Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Связь рецепторного статуса клеток инфильтративной карциномы молочной железы с уровнем пролиферативной активности

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Связь рецепторного статуса клеток инфильтративной карциномы молочной железы с уровнем пролиферативной активности"

Бриллиант Александр Александрович

СВЯЗЬ РЕЦЕПТОРНОГО СТАТУСА КЛЕТОК ИНФИЛЬТРАТИВНОЙ КАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С УРОВНЕМ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ

03.03.04 — Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оренбург 2013

21 НОЯ Ш

005539294

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Государственном бюджетном учреждении здравоохранения Свердловской области «Центр оказания специализированных видов медицинской помощи населению «Институт медицинских клеточных технологий»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Сазонов Сергей Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор заведующая кафедрой анатомии человека ГБОУ ВПО «Самарский государственный

медицинский университет» МЗ РФ Суворова Галина Николаевна

доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии ГБОУ ВПО «Кировская государственная

медицинская академия» МЗ РФ Зайцев Валерий Борисович

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук

Защита состоится «_»_2013 г. в_часов на заседании диссертационного

совета Д. 208.066.04 при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6, в конференц-зале (аудитория №205), телефон: (3532) 40-35-62, факс (3532) 77-24-59, e-mail: orgma_ds2@esoo.ru, официальный сайт: www.orgma.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России.

Автореферат разослан/?//^» // _2013 г., автореферат и текст объявления размещены на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Шевлюк Николай Николаевич

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Рак молочной железы считается одной из наиболее распространенных опухолей, являющейся ведущей причиной смерти от рака среди женщин в экономически развитых странах (Семиглазов В.Ф. и соавт., 2003; Faria G. etal, 2012). В структуре онкологической заболеваемости отмечается тенденция к увеличению доли рака молочной железы. В России данное заболевание занимает I место среди онкологических заболеваний женского населения с выявлением около 45 тысяч новых случаев в год (Семиглазов В.Ф. и соавт., 2003; Gruver A.M. etal, 2011).

Инвазивный рак молочной железы представляет собой злокачественную опухоль, часть которой или вся прорастает базальную мембрану эпителиальной выстилки протока или дольки. Прогноз рака молочной железы зависит от двух групп параметров. Первые из них время зависимые показатели, определяющие стадию рака: размер опухоли, наличие регионарных или отдаленных метастазов. Вторая группа определяет «внутренние» биологические особенности опухоли: гистологический тип, степень злокачественности, экспрессию рецепторов гормонов, факторов роста (HER-2) и другие молекулярные характеристики опухоли (Бондарева В.А., Шпонька И.С., 2007; Семиглазов В.Ф, Семиглазов В.В., 2010; Невожай В.И., Мюллер Е.С., 2007).

Процессы клеточного деления, дифференцировки и апоптоза происходят как в нормальных, так и в опухолевых клетках. Последние отличаются от нормальных тем, что происходящие в них процессы являются неконтролируемыми.Опухолевые клетки содержат набор молекул, необходимых для выживания, пролиферации, дифференцировки, апоптоза и экспрессии специфических функций. Неспособность регулировать эти процессы приводит к изменению фенотипа клеток и развитию опухоли, при этом изменяется структура рецеп-торного аппарата клеток (Andreeff M., Goodrich D.S., 2003).

Именно рецепторный аппарат клеток играет важную биологическую роль в происхождении опухолей. В большинстве опухолевых клеток экспрессируются рецепторы родительских клеточных линий, отвечающих за их физиологические функции (Riggs B.L., Hartmann L.S., 2003). Например, рецепторы эстрогена играют важную роль в функционировании молочных желез. Через соответствующие рецепторы, эстроген стимулирует рост органа, регуляцию физиологиче-

ских функций клеток. В то же время, многие рецепторы принимают участие в процессах канцерогенеза и роста опухоли. Известно, что экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона в клетках влияет на развитие карциномы молочной железы (Clemons M., Goss P., 2001).

Во многих карциномах уровень экспрессии рецепторов сопоставим с таковым в нормальных (интактных) тканях. По всей вероятности, регуляция опухолевого роста в таких случаях происходит при участии других факторов, влияющих на клеточный рост и пролиферацию (Dickson R.B., Stancel G.M., 2000). Известно, что для некоторых опухолевых клеток характерным свойством является наличие гиперэкспрессии рецепторов HER-2/neu, приводящей к стимуляции аберрантного сигнального пути, ответственного за пролиферацию клеток и развитие карциномы молочной железы (Baselga J., Cortes J., 2005).

В настоящее время используется ряд клеточных маркеров для определения тактики ведения случаев карцином молочной железы с наличием или отсутствием экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона (Семиглазов В.Ф., 2003; Троценко И.Д. и соавт., 2012; Радюко-ва И.М. и соавт., 2012). Одним из таких маркеров является ядерный белок KI-67, отражающий клеточную пролиферацию. Было показано, что микроинъекции антител, направленных против мышиного KI-67 приводят к снижению скорости деления клеток (Blau Н.М., Banfi А., 2001). Аналогичные результаты были получены введением человеческих антител белка KI-67. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что KI-67 играет существенную роль в клеточной пролиферации (Scholzen T. etal, 1997).

Известно, что экспрессия KI-67 меняется в пределах всего клеточного цикла. Уровень белка считается низким в течении Gl и ранней S фазе, и возрастает до максимума к митозу. В анафазе и телофазе экспрессия KI-67 значительно снижается. Это доказывает тот факт, что белок является точным маркером роста клеточной фракции (Ра-дюкова И.М. и соавт., 2012).

Считается, что степень пролиферации ткани карциномы молочной железы наряду с определением стероидных рецепторов имеет как прогностическое, так и предсказывающее значение. Несмотря на это, на сегодняшний день существует проблема стандартизации методик и методов оценки, необходимых для интеграции биомаркера KI-67, характеризующего степень пролиферации опухолевых клеток, в длительное прогнозирование исхода заболевания и эффективности химиотерапии (Lopez F., 1991).

Считается, что рецепторный аппарат опухолевых клеток состоит из нескольких частей: лиганда (небольшие молекулы, синтезируемые в тканях организма или пептиды, выделяемые эндокриноцита-ми) (Moran С.А., Suster S., 2007), и самих рецепторов, находящихся на мембране клеток (рецепторы HER-2/neu) либо в клеточном ядре (Estrogen receptor, Progesterone receptor, KI-67). На сегодняшний день, механизмы взаимодействия лиганда и рецепторов мало изучены, также остаются не выясненными закономерности инициализации и воздействия на клетку сигнальных путей, образующихся в результате активации лигандами соответствующих клеточных рецепторов. Еще больше вопросов возникает при изучении связи рецеп-торного статуса опухоли с уровнем ее пролиферативной активности.

Цель исследования:

Изучить особенности рецепторного статуса клеток инфильтратив-ной карциномы молочной железы с разным уровнем пролиферативной активности.

Задачи исследования:

1. Изучить рецепторный аппарат клеток инфильтративной карциномы молочной железы.

2. Дать характеристику состояния пролиферативных процессов в ткани инфильтративной карциномы молочной железы.

3. Изучить рецепторный статус клеток опухоли с разным уровнем пролиферативной активности.

4. Оценить степень васкуляризации ткани карциномы молочной железы.

5. Исследовать ангиогенные процессы в группах пролиферативной активности инфильтративной карциномы.

Научная новизна исследования

Впервые определены закономерности трансформации рецепторного профиля инфильтративных карцином молочной железы при изменении уровня их пролиферативной активности в группах с разным уровнем пролиферации, с наличием или отсутствием экспрессии рецепторов стероидных гормонов и HER-2/neu.

На основании полученных данных выявлено, что в группе карцином с наличием экспрессии Estrogen receptor и отсутствием экспрессии Progesterone receptor и HER-2/neu, при увеличении уровня экс-

прессии Estrogen receptor достоверно растет количество опухолей с высокой пролиферативной активностью. Показано, что в группе карцином с экспрессией гормональных рецепторов и отсутствием экспрессии HER-2/neu большинство случаев относятся к группе с низкой степенью пролиферации.

При исследовании ангиогенных процессов в опухоли установлено, что с увеличением пролиферативных процессов в опухоли уменьшается количество зрелых форм капилляров в ее сосудистой сети.

Научно-практическая значимость работы

Полученные данные существенно дополняют имеющиеся сведения, характеризующие пролиферативные процессы в инфильтратив-ной карциноме молочной железы. Результаты не исследованных ранее особенностей рецепторного аппарата клеток опухоли в группах пролиферативной активности, а также исследование рецепторов клеток эндотелия капилляров инфильтративной карциномы могут быть использованы для углубления понимания процессов, происходящих при развитии опухоли.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Состояние пролиферативных процессов в ткани инфильтративной карциномы молочной железы связано с особенностями рецепторного аппарата клеток опухоли.

2. При увеличении экспрессии Estrogen receptor, в клетках опухоли, экспрессирующих HER-2/neu обнаружен высокий уровень пролиферативной активности клеток, реализуемого посредством сигнального пути RAS-Raf-MAPK.

3. При отсутствии экспрессии рецепторов Estrogen receptor, Progesterone receptor и HER-2/пеина клетках карцином молочной железы, большинство из них относятся к группе с высокой степенью пролиферации.

4. В ткани инфильтративной карциномы молочной железы количество созревающих капилляров в 5 раз больше, чем в интакт-ной ткани молочной железы, при этом их доля не меняется с ростом

пролиферативных процессов в опухоли. Доля зрелых капилляров снижается при увеличении пролиферативной активности опухоли.

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертационной работы используются при научных исследованиях в лаборатории патоморфологии ГБУЗСО Институт медицинских клеточных технологий, г. Екатеринбург, в учебном процессе кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии, а также кафедры онкологии и медицинской радиологии ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, в работе патоморфологической и цитологической лабораторий ГБУЗСО «Свердловский областной онкологический диспансер».Получена приоритетная справка на получение патента «Схема связи рецепторного статуса клеток инфиль-тративной карциномы молочной железы и состояния пролиферативных процессов» №2013503298/49 от 28 августа 2013 года.

Апробация работы

Работа апробирована на заседаниях кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Екатеринбург, 2008, 2009, 2013); X Конгрессе Международной Ассоциации морфологов (Ярославль, 2010); V Ежегодной конференции патоморфологов по диагностике рака молочной железы (Каир, Египет, 2010), Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (Москва, 2011), XI Конгрессе Международной Ассоциации морфологов (Самара, 2012), Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Морфология человека в норме и при патологии» (Уфа, 2012), VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2013).

Публикации

По материалам диссертации опубликована 41 научная работа, в том числе 15 публикаций в журналах, рекомендованных ВАК Миноб-

рнауки РФ для публикации результатов докторских и кандидатских диссертаций.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав с описанием материала и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, списка литературы и списка иллюстративного материала. Работа содержит 13 таблиц и 36 рисунков. Список литературы содержит 212 источников, включая 45 отечественных и 167 зарубежных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

В качестве объекта исследования в работе использовался материал 406 случаев инфильтративной карциномы молочной железы. Для исследования пролиферативной активности опухолевых клеток с помощью иммуногистохимического метода был определен индекс пролиферативной активности KI-67 исследуемых карцином. Все случаи также были исследованы на наличие экспрессии рецепторов стероидных гормонов (Estrogen receptor, Progesterone receptor), HER-2/neu при помощи иммуногистохимического метода.

Уровень васкуляризации ткани опухоли определялся морфоме-трическим и иммуногистохимическим методами. Для этого использовался материал 20 случаев инфильтративной карциномы молочной железы. На эндотелии выделяемых капилляров определялась экспрессия CD31, CD34, фактора роста эндотелия сосудов VEGF, а также рецепторов к фактору роста эндотелия сосудов VEGFR. В качестве контрольной была принята группа, состоящая из 20 случаев интактной ткани молочной железы.

Количественная характеристика использованного материала представлена в таблице 1.

Таблица 1

Количественная характеристика исследуемых групп случаев карциномы молочной железы

№ группы Группы исследования Число исследуемых случаев

1. Контрольная группа - интактная молочная железа. 20

2. Инфильтративная карцинома молочной железы

Ю-67, Estrogen receptor, Progesterone receptor, HER-2/neu 406

CD 31,CD34, VEGF, VEGFR 20

Материал для исследования поставлялся из НПЦ «Онкология» Министерства здравоохранения Свердловской области, г. Екатеринбург (заведующая патолого-анатомическим отделением Казанцева Н.В.) и Городского Маммологического центра на базе ГКБ№40, г. Екатеринбург (заведующий проф. Демидов С.М.).

Методы исследования

Материал отобранных случаев исследовался гистологическим, им-муногистохимическим, морфометрическими и статистическим методами.

Гистологический метод Предварительно приготовлены парафиновые блоки (Калантарли С.С., Мацко Д.Е., 2012). Для этого материал прошел фиксацию в 10% растворе нейтрального формалина в течение 1-2 суток, осуществлена его проводка по спиртам, после чего материал был залит в парафиновые блоки. Изготовление серийных срезов толщиной 4 мкм осуществляли на ротационном микротоме Microm НМ340 (MICROM Laborgerate Gmbh) с системой переноса срезов. После депарафиниза-ции производили гистологическую окраску с помощью гематоксилина Майера и эозина.

Иммуногистохимический метод Для проведения иммуногистохимических исследований использовались стекла, покрытые полилизином — POLYSINE SLIDES (Thermo Scientific, Германия). Для определения ядерного индекса пролиферации опухоли использовались антитела Mouse Anti-Human KI-67 Antigen (DAKO, Дания). Определение экспрессии HER-2/neu на клет-

ках опухоли осуществлялось с помощью поликлональных антител Polyclonal Rabbit Anti-Human c-erb-2 Oncoprotein (DAKO, Дания), рецепторов эстрогена и прогестерона на ядрах клеток опухоли — с помощью моноклональных мышиных антител Monoclonal Mouse Anti -Human Estrogen Receptor, Monoclonal Mouse Anti-Human Progesterone Receptor (DAKO, Дания)(Шайкина A.C. и соавт., 2011).

Для выявления рецепторов эндотелия капилляров использовали антитела Monoclonal Mouse Anti - Human CD31, CD34 (DAKO, Дания). Сосудистый эндотелиальный фактор роста определяли с помощью антител Monoclonal Mouse Anti - Human Vascular Endothelial Growth Factor (DAKO, Дания), рецепторы к фактору роста эндотелия сосудов определяли с помощью моноклональных мышиных антител NCL-L-VEGFR-3 (Novocastra, Англия). Предварительная демаскировка антигенов с использованием Target Retrieval Solution проходила в барокамере «Paskai DAKO Cytomation» (Дания) при давлении 22Р и температуре 127°С.

Все иммуногистохимические реакции осуществлялись в автостей-нере "DAKO" (Дания) с использованием буфера Dako Wash Buffer, системы визуализации Dako En Vision + DualLink System - HRP, хромогена Dako Liquid DAB+ Substrate Chromogen System фирмы (DAKO, Дания).

Уровень пролиферативной активности оценивали по ядерному индексу пролиферации клеток опухоли — KI-67. По процентному отношению числа окрашенных ядер клеток карциномы к неокрашенным судили о пролиферативной активности исследуемой опухоли. В каждом случае оценивали не менее 600 опухолевых клеток (Jalava, Kuopio, 2006). Все случаи в соответствии со степенью пролиферации были распределены по трем группам. Первую группу составили случаи рака молочной железы с низким уровнем пролиферации, индекс ядерной пролиферации менее 10%, во вторую группу вошли случаи со средней пролиферативной активностью опухоли (индекс KI-67 от 10% до 30% включительно), в третью — случаи с высокой пролиферативной активностью опухоли (индекс KI-67 более 30%). Уровень экспрессии Estrogen receptor и Progesterone receptor определяли по шкале от 0 до 8 (Allred D.C. etal, 1998). Оценка уровней мембранной экспрессии HER-2/neu в опухолевых клетках производилась по шкале от 0 до 3+ (Bilous М. etal, 2003).

Оценку реакции осуществляли на роботизированном микроскопе "Zeiss Imager М" (Германия).

Морфометрический метод С помощью морфометрической программы Axio Vision (Германия) проводили измерения диаметра, количества и площади капилляров, а также количества изучаемых клеток. Площадь поля зрения микроскопа при увеличении 40х равна 400,0 мкм2.

Статистический метод Для статистической обработки полученных данных, а также построения соответствующих графиков и таблиц использовали программные продукты «Statistica 6 for Windows», «MS Excel 2007». Достоверность различий сравниваемых показателей определяли по t-критерию Стьюдента, используемого для нормального распределения данных. Различия средних величин считали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Особенности пролиферативных процессов при развитии карциномы молочной железы В нашей работе мы изучали уровень пролиферативной активности карциномы молочной железы по экспрессии маркера пролиферации клеток — KI-67. При обработке данных 406 пациентов в соответствии с экспрессией белка KI-67 на клетках карциномы были сформированы 3 группы. Первую группу составили 248 случаев (61%), менее 10% клеток которых (включительно) экспрес-сировали KI-67, вторую группу — 82 случая (20%), в которых KI-67 экспрессировали более чем 10%, но менее 30% клеток включительно. В третью группу вошло 76 случаев (19%), в которых рецепторы KI-67 определялись на более чем на 30% клеток. Распределение случаев карцином молочной железы в соответствии с процентом опухолевых клеток, экспрессирующих KI-67 представлено на рисунке 1.

И 1 группа пациентов со степенью

пролиферации менее 10% включительно ■ 2 группа пациентов со степенью

пролиферации10-30% включительно □ 3 группа пациентов со степенью

пролиферации более 30%

Рисунок 1. Распределение пациентов с карциномой молочной железы в соответствии с процентом клеток, экспрессирующих KI-67

Таким образом, большинство карцином молочной железы имели низкий уровень пролиферации, то есть до 10% клеток экспрессиро-вали рецепторы белка KI-67.

Изменение пролиферативнъис процессов в зависимости от рецепторного аппарата клеток карциномы В своей работе мы проанализировали изменение пролифератив-ных процессов в зависимости от рецепторного аппарата клеток ин-фильтративной карциномы молочной железы. Обнаружено, что с увеличением пролиферативной активности клеток карциномы достоверно снижается экспрессия рецепторов стероидных гормонов (Estrogen receptor, Progesterone receptor) и повышается экспрессия HER-2/neu (табл. 2).

Данные литературы, касающиеся таких закономерностей, крайне разнятся. Это связано с тем фактом, что группировка случаев по иммуногистохимическому признаку (пролиферации в группах с наличием экспрессии Estrogenreceptor, Progesterone receptor, HER-2/ neu) выявляет скрытые в общей массе случаев биологические особенности данной группы опухолей.

Таблица 2

Рецепторный статус карциномы в группах экспрессии KI-67

Группа экспрессии К1- 67 Среднее значение рецепторного статуса

1 группа — случаи с низкой степенью пролиферации (менее 10%) Estrogen receptor 2,5±0,17 p(l-2)>0,05

Progesterone receptor 2,2±0,17 p(l-2)>0,05

HER-2 /neu 1,9±0,82 p(l-2)>0,05

2 группа — случаи со средней степенью пролиферации (более 10%, но менее 30% включительно) Estrogen receptor 2,3±0,22 p(2-3)<0,05

Progesterone receptor 2,0±0,20 p(2-3)<0,05

HER-2 /neu 2,0+0,9 p(2-3)<0,05

3 группа — случаи с высокой степенью пролиферации (более 30%) Estrogen receptor 1,5±0,25 p(3-l)<0,05

Progesterone receptor 1,3±0,24 p(3-l)<0,05

HER-2 /neu 2,8±1,5 p(3-l)<0,05

При использовании в работе принципа разделения случаев по иммуно-гистохимическому типу в зависимости от степени пролиферации в опухоли, были выявлены другие закономерности экспрессии Estrogen receptor, Progesterone receptor, рецепторов HER-2/neu.

Среди карцином, экспрессирующих HER-2/neu, было выявлено, что большинство из них (77%) принадлежало к группам со средней и высокой проли-феративной активностью (рис. 2,3).

Данный феномен может быть объяснен механизмом взаимодействия пролиферативных процессов и экспрессии HER-2/neu на клетках опухоли через сигнальный путь RAS-Raf-Mekk-Erk (Menard S. etal, 2000). Этот механизм реализуется благодаря димеризации HER-2, уровень экспрессии которого напрямую связан с пролиферацией в опухоли.

Значительная часть карцином молочной железы гормональноза-висимы (Бондарева В.А., Шпонька И.С., 2007). При этом данные о возможном дифференцированном влиянии эстрогена и прогестерона на рецепторный аппарат клеток рака молочной железы крайне неполны (Жабина А.С., Проценко С.А., 2011).

23%

НИ |§ff щ

54%

¡p-h-i

S 1 группа - случаи с низкой степенью пролиферации (менее 10%)

В 2 группа - случаи со средней степенью пролиферации (более

10%, но менее 30% включительно) И 3 группа - случаи с высокой степенью пролиферации (более 30%)

Рисунок 2. Распределение случаев с экспрессией HER-2/neu по группам пролиферативной активности

В ходе исследования рецепторного статуса всех случаев выявлено достоверное снижение экспрессии Estrogen receptor от первой к третьей группе пролиферативной активности, т.е. при увеличении проли-феративных процессов в опухоли, определяется уменьшение Estrogen receptor в цитоплазме клеток.

Дифференцированный анализ случаев (с наличием экспрессии Estrogen receptor) по группам пролиферации опухоли показал, что при увеличении уровня пролиферативных процессов растет и уровень экспрессии Estrogen receptor (рис. 4, табл. 3).

Рисунок 3. Карцинома молочной железы с экспрессией З+НЕЯ-2/ пеи(А), Х400 ивысокимуровнем экспрессии К1-67 (Б), Х100.

Окраска: ИГХ реакция НЕР/ВАВ, докраска ядер — гематоксилин Майера

Рисунок 4. Карцинома молочной железы с высоким уровнем экспрес-сиии Estrogen receptor TS-7 баллов (А) и высоким уровнем К1-67(Б), Х100.

Окраска: ИГХ реакция HRP/DAB, докраска ядер — гематоксилин Майера

Таблица 3

Рецепторный статус карциномы в группах экспрессии KI-67 с экспрессией Estrogen receptor

Группа экспрессии К1-67 Среднее значение рецепторного статуса

1 группа — случаи с низкой степенью пролиферации (менее 10%) Estrogen receptor 45% 3,5±0,21 p(l-2) <0,05

Progesterone receptor 0,01 ±0,01 p(l-2)>0,05

HER-2/neu 0,3 ±0,05 p(l-2)>0,05

2 группа — случаи со средней степенью пролиферации (более 10%, но менее 30% включительно) Estrogen receptor 40% 4,5±0,25 p(2-3)>0,05

Progesterone receptor 0,01±0,01 p(2-3)>0,05

HER-2/neu 0,28 + 0,06 p(2-3)>0,05

3 группа — случаи с высокой степенью пролиферации (более 30%) Estrogen receptor 15% 4,8±0,44 p(3-l) <0,05

Progesterone receptor 0,0±0,0 p(3-l) >0,05

HER-2/neu 0,6±0,04 p(3-l)>0,05

Для объяснения этого феномена рассмотрим сигнальные пути с участием Estrogen receptor (рис. 5). Основным регулятором проли-феративных процессов с участием Estrogen receptor также считается сигнальный путь RAS-Raf-Mekk-Erk, который активируется присоединением комплекса Estrogen+Estrogen receptor к связывающему белку Src и образованию комплекса SHC-Src-GRB2-SOS с белком RAS (Mohibi S., Mirza S., 2011; Guttilla I.K., Adams B.D., 2012). Из рисунка видно, что димеризация и активация Estrogen receptor может увеличивать пролиферативную активность опухолевых клеток.

Феномен обратной зависимости пролиферативной активности и экспрессии Estrogen receptor при исследовании всех случаев можно объяснить, используя дифференцированный подход к анализу групп карцином молочной железы. Если учесть, что большинство карцином (61%) имеют минимальную экспрессию Estrogen receptor, следовательно, их клетки не имеют соответствующих рецепторов и пролиферация в таких случаях может увеличиваться только за счет механизмов, реализуемых при участии HER-2 или других неустановленных механизмов.

Учитывая наличие обратной корреляционной связи между HER-2/neu и Estrogen receptor (r=-0,13, р<0,05), нами показано, что при увеличении экспрессии HER-2/neu закономерно снижается экспрессия Estrogen receptor.

Подобный феномен был выявлен и при исследовании Progesterone receptor. При анализе всех случаев без деления на подгруппы, были получены данные о том, что с увеличением пролиферативных процессов уменьшается уровень экспрессии Progesterone receptor (табл. 1).

Механизм реализации действия Progesterone схож с действием сигнальных путей с участием димеров HER-2 (рис. 5). Гормон прикрепляется к SH3 домену цитоплазматической тирозинкиназы и встраивается в каскад сигналов RAS-MAPK, который ведет к увеличению пролиферации опухолевой клетки. По всей вероятности, гормон может попадать в ядро через ядерные поры, индуцируя при этом синтез себе подобных молекул. Однако, зависимость этого процесса от пролиферации в клетке остается недоказанной.

Таким образом, в ходе исследования мы выявили некоторые особенности пролиферации в карциноме молочной железы. В результате нами была создана общая схема, отражающая механизмы воздействия на клеточную пролиферацию рецепторов HER-2/neu, Estrogen receptor и Progesterone receptor (рис. 5). Как видно из схемы, каждый из трех исследуемых рецепторов способен принимать

О О ООО

Низкий уровень

Высокий уровень

Факторы роста

Рецепторы Плазмолемма

Цитоплазма

Ядерная оболочка Ядро

Пролиферация

Рисунок 5. Связь рецепторного статуса клеток инфилътративной карциномы молочной железы с разным уровнем пролиферативной активности

участие в изменении уровня пролиферации опухолевых клеток через сигнальный путь RAS-Raf-MAPK.

При высоком уровне экспрессии HER-2/neu на клетках опухоли, выявлена высокая пролиферация независимо от экспрессии стероидных рецепторов. При высокой экспрессии Estrogen receptor и отсутствии рецепторов к HER-2, пролиферация также увеличивается за счет включения Estrogen receptor в сигнальный путь RAS-Raf-MAPK. Количество димеризованных стероидных рецепторов в ядре опухолевой клетки напрямую коррелирует с количеством Estrogen receptor, Progesterone receptor, участвующих в активации пролиферации.

Кроме иммуногистохимических подтипов опухолей описанных ранее, нами исследованы случаи с менее распространённым вариантом рецепторного аппарата. При исследовании опухолей с отсутствием экспрессии Estrogen receptor, Progesterone receptor и рецепторов HER-2/neu выяснилось, что большинство случаев (44%) относятся к группе с высокой степенью пролиферации. Механизм стимуляции пролиферативной активности в таких опухолях остается не ясным.

При анализе случаев с наличием экспрессии Estrogen receptor, Progesterone receptor, HER-2/neu не обнаружено статистически значимых закономерностей связи уровня экспрессии рецепторов с изменением пролиферативной активности. Данная группа составляет всего 1,5% от общего числа исследованных случаев.

Неоангиогенез при развитии карциномы молочной железы

Особое значение в прогнозировании исхода рака молочной железы придается ангиогенезу (Leek R.D., 2001). Активация сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и его рецепторов (VEGFR) могут стимулировать экспрессию факторов, важных для ангиогенеза, в том числе антиапоптических белков, молекул клеточной адгезии, VEGFR-1 и матриксных металлопро-теиназ (ММР). Многочисленные исследования свидетельствует о том, что VEGFR-2 является наиболее важным из рецепторов VEGF благодаря его участию в ангиогенезе через пострецептор-ные сигнальные пути, которые способствуют делению клеток эндотелия, усилению проницаемости и их выживанию (Weidner, Semple, 2005). Митогенный, ангиогенный и улучшающий проницаемость эффекты VEGF, в основном, опосредованы рецепторами VEGF-2 (VEGFR-2), которые подвергаются димеризации и фос-

форилированию после связывания лиганда. Также пролиферацию клеток эндотелия может стимулировать и рецептор VEGFR-3 (Blau H.M., Banfi A., 2001; Bergers G., Benjamin L.E., 2003).

Мы исследовали сосудистую сеть опухоли путем выявления в ней эндотелия капилляров (табл. 4). Было обнаружено, что в группе опухолей со средней степенью пролиферации площадь капилляров, экспрессирующих рецепторы к VEGFR в 1,4 раза (р<0,05) больше площади капилляров, экспрессирующих VEGF.

Количество капилляров, выявленных с помощью иммуноги-стохимического исследования с экспрессией CD31 в исследуемом срезе карциномы молочной железы более чем в два раза (р<0,05) превышает контрольный показатель интактной ткани (рис. 6).

Рисунок 6. Карцинома молочной железы. А-интактная тканъ молочной железы. Б-экспрессия СО-31 на эндотелии капилляров в ткани инфилътративной карциномы молочной железы. Х100

Окраска: ИГХ реакция НЯР/ОАВ, докраска ядер — гематоксилин Майера

Рисунок 7. Карцинома молочной железы: А-экспрессия СВ34 на эндотелии капилляров в ткани инфилътративной карциномы молочной железы, Б-высокая пролиферативная активность клеток опухоли. Х100

Окраска: ИГХ реакция НКР/ВАВ, докраска ядер — гематоксилин Майера

При проведении корреляционного анализа обнаружена сильная отрицательная корреляционная связь между площадью капилляров, экспрессирующих рецепторы СЭ31 и группами экспрессии белка К1-67 в опухоли (г=-0,93).

При исследовании экспрессии С034 в ткани инфильтративной карциномы молочной железы обнаружено, что площадь капилляров, экспрессирующих этот рецептор более чем в пять раз (р<0,05), а диаметр капилляров в два раза (р<0,05), превышают аналогичные показатели в интактной ткани (табл. 4).

Таблица 4

Связь васкуляризации тканей инфилътративной карциномы молочной железы с уровнем пролиферативной активности

Группа экспрессии К1-67 Среднее значение площади васкуляризации, мкм2

Интактная молочная железа СО 31 798 ±203 р (С031-С034) <0,05

СО 34 61±5 р(С031-С034)<0,05

УЕСР, УЕвРЯ Не обнаружено

1 группа — случаи с низкой степенью пролиферации (мене 10%) СО 31 1638±604 р(1-2)<0,05

СО 34 328,2 ±134,7 р(1-2)>0,05

УЕвР Не обнаружено

УБвРЛ Не обнаружено

2 группа — случаи со средней степенью пролиферации (более 10% но менее 30% включительно) СО 31 627Д±88,1 р(2-3)<0,05

СО 34 395,4±82,1 р(2-3)>0,05

УЕСР 387,7±46,73

УБвРЯ 542,3±3,24

3 группа — случаи с высокой степенью пролиферации (более 30%) СО 31 267,2 ±23 р(1-3)<0,05

СО 34 264,2±25,4 р(1-3)>0,05

УЕвР Не обнаружено

УЕСР11 Не обнаружено

Анализ данных по группам пролиферации показал, что с увеличением пролиферативных процессов в опухоли уменьшается площадь зрелых форм капилляров. Если в первой группе пролиферативной активности доля незрелых капилляров составляет лишь пятую часть, то во второй группе половина капилляров являются созревающими, а в третьей практически все капилляры находятся в состоянии ангиогенеза (рис. 7).

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что при быстром росте опухоли образуется большее число капилляров, не успевающих приобрести иммуногистохимические характеристики зрелых.

выводы

1. Состояние пролиферативных процессов в ткани инфильтра-тивной карциномы молочной железы связано с особенностями ре-цепторного аппарата клеток опухоли.

2. При увеличении экспрессии Estrogen receptor в клетках опухоли и отсутствии коэкспрессии HER-2/neu и Progesterone receptor обнаружена стимуляция пролиферативной активности клеток посредством сигнального пути RAS-Raf-MAPK.

3. При наличии на клетках опухоли Progesterone receptor и отсутствии экспрессии Estrogen receptor и HER-2/neu не выявлено различий связи количества рецепторов с уровнем пролиферативной активности.

4. При экспрессии в клетках Estrogen receptor и Progesterone receptor и при отсутствии HER-2/neu встречается в 4 раза больше опухолей с низкой пролиферативной активностью. При этом не обнаружено связи уровня экспрессии стероидных рецепторов и изменения пролиферативной активности.

5. При отсутствии экспрессии Estrogen receptor, Progesterone receptor и рецепторов HER-2/neu большинство карцином молочной железы относятся к группе с высокой степенью пролиферации.

6. При увеличении экспрессии HER-2/neu в инфильтративной карциноме молочной железы увеличивается пролиферативная активность опухоли. Димеризованный рецептор HER-2/neu увеличивает пролиферацию клеток опухоли через сигнальный путь RAS-Raf-MAPK.

7. В ткани инфильтративной карциномы молочной железы количество созревающих капилляров в 5 раз больше, чем в интактной молочной железе, при этом их доля не меняется с ростом пролиферативных процессов в опухоли. Доля зрелых капилляров снижается при увеличении пролиферативной активности опухоли.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Бриллиант А.А. КоэкспрессияЮ-67 и HER2/neu в клетках карциномы молочной железы// Материалы 63 межвузовской научно-практической конференции молодых учёных и студентов. - 2008. - С. 190-191.

2) Бриллиант А.А., Сазонов С.В., Демидов С.М. Особенности экспрессии Estrogen receptor и Progesterone receptor на клетках HER2/пей положительной карциномы молочной железы// Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2008. - №4. - С. 57-60.

3) Бриллиант А.А., Сазонов С.В., Демидов С.М. Особенности экспрессии рецепторов на клетках карциномы молочной железы при определении показаний к иммунотерапии герцептином// Аллергология и иммунология. - 2009. - №1. - С. 115.

4) Бриллиант А.А., Глуханкж Е.В. Неоангиогенез при карциноме молочной железы // Материалы 64 межвузовской научно-практической конференции молодых учёных и студентов. - 2009. - С. 248-249.

5) Рычагова К.В., Бриллиант А.А. Особенности распределения различных уровней экспрессии КЗ-67 в ядрах клеток карцином молочной железы среди пациентов // Материалы 64 межвузовской научно-практической конференции молодых учёных и студентов. - 2009. - С. 270-271.

6) Бриллиант А.А. Особенности экспрессии Estrogen, Progesterone Receptor и Ю-67 на клетках карциномы молочной железы// Материалы 64 межвузовской научно-практической конференции молодых учёных и студентов. - 2009. - С. 244-245.

7) Бриллиант А.А. Возможности иммуногистохимического метода в изучении рецепторного статуса клеток карциномы молочной железы// Тезисы Международной научной школы для молодежи (инновационные технологии в реальном секторе экономики). - 2009. - С. 29-30.

8) Бриллиант А.А., Сазонов С.В., Демидов С.М., Дорофеев А.В. Некоторые закономерности экспрессии Estrogen, Progesterone Receptor и Ю-67 на опухолевых клетках карциномы молочной железы// Уральский медицинский журнал. - 2010. - №12 (77). - С.68-71.

9) Сазонов С.В., Бриллиант А.А., Демидов С.М., Дорофеев АВ. Результаты работы референс-лаборатории по HER-2/neu тестированию карциномы молочной железы в УрФО за 2009// Уральский медицинский журнал. - 2010. - №12 (77). - С. 133-138.

10) Бриллиант А.А., Сазонов С.В. Состояние пролиферативных процессов в клетках внутрипротоковой карциномы молочной железы// Сборник научных трудов 8 всероссийской конференции по патологии клетки. - Москва. - 2010. - С. 43.

11) Бриллиант А.А. Гистотопография пролиферативного процесса во внутрипротоковой карциноме молочной железы// Морфология. -2010. - Т. 137. - №4. - С. 41.

12) Бриллиант А.А. Гистотопография экспрессии KI-67 во внутрипротоковой карциноме молочной железы// Материалы 65 межвузовской научно-практической конференции молодых учёных и студентов. - 2010. -С. 462-463.

13) Бриллиант А.А., Сазонов С.В. Особенности экспрессии Estrogen и Progesterone receptor на клетках HER-2/neu карциномы молочной железы// Международный журнал по иммунореабилитации. - 2011.

14) Валиева И.Р., Балуева М.В. Бриллиант А.А. Состояние пролифератив-ных процессов в карциноме молочной железы в зависимости от амплификации гена HER2/neu// Материалы 66 межвузовской научно-практической конференции молодых учёных и студентов. - 2011. - С. 462-463.

15) Бриллиант А.А., Сазонов С.В. Иммуногистохимическое исследование пролиферативных процессов на клетках HER2/neu карциномы молочной железы// Аллергология и иммунология. - 2011. - Т. 12. - №1. - С. 108.

16) Сазонов С.В., Леонтьев СЛ., Бриллиант А.А. Результаты работы референс-лаборатории по HER-2/neu тестированию карциномы молочной железы в УрФО в 2011 г.// Вестник уральской медицинской академической науки. - 2011. - №4 (37). - С. 7.

17) Бриллиант А.А. Связь ангиогенеза и пролиферации при развитии карциномы молочной железы// Сборник научных трудов Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина». - Москва. - 2011.

18) Бриллиант А.А., Сазонов С.В. Особенностиваскуляризации молочной железы// Морфология. - 2012. - №3. - С. 28.

19) Бриллиант А.А., Сазонов С.В. Процесс ангиогенеза и пролифератив-ная активность инфильтративной карциномы молочной железы// Ангиология и сосудистая хирургия. - 2012. - Т. 18. - С. 34.

20) Бриллиант А.А. Состояние рецепторного аппарата опухолевых клеток в зависимости от пролиферативной активности в ткани карциномы молочной железы// Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения: Материалы 67 межвузовской научно-практической конференции молодых учёных и студентов. - 2012. - С. 252-253.

21) Бриллиант А.А., Конышев К.В. Изучение экспрессии рецепторов к эстрогену и прогестерону клетками карциномы молочной железы в регионарных метастазах//Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения: Материалы 67 межвузовской научно-практической конференции молодых учёных и студентов. - 2012. - С. 262-263.

22) Бриллиант А.А., Сазонов С.В., Леонтьев СЛ. Иммуногистохими-ческие закономерности экспрессии Estrogen, Progesteron receptor и KI-67 на опухолевых клетках карциномы молочной железы // Аллерголо-

гия и иммунология. - 2012. - Т. 13. - №1. - С. 85.

23) Сазонов C.B., Леонтьев С.Л., Бриллиант A.A. Опыт работы референс-лаборатории по HER2/neu тестированию карциномы молочной железы в Свердловской области// Материалы региональной научно-практической конференции ИМКТ. - 2012. - С. 55-56.

24) Бриллиант A.A., Сазонов C.B., Леонтьев С.Л. Трансформация рецеп-торного статуса в группах пролиферативной активности карциномы молочной железы// Материалы региональной научно-практической конференции ИМКТ, - 2012. - С. 66-73.

25) Конышев К.В., Сазонов C.B., Бриллиант A.A. Изменение экспрессии рецепторов клетками карциномы молочной железы при метастазировании в регионарные метастазы // The journal Malignant tumours. - 2012. - T. 2. -№2. - С. 132.

26) Бриллиант A.A., Сазонов C.B. Связь рецепторного статуса клеток ин-фильтративной карциномы с уровнем пролиферативных процессов// The journal Malignant tumours. - 2012. - T. 2. - №2. - С. 134.

27) Бриллиант A.A., Сазонов C.B. Исследование зависимости пролиферации от уровня экспрессии HER2 neu в клетках карциномы молочной железы с использованием иммуногистохимического метода// Вестник молодых ученых Республики Башкортостан. - 2012. - №4. - С. 72-77.

28) Конышев К.В., Сазонов C.B., Бриллиант A.A. Экспрессия рецепторов к половым гормонам клетками карциномы молочной железы в регионарных метастазах// Вестник молодых ученых Республики Башкортостан. -2012. - №4. - С. 77-80.

29) Бриллиант A.A., Сазонов C.B., Засадкевич Ю.М. Особенности пролиферации карцином молочной железы положительных по экспрессии HER-2/NEU и с амплификацией гена// Материалы 7 Московского международного конгресса Биотехнология состояние и перспективы развития. - 2013.

- С. 51-52.

30) Засадкевич Ю.М., Бриллиант A.A., Сазонов C.B. Молекулы клеточной адгезии как биомаркеры прогноза рака молочной железы// Материалы 7 Московского международного конгресса Биотехнология состояние и перспективы развития. - 2013. - С. 78-79.

31) Бриллиант A.A. Амплификация гена HER-2 и уровень пролиферативной активности в карциноме молочной железы// Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения: Материалы 68 межвузовской научно-практической конференции молодых учёных и студентов.

- 2013. - С. 279-280.

32) Бриллиант A.A., Засадкевич Ю.М. Изучение экспрессии Е-кадерина при различных иммуногистохимических вариантах рака молочной железы// Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения: Материалы 68 межвузовской научно-практической конференции

молодых учёных и студентов. - 2013. - С. 282-283.

33) СпильникТ.В., Бриллиант А.А. Сравнительная оценка пролифератив-ной активности «Basallike», «Luminalb» и «Luminala» типов карцином молочной железы// Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения: Материалы 68 межвузовской научно-практической конференции молодых учёных и студентов. - 2013. - С. 304-306.

34) Божко Я.Г., Новикова Е.А. Бриллиант А.А. Сравнение подходов к изучению экспрессии топоизомеразы II а в клетках карциномы молочной железы// Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения: Материалы 68 межвузовской научно-практической конференции молодых учёных и студентов. - 2013. - С. 277-279.

35) Опыт работы референс-лаборатории по HER2 тестированию карциномы молочной железы в Свердловской области// Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2013. - №1. - С. 56-60.

36) Сазонов С.В., Леонтьев С.Л., Бриллиант А.А. Опыт организации работы референс-лаборатории по HER2 NEU тестированию рака молочной железы в УРФО// Материалы 4 Всероссийского съезда патологоанатомов. - 2013. - С. 395-396.

37) Конышев К.В., Сазонов С.В., Бриллиант А.А. Экспрессия рецепторов к стероидным гормонам в регионарных метастазах карциномы молочной железы// Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения: Материалы 68 межвузовской научно-практической конференции молодых учёных и студентов. - 2013. - С. 249-250.

38) Бриллиант А.А., Сазонов С.В. Изменение рецепторного статуса в группах пролиферативной активности карцином молочной железы// Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2013. - №1. -С. 61-63.

39) Sazonov S.V., Brilliant АЛ., Zasadkevich Y.M. Features of vimentin and Ki-67 expression in basal-like breast cancer// 25th European Congress of Pathology. Virchows Archiv. - 2013. - V. 463. - №2. - p. 250.

40) Konyshev K.V., Sazonov S.V., Brilliant A.A. Discordance of estrogen and progesterone receptors expression between cells of primary lesions and locoregioal metastases in breast cancer// 25th European Congress of Pathology. Virchows Archiv. - 2013. - V. 463. - №2. - p. 259.

41) Brilliant A.A., Zasadkevich Y.M., Sazonov S.V. Characteristics of the relation between epithelial-mesenchymal transition and proliferative activity in breast carcinomas// European Journal of Cancer. - 2013. - V. 49/2.-p. 216.

Бриллиант Александр Александрович

Связь рецепторного статуса клеток инфильтративной карциномы молочной железы с уровнем пролиферативной активности

03.03.04 — Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 24.10.2013. Формат 60x84 1/16 Усл. печ. л. 1,0. Тираж 130 экз. Заказ № 207879/1 ООО «ПК Артикул», г.Екатеринбург, ул.Белинского, 71в, (343) 251-61-75

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бриллиант, Александр Александрович, Оренбург

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Свердловской области «Центр оказания специализированных видов медицинской помощи населению «Институт медицинских клеточных технологий»

СВЯЗЬ РЕЦЕПТОРНОГО СТАТУСА КЛЕТОК ИНФИЛЬТРАТИВНОЙ КАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С УРОВНЕМ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

04201452147

Бриллиант Александр Александрович

Научный руководитель -доктор медицинских наук, профессор С.В.Сазонов

Оренбург, 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................4

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ........................11

1.1. Состояние пролиферативных процессов в ткани опухоли при раке молочной железы.........................................................................................11

1.1.1. Ю-67 в нормальной молочной железе..........................................12

1.1.2. Ю-67 и другие биологические маркеры при раке молочной железы.... 12

1.2. Состояние рецепторного аппарата клеток эпителия молочной железы.................................................................................13

1.2.1. Изменение рецепторного аппарата клеток эпителия при развитии молочной железы...................................................................13

1.2.2. Изменение рецепторного аппарата клеток эпителия при развитии опухолей молочной железы.......................................................19

1.2.3. Гетерогенность рака молочной железы........................................23

1.3. Неоангиогенез при развитии опухолевых клеток карциномы.............28

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.....................31

2.1. Материалы исследования.........................................................31

2.2. Методы исследования.............................................................32

ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК ИНФИЛЬТРАТИВНОЙ

КАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ.............................................38

3.1. Иммуногистохимическая характеристика клеток инфильтративной карциномы молочной железы...................................................38

3.1.1. Изучение уровня экспрессии рецепторов к эстрогену......................38

3.1.2. Изучение уровня экспрессии рецепторов к прогестерону.................44

3.1.3. Изучение уровня экспрессии рецепторов к НЕК-2/пеи.....................49

3.2. Изучение степени васкуляризации ткани карциномы молочной железы.................................................................................56

3.3. Состояние пролиферативных процессов в опухоли........................63

3.3.1. Исследование рецепторного статуса клеток опухоли с разным уровнем пролиферативной активности....................................................68

3.3.2. Исследование ангиогенных процессов в группах пролиферативной активности инфильтративной карциномы молочной железы............74

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................77

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................88

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА................................112

ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования

Рак молочной железы считается одной из наиболее распространенных опухолей, являющейся ведущей причиной смерти от рака среди женщин в экономически развитых странах (Семиглазов В.Ф. и соавт., 2003; Faria G. et al, 2012). В структуре онкологической заболеваемости отмечается тенденция к увеличению доли рака молочной железы. В России данная патология занимает I место среди всех онкологических заболеваний женского населения с выявлением около 45 тысяч новых случаев в год (Семиглазов В.Ф. и соавт., 2003; Gruver A.M. et al, 2011).

Инвазивный рак молочной железы представляет собой злокачественную опухоль, часть которой или вся прорастает базальную мембрану эпителиальной выстилки протока или дольки. Прогноз рака молочной железы зависит от двух групп параметров. Первые из них время зависимые показатели, определяющие стадию рака: размер опухоли, наличие регионарных или отдаленных метастазов. Вторая группа определяет «внутренние» биологические особенности опухоли: гистологический тип, степень злокачественности, экспрессию рецепторов гормонов, факторов роста (HER-2) и другие молекулярные характеристики опухоли (Бондарева В.А., Шпонька И.С., 2007; Семиглазов В.Ф., Семиглазов В.В., 2010; Невожай В.И., Мюллер Е.С., 2007).

Процессы клеточного деления, дифференцировки и апоптоза происходят как в нормальных, так и в опухолевых клетках. Последние отличаются от нормальных тем, что происходящие в них процессы являются неконтролируемыми. Опухолевые клетки содержат набор молекул, необходимых для выживания, пролиферации, дифференцировки, апоптоза и экспрессии специфических функций. Неспособность регулировать эти процессы приводит к изменению фенотипа клеток и развитию опухоли, при

этом изменяется структура рецепторного аппарата клеток (Andreeff М., Goodrich D.W., 2003).

Именно рецепторный аппарат клеток играет важную биологическую роль в происхождении опухолей. В большинстве опухолевых клеток экспрессируются рецепторы родительских клеточных линий, отвечающих за их физиологические функции (Riggs B.L., Hartmann L.C., 2003). Например, рецепторы эстрогена играют важную роль в функционировании молочных желез. Через соответствующие рецепторы, эстроген стимулирует рост органа, регуляцию физиологических функций клеток.

Многие рецепторы принимают участие в процессах канцерогенеза и роста опухоли. Считается, что экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона в клетках влияет на развитие карциномы молочной железы (Clemons М., Goss Р., 2001).

Во многих карциномах уровень экспрессии рецепторов сопоставим с таковым в нормальных (интактных) тканях. По всей вероятности, регуляция опухолевого роста в таких случаях происходит при участии других факторов, влияющих на клеточный рост и пролиферацию (Dickson R.B., Stancel G.M., 2000). Известно, что для некоторых опухолевых клеток характерным свойством является наличие гиперэкспрессии рецепторов HER-2, приводящей к стимуляции аберрантного сигнального пути, ответственного за пролиферацию клеток и развитие карциномы молочной железы (Baselga J., Cortes J., 2005).

В настоящее время используется ряд клеточных маркеров для определения терапии случаев карцином молочной железы положительных или отрицательных по Estrogen receptor и Progesterone receptor (Семиглазов В.Ф., 2003; Троценко И.Д. и соавт., 2012; Радюкова И.М. и соавт., 2012). Одним из таких маркеров является ядерный белок KI-67, отражающий клеточную пролиферацию. Белок был тщательно изучен и легко определяется в настоящее время. KI-67 впервые был обнаружен Гердесом и

соавторами в 1991г. как ядерный негистонный белок. В 1993г. была найдена последовательность генов, кодирующих данный белок. Было показано, что микроинъекции антител, направленных против мышиного KI-67 приводят к снижению скорости деления клеток (Blau Н.М., Banfi А., 2001). Аналогичные результаты были получены введением человеческих антител белка KI-67. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что данный белок играет существенную роль в клеточной пролиферации (Scholzen T. et al, 1997).

Известно, что экспрессия KI-67 меняется в пределах всего клеточного цикла. Уровень белка считается низким в течении Gl и ранней S фазе, и возрастает до максимума к митозу. В анафазе и телофазе экспрессия KI-67 значительно снижается. Это доказывает тот факт, что белок является точным маркером роста клеточной фракции (Радюкова И.М. и соавт., 2012).

Считается, что степень пролиферации ткани карциномы молочной железы наряду с определением экспрессии стероидных рецепторов имеет как прогностическое, так и предсказывающее значение. Имеются данные, свидетельствующие о том, что высокие показатели различных маркеров опухолевой пролиферации (высокий пролиферативный индекс, III степень гистологической злокачественности, уровень экспрессии KI-67 равен 20%) ассоциируются с большей вероятностью полного регресса опухоли в ответ на химиотерапию (Ernster V.L. et al, 1996; Penault-Llorca F. et al, 2003). Во многих исследованиях высокая степень гистологической злокачественности ассоциировалась с большей частотой полных морфологических регрессов после различных режимов неоадъювантной химиотерапии (Amat S. et al, 2002; Penault-Llorca F. et al, 2003; Urruticoechea A. et al, 2005; Вторушин C.B. и соавт., 2007). Было выявлено, что случаи с высоким индексом KI-67 дают полный ответ на применение неадъювантной терапии (Lopez F., 1991).

Другие исследования показали, что существует корреляция между количеством клеток, экспрессирующих KI-67, и степенью злокачественности опухоли, а также митотическим индексом. Penault-Llorca установил, что

пациенты, опухоли которых экспрессируют KI-67 более чем в 50% клеток, имеют высокий риск развития рецидива заболевания (Penault-Llorca F. et al, 2003).

Несмотря на большое количество исследований, проведенных в области изучения KI-67, на сегодняшний день существует проблема стандартизации методик и методов оценки, необходимых для интеграции биомаркера в длительное прогнозирование исхода заболевания и эффективности химиотерапии.

Считается, что рецепторный аппарат опухолевых клеток состоит из нескольких частей: лиганда (небольшие молекулы, синтезируемые в тканях организма или пептиды, выделяемые эндокриноцитами) (Moran С.А., SusterS., 2007), и самих рецепторов, находящихся на мембране клеток (рецепторы HER-2/neu) либо в клеточном ядре (Estrogen receptor, Progesterone receptor, KI-67). На сегодняшний день механизмы взаимодействия лиганда и рецепторов мало изучены, также остаются не выясненными закономерности инициализации и воздействия на клетку сигнальных путей, образующихся в результате активации лигандами соответствующих клеточных рецепторов. Еще больше вопросов возникает при изучении связи рецепторного статуса опухоли с уровнем ее пролиферативной активности.

Цель исследования

Изучить особенности рецепторного статуса клеток инфильтративной карциномы молочной железы с разным уровнем пролиферативной активности.

Задачи исследования

1. Изучить рецепторный аппарат клеток инфильтративной карциномы молочной железы.

2. Дать характеристику состояния пролиферативных процессов в ткани инфильтративной карциномы молочной железы.

3. Изучить рецепторный статус клеток опухоли с разным уровнем пролиферативной активности.

4. Оценить степень васкуляризации ткани карциномы молочной железы.

5. Исследовать ангиогенные процессы в группах пролиферативной активности инфильтративной карциномы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Состояние пролиферативных процессов в ткани инфильтративной карциномы молочной железы связано с особенностями рецепторного аппарата клеток опухоли.

2. При увеличении экспрессии Estrogen receptor, в клетках опухоли, экспрессирующих HER-2/neu обнаружен высокий уровень пролиферативной активности клеток, реализуемого посредством сигнального пути RAS-Raf-MAPK.

3. При отсутствии экспрессии рецепторов ER, PR и HER-2/neu на клетках карциномы молочной железы выяснилось, что большинство случаев относятся к группе с высокой степенью пролиферации.

4. В ткани инфильтративной карциномы молочной железы количество созревающих капилляров в 5 раз больше, чем в интактной ткани молочной железы, при этом их доля не меняется с ростом пролиферативных процессов в опухоли. Доля зрелых капилляров снижается при увеличении пролиферативной активности опухоли.

Научная новизна исследования

Впервые проведено исследование подтипов инфильтративных карцином молочной железы по группам пролиферации с наличием и отсутствием экспрессии стероидных рецепторов и HER-2 /пей.

На основании полученных данных, выяснилось, что в группе карцином с наличием экспрессии Estrogen receptor и отсутствием экспрессии Progesterone receptor и HER-2 /пей, при увеличении уровня экспрессии Estrogen receptor достоверно растет количество опухолей с высокой пролиферативной

активностью. Было показано, что большинство карцином молочной железы с наличием экспрессии стероидных и отсутствием экспрессии НЕИ-2 /пей относятся к группе с низкой степенью пролиферации.

При исследовании ангиогенных процессов в опухоли установлено, что на капиллярах исследуемой опухоли количество рецепторов к фактору роста эндотелия сосудов (УЕОРЯ-З) больше, чем белка фактора роста эндотелия сосудов УЕвЕ. Показано, что с увеличением пролиферативных процессов в опухоли уменьшается площадь зрелых форм капилляров.

Научно - практическая значимость работы

Полученные результаты существенно дополняют имеющиеся данные по характеристике пролиферативных процессов в инфильтративной карциноме молочной железы. Обнаружены не исследованные ранее особенности рецепторного аппарата клеток опухоли в группах пролиферативной активности. Исследованы рецепторы клеток эндотелия капилляров инфильтративной карциномы. Результаты исследований могут быть использованы для углубления понимания процессов, происходящих при развитии опухоли.

Апробация работы

Работа апробирована на заседаниях кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Екатеринбург, 2008, 2009); X Конгрессе Международной Ассоциации морфологов (Ярославль, 2010); V Ежегодной конференции патоморфологов по диагностике рака молочной железы (Каир, Египет, 2010), Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (Москва,

2011), XI Конгрессе Международной Ассоциации морфологов (Самара,

2012), Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Морфология человека в норме и при патологии»

(Уфа, 2012), VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2013).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 41 научная работа, в том числе 15 публикаций в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Внедрение в практику Результаты диссертационной работы используются при научных исследованиях в лаборатории патоморфологии ГБУЗСО Институт медицинских клеточных технологий, г. Екатеринбург, в учебном процессе кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии, а также кафедры онкологии и медицинской радиологии ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, в работе патоморфологической и цитологической лабораторий ГБУЗСО «Свердловский областной онкологический диспансер». Получена приоритетная справка на патент «Схема связи рецепторного статуса клеток инфильтративной карциномы молочной железы и состояния пролиферативных процессов» №2013503298/49 от 28 августа 2013 года.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ 1.1. Состояние иролиферативных процессов в ткани опухоли при раке

молочной железы

Пролиферация клеток, утративших способность дифференцироваться в клетки того или иного органа, ведет к возникновению опухолей. Одни органы и ткани обладают очень высокой способностью к пролиферации клеток (соединительная, кроветворная, костная ткань, печень, эпидермис, эпителий слизистых оболочек), другие — более умеренной (скелетные мышцы, поджелудочная железа, слюнные железы и др.), третьи — совсем или почти лишены этой способности (центральная нервная система, миокард). В последних длительное функциональное напряжение, а также репарация повреждения после действия патогенных факторов обеспечивается пролиферацией внутриклеточных структур в сохранившихся клетках, которые при этом увеличиваются в объеме, подвергаются гипертрофии (Давыдовский И.В., 1969; Саркисов Д.С., 1987; Чеснокова Н.П. и соавт., 2008).

Пролиферация клеток играет важную роль при диагностике заболеваний молочной железы. Так, фиброзно-кистозная мастопатия в зависимости от уровня пролиферации может переходить в рак молочной железы. Проф. Слонимская Е.М. (НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, г.Томск) выделяет три уровня выраженности пролиферативных процессов в молочной железе при мастопатии (1-без пролиферации, 2-умеренная пролиферация, 3- выраженная пролиферация). По мнению ученой, при пролиферативной мастопатии в 20% случаев наблюдается опухолевая трансформация (Чеснокова Н.П. и соавт., 2012; Любченко Л.К. и соавт., 2007).

Степень злокачественности и дифференцировки рака молочной железы во многом определяется пролиферативной активностью опухолевых клеток, однако, традиционный подсчет митотической активности не отражает пролиферативный потенциал опухоли, так как собственно митоз занимает

несколько часов (что может визуализироваться при рутинном исследовании), а подготовка к нему - около 24 часов, в связи с чем изучение маркера пролиферации Ki-67, экспрессирующегося во всех клетках, вышедших из G0-фазы, представляется актуальным и позволяет определить именно "скрытый" пролиферативный потенциал данной опухоли и судить о степени злокачественности (Бондарева В.А., Шпонька И.С., 2007).

Многие исследования посвящались взаимосвязи между Ki-67 и другими известными маркерами п�