Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ статуса экспрессии раково-тестикулярных генов как мишеней для терапии и профилактики онкологических заболеваний

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ статуса экспрессии раково-тестикулярных генов как мишеней для терапии и профилактики онкологических заболеваний"

На правах рукописи

Скородумова Любовь Олеговна

АНАЛИЗ СТАТУСА ЭКСПРЕССИИ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ ГЕНОВ КАК МИШЕНЕЙ ДЛЯ ТЕРАПИИ И ПРОФИЛАКТИКИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7 МАЙ 2015

МОСКВА 2015

005569493

Работа выполнена в лаборатории генной терапии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук

Научный руководитель:

Ларин Сергей Сергеевич,

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Колесников Николай Николаевич, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (ИМКБ СО РАН)

Чернов Игорь Павлович, кандидат химических наук, научный сотрудник лаборатории структуры и функций генов человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН)

Защита состоится «30» июня 2015 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д.34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук по адресу:

http://www.genebiology.ru/dissertation/dis-8/Skorodumova-dissertation.pdf Автореферат разослан «мая 2015 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук г

Г^абовская Любовь Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень её разработанности.

Опухолевые клетки характеризуются наличием генетических аберраций, которые приводят к изменению профиля экспрессии генов и появлению опухоль-ассоциированных антигенов. Одной из групп таких антигенов являются раково-тестикулярные (РТ) антигены (Hofmann О. et al., 2008; Scanlan M.J. et al, 2004). В норме они синтезируются преимущественно в зародышевых клетках человека, а аберрантно - в опухолях. В соматических зрелых тканях РТ-антигены отсутствуют, и их появление может служить молекулярным маркёром опухолевой ткани и запускать иммунный ответ. Иммунный ответ на РТ-антигены может быть запущен с помощью генно-клеточных противоопухолевых вакцин. Ранее в лаборатории генной терапии ИБГ РАН были разработаны генно-клеточные вакцины, на основе клеточных линий меланомы человека, модифицированных с использованием генов tag7 и/или GM-CSF, и экспрессирующие, в том числе, РТ-гены (Larin S.S. et al., 2004; Данилов А.О. и соавт., 2004; Mikhaylova I.N. et al., 2005; Бережной A.E. и соавт., 2006). Проведены клинические испытания данных вакцин для терапии и профилактики метастазирования меланом и рака почки (Moiseyenko V.M. et al, 2003; Моисеенко В.М. и соавт., 2004).

Потенциально данный подход может быть применим и для других видов злокачественных опухолей. Например, для рака молочной железы, который является самым распространённым онкологическим заболеванием среди женщин. Разработка иммунотерапевтических подходов, направленных на РТ-антигены, для этой группы пациентов является важной и актуальной задачей на пути борьбы за снижение смертности от злокачественных новообразований вообще и рака молочной железы в частности.

Перспективы внедрения в практическое использование методов активной специфической иммунопрофилактики и иммунотерапии злокачественных новообразований, в том числе и генно-клеточных противоопухолевых вакцин, разработанных в ИБГ РАН, делает особо актуальным вопрос о рациональной селекции пациентов-участников клинических испытаний с учётом сведений о профиле экспрессии РТ-генов в опухолях пациентов и его пересечении с таковым в составе терапевтических вакцин. В связи с этим встаёт вопрос о разработке валидированного и одобренного регистрирующим органом инструментария для оценки экспрессии раково-тестикулярных генов, поскольку таковой отсутствует на рынке медицинских изделий.

Наличие валидированной системы оценки уровня экспрессии РТ-генов позволяет обосновать не только подбор пациентов для иммунотерапии опухолей, но и возможность истинных иммунопрофилактических подходов в случае потенциально злокачественных заболеваний. Профилактических вакцин, индуцирующих

специфический иммунный ответ именно против опухолевых антигенов/клеток в настоящее время нет в практическом использовании. Таким образом, изучение фундаментальных основ специфической иммунопрофилактики опухолей на ранних стадиях её развития остаётся по-прежнему важной и актуальной задачей.

Гипотеза настоящего исследования состоит в том, что предраковые заболевания, с большей вероятностью прогрессирующие в злокачественные, будут отличаться по наличию и характеру генетических и молекулярных нарушений от тех предраковых заболеваний, которые не будут прогрессировать. Такие отличия могут стать молекулярными маркерами, которые помогут разработать наиболее оптимальную стратегию лечения и, возможно, профилактики. На примере плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта (СОПР) известно, что существуют трудности в дифференциальной диагностике плоскоклеточного рака от предраковых заболеваний СОПР (OgdenG.R. е/ а1, 2013; МеззасИ О.У. е/ а1, 2014), а также в оценке риска злокачественной трансформации каждого конкретного образования (\Varnakulasuriya Б. е! а!., 2011). Учитывая, что почти половина плоскоклеточных карцином полости рта развивается из потенциально злокачественных образований, задача поиска молекулярных маркёров повышенного риска озлокачествления является актуальной. Самым распространённым потенциально злокачественным заболеванием СОПР является лейкоплакия (ЯеШеи. е1 а!., 2003). Особенности экспрессии РТ-генов в лейкоплакии практически неизвестны. Возможно, появление мРНК РТ-генов или их продуктов, РТ-антигенов, в патологически изменённых тканях слизистой оболочки полости рта является показателем повышенного риска злокачественной трансформации.

Цели и задачи работы

В связи с вышеизложенным, целью нашей работы было изучение экспрессии РТ-генов в образцах опухолей, потенциально злокачественных заболеваний и нормальных тканей в рамках разработки метода диагностики и рационального выбора пациентов-участников клинических испытаний генно-терапевтических противоопухолевых вакцин.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Разработать и валидировать набор реагентов для молекулярно-генетической диагностики РТ-антигенов методом ПЦР

2. Сопоставить профиль экспрессии РТ-генов в образцах рака молочной железы и нормальной ткани молочной железы с набором РТ-генов в генно-клеточных противоопухолевых вакцинах «Компливак» и «Аллоген»

3. Изучить экспрессию РТ-генов в образцах нормальной ткани и плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта

4. Изучить экспрессию РТ-генов в образцах лейкоплакии слизистой оболочки полости рта.

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы

В ходе диссертационной работы Скородумовой Л.О. было выявлено, что в нормальной ткани и в лейкоплакиях слизистой оболочки полости рта с низким риском злокачественной трансформации не экспрессируются РТ-гены МАвЕ-АЗ, МАОЕ-А4, МАСЕ-А6, МАСЕ-А12 и N¥-£80-1. При этом вышеперечисленные РТ-гены экспрессируются с высокой частотой в плоскоклеточном раке слизистой оболочки полости рта. Полученные результаты дают основание использовать экспрессию раково-тестикулярных генов МАОЕ-АЗ, МАОЕ-А4, МАОЕ-А6, МАОЕ-А12 и ЫУ-ЕБО-! для подтверждающей дифференциальной диагностики нормальной ткани и лейкоплакии от плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта.

В результате выполнения диссертационной работы было показано, что экспрессия раково-тестикулярных генов, входящих в состав набора «РТ-антиген», может служить критерием отбора пациентов для участия в клинических испытаниях генно-клеточных противоопухолевых вакцин, разработанных в ИБГ РАН.

Практическая значимость работы была подтверждена в ходе официальных медицинских испытаний разрабатываемого набора в трёх независимых клинических учреждениях: РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, ФГУ «ФНКЦ ДГОИ» Росздрава, ГОУ ДПО РМАПО. Апробированный набор прошёл регистрацию в Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения и социального развития «Набор реагентов для молекулярно-генетической диагностики раково-тестикулярных антигенов методом полимеразной цепной реакции (РТ-антиген)» номер регистрационного удостоверения ФСР 2010/09180 от 9 ноября 2010 года.

Таким образом, результаты представленной диссертационной работы обладают не только научной новизной, но несомненной практической значимостью как для обеспечения дальнейших научных исследований и проведения клинических испытаний новых вариантов генно-клеточных вакцин, разработанных в ИБГ РАН, так и для текущего проведения дифференциальной диагностики атипичной пролиферации слизистой оболочки полости рта и расширения потенциального спектра применения этих вакцин для отличных от меланомы видов злокачественных опухолей.

Положения, выносимые на защиту

1. Анализ экспрессии выбранного набора РТ-генов может применяться для рациональной селекции пациентов при включении в клинические испытания генно-клеточных противоопухолевых вакцинах «Компливак» и «Аллоген» для различных гистологических типах опухолей.

2. Экспрессия раково-тестикулярных генов может быть использована для дифференциальной подтверждающей диагностики нормальной ткани и лейкоплакии с низким риском злокачественной трансформации от плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта.

Личное участие автора в проведении исследований:

Автором самостоятельно выполнен основной объем экспериментов, проведены обработка и анализ полученных экспериментальных данных, подготовлен иллюстративный материал, сформулированы основные положения диссертации, составляющие её новизну и практическую значимость, а также подготовлены материалы публикаций в научных журналах. Кроме того, Скородумова Л.О. является автором и соавтором регистрационного досье «Набора реагентов для молекулярно-генетической диагностики раково-тестикулярных антигенов методом полимеразной цепной реакции (РТ-антиген)». Скородумова Л.О. являлась ключевым исполнителем со стороны ИБГ РАН при проведении технических и медицинских испытаний набора «РТ-антиген». Предварительные работы по дизайну праймеров к раково-тестикулярным генам были проведены Шепелевым М.В. Образцы тканей потенциально злокачественных, злокачественных и нормальных тканей были получены в ходе сотрудничества с докторами Мураевым A.A., Задеренко И.А., Тихоновой О.

Апробация работы

Результаты работы представлены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010), на зимней школе «Современная биология и биотехнологии будущего 2014», (Звенигород, 2014), на IX симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» II международном симпозиуме «Трансляционная и регенеративная медицина» (Москва, 2015). Разработанный в рамках диссертационной работы набор реагентов «РТ-антиген» был апробирован в медицинских испытаниях на трёх независимых клинических базах: РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, ФГУ «ФНКЦ ДГОИ» Росздрава, ГОУ ДПО РМАПО.

Публикации

По результатам диссертационной работы опубликованы 5 печатных работ, из них 4 в российских рецензируемых журналах из перечня ВАК РФ и одни тезисы доклада на российской конференции.

Структура и объем диссертации

Диссертация построена по традиционному принципу и включает разделы: ведение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы. Материал диссертации изложен на 133 листах машинописного текста, содержит 25 рисунков и три приложения. Библиографический список включает 230 работ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка набора реагентов для молекулярно-генетической диагностики экспрессии РТ-генов методом полимеразной цепной реакции

В рамках диссертационной работы был разработан и зарегистрирован в Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации «Набор реагентов для молекулярно-генетической диагностики раково-тестикулярных антигенов методом полимеразной цепной реакции (РТ-антиген)».

Набор предназначен для качественного определения наличия РНК, кодирующих РТ-гены, в гистологическом материале, клеточных линиях и первичных клеточных культурах, полученных из опухолевых тканей пациентов. Наличие кДНК определяется методом ПЦР с детекцией продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза в агарозном геле.

РТ-гены, отобранные для набора из 276 известных РТ-генов, имели следующие характеристики: экспрессировались в меланомах, экспрессировались в других типах опухолей, для кодируемых РТ-генами антигенов показана иммуногенность. Далее была исследована экспрессия выбранных РТ-генов (MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-А6 MAGE-A10, MAGE-A12, гены семейства BAGE, гены семейства GAGE, NY-ESO-1) в клеточных линиях меланом, входящих в состав вакцин «Компливак» (клеточные линии 1, 2, 3) и «Аллоген» (клеточная линия MelP). Результаты этого анализа приведены в Таблице 1.

Таблица 1 — Экспрессия РТ-генов в клеточных линиях вакцин «Аллоген» (клеточная линия Ме1Р) и «Компливак» (клеточные линии 1,2,3), где «+» - экспрессия обнаружена, «-» — экспрессия не обнаружена.

Название клеточной линии Название раково-тестикулярного гена

MAGE-АЗ MAGE-А4 MAGE-Аб MAGE-А10 MAGE-А12 BAGE MAGE-В1 MAGE-B2 GAGE2, GAGE3, GAGE4 LAGE-1а NY-ESO-1

Клеточная линия 1 + + + + + + + + + + +

Клеточная линия 2 + + + + + + - + + - +

Клеточная линия 3 + + + + + + - + + - -

Ме1Р + - + - + - - + - - -

Было выяснено, что все выбранные гены экспрессируются в клеточных линиях вакцин и могут быть использованы для создания набора реагентов.

С помощью полнотранскриптомного (поли-А РНК) секвенирования клеточной линии MelP (Михайлова И.Н. и соавт.. Патент RU 2287575), входящей в состав вакцины «Аллоген», была изучена представленность РТ-генов, выбранных для создания набора реагентов, среди всех известных РТ-генов. Исследование было проведено в трёх повторах, вычислено среднее значение относительного уровня экспрессии для каждого РТ-гена (RPKM — reads per kilobase of exon per million of reads - число прочтений на тысячу пар оснований экзона на миллион прочтений). В 103 генах значение среднего RPKM было больше нуля. Транскрипты генов, выбранных для набора реагентов (MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A12), экспрессируются с наибольшей интенсивностью по отношению к большинству известных РТ-генов (Рисунок 1).

Уровень экспрессии в RPKM

О 50 100 150 200

РТ-гены с уровнем экспрессии > О

Повтор 2 _ Повтор 3

ьр о-0 & .У" ^ ///

Рисунок 1 - Представленность транскриптов РТ-генов, выбранных для набора реактивов (МАвЕ-АЗ, \1AGE-A4, \1AGE-A6, МЛСЕ-АЮ, МАСЕ-А12, ВАСЕ) среди транскриптов всех РТ-генов, экспрессируюшихся в клеточной линии Ме1Р.

Таким образом, экспрессию генов, широко представленную в клетке, можно детектировать при выполнении небольшого количества циклов ПЦР (20-30). При детекции в агарозном геле сигнал наличия специфического ПЦР-продукта будет присутствовать в ожидаемом диапазоне длин ДНК-фрагментов, а «шумы» (неспецифическая амплификация) будут отсутствовать.

Была разработана нормативная документация для регистрации набора: лабораторный и опытно-промышленный регламент, технические условия. По

9

результатам подготовки нормативных документов был установлен состав набора реактивов и правила его использования.

В состав набора входят праймеры для исследования экспрессии раково-тестикулярных генов MAGE-A3; MAGE-A4; MAGE-A6; MAGE-А10; MAGE-A12; GAGE2-GAGE8; NY-ESO-1; LAGE-la; BAGE2 и BAGE3. Данный набор содержит также праймеры к гену GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase - НАД-зависимая глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа), что дает возможность проводить качественную оценку выделенной из исследуемых образцов РНК. Для подтверждения правильной работы набора в его состав включены два положительных контрольных образца, представляющих собой раствор ПЦР-фрагментов. Положительный контрольный образец 1 используется при проведении ПЦР с праймерами к гену GAPDH для оценки качества исследуемой РНК. Положительный контрольный образец 2 используется при проведении ПЦР с праймерами к РТ-генам. В качестве отрицательного контроля используется вода.

Были проведены технические испытания трёх серий набора реагентов на контрольных образцах, согласно требованиям нормативных документов и инструкции. В ходе испытаний оценивалась специфичность и чувствительность набора. Пример испытания пары праймеров к гену GAPDH приведен на Рисунке 2. Чувствительность набора реагентов «РТ-антиген» составила от 102 копий матрицы (при 38 циклах амплификации) до 105 копий матрицы (при 26 циклах амплификации).

Рисунок 2 - Электрофореграмма технических испытаний набора реагентов «РТ-антиген», где

«К+» - положительный контрольный образец 1, «К-» - отрицательный контрольный образец, «КОЧ1» - контрольный образец чувствительности тш «-f-250 П.Н. 1, «КОЧ2» - контрольный образец

чувствительности 2, «КОС» - контрольный К+ К- коч1коч2кос образец специфичности, М - маркер

молекулярного веса ДНК.

праймер 0 (GAP)

Затем были проведены медицинские испытания на биообразцах, полученных от пациентов. В ходе данных испытаний контролировалась воспроизводимость результатов в заявленных типах биологических образцов пациентов с подтвержденным диагнозом. Медицинские испытания включали 3 этапа, в ходе первого из них тестировалась работа набора на разном типе биообразцов: биопсийных образцах злокачественных новообразований (рака молочной железы, плоскоклеточного рака СОПР) и клеточных линий меланомы. На втором этапе испытывали набор на образцах злокачественных опухолей (рака молочной железы, плоскоклеточного рака СОПР, меланома, аденокарциномы кишечника) и образцах

доброкачественных новообразований (полипах кишечника, лейкоплакии СОПР, доброкачественных опухолях молочной железы, невусах).

Экспрессия хотя бы одного РТ-гена была детектирована у 12 из 15 пациентов с диагнозом рак, и только у одного пациента из группы доброкачественных заболеваний (NY-ESO-1 у пациента с фиброаденомой молочной железы). Было подтверждено, что наличие экспрессии хотя бы одного из панели РТ-генов статистически достоверно ассоциируются с опухолевыми заболеваниями (р=0.0001, двусторонний критерий Фишера). Пример результатов второго этапа медицинских испытаний приведен на Рисунке 3.

7 8 9 10 11 12 13 1« 15 к. к- к 17 18 19 20 21 И

— — — *• — - ¡»ISO». — — — — - - — - ■Г 250 пн GAPDH

_ «а — _ — — 5-250 п.н MAGE-A3

_ W2Mn» — Ш-250ПН MAGE-A4

пи. MW5E-A6

ш — ¿»гюг.*.

_ _ w-гзол н 250 ПН MAGEA10

- - н 0-26ОПМ •750 ПН - Щ-250ПН. «Г250ЛН Ш-250ПМ MAGE-A12 GAGE2-GAGE8 NY-ESO-1

I «м MV

— — 1»250ли — в».. LAGE-1а

т — ■ 1,250»- - BAGE2, BAGE3

Рисунок 3 - Электрофореграммы результатов второго этапа медицинских испытаний набора реагентов «РТ-антиген» на образцах злокачественных и доброкачественных новообразований, где «К+» - положительный контроль, «К-» - отрицательный контроль, 7-12 -образцы меланом, 13-15 - образцы плоскоклеточного рака СОПР, 16 - образец фиброаденомы

I молочной железы, 17-19 - образцы полипов прямой кишки, 20-22 - невусы кожи, «+» и «-» -положительная и отрицательная пробы реакции обратной транскрипции, «М» — маркер молекулярного веса ДНК.

В ходе третьего этапа медицинских испытаний тестировалась специфичность анализа экспрессии РТ-генов набором реагентов «РТ-антиген» в биопсийных образцах злокачественных образований (РМЖ, карциномы прямой кишки, меланомы, плоскоклеточный рак слизистой оболочки полости рта) с помощью капиллярного секвенирования последовательностей ПЦР-фрагментов. Консенсусные последовательности всех ПЦР-фрагментов имели высокий уровень гомологии (от 93% до100%) с последовательностями кДНК РТ-генов. Эти значения подтвердили специфичность анализа экспрессии РТ-генов с помощью набора «РТ-антиген». Таким образом, третий этап испытаний был успешно выполнен, и закончена экспериментальная часть процесса регистрации набора реагентов.

После представления всех нормативных документов, проведения успешных технических и медицинских испытаний приказом № 10362-Пр/10 от 09 ноября 2010 года Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации было разрешено производство, продажа и применение изделия медицинского назначения «Набора реагентов для молекулярно-

генетической диагностики раково-тестикулярных антигенов методом полимеразной цепной реакции (РТ-антиген)» на территории Российской Федерации (Регистрационное удостоверение № ФСР 2010/09180 от 09 ноября 2010 года).

Итогом разработки стал валидированный набор реагентов, который можно использовать для воспроизводимых и контролируемых научных исследований экспрессии РТ-генов, но, что самое главное, он необходим для использования в клинических испытаниях разработанных ранее противоопухолевых вакцин, так как в соответствии с современными требованиями к клиническим испытаниям, все тесты должны быть одобрены Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФЗ №323-Ф3 "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации").

2. Исследование экспрессии раково-тестикулярных генов в образцах рака молочной железы

Рак молочной железы — гетерогенное заболевание. На основании стандартных биомаркеров не всегда удается определить наилучший метод лечения и предсказать течение болезни. Ранее было показано, что экспрессия РТ-генов ассоциируется с принадлежностью к группе тройных негативных опухолей и более высокой злокачественностью (Theurillat J.P. et al, 2007; Grigoriadis A. et al, 2009; Matkovic B. et al, 2011; Lian Y. et al, 2012). Таким образом, РТ-антигены могут стать мишенями, диагностика и использование которых повысит точность прогноза. Кроме того, разработка новых иммунотерапевтических подходов может стать терапией выбора для пациентов с раком молочной железы, в том числе и для группы плохого диагноза — пациентов с «тройным негативным» фенотипом опухоли. Таким образом, разработка диагностических и иммунотерапевтических подходов с использованием РТ-генов и РТ-антигенов является актуальной проблемой.

Ранее в ИБГ РАН были разработаны генно-клеточные противоопухолевые вакцины «Компливак», и «Аллоген», экспрессирующие набор РТ-генов. Перспективы применения этих вакцин для лечения больных с раком молочной железы не ясны, так как исследования экспрессии РТ-генов у российских пациенток до настоящего времени не проводились. В связи с этим был сопоставлен профиль экспрессии РТ-генов в образцах рака молочной железы и нормальной ткани молочной железы с набором РТ-генов в генно-клеточных противоопухолевых вакцинах.

2.1. Исследование экспрессии раково-тестикулярных генов в образцах

нормальной ткани молочной железы

С помощью набора реагентов «РТ-антиген» была исследована экспрессия РТ-генов MAGE-A3, -А4, -А6, -А10, -А12, GAGE2-GAGE8, NY-ESO-1, LAGEla, BAGE2 и BAGE3 в трёх образцах нормальной ткани молочной железы. По литературным данным экспрессия выбранных РТ-генов в нормальной ткани молочной железы

12

отсутствует. Ни в одном из образцов нормальной ткани молочной железы нами не было детектировано экспрессии РТ-генов, что говорит об отсутствии ложноположительных результатов.

2.2. Исследование экспрессии раково-тестикулярных генов в образцах рака

молочной железы

После того, как мы убедились, что подобранные нами условия анализа позволяли адекватно оценивать экспрессию РТ-генов в образцах ткани молочной железы, с помощью набора реагентов «РТ-антиген» был исследован 41 образец рака молочной железы. На Рисунке 4 приведен пример результатов исследования экспрессии РТ-генов в образцах рака молочной железы.

1.1 2.1 3.1 4.1 5.1 6.1 7.1 8.1 9.1 М Название гена

к+ к- + + + + + + + + +

— — — — — — — — — — ■•-250 п.н. GAPDH

— «W «■•-250 п.н. MAGE-A3

— — *Ц-250 п.н MAGE-A4

— — f*-250 п.н. MAGE-A6

— — »250 п.н. MAGE-A10

— laf-250 п.н. MAGE-A12

— ё-250 п.н GAGE2-GAGE8

— — — — 0-250 п.н NY-ESO-1

я» — 9-250 п.н BAGE2, BAGE3

Рисунок 4 - Электрофореграммы результатов исследования экспрессии РТ-генов в образцах рака молочной железы, где «К+» - положительный контроль, «К-» - отрицательный контроль, «1.1»-«9.1» - образцы рака молочной железы, «+» и «-» - положительная и отрицательная пробы реакции обратной транскрипции, «М» - маркер молекулярного веса ДНК.

Результаты исследования экспрессии РТ-генов в образцах рака молочной железы суммированы в Таблице 2.

Название гена Количество образцов, экспрессирующих ген Частота экспрессии гена, % Частота экспрессии гена по данным литературы, %

MAGE-A3 7 17,1 10-14

MAGE-A4 11 26,8 4-13

MAGE-A6 7 17,1 15

MAGE-A10 5 12,2 7,6

MAGE-A12 9 22,0 9

GAGE2-GAGE8 4 9,8 8-26

NY-ESO-1 17 41,5 10,1-54,8

LAGE-1а 2 4,9 3,1-5,4

BAGE2, BAGE3 2 4,9 2-10

В результате нашей работы были впервые получены данные о частоте экспрессии РТ-генов MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, GAGE2-GAGE8, NY-ESO-1, LAGE la, BAGE2 и BAGE3 при раке молочной железы населения Российской Федерации. Значения частоты экспрессии генов MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12 отличались от тех, что описаны в литературе Значения частоты экспрессии генов NY-ESO-1, BAGE2, BAGE3, LAGEla, GAGE2-GAGE8 были сходны с литературными данными (SahinU. et al., 1998; MashinoK. et al, 2001; OtteM. et al., 2001; MischoA. et al. 2006; Taylor M. et al,. 2007).

2.3. Сопоставление профиля экспрессии РТ-генов в образцах рака молочной железы с набором РТ-генов клеточных линий противоопухолевых вакцин «Компливак» и «Алл о ген» Поливалентные вакцины, разработанные в ИБГ РАН, содержат набор РТ-генов, и все из них экспрессировались в исследованных образцах рака молочной железы (Рисунок 5).

Рисунок 5 - Сопоставление профиля экспрессии РТ-генов в образцах РМЖ и в клеточных линиях, входящих в состав вакцины «Компливак» и «Аллоген», на диаграммах отражена доля образцов, в которых профиль экспрессии РТ-генов комплементарен набору РТ-генов в соответствующей клеточной линии.

Анализ доли пациентов, которые имеют профиль экспрессии РТ-генов, перекрывающийся с каждой из клеточных линий вакцин, подтвердил важность комбинации нескольких клеточных линий в вакцине. Противоопухолевая вакцина «Аллоген» состоит только из клеточной линии Ме1Р. Набор РТ-генов, экспрессирующихся в ней, пересекается с профилем экспрессии РТ-генов лишь у 56% потенциальных пациентов-участников. Противоопухолевая вакцина «Компливак» является поливалентной и содержит в своем составе несколько клеточных линий, поэтому ей можно охватить всех пациентов, потенциальных участников испытаний, которые имеют экспрессию хотя бы одного РТ-гена из панели набора реагентов «РТ-антиген».

Всего экспрессия хотя бы одного из исследованных генов была детектирована в 27 из 41 образца (65,7%). Количество генов, экспрессировавшихся у каждого пациента, приведено на Рисунке 6.

■ О Я1 Я2 3 Я 4 ■5 ШЬ Ш7 И8 Число генов, экспрессировавшихся у пациента

Рисунок 6 - Распределение пациентов по количеству РТ-генов из панели набора реактивов (экспрессия у каждого отдельного пациента).

Таким образом, у 15 пациентов с раком молочной железы отсутствуют РТ-антигены, которые есть в клеточных линиях вакцин. Введение такому пациенту клеток вакцины, на которых экспрессируются РТ-антигены, вызвало бы формирование клеточного и гуморального иммунного ответа против РТ-антигенов. Так как на опухолевых клетках отсутствуют РТ-антигены, антигенспецифические клетки не смогли бы их распознать и лизировать. В связи с этим, участие данных пациентов в клинических испытаниях противоопухолевых вакцин «Компливак» или «Аллоген» было бы малоэффективным, и, следовательно, нецелесообразным.

Наличие экспрессии РТ-генов из панели набора реагентов «РТ-антиген» обеспечивает перекрёст в антигенном профиле клеток вакцины и клеток опухоли пациента, а значит, увеличивается вероятность того, что антигенспецифические клетки будут эффективно воздействовать на клетки опухоли. Показанная в настоящей работе высокая частота экспрессии РТ-генов при раке молочной железы обусловливает целесообразность дальнейших исследований потенциала противоопухолевых вакцин, содержащих РТ-антигены, для иммунотерапии российских пациенток с различными клиническими формами рака молочной железы. В связи с этим также можно заключить, что есть все основания для применения набора реагентов «РТ-антиген» для отбора пациентов для иммунотерапии рака молочной железы на основании экспрессии РТ-генов.

3. Результаты исследования экспрессии раково-тестикулярных генов в образцах лейкоплакии и плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта

3.1. Экспрессия раково-тестикулярных генов в образцах нормальной слизистой оболочки полости рта

Лейкоплакия является предраковым заболеванием, которое развивается из нормальной ткани и, в свою очередь, может трансформироваться в рак. Частота экспрессии РТ-генов была исследована с помощью набора реагентов «РТ-антиген» в каждом из этих состояний. По результатам учёта ПЦР в 15 образцах нормальной СОПР, экспрессия всех исследованных РТ-генов отсутствовала (Рисунок 7).

1H 2H 3H 4H 5H 6H 7H 8H 9H 10H 11H 12H 13H 14H 15H Название гена

K+ K- + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - M

— — - — — - — - — — — — — — — — —250 П.Н. GAPDH

— e-250 П.Н. MAGE-A3

- —250 п.н. MAGE-A4

— —250 n.H. MAGE-A6

1- —250 n.H. MAGE-A10

- —250 п.н. MAGE-A12

- —250 n.H. GAGE2-GAGE8

— —250 n.H. NY-ESO-1

- —250 n.H. BAGE2, BAGE3

Рисунок 7 - Электрофореграммы результатов исследования экспрессии РТ генов в образцах нормальной СОПР, где «К+» - положительный контроль, «К-» - отрицательный контроль, «1Н»-«15Н» - образцы нормальной СОПР, «+» и «-» - положительная и отрицательная пробы реакции обратной транскрипции. «М» - маркер молекулярного веса ДНК.

3.2. Экспрессия раково-тестикулярных генов в образцах плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта

С помощью набора реагентов «РТ-антиген» была исследована экспрессия РТ генов M AGE-A3, -A4, -А6, -А10, -А12, GAGE2-GAGE8, NY-ESO-1, BAGE2 и BAGE3 в 16 образцах плоскоклеточного рака СОПР. В образцах плоскоклеточного рака СОПР экспрессировались гены MAGE-A3 (в 10-ти образцах, 62,5%); MAGE-A4 (в 8-ми образцах, 50%); MAGE-A6 (в 9-ти образцах, 56,3%); MAGE-A10 (в 2-х образцах, 12,5%); MAGE-A12 (в 9-ти образцах, 56,3%); GAGE (в 2-х образцах, 12,5%); NY-ESO-1 (в 6-ти образцах, 37,5%) (Рисунок 8). В целом, гены семейства MAGE-А экспрессировались с наибольшей частотой, а гены семейств GAGE, BAGE — с наименьшей. Эти закономерности согласуются с данными литературы (Kienstra М.А. et al., 2003; Atanackovic D. et al., 2006; Figueiredo D.L. et al., 2006; Ries J. et al., 2008; Ries J. et al. 2009).

к+к- 1Р + - 2Р + - ЗР + - 4P + - 5Р + - 6Р + - 7Р + - 8Р + . ЭР + - ЮР + - 11Р + - 12Р + - 13Р + - 14Р + - 15Р + - 16Р + - M Название гена

- — — — — — — — — — — — — — »250 п.н. GAPDH

- «я* — - - - - - - - ( • ш-250 п.н MAGE-A3

- - — -- - — — - п.н. MAGE-A4

- - — - — - - - - - -»-250 п.н MAGE-A6

- - —-250 п.н. MAGE-A10

- - - - — — — — w-250 п.н MAGE-A12

- •»-250 п.н GAGE2-GAGE8

- W-250 п.н NY-ESO-1

- —250 п.н. BAGE2. BAGE3

Рисунок 8 - Электрофореграммы результатов исследования экспрессии РТ генов в образцах плоскоклеточного рака СОПР, где «К+» - положительный контроль, «К-» -отрицательный контроль, «1Р»-«16Р» - образцы плоскоклеточного рака СОПР, «+» и «-» -положительная и отрицательная пробы реакции обратной транскрипции, «М» - маркер молекулярного веса ДНК.

Частота экспрессии раково-тестикулярных генов MAGE-A10 и GAGE2-GAGE8 низкая, поэтому вычисление ассоциации для данных генов нецелесообразно. Напротив, частота экспрессии генов MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A12, NY-ESO-1 высокая, и наличие экспрессии хотя бы одного из данных генов достоверно ассоциировалось с плоскоклеточным раком полости рта (р=0.0002, р=0.0024, р=0.0008, р=0.0008, р=0.0177 соответственно; двунаправленный критерий Фишера). Таким образом, возможно применение набора «РТ-антиген» для верификации диагноза рака СОПР.

3.3. Результаты исследования экспрессии раково-тестикулярных генов в образцах лейкоплакии слизистой оболочки полости рта

Экспрессия РТ-генов MAGE-A3, -А4, -А6, -А10, -А12, GAGE2-GAGE8, NY-ESO-1, BAGE2 и BAGE3 была исследована в 15 образцах лейкоплакии СОПР (Рисунок 9). Среди образцов лейкоплакии СОПР можно было выделить группу образцов с низким риском злокачественной трансформации (простые лейкоплакии 1Л, 2Л. 4Л, 6J1, 7JI, 8Л, 9J1, 11 Л, 15JI) и группу лейкоплакий с повышенным риском озлокачествления (веррукозные лейкоплакии 3J1, 5Л, 12JI, 13JI, 14JI и эрозивно-язвенная ЮЛ). Экспрессия исследованных РТ-генов полностью отсутствовала в образцах лейкоплакии с низким риском злокачественной трансформации. Из группы лейкоплакий с повышенным риском озлокачествления только в одном образце 13Л была обнаружена экспрессия РТ-генов MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12. Этот образец относится к типу веррукозных лейкоплакий, которые имеют более высокий риск трансформации в плоскоклеточный рак СОПР, чем простые лейкоплакии (Warnakulasuriya S, el al. 2007). Экспрессия РТ-генов в

данном типе лейкоплакии отражает более выраженные молекулярные изменения, сопровождающие развитие веррукозной лейкоплакии.

1Л 2Л ЗЛ 4Л 5Л 6Л 7Л ЗЛ 9Л ЮЛ 11Л 12Л 13Л 14Л 15Л Название гена

к» к- M —.250 ли GAPDH

— — —250 лн MAGE-A3

— — —250 п.н. MAGE-A4

- — «•■250 пн. MAGE-A6

— — «»250 пн MAGE-A10

mm —■250 П.н MAGE-A12

_ —250 П.н GAGE2-GAGE8

■в —250 пн NV-ESO-1

—250 пн BAGE2. BAGE3

Рисунок 9 - Электрофореграммы результатов исследования экспрессии РТ генов в образцах лейкоплакии СОПР, где «К.+» - положительный контроль, «К-» - отрицательный контроль, «1Л»-«15Л» - образцы лейкоплакии СОПР, «+» и «-» - положительная и отрицательная пробы реакции обратной транскрипции, «М» - маркер молекулярного веса ДНК.

С помощью двунаправленного критерия Фишера был проведен статистический анализ частоты экспрессии РТ-генов MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A12, N Y-ESO-1 в плоскоклеточном раке СОПР и в лейкоплакии СОПР с низким риском озлокачествления (9 образцов). Отсутствие экспрессии данной панели РТ-генов достоверно ассоциировалось с принадлежностью образца к лейкоплакии с низким риском злокачественной трансформации (р<0.0001).

Полученные результаты показывают возможность использования теста на экспрессию вышеперечисленных РТ генов в качестве молекулярных маркеров плоскоклеточного рака СОПР у лиц с лейкоплакией. Наше исследование подтверждает целесообразность введения такого анализа в клиническую практику.

На основании полученных результатов нельзя однозначно сказать, о каких молекулярных нарушениях может говорить экспрессия РТ-генов в предраковом заболевании. Лейкоплакия СОПР является проявлением нарушения процесса деления клеток - гиперплазией и/или дисплазией. Возможно, что повышенная активность камбиальных элементов эпителия приводит к экспрессии РТ-генов. Например, это подтверждается экспрессией гена MAGE-A1 в заживающей кожной ране (Becker J.C. et al, 1994). Прослеживается тенденция, что чем больше клетки похожи на зародышевые, тем чаще в них экспрессируются РТ-гены. Это верно и для опухолевых клеток: чем они меньше дифференцированы, тем выше в них экспрессия РТ-генов. Для рака легкого, мочевого пузыря и меланомы показана ассоциация экспрессии РТ-генов с повышенной степенью злокачественности и худшим прогнозом (Gure А.О. et al., 2005; Velazquez Е.F. et al., 2007; Bergeron A. et al., 2009). Все эти сведения являются теоретическими предпосылками того, что экспрессия РТ-генов в лейкоплакии могла бы быть прогностическим маркёром повышенного риска

19

злокачественной трансформации в плоскоклеточный рак. Выяснить наличие прогностического значения экспрессии РТ-генов для оценки риска злокачественной трансформации лейкоплакии возможно только в результате объёмных лонгитудинальных исследований. Обнаруженная в данной работе экспрессия РТ-генов в лейкоплакии подтверждает уместность и целесообразность проведения таких исследований в дальнейшем. На данном этапе выявление экспрессии РТ-генов в лейкоплакии СОПР указывает на необходимость более частого клинического обследования конкретного пациента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Раково-тестикулярными генами называются гены, которые экспрессируются зародышевыми клетками человека и не экспрессируются в соматических зрелых тканях, но аберрантно активируются в различных злокачественных образованиях. Их продукты, РТ-антигены, являются иммуногенами и вызывают развитие гуморального и клеточного ответа. Так как экспрессия РТ генов в нормальных тканях ограничена, а семенники являются иммунопривилегированным органом, то РТ-антигены могут рассматриваться как биомаркеры и перспективные мишени для иммунотерапии.

Рак молочной железы является самым распространенным злокачественным новообразованием у женщин в Российской Федерации. Несмотря на достижения диагностики и терапии, рецидивирование рака молочной железы остается актуальной проблемой. Рациональным подходом к снижению частоты рецидивов рака молочной железы после первичного лечения является иммунотерапия. В ИБГ РАН были разработаны генно-клеточные противоопухолевые вакцины «Аллоген» и «Компливак», содержащие в себе клеточные линии, которые экспрессируют РТ-гены. Перспективы их применения для пациентов с РМЖ неизвестны. Так как возможность использования РТ-содержащих вакцин в значительной степени определяется частотой экспрессии РТ-генов опухолевыми тканями, она была исследована в образцах рака молочной железы.

Показано, что профиль экспрессии раково-тестикулярных генов в образцах рака молочной железы (MAGE-A3 (17,1%), MAGE-A4 (20,1%), MAGE-A6 (14,6%), MAGE-A10 (8,5%), MAGE-A12 (15,9%), NY-ESO-1 (31,7%), BAGE2 и BAGE3 (4,8%), LAGEla (3,6%), GAGE2-GAGE8 (7,3%)) комплементарен набору РТ-генов, экспрессирующихся в клеточных линиях генно-клеточных противоопухолевых вакцин «Аллоген» и «Компливак». Таким образом, была теоретически обоснована возможность применения вакцин «Компливак» и «Аллоген» для лечения пациентов с раком молочной железы.

В ходе диссертационной работы был разработан и зарегистрирован в Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения и социального развития

Российской Федерации «Набор реагентов для молекулярно-генетической диагностики раково-тестикулярных антигенов методом полимеразной цепной реакции (РТ-антиген)», который может быть использован для отбора пациентов при включении в клинические испытания вакцин «Аллоген» и «Компливак».

С целью поиска молекулярных маркеров повышенного риска злокачественной трансформации лейкоплакии СОПР с помощью разработанного в ходе диссертационной работы набора реактивов «РТ-антиген» была впервые в Российской Федерации изучена экспрессия раково-тестикулярных генов в образцах нормальной ткани, плоскоклеточного рака и лейкоплакии СОПР. Было выяснено, что в нормальной ткани и в группе лейкоплакий СОПР с низким риском злокачественной трансформации не экспрессируются раково-тестикулярные гены МАвЕ-АЗ, МАОЕ-А4, МАСЕ-А6, МАОЕ-А12 и ЫУ-Е80-1, ОАСЕ2-САСЕ8, ВАОЕ2 и ВАОЕЗ. Экспрессия МАСЕ-АЗ, МАСЕ-А4, МАОЕ-А6, МАОЕ-А12, ЫУ-ЕБО-1 достоверно ассоциировалась с плоскоклеточным раком СОПР. Отсутствие экспрессии генов МАОЕ-АЗ, МАОЕ-А4, МАОЕ-А6, МАОЕ-А12, ЫУ-Е80-1 в образце слизистой оболочки полости рта достоверно указывало на то, что исследуемый образец является либо нормальной тканью, либо лейкоплакией с низким риском злокачественной трансформации. Полученные результаты позволяют рассматривать РТ-гены в качестве молекулярных маркеров плоскоклеточного рака СОПР при проведении подтверждающей дифференциальной диагностики нормальной ткани и лейкоплакии СОПР от плоскоклеточного рака СОПР. Для ее проведения может быть использован разработанный набор «РТ-антиген».

Так как ни один вид активного лечения лейкоплакии СОПР не способен предотвратить рецидивирование или малигнизацию, становится целесообразным изучение возможности применения иммунотерапевтических подходов для профилактики рецидивов и злокачественной трансформации лейкоплакии. В качестве одного из таких подходов можно рассматривать генно-клеточные противоопухолевые вакцины «Аллоген» и «Компливак», содержащие в своем составе РТ-антигены.

Таким образом, результаты представленной диссертационной работы привели к созданию валидированной тест-системы для определения экспрессии РТ-генов, позволили предложить новый метод диагностики лейкоплакии СОПР и плоскоклеточного рак СОПР, а также вплотную приблизиться к проведению клинических испытаний новых вариантов генно-клеточных вакцин, в том числе и для нового спектра гистотипов опухолей.

выводы

1. Разработан, валидирован и зарегистрирован в Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения и социального развития «Набор реагентов для молекулярно-генетической диагностики раково-тестикулярных антигенов методом полимеразной цепной реакции (РТ-антиген)».

2. Показана комплементарность спектра экспрессии РТ-генов в образцах рака молочной железы и в клеточных линиях, входящих в состав противоопухолевых вакцин «Компливак» и «Аллоген», что делает возможным рациональную селекцию пациентов при включении в клинические испытания только носителей указанных антигенов.

3. Частоты экспрессии РТ-генов MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A12, N Y-ESO-1 в нормальной ткани и плоскоклеточном раке слизистой оболочки полости рта достоверно различались, и наличие экспрессии хотя бы одного из этих РТ-генов ассоциировалось с плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта.

4. Отсутствие экспрессии РТ-генов MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A12, N Y-ESO-1 в образце лейкоплакии слизистой оболочки полости рта статистически значимо ассоциировалось с принадлежностью к форме с низким риском злокачественной трансформации.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах из перечня ВАК РФ:

1. Скородумова JI.O.. МураевА.А., Володина Е.В., Иванов С.Ю., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Ларин С .С. Молекулярные маркеры риска злокачественной трансформации лейкоплакии слизистой оболочки полости рта // Вопросы онкологии. - 2012. - Т.58.- №3. - Стр. 327-332.

2. Скородумова Л.О.. Мураев A.A., Захарова Е.С., Шепелев М.В., Коробко И.В., Задеренко И.А., Иванов С.Ю., Гнучев Н.В. , Георгиев Г.П. , Ларин С.С. Изучение экспрессии раково-тестикулярных генов в образцах лейкоплакии и плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта // Вопросы онкологии.

- 2012. - Т.58,- №4. - Стр. 486-492.

3. Скородумова Л.О.. Мураев A.A., Володина Е.В., Иванов С.Ю., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Ларин С.С. Лейкоплакия слизистой оболочки полости рта: классификация, гистопатология, методы диагностики и лечения // Вопросы онкологии. - 2013.- №5. - Стр. 548-554.

4. Скородумова Л.О.. Лукашина М.И., Сальникова Л.Е., Тихонова O.A., Иванов С.Ю., Ларин С.С. Исследование экспрессии раково-тестикулярных генов в образцах рака молочной железы // Доклады Академии наук. - 2013.,

- №6. - Стр. 694—696,

Тезисы конференций:

Скородумова Л.О.. Захарова Е.С., Мураев A.A., Иванов С.Ю., Задеренко И.А., Шепелев М.Ю., Коробко И.В., Ларин С.С. Изучение экспрессии раково-тестикулярных антигенов в образцах лейкоплакии и плоскоклеточного рака ротовой полости. Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010», г. Москва.

\ ^

Подписано в печать 13.05.15

Печать трафаретная Заказ №367 Тираж:101экз.

Типография ООО "КОПИМАСТЕР"

119049, г. Москва, Калужская площадь, дом 1, корпус 1 Телефон:8 (495) 229-56-62