Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение экспрессии генов метаболизма и сигнального пути ретиноидов при раке толстой кишки, желудка и легкого

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изменение экспрессии генов метаболизма и сигнального пути ретиноидов при раке толстой кишки, желудка и легкого"

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВА ЕКАТЕРИНА СЕРГЕЕВНА

ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ МЕТАБОЛИЗМА И СИГНАЛЬНОГО ПУТИ РЕТИНОИДОВ ПРИ РАКЕ ТОЛСТОЙ КИШКИ, ЖЕЛУДКА И ЛЕГКОГО

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

13 ПАИ 2015

005568440

Москва, 2015

005568440

Работа выполнена в лаборатории структурно-функциональной геномики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Научный руководитель: старший научный сотрудник Федерального

государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, кандидат химических наук Машкова Тамара Дмитриевна

Официальные оппоненты: ведущий научный сотрудник Федерального

государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, доктор биологических наук, профессор Сулп.чова Галина Ефимовна

заведующий лабораторией постгеномных молекулярно-генетических исследований Федерального

государственного бюджетного учреждения науки Института биохимической физики им. И М. Эмануэля Российской академии паук, доктор биологических наук, профессор

Носиков Валерий Вячеславович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт биологии гена Российской академии наук

Защита диссертации состоится "26" мая 2015 г. в 12— часов на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении наукн Институте молекулярной биологин им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Инстнт\та молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Автореферат разослан "24" апреля 2015 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Природные и синтепгческие ретиноиды (производные витамина А -ретинола) занимают в настоящее время значительное место в профилактике и терапии различных видов рака. Основной природный биологически активный ретинонд — полностью транс-ретиноевая кислота (ATRA - all-rrans-retinoic acid) - сигнальная молекула, регулирующая экспрессию большого количества генов и играющая очень важную роль в эмбриогенезе, клеточной пролиферации, дифференцнровке ч канцерогенезе (Blomhoff et al, 2006).

Биосинтез ATRA — процесс многоэтапный, в котором участвует множество генов, кодирующих ферменты, различающиеся по активности и уровню экспрессии (Belyaeva et al., 2005; Parés et al., 2008; Kumar et al., 2012). Нарушения на каждом этапе этого метаболического пути могут приводить к онкологической трансформации. Большинство опубликованных работ посвящено изучению экспрессии какого-то одного или нескольких генов или ферментов, вовлеченных в метаболизм ретиноидов. Для многих тканей, включая нормальные и опухолевые ткани толстой кишки, желудка и легкого, ключевые гены и ферменты, ответственные за биосинтез ATRA, остаются неизвестными.

ATRA, связываясь с ядерными ретинондными рецепторами (RAR и RXR), регулирует экспрессию широкого спектра генов-мишеней (Brtko, 2007), включая гены, контролирующие различные метаболические и сигнальные пути, клеточный цнкл, днфференцировку и апоптоз. Изменение экспрессии таких генов связано с процессом неопластической трансформации. Немелкоклеточный рак легкого (HMPJ1), рак желудка (РЖ) и рак толстой кишки (РТК) относятся к наиболее распространенным в России и в мнре видам онкологических заболеваний {Jemal et al, 2011; Siegel et al., 2013; Давыдов и др., 2014; Каприн и др., 2014). Локализация и гистологический тип опухоли могут различаться как генетическими повреждениями, так и паттерном экспрессии генов.

Известно, что на чувствительность раковых клеток к ретиноидам могут влиять различные факторы, включая дерегуляцию экспресаш генов ретнноидного каскада. Знание комплексной картины изменений экспрессии генов, вовлеченных в метаболический и сигнальный пути ретиноидов при канцерогенезе, важно для понимания вклада этих изменений в процесс возникновения и развития злокачественных новообразований.

Цель ti задачи исследования. Цель настоящего исследования состояла в изучении изменения паттернов экспрессии генов, участвующих в метаболизме и сигнальном пути ретиноидов. при злокачественных опухолях толстой кишки, желудка и легкого.

В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи: 1) Идентифицировать гены, вовлеченные в метаболический и сигнальный пути ретиноидов в

нормальных н опухолевых тканях толстой кишки, желудка и легкого, и провести предварительную оценку их экспрессии с помощью анализа различных транскриптомных баз данных.

2) Провести количественный анализ изменения экспрессии отобранных при бионнформатическом аналнзе генов метаболизма и сигнального пути ретиноидов при РТК, РЖ и НМРЛ с помощью ПЦР, совмещенной с обратной транскрипцией (полуколичественная ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени).

3) Выявить корреляции между изменением уровня экспрессии этих генов и клннико-патологическими характеристиками опухолевых образцов.

4) Оценить вклад эпигенетических изменений (метилирование ДНК и модификация гистонов) в инактивацию исследованных генов.

Научная новнзна работы. Впервые показана комплексная картина изменения экспрессии генов, кодирующих ключевые ферменты биосинтеза АТЯА и ретинондные рецепторы, и выявлена их аномальная экспрессия при РТК, РЖ и НМРЛ по сравнению с нормальными тканями. Показано частое и значительное уменьшение уровня мРНК генов АЭШВ, АО!¡1С, КОШ, АКШВЮ, ПЛЮШ (РТК): генов АО! 14, АОШВ и .10///С, ДОЯ/2, АКШВЮ, ПЛЮШ (РЖ); генов АИШВ, АйНЗ, ЯОЯЦ 1ЮН11,1Ш.01П (НМРЛ) и значительное повышение уровня мРНК гена АКШВЮ при НМРЛ. Изменение экспрессии этнх генов происходит уже на ранних стадиях оиухолеобразования. Определен возможный вклад генов в нарушение каждого этапа биосинтеза АТЯА. Впервые показано резкое снижение уровня мРНК гена, кодирующего ядерный рецептор ЯХЯу, в большинстве опухолевых образцов при РТК, РЖ и НМРЛ. Впервые обнаружено значительное и частое снижение уровня белка АКШВЮ в образцах РТК и выявлена корреляция .между изменением уровня этого белка и .мРНК АКЛ1В10. Показано значительное снижение уровня экспрессии нескольких АТ11А-зависимых генов в большинстве опухолевых образцов по сравнению с нормальными тканями (7,С16р и ВЬС26АЗ при РТК; У.С16р при кишечном типе РЖ; ГВ-1, РАВРС1, Т1МРЗ и ОЛРК1 при НМРЛ).

Впервые выявлены корреляции между уровнем экспрессии генов и прогрессией опухолей, а также метастазированием опухолей при РТК: стадией опухоли (АОН1В, А ОН 1С, АКШВЮ, '¿С!6р), степенью дифференцировки опухолей (АКШВЮ и Sl.C26.A3) и образованием метастазов в регионарных лимфоузлах (АКШВЮ и КПбр). Выявлены корреляции между изменением уровня мРНК генов АОП4, ЛОШВ, АОН1С, АКШВЮ, 1ЮШ2 и 2С,16р и гистологическим типом РЖ (диффузный или кишечный). Впервые обнаружено скоординированное снижение экспрессии генов УВ-1 и РАВРС1, кодирующих мажорные белки цнтоплазматических мРНП в образцах рака легкого.

Показано участие эпигенетических изменений в снижении экспрессии генов:

4

метилирования ДНК (гены ЯйНЬ, НА1.1)Ш) и деацетилировання гистонов (гены '¿О 16р. Б1.С26АЗ и ЯЛШН1).

Научно-практнческая значимость работы. Комплексная картина изменения экспрессии большого количества генов, вовлеченных в биосинтез АТЯА, прн РТК. РЖ и НМРЛ позволила идентифицировать ключевые гены, аномальная экспрессия которых может приводить к резкому уменьшению содержания ретиноевой кислоты - основного эндогенного агонисга ретннондных рецепторов. Так как АТЯА, являясь плейотропным регу лятором транскрипционной активности многих генов, относится к важным факторам, необходимым для нормальной клеточной дифференцировкн и пролиферации, блокирование образования АТЯА может вызывать множество патологических изменений в нормальных тканях толстой кишки, желудка и легкого.

Значительное изменение уровня мРНК набора генов, колирующих ключевые ферменты биосинтеза АТЯА, и мРНК АТСА-зависимых генов можно обнаружить уже на ранних стадиях опухолевого процесса при РТК (включая аденомы). РЖ п НМРЛ. что позволяет рассматривать эти гены как потенциальные диагностические маркеры.

Выявленные корреляции между изменением уровня мРНК генов и прогрессней/метастазнрованием опухолей: стадией (АЭН/В, А[)ШС, АКК1В10, У.СПбр), степенью дифференцировкн (АКЯ/ВЮ, 31-С26АЗ) и образованием метастазов в регионарных лимфоузлах (АКЯ1В10, У.СПбр) при РТК, свидетельствуют о вовлеченности этих генов в процессы прогресса и метастазирования опухолей толстой кишки и прогностической значимости этих генов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на российских и межд\л!ародных конференциях: Молекулярная генетика, микробиология и вирусология (Москва, 2006): IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск. 2008): V и VI Московский Международный Конгресс "БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития" (Москва. 2009 н 2011); Сибирско-Таиваискнй форум "'Опыт научно-технического и инновационного сотрудничества Томской области и Тайваня"' (Томск.

2009); VI конференция "Фундаментальная онкология - Петровские чтения" (Санкт-Петербург.

2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 2 патента. Структура II объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 141 странице и включают 30 рисунков и 20 таблиц. Диссертация состоит из разделов: "Введение". "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты исследования", "Обсуждение результатов". "Заключение", "Выводы", "Список литературы", который содержит 260 ссылок, "Приложения".

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ОБЪЕКТЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали операционный материал от пациентов с диагнозом РТК, РЖ и НМРЛ, биопсийный материал, полученный прн колоноскопическом обследовании пациентов, а также три клеточные лишш злокачественных опухолей толстой кишки — HCT-116, RKO, НТ-29 (НИИ КО ГУ РОНЦ Ilm. H.H. Блохина РАМН, НИИ онкологии СО РАМН, Медицинский центр ЦБ РФ). После операции образцы немедленно замораживали при -70° С и хранили в этих условиях до использования. Анализировали более 170 пар (опухоль - "условная" норма) послеоперационных образцов тканей: 80 пар образцов толстой и прямой кишки, полученных от больных РТК, 38 пар образцов от больных РЖ, 44 пары образцов тканей легкого от пациентов с диагнозом НМРЛ, а также 9 пар биопсийных образцов, полученных от больных с диагнозом РТК. За условную норму принимали гистологически нормальные ткани, смежные с опухолью. Все образцы опухолей охарактеризованы согласно международной системе клинико-морфологической классификации опухолей TNM. С помощью гистологического анализа отбирали образцы с содержанием неопластических клеток не менее 70-80%. Пациенты ранее не подвергались лучевой и химиотерапии.

Для идентификации интересующих нас генов и предварительной оценки уровня их экспрессии в нормальных и опухолевых тканях толстой кишки, желудка и легкого анализировали различные доступные транскриптомные базы данных: клонотеки экспрессирующихся нуклеотидных последовательностей dbEST (The Expressed Sequence Tags database) (http://www.ncbi.nlm.mh.gov/nucest), данные высокопроизводительного секвенирования РНК (RNA-seq) (http://medicalgenomics.org/rna_seq_atlas/), стандартнзоваптто базу данных RefExA (Reference database for gene Expression Analysis) (http7/157.82.78.238/refexa'main_search.jsp) и базу данных ONCOM1NE (http://www.oncomine.org).

Основные методы: выделение РНК из образцов тканей н клеточных культу р, синтез кДНК, подбор геноспецифичных праймеров, полуколичественная ОТ-ПЦР, количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), электрофорез в ПААГ и агарозном геле, выделение белковых экстрактов, Вестерн-блот анализ. В качестве контрольных генов использовали АСТВ и ß2M (РТК). АСТВ (РЖ) и GAPDH (НМРЛ). Значимым считали изменение экспрессии гена в два и более раз. Анализ полученных результатов после ПЦР-РВ проводили по метод)' построения калибровочной кривой (зависимости порогового цикла от логарифма концентрации стандарта) с определением эффективности реакшш с помощью программы LinRegPCR (12.0). Для оценки статистической значимости изменений уровня мРНК анализируемых генов в опухолевых образцах по сравнению с нормой использовали непараметрическш! тест

6

Уилкоксона. Точный тест Фишера применяли для выявления корреляций между изменением уровня мРНК и клинико-патологическими характеристиками образцов. Все статистические процедуры проводили с помощью программного обеспечения Statistica 10.0. Данные считали достоверными при р<0.05.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ретиноиды играют фундаментальную роль в эмбриональном развитии, дифференцировке, росте клеток, поддержании нормального функционирования нервной и иммунной систем и многих других процессах. ATRA - наиболее активный природный ретиноидный метаболит, который может активировать и подавлять экспрессию большого числа генов. ATRA проявляет противоопухолевую активность, ингибируя клеточную пролиферацию и индуцируя дифференцировку клеток и апоптоз. Показано, что ретиноиды, включая ATRA, необходимы для поддержания нормальной морфологии слизистой оболочки желудка, толстой кишки и легкого (Matsumoto et al.. 2005: Nadauld et al., 2005).

Пищевые источники ретиноидов (эфиры ретинола, каротиноиды) превращаются в полностью транс-ретинол в основном в тонкой кишке. Ретинол в комплексе с ретинол-связывающими белками через кровоток доставляется из основного места своего хранения -печени, к клеткам-мишеням, где и происходит синтез ATRA. В клеточную цитоплазму поступает ретинол, связанный с ретинол-связываюшим белком 1. но в реакцию окисления, как полагают, вступает свободный ретинол. В слизистой оболочке толстой кишки, желудка и легкого человека в норме обнаружено значительное количество ATRA (Aug et al., 19%; Yokoyama et al, 2001). Биосинтез ATRA - процесс многоэтапный, в котором участвует множество ферментов, различающихся по активности, уровню экспрессии и субстратной специфичности (Belyaeva et al, 2005: Parés et al. 2008: Napoli et al. 2012) (Рис. 1).

Рис. 1. Основные участники биосинтеза ATRA в клетке.

Биосинтеза ATRA включает обратимую реакцию окисления ретинола в ретпналь с последующим его окислением в ретиноевую кислоту. В окислении ретинола в ретпналь участвуют как цитозольные алкогольдегидрогеназы (ADH), так и микросомальные NAD -зависимые ретинолдегидрогеназы (RDH). а в реакции восстановления ретиналя в ретинол -NADP -зависимые RDH и альдокеторедуктазы (AKR). В организме человека окисление

<çrbpj> nab- rdh nadh raldh <gç®35j»

ретинол i ■ ретпналь-- atra «* atra

nabph

яоршщия

CYP26 • „рог,™

ретиналя в ATRA катализируется ретинальдегиддегидрогеназами RALDH1, 2 и 3. Количество ATRA регулируется как АТИА-спнтезирующими ферментами, так и специфичными для человека ATRA-деградирующими щггохромами - CYP26A1, В1 и CI (Blomhoff et а!., 2006). CRABP2 белок осуществляет перенос ретиноевои кислоты нз цитоплазмы в ядро клетки для связывания с ретиноиднымн рецепторами, их активации и регуляции экспрессии генов-мишеней.

2.1. Анализ транскрилтомных баз данных

На основе анализа современной биомедшшнской литературы нами составлен список из 33 генов (семь ADH, 16 RDH, два AKR, три RALDH, три CYP26, два гена, кодирующие ретинол-и ATRA-связывающие белки), которые потенциально могут участвовать в биосинтезе ATRA, н проведен анализ нескольких транскриптомных баз данных для идентифицнкации генов-кандидатов, вовлеченных в этот процесс в тканях толстой кишки, желудка и легкого. Использованные нами базы данных: EST, микрочиповый анализ (гибридизация на микропанелях RefExa и ONCOMINE) и высокопроизводительное секвенирование (RNA-seq) -широко н успешно применяются для предварительной оценки уровня экспрессии генов (Rhodes et al„ 2004; Nagaraj et al„ 2007; Washietla et ai, 2012). Биоинформатический анализ показал, что большое количество исследованных нами генов имеют измененный уровень экспрессии при РТК, РЖ и НМРЛ по сравнению с нормальными тканями. При отборе генов для количественной оценки их экспрессии с помощью ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ кроме транскрипционной активности генов мы учитывали также каталитическую активность и субстратную специфичность кодируемых ими ферментов. С помощью бионнформатического анализа нами также проведена предварительная оценка изменения экспрессии при РТК, РЖ и РЛ нескольких генов, транскрипция которых регулируется ATRA. В итоге для количественного определения уровня экспрессии отобраны 20 генов, вовлеченных в метаболизм ретиноидов, 6 ATRA-зависимых генов и 6 генов ретиноидных рецепторов.

2.2. Изменение экспрессии генов, кодирующих ретинол-окисляющне ферменты

В реакции окисления аН-ггати-ретинола в ретиналь в нормальных тканях могут участвовать гены ADI1 (ADH1B, ADHIC, ADH3 - толстая кишка, ADHIB, ADHIC, ADH3 и ADH4 - желудок и легкие) и гены NAD'-завнснмых RDH (RDH10, RDHL и RDH5 - толстая кишка и желудок, RDHIO, RDHL и RoDH4- легкие) (Рис. 1).

Гены ADH, наиболее активно экспрессирующиеся в нормальных тканях, претерпевают значительные изменения уровня экспрессии уже на ранних стадиях развития рака: ADH1B (85%, 68/80) и ADH1C (81%, 65/80) для РТК (Рнс. 2: Таблица 1), A DIM (84%, 32/38), ADHIB (53%, 20/38) и ADHIC (58%, 22/38) для РЖ (Рис. 3; Таблица 1) и ADHIB (82%, 36/44) для НМРЛ

(Таблица 1). причем более чем в 90% опухолевых образцов толстой кишки и желудка наблюдали существенное снижение уровня экспрессии хотя бы одного из этих генов.

В опухолевых тканях толстой кишки уровень мРНК значительно снижен для генов 1(1)111. (90%, 27/30) и КОНЗ (50%, 15/30), наблюдается разнонаправленное изменение экспрессии гена ЯйНЮ. а уровень мРНК гена Л О!13 не изменяется в большинстве образцов (Таблица 1). В опухолевых тканях желудка по сравнению с нормой уровень мРНК гена КГ)Ш. изменяется не столь существенно, а уровень мРНК генов 1(1)1110, АОНЗ и 1(1)115 остается неизменным (Таблица 1).

Рис. 2. Изменение уровня мРНК генов ЛВН1В и ЛОН1С при РТК по данным ПЦР-РВ.

Г — гиперплазированная слизистая оболочка, А — аденома.

I - IV - стадии РТК, синх. р. - синхронный рак. н.д. — нет данных.

При НМРЛ наблюдали значительное снижение уровня мРНК генов ADH3 (79%, 26/33) и RDHL (73%, 22/30) в большинстве опухолевых образцов, содержание мРНК гена ADH1C существенно уменьшалось лишь в трети и не изменялось в половине образцов, а для генов AHD4, RDH/0 и RoDH4 показано разнонаправленное изменение экспрессии (Таблица 1).

Для оценки суммарного эффекта выявленных изменений на биосинтез ATRA кроме уровня экспрессии генов необходимо учитывать активность соответствующих ферментов. И хотя сравнение кинетических констант должно быть сделано с большой осторожностью, т.к. при их определении часто используют различные методы, можно с уверенностью сказать, что в реакции окисления ретинола наибольшей активностью обладают ADH4, RDH10. ADH1C и ADH1B ферменты (Belyaeva et al.. 2008; Parés et al.. 2008). Показано, что RDH10 - это доминирующая ретинол-окисляющая RDH в эмбриогенезе мышей (SandelI el al.. 2012), в то время как семейство ADH ферментов играет важную роль в биосинтезе ATRA в клетках взрослого организма (Kumar et al.. 2012). Следует отметить, что ADH ферменты являются цитозольными белками, при этом высокая каталитическая эффективность окисления ретинола показана именно в цитозоле клеток слизистой оболочки толстой кишки (Parlesak el al.. 2000).

S «M 5

in'

1Г!

■ ADH4 О ADHJC n ADH1B

Ш IV

Pue. 3. Изменение уровня мРНК генов ADH4, AD HIC u ADH1B при РЖ по данным ПЦР-РВ.

I - IV-стадии РЖ.

RoDH4 и, в большей степени, ADH3, RDHL и RDH5 оксидоредуктазы характеризуются меньшей каталитической активностью в реакции окисления ретинола (Molotkov et al., 2002), поэтому их вклад в реакцию окисления ретинола значительно меньше по сравнению с ADH4, ADH1 и RDH10, учитывая еще и меньший уровень их содержания в тканях толстой кишки, желудка и легкого.

Таким образом, в большинстве опухолевых образцов мы выявили значительное снижение уровня мРНК генов, кодирующих высокоактивные ферменты окисления ретинола в ретиналь, и наиболее активно экспрессирующихся в нормальных тканях толстой кишки, желудка и легкого. Поэтому снижение их экспрессии может приводить к значительному уменьшению образования ретнналя, и, соответственно, ATRA. а также к накоплению ретинола.

2.3. Изменение экспрессии генов, кодирующих ретиналь-восстанавливающие ферменты

В реакции восстановления ретиналя в ретинол участвуют гены ЫАОР+-зависимых RDH (RDH11 и RDHI2 (желудок и легкие)), AKR (AKR1B10 и AKR1B1), а также гены ADH (в основном ADH4, хотя эффективность фермента значительно меньше, чем в реакции окисления ретинола). Наибольшей ретиналь-восстанавливающей активностью обладают RDH12, RDH11, AKR1B10 и ADH4 (Belyaeva et al., 2008; Parés et al, 2008).

Гены, наиболее активно экспрессирующиеся в нормальных тканях, в опухолях претерпевают самые значительные изменения в уровне экспрессии: AKR1B10 (87%, 69/80) -РТК (Рис. 4); ADH4 (84%, 32/38), RDH12 (84%, 32/38) и AKR1B10 (74%, 28/38) - РЖ (Рис. 6) и RDH11 (66%, 29/44) и AKR1B10 (80%, 35/44) - НМРЛ.

Следует отметить, что уровень мРНК гена AKR1B10 значительно увеличивается в

большинстве опухолевых образцов легкого по сравнению с нормальными тканями в отличие от

толстой кишки и желудка. Значение kcadKm для AKR1B10 в реакции восстановления ретиналя

10

в ретинол сравнимо с наиболее активными ферментами дегидрогеназ/редуктаз (Gallego et al., 2006).

Рис. 4. Изменение уровня мРНК гена AKR1B10 при РТК по данным ПЦР-РВ.

Г — гиперплазированная слизистая оболочка, А - аденома. I - IV - стадии РТК. синх. р. - синхронный рак,

н.д. - нет данных.

Известно, что при раке легкого происходит повышение уровня белка AKRIBI0 (Fukumoto et al. 2005). С помощью Вестерн-блот анализа мы показали значительное снижение содержания белка AK.R1B10 в опухолевых образцах толстой кишки по сравнению с нормой в подавляющем большинстве образцов (82%, 18/22), причем изменение синтеза этого белка положительно коррелирует с изменением уровня мРНК (95%) (Рис. 5). Белок AKR1B10 можно рассматривать как потенциальный протеомный маркер РТК. Повышение экспрессии гена AKR1B10 должно приводить к еще большему уменьшению содержания ретиналя. а, следовательно, и ATRA при HMPJI.

\ * 20 57 71 37 68 18 22 46 53 Рнс. 5. Анализ содержания белка AKR1B10

NT NT n Т NT NT NT n TNT NT NT (А, Вестерн-блоттннг) ii мРНК гена

AKR1B10 — m-m~- Ш— «■- ~ kDi AKR1B10 (Б. ОТ-ПЦР) в парных образцах

GAPDH - - шш норма-опухоль толстой кишки.

" _ Белок GAPDH и ген ß2M - внутренние

AKR1BJ0 •»■■«• »-- — » т » -»-14«...

контроли.

Таким образом, мы наблюдаем аномальную экспрессию генов, кодирующих ферменты превращения ретиналя в ретинол, при трех видах рака по сравнению с нормальными тканями.

2.4. Изменение экспрессии генов, кодирующих ретиналь-окисляющне и ATRA-деградирующпе ферменты, ретннол- и ATRA-связывающне белки

У человека в окислении ретиналя в ATRA участвуют гены RA LDH 1. 2 и 3. Нами

показано, что уровень экспрессии гена ДЛЮЯ/ значительно превышает таковой генов К А1. ОН2 и КЛи)! 13 во всех трех изученных нами видах нормальных тканей.

I

к

■ ют 12

а AKR1B10

Рис. 6. Изменение уровня мРНК генов RDH12 и AKRIB10 при РЖ но данным ПЦР-РВ.

1 - IV - стадии РЖ.

0.0001 стадия

III IV

Содержание ретиноевой кислоты в крови Raldh-I- нокаутных мышей значительно снижено по сравнению с мышами дикого типа (Molotkov et al., 2003). Уменьшение уровня ATRA наблюдали и при добавлении ацетальдегида - ингибитора RALDH (Yokovama et al, 2001). Обнаруженное нами значительное снижение экспрессии гена, кодирующего преобладающий в тканях толстой кишки, желудка и легкого ретиналь-окисляющий фермент RALDH1 (60%, 57% и 64%, соответственно), может также приводить к уменьшению образования ATRA (Рис. 7, Таблица 1) в соответствующих опухолях.

Цитохром CYP26A1 катализирует расщепление ATRA на неактивные полярные метаболиты (Ross et al.. 2011). Повышенный уровень экспрессии гена CYP26A1 показывает, что деградация ATRA, даже незначительная, усиливается в половине опухолевых образцов толстой кишки, желудка и легкого (50%, 53% и 50%, соответственно), что также может приводить к уменьшению количества ATRA (Рис. 7, Таблица 1). Уровень мРНК гена CRBP1 остается неизменным в большинстве опухолевых образцов толстой кишки, желудка и легкого.

Показано повышение экспрессии гена CRABP2 в большинстве опухолевых образцов РТК и РЖ (60% и 74%, соответственно) и в 47% опухолей легкого (Таблица 1). Этот ген кодирует белок, транспортирующий ретиноевуто кислоту в ядро клетки для связывания с ретиноидными рецепторами, т.е. белок, который может служить конку рентом за связывание с рецепторами

В опухолевых клеточных линиях толстой кишки НСТ-116, RKO и НТ-29 мы наблюдали сходную картину изменения уровня экспрессии ключевых генов биосинтеза ATRA. Следует отметить, что уменьшение образования ретиноевой кислоты обнаружено во многих колоректальных опухолевых клеточных линиях, включая вышеперечисленные, и происходит

параллельно e понижением экспрессии генов RDHL и RDH5 (Jette et ai, 2004). Однако ферменты, кодируемые этими генами, обладают двойной субстратной специфичностью (ретинол/стерол), и их активность в отношении ретинола довольно низкая. Уменьшение их экспрессии не может быть основной причиной снижения образования ATRA.

Исследованные эпителиальные ткани (толстая кишка, желудок и легкие) отличаются не только набором генов, кодирующих ключевые ATRA-синтезирующие ферменты, но и изменением профиля их экспрессии при канцерогенезе (Рис. 7). Например, при НМРЛ показано повышение уровня мРНК гена AKR1B10, тогда как при РЖ и РТК уровень этой мРНК значительно снижен.

Рис. 7. Нарушение метаболизма п

сигнального пути ретнноидов при РТК

(A). РЖ (Б) и НМРЛ

(B).

Толщина и размер шрифта символов генов отражает уровень их экспрессии в нормальных тканях, а толщина и размер стрелок - уровень изменения экспрессии генов в опухолевых тканях по сравнению со смежными нормальными тканями.

А 4- ADH1B РТК 1 ADH1C

■WH3 . „ _____

I RDHL ' R-iLDH1

UtDHS 4ULDH2

RDH10 R.4LDH3

^ РЕТИНОЛ * РЕТИНАЛЬ ATRA

S \

' j-r^urjn- s \ рЯ1ИП0рА\П1ИреГ>ТМ1Ш

\akribio

люи»1

t CYP26A1 mita RXRa 1JUR3 юау 1RAR;' Щ' I

{ «Я/В рж 4 ADH1C 1 ADH4

ADH3 I R.4LDH1

RDH10 RALDH3

1 RDHL R.ÎLDH2

¡х^Д^Д^снон —» ^jp-J^O^CHO-> ■ ^UUcco»

^ ретинол *- ^ ретиналь * ATRA Cniiunmtunfiiiimt

RDH11 з-пшии / \ Г"™!»"»!»!«—»

§ 1 \ îicapecoai renoi'Hnnfmii

4 AKR1B10 î CYP26.il t M. RVta

; .OJtIBI UM *

\ ADH4 W m ' *

I J ADH1B НМРЛ

| ADH3 ADH1C | R.4LDH1

1 mHL P4lDH->

RDH10 RALDH2

RODH4 *RALDH3

ic^j^i^cHOH > XjvW^C»«-> I

^^ ретинол < ргтяндть ATRA

ргтянд -n. ATRA t««—

. y \ раеатсршя в pîrvranm

J.iKRIBlO дггриаша \ экспрессии ггас!-ииш*я»й

tCYP26A1 I RARa RXRai AKRIBI ¿¡¡y ¡¡¿M

RARy ЮХ; 1

Таблица 1. Изменение уровня мРНК генов, вовлеченных в метаболизм ретинондов при PIX, РЖ и НМРЛ по результатам ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ

Ген Изменение уровня мРНК при соответствующем виде рака (% образцов; количественная оценка изменений*)

РТК РЖ НМРЛ

Снижение Повышение Пет изменения Снижение Повышение Нет изменения Снижение Повышение Нет изменения

ADHIB 85% (68/80) 28 12.05-2224)" 5% (4/80) 3.0(2.0-4.6) 10% (8/80) 53% (20/38) 15 (2.1-1538)" 10% (4/38) 6.1 (3.0-15.3) 37% (14/38) 82% (36/44) 10.8 (2.0-50.0)" 7% (3/44) 7.1 (3.0-20.0) 11% (5/44)

ADH1C 81% (65/80) 41 (2.03-2455}** 2.5% (2/80) 3.4 (2.6-4.3) 16.5% (13/80) 58% (22/38) 23 [2.1-744)" 18% (7/38) 5.3 (2.2-12.7) 24% (9/38) 34% (11/32) 17.2 (2.0-50.0) 16% (5/32) 4.3 (2.0-8.0) 50% (16/32)

ADH3 17% (5/30) 2.7 (2.0-5.0) 10% (3/30) 2.5 (2.0-3.0) 73% (22/30) 23% (7/30) 3.5 (2.1-8.0) 13% (3/30) 4.8(2.1-15.0) 64% (20/30) 79% (26/33) 4.9 (2.0-50.0)" 6% (2/33) 1.7(2.5) 15% (5/33)

ADH4 нет экспрессии 84% (32/38) 31 (2.3-1790 " 3% (1/38) 16.7 13% (5/38) 43% (13/30) 9.8 (2.0-50.0) 37% (11/30) 5.9(2.0-12.0) 20% (6/30)

RDHL 90% (27/30) 7(2.0-10.0)" 0% 10% (3/30) 60% (18/30) 4.9(2.5-10.0)" 73% (22/30) 9.9(2.0-50.0) 10% (3/30) 3.9 (3.0- 73% (22/30) 9.9 (2.0-50.0)" 10% (3/30) 3.9(3.0-5.0) 17% (5/30)

RDHS 50% (15/30) 5.2 (2.5-10,0)" 3% (1/30) 3.5 47% (14/30) 40% (12/30) 11.9 (2.5-10.0) 7% (2/30) 9.2 (6.4-12.0) 53% (16/30) нет экспрессии

RoDH4 нет экспрессии нет экспрессии 42% (13/31) 5.1 (2.0-30.0) 42% (13/31) 8.0(2.0-50.0) 16% (5/31)

RDH10 23% (7/30) 3.8 (2.1-6.5) 33% (10/30) 4.8 (2.05-12.9) 44% (13/30) 17% (5/30) 3.7 (3.0-4.5) 7% (2/30) 3.2 (2.1-5.2) 76% (23/30) 33% (10/30) 5.3(3.0-10.0) 27% (8/30) 3.5 (2.0-15.0) 40% (12/30)

RDH11 3% (1/30) 3.5 10% (3/30) 3.1 (3.0-6.0) 87% (26/30) 33% (10/30) 3.3(2.1-5.5) 23% (7/30) 3.6(2.1-10.2) 44% (13/30) 66% (29/44) 5.1 (2.0-50.0)" 9% (4/44) 3.6 (2.0-8.0) 25% (11/44)

RDH12 нет экспрессии 84% (32/38) 37.8 (2.4-1999)" 8% (3/38) 2.2 (2.1-2.4) 8% (3/38) 40% (12/30) 8.2 (2.0-50.0) 27% (8/30) 5.1 (2.0-20.0) 33% (10/30)

AKR1B1 7% (2/30) 2.25 (2.0-2.5) 0% 93% (28/30) 53% (16/30) 4.6(2.5-10.1)" 17% (5/30) 2.9(2.1-4.0) 30% (9/30) 47% (14/30) 3.2(1.8-15.0) 0% 53% (16/30)

AKRIB10 87% (69/80) 20 (2.4-2043)" 0% 13% (11/80) 74% (28/38) 20.4(2.1-393)" 13% (5/38) 6.1(2.1-15) 13% (5/38) 9% (4/44) 5.5 (2.0-10.0) 80% (35/44) 9.3 (3.0-50.0)" 11% (5/44)

RALDH1 60% (18/30) 2.7 (2.0-2.9)" 0% 40% (12/30) 57% (17/30) 4.8 (2.5-10.0)" 10% (3/30) 3.1 (2.5-4.0) 33% (10/30) 64% (28/44) 6.3 (2.0-20.0)" 11% (5/44) 6.7 (2.0-15.0) 25% (11/44)

RALDH2 50% (15/30) 6.2 (2.0-10.0)" 33% (10/30) 6.1 (3.0-10.0) 17% (5/30) 20% (6/30) 6.1 (3.0-10.0) 7% (2/30) 2.6 (2.2-3.0) 73% (22/30) 37% (11/30) 3.9 (2.0-8.0) 3% (1/30) (2.0) 60% (18/30)

RALDH3 3% (1/30) 3.5 37% (11/30) 3.5 (3.0-10.0) 60% (18/30) 30% (9/30) 4.5 (2.1-4.3) 20% (6/30) 3.5(2.5-5.5) 50% (15/30) 53% (16/30) 7.2(2.0-30.0)" 0% 47% (14/30)

CYP26A1 13% (4/30) 2.3 (2.0-5.0) 50% (15/30) 5.8(2.0-10.0)" 37% (11/30) 13% (4/30) 2.7(2.1-4.5) 53% (16/30) 2.6 (2.1-4.0)" 33% (10/30) 27% (8/30) 5.6(3.0-10.0) 50% (15/30) 5.8 (2.0-10.0)" 23% (7/30)

CRBP1 3%(1/30) 8.3 3% (1/30) 4.0 94% (28/30) 20% (6/30) 2.3 (2.1-5.5) 23% (7/30) 2.3 (3.5-10.0) 57% (17/30) 33% (10/30) 4.1 (2.0-12.0) 40% (12/30) 7.5 (2.0-40.0) 27% (8/30)

CRABP2 7% (2/30) 5.0(2.5-10.0) 60% (18/30) 6.5(2.0-15.0)" 33% (10/30) 13% (4/30) 4.5(2.0-10.0) 74% (22/30) 5.1 (2.0-10.0)" 13% (4/30) 23% (7/30) 3.2 (2.0-10.0) 47% (14/30) 5.4(2.0-10.0) 30% (9/30)

Таблица 2. Изменение уровня мРНК генов ретннондных рецепторов при РТК, РЖ и НМРЛ по результатам ОТ-ПЦР и ПРЦ-РВ

Геи Изменение уровня мРНК при соответствующем виде рака (% образцов; количественная оценка изменении*)

РТК РЖ НМРЛ

Смижч'нпе Повышение Нет изменения Снижение Повышение Нет изменения Снижение Повышение Нет изменения

ЯЛ Л а 20% (6/30) 2.5 (2.0-3.0) 27% (8/30) 4.7(2.0-15.0) 53% (16/30) 0% 53% (16/30) 3.1 (2.0-10.0) 47% (14/30) 67% (20/30) 4.6 (2.0-10.0) 10% (3/30) 4.9 (4.0-6.0) 23% (7/30)

3% (1/30) 10.0 60% (18/30) 4.0 (2.0-15.0) 37% (11/30) 20% (6/30) 5.3 (5.0-6.0) 30% (9/30) 3.6 (2.0-5.0) 50% (15/30) 43% (13/30) 3.6 (2.0-6.0) 10% (3/30) 2.6(2.0-3.0) 47% (14/30)

КАЯу 0% 57% (17/30) 3.6(2.0-10.0) 43% (13/30) 30% (9/30) 2.2(2.0-2.5) 30% (9/30) 3.1 (2.1-3.5) 40% (14/30) 43% (13/30) 4.1 (2.0-10.0) 17% (5/30) 4.9(2.1-10.0) 40% (12/30)

ИХЯа 20% (6/30) 2.8(2.0-10.0) 17% (5/30) 4.3 (2.0-10.0) 63% (19/30) 10% (3/30) 2.4 (2.3-2.5) 13% (4/30) 3.4 (2.0-8.0) 77% (23/30) 57% (17/30) 4.7 (2,0-9.5) 20% (6/30) 5.5(2.5-10.0) 23% (7/30)

ЛАД/? 17% (5/30) 4.1 (2.0-10.0) 26% (8/30) 4.4 (2.0-10.0) 57% (17/30) 53% (16/30) 3.8 (2.0-10.0) 20% (6/30) 6.5 (4.0-7.0) 27% (8/30) 43% (13/30) 3.8(2.0-10.0) 14% (4/30) 2.6(2.0-4.0) 43% (13/30)

ЯХЯу 68% (42/62) 13.0(2.0-425) 11% (7/62) 5.2 (2.0-11.1) 21% (13/621 53% (16/30) 5.7(2.0-20.0) 10% (3/30) 3.5(3.0-4.0) 37% (11/30) 80% (24/30) 6.6(2.01-12.0) 17% (5/30) 8.8(4.0-15.0) 3% (1/30)

Таблица 3. Изменение уровня мРНК АТКА-зависимых генов при РТК и НМРЛ по результатам ОТ-ПЦР и ПРЦ-РВ

Ген Изменение уровня мРНК при соответствующем виде рака (% образцов: количественная оценка изменений'*)

РТК НМРЛ

Снижение Повышение Пет изменения Сннженне Повышение Пет изменения

габр 86% (69/80) 88.2 (2.05-4940)" 6% (5/80) 2.4(1.88-2.89) 8% (6/80)

<ас2Ш 91% (73/80) 58.5(2.1-13636)" 0% 9% (7/80)

УВ-1 13% (4/30) 2.5 (2.0-3.5) 33% (10/30) 3.4 (2.2-5.4) 54% (16/30) 67% (20/30) 4.0 (2.0-50.0)" 0% 33% (10/30)

РАВРС1 10% (3/30) 2.1 (2.0-3.1) 50% (15/30) 4.5(1.0-13.6) 40% (12/30) 77% (23/30) 7.9 (2.0-94.0)" 10% (3/30) 5.5 (4.2-20.4) 13% (4/30)

йАРК1 83% (25/30) 8.7(2.0-120.0)" 0% 17% (5/30)

Т1МРЗ 86% (26/30) 8.1 (2,0-170.0)" 0% 14% (4/30)

Примечание. * — Частота изменений в %. цифры в скобках — количество образцов с измененным или неизмененным уровнем мРНК к общему количеству образцов; следующая строка — среднее геометрическое значение изменения уровня мРНК (разы), в скобках — интервал обнаруженных изменений. Доминирующие значения затенены. Значение р подсчитано для данных при доминирующем характере изменения уровня мРНК (снижение или повышение), **р<0.05.

ADH, AKR и RALDH, кодируемые исследованными в данной работе генами, участвуют как в биосинтезе ATRA, так и в защите тканей от спиртов и альдегидов. Высокая активность этих ферментов обнаружена в пищеварительном тракте, где они вовлечены в реакции детоксикации (Westerlimd et al., 2007; Martin et al„ 2009). Снижение их содержания в толстой кишке и желудке может приводить к различным эффектам, связанным не только с дефицитом ATRA, но также с токсичностью спиртов и альдегидов.

Высокий уровень ретинола может нарушать многие клеточные процессы благодаря его неспецифическому связыванию. Токсичность ретинола показана у AdhI" мышей с резко сниженной активностью биосинтеза ATRA. Исследования на трансгенных мышах свидетельствуют о том, что ADH1 - основной фактор защиты против токсичности ретинола (Molotkov et ai, 2002).

Таким образом, мы выявили аномальную экспрессию ключевых генов метаболизма ретиноидов при РТК, РЖ и НМРЛ по сравнению с нормальными тканями.

2.5. Изменение экспрессии генов ретинондных рецепторов

Существует несколько механизмов, посредством которых ATRA осуществляет регуляцию экспрессии большого количества генов. Один из основных механизмов - связывание и активация ядерных рецепторов (Blomhoff et al., 2006). ATRA взаимодействует с рецепторами ретиноевой кислоты RAR (а, ß, у), которые образуют гетеродимерный комплекс с X ретиноидными рецепторами RXR (а, ß, у), и в составе этого комплекса влияет на транскрипцию ATRA-зависимых генов. Гены-мишени ATRA часто характеризуются присутствием специфических нуклеотидных последовательностей RARE — «элементах ответа на ретиноевую кислоту», к которым и присоединяется гетеродимер RAR/RXR (Blomhoff et al., 2006; Li et al.. 2009; Tang etat., 2011).

Взаимодействие ATRA с ретнноидными рецепторами — необходимое условие классической ретиноидной сигнальной системы. Изменение экспрессии генов RAR и RXR, приводящее к нарушению их сигнальной функции, выявлено при различных формах рака, однако для изучаемых нами видов опухолей экспрессия этих генов исследована недостаточно (Tangetal.. 2011; Ни et а!.. 2012).

Нами показана дифференциальная картина изменения уровня мРНК генов, кодирующих ядерные рецепторы RAR и RXR, для исследуемых видов рака. При РТК наблюдали повышение содержания мРНК генов RARß (60%) и RARy (57%) (Рис. 7А), при РЖ - повышение уровня мРНК гена R4Ra (53%) и снижение RXRß (53%) (Рис. 7Б), при НМРЛ - снижение уровня мРНК генов R.4Ra (67%) и RXRa (57%) (Рис. 7В) (Таблица 2). Выявлено значительное снижение уровня мРНК гена RXRy в большинстве опухолей (87%, 53% и 80% образцов при РТК, РЖ и

HMPJI, соответственно) (Таблица 2), которое происходит уже на ранних стадиях опухолеобразования. RAR и RXR гены являются генами-мишенями различных противоопухолевых ретиноидных препаратов, поэтому прн выборе лекарств важно знать изменение нх экспрессии для каждого пациента. RXR образуют гетеродимеры не только с RAR, но и со многими другими ядерными рецепторами, например, рецепторами, активирующими пролиферацию пероксисом (PPAR), рецепторами тиреоидных гормонов, рецепторами витамина Д и др. (Ziouzenkova et al„ 2008; Rhinn et al., 2012; Brun et al., 2013). Поэтому резкое снижение экспрессии гена RXRy может влиять на многие процессы, в которые вовлечены эти ядерные рецепторы.

2.6. Изменение экспрессии ATRA-завнснмых генов при IT К, РЖ н HMPJI

Комплекс ATRA-RAR/RXR может регулировать экспрессию генов и в отсутствие сайтов RARE. Ретнноевая кислота также влияет на активность ядерных рецепторов, отличных от RAR и RXR. Контроль транскрипции генов-мишеней может осуществляться опосредованно, в результате действия промежуточных транскрипционных факторов. Среди генов, экспрессия которых регулируется ATRA классическим путем, есть гены, участвующие в метаболизме и сигнальном пути ретиноидов (Rochette-Eglv et al, 2013). Изменение уровня мРНК ряда генов из этого списка (ADH1C, CYP26A1, R.4Ra, R.4Rß, RARy, CRBP1, CRABP2) описано нами выше для опухолей толстой кишки, желудка и легкого. Используя бионнформатические подходы, мы отобрали несколько неизученных или малоизученных ATRA-зависимых генов, экспрессия которых менялась при РТК, РЖ и раке легкого, и с помощью ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ определили паттерны изменения их экспресаш прн интересутощих нас видах рака. Выбраны гены, контролирующие клеточный цикл, дифференцировку, пролиферацию, апоптоз, защитные реакции организма.

Ген ZG16p кодирует секреторный лекпш (Zymogen Granule protein), впервые обнаруженный в гранулах зимогена поджелудочной железы крыс и бокаловидных клетках пищеварительного тракта, которые, как известно, вовлечены в самозащиту от вторгающихся болезнетворных микроорганизмов (Cronshagen et al., 1994; Rinn et al., 2011). Известно, что многие лектнны (онколектины) играют роль в профессии и метастазировании опухолей (Song et al., 2002; Liu et al., 2005). Показано, что у человека ZG16p узнает патогенные грибы через чужеродную поливалентную маннозу в пищеварительной системе.

Повышенная экспрессия ZG16p выявлена в печени, поджелудочной железе, тонкой и толстой кишке (Zhou et al., 2007; Tateno et al., 2012). Экспрессия этого гена прн канцерогенезе мало изучена (Zhou et al., 2007). Обнаружено значительное снижение экспрессии ZG16p при гепатоцеллюлярной карциноме. Методом ПЦР-РВ нами показано резкое снижение уровня

мРНК гена ZG16p в 86% (69/80) опухолевых образцов толстой кишки по сравнению с нормальной слизистой оболочкой, причем значительные изменения количества мРНК выявлены уже на ранних стадиях развития опухоли (Рис. 8, Таблица 3). Существенное снижение уровня мРНК ZGlfip в 200 раз) наблюдали также в трех опухолевых клеточных линиях РТК (НСТ-116, НТ-29 и RKO).

Рис. 8. Изменение уровня мРНК

генов ZGI6p н SLC26A3 при РТК по данным ПЦР-РВ. Г-

гиперплазированная слизистая оболочка. А - аденома. I-IV-стадии РТК. синх. р. -синхронный рак. н.д. - нет данных.

Ген SLC26A3. Белок SLC26A3 (solute carrier family 26 member 3) — трансмембранный гликопротеин. который транспортирует хлорид-ионы через клеточную мембрану в обмен на ионы Са~~ (Antalis et ai, 1998). Этот белок преимущественно находится в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта. Обработка опухолевых клеточных линий толстой кишки ATRA значительно повышает уровень экспрессии SLC26A3 как на транскрипционном, так и на трансляционном уровне (Prívamvada et ai. 2013). Кроме того, при обработке клеток ATRA наблюдали резкое повышение экспрессии генов RAR/1 и HNF-lfí (hepatic nuclear factor), ядерного рецептора, отвечающего за регулирование экспрессии SLC26A3 (D 'Angelo et ai. 2010). Таким образом, обработка ATRA повышает экспрессию SLC26A3 через связывание RAR/3 с HNF-ip (Príyamvada et ai. 2013).

Известно, что экспрессия SLC26A3 снижается уже на ранних стадиях РТК (Ahefai et ai, 2007). Установлено, что частота инактивации гена высока в предраковом состоянии (50%) и увеличивается по мере прогрессии заболевания (Antalis et al., 1998). Однако, возможно, из-за использования полуколичественных методов (гистохимический и Нозерн анализы) и недостаточного количества образцов авторам не удалось установить четкой корреляции между изменением экспрессии гена и степенью дифференцировки опухолей.

Методом ПЦР-РВ нами выявлено значительное (в среднем в 58.5 раз) снижение уровня

мРНК гена SLC26A3 в подавляющем большинстве опухолевых образцов (91%, 73/80) толстой кишки по сравнению с нормальной слизистой оболочкой уже на ранних стадиях заболевания, а также в аденомах (Рис. 8, Таблица 3).

Гены YB-1 н РАВРС1. YB-1 - Y-бокс-связывающий белок соматических клеток человека относится к семейству белков холодового шока (Kohno et al., 2003). Белки этого семейства активируют или подавляют транскрипцию и трансляцию генов, связанных с клеточным ростом, множественной лекарственной устойчивостью и синтезом ДНК (Kohno el al., 2003; Evdokimova el al., 2006a). YB-1 играет важную роль в канцерогенезе и обладает свойствами онкобелока, стимулируя клеточную пролиферацию, повышая множественную лекарственную устойчивость и способствуя метастазированию (Matsumoto el al., 2005). Однако YB-1 может действовать и как супрессор опухолей (Елисеева и др., 2011), препятствуя онкогенной трансформации клеток в цитоплазме по Р13К/Ак1-киназному сигнальному пути (Bader el al., 2003; Evdokimova el al., 2006b). YB-1 и полн(А)-связывающие белки (РАВР) являются основными компонентами мРНП и играют ключевую роль в трансляции и стабилизации мРНК (Mangus et al., 2003).

Показано, что ATRA обеспечивает связывание RARa с YB-1 и транскрипционными факторами KLF4 (Kruppel-like factor 4) и Spl (specificity protein 1) в гладкомышечных клетках сосудов (Shi el al., 2012). YB-1 в комплексе с KLF4 и Spl взаимодействует с RARa, что приводит к усилению транскрипции гена Klf4, который активно участвует в пролиферации, дифференцировке и апоптозе клеток (Evans el al., 2008, McConnell et al., 2011). При обработке ретиноевой кислотой EML клеток и миелоидных клеток-предшественников экспрессия YB-1 значительно нзмененяется (Bhullar et al., 2011). При обработке клеток эмбриональной карциномы мыши репшоевой кислотой наблюдали изменение экспрессии РАВРС (ТепепЬаит et al., 2000).

Мы определяли изменение уровня экспрессии генов YB-I и РАВРСI при РТК и HMPJI. Анализ EST баз данных показал, что из цитоплазматических РАВР только ген РАВРС 1 имеет значительно измененный уровень экспрессии в опухолевых клетках толстой кишки и легкого по сравнению с нормальными тканями. С помощью ПЦР-РВ мы выявили снижение уровня мРНК гена YB-1 (67%, 20/30) одновременно с резким уменьшением содержания мРНК гена РАВРС1 (77%, 23/30) в подавляющем большинстве образцов при HMPJI. При РТК уровень мРНК гена YB-1 почти не изменялся, а уровень мРНК гена РАВРС1 повышался в половине опухолевых образцов (Таблица 3).

Гены Т/МРЗ н DAPKI. Тканевый ингибитор металлопротеиназы 3 (Т1МРЗ) участвует в межклеточных взаимодействиях и индукции апоптоза, может подавлять рост многих опухолей, включая HMPJI, ангиогенез, прорастание и метастазирование (Li et al., 2013). Ген TJMP3 —

19

ATRA-регулируемый, его экспрессия повышается в клетках меланомы мышей приблизительно в три раза через 48 часов после обработки ATRA (Estler et al, 2008).

Апоптоз-ассоциированная протеинкиназа 1 (DAPK1) участвует в регуляции клеточного цикла и индукции апоптоза (Kogel et al., 2001, Gozuacik et al., 2006). Показано, что ряд генов, включая DAPK1, участвует в регуляции апоптоза при лечении ATRA больных острым промиелоцитарным лейкозом с транслокацией t(15;17) (Savli et al., 2003, Safar et al., 2005).

Гены ТШРЗ и DAPK1 относят к потенциальным генач-супрессорам опухолевого роста. По данным литературы частота метилирования промоторных областей этих генов при НМРЛ не превышает 30 и 50% соответственно, однако полученные нами результаты снижения уровня экспрессии (86% для ТШРЗ и 83% для DAPK1 — Таблица 3) позволяют предположить, что метилирование промоторов — не единственный и даже не основной механизм потери транскрипционной активности этих генов. Кроме эпигенетических, существуют и другие механшмы инактивации генов. Например, ген DAPK1 локализован на хромосоме 9q34.1 в области, характеризующейся частыми аллельными потерями при раке легкого.

2.7. Участие эпигенетических изменений (метилирования ДНК и модификации гпстопов) в пиактнвацни исследованных генов

Активность многих генов, изученных в данной работе, значительно снижена при трех видах рака. Инактивация генов при канцерогенезе нередко может происходить в результате эпигенетических изменений (метилирования регуляторных областей ДНК, а также модификации гистонов, включая их деацетилирование). Экспрессия генов RDHL и RALDH1 после обработки клеточных линий РТК ингибитором ДНК-метшггрансферазы 5-аза-2'-дезоксишгшдином (5-aza-dC) восстанавливалась (RDHL - в 2 и 2.5 раза в клеточных линиях RKO и НТ-29, соответственно) (RALDH1 - в 2.5 раза в клеточной лишш НСТ-116), что указывает на возможное участие метилирования ДНК в их инактивации.

В отсутствие лиганда (ATRA) гетеродимеры RAR/RXR рекрутируют различные корепрессоры, в том числе и те, которые имеют активность гистондеацетилаз. Деацетилированные пистоны повышают конденсацию хроматина и ингибируют транскрипцию (Tang et al., 2011). Экспрессия генов ZGIfip, SLC26A3 и RALDHI восстанавливалась после обработки клеточной лишш рака толстой кишки HCT-116 трихостатином A (TSА) - известным сильнейшим ингибитором гистондеацетилаз (HDAC) (в 5, 3 и 2 раза, соответственно), что свидетельствует о том, что возможный механизм инактивации этих генов - деацетилирование гистонов. Ген ZG16p входит в состав большого 14-генного кластера, локализованного на хромосоме 16р11.2. Показано, что при раке молочной железы происходит одновременная эпигенетическая инактивация всех генов этого кластера, причем гиперметилирование выявлено

только у части генов. И хотя ген ZGl6p не имеет CG-островков вблизи 5'-промоторной области, наблюдается его репрессия, как и репрессия всего кластера, обусловленная высокой степенью компактизащш хроматина (Hua et al., 2009).

2.8. Корреляционная зависимость меаау аномальной экспрессией генов и клинико-патологнческнмн характеристиками опухолей

Анализ экспрессии исследованных нами генов ADHIB, ADH1C, AKRIBIO, ADH4, RDHL, RDH11, RDH12, CRABP2, YB-1, РАВРС1, ZGlôp, SLC26A3, ТШРЗ и DAPK1 в опухолевых тканях по сравнению с нормой обнаружил значительные изменения уровня их мРНК уже на ранних стадиях опухолевого роста, что позволяет рассматривать эти гены как потенциальные диагностические транскриптомные онкомаркеры. Снижение экспрессш! генов ADHIB и ADH1C наблюдали уже в аденомах толстой кишки (Рис. 2).

Для РЖ широкое распространение получила гистологическая классификация, выделяющая два типа желудочной карциномы: кишечный и диффузный. При РЖ для генов A DU4, ADHIB, ADH1C, AKRIBIO, RDH12 и ZG16p показана четкая корреляция между снижением уровня мРНК и гистологическим типом опухоли. В образцах кишечного типа РЖ наблюдали более значительное снижение экспрессии этих генов по сравнению с образцами диффузного типа (Рис. 9). Уровень мРНК гена ZGI6p в неизменной слизистой желудка большинства пациентов с кишечным типом РЖ значительно превышает таковой в нормальных тканях пациентов с диффузным типом (82%). В большинстве образцов кишечного типа выявлено «шжение экспрессии гена ZGl6p. тогда как для диффузного типа РЖ наблюдали повышение экспрессии этого гена (Рнс. 9). Карциномы кишечного типа, как известно,

Рис. 9. Диаграммы рассенвания, показывающие корреляции между изменением уровня мРНК генов ADHIB, ADH1C, ADH4, AKRIBIO, RDHÏ2 и ZG16p h гистологическим типом опухоли РЖ.

Д и К — диффузный и кишечный типы рака желудка. Среднее геометрическое значение снижения ур°вня экспрессии для каждой группы образцов обозначено короткой горизонтальной линией.

встречаются чаще в группах повышенного риска.

J

! e.oi

ADHIB ADHIC ADIU AKRIBIO RDH12 ZG16p

% %

V

—X» *«' * ф • • «• ••

* 'l -«- " *. -

• ; . •• С v J- : -

д к д к

р-0.0002 R-aoooi

Д К Д К Д

p.OOOOl IK0.0001 РО.ООО

к

4.019

Показаны корреляции между уровнем экспрессии гена $'[.С26ЛЗ и локализацией опухоли, а также полом пациента с диагнозом РТК (Рис. 10).

10 SLC26A3

•

1 • •

а # Л й

н д: # •í

и £ X ■ 6.1 £ 1 т ••• г • т- :

£ 0^01 ФЧ •

■ ■ в < • 1 * • и

O.OOl

6 J •• • • • >

• «

• i j S t

04)001 i 1 I i 1 t i

К »»6 Г-М2! 1

рм.оп-

»-J5 ■—25 ■-49 •-31 ■-11 ■-39 ■-13

лльпиирвкпоишп мгкке1«нгет1 lUtWllVlIfpniil'inKM

локгамш о m«.n ■ол стеог» »ффереатроока

•■vían

Рис. 10. Диаграммы рассеивании, показывающие корреляции между изменением уровня мРНК гена $(.С26АЗ и клинико-

патологическимн характеристиками (РТК).

Среднее геометрическое значение снижения уровня экспрессии для каждой группы образцов обозначено короткой горизонтальной линией.

Нами выявлены корреляции между изменением уровня экспрессии генов ADH1B, ADH1C, AKR1BI0, ZG16p и стадией опухолей (Рис. 11, 12А и 13А) при РТК, при этом происходит постепенное снижение уровня мРНК этих генов при прогрессии опухолей: от гиперплазии или I стадии до III стадии.

AD1I1B

г-

Ь I

¡¿

Нг

й:

0,0001-1 р<0.0! гшперлювя

р<0.01 — I

р-0.002 п ш

Е о.»

х ■

а

ADII1C

i»:

L

J|_

р-0.005 р*0.002в •jxhi ±

гшяерллвзмя .

СТАДИЯ аденоме

pO.OOl

п ra IV

Рис. 11. Корреляции между изменением уровня мРНК АРН1В (А) и АОН1С (Б) п стадией опухолей (РТК).

Среднее геометрическое значение снижения уровня экспрессии для каждой группы образцов обозначено короткой горизонтальной линией.

Показаны корреляции между изменением экспрессии генов и прогрессией, а также метастазированием опухолей толстой кишки: степенью дифференцировки опухолей (AKRIBIO и SLC26A3 (Рис. 12Б и 10), степенью инвазии опухоли (ZGI6p (Рис. 13В) и образованием метастазов в регионарных лимфоузлах (AKRIBIO и ZGIôp (Рис. 12В и 13Б)). Корреляционный анализ выявил гены, вовлеченные в процессы прогрессии и метастазирования опухолей толстой кишки.

■ 0,01 в

В

—

•••

0.0001 стадия аденома

р<0.001 Р-О.ОЗ

гиперплазия j п щ jу

0,0001 степ«вь

У X

р-0 0013 шсокая низкая

I

l»-ooi n0 n1

Мсисглы в

р'г"л"'р""' 0=37 11=26

N2 п=11

Рис. 12. Корреляции между изменением уровня мРНК гена AKRIBIO н стадией опухолей (А), степенью днфференцнровкн опухоли (Б), отсутствием/присутствием метастазов в регионарных лимфоузлах (В) при РТК. Среднее геометрическое значение снижения уровня экспрессии для каждой группы образцов обозначено короткой горизонтальной линией.

L_

_j

0.0001-Mnirnui в регионарные

р<0.001 (-) (+) о=37 п=37

0.00

Т1 11=3

•ь .1.

р<0.001 ТЗ Т4 11=28

п-43

Рнс. 13. Корреляции между изменением уровня ZC^б^7 мРНК и стадиен опухолей (А), образованием метастазов в регионарных лимфоузлах (Б) н степенью инвазии опухоли (В) при РТК. Среднее геометрическое значение снижения уровня экспрессии для каждой группы образцов обозначено короткой горизонтальной линией.

23

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые показана суммарная картина изменения экспрессии большого количества генов, вовлеченных в биосинтез АТЯА при РТК. РЖ и НМРЛ, и выявлена аномальная экспрессия ключевых генов на всех этапах этого процесса, которая может приводить к резкому уменьшению содержания ретиноевой кислоты. Обнаружены сходства и отличия в паттернах экспрессии этих генов при разных видах рака.

Так как АТЯА, являясь плейотропным регулятором транскрипционной активности многих генов, отноагтся к важным факторам, необходимым для нормальной клеточной дифференцнровки и пролиферации, ингибирование образования АТЯА может приводить к множеству патологических изменений в нормальных тканях толстой кишки, желудка и легкого.

Обнаруженные нами различия в экспрессии многих генов, участвующих в метаболизме и снгнатьном пути ретпноидов, в опухолевых тканях по сравнению с нормой могут быть использованы хля ранней диагностики соответствующих видов рака. Значительные корреляции аномальной экспрессии генов с прогрессией и метастазированием опухолей свидетельствуют об их вовлеченности в эти процессы и прогностической значимости при соответствующих видах рака.

Повышение экспрессии генов в опухолевых клеточных линиях толстой кишки после обработки их деметилнрутощим агентом 5-аза-2'-дезоксицитидином (гены КОШ. п ЯАЮШ) и ингибитором гистондеацетилаз трихостатином А (гены ИЛЮШ, Ю16р и Sl.C26.43) свндельствует о том, что возможными механизмами инактивации этих генов являются метилирование регуляторных областей ДНК и/или деацетилирование гистонов.

Большинство ключевых ферментов, вовлеченных в биосинтезе АТЯА. можно отнести к полифункцпональным ферментам, участвующим не только в метаболизме ретиноидов, но и катаболизме нейромедиаторов. конверсии стероидных гормонов и омега-оксижирных кислот, синтезе холестерина и желчных кислот, в защите от экзогенного этанола, а также эндогенных токсических соединений. Известно, что ретиноидный сигнальный путь взаимодействует с другими сигнальными путями. Следовательно, наблюдаемые изменения в экспрессии исследованных генов могут приводить к нарушению регуляции не только метаболизма и сигнального пути ретиноидов. но и работы многих систем.

выводы

1. Впервые показана комплексная картина изменения экспрессии большого количества генов, вовлеченных в биосинтез полностью транс-ретнноевой кислоты (АТКЛ), при раке толстой кишки, желудка и немелкоклеточном раке легкого, и выявлена аномальная экспрессия ключевых генов на всех этапах этого процесса.

2. В большинстве анализируемых образцов уже на ранних стадиях опухолеобразовання наблюдали значительное уменьшение уровня мРНК генов АО/И В, АО// /С, НО///., АКЯ/ВЮ, ЯАШН1 и ЯХЯу (рак толстой кишки); генов АЭН4, АО/НИ, АО/НС, ЯО///2, АКН/ВК) н ЯА/.РН1 (рак желудка); генов АО/ПВ, АО//3, /ЮШ, КОШ/, /14/.ОН/ и ЯХЯу (рак легкого), а также значительное повышение уровня мРНК гена АКЯ1В10 при раке легкого. Резкое изменение экспрессии большинства этих генов может приводить к уменьшению синтеза АТКЛ.

3. С помощью Вестерн-блоттннга обнаружено резкое снижение синтеза белка АКЮВЮ в большинстве опухолей толстой кишки. Выявлена корреляция между изменением уровня этого белка и мРНК гена АКЯ1В10.

4. Обнаружено значительное снижение экспрессии АТИА-зависимых генов в большинстве опухолевых образцов по сравнению с нормальными тканями уже на ранних стадиях опухолеобразовання (/С/б/) и Sf.C26.i3 при раке толстой кишки; УХ!/6р при кишечном типе рака желу дка; УВ-1, РАВРС1, Т1МРЗ и ОА/'К/ при раке легкого).

5. Показано участие эпигенетических изменений в инактивации исследованных генов: метилирование ДНК (гены ЯО//Т и ЯА/.йШ) и деацетилирование гистонов (гены 767 й/;, 5/.С26ЛЗ и ЯАШН1).

6. Анализ корреляций между экспрессией генов и клинико-патологическимн характеристиками опухолей толстой кпшкп выявил гены, вовлеченные в процессы прогрессии (АО/НК, АОН1С, АКШВН), гв16р и 51С_'6.и) и метастазирования (АКЮВН) и УСНбр) опухолей.

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (проект № 14-50-00060).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Машкова Т.Д., Опарина Н.Ю., Зиновьева О.Л., Кропотова Е.С., Дубовая В.И., Полтараус А.Б., Фридман М.В., Копанцев Е.П., Виноградова Т.В., Зиновьева М.В., Лактионов К.К., Касымова О.Т., Зборовская И.Б., Свердлов Е.Д., Киселев Л.Л. (2006) Транскрипция генов TIMP3, DAPK1 и AKR1B10 при плоскоклеточном раке легких. Молекулярная биология, 40, 1047-1054.

2. Тычко P.A., Опарина Н.Ю., Зиновьева О.Л., Кропотова Е.С., Зиновьева М.В., Машкова Т.Д., Овчтшиков Л.П. (2009) Количественная оценка изменения уровня экспрессии гена YB-1 при немелкоклеточном раке легкого. Труды МФТИ, 1, 111-119.

3. Кропотова Е.С., Тычко P.A., Зиновьева О.Л., Зырянова А.Ф., Ханкин С.Л., Черкес В.Л., Алиев В.А., Берестень С.Ф., Опарина Н.Ю., Машкова Т.Д. (2010) Снижение экспрессш! гена AKR1B10 при колоректальном раке. Молекулярная биология, 44, 243-250.

4. Кропотова Е.С., Зиновьева О.Л., Зырянова А.Ф., Чойнзонов Е.Л., Афанасьев С.Г., Чердынцева Н.В., С.Ф. Берестень С.Ф., Опарина Н.Ю., Машкова Т.Д. (2013) Изменение экспрессии генов, вовлеченных в биосинтез ретиноевой кислоты, при раке желудка. Молекулярная биология, 47,317-330.

5. Kropotova E.S., Zinovieva O.L., Zyryanova A.F., Dybovaya V.l., Prasolov V.S., Beresten S.F., Oparina N.Y., Mashkova T.D. (2014) Altered expression of multiple genes involved in retinoic acid biosynthesis in human colorectal cancer. Pathol. Oncol. Res. 20, 707-717.

6. Пат. 23 74647 Российская Федерация, МПК GO IN 33/48. Способ диагностики рака толстой кишки и набор для его осуществления/ Кропотова Е.С., Тычко P.A., Машкова Т.Д., Опарина Н.Ю., Зиновьева О.Л., Ханкин С.Л.. Берестень С.Ф: заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академш! наук - 2008131877/15; заявл. 05.08.2008; опубл. 27.11.2009, Бюл .№33.

7. Пат. 2395234 Российская Федерация. МПК А61В 10/00 C12Q 1/68. Определение снижения уровня мРНК гена ZG16 как способ диагностики рака толстой кишки и набор для его осуществления/ Кропотова Е.С., Тычко P.A., Краснов Г.С., Опарина Н.Ю., Зиновьева О.Л., Ханкин С.Л., Берестень С.Ф., Машкова Т.Д.: заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук - 2009128577/14; заявл. 24.07.2009; опубл. 27.07.2010, Бюл. №21.

Подписано в печать 17.04.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 5311-4-15 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39