Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Стволовые клетки в популяции культивируемых клеток колоректальной карциномы человека

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Стволовые клетки в популяции культивируемых клеток колоректальной карциномы человека"

Давыдов-Синицын Александр Петрович

Стволовые клетки в популяции культивируемых клеток колоректальной карциномы человека

Специальность: 03.03.04 — Клеточная биология, цитология, гистология.

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7ФЕ В 2014

Санкт-Петербург 2014

005545467

005545467

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук (Санкт-Петербург)

Научный руководитель: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Толкунова Елена Николаевна

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии РАН, старший научный сотрудник

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кудрявцев Борис Николаевич

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии РАН,

заведующий Лабораторией клеточной патологии

доктор биологических наук Тиллиб Сергей Владимирович

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена РАН,

заведующий Лабораторией молекулярных биотехнологий

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится » марта 2014 года в 13 часов на заседании

Диссертационного совета Д002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу:

194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, д.4

Сайт института : http://www.cvtspb.rssi.ru

Электронная почта: cellbio@incras.ru

Факс: (812) 297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН. Автореферат разослан <<"2с>» февраля 2014 года.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.В. Каминская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. По данным Всемирной организации здравоохранения, ежегодно в мире выявляется 10 млн. новых случаев онкологических заболеваний, которые уносят более 7,5 млн. жизней в год. Рак кишечника по частоте встречаемости занимает третье место в структуре онкологических заболеваний в России и в мире.

В настоящее время развивается концепция раковых стволовых клеток (РСК), согласно которой главную роль в развитии злокачественных новообразований играет небольшая субпопуляция раковых клеток, обладающая характеристиками стволовых клеток. Рядом авторов показано, что РСК отличаются от основной массы дифференцированных раковых клеток способностью к асимметричному делению, неограниченному самовоспроизведению и дифференцировке, меньшей скоростью пролиферации, высокой активностью репаративных систем, экспрессией некоторых маркеров стволовых клеток и длиной теломер (Bonnet, Dick, 1997; Jessup, Thomas, 1998; Al-Hajj et al., 2004; Xu et al., 2009). Высокая устойчивость РСК к повреждающим воздействиям, в том числе к ионизирующему излучению и цитотоксическим веществам, позволяет им переживать радио- и химиотерапию и воссоздавать опухоль после лечения, сводя результаты лечения на нет. Дифференцирующиеся раковые клетки, в отличие от стволовых, активно размножаются, но при этом уменьшается их устойчивость к повреждающим воздействиям и теряется возможность неограниченного самовоспроизведения.

Сходство РСК со здоровыми тканевыми стволовыми клетками позволяет предположить общность их происхождения. Накапливаются экспериментальные доказательства возможности злокачественной трансформации мультипотентных взрослых стволовых клеток и их более коммитированных потомков в раковые стволовые клетки (Iluntly et al., 2004; Matsiii et al., 2008; Zhu et al., 2009).

Изучение особенностей и возможности регулирования пролиферации РСК при возникновении различных видов рака — актуальнейший вопрос современной молекулярной онкологии. Углубление наших знаний в области РСК будет способствовать разработке новых, более эффективных противоопухолевых препаратов, направленных против низкодифференцированных клеток, которые в сочетании с существующими хирургическими и химическими подходами позволят бороться с раковой опухолью на всех уровнях её развития.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось создание опухолевой клеточной культуры, в которой возможно как накопление стволового компонента, так и его прицельное уничтожение, не затрагивающее дифференцированные опухолевые клетки, а также проверка гипотезы о значимости транскрипционного фактора Oct4 в обеспечении стволовых свойств раковых клеток.

В работе были поставлены следующие задачи:

• Внедрить в геном клеток линии MIP101 и её производных трансгенную конструкцию, несущую селективный маркер и ген чувствительности к антибиотику под контролем промотора Oct4 (т.н. суицидальная кассета).

• Получить клеточные популяции, обогащенные по стволовому компоненту, за счёт активности суицидальной кассеты в раковых стволовых клетках.

• Провести уничтожение раковых стволовых клеток в культуре путём обработки клеточной культуры предшественником цитотоксического препарата, который переходит в токсичную форму в клетках с активной суицидальной кассетой.

• Оценить свойства полученных популяций, обогащённых по стволовым клеткам либо лишённых стволового компонента, в сравнении с исходными.

• Осуществить подавление раковых стволовьix клеток in vivo в развивающейся опухоли.

Основные положения, выносимые на защиту

• В культуре клеток колоректального рака MIP101 с помощью суицидальной генетической конструкции можно выделить субпопуляцию, отличающуюся высоким уровнем транскрипции с промотора Oct4, а также удалять эти клетки из популяции in vitro и in vivo.

• Выделенные клетки обладают повышенной клоногенностью и туморогенностью в сравнении с исходной популяцией. Популяция, лишённая этих клеток, теряет способность формировать опухоли in vivo. Уничтожение описываемых клеток в зрелых опухолях in vivo приводит к замедлению их роста. Совокупность этих признаков позволяет считать выделенные клетки раковыми стволовыми.

• Стволовые свойства клеток MIPI01 определяются не транскрипционным фактором Oct4, но близким к нему белком, имеющим сходный цис-элемент.

Научная иовтна и практическая ценность работы. Настоящая работа посвящена проблеме раковых стволовых клеток — одной из главных стратегических проблем

современной онкологии. Результаты работы подчёркивают общность раковых стволовых и эмбриональных стволовых клеток, важную роль POU-доменных транскрипционных факторов в поддержании стволовых характеристик раковых клеток. Кроме этого, проиллюстрировано влияние клинического онкомаркера СЕЛ (раково-эмбрионального антигена) на свойства опухолевых клеток, в том числе на стволовость.

С точки зрения практики, созданная в ходе настоящей работы клеточная культура с генетически сенсибилизированным стволовым компонентом является моделью для перспективных методов лечения рака, направленных на уничтожение стволовых клеток опухоли. Результаты работы, доказывающие активность экспрессии POU-доменных транскрипционных факторов именно в стволовом компоненте опухолевой популяции, характеризуют это семейство белков как маркер раковых стволовых клеток и потенциальную мишень для генетической терапии рака.

Личный вклад автора. Автором диссертации самостоятельно выполнены большинство экспериментов, в том числе культивирование клеток, трансфекция и вирусная инфекция, операции Fia животных, выделение РНК, люциферазный анализ клеточных экстрактов, а также сбор и обработка полученных данных. Очистка вирусных препаратов выполнена совместно с к.б.н., н.с. М.А. Лпсковых (Лаборатория молекулярной биологии стволовых клеток ИИЦ РАН). ПЦР в реальном времени выполнена при содействии и под руководством к.б.н. A.B. Кропотова (Лаборатория стабильности хромосом и клеточной инженерии ИНЦ РАН).

Материалы, вошедшие в работу, обсуждались и публиковались совместно с научным руководителем и соавторами.

Апробация работы. Данные, представленные в настоящей работе, опубликованы в 3 статьях в рецензируемом журнале («Цитология»), Основные положения работы изложены в тезисах 2 конференций: форум «Молекулярная медицина - новая модель здравоохранения XXI века: технологии, экономика, образование» (Санкт-Петербург, 26—27 июня 2013 г.) и VÍ ежегодный международный симпозиум «Актуальные вопросы генных и клеточных технологий» (Москва, И —12 октября 2013 г.).

Структура и объём работы. Диссертация изложена на_страницах, содержит_

рисунков и_таблиц, состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов,

Результатов и обсуждения, Выводов и Списка литературы, включающего_источников.

Материалы и методы исследования

Объект исследования

Объектом исследования являлись культивируемые клетки карциномы прямой кишки человека MIP101. Особенностью этой клеточной линии является тот факт, что клетки MIP101 .экспрессируют рецептор CEAR (hnRNPm4 [Bajenova et al., 2003]) к раковому эмбриональному антигену (СЕЛ, СЕАСАМ5, carcinoembryonic antigen), являющемуся клиническим онкомаркером плазмы крови — но, в отличие от многих других колоректальных раковых линий, самостоятельно не синтезируют этот антиген.

В работе использовались 4 клеточные линии: базовая MIP101 (CEA-CEAR+), в дальнейшем обозначаемая как 101(A-R+) — Antigen- / Receptor+, и её производные MIP101 клон 8 с трансгенной экспрессией СЕА — 8(A+R+), клоны 101-7(A-R-) и 8-7(A+R-), в которых подавлена экспрессия рецептора CEAR методом РНК-интерференции [Thomas et al., 2011].

Для исследования стволовых качеств раковых клеток была использована разработанная в Лаборатории молекулярной биологии стволовых клеток генно-инженерная конструкция, обозначаемая как «суицидальная кассета» [Лисковых и др., 2011] (рис. 1).

start

Рис. 1. Суицидальная кассета [Лисковых и др., 2011]

Эта конструкция включает в себя ген тимидинкиназы вируса герпеса (ТК) со своим минимальным промотором, сшитый с геном устойчивости к пуромицину (Puro) через внутренний сайт посадки рибосомы (ires), и метку полиаденилирования (BOVGII рА). Перед минимальным промотором стоит сайт связывания транскрипционного фактора Oct4 (2А2В).

Если суицидальная кассета попадает в клетку, где присутствует эндогенный Oct4, то

инициируется её транскрипция. Единый транскрипт содержит две независимо

транслируемых рамки считывания: puro и Ik. Первая даёт белок, сообщающий клеткам

устойчивость к пуромицину, благодаря чему становится возможен их отбор на селективной

среде. Второй белок — вирусная тимидинкиназа, которая в числе прочих функций

способствует превращению противовирусного препарата ганцикловир

6

(9-( 1,3-дигидрокси-2-пропоксиметнл)гуанин) в аналог гуанина, блокирующий синтез ДНК. Добавление ганцнкловира в культуральную среду или ннъекция в организм приводит к гибели клеток с активной суицидальной кассетой (отсюда и её название).

Суицидальная кассета может быть внесена в клетку любым методом, но наиболее универсальным в наших условиях является лентивирусный вектор pLVTHM.

Поскольку клетки 101-7(A-R~) и 8-7(A+R-) уже несут ген устойчивости к пуромицину, для них была создана модифицированная кассета, в которой ген риго заменён на Ыа — ген устойчивости к бластпцидину.

Культивирование клеток

Все клеточные культуры содержались в культуральном ССЫшкубаторе при 37° С и 4 % СО:. Культивирование клеток линии рака прямой кишки MIP101 проводили в среде RPMI 1640 (Gibco, США), содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки (Sigma, США). Клетки пересевали с использованием готового культурального раствора трипсина (Gibco, США) 1 раз в 3 сут в отношении 1:3. Для этого из сосуда с клетками отбирали среду, три раза промывали клеточный слой стерильным PBS, затем добавляли раствор трипсина (минимальный объём, достаточный для покрытия дна сосуда) и помещали сосуд в культуральный инкубатор на 3 мин. После инкубации трипсин инактивировали путём добавления равного объёма среды с сывороткой и удаляли с помощью центрифугирования (300 g, 2 мин).

Для наработки вирусных частиц использовали клетки линии эмбриональной почки человека НЕК293Т, культивируемые в среде DMEM, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки (Sigma, США), и пересевали через каждые 3 сут в соотношении 1:4.

Кальций-фосфатная трансфекция

В основе кальций-фосфатного метода трансфекции клеток эукариот лежит свойство молекул ДНК образовывать комплексы с ионами кальция и ортофосфата, которые поглощаются клеткой.

За 18 ч до трансфекции клетки рассаживали по 2 млн на чашку диаметром 10 см. За час до проведения трансфекции меняли среду на свежую. Для каждого образца готовили 2 пробирки: 1 — для ДНК с хлоридом кальция и 2 — круглодонная пробирка с 2х буфером HBS (HBS 2х: NaCl 280 мМ, llepes 100 мМ, 1Ма:НР04 1.5 мМ). В первой пробирке смешивали ДНК (не менее 7-10 мкг) с водой в объёме 600 мкл, к раствору добавляли 200 мкл 1М раствора СаСЬ. В круглодонную пробирку добавляли 800 мкл 2*. буфера 1IBS и, держа её на шенкере, добавляли по каплям первый раствор (ДИК с хлоридом кальция). Через 10-30 мин

7

инкубирования при комнатной температуре полученную смесь с образовавшимися комплексами кальцип-фосфат-ДПК равномерно распределяли (внося по каплям) по поверхности монослоя трансфицируемых клеток (чашку при этом необходимо двигать вперёд-назад по поверхности, избегая круговых движений). Через 18 ч среду в клетках меняли на свежую, удаляя трансфекцнонную смесь. Лентивирусная инфекция

Плазмиды для лентивирусных технологий и протоколы получены из лаборатории Tronolab (http://tronolab.epfl.ch/).

Для сборки вирусных частиц клетки линии 293Т трансфицировали калышй-фосфатным методом, вводя плазмидную конструкцию на основе лентивирусного интегрирующегося вектора, а также вспомогательные плазмиды для обеспечения сборки вирусных частиц (http://tcf.epfl.cli/page-6766-en.htinl). Среду, в которой культивировали трансфшшрованные клетки, собирали в течение 48 ч после трансфекции, содержащиеся в ней вирусные частицы концентрировали ультрацентрифугированием по стандартной методике (http://tcf.epfl.ch/pai;e-6764.html).

Инфекцию раковых клеток лентивирусом проводили в 24-луночном планшете, в который за 1 сут до заражения высевали клетки линии MIP10I с плотностью 100 тыс. клеток на 1 лунку. К клеткам добавляли 10 мкл концентрированных вирусных частиц. Заражение проводили в среде для культивирования клеток линии MIP101. Через 3 сут после вирусного заражения клетки пересевали на 10-сантиметровые культуральные чашки (Falcon, США).

Обработка антибиотиками и гаицикловиром in vitro

Для отбора клеток, экспрессирующих ген устойчивости к пуромицину, в стандартную среду для MIP101 добавляли раствор пуромшщна до концентрации 30 мг/л. Культивирование клеток с антибиотиком производили в течение 10-14 сут, меняя среду каждые 2 сут. Обработка бластицидином производилась аналогично, но оптимальная концентрация составляла 20 мг/л. Обработка гаицикловиром в культуре производилась в течение 10 сут при концентрации его в среде 20 мг/л. Предварительно эти клетки содержались в среде без пуромицнна и бластицидина в течение 10 сут для накопления дифференцированных клеток.

Анализ сферообразования на нчзкоадгезивном субстрате

Анализ сферообразования клеток M1P10I на низкоадгезивном субстрате проводили в

среде DMEM-FI2 с добавлением 20 нг/мл EOF, 20 нг/мл bFGF, 1 % супилемента В27 и Iх

культуральной смеси антибиотиков. Для проведения эксперимента клетки, растущие в

монослое, обрабатывали раствором трипсина до состояния одноклеточной суспензии,

проводили подсчёт клеток в камере Горясва, после чего переносили по 100 мкл суспензии с

8

концентрацией !000кл/мл в лунки 96-луночного низкоадгезивного планшета. Через I сут добавляли по 25 мкл свежей среды того же состава, далее культивировали клетки в течение 10 сут. По окончании срока в каждой лунке подсчитывали сферы размером более 90 мкм.

Получение подкожных опухолей

Клеточные культуры обрабатывали трипсином для получения одноклеточной суспензии, после чего промывали р-ром Хэнкса три раза с осаждением на центрифуге (300 g, 3 мин). После всех промывок измеряли концентрацию клеток с помощью камеры Горяева и доводили концентрацию до 10 млн/мл. Полученную суспензию инъецировали иммунодефинитным лабораторным мышам линии Nude подкожно в область бедра по 100 мкл (1 млн клеток). Для предотвращения вытекания жидкости пглу шприца вводили с верхней стороны бедра сквозь мышцу до просвета между кожей и мышцами на нижней стороне. Каждая мышь получала по две инъекции — в правое и левое бедро.

Вырастающие опухоли измеряли каждые 10 сут, начиная с 20-х сут после инъекции. Измерения производили штангенциркулем по максимальному диаметру с точностью до 1 мм.

Получение опухолей во внутренних органах

Для моделирования печёночного метастазирования использовалось введение исследуемых клеток в селезёнку иммунодефицитных мышей Nude. Клетки приготавливали аналогично предыдущему протоколу, но конечная концентрация составляла 50 млн/мл, то есть 2.5 млн клеток в 50 мкл. Инъекцию проводили с применением лапаротомнп в стерильных условиях, все инструменты и вспомогательные материалы автоклавировали.

Мышь вводили в общий наркоз путём внутрибрюшинной инъекции авертина: раствор 2,2,2-трибромэтанола в 2-метилбутанолс 1 г/мл, рабочее разведение 1:50 в PBS, дозировка 15 мкл на 1 г массы тела (протокол, оптимизированный в Лаборатории МБСК). Через разрез на правом боку селезёнку частично извлекали из брюшной полости и помещали на стерилизованную подложку из ватмана. Суспензию клеток в культуральной среде или растворе Хэнкса (2.5 млн клеток в 50 мкл) инъецировали в толщу селезёнки с помощью микролитрового стеклянного шприца (Hamilton Microliter Syringes), после чего место инъекции прижимали стерилизованной фильтровальной бумагой для предотвращения вытекания жидкости. Затем селезёнку возвращали в брюшную полость и на место разреза накладывали шов с помощью хирургической шёлковой нити 0.08 мм и кожных зажимов 5 мм (Perfect Ets, Bruneau).

Через 90 сут после операции мышей умерщвляли путём цервикальной дислокации, после чего производили вскрытие. Селезёнки и печени осматривали невооружённым глазом

на наличие опухолей и затем фиксировали в 4%-ном растворе формальдегида в PBS для гистологического исследования.

Лечение гаицикловиром in vivo

Для исследования влияния ганцикловира на опухоли in vivo были подготовлены животные, несущие подкожные опухоли, согласно выщеописанному протоколу. Раствор ганцикловира разбавляли стерильным PBS до концентрации 2 мг/мл и использовали в дозировке 10мкл на 1 г массы тела (200 мкл на одну мышь среднего размера). Инъекции производились внутримышечно раз в сутки в течение 10 дней (с 11 -го по 20-й день после инъекции клеток).

Игмереиие люцифератой активности

Клетки трансфицировали плазмидой TOPflash, содержащей ген люциферазы светляка под контролем промотора, чувствительного к транскрипционному фактору TCF/Lef (ключевому эффектору Wnt-сигнального пути), а также второй плазмидой, содержащей ген Р-галактозидазы (для нормализации измерений). Сбор клеток производили через 2 сут после трансфекшш.

Для проведения люциферазного анализа использовался набор компании Promega (США) Bright-Glo™ Luciferase Assay. Через 2 сут после трансфекции клетки лизировали буфером Glo-Lysis, после чего 50 мкл полученного лизата смешивали с равным объёмом субстрата Bright-Glo, содержащего люцифернн. В результате в образцах происходила двустаднйная ферментативная реакция, катализируемая люциферазой. Интенсивность возникшего свечения определяли с помощью биолюминометра.

Параллельно проводили нормализацию — определение относительного содержания клеток в лунках в момент их лизирования, что необходимо для корректировки полученных при люминесцентном анализе данных. Для этого 20 мкл лизата смешивали с 60 мкл раствора, содержащего 60 мМ Na2HP04, 40 мМ NafhPOj, 10 мМ КС1, 1 мМ MgCb, 50 мМ Р-меркаптоэтанола и 20 мкл раствора, содержащего субстрат р-галактозидазы ONPG (ortho-nitrophenyl-P-galactoside) в концентрации 2 мг/мл. В течение 1 ч в пробах развивалась жёлтая окраска, интенсивность которой определяли на спектрофотометре при длине волны 420 нм. Перед определением оптической плотности реакцию останавливали внесением в пробы 50 мкл 1М раствора NajCO?. Нормализованное значение яркости свечения люциферазы определяли путем деления абсолютной яркости по прибору (в отн. ед.) на оптическую плотность после Р-галактозидазной реакции.

Выделение РНК и обратная транскрипция

Тотальную РНК in клеток-выделяли с помощью набора Quiagen RNeasy Mini Kit. После выделения РНК растворяли в стерильной воде, обработанной DEPC, измеряли её концентрацию с помощью спектрофотометра NanoDrop и доводили её до 100 нг/мкл. На каждую реакцию обратной транскрипции брали по 1мг тотальной РНК и по 500 нг олиго-дТ-праймсра. Использовались ферменты, буферные растворы и реагенты фирмы NEB. Смесь РНК, пранмера и воды общим объемом 12 мкл инкубировали 5 мин при 70°С для денатурации, затем переносили в ледяную баню. Далее в смесь добавляли смесь дНТФ (2 мкл), ингибитор РНКаз (1 мкл), 5х буфер для обратной транскриптазы (4 мкл), инкубировали 5 мин при 37° С, добавляли 1 мкл обратной транскриптазы и оставляли на 37°С в течение 1 ч. Реакцию останавливали путём нагрева до 75° С в течение 10 мин.

ПЦР в реальном времени

Для полимеразной цепной реакции в реальном времени использовалась готовая смесь QuantiTect SYBR Green PCR Kit, в которую входит интеркалирующий краситель SYBR green, термостабильная ДНК-полимераза, буфер, смесь дНТФ и хлорид магния. Реакцию проводили в объёме 20 мкл. IIa каждую реакцию брали 0.8 мкл кДНК после обратной транскрипции, праймеры в концентрации 625 нМ и 10 мкл готовой двукратной смеси. Каждую комбинацию кДНК и праймеров ставили в 3 повторностях. Реакцию производили и документировали при помощи аппарата Applied Biosystems 7500 и соответствующего программного обеспечения. Использовались следующие пары праймеров, оптимизированные для кДНК человека: Oct4-F GAA CAG ТТТ GCC ААС, CTG CTG; Ocl4-R CCG GTT ЛСЛ GAA CCA TAC TCG; GAPDII-F TGA CCT CAA СТА CAT GGT ТТЛ С; GAPDH-R СТС СЛС GAC GTA СТС AGC; b-Act-F СЛТ GTA CGT TGC ТЛТ CCA GGC; b-Act-R СТС СТТ ЛАТ GTC ACG СЛС GAT; b2m-F GGA GGC ТЛТ ССЛ GCG ТЛС ТС; b2m-R ЛСЛ TAG АЛА GAC CAG ТСС TTG С.

Экспериментальная часть и обсуждение

Онухолеобразование и метастазирование клеток MIP101

Задачей эксперимента являлась оценка способности различных производных линии MIP101 образовывать первичные и вторичные опухоли во внутренних органах иммунодефицитных животных.

Для оценки метастатического потенциала клеток мы использовали метод их инъекции в селезёнку иммунодефицитных мышей Nude. Через 3 мсс после инъекций производили вскрытие и анализ зон опухолеобразования — первичного (в селезёнке) и вторичного (в печени). Результаты эксперимента представлены в таблице 1.

Таблица 1. Частота возникновения опухолей во внутренних органах при трансплантации различных производных клеток М1Р101.

Клетки Число мышей Опухоли в селезёнке Опухоли в печени

101(А-11+) 7 : 3/7 = 42 % 0

101-7(А-Я-) : 6 0 0

К(А-К-) 9 8/9 = 89 % 1/9=11 %

8-7(Л+Я-) ; 5 1/5=20% 0

Согласно полученным результатам, эффективность образования первичных опухолей демонстрирует явную разницу в агрессивности исследованных клеточных линий в зависимости от наличия или отсутствия антигена СЕА и его рецептора. Клетки 8(А+Я+), экспрессирующие и лиганд, и рецептор, являются наиболее агрессивными, тогда как 101-7(А-11-), напротив, не образуют опухолей.

Клоногешюсть клеток М1Р101

Задачей эксперимента являлась оценка изменения количества клоногенных клеток в культуре М1Р101 в исходном состоянии и после предполагаемого обогащения по стволовым клеткам.

В опыте использовались клетки базовой линии М1Р101(А-Г1+) в исходном состоянии, а также заражённые лентивирусом с суицидальной кассетой и обработанные пуромицином.

Результаты эксперимента показали, что в таких условиях базовые клетки М1Р101(А-Я+) не образуют заметных колоний на фоне массовой гибели клеток. Отобранные на пуромицине клетки М1Р101(А-11+)8 дают в среднем 48 ± 16 колоний на лунку (среднее ± станд. откл.).

Этот эксперимент явился первым подтверждением взаимосвязи активности Ос^подобных транскрипционных факторов и пролиферативных характеристик раковых клеток линии М1Р101.

Туморогенность М1Р101

Задачей эксперимента была сравнительная оценка туморогенности клеток М1Р101 в исходной популяции, после обогащения по стволовому компоненту и после уничтожения стволового компонента.

В опытах использовались клетки базовой линии М1Р101(А-К+), зараженные лентивирусом с суицидальной кассетой ТК-неэ-Риго.

Обогащение клеточной популяции производили путём отбора на селективной среде с пуромицином (30 мг/л) в течение 10 еут, в результате чего выживали только клетки, несущие суицидальную кассету и активно экспрессирующие её за счёт эндогенных транскрипционных факторов.

Оценку туморогенности производили путём измерения диаметров опухолей на сроках 20, 30 и 40 сут от дня инъекции. Клетки 1018 дали опухоли во всех 6 животных, а базовые 101 —в5 изб (83%).

Таблица 2. Диаметр опухолей при подкожном введении клеток М1Р101 в исходной и

обогащенной популяции.

Клетки Диаметр опухоли на разных сроках, мм

20 сут 30 сут 40 сут

101 (исходные) 4.0 ±0.7 5.2 ± 1.1 6.6 ±2.1

; 1018 7.0 ±2.6 11.8 ±2.3 13.2 ±2.0

Оценка достоверности различий с помощью ^критерия Стьюдента показала, что размеры опухолей 101 и 1018 достоверно различаются на всех сроках (р < 0.05, на 30-е и 40-е сутр <0.01).

Во втором опыте были задействованы клетки 101 и 1018. Каждая культура была разделена на две части, одна из которых проходила обработку ганцикловиром, а вторая — нет. Итого получили 4 популяции: 101, 101+0, 1018, 1018+0. Условия инъекции были такие же, как в предыдущем опыте. Клетки 101 и 101+0 (не несущие кассеты) были инъецированы 3 мышам, 1018 и 101Б+О (несущие кассету и прошедшие обогащение) — 5 мышам. Клетки 101Э+О, то есть прошедшие отбор на наличие кассеты и затем лишённые стволового компонента, не дали ни одной опухоли. Клетки 101 и 101 +0 дали опухоли в одной из трёх повторностей и имели сходные размеры, то есть эти клетки не реагировали на ганцикловир.

Таблица 3. Оиухолеобразование при подкожном введении клеток М1Р101 в исходной, обогащенной и обеднённой популяции.

Клетки Частота возникновения опухолей Диаметр опухоли па разных сроках, мм

20 сут 30 сут

101 33% (1 изЗ) 6 8

101+С 33% (1 изЗ) 5 113

1018 60% (3 из 5) 7.3 ± 2.1 ; 11.3 ± 3.1

1018+0 0% — ;—

Таким образом, показано, что обогащение популяции М1Р101 с помощью суицидальной кассеты, активируемой транскрипционным фактором Ос14 (и, вероятно, его иаралогами) способствует увеличению их туморогенности, тогда как уничтожение клеток, в которых активен этот транскрипционный фактор, ведёт к исчезновению туморогенности.

Активность Фш-сигналиига в базовой и обогащенной популяции

Поскольку Шп^сигнальный путь является одним из ключевых в самоподдержании

стволовых клеток эпителия кишечника и может сохранять свою роль и после раковой трансформации, была посталена задача сравнить активность ХУШ-сигналинга в клетках М1Р101(А-Я+) и их производных — 8(А+Я+) в исходном состоянии, после обогащения по стволовому компоненту (5) и после подавления стволовых клеток (Б+С).

Исходные культуры

Обогащенные популяции

Обеднённые популяции

Рис. 2. Интенсивность экспрессии плазмиды ТОРАазЬ в клетках М1Р101 в исходном, обогащённом и обеднённом состоянии. 14

Как показывают результаты измерения, в исходном состоянии клетки 8(A+R+) имеют вдвое большую активность транскрипционного фактора TCF/Lef по сравнению с базовыми 101(A-R+). Обогащение по стволовому компоненту приводит к двух-трёхкратному усилению активности, причём исходные СЕА-негативные клетки сравниваются с СЕА-экспрессирующими клетками, а уничтожение стволовых клеток сопровождается двукратным спадом активности Wnt-сигналинга по сравнению с исходной популяцией, опять же, уравнивая СЕА-позитивные и СЕА-негативные клетки.

Подавление РСК in vivo

Контрольный эксперимент. Задачей контрольного эксперимента было исключение влияния ганцикловира на клетки, не несущие суицидальной кассеты. В опыт было включено 16 мышей в возрасте 90-120 сут. Проверяли все 4 клеточные линии, не несущие суицидальной кассеты.

Клетки 101-7(A-R-) давали небольшие (4-5 мм) опухоли в 3 случаях из 4. Результаты их измерений не приводятся по причине недостоверности. Остальные измерения приведены на рис. 3^1.

Лечение ганцикловиром in vivo. Для опыта были взяты 9 мышей в возрасте 45-50 сут. Клетки для опыта были предварительно инфицированы лентивирусом, несущим суицидальную кассету, и затем отобраны на селективной среде с добавлением антибиотика (пуроминин — для клеток 101(A-R+) и 8(A+R+)b концентрации 30 мкг/л, бластицидин — для 101-7(A-R-), 8(A+R+)n 8-7(A+R-), 10 мкг/л). Клетки 101-7(A-R-) погибали в ходе селекции, что может быть связано с чрезвычайно малым количеством стволовых клеток в их популяции. В дальнейших опытах клетки 10!-7(A-R-) не использовали.

Спустя 20 сут после инъекции образовавшиеся опухоли были измерены, после чего 3 мыши из первой группы и 2 мыши из второй группы начали получать ежедневные инъекции ганцикловира внутримышечно (по 100 мкл, 2 мг/мкл). Инъекции повторялись в течение 10 сут. Повторное измерение диаметров опухолей проводили на 30-е сут (10 сут от начала лечения), 40-е и 50-е сут (30 сут от начала лечения) (рис. 5-6).

Обработка данных. Поскольку на момент начала лечения опухоли имели разный диаметр (5-17 мм), для нормализации измерений были рассчитаны относительные размеры опухолей в процентах от первого измерения (20-е сут). Соответственно, все опухоли, которые не наблюдались на 20-е сут, были исключены из расчётов.

Статистическую обработку проводили с помощью непараметрического критерия Уилкоксона. Проверяли наличие разницы между относительными размерами опухолей на

всех сроках на фоне наличия или отсутствия лечения ганцикловиром. Наличие достоверных отличий должно показать, что на всех сроках после лечения темп роста оказывается достоверно ниже, чем без лечения.

Результаты измерений приводятся в виде графиков абсолютных размеров опухолей, усреднённых для каждого типа клеток (поверх графиков точками обозначены измерения каждой опухоли), и графиков относительных размеров для каждой опухоли.

Поскольку клетки 101-7(А-К-) не дали ни одной видимой опухоли на 20-е сут эксперимента, вычисление относительных размеров опухолей для них не проводили.

Клетки, не несущие суицидальной кассеты, не показали статистически достоверного изменения темпов роста опухоли при лечении ганцикловиром, что свидетельствует об отсутствии влияния ганцикловира на исходные клетки М1Р101 всех вариантов. Клетки, несущие суицидальную кассету и обогащённые на среде с антибиотиком, практически во всех случаях демонстрировали замедление роста опухолей после начала лечения ганцикловиром. Клетки 8-Риго могут быть рассмотрены как выпадающая точка, поскольку для них была доступна только одна контрольная и одна опытная опухоль. Статистическая достоверность по критерию Уилкоксона показана для клеток 8(Л+К+)-В1а — > 95% и 8-7(А+Я-)-В1а — > 90%.

Результаты эксперимента позволяют, сделать вывод, что клетки, экспрессирующие суицидальную кассету, определяют способность опухоли к росту.

101-7<А-К-> 8-7(А+(?-)

! ......................... ....................... 1

:■< ЗС ¿0 Г:0 20 30 ли

Рис. 3. Исходные клетки — абсолютный размер опухолей

Рис. 5. Обогащённые популяции — абсолютный размер опухолей

Рис. 6. Обогащённые популяции — относительный размер опухолей

ОТ-ПЦР в реальном времени па ос(4

Для количественного определения уровня экспрессии Oct4 в исследуемых клетках на уровне мРНК была поставлена реакция ПЦР в режиме реального времени с праймерами к человеческой мРНК oct4.

РНК, выделенная из клеток 101(A-R+), 8(A+R+), а также 8(A+R+), отобранных на пуромицине (8(A+R+)S), была использована для синтеза кДНК по стандартному протоколу с олиго-dT праймером. Поскольку концентрация кДНК после реакции обратной транскрипции не может быть измерена на спектрофотометре из-за примеси праймеров и мононуклеотидов, нормализацию количества матрицы проводили на этапе разведения выделенной РНК. ПЦР в реальном времени проводилась в присутствии интеркалирующего красителя SYBR green.

Подготовительный эксперимент проводился с целью стандартизации условий реакции и определения наиболее эффективного контрольного гена для измерения относительного уровня экспрессии гена интереса. В качестве контрольных генов использовали aclb (бета-актин), gapdh (глицеральдегидфосфатдегидрогеназа) и Ь2т (бета-2-микроглобулин) человека. Реакции ставили в трёх повторностях. Концентрацию на данном этапе не вычисляли, результаты оценивали на уровне Ct (порогового цикла).

Результаты показывают, что наименьший разброс (и, соответственно, наибольшую точность) как между повторноетями, так и между образцами, дают праймеры к Ь2ш. Контрольные образцы, не содержавшие ДНК (вода), не достигали порогового уровня.

Таблица 4. Результаты ОТ-ПЦР в реальном времени с праймерами к различным контрольным генам. Указаны значения порогового цикла (Ct)

кДНК Праймеры Средний Ct Ст. откл.

! 10KA-R+) b-act 15.02 0.12

8(A+R+) b-act 14.90 0.39

' 8(A+R+)S b-act 13.86 0.39

101(A-R+) gapdh 18.95 0.39

; 8(A+R+) gapdh 18.52 0.60

8(A+R+)S gapdh 17.93 0.29

101(A-R+) b2m 19.32 0.28

[ 8(A+R+) b2m 19.24 0.25

8(A+R+)S b2m 19.34 0.16

¡¡мереные уровня экспрессии о с!4 выполнено на образцах мРНК клеток 101(А-^+), 8(A+R+) и 8-7(А+Я-), как натнвных, так и несущих суицидальную кассету и отобранных на

пуромицине (всего 6 образцов). Задачей эксперимента была проверка роли 0«4 в появлении у этих клеток устойчивости к пуромицину. Приготовление образцов и условия эксперимента были аналогичны подготовительному эксперименту. Внутренним контролем для нормализации результатов служил ген Ь2т.

Результаты эксперимента показаны на рис. 7 (относительный уровень экспрессии и его стандартное отклонение).

109 " 8 " 7 " 6 " 54 " 3 -2 -1 -

Рис. 7. Результаты количественного ОТ-ПЦР с праймерами к ос)4 на кДНК клеток-производных М1Р101 в исходном и обогащенном состоянии. Опыт показал, что только для клеток !0!(Д-Я+) (т.е. исходных М1Р101) активация суицидальной кассеты и отбор на пуромицине приводят к некоторому усилению экспрессии о с 14. Клетки 8(Я+А+) демонстрируют стабильно невысокий уровень ос14, а 8-7(А+11—) — стабильно высокий, вне зависимости от селективного давления.

На основании полученных результатов можно предположить, что в клетках-производных М1Р101 активация суицидальной кассеты осуществляется иным транскрипционным фактором, нежели Ой4, имеющим сходную последовательность цис-элемента и поэтому способным связываться с промотором суицидальной кассеты. Вероятно, таким транскрипционным фактором может быть Осд I [МасМох с! а1., 2012] или другой РОи-домен-содержащий белок.

Вне зависимости от того, какой именно белок активирует суицидальную кассету в

исследуемых клетках, отбор активированных клеток приводит к росту клоногенности и

20

-г-

101(А-Я+)'101(А-Н+)5' 8(А+И+) 1 8(А+И+)5 1 8-7(А+Я-) !8-7(А+Я-)5

туморогенности клеточной популяции, тогда как подавление этих же клеток на уровне гетерогенной популяции in vitro лишает её туморогенности, a in vivo — приводит к торможению роста опухоли. Таким образом, суицидальная кассета с промоторным элементом 2А2В может быть использована для отбора раковых стволовых клеток в линии MIP101.

Выводы

1. Разработан метод, позволяющий выделять в культуре клеток колоректальной карциномы М1Р101 популяцию, отличающуюся высоким уровнем транскрипции с промотора Oct4, а также удалять эти клетки из популяции in vitro и in vivo.

2. Выделенные клетки обладают повышенной клоногенностью и туморогенностью в сравнении с исходной клеточной линией. В то же время популяция, лишённая этих клеток, теряет способность формировать опухоли in vivo. Уничтожение описываемых клеток в зрелых опухолях in vivo приводит к замедлению их роста. Совокупность этих признаков позволяет считать выделенные клетки раковыми стволовыми.

3. Повышенная активность Wnt-сигнального пути в описываемых стволовых клетках колоректальной карциномы сближает их с нормальными стволовыми клетками кишечного эпителия.

4. Стволовые клетки линии MIP101 характеризуются экспрессией не транскрипционного фактора Oct4, но близкого к нему белка, имеющего сходный цис-элемент.

Список опубликованных работ по теме диссертации Статьи

1. Дисковых М.А., Давыдов-Сипицыи AM., Мариловцева Е.В., Томилин А.Н., Толкунова ЕЛ. 2011. Взаимодействие транскрипционного фактора CDX2 с белком DDX5. Цитология. 53 (12): 930-938

2. Давыдов-Сипицыи А.П., Баженова О.В., Ласковых М.А., Чечнк J1.J1., Пономарцев СВ., Томилин АЛ., Толкунова Е.Н. 2013. Получение in vitro и характеристика субпопуляции стволовых клеток рака кишечника. Цитология. 55 (5): 3 18-323.

3. Давыдов-Сшшцьш А.П., Баженова О.В., Ласковых М.А., Чечик Л.Л., Пономарцев СВ., Томилин АЛ., Толкунова ЕЛ. 2013. Сравнительная характеристика клеток карциномы кишечника, различающихся по метастатическому потенциалу. Цитология. 55 (6): 379-387.

Тезисы

1. Давыдов-Сипицыи А.П., Баженова О.В., Лисковых М.А., Чечик Л.Л., Пономарцев С В., Томилин АЛ., Толкунова Е.Н. 2013. Выделение культуры стволовых клеток рака

21

кишечника. Сборник материалов I Международного форума «Молекулярная медицина — новая модель здравоохранения XXI века: технологии, экономика, образование" 26-27 июня 2013 п/р И.А. Максимцева, В.И. Ларионовой. Издательство Санкт-Петербургского государственного экономического университета, 2013 г. С. 69-71.

2. Давыдов-Синицын А.П., Баженова О.В., Ласковых М.А., Чечик Л.Л., Пономареве С.В., Томилин А.П., Толкунова Е.Н. 2013. Уничтожение стволовых клеток колоректального рака in vivo с помощью суицидальной технологии. VI ежегодный международного симпозиум «Актуальные вопросы генных и клеточных технологий». Москва, 11-12 октября 2013 г. Опубликовано в: Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013, с. 13-14

Список цитируемой литературы

Ласковых М.А., Чуйкин И.А., Рсшян А., Сафина Д.А., Толкунова Е.И., Минина Ю.М., Жданова Н.С., Дыбан П.А., Маллинс Дж., Коапылева Е.И., Чихиржнна Е.В., Бадер А/., Аленина Н., Томилин А.Н. 2011. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток крысы: анализ условий репрограммирования и культивирования. Цитология. 53 (12) : 939-945.

Al-Hajj М„ IFicha M.S.. Benito-Hernández A., Morrison S.J., Clarke M.F. 2004. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA, 100 (7): 3983-3988.

Bajenova O., Stolper E„ Gapon S., Sundina N.. Zimmer R., Thomas P. 2003. Surface expression of heterogeneous nuclear RNA binding protein M4 on Kupffer cell relates to its function as a carcinoembryonic antigen receptor. Exp. Cell Res. 291 : 228-241.

Bonnet D., Dick J. 1997. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med , 3 (7): 730-737.

Huntly B.J., Shigematsu H., Deguchi K., Lee B.M., Mizuno S., Duelos N.. Rowan /?.. Amara! S„ Curley D„ Williams I.R., Akashi K„ Gilliland D.G. 2004. MOZ-TIF2, but not BCR-ABL, confers properties of leukemic stem cells to committed murine hematopoietic progenitors. Cancer Cell. 6 : 587-596.

Jessup J.M., Thomas P. 1998. CEA and metastasis: a facilitator of site-specific metastasis. In: Stanner C.P., editor. Cell adhesion and communication mediated by the CEA family: basic and clinical perspectives. New York: CRC Press; p. 195-222.

Maddox J., Shakya A., South S., Shelton D., Andersen J.N., Chidester S., Kang J., GUgorich K.M., Jones D.A., Spangrude G.J., IVe/m B.E., Tantin D. 2012. Transcription factor Octl is a somatic and cancer stem cell determinant. PLoS Genet. 8(1 l):e 1003048. doi: 10.1371/joumal.pgen. 1003048.

Matsui IK, Wang Q., Barber J.P.. Brennan S„ Smith B.D., Borrello L., McNiece I.. Lin L., Ambinder R.F., Peacock C„ Watkins D.N., Huff C.A., Jones R.J. 2008. Clonogenic multiple myeloma progenitors, stem cell properties, and drug resistance. Cancer Res. 68 : 190-197.

Thomas P., Gangopadhyay A., Steele G. Jr., Andrews C., Nakazato 11., OikawaS., Jessup J.M. 1995. The effect of transfection of the CEA gene on the metastatic behavior of the human colorectal cancer cell line MIP-101. Cancer Lett. 92 : 59-66.

Xu Q„ Yuan X., Tunici P., Liu G„ Fan X, Xu M„ Ни J., Hwang J. Y., Farkas D.L., Black K.L., YuJ.S. 2009. Isolation of tumor stem-like cells from benign tumors. Br J Cancer, 101 : 303-311.

Zhu L.. Gibson P., Currle D.S., Tong Y, Richardson R.J., Bayazitov ¡.Т.. Poppleton !!., Zakharenko S., Ellison D. IV., Gillbertson R.J. 2009. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457 : 603-607.

Подписано в печать 17.02.2014. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 11572Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.:(812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Давыдов-Синицын, Александр Петрович, Санкт-Петербург

Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН

Давыдов-Синицын Александр Петрович

Стволовые клетки в популяции культивируемых клеток колоректальной карциномы человека

Специальность: 03.03.04 — Клеточная биология, цитология, гистология.

Диссертация

на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2014

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................................................5

Цели и задачи исследования....................................................................................................................................6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................................................................7

ПОНЯТИЕ О СТВОЛОВОЙ КЛЕТКЕ....................................................................................................................................7

Стволовые клетки кишечника млекопитающих................................................................................................10

Эпителий кишечника млекопитающих.................................................................................................................10

История исследований кишечного эпителия.......................................................................................................12

Первые наблюдения стволовых клеток крипты.................................................................................................14

Молекулярные подходы к выявлению стволовых клеток....................................................................................16

Воссоздание кишечного эпителия in vitro.............................................................................................................21

Ниша стволовой клетки..........................................................................................................................................24

Ниша стволовой клетки крипты..........................................................................................................................26

СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ В КИШЕЧНОЙ КРИПТЕ..................................................................................................28

Wnt............................................................................................................................................................................28

Втр...........................................................................................................................................................................33

PTEN/PI3K...............................................................................................................................................................37

Delta-Notch...............................................................................................................................................................39

Опухолевые стволовые клетки..............................................................................................................................40

Опухолеспецифические антигены.........................................................................................................................44

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..........................................................................................................................................45

Работа с клетками в культуре.................................................................................................................................45

Культивирование клеток.......................................................................................................................................45

Пространственные клеточные культуры...........................................................................................................45

Кальций-фосфатная трансфекция......................................................................................................................47

Лентивирусная инфекция.......................................................................................................................................47

Обработка антибиотиками и ганцикловиром in vitro........................................................................................48

Построение кривых роста....................................................................................................................................48

Анализ сферообразования на низкоадгезивном субстрате................................................................................48

Получение пространственных колоний................................................................................................................49

РАБОТА С ЖИВОТНЫМИ, ОРГАНАМИ И ТКАНЯМИ.........................................................................................................49

Экспериментальные животные...........................................................................................................................49

Получение подкожных опухолей............................................................................................................................49

Получение опухолей во внутренних органах.........................................................................................................50

Лечение ганцикловиром in vivo..............................................................................................................................51

Гистологические методы......................................................................................................................................51

3. Молекулярные и биохимические методы.........................................................................................................51

Молекулярное клонирование..................................................................................................................................51

Выделение геномной ДНК......................................................................................................................................51

Выделение РНК и обратная транскрипция.........................................................................................................52

Полимеразная цепная реакция...............................................................................................................................52

ПЦР в реальном времени........................................................................................................................................52

Выделение белка и дот-гибридизация...................................................................................................................53

Измерение люциферазной активности................................................................................................................54

Иммунофлюоресцентное окрашивание................................................................................................................54

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...............................................................................................................................56

Взаимодействие белков Cdx и Ddx5 в клетках кишечного эпителия..........................................................56

Колокализация Cdx2 и Ddx5 в клетках СаСо-2 и эпителии кишечника............................................................56

Влияние Cdx2 и Ddx5 на активность Wnt-сигнального пути.............................................................................57

Пространственные культуры в коллагеновом гидрогеле.................................................................................60

MIP101..........................................................................................................................................................................62

Построение кривых роста....................................................................................................................................63

Иммуноокрашивание клеток MIP101...................................................................................................................64

Проверка клеток MIP101 на экспрессию генов-маркеров..................................................................................66

Активность промотора сукразы-изомальтазы в клетках MIP101..................................................................67

Опухолеобразование и метастазирование клеток MIP101..............................................................................70

Формирование пространственных колоний.........................................................................................................71

Кпоногенность клеток MIP101.............................................................................................................................74

Туморогенность MIP101........................................................................................................................................74

Активность Wnt-сигналинга в базовой и обогащенной популяции....................................................................76

Подавление РСК in vivo..........................................................................................................................................77

ОТ-ПЦР в реальном времени на oct4.....................................................................................................................81

Возможные альтернативы Oct4 в стволовых клетках MIP101.......................................................................83

ВЫВОДЫ.........................................................................................................................................................................87

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................................................................88

Список сокращений

ОСК — опухолевые стволовые клетки

ОТ-ПЦР — обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция

РСК — раковые стволовые клетки

СК — стволовые клетки

ЭСК — эмбриональные стволовые клетки

СВС-клетки — Crypt base columnar cells — столбчатые клетки основания крипты СЕА — Carcinoembryonic antigen — раково-эмбриональный антиген (СЕАСАМ5) CEAR — СЕА receptor — рецептор СЕА (hnRNPM)

НЕК — Human embryonic kidney cells — клетки эмбриональной почки человека

HBS — Hepes buffered saline — буферный раствор с Hepes

PBS — Phosphate buffered saline — фосфатный буферный раствор

PBST — PBS-Tween — PBS с добавлением 0.1 % Tween

+4-клетки — клетки крипты, расположенные в 4 клеточных диаметрах от её основания

Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения, ежегодно в мире выявляется 10 млн. новых случаев онкологических заболеваний, которые уносят более 7,5 млн. жизней в год. Рак кишечника по частоте встречаемости занимает третье место в структуре онкологических заболеваний в России и в мире.

В настоящее время развивается концепция раковых стволовых клеток (РСК), согласно которой главную роль в развитии злокачественных новообразований играет небольшая субпопуляция раковых клеток, обладающая характеристиками стволовых клеток. Рядом авторов показано, что РСК отличаются от основной массы дифференцированных раковых клеток способностью к асимметричному делению, неограниченному самовоспроизведению и дифференцировке, меньшей скоростью пролиферации, высокой активностью репаративных систем, экспрессией некоторых маркеров стволовых клеток и длиной теломер [Bonnet, Dick, 1997; Jessup, Thomas, 1998; Al-Hajj et al., 2004; Xu et al., 2009]. Высокая устойчивость РСК к повреждающим воздействиям, в том числе к ионизирующему излучению и цитотоксическим веществам, позволяет им переживать радио- и химиотерапию и воссоздавать опухоль после лечения, сводя результаты лечения на нет. Дифференцирующиеся раковые клетки, в отличие от стволовых, активно размножаются, но при этом уменьшается их устойчивость к повреждающим воздействиям и теряется возможность неограниченного самовоспроизведения. Сходство РСК со здоровыми тканевыми стволовыми клетками позволяет предположить общность их происхождения. Накапливаются экспериментальные доказательства возможности злокачественной трансформации мультипотентных взрослых стволовых клеток и их более коммитированных потомков в раковые стволовые клетки [Huntly et al., 2004; Matsui et al., 2008; Zhu et al., 2009].

Изучение особенностей и возможности регулирования пролиферации РСК при возникновении различных видов рака — актуальнейшая задача современной молекулярной онкологии. Углубление наших знаний в области РСК будет способствовать разработке новых, более эффективных противоопухолевых препаратов, направленных против низкодифферен-цированных клеток, которые в сочетании с существующими хирургическими и медикаментозными подходами позволят бороться с раковой опухолью на всех уровнях её развития.

Настоящая работа посвящена проблеме раковых стволовых клеток на модели культивируемой линии колоректальной карциномы. Результаты работы подчёркивают общность раковых стволовых и эмбриональных стволовых клеток, важную роль

POU-доменных транскрипционных факторов в поддержании стволовых характеристик раковых клеток. Кроме этого, проиллюстрировано влияние клинического онкомаркера CEA (раково-эмбрионального антигена) на свойства опухолевых клеток, в том числе на стволовость.

Созданная в ходе настоящей работы клеточная культура с генетически сенсибилизированным стволовым компонентом является моделью для перспективных методов лечения рака, направленных на уничтожение стволовых клеток опухоли. Результаты работы, доказывающие активность экспрессии POU-доменных транскрипционных факторов именно в стволовом компоненте опухолевой популяции, характеризуют это семейство белков как маркер раковых стволовых клеток и потенциальную мишень для генетической терапии рака.

Цели и задачи исследования

Целью работы являлось создание опухолевой клеточной культуры, в которой возможно как накопление стволового компонента, так и его прицельное уничтожение, не затрагивающее дифференцированные опухолевые клетки, а также проверка гипотезы о значимости транскрипционного фактора Oct4 в обеспечении стволовых свойств раковых клеток.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) Внедрить в геном клеток линии MIP101 и её производных трансгенную конструкцию, несущую селективный маркер и ген чувствительности к антибиотику под контролем промотора Oct4 (т.н. суицидальная кассета).

2) Получить клеточные популяции, обогащенные по стволовому компоненту, за счёт активности суицидальной кассеты в раковых стволовых клетках.

3) Провести уничтожение раковых стволовых клеток в культуре путём обработки клеточной культуры предшественником цитотоксического препарата, который переходит в токсичную форму в клетках с активной суицидальной кассетой.

4) Оценить свойства полученных популяций, обогащенных по стволовым клеткам либо лишённых стволового компонента, в сравнении с исходными.

5) Осуществить подавление раковых стволовых клеток in vivo в развивающейся опухоли.

Обзор литературы

Понятие о стволовой клетке

Возникновение понятия «стволовая клетка» традиционно связывается с именем Александра Александровича Максимова, русского и американского гистолога. В своей работе по кроветворению от 1909 года "Der Lymphozyt als gemeinsame Stammzelle der verschiedenen Blutelemente in der embryonalen Entwicklung und im postfetalen Leben der Säugetiere" Максимов доказывает происхождение всех форменных элементов крови от одного клеточного типа, для которого вводит термин "Stammzelle". Необходимо пояснить, что немецкое слово "Stamm" означает не только «ствол», но и «племя, род, раса», то есть перевод «стволовая клетка» имеет альтернативы — например, «клетка-родоначальница».

Впоследствии кроветворные стволовые клетки (гемоцитобласты) становятся классическим примером стволовой клетки взрослого организма. Диаграмма возможных направлений развития такой клетки, содержащая множество разветвлений, напоминает дерево, в основании которого — «стволе» — находится собственно «клетка-родоначальница», отсюда и устоявшийся термин «стволовая клетка».

Любая стволовая клетка — эмбриональная, тканевая или индуцированная — обладает по меньшей мере двумя фундаментальными свойствами:

1) Способность к неограниченному самообновлению, то есть клеточное бессмертие.

2) Способность дифференцироваться, превращаться в тот или иной тип зрелых клеток.

Рядом авторов предлагались дополнительные свойства стволовых клеток:

3) Способность к асимметричному делению, при котором одна дочерняя клетка сохраняет свойства стволовой, а вторая уходит в созревание.

4) Способность стволовой клетки делать выбор между симметричным и асимметричным делением.

Свойство неограниченного самообновления является ключевым для стволовых клеток и отличает их от потомков — переходных клеток (иногда называемых полустволовыми клетками). Переходные клетки активно размножаются и в конечном итоге дифференцируются в те или иные зрелые клетки, однако их способности к размножению ограничены [Nayernia et al., 2004], и эти клетки существуют лишь непродолжительное время до окончательной дифференцировки. В то же время стволовые клетки должны сохраняться

на протяжении всей жизни организма, иначе невозможно объяснить постоянное обновление тканей (к примеру, кожи или кишечного эпителия).

Способность к бесконечному размножению является весьма нетипичной для клеток взрослого организма. Механизмы удвоения хромосом, предшествующего делению клетки, не позволяют копировать самые концы нитей ДНК, в результате чего после каждого удвоения хромосомы укорачиваются на несколько нуклеотидов. На концах хромосом располагаются участки некодирующей ДНК — теломеры, состоящие из многократно повторяющихся коротких последовательностей, поэтому укорочение хромосом до определённого предела происходит нечувствительно для клетки. После определённого числа делений, называемого пределом Хейфлика (Hayflick limit), укорочение хромосом достигает критического уровня и размножение клетки блокируется.

Очевидно, что должен существовать механизм восстановления теломер по крайней мере в некоторых типах клеток — в частности, в клетках полового пути, которые переходят из поколения в поколение, а также у одноклеточных организмов, размножающихся бесконечно. Именно у простейших — у инфузории Tetrahymena — в 1985 г. был описана теломераза— фермент, восстанавливающий концы теломер [Greider et al., 1985]. Теломераза у млекопитающих активно работает в эмбриональных клетках и клетках полового пути, в тканевых стволовых клетках и в отдельных типах зрелых клеток, способных размножаться, например, в активированных лимфоцитах.

Способность к дифференцировке в те или иные типы зрелых клеток является вторым неотъемлемым свойством стволовых клеток, позволяющим им выполнять свою функцию в организме. У разных типов стволовых клеток количество путей дифференцировки различается, и существует классификация стволовых клеток по этому признаку:

1) Тотипотентные стволовые клетки — способны давать начало любому клеточному типу всего организма на всех стадиях онтогенеза. У млекопитающих такими свойствами обладают клетки зародыша — бластомеры — на стадиях от одной до 16 клеток, после чего начинается формирование первой внезародышевой оболочки — трофобласта.

2) Плюрипотентные стволовые клетки — дифференцируются в любые ткани взрослого организма и зародыша, за исключением внезародышевых оболочек. Таковы эмбриональные стволовые клетки, составляющие внутреннюю клеточную массу бластоцисты — зародыша млекопитающих после формирования трофобласта.

3) Мультипотентные стволовые клетки — имеют ограниченное количество путей дифференцировки. К этому классу относится большинство тканевых стволовых клеток взрослого организма, �