Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск фармакологических мишеней для терапии рака молочной железы на основе компьютерного моделирования регуляции клеточного цикла

ВАК РФ 03.01.09, Математическая биология, биоинформатика

Автореферат диссертации по теме "Поиск фармакологических мишеней для терапии рака молочной железы на основе компьютерного моделирования регуляции клеточного цикла"

На правах рукописи

КОБОРОВА Ольга Николаевна

ПОИСК ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ МИШЕНЕЙ ДЛЯ ТЕРАПИИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ НА ОСНОВЕ КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

03.01.09 - математическая биология, биоинформатика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 МАЙ 2012

Москва 2012

005044871

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «ИБМХ» РАМН)

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,

Поройков Владимир Васильевич

кандидат физико-математических наук, Филимонов Дмитрий Алексеевич

Официальные оппоненты: Веселовский Александр Владимирович,

доктор биологических наук, ФГБУ «ИБМХ» РАМН, зав. лаб.

Алексеевский Андрей Владимирович,

кандидат физико-математических наук, НИИ Физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ им. М. В. Ломоносова, зав. лаб.

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта Российской академии наук

Защита состоится «7» июня 2012 г. в 12:30 часов на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича» Российской академии медицинских наук по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ИБМХ» РАМН.

Автореферат разослан «_» мая 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук Е. А. Карпова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поиск фармакологических мишеней для терапии социально значимых заболеваний человека представляет одну из наиболее важных задач современной биоинформатики. Рак молочной железы (РМЖ) у женщин, по данным Американского онкологического общества за 2011 год, находится на втором месте по количеству летальных исходов среди различных видов опухолей, и поиск новых фармакологических мишеней для терапии РМЖ более чем актуален. Экспериментальные методы исследования различных клеточных фенотипов, в том числе и опухолевых, в масштабах целого генома быстро совершенствуются, что позволяет более глубоко изучать механизмы опухолевых процессов на молекулярном и клеточном уровнях. Системный подход повышает эффективность при отборе перспективных мишеней лекарств и уменьшает как риски для пациентов, так и финансовые издержки фармацевтических компаний в процессе разработки препаратов (Chua и Roth, 2011).

Регуляция клеточного цикла включает в себя важнейшие процессы, имеющие решающее значение для выживания клетки, в том числе выявление и репарацию генетических повреждений, а также предотвращение бесконтрольного клеточного деления. Нарушения этих процессов составляют основу патогенеза опухолевого роста. Регуляцию клеточных процессов часто рассматривают как сеть, которая отражает теоретическую абстракцию биохимических реакций и межмолекулярных взаимодействий в клетке. Несмотря на большое количество разрабатываемых методов анализа и моделирования поведения регуляторных сетей, основной проблемой оказывается невозможность оценки влияния всей совокупности положительных и отрицательных обратных связей, что ограничивает существующие методы в поиске новых фармакологических мишеней. Эти предпосылки легли в основу разработки метода поиска фармакологических мишеней для терапии РМЖ на основе компьютерного моделирования регуляции клеточного цикла.

Цель работы: разработать компьютерный метод выявления молекулярных мишеней для лекарственной терапии злокачественных новообразований и апробировать его на примере рака молочной железы.

Задачи исследования:

1. Собрать и проанализировать информацию о регуляции клеточного

цикла, экспрессии белков в нормальных и опухолевых клетках.

2. Разработать и реализовать в виде компьютерной программы метод выявления и оценки противоопухолевых мишеней.

3. Провести валидацию предложенного метода идентификации перспективных противоопухолевых мишеней на основе доступных экспериментальных данных.

4. Применить разработанный метод к идентификации перспективных противоопухолевых мишеней для терапии опухолевых заболеваний.

Научная новизна. Впервые предложен и реализован в виде компьютерной программы NetFlowEx метод дихотомического моделирования регуляции клеточного цикла в норме и при патологиях с целью выявления перспективных фармакологических мишеней. Впервые проведено моделирование поведения регуляторной сети, состоящей из 1405 вершин и 2336 взаимодействий с использованием данных об экспрессии в норме и для четырех групп РМЖ: генерализированного рака молочной железы, НЕК2/пеи-положительной карциномы молочной железы, карциномы протоков, инвазивной карциномы протоков и/или узловых метастазов. Для терапии РМЖ выявлены значимые мишени, ингибиторы к которым проявили противоопухолевую активность на трех опухолевых клеточных линиях карциномы молочной железы (MCF7, SkBr и MDA-MB231). Получено свидетельство №2011617330 от 21.09.2011 г. на регистрацию программы для ЭВМ NetFlowEx, выданное Федеральной службой по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам.

Личный вклад автора. Представленные в диссертационной работе результаты получены лично соискателем, а также совместно с коллегами: А. А. Лагунин и А. В. Захаров - поиск лигандов к выявленным мишеням; Ю. В. Кондрахин и Р. Шарипов - статистическая обработка данных об экспрессии генов; Г. Селиванова с сотр. - экспериментальная валидация полученных лигандов для выявленных мишеней. В опубликованных работах [2-4] соискателю принадлежат разработка, реализация в виде компьютерной программы и применение разработанного метода для поиска перспективных противоопухолевых мишеней РМЖ.

Практическая значимость. Разработанный и реализованный в программе NetFlowEx метод использован для выявления перспективных фармакологических мишеней в рамках Европейского проекта "Net2Drug — From gene regulatory networks to drug prediction". Метод может быть применен для анализа и моделирования регуляторных сетей, а также для поиска

перспективных молекулярных мишеней при некоторых формах онкопатологии. Метод может быть использован в научно-исследовательских и медицинских учреждениях, работающих в областях системной биологии, молекулярной биологии и генетики, генной инженерии и др., а также применен в поиске и разработке новых лекарственных препаратов, использован в учебном процессе высших учебных заведений соответствующего профиля.

Работа выполнена при поддержке грантов Европейской Комиссии № 037590 (FP6-2005-LIFESCIHEALTH-7) и Госконтракта № 07.514.11.4118.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях: "Московская конференция по вычислительной молекулярной биологии" - МССМВ-2009 и МССМВ-2011, Россия, Москва, 2009; "XVI и XV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»", Россия, Москва, в 2009 и 2010; "Международный симпозиум по вычислительным методам в токсикологии и фармакологии объединяющих интернет ресурсов" - CMTPI-2007 (Россия, Москва) и CMTPI-2009 (Турция, Стамбул); "Шестая международная конференция по биоинформатике регуляции и структуры генома" - BGRS-2008, Новосибирск, 2008; "Четвертая международная конференция «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанобиотехнологии для медицины» " -GPBNM-2008, Россия, Москва - Нижний Новгород - Москва, 2008; "Симпозиум по системной биологии Гемгольц-Россия-Германия", Россия, Москва, 2008; "Четвертая международная конференция «Постгеномные технологии разработки противоопухолевых агентов с новыми механизмами действия»", Россия, Москва, 2007; "Четвертый московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития»", Россия, Москва, 2007; "Четвертый евразийский съезд по гетероциклической химии" - ЕАМНС-2006, Салоники, Греция, 2006.

Публикации. Материалы диссертационной работы отражены в 18 публикациях, из них 3 статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК, 15 публикаций в трудах конференций. Получено 1 свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 156 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 7 таблиц, состоит из введения, трех глав, заключения, списка литературы, содержащего 155 ссылок, и приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

Рассмотрены понятия регуляторных сетей, фармакологических мишеней и пр. Представлена информация об особенностях регуляции клеточного цикла и апоптоза, в частности, о ключевых белках, активация и/или блокада которых отражает переход между фазами цикла и необратимый запуск апоптоза. Также проанализированы существующие подходы к формальному описанию и представлению взаимодействий между белками и/или генами. Детально рассматриваются методы моделирования регуляторных сетей: непрерывные (моделирование с использованием дифференциальных уравнений, непрерывные линейные модели, анализ баланса потоков) и дискретные (логические сети, сети Петри, и их разновидности). Представлены примеры применения вышеперечисленных методов для поиска перспективных фармакологических мишеней, проанализированы их преимущества и ограничения, а также приведено обоснование для разработки дихотомической модели регуляции клеточного цикла для выявления перспективных противоопухолевых мишеней лекарств.

Глава 2. Материалы и методы

Информация об участках регуляторных сетей была экстрагирована нами из базы данных (БД) TRANSPATH® (http://www.biobase-international.com), содержащей информацию о белках, генах и их взаимодействиях (Krull et al., 2006).

Информация о генах "домашнего хозяйства"1 (ГДХ) человека была получена с использованием биоинформатического ресурса ExPlain® (http://www.genexplain.com/) (A. Kel et al., 2008).

Списки генов с измененной экспрессией для РМЖ были взяты из БД Cyclonet (http://cyclonet.biouml.org) (Kolpakov et al., 2007).

Дихотомическое моделирование и выявление перспективных фармакологических мишеней было проведено с помощью разработанной нами компьютерной программы NetFlowEx, написанной на языке Java 2.0 в среде разработке Eclipse (www.eclipse.org).

1 Гены "домашнего хозяйства" - гены, необходимые для поддержания важнейших жизненных функций организма, которые экспрессируются практически во всех тканях и клетках на относительно постоянном уровне. Гены домашнего хозяйства функционируют повсеместно, на всех стадиях жизненного цикла организма.

Для более подробного анализа выявленных мишеней нами была проанализирована БД Integrity® (http://www.prous.com/integrity/), содержащая наиболее полную информацию по разрабатываемым лекарственным препаратам.

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Анализ информации о регуляции клеточного цикла,

экспрессии белков в норме и при раке молочной железы

В результате анализа литературы и БД TRANSPATH® была составлена регуляторная сеть, состоящая из 1405 вершин (генов и белков) и 2336 взаимодействий, и содержащая различные регуляторные пути, вовлеченные в развитие и прогрессию РМЖ. Для вершин, отражающих белки, были отобраны только реакции, которые подтверждены экспериментально; также были включены связи между генами и белками (трансрепрессия, трансактивация, экспресия). Среднее число взаимодействий для вершин в полученной сети составляет 1,66.

Количество отобранных для моделирования генов с измененной экспрессией для РМЖ и ГДХ, использованных для моделирования, представлены в Таблице 3.1 диссертационной работы.

3.2. Метод дихотомического моделирования регуляторных сетей

Одним из фундаментальных принципов работы биологических систем является принцип усиления и ограничения сигнала для поддержания устойчивости и/или для перехода между состояниями системы при воздействии внутренних и/или внешних факторов (Kitano, 2007). В рамках дихотомической модели каждый ген и каждый белок представлены в виде вершины направленного графа, в котором ребра проводятся между вершинами тогда и только тогда, когда между ними имеется взаимодействие. Отдельные вершины сети (белки и/или гены) могут быть в одном из двух состояний: активном и неактивном. Активное состояние гена соответствует экспрессии соответствующего белка, активное состояние белка - его способности связывать свои субстраты. Состояния изменяются в дискретные моменты времени. Последовательность состояний сети S(0), S(l), S(2), ... , S(k) называется траекторией. В каждый момент времени (шаг траектории) состояния вершин зависят от состояний вершин на предыдущем шаге моделирования. Подмножества состояний {S}62w сети из N узлов называются событиями. Вычисление траектории прекращается после наступления некоторого события, интересующего исследователя, например,

апоптоза, когда запускается каскад каспаз и процесс становится необратимым, или остановки клеточного цикла на одной из его фаз.

Входными данными модели являются состояния вершин в начальный момент времени. Состояние узла обозначено S, — для активного узла S, = 1, а для неактивного 5, = 0. Функции перехода в нашей дихотомической модели сети регуляции клеточного цикла представлены в виде:

5j(n + 1) = в(щ + £к bikSk(n)) (1)

где пороговая функция 8(х) = 0 при х < 0 и в(х) = 1 при х > 0; bik = 1, если ребро выходит из узла к и активирует узел /; bik = —1, если ребро выходит из узла к и инактивирует узел /; bik = 0 во всех остальных случаях, a Ькк = 0 означает, что узел не активирует сам себя; только одно из двух чисел bik или bki может быть отличным от нуля. В простейшем случае а; = 0, bik = ±1, однако, эти параметры можно использовать для более тонкой настройки модели по известным данным о процессах регуляции.

Для достижения целей работы необходимо вычисление не одной, а целого пучка траекторий, что позволит верифицировать построенную модель по имеющимся литературным данным об особенностях функционирования сетей регуляции клеточного цикла.

Для выявления молекул-мишеней, соответствующих определенным белкам/генам, состояние узлов сети фиксируется согласно виду предполагаемого воздействия, например, 5X0) = S,( 1) = S,(2) = ... = S,(n) = 0 при ингибировании соответствующего /-ого белка/гена. Если при ингибировании или активировании белка/гена и/или комбинации белков/генов, поведение сети меняется желаемым образом, например, происходит переход клетки в апоптоз или остановка клеточного цикла -такой белок и/или комбинация белков рассматривается как перспективная фармакологическая мишень/мишени.

Метод дихотомического моделирования регуляции клеточного цикла реализован нами в компьютерной программе NetFlowEx (Net Flow Explorer) на языке Java 2.0 (см. раздел 2.3 диссертационной работы). Программа зарегистрирована в Федеральной службе по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам [1].

3.3. Моделирование клеточных процессов в норме

Для моделирования клеточных процессов в норме в качестве входных данных нами были использованы ГДХ, начальные состояния которых в дихотомической модели рассматривались как активные. Для некоторых ГДХ отсутствовала информация об их регуляции другими генами или белками,

поэтому, для этих генов значения параметра а1 (уравнение 1) были взяты таким образом, чтобы обеспечивалась постоянная активность данных генов.

Для того, чтобы убедиться, что все взаимодействия между вершинами могут быть задействованы при моделировании, максимальное число шагов траектории было выбрано большим, чем количество вершин в исследуемой сети (2500 шагов).

В результате моделирования при активных начальных состояниях ГДХ с 14 по 19 шаг и с 15 по 20 шаг траектории белок СОК1 и комплекс Сус1ш А:СОК1 активны, соответственно (Рис.1). Однако, после 20-го шага участники клеточного цикла остаются неактивными, клетка не входит в М фазу клеточного цикла (комплекс СусНп В:СОК1 неактивен).

24 23 26 27 28 29 30

BID ВАК

CYTOCHROME С CASPASE-3 CASPASE-9 CASPASE-7 CASPASE-5 CASPASE-2

Рисунок 1. Результат моделирования нормальных клеточных процессов при активных начальных состояниях ГДХ. Представлены состояния белков клеточного цикла и их комплексов, отвечающих за переход по фазам клеточного цикла, а также белки апоптоза, активация которых является индикатором необратимости данного процесса. Строки соответствуют белкам, колонки соответствуют шагам траектории; ячейка таблицы отражает активное (1) или неактивное (0) состояние белка на определенном шаге. Активные состояния выделены серым цветом.

Белок Р57К1Р2, который ингибирует различные комплексы СЭК2, ответственные за вход и продвижение по Б-фазе, становится активным с четвертого шага, что согласуется с известной информацией об участии Р57К1Р2 в процессах регуляции клеточного цикла (ВогпеПо е1 а1., 2011). Как видно из рис. 1, каспазы (СаэраБе-г, -3, -6, -7, -9) и цитотохром С, активация которых необратимо переводит клетку в апоптоз (\Vyllie, 2010), неактивны. Таким образом, результаты моделирования не противоречат известным процессам в клетках в покое (Сарисо е/ а!., 2003, \УуШе, 2010, ВогпеПо е/ а/., 2011).

3.4. Моделирование патологических процессов

Моделирование патологических процессов было проведено для каждой из четырех групп данных для РМЖ: (1) НЕИ2/пеи положительной карциномы молочной железы, (2) карциномы протоков, (3) инвазивной карциномы протоков и/или узловых метастазов и (4) генерализированного РМЖ. Для моделирования было также выбрано 2500 шагов, чтобы все вершины при моделировании могли быть пройдены. Результат моделирования для генерализированного РМЖ представлен на рис. 2.

Z 2 3 4 5 6 7 8 13 14 15 16 17 18 19 20 21 0 0 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

CYCUN Е CDK2 0 0 и и o^ngiSy о о оНВ 1 _1 1111 1111 0 1 л 0 0 0 0 0 0 о| 0 0 0 -i 0 0 0 0 0 ^■и и #0 0 0 0 0 s ши 0 0 0 0 0 11 0 ■ 0 0 о| ¡

CYCUN E:CDK2 0 0 0 0 0 0 0 ■ 0 0 0 0 0 ■ 1 0 0 0 ■ 0 0 0 0 • 0 0 0 0 0 0 0

HISTONE Н1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 -X ■ ■ 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 Е в 0 0 0 0 0 0 0 И 0 0 0

CDK1 0 0 0 0 оЩ Ш оЩ 0 0 0 0 0 0 0 0 ■ о 1° й 0 11 ■ 0 0 0 1 0 ■ 0 J а 1 [о

CYCUN А:СОК1 0 0 0 0 0 о] ■ГоВ 0 0 0 0 0 0 0 оШ 0 оИ i 0 0 0 0 и

CYCUN Bl:CDKl 0 0 0 0 0 0 0 0 шшшш .1 ■ 1 ■ 1 ■ оЩ 0 ■ оЩ 0 0 ■ Г®1 оИ 0 0 0 0 lo 0 [i 0 1 1

CYC LOSOME 0 о о о оЩ _г! -Í «нН |о ■ 0 0 ш 01 _ _0! 1 0 о] 0

CYCUN В1 0 ■ л оШоо 0 0 0 0 0 о| ! 0 0 0 0 о| 0 ~ó¡ 0 1 0 I

Р107 0 ЯШ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ^шшшшшшш 0 Mi 0 0 0 0 0 щ 0 и■ 0 0 0 0 шл 0 0 0 и

P19INK4D P57KIP2 0 V : 1 0 0 0 0 0 0 -Л. 0 0 0 ш 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ш 0 н 0 н 0 н 0 0 ■ 0 н 0 ШЛ 0 0 шл 0 ■ш 0 0 0

АКТ ВАХ DA XX 0 0 0 1111111111 1 1 11 11-1 1 11 11111 11.111 1111 11 1.1 Й - Л ш щ J

CASPASE-8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

ею »1 ■■о 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

ВАК 0 (>■■ о 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

CYTOCHROME С 0 0 0 0 0 0 о 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

CASPASE-3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

CASPASE-9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

CASPASE-7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 о| ■ ■ 1 1 1 1 0 0 0 0 0 «■ 0 0 0 0 ■ 0 0 0 0 0 0 0

CASPASE-6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

CASPASE-2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Рисунок 2. Результат моделирования патологических процессов при генерализированном РМЖ. Представлены состояния наиболее важных для клеточного цикла и апоптоза белков. Строки соответствуют белкам, колонки соответствуют шагам траектории; ячейка таблицы отражает активное (1) или неактивное (0) состояние белка на определенном шаге. Активные состояния выделены серым цветом.

Входные данные для начальных состояний моделирования содержат пять гиперэкспрессированных ГДХ: EZRIN, NDKA, PIN1, PRDX1 и RHOGDI-1. Состояния двадцати четырех генов были определены как постоянно гиперэкспрессированные (значения параметра ai обеспечивали постоянную активность данных генов), поскольку они не могут продуцировать самих себя в модели в связи с недостатком информации об их регуляции. Несмотря на то, что один из ингибиторов клеточного цикла pl9INK4D постоянно активен - комплексы клеточного цикла в модели периодично активируются. Cyclin E:CDK2 активен с 9 по 14 шаг, а с 21 шага и далее активен на каждом пятом шаге. Cyclin A:CDK1 и Cyclin B1:CDK1 активны с 7 по 10 шаг и с 9 по 16 шаг, соответственно. Комплекс Cyclin A:CDK1 и комплекс Cyclin B1:CDK1 периодически активизируются не более чем через каждые два шага, начиная с 20-ого шага и с 21-ого шага, соответственно. Белок АКТ, способствующий выживаемости клеток с помощью негативной регуляции апоптотического белка р53 (Hers I. et al., 2011), остается активным с третьего шага траектории.

Результаты моделирования для всех рассмотренных типов РМЖ показали, что участвующие в апоптозе белки являются неактивными, комплексы Cyclin/CDK и основные факторы роста, принадлежащие к белковым семействам ERBB, EGFR и VEGFR, наоборот, находятся в активном состоянии. Поведение Cyclin/CDK для рассматриваемых типов РМЖ в модели отличается периодичностью активации: чем более инвазивен вид опухоли, тем чаще происходит повторение фаз клеточного цикла, что согласуется с известными данными о метастазировании опухолей (Hanahan и Weinberg, 2011).

3.5. Идентификация фармакологических мишеней

Идентификация фармакологических мишеней для терапии РМЖ в рамках развитого нами дихотомического подхода происходит следующим образом: используя регуляторную сеть и данные об экспрессии генов при РМЖ в качестве входных данных, происходит расчет траектории, и выполняется проверка наступления определенного события. Если в процессе моделирования, при инактивации какой-либо вершины или комбинации вершин, наступает выбранное исследователем желаемое событие - в данном случае были выбраны: (1) остановка клеточного цикла и (2) стимуляция апоптоза, - то такая вершина или комбинации вершин могут рассматриваться как перспективные фармакологические мишени, воздействие на которые может быть использовано для терапии данного вида опухоли. Этот процесс поиска происходит до тех пор, пока не будет осуществлен перебор всех

комбинаций инактивируемых вершин. Ниже рассмотрены результаты выявления перспективных мишеней для терапии РМЖ для каждого из выбранных событий.

3.5.1. Остановка клеточного деления

В качестве желаемого события нами было выбрано блокирование комплексов Cyclin/CDK, т.к. их ингибирование ведет к остановке клеточного цикла как in vivo, так и in vitro (Sharma et al., 2008). Комплексы Cyclin/CDK могут быть блокированы напрямую или опосредованно через активацию или ингибирование других вершин, поэтому в качестве желаемых событий нами было выбрано блокирование Cyclin D1:CDK4 и Cyclin D1:CDK6 (Gl фаза); Cyclin E:CDK2 и Cyclin A:CDK2 (Gl/S фаза, S фаза), Cyclin B:CDK1 (G2/M фаза). Для выявления мишеней, ингибирование которых приводит к инактивации комплексов Cyclin/CDK, была произведена инактивация вершин сети по одной поочередно, и было проверено, дает ли ингибирование той или иной вершины желаемое событие. Как видно из Таблицы 1, для блокирования комплексов Cyclin A:CDK2 и Cyclin E:CDK2, были найдены: CYCE, CYCLIN Е, CDK2, PLK1 и АКТ-1.

Нами не было найдено мишеней, влияние на которые приводит к инактивации комплекса Cyclin B1:CDK1, за исключением киназы SYK. Недавно было показано (Singh et al., 2009), что мутации, активирующие К-Ras, часто присутствуют в опухолях и увеличивают экспрессию SYK киназы в некоторых клеточных линиях рака легких и поджелудочной железы. Также показано, что ингибиторы SYK влияют на суппрессию опухолевого роста В-клеток (Ruzza et al., 2009).

Нами не было найдено нетривиальных комбинаций мишеней, блокада которых ведет к одновременному ингибированию всех комплексов циклин-зависимых киназ. Однако PLK1 и АКТ-1 могут быть интересными мишенями в связи с тем, что их комбинация с циклинами и циклин-зависимыми киназами не столь очевидна, и их функционирование оказывает влияние на переход между фазами клеточного цикла в норме и при патологиях (Lindqvist et al., 2009).

Таблица 1. Результаты идентификации перспективных мишеней для терапии РМЖ.

Событие Механизм НЕН2/пеи положительная карцинома молочной железы Карцинома протоков молочной железы Пнвазивная карцинома протоков молочной железы н/нлн узловые метастазы Генерализированный РМЖ

Ингибнрованне клеточного цикла Инактивация СусНп 01:С0К4, СусНпШ:СОК6 (01 фаза) СУСШ, СУСЫЫ

Инактлвация СусНп Е:СЭК2 (01/8 фаза), СусНп А:С0К2 (8 фаза) СУСЕ, СУСЫИ Е, С0К2, Р1Ж1, АКТ-1

вУК - -

Инактивация СусНп В:С0К1 (вШ фаза) 5УК - - -

Активация апоптоза Высвобождение цитохрома С ВСЬ-2

- - ЯАР-1, бив-г, РКС, 11АСК1 интегрин «5р1, фибронектин

Активация каспазы-3 МКК4, Р13К, МККб, Р38АЬРНА, СККЦ НРК1

- - УЕвР-А, УЕСРЯ-2, Н1Р-1 АЕРНА,УЕСР -

3.5.2. Стимуляция апоптоза

В качестве желаемых событий были выбраны (1) высвобождение цитохрома С; (2) активация каспазы-3, так как данные события приводят к апоптозу - запрограммированной гибели клеток (Sykes et al., 2007; Gupta et al., 2009).

3.5.2.1. Высвобождение цитохрома С. В результате моделирования для генерализированного РМЖ снижение уровня экспрессии фибронектина, либо инактивация интегрина a5ß, приводят к активации цитохрома С, а, следовательно, и к апоптозу, в то время как инактивация RAF-1, GRB-2, РКС или RACK1 приводит к апоптозу при инвазивной карциноме протоков молочной железы и/или узловых метастазов. Белок BCL-2 был выявлен в качестве потенциальной мишени для всех рассматриваемых видов опухолей

молочной железы.

3 5 2.1. Активация каспазы-3. Инактивация белков, ответственных за

рост кровеносных сосудов VEGF-A, VGFR-2, HIF-1 ALPHA и VEGF, приводит к активации каспазы-3 при инвазивной карциноме протоков молочной железы и/или узловых метастазов. В литературе показана эффективность ингибирования факторов роста кровеносных сосудов при инвазивных опухолевых процессах (Bischoff и Ignatov, 2010). В Таблице 2 приведены общие мишени, найденные для всех рассматриваемых видов опухолей: МКК4, PI3K, МКК6, РЗ8ALPHA, CRKL и НРК1.

3.6. Верификация метода

Валидация результатов моделирования и выявления перспективных фармакологических мишеней была осуществлена путем моделирования инактивации найденных мишеней в норме с использованием ГДХ. Ингибирование практически всех выявленных мишеней приводит к апоптозу только при наличии патологии, за исключением МКК4, МКК6 и BCL-2. Это может быть связано с неполнотой имеющихся данных о регуляции клеточного цикла. Ингибирование МКК4 и МКК6 может быть разрушительно для клетки, т.к. данные киназы являются важными проводниками клеточных сигналов при ее нормальном функционировании (Remy et al. 2010; Haeusgen et al, 2011). Инактивация BCL-2 также ведет к инициации апоптоза через цитохром С по пути катепсина В. Однако, цитохром С становится неактивным с 20-го шага и остается неактивным по 2500 шаг.

Верификация алгоритма была осуществлена посредством использования случайно сгенерированных списков гипер- и гипоэкспрессированных генов. При этом не было выявлено ни одной

мишени. Это позволяет предполагать, что разработанный нами алгоритм выявляет те мишени, которые действительно важны для регуляции и сигнализации клеточных процессов, и наши результаты не являются результатом случайного выбора.

Выявленные мишени были нами проанализированы с использованием ьд Integnty (http://www.prous.com/integrity/) по разрабатываемым лекарственным препаратам. Были найдены одиннадцать мишеней для которых известны препараты, используемые в клинике. Препараты для двенадцати выявленных мишеней относят к группе для терапии РМЖ Для четырех мишеней: Rackl, МКК6, CRKL, НРК1 информация о разрабатываемых лекарственных препаратах и соответствующих терапевтических группах не обнаружена.

3.7. Поиск и экспериментальная валидация перспективных фармакологических мишеней для клеточной линии MCF-7 РМЖ 3.7.1. Поиск перспективных фармакологических мишеней для достижения синергетического эффекта с противоопухолевым веществом Rita

Селивановой Г. с сотр. из Каролинского института (Швеция) экспериментально показано, что в клеточных линиях MCF-7 после инкубирования с низкомолекулярным соединением Rita 0,1 мкмоль/л происходит остановка клеточного деления, а при 1 мкмоль/л Rita инициируется апоптоз. Апоптоз также возникает в клеточной линии MCF10A, которая является экспериментальной моделью нормальных клеток молочной железы. В связи с этим, необходимо найти дополнительную мишень и соответствующий лиганд, который проявит синергичный эффект с Rita, что приведет к апоптозу опухолевых клеток, не оказывая существенного влияния на нормальные. Для этого при дихотомическом моделировании были использованы списки гипер- и гипоэкспрессированных генов клеточной линии MCF-7 после инкубирования с Rita 0,1 мкмоль/л В результате комплексы Cyclin/Cdk были неактивны, что согласуется с информацией о действии Rita 0,1 мкмоль/л на клеточные линии MCF-7 Для идентификации перспективных мишеней, нами были выбраны события-активация каспазы 3, 7 или 6, а также высвобождение цитохрома С (Таблица 2). Ьыли выявлены мишени как для клеточной линии MCF-7 так и для четырех типов РМЖ: РЗ8ALPHA, BCL-2, PI3K, МКК4, CRKL, НРК1.

Таблица 2. Результаты идентификации перспективных мишеней для клеточной линии РМЖ MCF-7, инкубированной с Rita 0,1 мкмоль/л.

Событие Механизм Мишени для клеточной линии MCF-7 с Rita 0,1 мкмоль/л

Активация каспазы-3 P38ALPHA, CIAP-2

я ел о н Высвобождение цитохрома С BCL-2, P38ALPHA

о с « к Активация каспазы-7 P21CIP1, PI3K, RAF-1, РАК1, JAK2, МЕК1, МЕК2, МККЗ, INSR, ERK2, P21WAF1, CIAP-2

я я Активация каспазы-6 МК.К4, PI3K, RAF-1, РАК1, ТАК1, IAK2, МЕК1, МЕК2, МКК6, P38ALPHA, INSR, CRKL, ERK2, CIAP-2, НРК1

3.7.2. Валндация найденных мишеней в эксперименте

Отобранные коллегами (Д. А. Филимонов, А. А. Лагунин, А. В. Захаров и Г. Селиванова) на основе предсказаний PASS (Filimonov и Poroikov, 2008), одиннадцать химических структур были протестированы на трех опухолевых клеточных линиях РМЖ (MCF7, SkBr и MDA-MB231) и на MCF10A (норма) Г. Селивановой с сотр. в Каролинском институте (Швеция). Молекулы CPI и CPII ингибировали рост опухолевых клеток, но не воздействовали на нормальные клетки. Молекула CPU показала свой ингибирующий рост эффект на клеточных линиях меланомы, в то время как молекула CPI оказывала влияние на все три клеточные линии РМЖ. Было показано наличие синергетического действия молекулы CPI в комбинации с Rita на ингибирование опухолевых клеток без влияния на рост клеточной линии MCF10A (норма). Эти данные позволяют предполагать, что CPI может рассматриваться как потенциальное соединение для разработки нового противоопухолевого препарата. Г.Селивановой с сотрудниками был проведен анализ экспрессии генов при инкубировании клеточной линии MCF-7 с CPI, с CPI+Rita и отдельно с Rita с использованием технологии микрочипов. Была выявлена пониженная экспрессия ряда генов, в том числе p38alpha, HIF-1 alpha, МКК4, которые были выявлены нашим методом в качестве перспективных противоопухолевых мишеней.

В рамках проекта Net2Drug с помощью программы GeneXplain (Kel et al., 2011) А. Келем с сотр. при инкубирования клеточной линии MCF-7 с Rita+CPI были найдены промотеры гипоэкпрессированных генов, отвечающих за выживание клетки и идентифицированы транскрипционные

14

факторы, участвующие в их регуляции. Среди них оказались PI3K и АКТ которые были найдены нашим методом (Таблицы 1 и 2). Таким образом' результаты нашего метода согласуются с результатами выявления ключевых мишенеи с помощью GeneXplain, и не противоречат экспериментальным данным при инкубировании клеточной линии MCF-7 с Rita+CPI.

3.7.3. Моделирование блокады и активации комбинации

противоопухолевых мишеней, предсказанных PASS

Нами было проведено моделирование и анализ комбинаций мишеней лиганды к которым являются аналогами Rita, CPI и CPII. Комбинации мишеней для каждого лиганда были отобраны по их наличию в регулярной сети^ Всего для дихотомического моделирования было отобрано 37 тройных комбинаций, где 13 комбинаций приводили к апоптозу во всех четырех типах РМЖ. Данные комбинации содержат белок BCL-2, предсказанный нашим методом в качестве перспективной мишени (см. раздел 3.5.2). Блокада ряда комбинаций приводила к остановке клеточного цикла в некоторых типах РМЖ. Активация комбинации цитокинов, отвечающих за межклеточные взаимодеиствия {IFNa, M-CSF, TNF} приводила к блокированию клеточного деления только в генерализированном РМЖ. Эта комбинация является нетривиальной, т.к. влияние на эти белки в комбинации не было нами найдено в литературе. Активация или блокада других комбинаций белков не приводила ни к блокированию клеточного деления, ни к инициации апоптоза при этом моделирование показывало последовательную активацию комплексов Cyclin/CDK.

Результаты показали, что наш метод применим для предсказания возможного механизма совместного действия аналогов Rita и CPI.

выводы

1. В результате сбора и анализа информации о регуляции клеточного цикла, экспрессии белков в нормальных и опухолевых клетках, была составлена сеть, состоящая из 1405 вершин (генов и белков) и 2336 взаимодействий, ответственных за регуляцию клеточного цикла в норме и при раке молочной железы. Полученная сеть и списки гипер- И гипоэкспрессированных генов были использованы в качестве входных

данных для дихотомической модели.

2. Разработан и реализован в виде компьютерной программы NetFlowEx метод выявления перспективных противоопухолевых мишеней базирующийся на дихотомическом моделировании регуляторных сетей с использованием данных об экспрессии генов.

3. Разработанный метод был провалидирован с использованием доступных данных об экспрессии генов в норме и при раке молочной железы. Результаты моделирования согласуются с известными процессами регуляции клеточного цикла в норме и при онкопатологии.

4. Применение метода идентификации фармакологических мишеней для четырех типов рака молочной железы выявило как общие, так и специфические для каждого типа значимые мишени. Низкомолекулярные соединения к выявленным мишеням проявили противоопухолевую активность на клеточных линиях карциномы молочной железы (MCF-7, SkBr и MDA-MB231), но не оказывали влияния на клеточную линию MCF10A (норма).

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Коборова О.н, Поройков В.В., Филимонов Д.А Кель АЭ Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ NetFlowEx №2011617330 от 21.09.2011 г., Москва, Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам.

Статьи в рецензируемых журналах:

2. Koborova O.N., Filimonov D.A., Zakharov A.V., Lagunin A.A., Ivanov S M Kel A., Poroikov V.V. In silico method for identification of promising anticancer drug targets // SAR and QSAR Environ. Res. 2009. Vol. 20 (7-8) P. 755-766.

3. Коборова O.H., Филимонов Д.А., Захаров A.B., Лагунин A.A., Кель А Колпаков Ф„ Кондрахин Ю.В, Шарипов Р., Поройков В в' Моделирование регулярных сетей для выявления противоопухолевых мишенеи на примере рака молочной железы // Информационный вестник ВОГиС. 2009. Т. 13 (1). С. 201-207.

4. Коборова О.Н., Филимонов Д.А., Захаров A.B., Лагунин A.A., Кель А Колпаков Ф„ Кондрахин Ю.В., Шарипов Р., Поройков В.В. Выявление противопухолевых мишеней с использованием биоинформационных технологии // Рос. биотерапевт, журн. 2008. Т. 7(2). С. 54-56

Материалы трудов конференций:

5. Poroikov V.V., Lagunin A.A., Koborova O.N., Filz O.A., Filimonov D A In suico Screening and rational design of multitargeted drugs // Abstr 5-th Moscow Conference on Computational Molecular Biology (MCCMB 11)

Moscow, Russia, 2011. P. 290.

6. Поройков B.B., Коборова O.H., Лагунин A.A., Филимонов ДА Компьютерные методы поиска препаратов для лечения заболеваний мутифакториальной природы // Мат. докл. Второй Всероссийской научно-практической конф. с межд. уч. «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии». Курск, 2011. С. 342-344

7. Коборова О.Н., Опарина Н.Ю., Филимонов Д.А., Лагунин A.A., Кель А Поройков В.В. Поиск противоопухолевых мишеней на основе регуляции' клеточного цикла // Мат. докл. XVI Рос. нац. конгресса «Человек и лекарство». Москва, 2010. С. 638.

8. Коборова О.Н., Филимонов Д.А., Захаров A.B., Лагунин A.A., Кондрахин Ю.В., Поройков В.В. Компьютерный поиск перспективных мишеней для терапии рака молочной железы // Мат. докл. XV Рос. нац. конгресса «Человек и лекарство». Москва, 2009. С. 534.

9. Kohorova O.N., Filimonov D.A., Zakharov A.V., Lagunin A.A., Poroikov V.V. Finding of molecular targets and their ligands for breast cancer therapy // Abstr. 4-th Moscow Conference on Computational Molecular Biology

(MCCMB 09). M„ 2009. P.172-173.

10. Kohorova O.N., Filimonov D.A., Zakharov A.V., Ivanov S.M., Poroikov V.V., Kel A. In silico method for identification of promising anticancer targets // Abstr. Fifth International Symposium on Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources. Istanbul, Turkey, 2009. P.60.

11 Kohorova O.N.. Filimonov D.A., Zakharov A.V., Lagunin A.A., Kel A., Kolpakov F. Sharipov R., Kondrachin Y„ Poroikov V.V. Modelling of regulatory networks to indentify promising drug targets for breast cancer therapy // Abstr. 6-th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure. Novosibirsk, 2008. P. 118.

12. Kohorova O.N., Filimonov D.A., Zakharov A.V., Lagunin A.A., Poroikov V.V. Method of perspective target analysis for breast cancer therapy // Abstr. 4-th International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine". Moscow-Nizhny Novgorod-Moscow, 2008. P. 37.

13. Kohorova O.N. Computer - aided prediction of promising drug targets for breast cancer // Abstr. Helmholtz-Russian-German Workshop on Systems

Biology. Moscow, 2008. P. 41.

14. Коборова O.H.. Филимонов Д.А., Захаров A.B., Лагунин А.А., Кель А., Колпаков Ф., Шарипов Р., Поройков В.В. Выявление противоопухолевых мишеней с использованием биоинформационных технологий // Мат. докл. Четвертой Междунар. конф. «Постгеномные технологии разработки противоопухолевых агентов с новыми механизмами действия». Москва, 2007. С. 15.

15. Поройков В.В, Лагунин А.А., Коборова О.Н., Захаров А.В., Филимонов ДА. Компьютерный поиск противоопухолевых препаратов множественного действия: достижения и перспективы // Мат. докл. Четвертой Междунар. конф. «Постгеномные технологии разработки противоопухолевых агентов с новыми механизмами действия». Москва, 2007. С. 24.

16. Поройков В.В., Лагунин А.А., Кобооова О.Н., Захаров А.В., Филимонов Д.А. Роль био- и хемоинформатики в создании лекарств, действующих на множественные мишени // Мат. докл. Четвертого Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 2007. С. 396-397.

17. Коборова О.Н., Захаров А.В., Шарипов Р., Колпаков Ф.А Кель А Поройков В.В. Возможности предсказания перспективных фармакологических мишеней на примере регуляторного пути E2F/PRB для рака молочной железы // Мат. докл. Четвертого Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2007. С. 405.

18. Koborova O.N., Zakharov A.V., Lagunin А.А., Filimonov D.A Kel A Kolpakov F., Sharipov R„ Poroikov V.V. Computer-aided prediction of prom,sing anti-tumor targets taking into account information about probable side effects // Abstracts of the Fourth International Symposium on Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources. Москва, 2007. P. 109.

19. Poroikov V.V., Koborova O.N., Zakharov A.V., Lagunin A.A., Filimonov D.A., Gloriozova T.A., Sharipov R„ Kolpakov F„ Milanesi L„ Kel A Targetmg cell cycle: old and new stories in anticancer therapy // Abstr 4th Eurasian Meeting on Heterocyclic Chemistry. Thessaloniki, Greece 2006

Подписано в печать. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 Экз. Заказ № А710 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.2 8 Тел. 8-495-782-88-39

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коборова, Ольга Николаевна, Москва

61 12-3/1300

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ В. Н. ОРЕХОВИЧА» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи

КОБОРОВА Ольга Николаевна

ПОИСК ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ МИШЕНЕЙ ДЛЯ ТЕРАПИИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ НА ОСНОВЕ КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

03.01.09 - Математическая биология, биоинформатика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В. В. Поройков кандидат физико-математических наук,

Д. А. Филимонов

Москва-2012

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ....................................................................................................2

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................10

1.1. Общие принципы регуляции клеточного цикла в норме.......................10

1.1.1. Клеточный цикл.......................................................................................12

1.1.2. Контроль клетки за прохождением клеточного цикла........................18

1.1.3. Апоптоз.....................................................................................................20

1.2. Признаки опухолевой клетки....................................................................23

1.3. Патологические механизмы, ведущие к возникновению и прогрессии рака молочной железы......................................................................................24

1.4. Классификация рака молочной железы....................................................31

1.5. Регуляторные сети......................................................................................33

1.6. Методы анализа регуляторных сетей.......................................................41

1.6.1. Статические методы анализа регуляторных сетей..............................41

1.6.2. Динамические методы анализа регуляторных сетей...........................44

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...........................................................57

2.1. Сеть регуляции клеточного цикла............................................................57

2.2 Данные об экспрессии генов в норме и при раке молочной железы.....59

2.3. Программа выявления перспективных фармакологических мишеней ^Бк^Ех...........................................................................................................60

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ................................................65

3.1. Анализ информации о регуляции клеточного цикла, экспрессии белков в норме и при раке молочной железы.............................................................65

3.2. Метод дихотомического моделирования регуляторных сетей..............67

3.3. Моделирование клеточных процессов в норме.......................................72

3.4. Моделирование патологических процессов............................................74

3.5. Идентификация фармакологических мишеней......................................77

3.5.1. Остановка клеточного деления..............................................................79

3.5.2. Стимуляция апоптоза..............................................................................81

3.6. Верификация метода..................................................................................83

3.7. Поиск и экспериментальная валидация перспективных фармакологических мишеней для клеточной линии MCF-7 рака молочной железы.................................................................................................................89

3.7.1. Поиск перспективных фармакологических мишеней для достижения синергетического эффекта с противоопухолевым веществом Rita..............89

3.7.2. Валидация найденных мишеней в эксперименте.................................92

3.7.3. Моделирование блокады и активации комбинации противоопухолевых мишеней, предсказанных PASS....................................95

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................104

ВЫВОДЫ.........................................................................................................106

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................107

ПРИЛОЖЕНИЕ................................................................................................127

А. Список генов/белков/белковых комплексов регуляторной сети...........127

Б. Список гипер- и гипоэкпрессируемых генов для четырех групп рака молочной железы.............................................................................................151

1. Генерализированный рак молочной железы.............................................151

2. НЕ112/пеи-положительная карцинома молочной железы........................154

3. Карцинома протоков молочной железы....................................................155

4. Инвазивная карцинома протоков молочной железы и/или узловые метастазы..........................................................................................................155

ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ

Сигнальная (регуляторная) сеть - сеть, узлы которой характеризуют молекулярные биологические объекты (белки, гены, РНК, эндогенные метаболиты и др.), а ребра - функциональные взаимодействия между этими объектами. Биологическая сигнальная (регуляторная) сеть отражает химические процессы, посредством которых клетки определяют и реагируют на изменения окружающей среды. Такая сеть отражает регуляцию различных клеточных процессов, например, процессы деления или гибели клеток.

Регуляторные мотивы - подграфы биологической сети, которые встречаются чаще, чем в случайно сгенерированных сетях.

Эффектор - молекула (низкомолекулярное соединение, белок, РНК), которая присоединяется к белку и изменяет его активность.

«ВМап» мотивы - мотивы регуляторной сети, которые состоят из регуляторов, влияющих на одинаковое количество эффекторов.

Регулятор - молекула (низкомолекулярное соединение, белок, РНК), которая регулирует или контролирует активность другой молекулы. В генетике регулятор соответствует гену, который кодирует белок, способный репрессировать или активировать экпрессию другого гена.

Антимитогены - факторы, блокирующие переход клеток из ОО-фазы к клеточному делению.

Митогены - факторы, вызывающие переход клеток из вО-фазы к клеточному делению. К митогенам относятся факторы роста.

Сигнальный (регуляторный) путь - группа молекул в клетке, которые работают вместе для управления одной или более клеточной функцией, например, деление или гибель клеток. После того, как первая молекула в пути получает сигнал, она активирует другую молекулу. Этот процесс повторяется до тех пор, пока активируется последняя молекула пути и осуществляется функция клетки в ответ на сигнал.

Клеточный сигналинг - часть сложной системы коммуникации, которая управляет основными клеточными процессами и координирует поведение клетки. Способность клеток воспринимать и правильно реагировать на их микроокружение является основой развития, восстановления тканей, иммунитета и поддержание нормального гомеостаза тканей.

Перенос сигнала - каскад процессов, с помощью которых внеклеточный сигнал (гормон или нейротрансмиттер) взаимодействует с рецептором на поверхности клетки, вызывая изменение концентрации вторичных посредников (например, кальция или циклического аденозин монофосфата) и, в конечном итоге, влияет на изменения в функционировании клетки (например, активирует деление клетки).

Технология микрочипов - технология, позволяющая производить полногеномные измерения уровня экспресии генов. Разработано множество различных типов платформ микрочипов, однако, все методы базируются на способности молекулы мРНК или кДНК специфично связываться с комплементарной ей молекулой ДНК (зондом), соответствующей последовательности исходного гена.

Уровень экспресии гена - в контексте технологии микрочипов — содержание транскрипта соответствующего гена в изучаемом образце.

Гиперэкспрессированный ген - в контексте данной работы - ген, экспрессия которого повышена более чем в 2 раза по сравнению с нормой.

Гипоэкспрессированный ген - в контексте данной работы - ген, эксприессия которого более чем в 2 раза пониженапо сравнению с нормой.

Гены «домашнего хозяйства» (housekeeping genes) — это гены, необходимые для поддержания важнейших жизненных функций организма, которые экспрессируются практически во всех тканях и клетках на относительно постоянном уровне. Гены домашнего хозяйства функционируют постоянно, на всех стадиях жизненного цикла организма.

ВВЕДЕНИЕ

Поиск фармакологических мишеней для терапии социально значимых заболеваний человека представляет одну из наиболее важных задач современной биоинформатики. С завершением секвенирования генома человека в начале третьего тысячеления появилась возможность исследования различных клеточных фенотипов, в том числе и опухолевых, в масштабах целого генома. Экспериментальные методы исследования геномов, транскриптомов и протеомов быстро совершенствуются параллельно с развитием аналитических компьютерных инструментов для интеграции и интерпретации полученных данных. Это позволяет исследовать все более детально механизмы опухолевых процессов на молекулярном и клеточном уровнях и строить модели, описывающие реакции опухолевых клеток на действие противоопухолевой терапии, выявлять возможные механизмы резистентности, ключевые молекулы-мишени и/или их комбинации, воздействие на которые может позволить более эффективно проводить терапию онкологических заболеваний. Системный подход повышает эффективность при отборе перспективных мишеней лекарств и уменьшает как риски для пациентов, так и финансовые издержки фармацевтических компаний при разработке противоопухолевых препаратов (Chua & Roth, 2011).

Рак - это мультифакторное заболевание, которое находится на втором месте после сердечно-сосудистых болезней по количеству смертей: примерно 7,6 миллиона человек (13%) от общего количества смертей в мире ежегодно (Beaglehole et al., 2011). Риск возникновения опухолевых заболеваний увеличивается с возрастом. Более 50% всех случаев рака выявляются у людей в возрасте 50 лет и старше. По прогнозам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) заболеваемость и смертность онкологическими заболеваниями во всем мире возрастет в 2 раза за период

с 1999 года по 2020 год: с 10 до 20 млн. новых случаев и с 6 до 12 млн. регистрируемых смертей, соответственно.

Рак молочной железы (РМЖ) у женщин, по данным Американского онкологического общества за 2011 год, находится на втором месте по количеству летальных исходов среди различных видов опухолей. Высокая смертность связана с обнаружением заболевания на поздних стадиях, а также с приобретением резистентности пациентов к противоопухолевой терапии, поэтому поиск новых фармакологических мишеней для терапии РМЖ более чем актуален.

Регуляция клеточного цикла включает в себя важнейшие процессы, имеющие решающее значение для выживания клетки, в том числе выявление и исправление генетических повреждений, а также предотвращение бесконтрольного клеточного деления. Нарушения этих процессов составляют основу патогенеза опухолевого роста. Регуляцию клеточных процессов часто представляют как сеть, которая отражает теоретическую абстракцию биохимических реакций и межмолекулярных взаимодействий в клетке. Существуют различные подходы к анализу и моделированию поведения сети. Статические методы анализа дают возможность работать с обширными регуляторными сетями, исследовать топологию сети, представленную различными мотивами, но не позволяют моделировать процессы в динамике. Для динамического моделирования наиболее широко используются дифференциальные уравнения, которые применимы только к сравнительно небольшим участкам регуляторной сети, в связи с недостатком экспериментальных данных, описывающих кинетику процесса (веа ег а1, 2008; \\/и ег а1., 2012).

Несмотря на большое количество разработанных методов анализа и моделирования поведения регуляторных сетей, основной проблемой оказывается невозможность оценки влияния всей совокупности положительных и отрицательных обратных связей, что ограничивает существующие методы в поиске новых фармакологических мишеней.

Исходя из этого, очевидна необходимость разработки нового метода поиска фармакологических мишеней на основе компьютерного моделирования регуляции клеточного цикла.

Цель работы: разработать компьютерный метод выявления молекулярных мишеней для лекарственной терапии злокачественных новообразований и апробировать его на примере рака молочной железы.

Задачи исследования:

1. Собрать и проанализировать информацию о регуляции клеточного цикла, экспрессии белков в нормальных и опухолевых клетках.

2. Разработать и реализовать в виде компьютерной программы метод выявления и оценки противоопухолевых мишеней.

3. Провести валидацию предложенного метода идентификации перспективных противоопухолевых мишеней на основе доступных экспериментальных данных.

4. Применить разработанный метод к идентификации перспективных противоопухолевых мишеней для терапии опухолевых заболеваний.

Научная новизна. Впервые предложен и реализован в виде компьютерной программы №1Р1о\¥Ех метод дихотомического моделирования регуляции клеточного цикла в норме и при патологиях с целью выявления перспективных фармакологических мишеней. Впервые проведено моделирование поведения регуляторной сети, состоящей из 1405 вершин (белков) и 2336 связей между ними (взаимодействий) с использованием данных об экспрессии в норме и для четырех групп РМЖ: генерализированного рака молочной железы, НЕК2/пеи-положительной карциномы молочной железы, карциномы протоков, инвазивной карциномы протоков и/или узловых метастазов. Для терапии РМЖ выявлены значимые мишени, ингибиторы к которым проявили

8

противоопухолевую активность на трех опухолевых клеточных линиях карциномы молочной железы (MCF7, SkBr и MDA-MB231). Получено свидетельство №2011617330 от 21.09.2011 г. на регистрацию программы для ЭВМ NetFlowEx, выданное Федеральной службой по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам.

Практическая значимость. Разработанный и реализованный в программе NetFlowEx метод использован для выявления перспективных фармакологических мишеней в рамках Европейского проекта "Net2Drug — From gene regulatory networks to drug prediction". Метод может быть применен для анализа и моделирования регуляторных сетей, а также для поиска перспективных молекулярных мишеней при некоторых формах онкопатологии. Метод может быть использован в научно-исследовательских и медицинских учреждениях, работающих в областях системной биологии, молекулярной биологии и генетики, генной инженерии и др., а также применен в поиске и разработке новых лекарственных препаратов, использован в учебном процессе высших учебных заведений соответствующего профиля.

Работа выполнена при поддержке грантов Европейской Комиссии № 037590 (FP6-2005-LIFESCIHEALTH-7) и Госконтракта №07.514.11.4118.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие принципы регуляции клеточного цикла в норме

Регулирование клеточного цикла включает в себя важнейшие процессы, имеющие существенное значение для выживания клетки, в том числе выявляние и исправление генетических повреждений, а также предотвращение бесконтрольного клеточного деления. Нарушения этих процессов составляют основу патогенеза опухолевого роста. Регуляция клеточного цикла - сложный процесс, в который вовлечено множество генов, РНК и соответвующих им белков, обладающих различной активностью и специфичностью. Они являются участниками обширной сети взаимодействий, в основе регуляции которой лежит наличие многочисленных отрицательных и положительных прямых и обратных связей. На рис. 1.1 представлены примеры положительных и отрицательных прямых и обратных связей, которые в литературе также упоминаются как регуляторные мотивы сети (Ма'ауап, 2009). Положительные обратные связи, как правило, располагаются в сигнальных путях, ассоциированных с рецепторами, например, это может быть каскад MAP киназ, усиливающий сигнал, идущий от рецептора (в данном случае, увеличивающий концентрацию фосфорилированных белков для активации транскрипции необходимых генов в ответ на определенный сигнал, идущий от рецептора) (рис. 1.1, А). В отрицательные обратные связи наиболее часто вовлечены сами рецепторы, например, р2-адренергический рецептор инактивируется белковой киназой А, которая активируется через цепочку вторичных посредников, в том числе аденилил циклазу (рис. 1.1, Б). Прямые положительные связи, в основном, способствуют проведению сигнала от рецептора к ядру (рис. 1.1, В), в то время как отрицательные прямые связи препятствуют проведению сигнала (рис. 1.1, Г). Также существуют «bi-fan» мотивы, которые состоят из регуляторов, влияющих на одинаковое количество эффекторов. Примером такого мотива является

10

регуляция транскрипционных факторов ATF2 и Elk с помощью киназ JNK и р38 (рис. 1.1, Д).

Б. Отрицательная В. Положительная А. Положительная обратная связь обратная связь прямая ;связь

Р1.А2

Г. Отрицательная прямая связь

Рисунок 1.1. Примеры регуляторных мотивов в регуляторных сетях (адаптировано из (Ма'ауап, 2009)). СаМ - кальмодулин, СаЫ -кальцинеурин, АС1 - аденилил циклаза 1, АА - арахидоновая кислота, В2АЯ - (32-адренергический рецептор, II - ингибитор 1, РКА - белковая киназа А, РКС - белковая киназа С, РРI - белковая фосфатаза I, МАРК -митоген активируемая белковая киназа, РЬА2 - фосфолипаза А2, САМКИ -Са27кальмодулин-зависимая киназа II. Серые стрелки отражают компоненты мотивов, которые проводят сигнал дальше к другим элементам сети, которые не яв