46.

33. Райхлин Н.Т. Электронная микроскопия в диагностике опухолей человека.//Вопр. онкол. -1983.-№10. -с.80-101.

34. Райхлин Н.Т., Кветной И.М., Соломатина Т.М. Патология APUD-системы органов пищеварения. //Арх. патол.- 1983. №7. - С. 58-64.

35. Райхлин Н.Т., Махник Г., Катенкамп Д. APUD-система (диффузная эндокринная система): новые данные и направления исследований. //Успехи совр. биол. 1989. - Т. 107. - Вып. 2. -С. 209-212.

36. Райхлин Н.Т., Кветной Н.М., Осадчук М.А. APUD-система (общепатологические и онкологические аспекты). Обнинск, 1993. -127с.(1) и 108с.(Н).

37. Руководство по клинической эндокринологии. Под ред. Старковой Н.Т. С-Петербург, 1996.-539 с.

38. Симоненко В.Б. Нейроэндокринные опухоли. Москва, 2000. -289 с.

39. Соколова И.Н., Первощиков А.Г., Чистякова О.В., Овчинников Л.С. Папиллярные эпителиальные опухоли поджелудочной железы. //Арх. патол. 1995. - №5. -с.53-57.

40. Струков А.И. Эндокринные опухоли поджелудочной железы.//Арх. патол. -1980. -№9. -с.85-86.

41. Уголев А.М. Энтериновая (кишечная гормональная) система. //Трофологические очерки. -Л., Наука, 1978.

42. Ультраструктура опухолей человека. Под ред. Райхлина Н.Т., Давида Г., Лапиша К. М., Медицина, 1981.-550с.

43. Хасигов П.З., Подобед О.В., Грачева Т.С. и соавт. Роль металлопротеиназ матрикса и их ингибиторов в процессах опухолевой инвазии и метастазировании. //Биохимия. 2003. -Т.68. -Вып.7. -С.869-876.

44. Хасигов П.З., Подобед О.В., Кцоева С.А. и соавт. Металлопротеиназы матрикса нормальных тканей человека. //Биохимия. 2001. -Т. 66. -Вып.2. -С.167-179.46