Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция экспрессии гена D-глюкуронил C5-эпимеразы в опухолевых клетках молочной и предстательной железы человека

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция экспрессии гена D-глюкуронил C5-эпимеразы в опухолевых клетках молочной и предстательной железы человека"

На правах рукописи

Мостович Людмила Андреевна

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА Б-ГЛЮКУРОНИЛ С5-ЭПИМЕРАЗЫ В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ МОЛОЧНОЙ И ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

ЧЕЛОВЕКА

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 м \Р 2012

Новосибирск - 2012

005012783

Работа выполнена в ФГБУ «НИИМББ» СО РАМН (Новосибирск, Россия)

Научный руководитель

кандидат биологических наук Григорьева Эльвира Витальевна Официальные оппоненты:

Душкин Михаил Иванович доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «НИИ терапии» СО РАМН, заведующий лабораторией Молекулярно-клеточных механизмов терапевтических заболеваний

Макарова Светлана Ивановна кандидат биологических наук, ФГБУ «НИИМББ» СО РАМН, старший научный сотрудник лаборатории Метаболизма лекарств и фармакокинетики

Ведущая организация: ФГБУН ИМКБ СО РАН (Новосибирск)

Защита диссертации состоится «/т^» ^^,^1/2012 г. в '/¿Р часов на заседании диссертационного совета Д. 001.034.01 в ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН по адресу: г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2; тел. 8 (383) 333-54-81.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН.

Автореферат разослан » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Русских Галина Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. D-глюкуронил С5-эпимераза является ключевым ферментом биосинтеза гепарансульфат протеогликанов (ГСПГ), которые представляют собой класс сложных биологических молекул, состоящих из корового белка и одной или нескольких полисахаридных цепей гликозаминогликанов (ГАГ). Благодаря структурной сложности и разнообразию ГСПГ выполняют множество различных функций в организме - во внеклеточном матриксе, помимо структурной функции, они участвуют в межклеточных взаимодействиях, во взаимодействиях клетки с внеклеточным матриксом, процессах адгезии и миграции; на поверхности клеток осуществляют сигнальные функции, выступая в качестве рецепторов и корецепторов для различных факторов роста и цитокинов. Функции протеогликанов во многом обусловлены модификациями углеводных цепей гликозаминогликанов, включающими N- и О-сульфатирование по разным положениям и эпимеризацию D-глюкуроновой кислоты (GlcA) в L-идуроновую кислоту (IdoA), которая повышает гибкость полисахаридных цепей гепарансульфат протеогликанов, обеспечивая их эффективное взаимодействие с лигандами. Изменение соотношения IdoA/GlcA наблюдается при злокачественной трансформации различных тканей и клеток (Mikami et al, 2001; Loussouarn et al, 2008). За процесс эпимеризации уроновых кислот отвечает фермент D-глюкуронил С5 эпимераза (GLCE), играющий важную роль в процессах морфогенеза и жизнедеятельности живых организмов - мыши, нокаутные по гену GLCE, погибают сразу после рождения и имеют дефекты развития почек, легких и скелета (Li etal, 2003).

Ранее в нашей лаборатории было показано, что экспрессия GLCE значительно снижена в большинстве злокачественных опухолей молочной и предстательной железы человека и в клетках мелкоклеточного рака легкого (Grigorieva et al, 2008; Прудникова, 2009). Эктопическая экспрессия GLCE подавляла пролиферативную активность опухолевых клеток молочной (Prudnikova et al, 2010) и предстательной желез человека (Прудникова, 2009), мелкоклеточного рака легкого in vitro и рост экспериментальных опухолей in vivo (Grigorieva et al, 2011). Полученные данные впервые позволили охарактеризовать GLCE в качестве нового гена супрессора опухолевого роста, однако молекулярные механизмы антипролиферативного действия эпимеразы и причины снижения уровня экспрессии этого гена в опухолевых клетках оставались неизученными.

Известно несколько молекулярных механизмов, обеспечивающих эпигенетическую инактивацию генов супрессоров опухолевого роста. Одними из самых распространенных механизмов являются гиперметилирование промоторной области гена, приводящее к снижению уровня его экспрессии в клетке, и эпигенетическая регуляция экспрессии гена на уровне хроматина, которая определяется степенью модификации

гистонов (ацетилирование, фосфорилирование, метилирование, убиквинтинирование) и, как следствие, структурой нуклеосом (Veeck et ей, 2010). Немаловажную функцию в регуляции экспрессии генов играет также активность различных факторов транскрипции. Кроме того, регуляция активности генов может осуществляться и на пост-транскрипционном уровне малыми РНК - наиболее древний и консервативный механизм, называемый РНК-интерференцией (Bartels etal, 2009).

Поскольку молекулярные механизмы регуляции экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на данный момент практически неизучены, особую актуальность имеет поиск причин инактивации D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках, а также определение возможных молекулярных механизмов ее антипролиферативного действия.

Цель работы: оценить влияние D-глюкуронил С5-эпимеразы на экспрессию генов, участвующих в процессе канцерогенеза, и определить возможные молекулярные механизмы ее регуляции в опухолевых клетках и тканях.

Задачи исследования:

1. Определить влияние D-глюкуронил С5-эпимеразы на экспрессию генов, участвующих в процессе канцерогенеза в опухолевых клетках молочной, предстательной желез и рака легкого человека.

2. Определить статус метилирования промоторной области гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолях молочной и предстательной желез человека.

3. Изучить влияние изменения структуры хроматина на экспрессию D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках.

4. Определить роль факторов транскрипции TCF4 и ß-катенина в регуляции экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках.

5. Оценить вклад микроРНК-218 в регуляцию экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках.

Научная новизна работы

В данной работе впервые было показано, что:

1. Восстановление экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в клетках рака молочной и предстательной желез и мелкоклеточного рака легкого человека приводит к изменению экспрессии генов, участвующих в молекулярных механизмах ангиогенеза и инвазии/метастазирования,

2. регуляция экспрессии эпимеразы осуществляется как на транскрипционном, так и на пост-транскрипционном уровне через сложный комплекс эпигенетических механизмов регуляции экспрессии генов

3. в отличие от других генов-супрессоров развития опухоли, метилирование не играет роли в регуляции экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых тканях молочной и предстательной желез человека

4. степень модификации гистонов НЗК9Ас и НЗК4МеЗ влияет на экспрессию D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках молочной железы человека

5. экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках молочной железы in vitro и опухолях in vivo коррелирует с уровнем экспрессии TCF4 и р-катенина

6. микроРНК-218 приводит к снижению экспрессию белка D-глюкуронил С5-эпимеразы в клеточных культурах рака молочной и предстательной желез in vitro

Практическая значимость

Данная работа носит преимущественно фундаментальный характер и представляет собой определение возможных молекулярных механизмов антипролиферативного эффекта и инактивации D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках человека. Однако результаты исследования показали и возможность практического применения полученных данных для создания нового метода дифференциальной диагностики различных опухолей и выбора оптимальной стратегии лечения пациентов. Так, в ходе работы была показана активация экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы ингибитором гистоновых деацетилаз трихостатином А, который в настоящее время активно применяется в клинической практике в качестве антиопухолевого препарата. Диагностическое определение уровня экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы будет иметь важное значение для определения группы пациентов, для которых показано лечение этим препаратом.

Наряду с возможным использованием D-глюкуронил С5-эпимеразы в качестве нового дифференциального диагностического маркера, интересные перспективы связаны со способностью эпимеразы регулировать процессы опухолевого ангиогенеза и инвазии/метастазирования, что позволит рассмотреть возможность создания на ее основе нового анти-ангиогенного и /или антиметастатического препарата для лечения злокачественных новообразований.

Положения, выносимые на защиту:

1. Эктопическая экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках рака молочной и предстательной желез и мелкоклеточного рака легкого человека приводит к изменению активности генов канцерогенеза, продукты которых участвуют в молекулярных механизмах ангиогенеза и инвазии/метастаз ирования.

2. Тканеспецифичное действие эпимеразы заключается в регуляции экспрессии различных генов-супрессоров опухолевого роста (рак молочной железы) или факторов роста и их рецепторов (клетки мелкоклеточного рака легкого)

3. В опухолевых тканях молочной и предстательной желез не обнаружено гиперметилирование промоторной области гена D-глюкуронил С5-эпимеразы

4. Степень ацетилирования и метилирования лизиновых остатков гистонов НЗ влияет на экспрессию D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках молочной железы человека зависит от.

5. Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы в культуре опухолевых клеток in vitro и опухолях молочной железы in vivo положительно коррелирует с уровнем экспрессии ТСР4/р-катенин-транскрипционного комплекса

6. МикроРНК-218 регулирует уровень белка D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках молочной и предстательной желез in vitro

Апробация работы

Результаты работы были представлены и обсуждены на V региональной конференции молодых ученых-онкологов им. академика РАМН Н.В.Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, Россия, 2010); на 1 Британской Конференции по изучению рака молочной железы человека (1st British Breast Cancer Research Conference; Ноттингем, Великобритания, 2010); на XXIII Международной зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, Россия, 2011); на 16 Всемирном Конгрессе по Современным Достижениям в Онкологии и 14 Международном Симпозиуме по Молекулярной Медицине (16m World Congress on Advances in Oncology and 14th International Symposium on Molecular Medicine; Родос, Греция, 2011); на 8 Европейской конференции по исследованию рака молочной железы (8th European Breast Cancer Conference, Вена, Австрия, 2012).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 7 печатных

работ.

Структура работы: Диссертационная работа изложена на 105 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, состоит из 6 разделов: введение, обзор литературы, материалов и методов, результатов, и обсуждения результатов, выводов, а так же списка цитируемой литературы, содержащего 2 отечественных и 131 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 1 таблицей и 37 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследования механизмов регуляции D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых тканях человека было использовано по 19 образцов опухолей и наименее измененных удаленных участков молочной железы одного и того же пациента, и 20 образцов опухолей предстательной железы, удаленных в ходе хирургического вмешательства. Образцы замораживались жидким азотом и хранились при -70 °С. Операционный материал получали в Городской Клинической Больнице N1 г. Новосибирска, забор образцов молочной железы проводили под контролем д.м.н., проф. С В.Сидорова, образцов рака предстательной железы - под контролем к.м.н. И.С.Кунина, диагноз верифицирован гистологическим исследованием. Участки ткани для анализа отбирались таким образом, чтобы доля опухолевых клеток составляла более 70% ткани. Преобладающим гистологическим типом опухолей молочной железы являлся протоковый инфильтрующий рак, опухолей предстательной железы - карцинома предстательной железы. Большинство исследованных пациентов находились на второй стадии прогрессии злокачественного процесса в случае рака молочной железы и на второй и третьей стадии прогрессии злокачественного процесса в случае рака предстательной железы. Забор материала проводился с согласия больных и протоколировался по стандартам этического комитета Российской Федерации. Эксперименты соответствовали этическим стандартам биоэтического комитета НИИ МББ СО РАМН, разработанными в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и Правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными Приказом Минздрава РФ № 266 от 19.06.2003 г. Все лица, участвующие в исследовании, дали письменное информированное согласие на участие в исследовании.

Для исследования действия D-глюкуронил С5-эпимеразы на экспрессию генов канцерогенеза in vitro были использованы клеточные культуры рака молочной железы (MCF7), клеток мелкоклеточного рака легкого (U2020), рака предстательной железы (РСЗ, Du-145 и LnCaP) человека, стабильно трансфецированные плазмидой без вставки гена (epi-рСЕР4 или рЕТЕ) либо плазмидой, содержащей ген GLCE (/epi-pCEP4 или epi-pETEj. Культуры клеток были получены в Каролинском институте

(Стокгольм, Швеция). Клетки культивировали в среде IMDM, содержащей 2мМ L-глютамин, ЮОед. пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки, в 5% С02 атмосфере при 37°С. Для анализа клетки снимали с поверхности с использованием смеси трипсин/ЭДТА по стандартному протоколу, промывали трижды в фосфатно-солевом буфере, фиксировали в RNA-later и хранили при -20°С.

Суммарную РНК выделяли с использованием RNAqueous Micro Kit (Applied Biosystems, США) либо PureLink Total RNA Purification System (Invitrogen, США) согласно инструкции производителя, концентрацию РНК оценивали с помощью набора реактивов Quant-iT Assay Kit для количественного определения РНК на приборе Qubit (Invitrogen, США), качество оценивали с помощью электрофореза. кДНК синтезировали из 1-2 мкг общей РНК с использованием набора реактивов First Strand cDNA Synthesis (Fermentas, Канада).

Для определения возможных механизмов противоопухолевого действия гена GLCE использовали набор реактивов Cancer PathFinder RT2 Profiler™ PCR Array (SABioscience, США). ПЦР в реальном времени проводили в соответствии с руководством пользователя RT2 Profiler PCR Array System, используя SYBR Green PCR Master Mix (Fermentas, Канада) в iCycler iQ5 Multicolor Detection System (Bio-Rad, США). Полученные результаты анализировали программой Excel-based PCR Array Data Analysis Software (SABioscience, США).

Анализ экспрессии генов GLCE, TCF4 и CTNN1 в опухолевых клетках и тканях молочной и предстательной желез проводили при помощи мультиплексной ПЦР на амплификаторе Терцик (Компания "ДНК Технологии", Россия). Объем реакционной смеси составлял 10 мкл, с добавлением -100 нг кДНК, 1 мкл 10х ПЦР-буфера, 10 пмоль каждого праймера, 0,1 ммоль каждого дезоксинуклеозидтрифосфата и 1 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы. Амплификацию проводили в течение 10 циклов для генов эпимеразы и TCF4 и 7 циклов для гена CTNN1, после чего в реакционную смесь добавляли праймеры для GAPDH и проводили еще 22 цикла амплификации, при температуре отжига праймеров для GLCE 59°С и 55°С для TCF4 и CTNN1. Продукты ОТ-ПЦР анализировали электрофорезом в 1,5 % агарозном геле, который окрашивали бромистым этидием, сканировали с помощью видеосистемы «DNA Analyzer» (Россия). Денситометрию проводили с помощью программы «Total Lab» (Великобритания). Содержание мРНК GLCE, TCF4 и CTNN1 оценивали в относительных единицах как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы исследуемых генов к интенсивности полосы гена домашнего хозяйства.

Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием Custom GLCE TaqMan Assay (Applied Biosystems, США) на приборе BioRad IQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System (BioRad,

США). Реакционная смесь содержала -100 нг кДНК, lx TaqMan Universal PCR Master Mix (AppliedBiosystems, США), по ЮОнМ каждого праймера, 250нМ пробы. Реакцию проводили при следующих условиях: 95°С - 3 мин; 95°С - 15 сек, 60°С - 60 сек, - 40 циклов. Общий объем реакции составлял 25 мкл. Каждую реакцию проводили трижды, результат представлен в виде среднего

значения + ошибка среднего.

Для определения статуса метилирования промоторной области D-глюкуронил С5-эпимеразы были использованы методы метил-специфичной ПЦР и бисульфитного секвенирования. Для этого выделяли геномную ДНК с помощью E.Z.N.A. DNA isolation kit (Zymo Research, USA), для бисульфитной обработки использовали E.Z.N.A. DNA methylation kit (Zymo Research, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Геномную ДНК, обработанную бисульфитом, использовали для проведения метил-чувствительной амплификации ДНК фрагмента промоторной области с использованием двух различных пар праймеров Met и Unmet, специфичных к метилированоой или неметилированной последовательности промоторной ДНК, соответственно. Объем реакционной смеси составлял 30 мкл, она содержала ~ 75нг ДНК, 2х ПЦР-буфера для DreamTag-ДНК-полимеразы (Fermentas, Канада), 10 пкМ каждого праймера, 0,1 ммоль каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, ДМСО 3 %и 1 ед. акт. Dream Taq-ДНК-полимеразы. Амплификация проводилась при следующих условиях: 40 циклов при температуре отжига праймеров при 65°С для праймеров unmet, 63°С для праймеров met. Продукты амплификации анализировали электрофорезом в 10% ПААГ или в 3% агарозном геле.

Амплификацию фрагмента ДНК GLCE для бисульфитного секвенирования проводили с использованием праймеров, специфичных для последовательности CpG-островков гена GLCE, в качестве матрицы использовалась геномная ДНК после бисульфитной обработки. ПЦР проводилась при следующих условиях: 94°С 2 мин, 94°С 30 с, 56°С 30 с и 72°С 1 мин, последний этап элонгации 72°С 10 мин, 35 циклов. Общий объем реакции составлял ЗОмкл. Продукт ПЦР был очищен с помощью DNA Clean and Concentrator Kit (Zymo Research Corporation, США) и клонирован в ТОРО-вектор с использованием TOPO ТА Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen BV, Нидерланды) в соответствии с инструкциями производителя. Плазмидная ДНК была выделена с помощью Zyppy Plasmid Miniprep Kit (Zymo Research Corporation, США) в соответствии с инструкциями производителя. Для секвенирования был использован BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit v 1.1 и ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) в соответствии с инструкциями производителя. Для каждого образца было проанализировано 7-8 клонов.

Уровень экспрессии микроРНК-218 в образцах определяли методом ПНР в реальном времени с использованием TaqMan microRNA assay (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя. Выделение

суммарной РНК проводили при помощи Trizol Reagent (Invitrogen, США). В обратную транскрипцию брали от 1 до 10 нг РНК, реакцию проводили в 15 мкл буфера для обратной транскрипции (50 мМ трис-HCl, pH 8,3, 3 мМ MgCl2, 75 мМ KCl, 10 мМ DTT), 0,5 ммоль каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (включая dTTP), 50 ед. акт. обратной транскриптазы (MultiScribe™ Reverse Transcriptase) и 10 пмоль праймеров 5xRT при следующих условиях: ЗОмин 16°С , 30 мин при 42°С, 5 мин при 85°С. Реакционная смесь для ПЦР содержала продукт обратной транскрипции, TaqMan Universal PCR Master Mix, TaqMan MicroRNA Assay, общий объем реакционной смеси составлял 20 мкл, амплификацию проводили при следующих условиях: 50°С - 2 мин; 95°С - 10 мин, 95°С - 15 сек, 60°С - 60 сек, - 40 циклов.

Детекцию белка D-глюкуронил С5- эпимеразы проводили при помощи метода Вестерн-блота. Белки разделяли электрофорезом по Лэммли (Mini-Protean II Cell-System, Bio-Rad, США), переносили на PVDF мембрану и инкубировали с поликлональными антителами против GLCE человека (GenScript Corp., США). Визуализацию проводили с использованием системы Opti-4CN Substrate Kit (Bio-Rad, США).

Для хроматиновой иммунопреципитации использовали набор реагентов MAGnify Chromatin Immunoprecipitation System (Invitrogen, США) и ChlP-grade моноклональные антитела к различным изоформам гистона НЗ -НЗК9Ас, НЗК9МеЗ или НЗК4МеЗ (Abeam, UK). Для анализа использовали ~10 клеток на 10 ChIP-реакций. Анализ соосажденых ДНК фрагментов регуляторной последовательности гена эпимеразы после хроматиновой иммунопреципитации проводили при помощи ПЦР с праймерами GLCE ChIP С и GLCE ChIP 1 на амплификаторе Терцик (Компания "ДНК Технологии", Россия). Объем реакционной смеси составлял 10 мкл, ~100нг ДНК, 1 мкл 10х ПЦР-буфера, 0,1 ммоль каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 10 пмоль каждого праймера и 1 ед.акт. Taq-ДНК-полимеразы. Амплификацию проводили в течение 30 (для участка С) или 34 (для участка 1) циклов. Анализ продуктов ПЦР проводили методом вертикального гель-электрофореза в 8% ПААГ геле и анализировали при помощи видеосистемы «DNA Analyzer» (Москва) и программы «Total Lab» (Великобритания). Степень взаимодействия модифицированных гистоновых белков с участками промоторной области гена эпимеразы оценивали как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы к интенсивности полосы контрольного нанесения.

Статистическую обработку результатов: среднее, ошибка среднего, оценка достоверности по критерию Манна-Уитни, коэффициент корреляции Спирмена рассчитывали при помощи компьютерной программы ORIGIN Pro 8.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние эктопической экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы на экспрессию генов, участвующих в процессе канцерогенеза

Ранее в нашей группе было показано снижение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы (GLCE) в большинстве образцов опухолвых тканей молочной и предстательной железы человека. Также было показано. Что ген GLCE проявляет свойства гена-супрессора опухолевого роста. Однако механизмы антиопухолевого эффекта и инактивации GLCE в опухолевых клетках оставались неизученными

Для того чтобы определить возможные молекулярные механизмы антипролиферативного действия D-глюкуронил С5-эпимеразы, был проведен сравнительный анализ уровня экспрессии 84 генов, вовлеченных в процесс канцерогенеза, в исходных опухолевых клетках MCF7 (трансфецированных контрольной плазмидой) и в клетках GLCE-MCF7, экспрессирующих эпимеразу (стабильно трансфецированных плазмидой, содержащей ген GLCE), для чего был использован набор реагентов Cancer PathFinder RT2 Profiler™ PCR Array (Рис.1).

1_од 10{МСР7 2*0«1иС1)

Рисунок 1. Гены, экспрессия которых наиболее значительно изменена в клетках ОЬСЕ-МСР7, активно экспрессирующих О-глюкуроннл С5-эпимеразу человека, по сравнению с исходными клетками МСР7.

Наиболее значимые изменения уровня экспрессии генов канцерогенеза в клетках ОЬСЕ-МСР7 под действием эктопической

11

экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы можно приблизительно отнести к 3 основным механизмам:

1. усиление экспрессии генов супрессоров опухолевого роста - р53 (+3.3 раза), BRCA1 (+3.5 раза), SYK (+8.1 раза) и транскрипционного фактора E2F1 (+3.00 раза);

2. изменение уровня экспрессии генов, отнесенных к молекулярным механизмам ангиогенеза - IL8 (+4,6 раза), IFNB1 (+3,9 раза), TNF ( +4,6 раза) hTGFBI (-5,7 раза);

3. усиление экспрессии генов-супрессоров метастазирования SYK (+8.1 раза) и NME1 (+3.96 раза) и снижение экспрессии метастаз-ассоциированного гена S100A4 (-4.6 раза).

Повышение экспрессии эпимеразы в клетках рака предстательной железы затрагивает в разной степени все рассмотренные молекулярные пути, однако наибольшие изменения экспрессии происходят среди генов, участвующих в процессах

ангиогенеза - VEGFA (-6,3 раз), THBS1 (+5,9 раз), TGFBR1 (+9,6 раз), IGF1 (+18,7 раз), FGFR2 (+12,3 раз), ANGPT (+17,4 раз);

инвазии и метастазирования - TIMP3 (+7,2 раз), TIMP1 (-2,4 раз), TWIST 1 (+5,3 раз), ММР2 (+17,2 раз), ММР9 (+13,3 раз) и ММР1 (-3,5 раз).

В меньшей степени изменялась экспрессия генов, относящихся к процессам адгезии (ITGA4 (+9,2 раза), MC AM (+8,1 раз)) и регуляции клеточного цикла (CDC25A (+24,5 раз), CDK2 (+7,3 раза), E2F1 (+12,8 раз)).

Также анализ изменения экспрессии генов канцерогенеза в зависимости от экспрессии GLCE был проведен и для другой клеточной линии рака предстательной железы LNCaP. Как и в случае с клетками РСЗ, в клетках LNCaP, стабильно экспрессирующих эпимеразу, наибольшие изменения экспрессии наблюдались среди генов, участвующих в процессах ангиогенеза и инвазии/метастазирования.

При эктопической экспрессии эпимеразы в клетках мелкоклеточного рака легкого U2020 происходило изменение экспрессии 32 генов, относящихся главным образом к процессам

инвазии и метастазирования - ММР2 (-8.3 раза), МТА1 (-4.3 раза), PLAU (-4.3 раза), TIMP3 (-3 раза), S100A4 (-2.4 раза), SERPINE1 (-2.4раза) и TWIST 1 (-3.7раза);

апоптоза - TERT (-4.5 раза), АР AFI (-2.4 раза), HTATIP2 (-3.5 раза), TNFa и его рецепторы TNFRSF10B, TNFRSF1A и TNFRSF25 (в 3-4 раза);

и ангиогенеза - VEGF-A (-6.2 раза), TGFB1 (- 3.1 раза), FGFR2 (-3.2 раза), PDGF-A и PDGF-B (-2.4 раза), коллаген XVIII (-2.4 раза).

Хотя наиболее значительные изменения относились к изменению экспрессии ряда факторов роста и их рецепторов (в первую очередь связанных с ангиогенезом), в клетках epi-U2020 изменялась также экспрессия некоторых генов, вовлеченных и в другие молекулярные механизмы

канцерогенеза: снижалась экспрессия генов регуляции клеточного цикла E2F-1 (-2.4-раза) и р21 (-4.1-раза), генов, участвующих в процессах адгезии ITGA3 (-2.7 раза) и МСАМ (-2.4 раза) и вовлеченных в сигнальную трансдукцию SNCG (-6.2 раза), HER-2 (-2.4-раза), Jun (-3.2-раза), АКТ1 (-3.2-раза).

Также нами было исследовано влияние эпимеразы на изменение экспрессии генов канцерогенеза в экспериментальной системе in vivo. Было проведено сравнение относительных уровней экспрессии генов, участвующих в процессах канцерогенеза, в неразвившихся опухолевых образованиях в месте инокуляции клеток (эпимераза экспрессируется) и в выросших экспериментальных опухолях U2020 (эпимераза инактивирована). Согласно полученным данным, эктопическая экспрессия GLCE в клетках U2020, приводящая к подавлению роста экспериментальных опухолей, сопровождалась изменением экспрессии 26 генов, относящихся в основном к молекулярным путям

ангиогенеза - IGF1 (+273 раза), IFNA1 (+3,4 раз), IFNB1 (+2,5 раз), TGFB1 и FGFR2 (+2,1 раза), PDGFA (-11,8 раз), ANGPT1 (-3,6 раз) и THBS1 (-2,8 раз) и

апоптоза - HTATIP2 (+54 раза), BCL2 (+31 раз), TNF (+25,7 раз), TNFRSF6 (+8,4 раз), TNFRSF10B (-6,7 раз), BCL2L1 (+2,1 раз), CFLAR (+27,2 раза).

Кроме того, в меньшей степени были изменены уровни экспрессии генов, участвующих в адгезии - ITGA1 (+3,2 раз), ITGA3 (+2,5 раз), ITGB5 (7,9 раз), ITGB3 (-2,8 раз) и инвазии/метастазирования - SNCG (+2,7 раз), NME1 (+2,3 раз), ММР9 (-3,9 раз), МЕТ (-2,6 раз), SERPINEl(+2,8 раз).

Полученные результаты показывают, что антипролиферативный эффект D-глюкуронил С5-эпимеразы in vivo осуществляется через более сложную регуляцию молекулярных путей канцерогенеза, чем in vitro.

Таким образом, было показано, что во всех типах исследованных опухолевых клеток (рака молочной и предстательной железы и мелкоклеточного рака легкого) эктопическая экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы приводит к изменению экспрессии генов, относящихся к молекулярным механизмам опухолевого ангиогенеза и инвазии/метастазирования. Влияние экспрессии GLCE на процесс ангионгенеза может осуществляться через изменение структуры гепарансульфат протеогликанов (ГСПГ) клеточной поверхности и ВКМ. Известно, что многие ГСПГ вовлечены в регуляцию ангиогенеза, включая синдеканы (Alexopoulou et al, 2007), перлекан (Bix; Iozzo, 2005; Whitelock et al, 2008) и глипикан-l (Aikawa et al, 2008). Например, перлекан модулирует взаимодействие VEGF-VEGFR2 в процессе эмбрионального развития (Zoeller et al, 2009), а синдеканы важны для функций тирозин-киназного рецептора FGFR. С одной стороны, синдеканы, связывающие как bFGF, так и его рецепторы, выступают в качестве активаторов сигнального механизма

FGF; с другой стороны, синдеканы, взаимодействующие только с bFGF, действуют как ингибиторы сигнального каскада (Zhang et al, 2009). Таким образом, структура синдеканов (особенно их гепарансульфатной части) может определять свойства микроокружения клетки, модулируя про-онкогенные или анти-онкогенные функции FGFR.

Наряду с общими механизмами действия D-глюкуронил С5-эпимеразы в отношении различных типов опухолевых клеток, было показано также существование и тканеспецифичных механизмов антимитотического действия эпимеразы. Так, в клетках рака молочной железы MCF7 восстановление экспрессии эпимеразы приводило к изменению экспрессии различных генов-супрессоров опухолевого роста, таких как BRCA1 и SYK, известных как ингибиторы развития рака молочной железы и метастазирования (Gorski et al, 2009; Coopman et al, 2006), а также p53 и E2F1, являющихся важными регуляторами клеточного цикла (Polager et al, 2009). Восстановление экспрессии эпимеразы в клетках мелкоклеточного рака легкого и в клетках рака предстательной железы приводило к изменению экспрессии факторов роста и их рецепторов (VEGF-A, PDGF-A, PDGF-B, FGFR2, TGFB1 и TNF), которое объясняет показанные ранее антипролиферативные свойства D-глюкуронил С5-эпимеразы в культурах клеток in vitro, поскольку определяет характер межклеточных взаимодействий и передачу сигнальной информации от клетки к клетке. Возможно, что эктопическая экспрессия эпимеразы в опухолевых клетках приводит к восстановлению баланса между факторами роста и ингибиторами процесса ангиогенеза и инвазии/метастазирования, что могло бы приводить к подавлению этих процессов в системе in vivo. Таким образом, полученные данные открывают перспективу для создания анти-ангиогенного или антиметастатического препарата на основе эпимеразы.

Молекулярные механизмы регуляции D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках Для определения причин инактивации D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых тканях, была изучена роль различных эпигенетических механизмов в регуляции экспрессии гена GLCE в образцах опухолевых тканей молочной и предстательной железы с различным уровнем экспрессии эпи меразы

Роль метилирования промоторной области в регуляции экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых тканях человека

Одной из первых задач было определение роли метилирования промоторной области в регуляции экспрессии GLCE в клетках, поскольку метилирование является одним из наиболее вероятных механизмов инактивации генов-супрессоров развития опухоли в процессе канцерогенеза.

Для определения статуса метилирования промоторной области гена аСЕ в опухолях молочной и предстательной желез с различным уровнем экспрессии Б-глюкуронил С5-эпимеразы были использованы методы метил-специфичной ПЦР и бисульфитного секвенирования (Рис. 2,3).

MSP

BS

Сро UMHril»tl«UttHH1T

ООФОйОООО'ОООбФООО

»eo^ftoooo^oooeooo 000009000«

»«»»»«eil

im »«»»Oii

o«4»6eeio<iao(sia«o ccnhvl html tmur»

«•oocoocoooi-oooc'oo ;

»90 О0ОО<Х>«0ОвО!>«>О J »4»»900t>«9 VQPOOQQ »

• ¡soeet 9»«iee»eeeai»«e t ооллоооооолоало ?

Рисунок 2. Метилирование CpG-островков регуляторной области гена GLC£ в опухолевых тканях молочной железы человека. Метил-специфичная ПЦР (MSP) промоторной области GLCE. 300-328 - опухоли молочной железы, С и Т - контрольная и опухолевая ткани молочной железы, PC - положительный ПЦР контроль, NC - негативный ПЦР контроль, М - ДНК маркер, М и U - праймеры для метилированной или неметилированной ДНК последовательности, соответственно. Бисульфитное секвенирование (BS) промоторной области GLCE опухолей молочной железы. 300 и 301 - № пациентов, пустые и черные круги - неметилированные и метилированные CpG-динуклеотвды, соответственно.

Было показано, что промоторная область СЬСЕ неметилирована практически во всех проанализированных опухолях молочной железы человека. Согласно результатам бисульфитного секвенирования, уровень метилирования в исследуемых образцах не превышал 5-7%, и не было выявлено каких-либо специфических сайтов метилирования.

Рисунок 3. Метилирование CpG-островков регуляторной области гена GLCE в опухолевых тканях предстательной железы человека. Метил-специфичная ПЦР промоторной области GLCE. 2-46 - опухоли предстательной железы, М и U - праймеры для метилированной или неметилированной ДНК последовательности, соответственно.

В опухолевых тканях предстательной железы также не было обнаружено метилирования промоторной области гена GLCE. Бисульфитное секвенирование 9 образцов подтвердило полное отсутствие метилирования CpG-островков во всех проанализированных опухолях.

Для дальнейшего изучения молекулярных механизмов регуляции экспрессии GLCE были проведены эксперименты на культурах клеток in vitro. Клетки рака молочной железы (MCF7) и рака предстательной железы (Du-145, LNCaP, РСЗ) были обработаны деметилирующим агентом 5-аза-

дезоксицитидином (5-ага-ёС) и/или ингибитором гистоновых деацетилаз трихостатином А (ТЭА) с последующим анализом статуса метилирования промоторной области ОЬСЕ и уровня ее экспрессии до и после обработки (Рис.4).

ОтиШр1«х КТ-РСТОЗАРОН ■ч(?«а|.'Пт« йТ-РСГОас«!»

С !Т

2 л

и I

£ 2 1 Я- I

X Ж

ф ■

ш 1 ■

о ■

-1 ■

о ■

* _ i 2---11 1 тк&т!

» 15а.гчм - - ню гоо <оо too гоо «оа

Рисунок 4. Активация экспрессии GLCE в клетках карциномы молочной железы MCF7 после обработки 5-aza-dC или TSA. Интенсивность амплифицированного фрагмента ДНК гена нормализована на интенсивность фрагмента GAPDH (мультиплексная ОТ-ПЦР) и Р-актина (TaqMan-OT ПЦР в реальном времени). Представлены средние значения ± SE трех экспериментов (OriginPro 8.1).

Методами метил-специфичной ПЦР и бисульфитного секвенирования было показано, что промотор GLCE в клетках рака молочной железы MCF7 не метилирован, а обработка клеток деметилирующим агентом 5-аза-дезоксицитидином не оказывает значительного влияния на уровень экспрессии гена. Эти данные хорошо согласуются с отсутствием метилирования промоторной области эпимеразы в опухолевых тканях молочной железы in vivo.

Однако клеточные линии рака предстательной железы (Du-145, LNCaP, РСЗ) различались по степени метилирования промоторной области D-глюкуронил С5-эпимеразы - в клетках Du-145 не было обнаружено метилирования промоторной области этого гена, в то время как клеточные линии LNCaP и РСЗ показали значительную степень метилирования промоторной последовательности. Обработка этих клеток 5-аза-дезоксицитидином снижала степень метилирования промотора GLCE в клетках LNCaP и активировала экспрессию эпимеразы, в то время как в клетках РСЗ обработка 5-aza-dC не изменяла статус метилирования промотора (40-50%), но приводила к усилению экспрессии эпимеразы в обработанных клетках. Такое различие степени метилирования промоторной области GLCE в разных клеточных линиях рака предстательной железы человека in vitro и опухолях предстательной железы in vivo, по-видимому, может объяснятся гистологическим и морфологическим типом опухолей предстательной железы человека.

Таким образом, промоторная область гена D-глюкуронил С5-эпимеразы, в принципе, при определенных условиях, может быть

метилирована в культивируемых опухолевых клетках in vitro, однако в ситуации in vivo в опухолях молочной и предстательной желез метилирование промоторной области гена GLCE не обнаружено.

Изучение влияния структуры хроматина на экспрессию гена Э-глюкуронил-С5-эпимеразы

Поскольку обработка клеток МСР7 трихостатином А (ТБА) приводила к повышению уровня мРНК йЬСЕ, мы предположили, что структура хроматина играет определенную роль в регуляции экспрессии этого гена. Активация хроматина может оказывать прямое воздействие на экспрессию генов, приводя к повышению доступности промоторной области гена для транскрипционных комплексов.

Для того чтобы определить прямое взаимодействие регуляторной области гена вЬСЕ с активированными гистоновыми белками, был проведен анализ их взаимодействия методом хроматиновой иммунопреципитации (СЫР) с использованием антител против модифицированных лизиновых остатков НЗК9Ас (ацетилированный лизиниовый остаток К9 гистона НЗ), НЗК4МеЗ (метелированный лизиниовый остаток К4 гистона НЗ) и НЗК9МеЗ (метелированный лизиниовый остаток К9 гистона НЗ) и двух пар праймеров, соответствующих участку промоторной области гена вЬСЕ (Рис. 5).

_С

д регион 1 регион с

Рисунок 5. Взаимодействие промоторной области гена БЬСЕ с различными модификациями гистона НЗ. А. Схема расположения праймеров для анализа связывания промоторной области с гистоновыми белками. Б. Пример электрофореграммы ПЦР после хроматиновой иммунопреципитации. В. Диаграмма изменения связывания промоторной области вЬСЕ с модифицированными гистоновыми белками.

Согласно полученным результатам, обработка клеток б-ага-сЮ/ТБА приводила к усилению взаимодействия промоторной области вЬСЕ с маркерами активного хроматина НЗК9Ас и НЗК4МеЗ, но практически не влияла на взаимодействие с маркером неактивного хроматина НЗК9МеЗ.

Такая активация транскрипционной активности эпимеразы, по-видимому, требует также дополнительного участия неидентифицированных пока регуляторных факторов, активируемых обработкой клеток 5-aza-dC. В целом, полученные данные подтверждают возможность прямого влияния структуры хроматина на транскрипционную активность промоторной области GLCE.

Роль комплекса транскрипционных факторов ТСР4/р-катенин в регуляции D-глюкуронил С5-эпимеразы.

Помимо прямого влияния на доступность промоторной зоны гена, активность структуры хроматина может оказывать и непрямое воздействие, связанное с активацией факторов, положительно регулирующих экспрессию GLCE в клетках. Одним из таких факторов может быть ТСР4/(3-катенин-транскрипционный комплекс, участие которого в регуляции экспрессии эпимеразы было показано для клеток рака толстой кишки в системе in vitro (Ghiselli et al, 2005).

Для установления роли р-катенина (CTNN1) и TCF4 в регуляции экспрессии GLCE в клетках рака молочной железы, была проведена оценка уровня экспрессии CTNN1 и TCF4 в клетках MCF7 до и после обработки 5-аза-дезоксицитидином и трихостатином А (Рис. 6).

ОТ-ПЦР анализ

RT-PCR

♦ 5-aM-dC mJig/mJ t TSA,nglmi

1 - - - 1 1 1

- 100 200 400 100 200 400

Относительный уровень экспрессии мРНК GI.CE, ТСР4, р-катенина в клетках карциномы молочной железы МСР7

ад «о 1» »о «о

Рисунок 6. Экспрессия компонентов \Уп1/р-катенинового пути в клетках карциномы молочной железы человека МСР7 до и после обработки клеток 5-аза-дезоксицитидином и трихостатином А. Мультиплексная ОТ-ПЦР и диаграмма изменения экспрессии генов вЬСЕ, ТСР4 и С7ЛВД в опухолевых образцах по сравнению с контрольной тканью. Представлены средние значения ± 8Е трех измерений (Оп§тРто 8.1).

Действительно, наряду с повышением экспрессии Б-глюкуронил С5-эпимеразы, обработка клеток рака молочной железы МСР7 трихостатином А

и/или 5-аза-дезоксицитидином приводила к повышению уровня экспрессии компонентов Wnt-сигнального пути TCF4 и р-катенина.

Статистический анализ данных по критерию Спирмена показал наличие корреляции средней силы для исследованных параметров.

Наряду с результатами, полученными для культуры клеток in vitro, уровень экспрессии TCF4, /1-катенина и GLCE был определен также in vivo в 10 клинических образцах опухолей молочной железы человека (Рис. 7).

,.LL--

lii.jl.i-

J Q 300 301 302 30S 30Sa 307 320 321 326 31?

TCF4

300 301 302 305 305а 307 320 321 326 317

300 301 302 ЗОБ 305а 307 320 321 32S 317

Рисунок 7. Изменение экспрессии генов GLCE, TCF4 и CTNN1 в опухолевых тканях молочной железы. Диаграмма мультиплексной ОТ-ПЦР с геном GAPDH в качестве внутреннего контроля. 300-326 - № пациентов.

Сравнительный анализ экспрессии GLCE, TCF4 и /3-катенина показал наличие прямой корреляции между уровнями экспрессии этих генов в опухолевых тканях молочной железы in vivo. Согласно полученным данным, наблюдается корреляция между изменениями экспрессии GLCE и TCF4 (Коэффициент корреляции Спирмена R=0,86, pD0,05), GLCE и /?-катенина (Коэффициент корреляции Спирмена R=0,68, pD0,05), а также между TCF4 и р-катенином (R=0,81; рП0,05). Полученные результаты согласуются с опубликованными данными и говорят о том, что транскрипционный комплекс ТСР4/(3-катенин может регулировать экспрессию D-глюкуронил С5-эпимеразы также и в опухолевых клетках молочной железы человека.

Таким образом, регуляция экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы на транскрипционном уровне осуществляется через сложный молекулярный

механизм, связанный в значительной мере со структурой хроматина, которая напрямую (усиление транскрипционной активности промоторной области GLCE) и косвенно (активация ТСР4/(3-катенин транскрипционного комплекса) влияет на уровень экспрессии этого гена.

Роль микроРНК-218 в регуляции D-глюкуронил С5-эпимеразы в

клетках рака молочной и предстательной железы Помимо транскрипционного уровня, регуляция экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы может регулироваться и на посттранскрипционном уровне.

Ранее было показано, что регуляция эпимеразы в эндотелиальных клетках ретины мышей может осуществляться через микроРНК-218 (Small et al, 2010). Мы предположили, что микроРНК-218 может также играть роль в регуляции экспрессии GLCE в опухолевых клетках молочной и предстательной желез человека. Для проверки этой гипотезы, клетки карциномы молочной железы MCF7 и рака предстательной железы Du-145 были трансфецированы олигонуклеотидами микроРНК-218 и анти-микроРНК-218 с последующим анализом уровня экспрессии микроРНК-218 и D-глюкуронил С5-эпимеразы в экспериментальных клетках (Рис. 8).

Рисунок 8. Экспрессия микроРНК-218 (А) и GLCE (Б) в клетках рака молочной (MCF7) и предстательной (Du-145) железы, трансфецированных микроРНК-218 и анти-микроРНК-218. Анализ ПЦР в реальном времени. В - Вестерн-блот анализ уровня белка GLCE в клетках MCF7 и Du-145, трансфецированных микроРНК-218 и анти-микроРНК-218. Представлены средние значения ± SE трех измерений (OriginPro 8.1).

Значительное повышение (в 7-10 раз) уровня микроРНК-218, как и ожидалось, не приводило к изменению уровня мРНК вЬСЕ, однако приводило к снижению уровня белка вЬСЕ в трансфецированных клетках,

что подтверждает способность микроРНК-218 регулировать уровень белковой молекулы D-глюкуронил С5-эпимеразы в клетках рака молочной и предстательной желез в системе in vitro.

Наряду с экспериментами in vitro на клеточных линиях, был проведен сравнительный анализ уровня экспрессии GLCE и микроРНК-218 в образцах опухолевых тканей молочной и предстательной железы человека in vivo. Результаты показали наличие прямой корреляции между уровнем мРНК GLCE и микроРНК-218 (Коэффициент Спирмена R=0,68 для образцов рака молочной железы и R=0,96 pD0,05 для опухолей предстательной железы), что может указывать на согласованную экспрессию микроРНК-218 и GLCE в изучаемых клетках. Однако уровень белка D-глюкуронил С5-эпимеразы слабо коррелировал с уровнем микроРНК-218 в опухолях молочной и предстательной желез (R=0,49 и R=0,53, соответственно; pD0,05). По-видимому, хотя в культуре клеток микроРНК-218 и способна регулировать уровень белковой молекулы эпимеразы, но в опухолевой ткани in vivo свой вклад вносят также и другие регуляторные механизмы и влияние микроРНК становится не столь очевидным.

В целом, результаты исследования показали сложную регуляцию экспрессии GLCE в опухолевых тканях молочной и предстательной железы, осуществляемую как на транскрипционном (структура хроматина, активность ТСР4/р-катенин транскрипционного комплекса, другие не идентифицированные пока регуляторные факторы), так и на посттранскрипционном уровне (микроРНК).

ВЫВОДЫ

1. Эктопическая экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы во всех типах исследованных опухолевых клеток (рака молочной и предстательной железы и мелкоклеточного рака легкого) приводит к изменению экспрессии генов, белковые продукты которых участвуют в процессах ангиогенеза (PDGF, TNF, IFNB1, ANGPT1, THBS1) и инвазии/метастазирования (TIMP1, TIMP3, TWIST 1, SI00A4)

2. Восстановление экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках приводит к тканеспецифичному изменению экспрессии генов-супрессоров опухолевого роста BRCA1, E2F1, р53 в клетках рака молочной железы или факторов роста PDGF-A, PDGF-B, VEGF-A , TGFB1 и их рецепторов в клетках мелкоклеточного рака легкого.

3. Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы не связана с метелированием промоторного участка гена в опухолевых тканях молочной и предстательной железы человека.

4. Уровень экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках молочной железы человека зависит от степени ацетилирования и метилирования лизиновых остатков в гистоне НЗ

5. Экспрессия D-глкжуронил С5-эпимеразы в культуре опухолевых клеток in vitro и опухолях молочной железы in vivo положительно коррелирует с уровнем экспрессии ТСР4/р-катенин-транскрипционного комплекса

6. МикроРНК-218 регулирует экспрессию белка D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках молочной и предстательной железы in vitro.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИ

1. Мостович JI.A., Прудникова Т.Ю., Доманицкая Н.В., Вержбицкая Н.Е., Харченко О.В., Непомнящих Г.И., Айдагулова С.В., Рыкова В.И., Григорьева Э.В. Молекулярные механизмы противоопухолевого эффекта Д-глюкуронил С5-эпимеразы в экспериментальной модели рака легкого in vivo. II Сибирский онкологический журнал. - 2010. - Том 38. -№2. - С. 24 - 29.

2. Prudnikova T.Y., Mostovich L.A., Domanitskaya N.V., Pavlova T.V., Kashuba V.I., Zabarovsky E.R., Grigorieva E.V. Antiproliferative effect of D-glucuronyl C5-epimerase in human breast cancer cells. // Cancer. Cell. Int. - 2010. -V. lO.-doi: 10.1186/1475-2867-10-27.

3. Grigorieva E.V., Prudnikova T.Y., Domanitskaya N.V., Mostovich L.A., Pavlova T.V., Kashuba V.I., Zabarovsky E.R. D-glucuronyl C5-epimerase suppresses small-cell lung cancer cell proliferation in vitro and tumour growth in vivo. // Br. J. Cancer. - 2011. - V. 105. - P.74-82.

4. Мостович Л.А., Прудникова Т.Ю., Доманицкая H.B., Вержбицкая Н.Е., Харченко О.В., Непомнящих Г.И., Айдагулова С.В., Рыкова В.И., Григорьева Э.В. D-глюкуронил С5-эпимераза человека подавляет развитие экспериментальных опухолей in vivo через молекулярный механизм ингибирования ангиогенеза. // Сибирский Онкологический Журнал - 2010. -прил.1, стр.77-78

5. Grigorieva E.V., Prudnikova T.Y., Mostovich L.A., Domanitskaya N.V., Zabarovsky E.R. D-glucuronyl C5-epimerase inhibits breast cancer cell proliferation through the tumour suppressor genes activation. // Europ. J. Cancer. Suppl. - 2010. - V.8. - № 6. -P. 24-25.

6. Мостович Л.А., Прудникова Т.Ю., Доманицкая H.B., Павлова Т.В., Рыкова В.И., Кашуба В.И., Забаровскиф Е.Р., Григорьева Э.В. Антиопухолевый эффект . D-глюкуронил С5-эпимеразы человека при мелкоклеточном раке легкого. // XXIII Международная зимняя школа «Перспективные направления физико-химической биологии». — 2011. — Москва, Россия. - С.27-28.

7. Prudnikova T.Y., Mostovich L.A., Kondratov A.V., Gubanova N.V., Kashuba V.I., Zabarovsky E.R., Grigorieva E.V. Molecular mechanisms of D-glucuronyl C5-epimerase expression in breast cancer. // Int. J. Mol. Med. - 2011. -Vol. 28.-P. 46.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГАГ- гликозаминогликаны

ВКМ - внеклеточный матрикс

GAPDH - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа

GlcUA- глкжуроновая кислота

IdoUA- идуроновая кислота

ГСПГ- гепарансульфат протеогликан

ПЦР - полимеразная цепная реакция

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

GLCE - D-глюкуронил С5-эпимераза

CTNN1 - Р-катенин

TCF4 - T-cell factor

TS А - трихостатин А

5-aza-dC - 5-аза-дезоксицитидин

НЗК9Ас -ацетилированный лизиниовый остаток К9 гистона НЗ

НЗК4МеЗ - метелированный лизиниовый остаток К4 гистона НЗ

НЗК9МеЗ - метелированный лизиниовый остаток К9 гистона НЗ

ПААГ - полиакриламидный гель

ChIP -хроматиновая иммунопреципитация

SE - ошибка среднего

R- коэффициент корреляции Спирмена

Подписано к печати 6 марта 2012г. Тираж 100 экз. Заказ № 015. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мостович, Людмила Андреевна, Новосибирск

61 12-3/1205

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» Сибирского Отделения Российской Академии Медицинских Наук

На правах рукописи

Мостович Людмила Андреевна

Регуляция экспрессии гена Б-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках молочной и предстательной железы

человека

03.01.04 - биохимия

Диссертация

соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н. Григорьева Эльвира Витальевна

Новосибирск - 2012

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................12

1.1 Гепаран сульфат протеогликаны...................................................................12

1.2 Биосинтез гепарансульфат протеогликанов...............................................17

1.3 D-глкжуронил С5 -эпимераза...........................................................................19

1.4 роль D-глюкуронил с 5 -эпимеразы в канцерогенезе...................................22

1.5 Механизмы регуляции экспрессии генов в канцерогенезе......................22

1.5.1 Метилирование ДНК.......................................................................................23

Методы детекции метилирования ДНК...............................................................27

1.5.2 Модификация гистонов..................................................................................30

1.5.3 микроРНК.........................................................................................................32

1.6 Механизмы регуляции экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы.........35

1.6.1 Роль трансактивационного комплекса ¡З-катенин/TCF4 в регуляции GLCE

1.6.2 Роль микроРНК-218 в регуляции экспрессии GLCE.....................................39

1.6.3. Регуляция экспрессии других генов биосинтеза гепарансульфатов.........39

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................42

2.1. Материалы............................................................................................................42

2.2. Методы..................................................................................................................45

2.2.1. Клеточные культуры.....................................................................................45

2.2.2 Обработка клеток дезоксиазацитином и трихостатином А..................45

2.2.3 Выделение РНК................................................................................................45

2.2.4 Измерение концентрации нуклеиновых кислот и белка..............................46

2.2.5 Обратная транскрипция................................................................................46

2.2.6 Анализ экспрессии генов методом мультиплексной ОТ-ПЦР....................47

2.2.7 Горизонтальный электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле.... 47

2.2.8 Количественная ПЦР в реальном времени...................................................48

2.2.9 Вестерн-блот анализ......................................................................................48

2.2.10 Определение возможных механизмов противоопухолевого действия гена

GLCE..........................................................................................................................49

2.2.11. Выделение геномной ДНК............................................................................50

2.2.12 Бисульфитная обработка ДНК...................................................................50

2.2.13 Метил-специфичная ПЦР.............................................................................50

2.2.14 Обработка ДНК CpG метилтранферазой.................................................57

2.2.15 Бисульфитное секвенирование.....................................................................57

2.2.16 ПЦР в реальном времени для микроРНК-218............................................52

2.2.17Хроматиновая иммунопреципитация (ChIP).............................................52

2.2.18 Статистическая обработка результатов................................................54

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ.............................................................................................55

3.1 влияние GLCE на сигнальные пути канцерогенеза....................................55

3.1.1. Карцинома молочной железы.......................................................................55

3.1.2 Рак предстательной железы.........................................................................5S

3.1.3 Мелкоклеточный рак легкого.........................................................................59

3.2 Молекулярные механизмы инактивации D-глюкуронил С5-эпимеразы в

опухолевых клетках................................................................................................j63

3.2.1 Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых тканях молочной и предстательной железы.........................................................................................

3.2.1.1 Молочная железа......................................................................................63

3.2.1.2 Предстательная железа.............................................................................65

3.2.2 Роль метилирования промоторной области в регуляции экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых тканях человека...............................61

3.2.2.1 Молочная железа......................................................................................68

3.2.2.2 Предстательная железа.............................................................................70

3.2.3 Изучение эпигенетической регуляции экспрессии гена D-глюкуронил С5-

эпгшеразы in vitro.....................................................................................................

3.2.3.1 Клетки карциномы молочной железы MCF7........................................70

3.2.3.2. Клетки рака предстательной железы.....................................................72

3.2.4 Влияние структуры хроматина на экспрессию гена D-глюкуронил-СЗ-

74

эпимеразы..................................................................................................................' ^

3.2.5 Роль комплекса транскрипционных факторов TCF4/[l-KameHин в регуляции D-глюкуронил С5-эпимеразы................................................................76

3.2.6 Роль микроРНК-218 в регуляции GLCE в клетках рака молочной железы и предстательной железы......................................................................................

ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.............................................................85

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................93

Список сокращений

ПГ- протеогликаны

ГАГ- гликозаминогликаны

ВКМ - внеклеточный матрикс

GAPDH - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа GlcN- глюкозамин GalN- галактозамин GlcUA- глюкуроновая кислота IdoUA- идуроновая кислота ГС- гепарансульфат ГСПГ- гепарансульфат протеогликан ПЦР - полимеразная цепная реакция мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота GLCE - D-глюкуронил С5-эпимераза NDST - К-деацетилаза-К-сульфотрансфераза HS2ST - гепарансульфат 2-О-сульфотрансфераза HS6ST - гепарансульфат 6-О-сульфотрансфераза 3-OST - З-О-сульфотрансферазы SULF2 - сульфатаза-2 DNMT - ДНК-метилтрансфераза HDAC - гистоновая деацителаза CTNN1 - Р-катенин TCF4 - T-cell factor ПААГ - полиакриламидный гель ChIP -хроматиновая иммунопреципитация SE - ошибка среднего

Введение

Б-глюкуронил С5-эпимераза является ключевым ферментом биосинтеза гепарансульфат протеогликанов (ГСПГ). Гепарансульфат протеогликаны представляют собой класс сложных биологических молекул, состоящих из корового белка и одной или нескольких полисахаридных цепей гликозаминогликанов (ГАГ). Благодаря структурной сложности и разнообразию ГСПГ выполняют множество различных функций в организме. Во внеклеточном матриксе, помимо структурной функции, они участвуют в межклеточных взаимодействиях, во взаимодействиях клетки с внеклеточным матриксом, процессах адгезии и миграции, на поверхности клеток осуществляют сигнальные функции, выступая в качестве рецепторов и корецепторов для различных факторов роста и цитокинов. Функции протеогликанов во многом обусловлены модификациями цепей гликозаминогликанов, включающими Ы- и О-сульфатирование по разным положениям и эпимеризацию Б-глюкуроновой кислоты (01сА) в Ь-идуроновую кислоту (ИоА). Содержание идуронового компонента повышает гибкость полисахаридных цепей гепарансульфат протеогликанов, обеспечивая их эффективное взаимодействие с лигандами. Изменение соотношения ЫоА/01сА наблюдается при злокачественной трансформации различных тканей и клеток (Млкагш et а1, 2001; Ьошзоиагп е/ а1, 2008). За процесс эпимеризации уроновых кислот и отвечает Б-глюкуронил С5 эпимераза (вЬСЕ). Мыши, нокаутные по гену вЬСЕ, погибают сразу после рождения и имеют дефекты развития почек, легких и скелета, что указывает на важную роль вЬСЕ в процессах морфогенеза (1л etal, 2003).

Ранее в нашей лаборатории было показано, что экспрессия СЬСЕ значительно снижена в большинстве злокачественных опухолей молочной и предстательной железы человека и в клетках мелкоклеточного рака легкого (<Зп§опеуа е/ а1, 2008; Прудникова, 2009). Дальнейшее изучение функций гена вЬСЕ показало, что эктопическая экспрессия СЬСЕ подавляет пролиферативную активность опухолевых клеток молочной (Ргиёшкоуа е/ а/, 2010) и предстательной железы (Прудникова, 2009), мелкоклеточного рака легкого т

vitro и рост экспериментальных опухолей in vivo (Grigorieva et al, 2011). Таким образом, было показано, что GLCE обладает свойствами гена супрессора опухолей.

Известно несколько молекулярных механизмов, обеспечивающих эпигенетическую инактивацию генов супрессоров опухолевого роста. Одними из самых распространенных являются гиперметилирование промоторной области гена, приводящее к снижению уровня его экспрессии в клетке, и эпигенетическая регуляция экспрессии гена на уровне хроматина, которая определяется степенью модификации гистонов (ацетилирование, фосфорилирование, метилирование, убиквинтинирование) и, как следствие, структурой нуклеосом (Veeck et al, 2010). Также немаловажную функцию в регуляции экспрессии генов играет активность различных факторов транскрипции. Кроме того, регуляция активности генов может осуществляться также на пост-транскрипционном уровне малыми РНК - наиболее древний и консервативный механизм, называемый РНК-интерференцией (Bartels et al, 2009). Молекулярные механизмы регуляции гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на данный момент остаются практически неизученными. Поэтому актуальным является поиск причин инактивации D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках, а также определение возможных молекулярных механизмов ее антипролиферативного действия.

Цель данной работы: оценить влияние D-глюкуронил С5-эпимеразы на экспрессию генов, участвующих в процессе канцерогенеза, и определить возможные молекулярные механизмы ее регуляции в опухолевых клетках и тканях.

В соответствии с целью, были поставлены следующие задачи:

1. Определить влияние D-глюкуронил С5-эпимеразы на экспрессию генов, участвующих в процессе канцерогенеза в опухолевых клетках молочной, предстательной желез и рака легкого человека.

2. Определить статус метилирования промоторной области гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолях молочной и предстательной желез человека.

3. Изучить влияние изменения структуры хроматина на экспрессию Б -глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках.

4. Определить роль факторов транскрипции ТСР4 и р-катенина в регуляции экспрессии Б-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках.

5. Оценить вклад микроРНК-218 в регуляцию экспрессии Б-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках.

Научная новизна работы

В данной работе впервые было показано, что:

1. Восстановление экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в клетках рака молочной и предстательной желез и мелкоклеточного рака легкого человека приводит к изменению экспрессии генов, участвующих в молекулярных механизмах ангиогенеза и инвазии/метастазирования,

2. регуляция экспрессии эпимеразы осуществляется как на транскрипционном, так и на пост-транскрипционном уровне через сложный комплекс эпигенетических механизмов регуляции экспрессии генов

3. в отличие от других генов-супрессоров развития опухоли, метилирование не играет роли в регуляции экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых тканях молочной и предстательной желез человека

4. структура хроматина и степень модификации гистонов НЗК9Ас и НЗК4МеЗ влияют на экспрессию D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках

молочной железы человека

5. экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках молочной

железы in vitro и опухолях in vivo коррелирует с уровнем экспрессии участников Wnt-сигнального пути TCF4 и (3-катенина

6. микроРНК-218 приводит к снижению экспрессию белка D-глюкуронил С5-эпимеразы в клеточных культурах рака молочной и предстательной желез in

vitro

Научно-практическая значимость

Данная работа носит преимущественно фундаментальный характер и представляет собой определение возможных молекулярных механизмов антипролиферативного эффекта и инактивации Б-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках человека. Однако результаты исследования показали и возможность практического применения полученных данных для создания нового метода дифференциальной диагностики различных опухолей и выбора оптимальной стратегии лечения пациентов. Так, в ходе работы была показана активация экспрессии гена В-глюкуронил С5-эпимеразы ингибитором гистоновых деацетилаз трихостатином А, который в настоящее время активно применяется в клинической практике в качестве антиопухолевого препарата. Диагностическое определение уровня экспрессии Б-глюкуронил С5-эпимеразы будет иметь важное значение для определения группы пациентов, для которых

показано лечение этим препаратом.

Наряду с возможным использованием В-глюкуронил С5-эпимеразы в

качестве нового дифференциального диагностического маркера, интересные перспективы связаны со способностью эпимеразы регулировать процессы опухолевого ангиогенеза и инвазии/метастазирования, что позволит рассмотреть возможность создания на ее основе нового анти-ангиогенного и /или антиметастатического препарата для лечения злокачественных новообразований.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Эктопическая экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках рака молочной и предстательной желез и мелкоклеточного рака легкого человека приводит к изменению активности генов канцерогенеза, продукты которых участвуют в молекулярных механизмах ангиогенеза и

инвазии/метастазирования.

2. Тканеспецифичное действие эпимеразы заключается в регуляции экспрессии различных генов-супрессоров опухолевого роста (рак молочной железы) или факторов роста и их рецепторов (клетки мелкоклеточного рака легкого).

3. В опухолевых тканях молочной и предстательной желез не обнаружено гиперметилирование промоторной области гена D-глюкуронил С5-эпимеразы.

4. Степень ацетилирования и метилирования лизиновых остатков гистонов НЗ влияет на экспрессию D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых

клетках молочной железы человека.

5. Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы в культуре опухолевых клеток in vitro и опухолях молочной железы in vivo положительно коррелирует с уровнем экспрессии ТСР4/(3-катенин-транскрипционного комплекса.

6. МикроРНК-218 регулирует уровень белка D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках молочной и предстательной желез in vitro.

Апробация работы

Результаты работы были представлены и обсуждены на V региональной конференции молодых ученых-онкологов им. академика РАМН Н.В.Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, Россия, 2010); на 1 Британской Конференции по изучению рака молочной железы человека Великобритания (Ist British Breast Cancer Research Conference; Ноттингем, Великобритания, 2010); на XXIII Международной зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, Россия, 2011); на 16 Всемирном Конгрессе по Современным Достижениям в Онкологии и 14 Международном Симпозиуме по Молекулярной Медицине (16th World Congress on Advances in Oncology and 14th International Symposium on Molecular Medicine; Родос, Греция, 2011); на 8 Европейской конференции по исследованию рака молочной железы (8th European Breast Cancer Conference, Вена, Австрия, 2012)

Глава 1. Обзор литературы

Б-глюкуронил С5 эпимераза является ключевым ферментом биосинтеза гепарансульфат протеогликанов, который проводит эпимеризацию глюкуроновой кислоты в идуроновую и необходим для появления функционально зрелых гепарансульфат протеогликанов (ГСПГ) клеточной поверхности. В силу этого, значимость этого фермента определяется, в основном, функциями ее субстратных молекул ГСПГ и нарушение функционирования гена В-глюкуронил С5-эпимеразы будет приводить к структурным изменениям ГС клеточной поверхности.

1.1 Гепаран сульфат протеогликаны

Гепарансульфат протеогликаны - это сложные белково-углеводные молекулы, состоящие из белкового кора и одной или нескольких цепей гликозаминогликанов (ГАГ). М олекулы гликозаминогликанов представляют собой неразветвленные углеводные цепи с характерными повторяющимися дисахаридными субъединицами. Дисахариды состоят из гексозамина (Б-глюкозамин (01с1М) и уроновой кислоты (Б-глюкуроновой (вкиА) или Ь-идуроновой (ЫоиА)) (Ма1ауак1 е1а1,2011; Еэко etal, 2009).

Рисунок!. Структура молекулы протеогликана(СоисЬтап, 2010).

Как остатки глюкозамина, так и остатки уроновой кислоты могут нести сульфатные группы в различных положениях. Сульфатирование цепей ГАГ очень гетерогенно и обеспечивает их высокий отрицательный заряд. При этом степень сульфатирования и эпимеризации полисахаридных цепей зависит как от типа клеток, так и от физиологических условий (Zhang et al, 2010; Hallak et al, 2000; Pan etal, 2010).

Гепарансульфат протеогликаны синтезируются практически всеми клетками организма и локализованы в основном на клеточной поверхности, в базальной мембране или во внеклеточном матриксе (Kjellen et al, 1991) (Рис.2). Существуют данные о том, что протеогликаны могут находиться в ядре (Fedarko etal, 1986; Рыкова и др., 1998; Dobra etal, 2003), но биологическое значение такой локализации до сих п