Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы регуляции амилорид-чувствительного натриевого канала почки малыми ионами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы регуляции амилорид-чувствительного натриевого канала почки малыми ионами"

АКАДЕМИЯ ПАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ

>Г6 од

На правах руконш и

1 / 1МЦ ШЬ

БЕРДИЕВ БАХРОМ КЛРИМОВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЛШШ АМИЛОРИД ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО НАТРИЕВОГО КАНАЛА ПОЧКИ МАЛЫМИ ПОПАМИ

03.00.02-бно|]>Ш11ка 03.00.13-ч|1|пнолоп!я человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени канншга (ншлпгнческих паук

'« ДПМ'ПГ - К':!

Работа выполнена в Институте Физиологии и Биофизики АН Республики Узбекистан и в Университете штата Алабама в Бирмингеме, США

Научные руководители:

* доктор биологических наук З.У. Бекмухаметова кандидат биологических наук И.И. Исманлов

Официальные оппоненты:

академик Хамидов Д.Х. доктор биологических наук Р.З. Сабиров Ведущая организация: Ташкентский Государственный Университет

Защита диссертации состоится " 4 " ^О ¿-Л 1996 г. в \0 часов па заседании Специализированного Совета Д 015.01.01. в Институте физиологии и биофизики АН Республики Узбекистан по адресу г. Ташкент, ул. Ниязова, 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

физиологии н биофизики АН РУ

Автореферат разослан _1996 г.

Ученый Секретарь Специализированного Совета, л.б.н.

Каликулов Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы: Основная гацечшин современной физиолоши п биофизики гакгтоит и проникновении на самые глубокие молекулнрные уроини структурной организации живого Среди областей современной физиологической науки, привлекающих сейчас присгалыюе внимание исследователей во ноем мире, особое место занимают биохимические основы клеточной регулинии. Одну из ведущих |*)лсй среди физиоло! очески нажных регуляторных механизмов шраег фосфорилнроиание белкой. ка га лизируемое специфическими ферментами нротсинкиназами. С у частием .пой реакции" контролируются мноше важнейшие и|юнесш жизнедеятельности клетки, н том чище обмен углеиодон и линидов, синтез белка, формироиише интоскелет и др. Примером утешною слиянии новых жснерименгальных и теоретических методой иоследоиания, оаюиашшх главным образом на соименных достижениях физики, химии, математики, шишстгл п|юц>еа: н исследовании клеточных мембран. Одна из основных функций этих мег.б|хш состоит и поддержании трансмемб|шпых ионных 1радиентов и селективного пинглорга вешеош между цитоплазмой и окружающей средой. Ионный баланс поддерживает! благодари наличию и ме,мб|ине пассивных проводящих путей -ионных каналов, а также систем активною и обменного транспорта ионоа В специализированных клетках различных видоп были выявлены целые системы транспорт ионов натрии. Kajmii, кальция, хлора и других ионоа

Эпителиальные клетки также содержат селективные натриевые каналы, которые иншбируютгл диуретиком амилоридом и его производными, что отличаег их от токсин-чувсгвительных >iaipneaux каналов нервных и мышечных клеток. В дисшльных or делах нефрона, ли каналы аюообсгиуют образованию конечной мочи, и их дисфункция можег привести к ряду серьезных заболеваний, и том числе к пшертензии. По лому, гонкая регуляция :)тих каналов 1Хзрмонами (вазоп|1еи:ин, альдосте|Х)н, окситонин), их вторичными меооенлже|ими (циклические нуклеотиды, О белки и др.) и ионным окружением является чрезвычайно важной для

ocyiiieciuiieiw» функции поддержании нмсоскш ншт» онанизма, что оп^делнет актуальность 1цхии|>ишгпли иаледошиип.

Цель |>аСош: функциональна« |*'кош:фукиии и изучение н молельной системе механизмад регулшши амилорид-чуисшшгльиош tiaivHeuoro канала ночки. В ходе исглелоианин решались следующие задачи:

изучение илшшии ионои натрии (Na') и килышя (C'a") на амилорид-чуиапигельний натриеиый канал (АПК) ночки. |х'конаруиронанный и ПпслоПныс лишиние мсмЛ|)апи (liilM);

изучение антоиний цхнкшмшпи АПК » оц-.утаиие и и нрисутаиие дшпогрешала (ДТП - агапа, |ызрушаюше10 дисульфидные шии;

исслсдоиание илиннин фсхфорп.ицкшиин, индушцхлишнот прогеинкнназой С (РКС), на модулншш АПК ночки ионами Na* и Са2'.

Научная новизна и ириктнческан ценность (шбош: Pwy.ii.ia™, нредегав ленные и данной раГнш; сшиегельсгиукл', что активность одиночна амилорид-чуисгишельиых Na' кана.юи ночки риулируетсн ионами Na' и CaJ'. Показано также, что нрисугавие Саг' muiierai необходимым усюаием дли оеушеаиюнин »ффекюи Na' на кинетику ами юрнд-чушлииамьныч Na' каналои, и чю иншоируюшее дейсгиие Са1* и значнпммюй мере yrji.umaeicii РКС-.инисимым фосфорилщюнанием. Иаледование 1Цюиоди.юсь на очищенных Na' кана.ых оооочкои бычьей почки в биглойних динидных мембранах, потому лкснернменгы не сопровождались неконтролируемыми 1именениями рН. потенциала или колнчалва функциональных каналои. 'Гакам общзом, саморегуляции шшелиалышх Na' laiiia.iou малыми нонами но тип} обрамюи евпзи инлиег собой Io|woiia.aiio пезашкимый аонолшпелышй механизм концю ш книиссш naipnii. Полученные |хаулыати («сширннл щхисгаилешш и механизме цаце шшелиалыют переноса ионов нафиа Резу.тыаги |jufîoiи нреилавлнн инп'|*ч: дли t ниша листа, занимающихся щюбаемлми mmnoiо цинснорга, и могуг наши применение и фармако юшн. а 1акже клинической и лкпкрименгалыюй меаишше

Апробации pafïoiir ( К ионные [ к jy 11.1111 i l Пыли доложены мл 39 Годичной Конфе|1ен11Ш1 Лмерикангтт Ппофпшчннно Oiiittiaici (СлиФцншшко, 1995. (ША)

Публикации: Но теме диссертации оиуПликонано 3 печатных («аПогы.

Структура лнссгртакии: Диссертация изложена на 113 страницах машинописною ickcra. состоит га впеления. оПзоде литературы, полученных результатов. их обсуждении. заключения. выводов. гниаса нищюванной литератзры. Диссертация шлержит 25 |tnc>iikou и 3 таблицы. Список цитированной литературы включает 227 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАОДТЫ

Мстоты нссдсдоплинп.

Очистку ЛИК ил емтков зоны (ТычьсП почки и|Ю1Юлили согласно Oh Y. and Beños D.J. (1993a). Полученный белковый щччццат Пыл реконструирован в липилпые везикулы щмнускамием че|*и колонку с Extracti-Ge! D (Piercc). БЛМ с удельной ечкчхгц.ю 300-400 pF _ форми|х)вали из jxicruopa дифиганоил-фосфатилил гганоламина, дифитаноил-ф«'.фатилилсеринз и окисленного холеагрина н /мжгане Ш2 (нсснеснес). конечная концентрация липила = 25 мг/мл) на onieixriim диамет|юч 200 цм и полчгпщюлоиой ячейке. Омынаюншй раствор • содержал соотнетсгнуюшую жшериментальным условиям концентрацию шсктролитои (см. тексг и подписи к рисункам). Во всех случаях рН расгвора ноддержшили па посгоянном у|ювне 7.4, с номошью 10 мМ MOPS-Трис. Градиент Na* создавали, замешан NaC! на жвимолнрный Ы-метч-О-глутамин хлорид (NMDG-CI). мо.игржшип таким образом осмолярность u cis- и trans-отсеках ячейки на постоянном уровне. Реконструированные протсолиносомы наносили на заранее сформи|х>ванную БЛМ при помоши полированной стеклянной палочки с trans- стороны мембраны при фиксации потенциала -40 mV {по отношению к виртуально заземленной trans- сго|юне). Встраиванию канала соответствовало ступенеобразное увеличение тока через мембрану в режиме фиксации потенциала. Использование отрицательно заряженной БЛМ и фиксация- потенциала -40 mV на мембране щм пеграипаиии приводам к специфической ориентации АНК почки в БЛМ. См-аорона были чувствительна к прогсинкитзг, А (РКА), РКС, коклюшному

(оксину (РТХ), карГюгадмстилтрансфсраэе. щелочной фосфатаjc. но не была чувствительна к амилориду. 7>агм-сторона, наоборот, была чувствительна к амилориду. но не отвечала на добаиление агаггов. действующих с шпонлааматической стороны. Измерение тока ироиодили с помощью шектрометрической установки. соП|йнной. как описано Alvarez О. et al. (1985). Cis-oтсек Пыл соединен с 1енерато|юм сишалои и устройством фиксации ншешшала на мембране. Гга/и-камера Пыла соединена с нреобдозоиа гелем "ток- напряжение". тГ)|«!:ном на операционном усилителе ОР 101, (Burr-Brown) с широтишюнием обратной связи 1 GQ. Ag/AgCI июктроды Пыли соединены с омывающим мемПраиу |ясг1!0|1ами с 1юмон|ыи агаровых мостиков. содержащих 3 М КС1. Изменения тока через БЛМ регистрировали на ииф|ювом запоминающем осиилл«п>афе Nicolet 310 (Nicolet), фиксироиали на лазерном бысцюденстиуюшсм самописце EasyGraf Recorder ТА 240 (Gould Electronics) и записывали полный спектр сигнала на шиеомапштофон, используй аналотвоч1Иф|Ю1Юй преобразователь Vcttcr 20 (Vetter Instruments). Записи отфильтровали. используя В-полюсной низкочастотный фильтр 902 LPF (Frequency Devices, Haverhill, MA), и преобразовывали дли дальнейшей компьютерной обработки, используя Digidata 1200 интерфейс и нри-рамное обеспечение pCLAMP 5.6 (Axon Instruments, Burlingame, CA). Дли компьютерно!« анализа были использованы исключительно записи одиночных каналов. Критерием отбора подобных записей служило ньшиление "молчащих" каналов, вст|юенных н ГЛМ, в результате фоофорилированин, индуцированного прогеинкиназой А (РКА). II случаях, когда РКА-заоисимое фосфорилирование увеличивало количество активных каналов в БЛМ, эксперимент исключали из дальнейшею рассмотрении.. Дна «о проводит используя записи длительностью 3-15 минут. Пунктирные линии . на всех рисунках означают линии нулевого тока через BJIVI. Все. значения* потенциала, фиксированного на БЛМ, даны дли см-отсека относительно виртуально «¡^членного trans-атажи ячейки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Запись одиночною АИК, полученного в результате реконструкции протеолипосом. содержащих белок, полученный из почки быка, показана на Риг. 1 А. Характерно, что )ти каналы в симметричных солевых у слови ах (100 тМ ЫаС1) демонстрируют исключительно низкую активность (Р. ~ 0.02). Исследование за1шсей тока через АПК выявило существование дополнительных случаев открытия одиночных каналов, которые отличались по амплитуде и частоте встречаемости (показано стрелками). Анализ гистограмм оцифрованных значений амплитуды тока через ли каналы показал наличие только двух пиков, для открытого и закрытого соскший (Рис. 1 Б, заштрихованные символы). Однако, детальное рассмотрение табличных значений амплитуд выявило относительное увеличение количества точек в графах, которые соответствуют промежуточным значениям амплитуды тока. Дли рассмотрении лого явлении Пыл выполнен анализ амплитуд событий переходов кашла между открытым и закрытым состоянием в записях продолжительностью -15

0 12)43*7 00

0 1 02 00 0 1 ,1 н.:г -i (|)

02 03 О 0 02 0.4 О А

Рис. 1. Олшочнын амилорил-|увств11те.1ы1ы1"1 натриевый канал в БДМ.

минут (Рис. 1 Б, столбики). Эга (»ста рачма вышла существование двух дополнительных уроиней тока -0.65 и -1.2 рА, наряду с пиковым значением амплитуды тока основного состоянии. равного -1.8 рА. Гисгмраммы продоласигел>носги времен нахождении канала в каждом из сосгошшй проводимости представлены иа Рис. I 11 Эги шсгираммы описываются одно жсноненниальным уравнением с консгантой 650 ±31 пи длн закрытого гасгоинин, и 11 ±4, 14±3 и 52 ± 3 пк для перво№третьего уровней щюиолима.ти, соответсгташо.

Обработка амшюрид-чувсгвителшого Ыа* кашьи ночки 01Т, |х*а1ентаи. способствующим разрушению днсульфидных евшей, переводила капал и наиболее низкое сосгошше проводимое! и 12-13 рЗ (Рис. 2).

К'< <11 (Ш н.

50 )*М ОТТ

100 дМ ОТТ

10 1!

Рис. 2. Влилние ДТТ на акшшкктгь амнлори-гчувешшелышю N3* канала.

| и)

ч >>>

Присутствие DTT практически не илиило на рил катионной селективности Li* (2.00 ± 0.08) > Na* > (1.0) > К* (0.17 ± 0.05)» Ca;f (< 0.001) (Рис. 3) и чувствительность к амилориду (К, =0.44 ±0.12 цМ в присутствие DTT и 0.42 ± 0.09 а отсутствие DTT) угош отдельно взятого уровня «рооолимости по сравнению с исходным состоянием канала. Эти результаты дополнительно свидетельствуют • пользу сушеспювания стабильных полсогтояний проводимости амилорил-чуосгвительного Na* канала почки

Рис. 3. Вольт-вмперные характеристики амилорагчувспштрлмгого Na* капа.14 в присутствие и отсутстиие ДТГ.

Соотношение трех уровней проводимости было исследовано при различных концентрациях Иа*. На Рио 4 показаны характерные записи тока через одиночные АПК, встроенные о БЛМ, в условиях градиентов концентрации различной величины и направления.

IM »M м«^ ■ IIIJi

>'„1,1. Г .1 Д.Г ili i J 4>»

Т

; I 1

; ! U

X) вхм

iíi_Ui.

ü

ггг~лт

11

■ul.

!0bmn.„ Увеличение i-радиента Na* no

направлению trans к eis (снижение [Na*]c„) приводило к увеличению числа событии открытии каналов. Однако, при каждом [Na*!,,,, соотношение со г. г о я н и и проводимости не менялось (а именно. 17, 17 и 66% or обшего времени записи дли у|ювиеП 1. 2 и 3. соответственно).

Наличие нодпроводнпшх состояний AHIC, ik:i| юеппых в БЛМ было замечено еше в ранних работах Beños D.J. и соавюро» (Sariban-Sohraby S. et а!., 1984; Garty Н. & Beños DJ., 1988). 3ro яв. юнне осталось в зпачигелыюн 0 , 1 мере ненсслелоианпым. хогя было

предположено. чго неоднородность щюнолимости можег бьпь сшгана I'm I. Ншлииг на ачнлорш чувенш сушеспюнанием цнличных стабиль

нчьный Na* канал в БЛМ. ных состояний п^июлткхлп. лип

ЛОГИЧНО ГрпмИНИШПОРОМ) кам:|Л>

-L.C

.Ш

I—г

(Busath D. & Szabo 0., 1981). С другой стороны, основываясь 1и графиках зависимости проводимости каната от концентрации Na+, построенных дня диу \ экстремумов проводимости (именно, 4 и 44 pS), OlansL. et al. (1984) предложили альтернативное объяснение, суть которого заключается и возможное.) п существования двух различных ноиуляиий канала. Существование двух ноиулянни канала было также использовано и качестве объяснения записей тока через АНК н плч-кламн экспериментах с клетками культуры А6 (Hamilton K.L. and Eaton D.C., 1986а; 1986b) и клетками кортикальной зоны собирательного канальца ночки к|юлика, выращенных на коллагаюных подложках в присутствии альдостерона (LingB.N. et al., 1991). Тем не менее, возможность, что эти каналы представляют собой не различные популяции, но являются выражением поднроводяших состояний одного и того же канала, экспериментально отвергнута не была. Полученные результата свидетельствуют в поддержку последней шгатезы. Анализ гистмрамм амплитуд событий перехода канала между открытым и закрытым состояниями в отсутствие и в присутствие «радиента Na* свидетельствует, что относительное содфжание переходов между подуровнями не меняется при каждом фишцювашюм значении [Na'L,,. Общее расп|>еделение амплитуд не подчиняется биномиальному закону, как можно было бы ожидать дли трех независимых каналов с одинаковой вероятностью нахождения в открытом согоянии. Более того, все три состояния проводимости наблюдались при каждом случае встраивания шала. Таким об]азом, наиболее вероятным обьяснением неоднородности амплитуд АПК пиляетса предположение о сушестиовании стабильных подсостояпий щюводимост и.

Исследование вольт-амперных характеристик тока одиночного канала (i) и усредненного тока (l=NP0¡) через одиночный АНК представлены па Ркс. 5. Конценцаиия Na+ в trans отсеке ячейки была фиксирована (100 мМ), а в eis отсеке - варьировала. Пок-нниалы |мчк:|кли тока, полученные методом |«Ц)ешш мерного порядка жеиеримешальных значений тока одиночного канала и уцененного тока

А. >««**»•

о 1-

• 1

■Н^ Ч'у'

В.

не отличаются друг аг друга и от теорежчески рассчитанных по у|мвнению Нернста (± 1 Б О) в соответствующих солевых условиях. Визуальное рассмотрение >тих графиков ноказыиает. что углы наклона волы-амперных характеристик усредненного тока, полеченные при различных |радиенгах концентрации Иа* явно отличаются лруг от друга. Подобное различие молег быть обусюилено сжмсгвием из определения, что усредненный ток нвлнетсн произведением тока одиночного канала и вероятности открытого состояния >гого канала /-ЖР...

Рис. 5. Вольт-амперные характеристики алиио- Эксперимент был повторен при рид-чувствительного канала в присутствии фиксированном значении концентра различных концентраций ГЧ»*. аии Ыа* в смотсеке и иариаииях

[На*^ (Рис 3 Б). В яом случае также, потенциалы реверсии тока фактически не отличались аг теоретически рассчиганных но уравнению Перист (± I вЭ) в соответствующих солевых условиях. Углы наклона вольт-амперных характеристик как усредненого тока, так и тока одиночного канала в данном случае мало отличаются друг от друга.

Наклон вольт-амперных характеристик одиночного кана..1а (¡/У) даёт значения его проводимости. В соответствии с экспериментальными условиями (концентрация

Na* с одной стороны БЛМ фиксирована, а с другой варьирует) Пыли построены два |рафика зависимости проводимости от концентрации Na* в trans и eis отсеках (Рис. 6).

В обоих случаях графики демонстрируют насыщение проводимости одиночною канала с. константами лиссоииаиии для односгоронпот связывания Na* при

tNl 100тМ

[N> J - 100 тМ

60

фиксированном значении 5м кониентраиии с другой стороны: К, 5 ^

9 61 + I 20 г У

3 I / К,-12.0+2.« тМ

г 10 h / 1

„^- ■

10 tco 1000

{Nl*| . (тМ)

«0 I » S 40

м 20

К,-22.4+11 тМ

10 100 1000 INl'l^mM)

«„ 9.72 ± 0.98 тМ.иК, 1Г1Л, 0.92 шМ.

С целью проверки предположения об изменении вероятности пребывания канала и открытом состоянии (Р0) канала при создании i-радиента [Na*] были построены (рафики зависимости Р0 от [Na* ] с одной стороны мембраны при фиксированном значении [Na*] с дру гой стороны (Рис. 73.

Как видна Р„ .жепонешшалыга убывает с повышением [Na*] u eis отсеке (Рис. 7 А), тогда как ¡рафики зависимостей Р„ от [Na*]^ имеют вид гипербол, асимптотически приближающихся к некоторому максимальному значению (Рис. 7 Б). Линеаризация последних зависимостей может быть проведена путем построения графиков в двойных обратных координатах, аналогично графикам Лайнуиоера-Берка в теории ферментативной кинетики (Segel I.H., 1975) (Рис. 7 В). По аналогии с ферментативной кинетикой, параллельность прямых, проведенных через экслери-

Рнс. 6. Графики зависимости проводимости амилорнгчувстшгтельного Na+ канала от концентрации натрия.

ментальные значения, свидетельствует о бесконкурентном механизме взаимодействия между ионами Na* с trans и eis стороны, что может свидетельствовать в пользу предположения о существовании о канале множественных центров связывания Na+. Эти графики также свидетельствуют, что повышение [Na*]^ сдвигает константу зависимости Р„ канала от концентрации Na+ в trans отсеке. Эгот сдвиг происходит в сторону более низких значений от К, = 100 ± 12 mM при 10 тМ [Na*!,,

к К, - 25 + 4 пгМ [Na*]^ при [Na*],.;, 50 тМ, ограничивая таким образом увеличение Р0 при увеличении концентраций Na* в trans отсеке.

X 0.1

0.0 4 t

** I™

* - JO mM ю О - »mM

i<7 -lOOeM

• • IJO mM

o.: -i ji

10 100 1000 [ Na* Jeu (mM)

S. 0.1 -

( r

I» ;

2 : IC-U-»-« ■;

А - 50 nM 1

Л - 100mM -» • IJOmM т С"""4* - '

А' -/ : iiC'a-'i-i

! I''-' -

10 100 1000 tN»*)„„(in.Vn

B. f* U

• .to mM

-0.05 л04 -0 03 -0 01 41.01 ООО 0.01 0.02 O.03 ОМ 0.05

l'lNa*U»<mM''>

Рис. 7. Зависимость Р„ АПК' от концентрации Na* о присутствии кальция.

Физиолошчсская значимость лих наблюдении может быть понята, учитывая Факт специфической ориентации канала в мембране (см. раздел Методы (•" лг.юпанин). Во-первых, вероятность пребьниния канала в открытом состоянии

повышается при понижении "внутриклеточной" концентрации Na* (в ей отсеке). Эги результаты согласуются с теорией регуляции по типу обратной связи. Главная особенность этого механизма заключается в том, что вхол Na+ через канал ишибируется при увеличении внеклеточной концентрации Na*. Таким образом, в сочетании с уменьшением движущей силы для входа Na\ снижение Р„ предотвращает увеличение уровня внутриклеточного Na+ и обьема клетки. Второе заключение, которое может быть сделано из вышеописанных результатов, состоит в том, что "внеклеточная" концентрация Na* ([Na*},^,) оказывала влияние на нероятноегь пребывания канала в отсрытом состоянии только при "внутриклеточной" концепт[кшии [Na+] (fNa+]c„) ниже 30 мМ. В этих условиях (поддержание постоянного [Na+]d, и увеличение [Na*]mJ наблюдалось насыщающееся увеличение Р„ Эги |>езультаты согласуются с наблюдением насыщения макроскопических Na+ токов при повышении наружного Na+ в коже лягушки (Van Driessche W. and Lindemann В., 1979) и в нтгч-кламн экспериментах на аникалыюй мембране кортикальной собирательной трубочке ночки крысы (Palmer L.G. and FrindtG., 1986). Более того, повышение [Na4] в см отсеке сдвигает относительную константу равновесия Р„ (К,) для [Na*](rm, в область более низких значений, что в переводе на физиолошческие термины означает более быстрое насыщение апикального входа Na+ при повышении его концентрации внутри клетки.

Все вышеописанные жеперименты были проведены в присутствии 10 рМ

[Са3+] (измерено спект|х>флуориметрически с использованием FURA-2).

♦

Лобаиление 10 мМ EGTA снижало концентрацию свободного [Сан] до <1 пМ и значительно повышало исходную активность АНК до ~ 0.1. Интересно, что при лгом приеме Р„ зависеш стг концентрации Na+ в cis и trans оттеках в существенно меньшей степени (Рис. 8).

Для дальнейшего выяснения влияния Са2* на АНК' была проведена серия женериментоп в присутствии различных концентраций Са2' в одном из отсеков

ячейки. Как показали лги эксперименты. присутствие Са2+ в cis опеке, но не [С*1*]«™. оказывает влияние на активность канала. Поттому лальнейшие эксперименты были проведены при постоянной концентрации Саг+ в trans отсеке < I пМ. Характерные записи тока через одиночные АНК. полученные п таких жепериментальных условиях представлены на Рис. 8 А.

д. 16 kim na^ / 100 гам n*^ о ci* *

I 1

fb If мм Ч. _ IH m.4

и,мсг;

i!

a ,M crj

1F1

-5

i fpA)

T

I J

3 у ^

j ук

4 4 4.*

Гистат»** J«ft ж\л

I 1 ида-л-)** ml чгжд>

' • wcwwiwi 4>u*>»»wm Гигтоп*** пии^ржиьых мчриня их*

В. алс«" I

<оо • • » « • -и

ТА_____к___

Рис. 8. Влияние ионов Са1* на актппноегь АНК'

Контролем в данном случае служит запись, полученная ири [Са2*]т < 1 пМ. Кальций дозозависимо интибировал активность канала в концентрациях выше 15 цМ.

Это ингибироиание происходит за тег снижения вероятности пребывания канала и открытом состоянии, которая снижалась до 0.09 ±0.01 и 0.02 ±0.01 при 15 и 2i> цМ Ca2*, соответственно. но не за счет изменения проводимости канала, к<и. показал анализ гистограмм амплитуд тока (Рис. 8 Б). Более тот, построение гистограмм времен жизни канала в различных состояниях проводимости (Рис. 8 Ii) свилегельствуег о снижении постоянной времени пребывании канала в открытом состоянии.

Дальнейшая серия жслериментов имела целью исследование эффектов РКС-заиисимого фосфорилирования (Рнс. 0). За контроль в данном случае принимали

активность канала в присутствии РКС и нулевой концентрации аденозинтрнфосфата (АТР)в условиях десятикратного градиента [Na*] (trans к eis, потенциал на мембране ± 80 mV). Вероятность пребывания канала в открытом состоянии о данном случае была равна 0.11±0.01, что практически не отличается or PG в отсутствие РКС (см выше). Реакция фосфорилирооанил требовала присутствия как диаиилглииерола (DAO) так и АТР о eis оттеке ячейки.

Рнс. 9. РКОмвпеимое ^осфорилировашк ииио- Исключение одного из комнонен-рил-чувствигельного Na+ канала тоо (РКС, DAO, И ли АТР) одно-

значно приводило к отсутствию эффекта на активность каналов. Повышение концентрации АТР до >50 цМ

■ • « ■ '■ • - • ' I _'Л_ГС.

кс - м , it

_' '__I—L.

"immrmn

nX-i00.J4AjT

1

«<»*• a llM J

[N«1 -ЮтМ

| Контроль 1 » ркс т атр;

• . 30 там 1 о • 30 тм 1

^ ■ 50тм й - 50 гом 1

■ • 100 тм1 □ • 100 лм;

т -150тм1 150 тм :

Т г

присолило к значительному снижению активности канала. Более того, фосфорилирроание приводило к изменению характера открытий канала: относительно продолжительные события, наблюдаемые в контрольных условиях, сменялись пачечным фликированием. В условиях РК.С-зависимого фосфорилирования ионы Са3+ также оказывали влияние на АНК исключительно с ей стороны Характерной особенностью .утих экспериментов является значительно более высокая эффективность Са2> в ингибировании АНК.

Концентрационные зависимости, полученные в этих экспериментах, представлены на Рис. 10.

Левосторонний сдвиг кривых 0, наблюдался при всех исследованных [Ыа*]^ как в отсутствие, так и в присутствие РКС-зависи-мого фосфорилирования. Однако, Р„ зависел от [Ыа*],^ в значительно меньшей степени в присутствии РКС-зависимого фосфорилирования.

Таким образом, из этих результатов следует, что эффекты "наружного" и/или "внутреннего" Ыа* зависят от концентрации Са2+ "внутри клетки". Ошжение кон-цешраиии Са-* в сц отсеке до уровня <1 пМ значительно повыша ет акишпость канала (от Р0 - 0.02 до Ро~0.1), и, более того, искши-

еС 0 1

0.0

Ч I-

Рнс. 10. Влиянне Са1* |Ш алииоршчувегшпель-ный N8* канал в присутствие и отсутствие РКОзавнсшюго фосформлировашш.

чае! дальнейшую зависимость Р0 с>1 кониешраиии Ыа* как в си, так и в ¡ют

отсеках. Зги" данные согласуются с наблюдениями уменьшении апикального входа Na' при ипги(ж|кшпии натрий-калиевого насоса бахиатедольноп мемб|юны уабаином и интактном :>нителии только и случае, если серозная qoa содержала более 0.1 мМ Сан (Chase U.S., Jr., 1984; Garty Н. & Lindemann В., 1984; Palmer L.G.. 1985; Silver R.B. el al, 1993). Результаты жснгри ментов. ирслсташюнные н данной |ыбаге. однако, не ншиоллил- ои|)слслить, какой из ионоо (Naf или Са2*) играет черничную )юл|. и |хчулинии АПК. Анализ концентрационных зависимостей активности АПК от Са:+ показывает, что оба иона нлияюг на кинетику капала, хотя их :х|>фскты имеют различные нронпления. Повышение "внутриклеточной" конпеи1|кшии С а2* выше 10 цМ приводит к флики|юванию канала. Гисгоцюммн времен жизни канала н открытом и закрытом состоянии в присутствии 25 цМ [Са2>),„ сиилете. |ьствуют. что ингибиронание и|юисхолит вследствие уменьшения измени жизни канала н обоих состояниях. Характерно, что ингибиронание наблюдалась в областях [Са:,],„. значительно выше физиологических концентраций. Повышение [Na*]r„ приводило к г.ншгу коншчщмшюниих зависимостей Р„ капала от fC'a:*|,„ влево. свидетел1,ствун. что оба нона (Na* и Са!*) вовлечены в |хг\ляпию активности канала. РКС-.тисимое фосфорилщюнание АПК сдвигало ire чи конипнпхннюннме еншеимостн в область значений, более близких к фнзиолоппсским коннгтрациям CaJt.

пынолм.

1. Лмилорил-чувстшпелипш Na'* канал ночки имеет три стабильных состояния и|юнолимо<:111 с амн »пумами 12-13, 24-26 и 40 pS. Отношение времен п{м|Пывания канала в них у|юннях нелюдимости составляет 17, 17 и 66% и остается неизменным но ни х m счеюванных концентрациях натрия. П|Юнодим(*;ц. одиночного ачилорщ чупстнтглмюго Na1 капана почки насыщается при увеличении копиейцшии натрия с олн(<П стороны мембраны, при фикси|юнпнном значении г тругой гшронн, с константами

диссоциации К, ,„ и К, равными 9.72 ± 0.98 тМ и 9.63 ± 0.92 шМ, соотиегствснио.

~>. Обработка амилорид-чуцстишслыюго N8* канала ночки ЭТТ, рсатнш. сношбсшуюншм (язрушепию лисульфидных связей, «пенолнла канал и наиболее низкое состояние 1Цюиодимоаи 12-13 рБ. Ирисупешие ОТТ (¡рактичаки не илияло на катонну ю ос-текпнякхтг, капа й и пом состоянии нрошдихюспс У* (2.00 ± 0.08) > Ыа4 > (1.0) Ж* (0.17 ± 0.05) » Саг* (< 0.001) но сравнению с контролем: У+( 1.97 ±0.05) > >(1.0) > К+ (0.15 ± 0.04)» Са3+(< 0.001). Амнщш иншбиропал канал с константой иш ибироиания 0.44 ± 0.12 цМ, значением, фактически не отличающимся от копцюдн « отсутствие ОТТ (0.42 ± 0.09).

Вероятность пребывания амшю|>ил-чу ветви гслиюго Ыа+ кaнaJla ночки в открытом состоянии увеличивается при уие.'вгкчши "внек-кп очной" концентрации натрия, но только н случае, «ли "сн)(риклсточная" цжла содержала не более 30 мМ и не менее 5 рМ Са2*. Снижение "внутриклеточной" концентрации натрия увеличивает ве|юягнос1Ь п|)ебывания канала п открытом состоянии при любой "внеклеточной" концентрации натрия.

4. Снижение "внутриклеточной" концентрации кальция до <1 пМ увеличивало »¡сходный уровень активности канала (Р„) с 0.02 ± 0.01 до 0.12 ± 0.02. но значительно снижало влияние как "ипутрикле точной", гак и "внеклеточной" концентрации натрия на вероятность пребывания канши в открытом (-«стоянии.

5. РКС-инлуииропанное фосфорилирование интбщюнало одиночные амилорид-чувегоительные Ыа* каналы ночки, снижая верошность нребмнапия канала в открытом состоянии, и сдвигая концентрационную завишмоси, ве[юнпюсти пребывания канала в отк|>мгом состоянии от кальция г. 10-100 }»М Са" без РКС-зависимого фосфорилирования до 1-3 рМ Са2' при РКС-зависимоч фосфорили|Ювании.

CONCLUSIONS.

This work describes the findings of experiments thai tested the hypothesis that |N.. and [CaJ*l directly alTect the Junction of renal amiloride-sensitive Na* channels in a cell-l«. model system. The purpose of the present work was also to elucidate the effects ol >' reducing agent dilhiothreitol (DTT) on behavior of these channels. It was found that:

1. The renal amiloride-sensitive Na* channel studied in planar lipid bilayers display tin < stable substates of 12-13, 24-26, and40pS. The relative proportion of time spent tithe channel in these levels did not change at any examined {Na+] (namely, 17, 17, .-h;.i 66% of total, for levels 1, 2, and 3 respectively).

The slope unitary conductance of the renal amiloride-sensitive Na* channel saturates with increasing sodium concentration on the one side of the bilayer while holding [Na'] on the other side constant, with K, values for [№*],„ and [№*}„„„ of 9.7 ± 1.0 mM and 9.6 + 0.9 mM, respectively.

2. Disulfide bond reduction of renal amiloride-sensitive Na* channel protein complexes with DTT in planar lipid bilayers promotes a permanent transition of the channel into one, resident predominantly in a lower conductance state 12-13 pS. The relative cation permeability sequence of renal amiloride-sensitive Na+ channel was unaffected by DTI treatment: Li* (2.00 ± 0.08) > Na* > (1.0) > K* (0.17 ± 0.05) » Ca2+ (< 0.001). Amiioride produced flickering-type block, with an apparent inhibitory equilibrium dissociation constant of 0.44 ± 0.12 pM, a value indistinguishable from control (i.e., a non-DTT-treated: 0.42 ± 0.09 pM).

3. The probability of the renal amiloride-sensitive Na* channel being in the open state increases with elevation of "extracellular" sodium, but only if the "intracellular" medium contained s30 mM Na+ and ¿5 pMCa!\

-1. Reducing "intracellular" sodium increases open probability of the channel at any "extracellular" sodium.

Buffering the cis calcium with 10 mM EGTA to [Ca2f]<I nM increased the initial level

of channel activity (from P„ = 0.02 ± 0.01 to P0 = 0.12 ± 0.02), but markedly reduced the influence of both "intracellular" and "extracellular" sodium on the channel open probability.

5. Protein kinase C-induced phosphorylation inhibited the renal amiloride-sensitive Na' channel by decreasing probability of the channel being open and shifted the dependence of this probability on [Ca2*]^ from the range of 10-100 pM in control to the range 1-3 pM CaJ*, for phosphorylated channel.

ХУЛОСА.

Ушбу илмий ишининг максади буйракнинг амилорид сезувчи натрии каналиниг бошкарилишин ыолекуляр механизмларини тадаиц килишдир. Натихада цуйидаги хулосарарга эришдик.

1. Буйракнинг амилорид сезувчи натрий канала куйидаги учта туррун. утказувчанлик *олатига эга - 12-13, 24-26 ва 4о пикосименс ампли-тудали. Каналнинг бу даражадаги утказувчанликда булиш вакти 17, Jv ва 66 фоизни ташкил «илиб, натриининг тад«ин килинган барча концен трациясида узгарыасдан колади. Буйракнинг амилорид сезувчи натрий каналининг утказувчанлиги мембрананинг бир томонидан натрии концентрациясининг ортиши иккинчи тоыондан сакланиш натихасида туйинади

2. Буйракнинг амилорид сезувчи натрий канали дисульфид богларни парчаловчи реагент - ДТТ билан ишланганда канал анча паст булган 12-13 пикосименс утказувчанлик *олатига келиб колади, ДТТ нинг иштироки каналнинг танловчанлик ва амилорид билан сусайтирилишини узгартирмайди.

3. Буйракнинг амилорид сезувчи натрий каналининг очилиш э^тимоли "*ужайрадан ташкари даги натрий концентрациясининг ортиши билан ортади, бунда "^укайра ичи" даги му^ит таркибида купи билан 30 "м/. натрий ва камида 5 мкМ кальций булиши керак.

"дукайра ичи" натрий концентрациясининг пасайиши "*ужайрадан ташкари" даги натрийнинг исталган концентрациясида каналнинг очилиш холатида булиш э^тимолигини оширади.

4. "дужайра ичидаги" кальций концентрациясининг I нМ гача пасайиши каналнинг очилис ^олатида булиш э^тимолигини оширади, лекин бунда ички ва ташки натрий концентрациясининг таъсири йуколади.

5. РКС га боглик булган фосфорилланиш буйракнинг амилорид сезувчи натрий каналининг фаъоллигини сусайтиради, ва кальцийнинг сусай-тирувчи таъсири сезиларли даражада РКС га боглиц Фосфорилланиш билан кучаяди.

CnticoK pa6oT, onyfLuiKOBaimiiMY no Tewe mccrptauHH

1. Ismailov, I.I., B.K. Berdiev, and D.J. Benos. 1995. Regulation by Na* and Ca2t of renal

epithelial Na* channels reconstituted Into planar lipid bilayen. J. Gen. Physiol. 106:445-466.

2. Ismailov, 1.1., B.K. Berdiev, and D.J. Benos. 1995. Feedback regulation of an

epithelial sodium channel in planar lipid bilayers. Biophys. J. 68:A387 (Abstr.).

3. Ismailov, I.I., B.K. Berdiev, A.L. Bradford, M.S. Awayda, C.M. Fuller, and D.J. Benos.

1996. Associated proteins and renal epithelial Na* channel function. J. Membrane Biol. 149:123-132.