Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование строения участка ионного канала нейронального никотиновогохолинорецептора

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование строения участка ионного канала нейронального никотиновогохолинорецептора"

РГ8 ОД

ЛИТ ^396 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК нетитут ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ и биохимии им. И. ДА. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

ГОРБУНОВА

Ольга Борисовна

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРОЕНИЯ УЧАСТКА ИОННОГО КАНАЛА НЕЙРОНАЛЬНОГО НИКОТИНОВОГО ХОЛИНОРЕЦЕПТОРА

Специальность 03.00.13—Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в лаборатории сравнительной физиологии дыхания (заведующий — доктор биологических наук Л. И. Кривчснко) Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН (директор — академик В. Л. Свидерский).

Научные руководители: кандидат химических наук Н. Б. Бровцына, доктор биологических наук А. И. Кривчснко.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н. Б. Суворов, доктор технических наук Д. А. Уголсв.

Ведущая организация: Санкт-Петербургский Государственный Университет.

Л,

Защита состоится «■11 » 1996 г.

в часов на заседании Диссертационного совета К.001.23.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при НИИ экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ПИИЭМ РАМН (Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12).

Автореферат разослан « » /И 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета К.001.23.01

доктор биологических наук О. Г. Куликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Холинергическая передача нервного импульса

является одной из основных как в центральной так и в периферической нервной системе. Это определяет необходимость проведения фундаментальных исследований строения и функции никотинового холинорецептора и, в особенности, его центральной чести - ионного канала, который и обеспечивает ионную проводимость. Интенсивное изучение никотиновых холинорецепторов в последнее десятиление привело к существенному прогрессу в понимании интимных механизмов синаптической передачи нервного импульса и, в частности, молекулярной организации холинорецепторов (11пуут, 1993, 1995; СИалдеих, 1995; ваИ, СИапдеих, 1995). Поскольку никотиновые холинорецепторы высоко гомологичны, основная часть исследований проводится на рецепторах мышцы и электрического органа как наиболее доступных в методическом отношении. В то время как определение строения нейронального холинорецептора является крайне трудной задачей даже при использовании таких современных методов исследования как рентгеноструктурный анализ, электронная микроскопия высокого разрешения, метод меченых лигандов и других.

Чтобы понять молекулярный механизм действия холинорецептора, необходимо установить его структуру и локализацию мест связывания лигандов, которые определяют его активность. Один из классов лигандов, регулирующих функцию рецептора, - неконкурентные блокаторы, которые могут стерически ингибировать транспорт ионов, входя в ионный канал и связываясь с определенным участком, расположенным в нем. В настоящее время известно большое число неконкурентных блокаторов, вместе с тем особенности топографии ионного канала и требования, предъявляемые им к структуре блокаторов остаются недостаточно изученными.

Неконкурентные блокаторы могут служить ценным инструментом для определения строения ионного канала, поскольку эффективность связывания определяется соответствием структуры молекулы блокатора участкам лолипептидных цепей, образующих русло ионного канала. Поэтому одним из методов изучения топографии ионного канала является метод, основанный на исследовании связи ме>кду активностью каналоблокаторов и структурой их молекул. Ранее, для решения такой задачи использовалась,структурная формула соединений. Но, поскольку молекулы лиганда имеют несколько простых связей, относительно которых происходит внутреннее вращение, молекула существует в различных пространственных формах (конформациях). Использование методов теоретического конформационного анализа, дающих возможность расчета трехмерной структуры молекулы блокатора, позволяет

получить количественные оценки элементов топографии ионного канала, определить взаимное расположение гидрофобных и нуклеофильных областей, а также объяснить парадоксы блокирующей активности в рядах соединений.

Цели и задачи. Основной целью настоящей работы являлось определение топографии ионного канала нейронального никотинового холинорецептора на участке связывания пентаметиленбисаммониевых ганглиоблокаторов.

Исходя из цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Выбор гомологических серий бис-катионных ганглиоблокаторов, существенно различающихся по активности при незначительных различиях в структуре молекул, выполнение конформационного анализа молекул выбранных соединений методом молекулярной механики.

2. Отбор наиболее низкоэнергетических конформаций и расчет их относительных заселенностей.

3. Построение пространственных моделей всех низкоэнергетических конфор-меров молекул изучаемых рядов.

4. Определение максимального коэффициента корреляции, связывающего трехмерную структуру молекул с их блокирующей активностью.

5. Построение модели ионного канала на участке связывания блокаторов с учетом всех полученных данных о конформационно-функциональных отношениях изученных рядов соединений.

б! На основании предложенной модели объяснение изменения блокирующей активности при изменении структуры молекул.

7. Создание представлений об основных свойствах блокаторов, необходимых для продуктивного связывания в ионном канале нейронального никотинового холинорецептора.

Научная новизна. Методом теоретического конформационного анализа выполнен систематический анализ 56 пентаметиленбисаммониевых соединений, являющихся блокаторами открытого ионного канала нейронального никотинового холинорецептора.

На основе сопоставления полученных данных с экспериментальными данными о блокирующей активности соединений, проведен анализ конформационно-функцио-нальных отношений, обнаружена корреляция между биологической активностью соединений и геометричекими параметрами их молекул. Выявлены элементы структуры молекул блокаторов, необходимые для продуктивного связывания.

Определен^ топография участка связывания бис-катионных ганглиоблокаторов в русле ионного канала нейронального никотинового холинорецептора. Исследована

роль стерического окружения нуклеофильных пунктов, а также выявлены требования, предъявляемые каждым из нуклеофильных пунктов к строению связывающихся с ними катионных групп. Построена модель участка ионного канала, связывающего данные блокаторы. На основании предложенной модели объяснены парадоксы блокирующей активности ряда соединений.

Практическая значимость. Результаты, полученные в данной работе, способствуют пониманию механизма действия уже известных ганглиоблокаторов, а трк же могут быть использованы при направленном синтезе новых препаратов избирательного типа действия, необходимых для клинической практики.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В ряду полиметиленбисаммониевых соединений, производных пентаэтония и пентаметония установлена корреляция между блокирующей активностью соединений и геометрическими параметрами их молекул!

2. Установлена ключевая роль стерического фактора при продуктивном связывании молекулы блокатора в ионном канале.

3. Показано, что геометрические параметры молекулы блокатора являются необходимым, но не достаточным условием для продуктивного связывания.. Установлено, что для продуктивного связывания катионной группы молекулы блокатора по месту первого нуклеофильного пункта необходимо наличие радикалов, обеспечивающих достаточное гидрофобное взаимодействие, в то время как для связывания со вторым нуклеофильным пунктом существенна четвертичность взаимодействующей с ним катионной группы.

4. Выявлены элементы структуры блокаторов, необходимые для продуктивного связывания в ионном канале нейронального никотинового холинорецептора

5. Предложена модель участка ионного канала нейронального никотинового холинорецептора, связывающего молекулы бис-катионных ганглиоблокаторов. Определены размеры узкой части ионного канала.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены: на заседании кафедры Физиологии человека и животных Санкт-Петербургского Государственного Университета (С.Петербург, 1994); Заседании секции Экологической физиологии Института Эволюционной Физиологии и Биохимии им.И.М.Сеченова РАН (С.Петербург, 1995); IX Международном симпозиуме по холинергическим механизмам (1вСМ) "От молекулярной биологии к клинической значимости" (Германия, Майнц, 1995); I Европейском конгрессе по фармакологии (ЕРНАЯ) (Италия, Милан, 1995); РгЗочем совещании Молодых ученых "Регуляция-роста аксонов, образование синапса и пластичность в нервной системе" (Швеция,

Кристиноберг, 1995); I Конференции молодых физиологов и биохимиков России "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций" (С.Петербург, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссетации. Диссертация изложена на .¿¿¿.страницах машинописного текста, состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссретация содержит Ч таблиц, 3 é рисунков, библиографию из Jjí¿. работ.

Методы исследования.

Конформационный анализ молекул соединений выполнен методом молекулярной механики (метод атом-атомных потенциалов). Конформационная энергия рассчитана как сумма невалентных взаимодействий атомов, торсионной энергии связей, энергии упругой деформации валентных углов атомов углерода и азота и энергии электростатических взаимодействий (Дашевский, 1974; Маслов, 1977). Минимизация энергии проводилась в пространстве торсионных и валентных углов при помощи универсальной программы для расчета конформаций органических молекул, разработанной Б.С.Жоровым (1975). Вычисления выполнены на IBM PC/AT. Расчет энергии молекул проводился с учетом внутреннего вращения вокруг всех простых связей триалкиламмониевой группы и связи пентаметиленовой цепочки ближайшей к азоту этой группы. Торсионные углы отсчитывались в соответствии с правилами IUPAC (Номенклатура IUPAC/IUB, 1973).

Методом теоретического конформационного анализа показано, что у пента-метония полностью вытянутая конформация энергетически более выгодна и при 25 °С заселена на 70% (Роэенгврт, Жоров, 19ВЗ), причем электростатическое отталкивание заряженных катионных групп в транс-конформации минимально, и мало зависит от их структуры. По этой причине в нашей работе для всех рассматриваемых соединений - принята транс- (т.е. полностью вытянутая) конформация пентаметиленовой цепочки с расстоянием между атомами азота равным 7.S А:

Для построения пространственных моделей молекул их наиболее выгодные устойчивые конформации визуализированы с помощью программы Desk Top Molecular Modelling (Oxford Electronic Publishing). Чтобы установить размеры минимального профиля конформера, его стержневая модель вращалась вокруг оси, связывающей атомы азота, до тех пор, пока ее проекция на экране не вписывалась в прямоугольную рамку минимальной площади.

Для определения размеров сечения ионного канала использовались конформации молекул блокаторов, превышающие энергетический минимум не более чем на 3 ккал/моль. Для каждой конформации I блокатора к были определены минимальные размеры прямоугольного сечения (/, т), через которое проходит данный конформер (Рис.'.).

Допустим, что сечение канала имеет форму прямоугольника со сторонами а й Ь. Тогда при любых а и Ь для каждого блокатора к можно рассчитать общую заселенность конформаций, проходящих сквозь это сечение по формуле:

Т» = £ [Р* * о*] 1 если I* < а и т* < Ь О если 1*>айт*>Ь

Ъ

X

X

Рис.1. Определение размеров проекции варьируемой катионной группы бис-катионно-го соединения.

Полученный ряд Т» можно соотнести с наблюдаемыми в эксперименте активностями блохаторов и рассчитать коэффициент корреляции между ними. Тогда истинными значениями параметров сечения а и Ь окажутся те, которым соответствует максимальный коэффициент корреляции.

Результаты. .

Исследуемые соединения разделены на две большие группы. Первая включает производные пентаэтония ЕЬМ'^СНЬЬ -М^'^Я3, вторая - пентаметония Ме3Ы*-(СН2)б-|\ГВ'Я2Н\ В обоих случаях варьировалась одна катионная группа, тогда как другая и пентаметиленовая цепочка между ними оставались неизменными. Каждая из больших групп подразделена еще на две подгруппы. В одной из них варьируемая катионная группа четвертичная, в другой - нечетвертичная. Это обеспечивает достаточно строгие условия при сопоставлении как конформационных, так и биологических эффектов веществ в пределах каждой подгруппы.

Особенности первого участка связывания блокаторов в ионном канале. Ранее показано, что бис-катионные ганглиоблокаторы взаимодействуют одновременно с двумя нуклеофильными пунктами никотинового холинорецептора, причем расстояние в 4-6 метиленовых групп между атомами азота оказывается оптимальным (Лукомская, Гмиро, 1962). Кроме того, было высказано предположение, что по крайней мере один нуклеофильный пункт расположен в русле канала (Скок, 1985). Анализ связи структуры и активности ряда пентаметиленэтониевых производных привел к предположению о неспособности ЕЬМ*-группы проходить через узкую часть канала (Гмиро и др., 1987).

В ряду соединений с постоянной Е^'-группой блокирующая активность падает с увеличением размеров варьируемой катионной группы (Табл.1). При этом соединения с переменными группами больших размеров проявляют одинаково слабую блокирующую активность, независимо от конкретной структуры этой группы. Этот факт позволяет предположить наличие в канале сужения, препятствующего проникновению соединений с аминогруппой значительных размеров к участку связывания. Нами высказано предположение, что большая по размеру катионная группа, не способная пройти через сужение канала, связывается с первым нуклеофильным пунктом, расположенным ближе к устью канала над сужением. В то I время как меньшая катионная группа связывается со вторым нуклеофильным пунктом, расположенным ниже данного сужения.

С целью определения параметров сужения, ограничивающего способность молекулы блокатора достичь участка связывания в русле канала, исследован ряд соединений с постоянной Е^з^-группой, вторая катионная группа которых варьировалась. Геометрические параметры варьируемой катионной группы определяли способность молекулы достичь учаска связывания. В первой части работы варьируемая катионная группа во всех случаях имела четвертичную структуру со стабильным (+)-зарядом на атоме азота (Табл.1). При анализе данных таблицы 1 обращает на себя

Таблица 1. Сопоставление активности соединений общей формулы ЕЬМЧСНгЬ-М'Н'я'Я3 с гидрофобностью и заселенностью продуктивных конформаций (для сечения 6.1 *8.3 А)_

Соеди- -М'К'ГГ'Р!' нения

-Ы'Ме.Е! '

-М'МеЕЬ

-К*МегРН

-МЧ'^гРг-п

-М*МеЕ1Рг-1

-ГГЕЬ

-га

Ме

Заселенность £Р %'

-1д Р*

Активность на ганглии #

симпатич. | ларасимпатич.

II

III

IV

V

VI

VII

VIII

IX

X

XI

XII

XIII

XIV

XV

XVI

XVIII

XIX

XX

£1

Е1

Рг-1

я

Рг-п

-о

Ме

"а

-О

Ме

•о

Е( /—ч

XVII -1}1'ч ,о

/ ч

-М*

н

Ме -Э'Мег

100.0 100.0 54.0 12.6 6.0 0.0 0.0

95.5

49.4 8.1 0.0 27.1 17.0 0.0

0.0

0.0

'92.4 47.3

100.0

95.5 100.0

-5.15 -5.09 -5.03 -5.16 -4.88

-4.97

-5.43 -5.50 -5.22

-5.56 -5.68

-5.22

5.60 7.70 3.10 0.70 0.20 0.50 0.12

3.7 0

1.50 0.16 0.07 0.05 0.07 0.08

0 70

0.17

3.20 1.30

2.50

0.70

1.60

16.60 25.80 16.90 11.00 0.39 6.80 0 22

11.00

23.2 0.42 0.18 0.12 0.09 0.32

8.7С

1.24

16.20 6.90

3.38 7.30

* - суммарная эась.'емкость продуктивных конформаций (для сечения 6.1 *8.3 А ) " - гидпофобность соединений, рассчитанная методом Хзнша

fit опюсшелыю гексоний, активнасль коюрго приняла равной 1 О внимание, что изменения структуры EtjN'-rpynnti и соединении VII веду г к превращению малоактивного VII в высокоактивные IX и III Это достигав ген либо укорочением одного из трех этильных радикалов EtjN'-rpynnu на СН^-звено (III), либо ограничением конформационной подвижности двух этилыных радикалов EljN'-группы путем замыкания их в пирролидиновое кольцо (IX). Увеличение же объема кажонной группы в IX на одно СНг-эвено путем замены этила на пропил (XI) или пзо-пропил (X), либо расширением пирролидинового кольца до пилеридинового (XVI) ведет к резкому падению активности. Соединения VII и IX, имеющие одинаковое число углеродных атомов, но в то же время разное строение переменной катионнои группы, различаются по активности более чем на порядок. Существенно различаются по активности также соединения III, IV, V с одинаковой брутго-'формулой переменной группы (-N'CsHu), причем эти соединения практически не отличаются по гидрофобмости (lg Р одного порядка). Следовательно, для продуктивного связывания молекул в ионном канале определяющим фактором оказываются конфирмационные параметры молекулы, и разница в активности может быть объяснена при наличии данных о трехмерной структуре блокатора. С этой целью нами рассчитаны все устойчивые конформации каждого соединения.

Сопоставление данных об активности и конформационных возможностях бис катионных блокаторов позволяет оценить размеры сужения, ограничивающего способность катионной группы достичь нуклеофильного пункта в русле канала. Подход к решению этой задачи основан на анализе множества вариантов размеров сужения. Для каждого варианта все устойчивые (т.е. низкоэнергетические) конформации молекул блокаторов разбиваются на две категории: продуктивные (способные проникнуть через сужение и достичь нуклеофильного пункта в русле канала) и непродуктивные (превышающие размер сужения). Если предложенная модель адекватна реальному процессу связывания бис-катионных ганглиоблокаторов, то такой.анализ может привести к выявлению оптимального профиля сужения, при котором активность блокаторов наилучшим образом коррелирует с заселенностью продуктивных конформации.

Максимальные коэффициенты корреляции (0.96 и 0.81 соответственно) имеют место при одних и тех же размерах сужения - а = 6.1 A, b = 8.3 А, как для симпатического так и для парасимпатического ганглиев (Табл.2,а). Эти результаты получены для 16 соединений, имеющих четко выраженное соответствие активности и конформационных параметров (основная группа А). При расчете коэффициента корреляции с учетом соединений, содержащих гетероциклическое кольцо (XIX, XX), серу (XXI),

Тябпица 2. Коэффициенты корреляции между активностью и заселенностью

продуктивных конформеров для соединений общей формулы EtjN >-(CH2)5-N'R'R R и MeaN -(CH;)5-N>R1R?R1.________

Соединение Наивысший коэффициент корреляции "

симпатический ганглий парасимпат-ческий ганглий

EtjN'-fCHsb-N'R'R'R'

а) с четвертичной группой -NYVrW

А 1, II, III, IV, V, VI, VII, VIH, IX, X, XI, XIV, XV. 0.96 (6.1; 8.3) 0.81 (6 2; 8.4)

XVI, XVII, XVIII

A + XII, XIII 0.96 (6.1; 8.3) 0.78 (6.3; 8 4)

A + XXI 0.91 (6.1; 8.3) 0 73 (6.3; 8.4)

A ♦ XIX, XX 0.88 (6.1; 8.3) 0.69 (б.З; 8.4)

6) с нечетвертичной группой -N'HR'R2

Г) XXII. XXIII, XXIV. XXV, XXVI, XXVII, XXVIII 0.87 (5.1; 6.3) 0.79 (5.1; 6.4)

В + XXIX, XXX 0.91 (6.1; 8 3) 0.79 (5.5; 8.4)

MejN'-fCHrb-N'R'R'R'

С: XXXIII, XXXIV, XXXV, XXXVI, XXXVII, 0.91 (5.5; 6.3) 0.96 (5.5; 6.3)

XXXVIII

С + XXXIX, XL, XLI.XLII 0.91 (5.5; 6.3) 0.97 (5.5; 6.3)

* В скобках - размеры сечения канала (А), соответствующие полученному

коэффициенту корреляции.

гептаметипениминовый цикл (XII) и циклоалкил (XIII), полученные размеры предполагаемого сечения ионного канала не изменились, и лишь несколько уменьшилось значение коэффициента корреляции (Табл 2,а).

Следует отметить, что для проявления высокой блокирующей активности важна но юпько способность молекулы пройти через сужение, но и возможность продуктивно связаться со вторым нуклеофильным пунктом. Так, у соединений XII и XIII 27% и 17% молекул проУодит через сужение, однако активность практически отсутствует. Можно предположить, что низкая блокирующая активность этих соединений связана со строением их гидрофобных радикалов, не позволяющих атому азота, несущему положительный заряд, достаточно близко подойти ко второму муклеофильному пункту, что также должно ослабить фиксацию EbN'-груллы на другом концо молекулы по месту первого нуклеофильного пункта, сдвинув ее в сторону расширения ионного канала и, тем самым, нарушив связывание (Рис.2).

Активность соединения VII, обе катионные группы которого не проходят через сужение 6.1*8 ЗА, равгактивности слабого монокатионнопэ бпокатора - тэтраэтил-

Рис.2. Орис1 нация молекулы бис-катионного блокатора XII в русле ионного канала

аммония -Е^Ы* (активность 0.1 от гексония). Отсюда следует, что в связывании по первому нуклеофильному пункту участвует одна Е1з№4- группа (см. Рис З.г).

Далее, для изучения влияния особенностей строения варьируемой катионной группы на активность бис-катионных блокаторов исследованы 9 соединений, содержащих нечетвертичную катионную группу (Табл.3).

Таблица 3. Активность соединений общей формулы ЕЬМ'-(СНг)ь-М'НК'Н2

и заселенность продуктивных конформаций (для сеченияб.1 -8.3 А)

Соединение -гтя'^3 Заселенность £Р % * Активность на ганглии #

симпатич. | парасимпатич

XXII 100.0 0.70 1.80

XXIII -М*НМе2 100.0 1.80 6.20

XXIV 79.6 1.10 4 .40

XXV н 100.0 1.10 4,00

XXVI -И'НгВи-/ ' 100.0 1.10 1.27

XXVII -ГЧ'НМеРг-/ 98.5 1.00 2.90

XXVIII -Ы*Н2Рг-/ 100.0 0.60 0.97

XXIX -Ы*НРг2-/ 41.6 0.18 1.05

XXX -М*НМеВи-( 87.2 0.11 0.38

" - суммарная заселенность продуктивных конформаций (для сечения 6.1*8.3 А) " относительно гексония, активность которого принята равной 1.0.

Ошетим, что соединения о ЕЦГН- (XXIV), /-PrMeN'H- (XXVIl), /-BuN'H2- (XXVI) лпрролидиновой (XXV) группами (первые три являются изомерными) имеют активность на симпатическом ганглии, близкую к 1, и заселенность продуктивных конформаций, близкую к 100с/о (Табл.З). Вместе с тем соединение с Ме2М*Н-группой (XXIII) имеет заселенность продуктивных конформаций также 100%, а активность на симпагическом ганглии а 1,5 раза выше, что, по-видимому, можно объяснить большей комппеменгарностыа Ma^N'H-группы гирофобной области нуклеофильного пункта и билыией силой кулоновского взаимодействия вследствие малого размера этой группы.

Коэффициент корреляции для данной группы соединений оказался равным 0.91 для симпатического ганглия и соответствует размерам сечения 6.1 "а.3 А (Табл 2,6). Столь высокая корреляция еще раз свидетельствует о ведущей роли стерического фактора при взаимодействии молекул блокатороа с ионным каналом.

Замена одной метильной группы а молекуле четвертичного аналога на водород ведет к падению активности, несмотря на высокий процент продуктивных конформаций у соединений с нечегвертичной группой (Табл.1, 3). В частности, замена одного из трех метилов в MejN'-грулпв (I) на водород (XXIII) ведет к падению активности в 3 раза при заселенности продуктивных конформаций 100% в обоих случаях. Такое же падение активности при сохранении высокой заселенности наблюдается также при переходе от соединения VIII к XXV. Аналогично, замена метила в EtjMeN'-rpynne (III) на водород (XXIV) также ведет к падению активности в 3 раза, несмотря на то, что заселенность продуктивных конформаций увеличивается в 2 раза. Эти данные позволяют высказать предположение о высоком сродстве именно четвертичных катионных групп ко второму нуклеофильному пункту.

Определение параметров сужения ионного канала в области второго нуклеофильного пункта. Далее рассмотрен другой ряд бис-катионных соединений -производных лентаметония. Высокую активность соединений MejN'-ряда нельзя объяснить задержкой в сужении 6.1 »8.3 Л одной из катионных групп по стерическим причинам, поскольку обе катионные группы способны проходить через это сужение, к тому же, активность соединений данного ряда увеличивается с увеличением размеров варьируемой катионной группы (Табл.4). Можно предположить, что в канале имеется второе сужение, более узкое по сравнению с первым и способное задерживать менее объемные катионные группы, подобные тем, что имеются у соединений Ме^'-ряда. В этом случае блокирующая активность данной группы соединений должна быть тем выше, чем труднее они проходят через второе сужение своей переменной катионной группой, т.е. корреляция должна быть обратна той, которая

Таблица А. Активность соединений общей формулы Ме]М,-(СН2)5-М*Н,Нгя'

Соеди- Заселенность Активность Обратная величина

нение на ганглии @ активности

1Р,%- симпат. | пэрасим. СИМРсП. | пэрасим

XXXI •N'1-13 100.0 0.0 0.03 0 05 33.30 20.00

XXXII -1М*НгМе 100.0 . 0.0 0.20 0.44 5 00 2.27

XXXIII -М'НМег 100.0 33.8 1.00 1.22 1.00 0.82

XXXIV 100.0 57.2 2.70 3.20 0 37 0.31

XXXV -М'НгРг-< 100.0 . 100.0 7.70 22.40 0.13 0.05

XXXVI -М*НгВи-Г 100.0 100.0 4.20 26.90 0 24 0.04

XXXV)! ■гО 100.0 100.0 ' 4.00 - 0.25 -

XXXVIII -Ы'НМеРг-/ • 98.5 100.0 7.70 13.90 0.13 0.07

XXXIX ^'НМеВи-Г 87.2 100.0 5 50 20.00 0.18 0.05

XI. ^*НЕ1г 79 6 100 0 3.70 19 60 0.27 0 05

хм -М'НРгг-/ 41.6 100 0 9.40 31 00 0.11 0 03

хш 32.9 100.0 4.20 11.80 0.24 0.09

хин -М Мез 100.0 1000 1.40 1.60 0.71 0.63

ХНУ -М'МегЕ1 100.0 100 0 1.90 7.10 0.53 0.14

XIV 10 95.5 100.0 4.00 6.30 0.25 0.16

1 >—1 Ме

хш -М'МеЕ1г 50.4 100.0 2.60 9 40 0.39 0.11

12.6 100.0 3.90 6.00 0.26 0.17

Х1_УШ 15.6 100.0 0.80 4.00 1.25 0.25

хих -1Ч'МеЕ1РЫ 0.0 4.80

и -ГГМеРгг-/ .0.0 5.00 -

и -М*НгСН2-Ас1 0.0 О.'ЗО 19 50

ш Н -ГГН2СН-Ас1 0.0 1.80 .30.00

Ме

ни -М%Ас1 0.0 1.50 60 00

НУ Ме Ме ч/ • 0.0 3.50 56.70

ч>

/ч Ме Ме

IV

IV!

Ф

0.0 0.0

2.40 26.60

3.30 5.90

' - суммарная заселенность продуктивных конформаций для сечения 6.1 *8.3 А " - суммарная заселенность продуктивных конформаций для сечг?нип 5.5 3 Л @ относительно гексония, актипмогчь которою принят рапной 1.0.

'4 ли - адамлпан (С,„Н|ь). имела место длл рассмотренных выше соединений с постоянной ЕЬМ'-груллсй в отношении первого сужения.

Чтобы проверить степень достоверности такого предположения, рассчитаны параметры сужения канала, для I вторых имеет место наивысший коэффициент корреляции между заселенностью проходящих конформаций и величиной, обратной величинам актиености (Табл.2). Продуктивными (т.е. биологически активными) в данном случае считались конформеры, неспособные по своим стсрическим параметрам пройти через сужение. Для расчета коэффициента корреляции использованы соединения, все низкоэнергетичьскии конформеры которых проходят через сужение канала 6.1 »8 3 А, (ХХХШ-ХХХУШ), в то время как соединения, у которых через это сужение проходит только часть конформеров, в расчет коэффициента корреляции первоначально не включались. Наивысший коэффициент корреляции, 0.91 для симпатического и 0.96 для парасимпатического ганглиев соответствует сужению аппроксимированному прямоугольником с параметрами а = 5.5, Ь = 6.3 А, (Табл.2).

Далее нами рассчитан коэффициент корреляции для расширенного ряда соединений, включающего ХХХ1Х-ХШ (Табл.4). Последние отличаются тем, что через сужение 6.1*8.3 А проходит лишь часть их конформеров, которые и учитывались при расчете. Для данного ряда коэффициент корреляции также соответствует сужению 6.5*6.3 А и равен 0.91 для симпатического и 0.97 для парасимпатического ганглиев (Табл.2). Полное совпадение результатов расчета для рядов из 6 и 10 соединений гакжеявляется подтверждением правомерности гипотезы о втором сужении.

Наименьшей активностью обладают соединения с ЬГНз- (XXXI) и МеЫ*Н2-груп-пами (XXXII) (Табл.4). Можно предпопожить, что такая низкая блокирующая активность этих соединений объясняется тем, что их небольшие катионные группы во всех своих конформациях проходят через сужение 5.5*6.3 А и выходят за пределы области связывания, что лишает молекулы данных соединений возможности двухточечной фиксации (Рис.4,в). В то же время существует вероятность другой ориентации молекулы в русле ионного канала, при которой Ме3Ы*-фуппа связывается со вторым нуклеофильным пунктом, а переменная катионная группа находится на уровне первого нуклеофильного пункта. Однако в этом случае продуктивной фиксации М*Нз- и МеМ*Н2-групп не происходит в связи с их неспособностью к 'эффективному гидрофобному связыванию (Рис.3,в).

Все остальные соединения имеют варьируемые катионные группы, в большей или меньшей степени не способные пройти через сужение 5.5*6.3 А, и все они обладают большей активностью по сравнению с первыми двумя (Табл.4). Некоторые

различия о величинах активностей этих веществ обусловлены, по-видимом/, степенью стерического соответствия участку связывания.

Поскольку полученные данные подтверждают гипотезу о втором сужении, то возникает вопрос о его местонахождении в канале. В качестве наиболее простого предположения, возможного на данный момент, можно принять следующее. Соединения МвзМ'-ряда связываются с тем же участком канала, что и предшествующая группа соединений EtjN'-ряда, т.е. одна катиомная группа соединения Ме^'-ряда связывается в области первого сужения (6 1*8.3 Л), о другая - в области второго сужения (5 5*6.3 /'0. отстоящего на расстоянии пенгаметиленовой цепочки от первого места связывания. Тогда расположение второго сужения будет совпадать с местом связывания переменной кагионной группы бис-кэтионных бловдторов EtjN'-ояда.

В табл.4 включены 8 соединений MejN'-ряда (XUX-LVI). переменные катионные группы которых не проходят через сужение 6.1 "8.3 А, и, следовательно, не могут подойти ко второму сужению 5.6'6.3 Л. Поэтому они не учитывались при расчете коэффициента корреляции применительно ко второму сужению и формально должны быть отнесены к тому типу соединений, которые представлены в EUN'-ряде. Активность 7-ми из 8-ми соединений, в общем, соответствует ожидаемой, и только неожиданно низкая активность соединения LI, содержащего AciCH¡N*Hj-rpynny, "ыпа-дает из этого ряда. Введение метильного радикала в эту группу при и-углеродном атоме к азоту существенно улучшает связывание (активность увеличилась от 0.3 до 1.8) в соответствии с общим правилом: увеличение разветвленное • • цепи в ближайшем окружением к атому азота ведет к рост/ п:гтивмости.

У соединений EtjN'-ряда VIII и XXV (Табл.1) блокирующая активность больше в 3 раза при наличии метильного радикала у азота, т.е. у четвертичного соединения по сравнению с нечетвертичным. Как было отмечено выше, такая закономерность характерна для всех соединений EtaN''-ряда. Такую разницу« активности нельзя i. Зъяснигь стерическими ограничениями для связывания, поскольку переменные катионные группы этих молекул свободно проходят через первое сужение (заселенность продуктивных конформаций 100%) (Табл.1). Но, поскольку, соединения EtjN'-ряда могут связываться со вторым нуклеофильным пунктом только "проходящей" переменной катионной группой, значит для продуктивного связьюан^я в области второго нуклео-фильного пункта существенна именно четвертичное гь катионной группы.

Логично было бы ожидать такой же разницы в активности и для соединений MejN'-ряда, однако, соединения XXXVII и XLV содержащие пирролидиновый цикл и отличающиеся на одну метильную группу, имеют одинаковую блокирующую активность (Табл.4). Поскольку обе катионные группы этих соединений способны пройти

через сужение, существует равновероятная возможность связываться как с первым, так и со вторым нуклеофильными пунктами любой из катионных групп. Остается предположить, что такая возможность и реализуется в данном случае, поскольку со вторым нуклеофильным пунктом может связаться одинаковая для обоих соединений триметильная четвертичная группа, что и приведет к выравниванию величин активностей соединений XXXVII и XIV. В этом случае лирролидиновое кольцо данных соединений оказывается на уровне первого нуклеофильного пункта.

Из полученных нами данных следует, что для проявления высокой' блокирую. щей активности важна не только способность достичь участка связывания, но и возможность продуктивно связаться с ним. На продуктивность связывания влияет не только величина гидрофобности алкильных радикалов, но и их комплементарность гидрофобным группам канала. Большей комплементарностью второму нуклеофиль-ному пункту обладают соединения с четвертичной катионной группой.

Модель участка ионного канала. Анализ всего семейства бис-катионных ганглиоблокаторов позволяет сформулировать представления об основных свойствах блокаторов, необходимых для продуктивного связывания в ионном канале нейрональ-ного никотинового холинорецептора. К ним относятся:

1. Свободный доступ молекулы блокатора к участку связывания.

2. Наличие стерических препятствий, удерживающих молекулу блокатора в области связывания.

3. Обе катионные группы должны иметь возможность контакта с нуклеофильными группами в канале.

4. Размеры и положение гидрофобных радикалов должны обеспечивать эффективное взаимодействие с гидрофобными группами в канале.

Из всех возможных вариантов моделей связывающего участка нами выбрана та модель, которая наилучшим образом удовлетворяет перечисленным выше требованиям. По нашему представлению связывающий участок образован двумя сужениями, 6.1*8.3 А, и 5.5*6.3 А, расстояние между которыми составляет порядка 7.5 А (что соответствует расстоянию между двумя положительно заряженными атомами азота при трансконформации пентаметиленовой цепи). В области сужений расположены нуклеофильные группы способные связывать катионную группу блокатора. Кроме того, в области каждого сужения имеются гидрофобные группы, взаимодействующие с гидрофобными радикалами молекулы блокатора (Рис.3,а).

Соединения, связывающиеся по дЬум нуклеофильным пунктам, имеют самую высокую блокирующую активность. Из изученных нами соединений таким типом связывания обладают те соединения с постоянной Е|3М*-группой, переменная катионная

С.11.3 я

Рис. 3. Модели различных вариантов связывания бис-катионных пентаметоние-вых блокаторов с нуклеофильными пунктами в русле ионного канала . нейронального никотинового холинорецептора (а,б,в,г).

группа которых способна пройти через сужение 6.1 *8.3 А и достичь второго нуклео-

фильного пункта. Аналогично происходит связывание соединений с постоянной

триметиламмониевой (Мв3М*-) группой, переменная катионная группа которых не

способна, подобно Е1эЫ*-группе пройти через сужение 6.1*8.3 А (Рис.3,а).

Для тех соединений Ме3М*-ряда, обе кат ионные группы которых способны пройти через первое сужение 6.1*8.3 А, возможно связывание любой из катионных групп как с первым, так и со вторым нуклеофильными пунктами (Рис.3,6).

В ряду соединений с постоянной Ме^'-группой малые варьируемые группы ряда соединений Либо выходят за пределы области связывания, лишая молекулу способности двухцентрового связывания, либо (при другой ориентации молекулы), оказываясь в области первого нуклеофильного пункта, не способны с ним продуктивно связаться в силу отсутствия достаточных невалентных контактов с гидрофобными группами этого пункта (Рис.3,в).

В ряду соединений с постоянной Е1зМ'-группой, соединения с большими варьируемыми группами не проходят череэ.сужение 6.1 *8.3 А, и не в состоянии продуктивно взаимодействовать со вторым нуклеофильным пунктом (Рис.3,г). С другой стороны, соединения с нечетвертичными варьируемыми группами хотя и способны достичь второго нуклеофильного пункта, но на способны с ним продуктивно связаться.

Такая модель позволяет объяснить все рассмотренные особенности в рядах бис-катионных ганглиоблокаторов.

Поскольку при построении модели мы пользовались только структурно-функциональными отношениями в ряду бис-катионных ганглиоблокаторов, модель не содержит сведений о том, какие группы в канале могут формировать описанные выше сужения. Такую информацию можно получить путем сопоставления предложенной нами модели с результатами других исследователей.

В настоящее время установлено, что внутреннюю стенку ионного канала никотинового холинорецептора формируют гомологичные М2 сегменты всех пяти субъединиц рецептора. Относительное.'.расположение аминокислотных остатков позволяет утверждать, что М2 сегмент организован в альфа-спиральную конформацию (3,6 аминокислотных остатка на виток). Остатки, ответственные за связывание блокаторов и ионную проводимость расположены на той стороне спирали, которая обращена внутрь поры канала и образуют в русле канала ряд расположенных друг над другом "колец" (СИапдеих е1 а1., 1995).

Изучение влияния точечных мутаций на проводимость канала (1то1о е1 а1., 1991; \ЛИаггое1 е( а!., 1991,1992) показало, что наиболее узкую часть канала образует треониновое кольцо. Это позволяет предположить, что именно треониновое кольцо образует второе, более узкое, сужение в нашей модели. Следует принять во внимание, что полученное нами расстояние между сужениями близко к расстоянию между соседними витками а-спирали (6.5 А). Следовательно, аминокислотные остатки, обеспечивающие связывание, располагаются на соседних витках. Тогда первое сужение окажется на уровне серинового кольца, которое находится на соседнем витке а-спирали в сторону расширения канала (Рис.4). При атом гидроксильные кислороды серинового и треонинового колец образуют нуклеофильные "браслеты", обеспечивающие связывание катионных групп блокаторов.

Таким образом, результаты данной работы согласуются с современными представлениями о строении ионного канала никотинового холинорецептора. Использование химико-фармакологического подхода Ь сочетании с возможностями теоретического конформационного анализа позволяет определить основные Характеристики связывающих групп, такие как взаимное расположение гидрофобных и нуклеофильных

ы

Рис.4. Топофафическая модель участка связывания бис-аммониевых блокаторов в ионном канале нейронального никотинового холинорецептора.

областей, а так же получить численные характеристики топофафии связывающего участка канала. Эти данные могут бы?ь использованы при дальнейшем изучении молекулярных механизмов блокады.

ВЫВОДЫ.

1. Методом атом-атомных потенциалов проведен теоретический конформаци-онный анализ 56 пеитаметиленбисаммониевых блокаторов ионного канала нейрональйого никотинового холинорецептора. Определены все низкоэнергетические конформации, построена трехмерная модель взаин/^ого расположения активных центров в молекуле блокатора.

2. Рассчитаны относительные заселенности всех низкоэнергетических конфор-меров для каждого соединения, оценена вероятности реализации той или иной взаимной ориентации активных атомов или фупп атомов в пространстве.

3. Получено графическое изображение всех низкоэнергетических конформеров изученных соединений и параметры их проекции на плоскость перпендикулярную оси, связывающей атомы азота. Определены размеры двух сужений ионного канала нейронального никотинового холинорецептора, расстояние между участками связывания бис-катионных блокаторов в русле канала, а также некоторые особенности гидрофобного окружения нуклэофильных пунктов канала.

4. На основании сопоставления данных о конформационных возможностях молекул соединений и их блокирующей активности установлена корреляция, между блокирующей активностью соединений и трехмерной структурой их молекул.

5. Предложена топографическая модель участка ионного канала нейронально-го никотинового холинорецептора, созывающего бис-катионные блокаторы. В данной модели определены основные характеристики связывающих групп, такие как взаимное расположение гидрофобных и нуклеофильных областей, а так же получены численные характеристики связывающего участка канала. Определены размеры узкой части ионного канала.

6. При помощи предложенной модели участка ионного канала нейронального никотинового холинорецептора объяснены изменения блокирующей активности при изменениях в строении переменной катионной группы, а так же некоторые парадоксы блокирующей активности соединений.

7. Выделены элементы структуру блокаторов, необходимые для продуктивного связывания в ионном канале нейронального никотинового холинорецептора. Показано, что геометрические параметры молекулы блокатора не являются единственным фактором, определяющим продуктивное связывание. Установлено, что для продуктивного связывания катионной группы молекулы блокатора по месту первого нуклео-фильного пункта необходимо наличие радикалов, обеспечивающих достаточное гидрофобное взаимодействие, в то время как для связывания со вторым нуклеофильным пунктом существенна четвертичность взаимодействующей с ним катионной группы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Гмиро В.Е., Бровцына Н.Б., Гобунова О.Б., Сердюк С.Е., Лукомская Н.Я. Топография участка связывания бис-катионных ганглиоблокаторов в ионном канале нейронального никотинового холинорецептора. II Доклады Российской Академии наук. 1995, Т.341, N 5, с. 699-705.

2. Горбунова О. Б. Некоторые особенности ионного канала нейронального холинорецептора, установленные на основании изучения связи структуры и активности в ряду ганглиоблокаторов II Вестник Санкт-Петербургского Государственного Университета. 1995, N 2, с.83.

3. Бровцына Н.Б., Гмиро В.Ё., Горбунова О.Б., Сердюк С.Е., Лукомская Н.Я. Особенности строения ионного канала нейронального никотинового холинорецептора, установленные на основании изучения связи структуры и активности в ряду ганглиоблокаторов. II Биологические Мембраны. 1995. т.12, N 6, с.670-783.

4. N.Brovtsyna, O.Gorbounova, V.Gmiro, N.Lukomskaya. The structure of the ion channel of the neuronal nicotinic acetylcholine receptor. II In: 9-th International Symposium on Cholinergic Mechanises From Molecular Biology to Clinical Significance (ISCM). Mainz. Germany. June 7-10, 1995. p. 17.

acetylcholine neuronal nicotinic receptor. II In: First European Congress of Pharmacology (EPHAR). Milan. Italy. June 16-20, 1995. Pharmacological Research. Vol.31, Supplement, p 315.

6. ' ГБ.Бровцына , О.Б.Горбунова, Н.Я.Лукомская. Элементы топографии ионного канала нейронального никотинового холинорецелтора, установленные на основании изучения связи структуры и активности в ряду ганглиоблокаторов. II "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций". Конференция Mono дых физиологов и биохимиков России.. Санкт-Петербург. 19-21 сентября 1995. с.27.

7. N.B.Brovtsyna, D.B.Tichonov, O.Gorbounova, V.E.Gmiro, S.E.Serduk, B.S.Zhorov, L.G.Magazanik, N.Lukomskaya. Architecture of the Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptor Ion Channel in the Region of BIS-cationic Blocking Drugs Binding Area. II J.Memb.Biol. 1996, Vot.152, N1, p. 77-87.

5. N.Brovtsyna, O.Gorbounova, V.Gmiro, N.Lukomskaya. Architecture of the

Подписано в печать 18.09.96. Зак.224. Тираж 100. Печать офсетная. Бумага офсетная. Формат 60x84^/16.

Типография Всероссийского НИИ растениеводства им.Н.И.Вавилова 189623 г. Павловск ул. Горная.