Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка мишеней для терапии колоректального рака на основе функциональной геномики

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Разработка мишеней для терапии колоректального рака на основе функциональной геномики"

На правах рукописи

Коротаева Александра Алексеевна

РАЗРАБОТКА МИШЕНЕЙ ДЛЯ ТЕРАПИИ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА НА ОСНОВЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ГЕНОМИКИ

03.02.07 — генетика

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

21 моя 2013

Москва-2013

005538464

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Карпухин Александр Васильевич, доктор биологических наук, профессор Официальные оппоненты:

Петрин Александр Николаевич, доктор медицинских наук, профессор. Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий лабораторией медицинских генетических технологий

Асаиов Алий Юрьевич доктор медицинских наук, профессор Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московской государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой медицинской генетики

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский национальный медицинский университет имени Н.И.Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1. Автореферат разослан » /У 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 001.016.01 по защите диссертаций на соискание ученой 4 -

степени кандидата наук, на соискание уу^^^^у ,

ученой степени доктора наук,

доктор медицинских наук, профессор Зннченко Рена Абульфазовна

Защита состоится

2013г. в

часов на заседании

J

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Одним из основных средств терапевтического лечения колоректалыюго рака является химиотерапия. Применяемые в настоящее время средства химиотерапии характеризуются не высокой эффективностью, но весьма значимой токсичностью, ограничивающей возможности длительного воздействия на опухоль (Galluzi L. et al., 2012). Наиболее современным средством в настоящее время является так называемая таргетная терапия, направленная на блокирование проявления конкретных генов. Но используемые сейчас способы и средства блокирования отдельных генов также несовершенны. Многие из них токсичны, недостаточно специфичны или не оказывают должного терапевтического эффекта. Требуется развитие новых подходов, базирующихся на последних достижениях и учитывающих структурно-функциональные особенности клеток злокачественной опухоли.

К наиболее современным способам блокирования функции генов относится РНК-интерференция. Применение малых интерферирующих РНК (миРНК), с высокой специфичностью ингибирующих функцию генов, является перспективным для разработки противоопухолевого средства, позволяющего существенно снизить дозировку стандартного химиопрепарата и, соответственно, свести к минимуму его побочное действие, при повышении эффективности терапии (Pecot C.V.et al., 2011).

Как известно, одной из причин, неконтролируемого размножения раковых клеток является нарушение механизма апоптоза. Современная химиотерапия опухолей часто базируется на стимулировании апоптоза раковых клеток. Индуцирование апоптоза раковых клеток является одним из основных направлений в современной терапии рака (Miura К et al., 2011). Исследование генов, участвующих в апоптозе, может помочь разобраться в процессах, происходящих в раковых клетках, а в последующем и улучшить антираковую терапию. Белки ингибиторы апоптоза - IAP (inhibitors of apoptosis proteins) играют очень важную роль в регуляции апоптоза, препятствуя его развитию. Повышенная экспрессия генов репарации и репликации ДНК позволяет опухолевой клетке восстанавливаться после воздействия цитостатиков, нейтрализуя терапевтический эффект (Krawczyk Р et al., 2012). «Выключение» генов - ингибиторов апоптоза и генов, участвующих в контроле целостности генома, должно приводить к запрограммированной гибели раковой клетки, особенно в условиях индукции апоптоза при воздействии химиопрепарата.

Исследование таких генов имеет как фундаментальное значение, с точки зрения выявления функции генов в норме и при злокачественной трансформации, так и практическое значение, заключающееся в создании новых лекарственных средств.

Цель исследования

Разработка мишеней для терапии колоректального рака на основе малых интерферирующих РНК и функционального анализа генов.

Задачи исследования:

1) На модели культивируемых клеток колоректального рака с мутацией в гене АРС с использованием малых интерферирующих РНК изучить значение экспрессии гена c-MYC для жизнеспособности раковых клеток. Сравнить полученные характеристики с уровнем экспрессии и апоптоза в клетках колоректального рака с отсутствием мутации в гене АРС.

2) Изучить апоптотический эффект от блокирования гена К RAS на модели клеток НТ-29. Определить уровень апоптоза при совместном ингибировании генов c-MYC и KRAS.

3) Изучить профили экспрессии сформированного набора генов в культивируемых клетках колоректального рака в зависимости от дозы и времени действия химиотерапевтического препарата оксалиплатина. Выявить потенциальные гены-мишени терапевтического воздействия.

4) Изучить апоптотический эффект от блокирования генов-мишеней в культивируемых клетках колоректального рака с помощью малых интерферирующих РНК на фоне воздействия оксалиплатина.

Новизна полученных результатов

Выявлено, что ингибирование функциональной активности гена c-MYC с помощью малых интерферирующих РНК приводит к апоптотическому эффекту в клетках колоректального рака с мутацией в гене АРС, но не эффективно для клеток рака этой локализации без мутации в гене АРС. Показано, что совместное ингибирование генов c-MYC и KRAS приводит к аддитивному апоптотическому эффекту. На основании исследования профилей экспрессии генов в клетках колоректального рака с мутацией в гене АРС выявлены потенциальные мишени терапевтического воздействия - гены Birc3, Birc7 и МСМ4. Впервые изучен апоптотический эффект от ингибирования гена МСМ4 в клетках колоректального рака с мутацией в гене АРС. Впервые показано, что совместное ингибирование генов Birc7 и МСМ4 дает синергетический апоптотический эффект, близкий к аддитивному при низкой дозе оксалиплатина.

Научно-практическая значимость работы

Разработан подход к таргетной терапии колоректального рака, основанный на выявлении генов-мишеней, блокирование которых позволяет существенно усилить ответ на стандартную химиотерапию. Выявлены гены, которые реагируют повышением экспрессии на разные концентрации оксалиплатина на всем протяжении культивирования. Такой подход является перспективным для поиска новых генов-мишеней терапевтического воздействия. Сконструированы и синтезированы малые интерферирующие РНК (миРНК) для ингибирования функции выявленных генов-мишеней. Найдена комбинация миРНК, обладающая синергетическим эффектом. При 5 мкМ

оксалиплатина уровень апоптоза при ингибировании комбинации генов составил 80%, что соответствует действию в 16 раз большей дозы оксалиплатина без ингибирования этих генов. Разработка нового эффективного противоопухолевого препарата на основе полученных результатов позволит повысить эффективность противоопухолевой терапии при снижении уровня побочных явлений, что приведет к сохранению деятельной жизни многих больных и увеличению ее продолжительности.

Положения, выносимые на защиту

1) Подавление гена c-MYC в культуре клеток колоректального рака НТ-29 с мутацией в гене Л PC приводит к апоптотическому эффекту достигающему 15-17 %. На клетках культуры Сасо2 без мутации в гене А PC при ингибировании гена c-MYC апоптоз практически не развивается.

2) Ингибирование гена KRAS в культуре клеток колоректального рака НТ-29 приводит к апоптотическому эффекту, достигающему 14 %. Совместное ингибирование генов c-MYC и KRAS приводит к аддитивному апоптотическому эффекту на уровне 30% клеток.

3) Определены профили экспрессии набора генов в зависимости от дозы и времени действия химиотерапевтичсского препарата оксалиплатина в культуре клеток IIT-29. В результате проведенного анализа выявлены потенциальные мишени терапевтического воздействия - гены B¡rc3, Birc7 и МСМ4.

4) При ингибировании генов Birc3, Birc7 и МСМ4 малыми интерферирующими РНК в сочетании с низкими концентрациями оксалиплатина 1 мкМ и 5 мкМ выявлено, что ингибирование гена МСМ4 приводит к наиболее высокому уровню апоптоза, достигающему 60% в сочетании с 5 мкМ оксалиплатина.

5) При ингибировании попарных комбинаций этих трех генов выявлена наиболее эффективная пара, включающая гены Birc7 и МСМ4, ингибирование которых приводит к значительному апоптотическому эффекту, достигающему 80% на фоне 5 мкМ оксалиплатина.

Апробация работы

Основные положения и результаты работы представлены и обсуждены на российских и международных научно-практических конференциях и съездах: XV, XVI Российских Онкологических Конгрессах (Москва 2011-2012 гг.); Всеросс. конф. с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск. 2008), 8-ой Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток». (Звенигород, 2011); VI Съезд Российского общества медицинских генетиков (Ростов, 2010), European Human Genetics Conferences (Вена, 2009; Гетеборг, 2010; Амстердам, 2011); работа стала лауреатом конкурса «Авангард знаний» 2012 г. в категории «Онкология».

По результатам работы подана заявка на патент №2013136339 от 02.08.2013 «Способ индукции апоптоза клеток злокачественной опухоли колоректального рака и средство для его осуществления».

Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании научного семинара ФГБУ «МГНЦ» РАМН 19 июня 2013 года.

Личное участие диссертанта

Автором проанализирована отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора: на этапах постановки цели и задач, разработки методов их выполнения, проведении исследований, обработки, анализа и обобщения полученных результатов, написания и оформления рукописи. Результаты исследования опубликованы в научных журналах и доложены на конференциях.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 4 - в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание учёной степени кандидата наук.

Структура и объём работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов, результатов исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 5 таблиц. Список цитируемой литературы включает 133 источника, из них 8 отечественных и 125 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали культивируемые in vitro клетки колоректального полипозного рака человека НТ-29 (АРС"'"), с мутацией в гене АРС, и Сасо-2 (АРС+/+), без мутации в гене АРС. Последовательность РНК олигонуклеотидов подбирались с помощью специализированной программы BLOCK-iT™ RNAi Designer (Invitrogen, Life Technologies, USA). Для каждого гена мишени подбиралось несколько вариантов миРНК, из которых выбирались наиболее эффективные. Эффективность в данном случае определялась наибольшим подавлением экспрессии гена при наименьшей концентрации миРНК. В дальнейшую работу отобраны олигонуклеотиды, проявляющие максимальную ингибирующую активность.

Трансфекцию клеток синтетическими олигонуклеотидами (миРНК) проводили липосомным методом согласно протоколу производителя с использованием реагентов Lipofectamine RNAiMAX ("Invitrogen", США). Трансфекция сделана прямым методом, т.е. смесь для трансфекции вносили непосредственно в среду культивирования. За 2 дня до эксперимента (трансфекции) клетки высевали на 12-ти луночные плашки, в концентрации 7,5* 104 клеток в 1 мл среды. Перед трансфекцией питательную среду с 10% сывороткой заменяли на ту же среду с 1% сывороткой, согласно протоколу.

Анализ апоптотических клеток проводили через 24 и 48 часов после трансфекции с помощью инвертированного микроскопа AxioObserver Dl ("Carl Zeiss"), оснащенного цветной цифровой камерой Iccl. Анализ фотографий проводили с помощью пакета прикладных программ AxioVision 3.1 ("Carl Zeiss").

Число апоптотических клеток подсчитывали после прижизненного окрашивания с помощью набора для определения апоптоза Vybrant Apoptosis Assay Kit #5 (Invitrogen, USA), включающего флуоресцентные красители (Hoechst 33342 и пропидиум йодид (PI).

В ходе работы проведен анализ изменения уровня экспрессии мРНК набора генов в клетках НТ-29 и Сасо-2. Измерения уровня экспрессии клеток, обработанных оксалиплатином и/или миРНК, проводили относительно ничем не обработанных клеток. В процессе анализа выполнены следующие процедуры: выделение суммарной (тотальной) РНК из клеточных культур (РНК RNcasy Mini Kit (QIAGEN, США)); определение концентрации водного раствора суммарной РНК (Nanodrop 1000); проведение реакции обратной транскрипции (ImProm-II™ Reverse Transcriptase (Promega)); ПЦР в реальном времени (RT-PCR) с продуктами обратной транскрипции (Real time StepOnePlus (Applied Biosystems)), оценка качества проведенной RT-ПЦР. Оценку чистоты реакции проводили по кривой плавления амплифицированных фрагментов ДНК, соответствующих каждому гену. Все эксперименты повторены несколько раз и оценивались только после получения одинаковых повторяющихся результатов в разных экспериментах. Для проверки зоны линейности сделаны серийные разведения кДНК. По результатам ПЦР в реальном времени построены калибровочные кривые для каждого гена.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. АНАЛИЗ ИНГИБИРОВАНИЯ ГЕНА C-MYC

Для исследований отобраны две культуры клеток полипозного рака кишечника - НТ-29 (с мутацией в гене APQ и Сасо2 (без мутации в гене АР С). Культура Сасо2 выбрана как контрольная, т.к. вследствие отсутствия в ней мутации в гене АРС ген c-MYC не должен находиться в состоянии повышенной экспрессии.

Определена функциональная активность (экспрессия) гена c-MYC в обоих из указанных типах культивируемых клеток колоректального рака. Найдено, что экспрессия гена c-MYC в культуре НТ-29 более, чем в 5 раз превышает экспрессию этого гена в культуре Сасо2 (Рис. 1).

Рис. 1 Сравнение экспрессии гена с-МУС в культурах клеток полипозного колоректального рака

Чтобы выявить значения уровня экспрессии гена с-А/УС для жизнеспособности раковых клеток, провели ингибирование гена с-МУС в обеих клеточных линиях.

Число апоптотических клеток подсчитывали после прижизненного окрашивания флуоресцентными красителями. Предварительно во всех лунках оценивали конфлюентность. Подсчет проводили визуально, не менее, чем в 10 полях на лунку. Вначале общее количество клеток подсчитывали под проходящим светом, потом микроскоп переводили во флуоресцентный режим и проводили подсчет апоптотических и мертвых клеток. В клетках обоих культур определили число апоптотических клеток.

Обнаружено, что после подавления гена с-МУС апоптоз в культуре клеток НТ-29 в 2-3 раза превышает апоптоз в культуре клеток Сасо2. При этом, в культуре НТ-29 наблюдался значительно больший апоптотический эффект относительно ничем не обработанных клеток, и клеток, обработанных случайной последовательностью нуклеотидов (Табл 1, Рис. 2).

Таблица ! Сравнение апоптотического эффекта при ингибировании гена с-МУС на культурах клеток полипозного колоректального рака

Культура клеток Гибель клеток в контроле, без подавления гена с-МУС Гибель клеток при подавлении гена с-МУС Гибель клеток при добавлении олигонуклеотида со случайной последовательностью нуклеотидов

НТ-29 1-2% 15-17% 8-10%

Сасо2 2-3% 6-7% 6-8%

1-Культура Сасо2, контрольные клетки. Окрашиваются

единичные апоптотические клетки (1-3%).

2-Культура НТ-29, контрольные клетки. Окрашиваются

единичные апоптотические клетки (1-3%)

З-Культура Сасо2 с блокированным геном с-МУС. Гибель клеток 6-7%.

4-Культура НТ-29 с блокированным геном с-МУС. Гибель клеток 1517%.

Рис. 2 Фотографии клеток рака толстой кишки НТ-29 и Сасо2 под флуоресцентным микроскопом.

К генам, играющим ключевую роль в развитии колоректального рака, относится также ген КШЯ. Изучен апоптотический эффект, вызываемый ингибированием гена К/145' «дикого» типа. В культуре клеток НТ-29 этот ген не имеет мутации. Поставлены эксперименты на культуре клеток НТ-29 с ингибированием гена К!Ы8. Апоптоз при этом составил 14%. Это значение не сильно отличалось от ингибирования гена с-МУС (17%). Для усиления апоптотического эффекта поставлены эксперименты по совместному ингибированию этих генов, в результате общий апоптотический эффект составил 30% (Рис. 3).

шки«

■ с-МУС+ТОАЭ

с-МУС КЙА$ с-МУС+КЯАБ

Рис. 3 Апоптотические эффекты при ингибировании генов с-МУС и КЯАБ

Полученный данные показывают, что эффект совместного ингибирования генов с-МУС и ККА8 носит аддитивный характер.

В то же время, уровень стимулирования апоптоза при блокировании генов с-МУС и КЯАБ, относящихся к ключевым для развития колоректального рака, в исследованных клетках рака этой локализации недостаточен для применения такого подхода в терапевтических целях.

Актуальным является создание препаратов для комплексной терапии, включающей стандартную химиотерапию в сочетании с таргетными

препаратами. Для химиотерапевтического воздействия выбран препарат оксали платан.

2. ЗАВИСИМОСТЬ АПОПТОТИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ОТ ДОЗЫ И ВРЕМЕНИ ВОЗДЕЙСТВИЯ ОКСАЛИПЛАТИНА

Основным направлением настоящей работы явилась разработка основ нового перспективного противоопухолевого средства, которое могло бы свести к минимуму побочные эффекты от воздействия химиопрепарата и при этом добиться максимального апоптотического эффекта. Работу проводили на культивируемых клетках полипозного колоректального рака с мутацией в гене APC (НТ-29). Для химиотерапевтического воздействия выбран один из наиболее современных препаратов, используемых при лечении рака кишечника, - оксалиплатин. Оксалиплатин - это препарат третьего поколения, имеющий в своем составе атом платины (Liu H.F. et al. 2010). При применении в стандартных дозировках, оксалиплатин имеет много побочных эффектов (Nannizzi S. et al, 2010).

На первом этапе изучена реакция культуры клеток НТ-29 на различные концентрации оксалиплатина. Определены концентрации оксалиплатина в диапазоне 1 мкМ - 250 мкМ в 1 мл. (Рис 4)

50 100 150 200 250

Концентрация оксалиплатин«, мкм

Рис. 4 Зависимость гибели клеток от различных концентраций оксалиплатина

При концентрации оксалиплатина 50 мкм гибель клеток составила около 50 %. При концентрации оксалиплатина достигающей 100 мкм и более мы наблюдали почти тотальную гибель клеток. Наибольший интерес представляли минимальные концентрации оксалиплатина 1 мкм и 5 мкм. При этих концентрациях гибель клеток практически не отличалась от контроля и составляла 1-3%, то есть, токсический эффект от воздействия химиопрепарата незначителен.

В предшествующих экспериментах показано, что через 24 и 48 часов после введения оксалиплатина происходит повышение экспрессии генов, отвечающих на оксалиплатин (ЭееЛагат Я. е1 а!., 2010). Поэтому для дальнейших экспериментов выбраны два временных интервала 24 и 48 часа.

3. ПРОФИЛИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК НТ-29 ПРИ ДЕЙСТВИИ ОКСАЛИПЛАТИНА

Изучен функциональный ответ генов на оксалиплатин для выявления потенциальных генов-мишеней, ингибирование которых должно давать наибольший эффект гибели раковых клеток. Сформирована панель генов, каждый из этих генов потенциально мог играть важную роль в защите раковой клетки от воздействия химиопрепарата. Формирование панели генов проводили на основании анализа литературы и баз данных по экспрессионным характеристикам. Принцип отбора состоял в выборе генов, наиболее часто экспрессируюшихся при колоректальном раке и, особенно, при химиотерапевтическом воздействии. Нас интересовали гены, отвечающие на химиопрепаты, содержащие платину, в особенности на оксалиплатин.

Уровень экспрессии генов измеряли с помощью ПЦР в реальном времени. Оценку чистоты реакции проводили по кривой плавления амплифицированных фрагментов ДНК, соответствующих каждому гену. Все эксперименты повторены несколько раз и оценивались только после получения одинаковых повторяющихся результатов в разных экспериментах. Для проверки зоны линейности сделаны серийные разведения кДНК, и произведён ПЦР в реальном времени с этими разведениями, по каждому исследуемому гену, затем построены калибровочные кривые по каждому гену.

Чтобы выявить наиболее эффективные гены мишени, использован подход, опирающийся на анализ дозовых и временных зависимостей функционального ответа раковых клеток на действие оксалиплатина. Эксперименты поставлены при 2-х концентрациях оксалиплатина - 1 мкМ и 5 мкМ, экспрессию оценивали в 2-х временных интервалах - через 24 ч и через 48 ч. после постановки эксперимента. Далее проанализированы полученные диаграммы в зависимости от дозы оксалиплатина и от времени инкубации (Рис. 5,6,7,8). При анализе экспрессию считали повышенной при ее возрастании в 2 и более раза. Было важно выявить те гены, которые проявляют зависимость от дозы и времени и реагируют повышением экспрессии на разные концентрации оксалиплатина на всем протяжении культивирования.

.. n in n т: я

и и и

ffi m i5 m in р м

Рис. 5 Экспрессионный профиль генов через 24 часа после постановки эксперимента. Сравнение при дозировках оксалиплатина (0x1), составляющих 1 и 5 мкм.

48 ч

□ 0x11 ■ 0x15

Рис. 6 Экспрессионный профиль генов через 48 часов после постановки эксперимента. Сравнение при дозировках оксалиплатина (Ох1), составляющих 1 и 5 мкм

Ох11 мкМ

3,5 -,

Рис. 7 Экспрессионный профиль генов при концентрации оксалиплатина 1 мкм. Сравнение временных характеристик (при 24 ч и при 48 ч).

Ох1 5 мкМ

Рис. 8 Экспрессионный профиль генов при концентрации оксалиплатина 5 мкм. Сравнение временных характеристик (при 24 ч и при 48 ч).

В сформированную панель вошли гены:

- гены BIRC - семейства (baculoviral 1АР repeat-containing proteins) - из группы ингибиторов апоптоза (Birc2, Birci, Birc4, Birc5, Bird) (Fulda S et al., 2012),

- ингибитор касназы 8 - FLIP (FLIP, длинная и короткая изоформы) (FLIP, sCFL, LF) (Mannhold K. et al., 2010),

- гены семейства Bcl-2 (Bcl-2, Bcl-XL) (Portt L. et al., 2011);

- ген Trap I (TNFR ассоциированный белок), ингибитор апоптоза путем блокирования митохондриального стресса (Landriscina М. et al, 2009);

- гены c-MYC и KMS, усиливают пролиферацию раковых клеток (Prochownik E.V. et al., 2010);

- гены, участвующие в контроле целостности генома (МСМ4, NHEJ1, ERCC1) (Kirschner К. et al., 2010);

- ген теплового шока (HspA5) (Ramp U. et al., 2007).

При анализе экспрессию считали повышенной при ее возрастании в 2 и более раза.

При использованных дозах оксалиплатина в обоих временных промежутках повышенную экспрессию имели только 3 гена - Birc3, Birc7 и МСМ4, которые демонстрируют четкую зависимость от дозы в обоих изученных временных интервалах (Рис 9).

Birc3 Birc7 МСМ4

Рис. 9 Экспрессионный профиль генов ВггсЗ, В/гс7, МСМ4 в зависимости от времени и дозировки воздействия оксалиплатина. Эти 3 гена реагируют повышением уровня экспрессии более, чем в 2 раза и демонстрируют четкую зависимость от дозы в обоих из изученных временных интервалах

Из полученных данных следует, что гены ВггсЗ, В ¡гс 7 и МСМ4 имеют повышенную и связанную с дозой оксалиплатина экспрессию в течение всего времени инкубации, в отличие от других исследованных генов.

4. ИЗУЧЕНИЕ АПОПТОТИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА В КЛЕТКАХ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА КУЛЬТУРЫ НТ-29 ПРИ ИНГИБИРОВАНИИ ВЫЯВЛЕННЫХ ГЕНОВ-МИШЕНЕЙ.

Первоначально изучен апоптотический эффект от ингибирования функции генов В'/гсЗ, Вис7 и МСМ4 по отдельности. В качестве контроля использовали три варианта:

1) ничем не обработанные клетки,

2) клетки, обработанные только оксалиплатином,

3) клетки, обработанные оксалиплатином, с добавлением олигонуклеотида со случайной последовательностью.

Апоптотический эффект изучен при ингибировании отдельных генов ШгсЗ, В¡гс7 и МСМ4 с разными концентрациями оксалиплатина (1 и 5 мкм). При обоих из исследованных концентраций оксалиплатина наименьшая доля апоптотических клеток (30% - 40%, в зависимости от дозы) наблюдается при ингибировании гена ШгсЗ (с-1АР2), наибольшее (50% - 60%, в зависимости от дозы) - при ингибировании гена МСМ4. Различие в доле апоптотических клеток при ингибировании указанных генов составляет 20%, то есть, ингибирование гена МСМ4 дает возрастание апоптотического эффекта на примерно 50% по сравнению с ингибированием гена В'ггсЗ. Ингибирование гена В\гс7 (МЬ-1ЛР, Ь'тп) приводит к промежуточной, по отношению к генам ВггсЗ и МСМ4, доле апоптотических клеток - на уровне 45% - 50%.

Хотя ингибирование гена МСМ4 позволило достичь высокого апоптотического эффекта при низких концентрациях химиотерапевтического средства - оксалиплатина, мы предположили, что комбинированное действие миРНК против выявленных генов-мишений может еще более увеличить этот эффект. С этой целью изучены различные парные комбинации ингибирования генов.

При обеих исследованных дозах оксалиплатина (1 мкМ и 5 мкМ) самый слабый результат дало совместное ингибирование генов В'1гсЗ/В1гс7 (Рис. 10). Комбинированное ингибирование этих генов позволило только на 5% -10% увеличить долю апоптотических клеток по сравнению с ингибированием только гена В1гс7.

Oxll

100 so 80 0x15

__

j[ 70 Т —f— -- —

! 50 * 40 ¡gl...........

* 30 —

20

Birc3+eirc7 9irc3+MCM4 Mtc7-*MCM4

Рис. 10 Апоптотический эффект при ингибировании комбинаций генов ШгсЗ. Шгс7 и МСМ4 при разных концентрациях оксалиплатина (1 и 5 мкм).

Подобный результат получен при совместном ингибировании генов В\гсЗ/МСМ4 (Рис. 10). По сравнению с эффектом от ингибирования только гена МСМ4, дополнительное ингибирование еще и гена В1гсЗ добавляло к доле апоптотических клеток только 5%. То есть, комбинированное ингибирование генов РагсЗ/МСМ4 не приводит к синергетическому эффекту.

В то же время, совместное ингибирование генов МСМ4 и Вггс7 дало существенный синергетический эффект. Доля апоптотических клеток возросла на 15% - 20% по отношению к эффекту от ингибирования только гена МСМ4, достигнув 80% при 5 мкМ оксалиплатина (Рис. 10, 11).

■ контрольные образцы

■ опытные образцы с Ох! I

МКМ

а опытные образцы с Ох! 5 мкм

Рис. 11 Сводная диаграмма объединяющая эффекты апоптоза (доля апоптотических клеток,%) в контрольных образцах, при ингибировании отдельных генов ВисЗ, Внс7 и МСМ4 и их комбинаций

1) ничем не обработанные клетки

2) клетки, обработанные миРНК со случайной последовательностью нуклеотидов

3) клетки, обработанные оксалиплатином I мкМ

4) клетки, обработанные миРНК со случайной последовательностью нуклеотидов + оксалиплатин 1 мкМ.

5) клетки, обработанные оксалиплатином 5 мкМ

6) клетки, обработанные миРНК со случайной последовательностью нуклеотидов + оксалиплатин 5 мкМ.

7) апоптотический эффект от подавления гена Birc3

8) апоптотический эффект от подавления гена Birc7

9) апоптотический эффект от подавления гена МСМ4

10)апоптотический эффект от подавления комбинации генов Birc3+Birc7

11 )апоптотический эффект от подавления комбинации генов Birc3+MCM4

12)апоптотический эффект от подавления комбинации генов Birc7+MCM4

Ген Birc7 осуществляет не только антиапоптотическую функцию, но и участвует также в контроле клеточного цикла и его ингибирование с помощью миРНК приводит к снижению синтеза ДНК (Chen et al., 2012). Скорее всего, именно эта функциональная особенность гена Birc7 обеспечивает синергию в апоптотическом эффекте при его ингибировании одновременно с геном МСМ4, блокирование которого нарушает репликацию ДНК и остановку деления клетки для репарации дефектов.

Вследствие высокого уровня апоптоза при ингибировании генов МСМ4 или Birc7 в присутствии оксалиплатина (50% - 60%), было трудно оценить характеристики их вклада в апоптотический эффект при их совместном ингибировании. В этой связи изучены апоптотические эффекты ингибирования указанных генов при меньшей дозе оксалиплатина - 0,3 мкМ и меньшем времени 40 ч. (Рис.12).

МСМ4 Birc? MCM4+Bfrc7

Рис. 12 Апоптотические эффекты при ингибировании генов при дозе оксалиплатина 0,3 мкМ (время постановки эксперимента 40 часов)

Таким образом, полученные данные показывают, что эффект от ингибирования изучаемых генов носит аддитивный характер.

Возможно, при низкой концентрации оксалиплатина и, соответственно, малом числе повреждений ДНК, действие гена В\гс7 ограничивается выполнением антиапоптотической функции. Ингибирование генов В1гс7 и МСМ4 приводит к возникновению двух независимых событий - активации каспазы 9, приводящей к апоптозу, и нарастанию апоптотических сигналов из-за нарушений репликации ДНК, соответственно.

На рис. 13 представлены сигнальные пути с участием изучаемых генов. Апоптотические пути подразделяют на внутрений и внешний. Внешний путь

связан со стимуляций клеточных рецепторов, внутренний характеризуется стрессовым воздействием на клеточные ораганеллы, прежде всего митохондрии и ЭПР. Действие оксалиплатина должно «запускать» механизм апоптоза, но активирующиеся гены защищают клетку от воздействия химиопрепарата. Ген МСМ4 участвует в репликации ДНК и играет важную роль в поддержании целостности генома. При нарушении этого процесса накопление дефектов ДНК приводит к апоптозу раковой клетки. Ген В1гс7 блокирует активацию каспазы 9, предотвращая развитие апоптоза. При ингибировании гена Ви-с7 происходит активация каскада каспаз, что приводит к апоптозу раковой клетки. Ингибирование этих генов в сочетании с низкими дозировками оксалиплатина может быть перспективным для обеспечения высокой эффективности терапии.

Внучкикий иуту

М)Д««яи(>ет_ \

V W

\ Bs!-; №

яи^хаом С № 1

" &rt-i ;

frV% ааыЛ 1

Нлшиегав

ДНК X X"

Ядро

т

Рис. 13 Схема сигнальный путей генов, проявивших повышенную экспрессию при воздействии оксалиплатином

В целом, совместное ингибирование экспрессии генов В ire 7 и МСМ4 на фоне оксалиплатина позволяет достигнуть значительно более высокого уровня апоптоза, чем просто при воздействии оксалиплатина. На рис. 14 видно, что к гибели 80% клеток приведет либо воздействие оксалиплатина в дозировке более 80 мкМ, либо воздействие генов Birc7 и МСМ4 на фоне 5 мкм

оксалиплагина. Таким образом, совместное ингибирование экспрессии генов ЕНгс7 и МСМ4 позволяет достигнуть высокого уровня апоптоза при дозировке оксалиплатина в 16 раз меньшей, по сравнению с применением только этого химиопрепарата. (Рис. 4 и 14).

воздействие галька

уоясзвкпдатикг;

—«— СКСЭЛИ1 та I ин и

комбинация •%''' генов МСМ4 +

Яр

Концентрация оксалиплатина, мим

Рис. 16 Количество апоптотических клеток (%) в зависимости от концентрации оксалиплатина. Графики с одними и теми же данными, но приведены в разных масштабах. А - рассмотрен вид кривых, при концентрации оксалиплатина до 100 мкм. Б - это тот же самый график, рассмотрений в другом маштабе, вид кривых, при концентрации оксалиплатина до 5 мкм.

Разработка терапевтического средства на основе соответствующих миРНК позволит принципиально снизить токсический эффект химиопрепарата при достижении высоких противоопухолевых результатов.

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что ингибирование с помощью миРНК гена c-MYC, активирующегося вследствие мутации в гене А PC в культуре клеток колоректального рака НТ-29, приводит к апоптозу клеток на уровне 15-17 %. В культуре клеток колоректального рака Сасо2 без мутации в гене АРС, уровень экспрессии гена c-MYC существенно ниже и при его ингибировании апоптоз практически не развивается.

2. Ингибирование гена KRAS, являющегося еще одним ключевым геном при развитии колоректального рака, приводит к апоптозу клеток на уровне 14% в культуре НТ-29. Совместное ингибирование генов c-MYC и KRAS дает аддитивный апоптотический эффект на уровне 30% клеток.

3. Определены профили экспрессии сформированного набора генов в культуре клеток НТ-29 в зависимости от дозы и времени действия химиотерапевтического препарата оксалиплатина. В результате проведенного анализа профилей экспрессии выявлены потенциальные мишени терапевтического воздействия - гены Birc3, Birc7 и МСМ4.

4. Показано, что ингибирование малыми интерферирующими РНК генов Bird, Bird и МСМ4 при 5 мкМ оксалиплатина приводит к апоптозу клеток колоректального рака НТ-29 на уровнях 40%, 50% и 60%, соответственно.

5. Показано, что совместное ингибирование генов Birc7 и МСМ4 дает синергетический апоптотический эффект, близкий к аддитивному при низкой (0,3 мкМ) дозе оксалиплатина. Другие комбинации интерферирующих РНК, ингибирующих гены Birc3, Birc7 и МСМ4, синергетическим воздействием на уровень апоптоза не обладают.

6. Показано, что уровень апоптоза при ингибировании комбинации генов Birc7 и МСМ4 составил 80% на фоне 5 мкМ оксалиплатина. Этот результат соответствует действию в 16 раз большей дозы оксалиплатина без ингибирования этих генов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Bavykin A.S., Korotaeva A.A., Poyarkov S.V., Syrtsev A.V., Tjulandin S.A., Karpukhin A.V. Double siRNA-targeting of cIAP2 and LIVIN results in synergetic sensitization of HCT-116 cells to oxaliplatin treatment // OncoTargets and Therapy. 2013.V.6.P. 1333- 1340

2. Коротаева A.A., Бавыкин A.C., Поярков C.B. Карпухин A.B. Ингибирование потенциальных генов-мишеней с помощью интерферирующих РНК в клетках колоректального рака // Интеграл. 2012. № 5. С. 26-28.

3. Коротаева A.A., Музаффарова Т.А., Сачков И.Ю., Кузьминов A.M., Карпухин A.B. Мутации в генах MYH и АРС при множественном полипозе среди российских больных // Медицинская генетика. 2011. 'Г. 10 №1. С.14-18.

4. Коротаева A.A., Музаффарова Т.А., Карпухин A.B. Молекулярно-гснетические причины множественного полипоза и рака толстой кишки: наследственные мутации в гене MYH // Медицинская генетика. 2008. Т.7. № 9. С. 10-17.

Публикации в других изданиях:

5. Бавыкин A.C., Коротаева A.A., Сырцев A.B., Тюляндин С.А., Карпухин A.B. Разработка способов повышения эффективности химиотерапии на основе малых интерферирующих РНК // Журнал «Злокачественные опухоли» (Journal of Malignant Tumours). 2012. T.2. №2. C.l 11-116.

6. Бавыкин A.C., Коротаева A.A., Сырцев A.B. , Тюляндин С.А., Карпухин A.B. Преодоление резистентности клеток рака толстой кишки к оксалиплатину с помощью таргетного ингибирования экспрессии генов малыми интерферирующими РНК. //Материалы III международной научно-практической конференции: «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». 2012. С. 57-58.

7. Bavykin A.S., Korotaeva A. A., Goncharova Е.А. Zenit-Zhuravlouva E.G., Syrtsev А.V., Karpukhin A.V. Analysis of different apoptosis ways by gene expression analysis and siRNA silencing in colorectal cancer cells // Eur. J. Hum.Gen. 2011. V.19. P. 201

8. Карпухин A.B., Бавыкин A.C., Коротаева A.A., Шубин В.П., Апанович Н.В., Кавнацкий И.О, Петере М.В., Черняев В.М., Кашурников А.Ю., Зенит-Журавлева Е.Г, Завадский C.B., Сырцев А.В, Любченко Л.Н., Грицай А.Н., Матвеев В.Б., Тюляндин С.А. Особенности экспрессии генов злокачественно трансформированных клеток при раке ряда локализаций. // Матер. 8-ой Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток». - Звенигород, 2011, С.35

9. Коротаева A.A., Бавыкин A.C., Зенит-Журавлева Е.Г.,. Гончарова Е.А, Карпухин A.B. Ингибирование функции генов сигнальных путей и различия в апоптотическом эффекте при разных структурных характеристиках генома раков // Матер. VI съезда мед. генетиков. Медицинская генетика. 2010. С.91.

10. Музаффарова Т.А., Коротаева A.A., Сачков И.Ю., Кузьминов A.M., Гинтер Е.К., Карпухин A.B. Мутации в генах МУН и АРС среди российских больных с множественным полипозом. // Матер. VI съезда мед. генетиков. Медицинская генетика. 2010. С.121.

11. Бавыкин A.C., Зенит-Журавлева Е.Г., Коротаева A.A., Гончарова Е.А., Сырцев A.B., Карпухин А.В Эффективная индукция апоптоза клеток рака толстой кишки с помощью интерферирующих РНК // Матер. VI съезда мед. генетиков Медицинская генетика. 2010. С.15

12. Korotaeva A.A., Bavykin A.S., Zenit-Zhuravlouva E.G., Goncharova E.A., Karpukhin A.V. The differentl effect of the gene knockdown on apoptosis of two human colon cancer cell lines // Eur. J. Hum.Gen. 2010. V.18. P.193

13. Карпухин A.B., Поспехова Н.И., Логинова A.H., Музаффарова Т.А., Цуканов A.C., Смирнова Т.Ю., Апанович Н.В., Коротаева A.A., Гончарова

Е.А., Любченко Л.Н., Новикова О.В., Гинтер Е.К. Генетическая гетерогенность проявления мутаций в генах-супрессорах наследственных форм онкологических заболеваний// Матер. 7-ой Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток». - Звенигород, 2009. С.16-17 14. Карпухин A.B., Поспехова H.H., Логинова А.Н., Музаффарова Т.А., Смирнова Т.Ю., Цуканов A.C., Апанович Н.В., Коротаева A.A., Любченко Л.Н., Гинтер Е.К. Молекулярные особенности генов-супрессоров наследственных форм ряда частых онкологических заболеваний// Сборник матер. Всеросс. конф. с международным участием «Молекулярная онкология». - Новосибирск. 2008. С. 112-113.

Список сокращений

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ОНП - однонуклеотидный полиморфизм

ПААГ — полиакриламидный гель

П. н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

САП - семейный аденоматозный полипоз

ХН - хромосомная нестабильность

АРС - Adenomatous Polyposis Coli gene - ген семейного аденоматозного

полипоза толстой кишки

BSA- бычий сывороточный альбумин

CSGE - метод конформационно - чувствительного электрофореза

MBA - N,N' - метилен бисакриламид

MYH - MutY homologue -гомолог гена MutY

Oxl - оксалиплатин

РСА - персульфат аммония

РТТ - метод тестирования неполноценного белка

SDS - додецилсульфат натрия

SSCP - метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК ТЕМЕД - N,N,N',N - тетраметилэтилендиамин ЭДТА - этилеидиаминтетраацетат

Подписано в печать:

05.11.2013

Заказ № 9018 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 wvw.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Коротаева, Александра Алексеевна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи

04201364691

Коротаева Александра Алексеевна

РАЗРАБОТКА МИШЕНЕЙ ДЛЯ ТЕРАПИИ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА НА ОСНОВЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ГЕНОМИКИ

03.02.07 "Генетика"

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: д.б.н., профессор А.В. Карпухин

МОСКВА, 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ....................................................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................................................................................6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................................................................................13

1. ПОЛИПОЗ И КОЛОРЕКТАЛЬНЫЙ РАК..............................................................................13

2. РОЛЬ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ MYH И АРС ПРИ ПОЛИПОЗНОМ КОЛОРЕКТАЛЬНОМ РАКЕ ............................................................................................................19

3. ГЕНЫ СЕМЕЙСТВА МУС..................................................................................................................20

4. ГЕНЫ СЕМЕЙСТВА RAS ..................................................................................................................23

5. ДЕЙСТВИЕ ОКСАЛИПЛАТИНА ПРИ ЛЕЧЕНИИ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА.........................................................................................24

6. ГЕНЫ РЕПАРАЦИИ ..............................................................................................................................27

7. ГЕНЫ, ОТВЕЧАЮЩИЕ ЗА ЦЕЛОСТНОСТЬ ГЕНОМА ......................................29

8. АПОПТОЗ-ПРОГРАМИРУЕМАЯ КЛЕТОЧНАЯ ГИБЕЛЬ ..........................30

9. ГЕНЫ ИНГИБИТОРЫ АПОПТОЗА ........................................................................................33

10. РЕГУЛЯТОРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БЕЖОВ СЕМЕЙСТВА IAP В АПОПТОЗЕ ......................................................................................................................................................37

И. РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ ....................................................................................................................41

12. ИНГИБИРОВАНИЕ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ГЕНОВ МИШЕНЕЙ В

КОМБИНИРОВАННОЙ ТЕРАПИИ РАКА ........................................................................43

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ..............................................................................................................46

1. ПОЛУЧЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ .... 46

2. КОНСТРУИРОВАНИЕ миРНК ..........................................................................................46

3. ТРАНСФЕКЦИЯ КЛЕТОК ПРЯМЫМ МЕТОДОМ И ОБРАБОТКА

ОКСАЛИПЛАТИНОМ ..................................................................................................................48

4. ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ ................................................................50

5. АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ..................................................................................52

5.1 ВЫДЕЛЕНИЕ РНК .........................................................................52

5.2 ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ .... 53

5.3 ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ С ПРОДУКТАМИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ........................................................................................................................54

6. КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ............................................................................60

7. АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ГЕНА АРС И ГЕНА МУН .. 61

7.1 ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ........................................................................................................................62

7.2 ПЦР (ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ) ................................................62

7.3 ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ПЦР ....................................................................................................67

7.4 ОБРАЗОВАНИЕ ГЕТЕРОДУПЛЕКСНЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК ... 67

7.5 ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ..............................................................................................................................68

7.6 ОКРАСКА ГЕЛЯ ..............................................................................................................................70

7.7 АВТОМАТИЧЕСКОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ ........................................................70

8. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ....................................71

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ ............................................................................................72

1. АНАЛИЗ ИНГИБИРОВАНИЯ ГЕНА С-МУС В КАЧЕСТВЕ МИШЕНИ ТАРГЕТНОЙ ТЕРАПИИ ............................................................................72

2. ЗАВИСИМОСТЬ АПОПТОТИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ОТ ДОЗЫ И ВРЕМЕНИ ВОЗДЕЙСТВИЯ ОКСАЛИПЛАТИНА ........................................83

3. ПРОФИЛИ ЭКСПРЕССИ ГЕНОВ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК НТ-29 ПРИ ДЕЙСТВИИ ОКСАЛИПЛАТИНА ....................................................................85

4. ИЗУЧЕНИЕ АПОПТОТИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА В КЛЕТКАХ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА КУЛЬТУРЫ НТ-29 ПРИ

ИНГИБИРОВАНИИ ВЫЯВЛЕННЫХ ГЕНОВ-МИШЕНЕЙ ............99

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ..........................................................................................................................................113

ВЫВОДЫ ........................................................................................................................................................115

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ..............................................................................................................117

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ОНП - однонуклеотидный полиморфизм

ПААГ - полиакриламидный гель

П. н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

САП - семейный аденоматозный полипоз

ХН - хромосомная нестабильность

АРС - Adenomatous Polyposis Coli gene - ген семейного аденоматозного

полипоза толстой кишки

BS А - бычий сывороточный альбумин

CSGE - метод конформационно - чувствительного электрофореза

MBA - N,N' - метилен бисакриламид

MYH - MutY homologue -гомолог гена MutY

Oxl - оксалиплатин

РСА - персульфат аммония

РТТ - метод тестирования неполноценного белка

SDS - додецилсульфат натрия

SSCP - метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК ТЕМЕД - N,N,N',N - тетраметилэтилендиамин ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы В структуре онкологической заболеваемости колоректальный рак прочно занимает второе-третье место в большинстве экономически развитых стран мира. Ежегодный прирост заболеваемости колоректальным раком в мире в последние пятнадцать лет составляет в среднем около 3% в год [Давыдов, 2009]. Одним из частых типов колоректального рака является полипозный рак толстой кишки — рак, развивающийся на фоне множественного полипоза.

Одним из основных средств терапевтического лечения колоректального рака является химиотерапия. Применяемые в настоящее время средства химиотерапии характеризуются не высокой эффективностью, но весьма значимой токсичностью, ограничивающей возможности длительного воздействия на опухоль [Galluzi et al., 2012]. Наиболее современным средством в настоящее время является так называемая таргетная терапия, направленная на блокирование проявления конкретных генов. Но используемые сейчас способы и средства блокирования отдельных генов также несовершенны. Многие из них токсичны, недостаточно специфичны или не оказывают должного терапевтического эффекта. Требуется развитие новых подходов, базирующихся на последних достижениях «постгеномной эры» и учитывающих структурно-функциональные особенности клеток злокачественной опухоли.

Частой причиной колоректального рака является аденоматозный полипоз. Наследуемые мутации в генах АРС и MYH приводят к возникновению множественного полипоза и семейного аденоматозного полипоза (САП), которые являются предшественниками рака толстой кишки [Poovorawan et al., 2012,]. С точки зрения молекулярно-генетических причин возникновения рака, наиболее важны

наследуемые мутации в гене АРС, наличие которых приводит к колоректальному раку с вероятностью, близкой к 100% [Grover et al., 2012]. В этом плане немаловажное значение имеет тот факт, что мутации в гене АРС характерны в качестве одного из самых первых молекулярных нарушений не только для наследственной, но и для спорадической формы колоректального рака. При этом опухоли с мутацией в гене АРС составляют основную часть случаев рака этой локализации [Poovorawan et al., 2012]. Поэтому развитие новых способов и средств терапии колоректального рака с такой молекулярно-генетической характеристикой представляется особенно актуальным.

Применение существующих коммерческих таргетных препаратов в качестве монотерапии далеко не всегда дает существенный эффект. Это привело к включению таких препаратов в состав комплексной терапии, сочетающей стандартные химиотерапевтические воздействия с применением таргетных препаратов. Однако таргетные препараты, разработанные специально для применения совместно со стандартными химиопрепаратами, в настоящее время отсутствуют. В связи с этим, актуальна разработка новых таргетных препаратов и поиск альтернативных лечебных подходов. Одним из таких подходов является выявление генов, ингибирование которых способно приводить не только к снижению жизнеспособности раковой клетки, но и к усилению чувствительности опухоли к стандартному химиотерапевтическому лечению.

К наиболее современным способам блокирования функции генов относится РНК-интерференция. В последние годы были обнаружены короткие фрагменты РНК (около 21-25 нуклеотидов), которые образованы из длинных молекул двуцепочечной РНК. Эти фрагменты называются малыми интерферирующими РНК (миРНК, siRNA -

short interfering RNA). Такие миРНК в составе комплекса с белками образуют каталитические структуры, вызывающие направленную деградацию комплементарной им мРНК-мишени [Pecot et al., 2011]. Интерферирующие РНК можно искусственно синтезировать и использовать для блокирования функции интересующего гена.

Применение миРНК является перспективным для разработки противоопухолевого средства, позволяющего существенно снизить дозировку химиопрепарата и, соответственно, свести к минимуму его побочное действие, при повышении эффективности терапии.

Как известно, одной из причин неконтролируемого размножения раковых клеток является нарушение запуска механизма апоптоза. Белки ингибиторы апоптоза - IAP (inhibitors of apoptosis proteins) играют очень важную роль в развитии аппотоза у большинства живых организмов. Достаточно часто клеточные мутации приводят к повышенной экспрессии генов ингибиторов апоптоза. Соответственно, мутантная клетка не погибает, а начинает дальше размножаться. Индуцирование апоптоза в раковых клетках является одним из основных направлений в современной терапии рака [Miura К et al., 2011]. Повышенная экспрессия генов репарации и репликации ДНК позволяет опухолевой клетке восстанавливаться после воздействия цитостатиков, нейтрализуя таким образом терапевтический эффект [Krawczyk Р et al., 2012]. «Выключение» генов ингибиторов апоптоза и генов, участвующих в контроле целостности генома, должно приводить к запрограммированной гибели раковой клетки, особенно в условиях индукции апоптоза. Исследование таких генов имеет как фундаментальное значение, с точки зрения выявления функции генов в норме и при

злокачественной трансформации, так и практическое значение, заключающееся в создании новых лекарственных средств.

Цель исследования

Разработка мишеней для терапии колоректального рака на основе малых интерферирующих РНК и функционального анализа генов.

Задачи исследования

1) На модели культивируемых клеток колоректального рака с мутацией в гене АРС с использованием малых интерферирующих РНК изучить значение экспрессии гена с-МУС для жизнеспособности раковых клеток. Сравнить полученные характеристики с уровнем экспрессии и апоптоза в клетках колоректального рака с отсутствием мутации в гене АРС.

2) Изучить апоптотический эффект от блокирования гена КЛАБ на модели клеток НТ-29. Определить уровень апоптоза при совместном ингибировании генов с-МУС и КЯАБ.

3) Изучить профили экспрессии сформированного набора генов в культивируемых клетках колоректального рака в зависимости от дозы и времени действия химиотерапевтического препарата оксалиплатина. Выявить потенциальные гены-мишени терапевтического воздействия.

4) Изучить апоптотический эффект от блокирования генов-мишений в культивируемых клетках колоректального рака с помощью малых интерферирующих РНК на фоне воздействия оксалиплатина.

Новизна полученных результатов

Выявлено, что ингибирование функциональной активности гена c-MYC с помощью малых интерферирующих РНК приводит к апоптотическому эффекту в клетках колоректального рака с мутацией в гене АРС, но не эффективно для клеток рака этой локализации без мутации в гене АРС. Показано, что совместное ингибирование генов c-MYC и KRAS приводит к аддитивному апоптотическому эффекту. На основании исследования профилей экспрессии генов в клетках колоректального рака с мутацией в гене АРС выявлены потенциальные мишени терапевтического воздействия - гены Birc3, Birc7 и МСМ4. Впервые изучен апоптотический эффект от ингибирования гена МСМ4 в клетках колоректального рака с мутацией в гене АРС. Впервые показано, что совместное ингибирование генов Birc7 и МСМ4 дает синергетический апоптотический эффект, близкий к аддитивному при низкой дозе оксалиплатина.

Научно-практическая значимость работы Разработан подход к таргетной терапии колоректального рака, основанный на выявлении генов-мишеней, блокирование которых позволяет существенно усилить ответ на стандартную химиотерапию. Выявлены гены, которые проявляют зависимость от дозы и времени и реагируют повышением экспрессии на разные концентрации оксалиплатина на всем протяжении культивирования. Такой подход является перспективным для поиска новых генов-мишеней терапевтического воздействия. Сконструированы и синтезированы малые интерферирующие РНК (миРНК) для ингибирования функции выявленных генов-мишеней. Найдена комбинация миРНК, обладающая синергетическим эффектом. При 5 мкМ оксалиплатина уровень апоптоза при ингибировании комбинации генов составил

и

80%, что соответствует действию в 16 раз большей дозы оксалиплатина без ингибирования этих генов. Разработка нового эффективного противоопухолевого препарата на основе полученных результатов позволит повысить эффективность противоопухолевой терапии при снижении уровня побочных явлений, что приведет к сохранению деятельной жизни многих больных и увеличению ее продолжительности.

Положения, выносимые на защиту

1) Подавление гена c-MYC в культуре клеток колоректального рака НТ-29 с мутацией в гене АРС приводит к апоптотическому эффекту достигающему 15-17 %. На клетках культуры Сасо2 без мутации в гене АРС при ингибировании гена c-MYC апоптоз практически не развивается.

2) Ингибирование гена KRAS в культуре клеток колоректального рака НТ-29 приводит к апоптотическому эффекту, достигающему 14 %. Совместное ингибирование генов c-MYC и KRAS приводит к аддитивному апоптотическому эффекту на уровне 30% клеток.

3) Определены профили экспрессии набора генов в зависимости от дозы и времени действия химиотерапевтического препарата оксалиплатина в культуре клеток НТ-29. В результате проведенного анализа выявлены потенциальные мишени терапевтического воздействия - гены Bird, Birc7 и МСМ4.

4) При ингибировании генов Birc3, Birc7 и МСМ4 малыми интерферирующими РНК в сочетании с низкими концентрациями оксалиплатина 1 мкМ и 5 мкМ выявлено, что ингибирование гена МСМ4 приводит к наиболее высокому уровню апоптоза, достигающему 60% в сочетании с 5 мкМ оксалиплатина.

5) При ингибировании попарных комбинаций этих трех генов выявлена наиболее эффективная пара, включающая гены Birc7 и МСМ4, ингибирование

которых приводит к значительному апоптотическому эффекту, достигающему 80% на фоне 5 мкМ оксалиплатина.

Апробация работы

Основные положения и результаты работы были представлены и обсуждены на российских и международных научно-практических конференциях и съездах: XV, XVI Российских Онкологических Конгрессах (Москва 2011-2012 гг.); Всеросс. конф. с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск. 2008), 8-ой Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток». (Звенигород, 2011); VI Съезд Российского общества медицинских генетиков (Ростов,

2010), European Human Genetics Conferences (Вена, 2009; Гетеборг, 2010; Амстердам,

2011), лауреат конкурса «Авангард знаний» 2012 в категории «Онкология».

По результатам работы подана заявка на патент №2013136339 от 02.08.2013 «Способ индукции апоптоза клеток злокачественной опухоли колоректального рака и средство для его осуществления».

Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании научного семинара МГНЦ РАМН 19 июня 2013 года.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ПОЛИПОЗ И КОЛОРЕКТАЛЬНЫЙ РАК

Число больных с распространенными формами рака ободочной кишки в последние годы не только остается стабильно высоким, но и отмечается тенденция к увеличению числа таких больных. В структуре онкологической заболеваемости колоректальный рак прочно занимает второе-третье место в большинстве экономически развитых стран мира. Более чем у 500 тысяч больных в год колоректальный рак является причиной смерти. Ежегодный прирост заболеваемости колоректальным раком в мире за последние пятнадцать лет составляет в среднем около 3% в год [Давыдов, 2009].

Наибольшая заболеваемость отмечается в США, Канаде, странах Западной Европы и России. Менее выражен рост заболеваемости в странах Азии и Африки. В Великобритании рак прямой кишки составляет 15% всех злокачественных опухолей, уступая лишь раку легкого. В США в 2000 г. зарегистрировано 130 200 случаев рака прямой и ободочной кишки, при этом умерло 56 300 больных, 93% приходится на лица старше 50 лет [Барсуков и др., 2006].

В России рак кишечника занимает одну из ведущих позиций. За последние 20 лет рак толстой кишки переместился в структуре онкологической заболеваемости населения Российской Федерации с 6-го на 2-е - 3-е место. В России �