Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Субстратная специфичность и цитотоксический эффект глюкозилтрансферазы LGT1 Legionella pneumophila

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Субстратная специфичность и цитотоксический эффект глюкозилтрансферазы LGT1 Legionella pneumophila"

На правах рукописи

Тартаковская Дина Игоревна

СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ЦИТОТОКСИЧЕСКИИ ЭФФЕКТ ГЛЮКОЗИЛТРАНСФЕРАЗЫ LGT1 LEGIONELLA PNEUMOPHILA

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

15 ИМ

2014

Москва 2014

005547865

005547865

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России)

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

Шемякин Игорь Георгиевич,

доктор биологических наук, профессор,

заместитель директора по научной работе

ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии

Роспотребнадзора

Смолякова Лариса Андреевна,

кандидат биологических наук,

старший преподаватель

кафедры микробиологии и вирусологии

медицинского факультета

Российского университета дружбы народов

Ведущая организация:

НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО "Смоленская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «23» мая 2014 г. в «11» часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 в ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России и на сайте www.gamaleya.org

Автореферат разослан «22» апреля 2014 г.

Ученый секретарь

Белый Юрий Федорович

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Возбудителем тяжелого респираторного заболевания человека - легионеллезной инфекции, является грамотрицательная бактерия рода легионелла (Fields В., Benson R. et al., 2002). К настоящему времени известно 56 видов и 70 серогрупп легионелл, примерно половина из которых патогенна для человека, но именно L. pneumophila серогруппы 1 является инфекционным агентом в 90% случаев заболевания легионеллезом в мире. L. pneumophila является вторым этиологическим агентом острой пневмонии, после Streptococcus pneumonia, и несмотря на удовлетворительные методы лечения легионеллеза, заболевание имеет высокий уровень смертности, который варьирует от 7 до 24% (Allombert J., Fuche F. et al., 2013). Именно этот вид играет ведущую роль в этиологии пневмоний, имеет высокое медико-социальное значение и занимает приоритетное место в исследованиях, направленных на изучение вирулентности легионелл.

Легионеллы - факультативные внутриклеточные паразиты, которые активно размножаются в макрофагах, что приводит к разрушению последних и выходу большого количества бактерий во внеклеточную среду для заражения новых клеток. Многократное повторение цикла заражения клеток хозяина обуславливает накопление возбудителя в высокой концентрации и развитие острого воспалительного процесса. Совокупность факторов патогенности определяет характер взаимодейсгаи бактерии с фагоцитирующей клеткой. Способность L. pneumophila формировать в клетке-мишени «репликативную вакуоль», в которой происходит размножение бактерии, и регулировать клеточные процессы, обусловлены наличием специализированной системы секреции IV типа Dot/Icm (Segal G., Shuman H., 1998; Vogel J. P., Andrews H. L. et al., 1998). Транспортная система L. pneumophila Dot/Icm представляет собой крупный мультибелковый комплекс, который кодируется 24 генами группы dotlicm (Segal G., Russo J. et al., 1999). Патогенная бактерия продуцирует и доставляет в эукариотические клетки посредством данной системы секреции около 300 эффекторных белков (Segal G., 2013; Zhu W., Banga S. et al., 2011). Эти молекулы обладают высокоспециализированной биохимической активностью и воздействуют на

различные клеточные процессы (везикулярный транспорт, метаболизм фосфолипидов, апоптоз, синтез белка и др.), за счет чего бактерия способна как создавать удобную нишу для пролиферации внутри эукариотической клетки, так и убивать ее. Определение функций эффекторов, поиск их мишеней и изучение взаимодействия с мишенью приводит к пониманию их роли в развитии инфекции, вызванной патогеном.

Первый эффекторный белок L. pneumophila, обладающий глюкозилирующей активностью, был выделен из штамма Philadelphia-1 и назван Lgtl (Legionella glucosyltransferase 1) (Belyi Y., Popoff M. et al., 2003). Биоинформатический анализ геномов известных штаммов L. pneumophila, направленный на поиск новых глюкозилирующих эффекторов, показал, что патоген продуцирует и доставляет в клетку хозяина целое семейство гомологичных глюкозилирующих эффекторов, которые образуют три группы: Lgtl, Lgt2 и Lgt3 (Belyi Y., Tabakova I. et al., 2008). Доставку в клетку-мишень всех представителей глюкозилтрансфераз Lgt осуществляет система секреции L. pneumophila Dot/Icm (de Felipe К., Glover R. et al., 2008; Hurtado-Guerrero R., Zusman T. et al., 2010).

Определение кристаллической структуры фермента Lgtl значительно способствовало характеристике механизма действия глюкозилтрансферазы, дало возможность выделить три структурных домена белка и отнести Lgtl к глюкозилтрансферазам типа A (Hurdato-Guerrero R., Zusman Т. et al., 2010; Lu W., Du J. et al., 2010). Как было показано, синтез ферментов клетками L. pneumophila подвержен строгому контролю (Belyi Y., Tabakova I. et al., 2008). Все глюкозилтрансферазы L. pneumophila модифицируют эукариотический фактор элонгации 1А и имеют единый сайт глюкозилирования - остаток серина в положении 53 (Belyi Y., Niggeweg R. et al., 2006). Эукариотический фактор элонгации 1А является одним из самых распространенных белков в клетке и неотъемлемым компонентом аппарата трансляции. Помимо своей основной роли в процессе синтеза белков, фактор элонгации участвует и во многих других жизненно важных клеточных процессах (Mateyak М., Kinzy Т., 2010). Как было показано, в системе in vitro глюкозилтрансферазы Lgt ингибируют трансляцию, а интоксикация

клеток млекопитающих ферментами приводит к цитотоксическому эффекту (Belyi Y., Niggeweg R. et al., 2006). В какой мере эти нарушения связаны с модификацией фактора элонгации 1 А, остается неясным.

Таким образом, предшествующие исследования, проведенные в первую очередь совместно в лаборатории молекулярных основ патогенности ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ и Университете Альберта-Людвига (Фрайбург, Германия), привели к значительному прогрессу в понимании различных аспектов функционирования глюкозилирующих эффекторов легионелл. В то же время работы, посвященные изучению субстратной специфичности Lgt и детальной характеристике фактора элонгации 1А как мишени L. pneumophila не проводились. Это послужило основанием для проведения настоящей диссертационной работы.

Цель диссертационной работы: выявление и характеристика мишени глюкозилтрансферазы Lgtl L. pneumophila, модификация которой приводит к гибели эукариотических клеток.

В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:

• осуществить анализ структуры эукариотического фактора элонгации 1А как субстрата, модифицируемого глюкозилтрансферазой Lgtl L.pneumophila;

• с применением компьютерных алгоритмов провести поиск новых потенциальных мишеней для глюкозилтрансферазы Lgtl L. pneumophila и оценить уровень их субстратной активности в реакции глюкозилирования;

• разработать модель для изучения токсического действия Lgtl с использованием эукариотических микроорганизмов S. cerevisiae;

• установить роль обнаруженных субстратов глюкозилирования в цитотоксическом эффекте Lgtl на дрожжевой модели.

Научная новизна работы. Впервые показана особенность субстратной специфичности глюкозилирующего эффекторного белка L. pneumophila, заключающаяся в модификации фрагмента белка eEFIA, состоящего из 10 аминокислотных остатков - 50-GKGSFKYAWV-59. Впервые обнаружена новая

мишень фермента Lgtl - эукариотический белок Hbsl. Впервые была разработана модельная система дрожжей S. cerevisiae для изучения молекулярных механизмов интоксикации эукариотических клеток глюкозилтрансферазой Lgtl L. pneumophila, а также других ингибиторов белкового синтеза бактериальной природы. С использованием данной модели было установлено, что глюкозилирование именно эукариотического фактора элонгации 1А является основным процессом, приводящим к цитотоксическому эффекту. Впервые показано, что аминокислотные остатки, входящие в распознаваемую Lgtl область фактора элонгации 1А (фенилаланин-54, тирозин-56 и триптофан-58), необходимы как для нормального функционирования эукариотического фактора элонгации, так и для глюкозилирования белковой мишени ферментом легионелл.

Практическое значение работы. Разработана живая система на основе организма S. cerevisiae, позволяющая выявлять новые токсические факторы бактериальной природы, а также моделировать их взаимодействие с соответствующими эукариотическими субстратами in vivo. Разработанная модель может быть использована для поиска новых лечебных (антидотных) препаратов в отношении возбудителей опасных инфекционных заболеваний человека, а также токсинов. Выявление пептида - фрагмента фактора элонгации 1А, - может послужить основой для разработки аналога данного пептида, низкомолекулярного структурного ингибитора реакции глюкозилирования для подавления токсического эффекта Lgt на клетки млекопитающих. По результатам работы подготовлены Методические рекомендации «Определение токсичности факторов патогенности бактерий с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae», утвержденные Советом по внедрению научных достижений в практику ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России 25 января 2013 г., протокол № 23.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Субстратами эффекторной глюкозилтрансферазы Lgtl являются два эукариотических белка - фактор элонгации 1А eEFIA и Hbsl - компоненты аппарата трансляции.

2. Участком узнавания и моноглюкозилирования ферментом Lgtl возбудителя легионеллеза является декапептид с последовательностью GK(G/S)SFKYAWV.

3. Глюкозилирование эукариотического фактора элонгации 1А является основным процессом, приводящим к гибели клеток дрожжей под действием Lgtl. Аминокислотные остатки фактора элонгации 1А F54, Y56 и W58 являются необходимыми не только для узнавания ферментом белковой мишени, но и для выполнения основной функции eEFlA в клетке.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012), на X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012), 8-й международной конференции по легионеллезной инфекции (Мельбурн, Австралия, 2013).

Апробация работы состоялась 12.12.2013 на научной конференции отдела бактериальных инфекций ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 научные статьи в издательствах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и список использованной литературы, содержащий ссылки на 128 источников. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 29 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы микроорганизмов. В работе использовали следующие штаммы: Е. coli DH10B и BL21 (DE3); S. cerevisiae МН272а/а, МН272а и D273-10B.

Плазмидные векторы. В экспрессирующей системе Е. coli использовали следующие векторы: рЕТ28а, pGEX-4T2, pBluescript KS [+], pUC19, pBC KS [+]. В

экспрессирующей системе S. cerevisiae/E. coli использовали следующие векторы: pRS313, pESC-Ura, YEPLacl95, YCPLac444, YEPLac555.

Культивирование микроорганизмов. Используемые в работе штаммы Е. coli выращивали на агаризованной или жидкой среде Luria-Bertani (LB) (Difco, США) в течение ночи при температуре 37°С с добавлением соответствующих антибиотиков и, в случае экспрессии рекомбинантных белков, изопропил-тиогалактопиранозида.

Используемые в работе штаммы S. cerevisiae выращивали на следующих средах: обогащенной глюкозой среде YPD, минимальной среде SD с добавлением глюкозы, минимальной среде SGal с добавлением галактозы. Штаммы S. cerevisiae культивировали на соответствующей агаризованной среде в течение 2-3 дней при температуре 30°С. Культивирование исследуемых штаммов в жидкой среде проводили в течение ночи при температуре 30°С. В зависимости от штамма S, cerevisiae при культивировании добавляли селективный маркер (гистидин, аденин, лейцин, триптофан, урацил или генетицин G418).

Постановка ПЦР. Метод ПЦР использовали для амплификации: гена Igtl, гена eefla, СООН-укороченных вариантов гена eefla, NH2- укороченных вариантов гена eefla, гена tefl с фрагментом в 500 п.н. до и после ОРС гена, В качестве матрицы использовали: соответствующие гибридные плазмиды, выделенные из культуры Е. coli набором GeneJET Plasmid Miniprep Kit, бактериальную геномную ДНК L.pneumophila, выделенную феноловым методом (Sanibrook J., Fritsch E.F. et al., 1989), геномную ДНК S. cerevisiae, выделенную набором Yeast DNA Extraction Kit.

Метод ПЦР использовали для точечного мутагенеза гена Igtl и гена tefl методом «QuikChange mutagenesis» и для создания делеционных конструкций tefl::TRPl, tefl::LEU, hbsl::HIS3. В качестве матрицы использовали соответствующие плазмиды.

Метод ПЦР использовали для проверки делеционных мутантов S. cerevisiae. В качестве матрицы использовали геномную ДНК соответствующих сконструированных штаммов S. cerevisiae.

Молекулярное клонирование фрагментов ДНК. Клонирование ДНК проводили согласно общепринятым методам (Sambrook J., Fritsch E.F. et al., 1989).

Экспрессия, очистка и анализ рекомбинантных белков. Для продукции рекомбинантных белков использовали экспрессирующую систему Е. coli, клетки штамма BL21 (DE3). Хроматографическое выделение рекомбинантных белков осуществляли с использованием сорбента Glutation - Sepharose Fast Flow (при клонировании в плазмиды pGEX) или Nickel - Sepharose Fast Flow (при клонировании в плазмиды рЕТ28) согласно рекомендациям к использованию сефарозы соответствующего типа. Также очистку рекомбинантных белков (на основе плазмиды рЕТ28) проводили методом никель-аффинной хроматографии с использованием His-Trap колонок (GE Healthcare, Германия) на хроматографической системе АКТА Purifier (GE Healthcare, Германия) согласно инструкции производителя. Концентрацию белков определяли методом Брэдфорд с использованием красителя Кумасси бриллиантовый голубой G-250 (Bradford М.М., 1976). Для определения гомогенности выделенных препаратов, а также для определения молекулярной массы белков использовали метод электрофореза в полиакриламидном геле.

Электрофорез в полиакриламидном геле в системе додецилсульфата натрия (SDS). Постановка электрофореза в полиакриламидном геле осуществлялась по методике Лэммли (Laemmli U.K., 1970).

Иммуноблоттинг. Идентификацию рекомбинантных белков проводили при помощи постановки Вестерн-блот анализа методом полусухого переноса.

Получение иммунных специфических сывороток. Очищенный рекомбинантный препарат вводился мышам внутрибрюшинно трехкратно в количестве 10 мкг каждые 5 дней.

Создание делеционных штаммов S. cerevisiae. Для создания делеционного штамма S. cerevisiae с мутациями в генах TEFI и TEF2, кодирующих фактор элонгации 1А, одна аллель каждого гена в геноме диплоидного штамма S. cerevisiae МН272а/а была последовательно инактивирована маркерными генами TRP1 и LEU2, соответственно. Методом тетрадного анализа был получен гаплоидный штамм дрожжей, который имел инактивированные хромосомные гены фактора элонгации

7

1А. В связи с тем, что фактор элонгации 1А является жизненно важным белком, его конститутивный синтез осуществлялся с трансформированной в штамм дрожжей гибридной плазмиды. Делеционный штамм S. cerevisiae с мутацией в гене HBS1 был получен в результате инсерции маркерного гена HIS3 в хромосомную копию гена HBS1 гаплоидного штамма дрожжей МН272а.

Определение токсического эффекта в клетках дрожжей титрацнонным методом. Для исследования токсичности глюкозилтрансферазы Lgtl в различных штаммах S. cerevisiae использовали метод «Drop test», основанный на культивировании штаммов в нескольких разведениях на обычной питательной среде SD и с индуктором синтеза фермента Lgtl - галактозой. Токсичность, синтезированного в клетках дрожжей белка, оценивали по выживаемости штаммов дрожжей.

Выделение белков из клеток S. cerevisiae. Ночную культуру S. cerevisiae осаждали центрифугированием и осадок суспендировали в буфере для экстракции белков (1, 85М NaOH, 7,4% ß-меркаптоэтанол, 1мМ PMSF). Для преципитации белков использовали 10% ТХУ, затем осадок белков промывали ледяным 100% ацетоном. Сухой остаток белков растворяли в стандартном буфере Лэммли и нагревали в течение 5 минут при температуре 95°С. Для аналитического анализа пробы подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле в системе додецилсульфата натрия.

Выделение фактора элонгации 1А из клеток S. cerevisiae. Выделение фактора элонгации 1А из культуры дрожжей основано на взаимодействии данного белка с фактором трансляции eEFIBa. Рекомбинантный белок eEFIBa был получен с использованием экспрессирующей системы Е. coli. Культуру клеток 5. cerevisiae лизировали в лизирующем буфере с использованием гомогенизатора высокого давления «френч-пресс». Очищенный лизат инкубировали с рекомбинантным белком eEFIBa, затем проводили элюцию образованного комплекса eEFlA-eEFIBa на колонке HisTrap HP. Для диссоциации комплекса использовали гуанозиндифосфат (ГДФ), а для элюции нативного дрожжевого фактора элонгации использовали хроматографическую колонку MonoQ.

Определение ГТФазной активности дрожжевого фактора элонгации 1А.

Для доказательства функциональной активности фактора элонгации 1А, выделенного из клеток S. cerevisiae, необходимо было выявить его ГТФазную активность. Реакция проводилась согласно стандартному протоколу, белок eEFIA в количестве 1 мкМ инкубировали в течение 5 минут при температуре 20°С в буфере для ГТФазной реакции, а затем инициировали реакцию добавлением к смеси радиоактивной метки [у-32Р] ГТФ в конечной концентрации 100 мкМ. Пробы смешивали с раствором абсорбирующего угля и центрифугировали в течение 10 минут при 13000 об/мин. Количество гидролизованного фосфата 32Р в супернатанте измерялось с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика.

Трансляция in vitro в системе S. cerevisiae. Изучение in vitro реакции трансляции выполнялось с использованием трансляционного экстракта из клеток S. cerevisiae и мРНК, кодирующей люциферазу светлячка Photinus pyralis (компоненты реакции были любезно предоставлены нам Арлетг Тайс, университет г.Фрайбург, Германия). Трансляционный экстракт инкубировали с очищенным рекомбинантным белком Lgtl (9 нМ, 90 нМ, 280 нМ) и косубстратом фермента УДФ - глюкозой (10 мкМ). Процесс трансляции запускали добавлением к смеси мРНК люциферазы, реакцию проводили в течение 50 минут при 20°С. После окончания реакции, пробы смешивали с люциферазным реагентом и регистрировали люминесценцию на люминометре «Lumat LB 9507».

Реакция глюкозилирования. Реакция глюкозшшрования проводилась согласно стандартному протоколу в 20 мкл смеси, состоящей из 20 мМ Трис-НС1 (pH 7.5), 150 мМ NaCl, 1 мМ МпС12, 2-5 мкг рекомбинантного белка GST-Lgtl, очищенного рекомбинантного субстрата (фактор элонгации 1А, пептиды белка eEFIA, мутантные декапептиды белка eEFIA, белок Hbsl) и 10 мкМ УДФ-[нС]глюкозы (ARC). Реакционные смеси инкубировали в течение 30 минут при температуре 37°С. Реакцию останавливали добавлением стандартного буфера Лэммли и нагреванием в течение 5 минут при температуре 95°С. Пробы подвергали электрофорезу в 12,5% или 15% полиакриламидном геле в системе додецилсульфата натрия. Гели сканировали при помощи сканера для радиоактивных гелей Storni 820

(GE Healthcare, Германия). Для расчета полученных результатов использовали программу Image-Quant 5.2 (GE Healthcare, Германия).

Статистическая обработка результатов. Анализ и статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами, используемыми в биологии (Лакин Г.Ф., 1990). Достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по разностному методу Стьюдента-Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Глюкозилирующая активность Lgtl в отношении нативного белка EF1A S. cerevisiae и его фрагментов

В реакции in vitro глюкозилирования фермент Lgtl модифицирует очищенный рекомбинантный фактор элонгации 1А (Belyi Y., Niggeweg R. et al., 2006). Использование рекомбинантного субстрата в реакции может снижать эффективность фермент-субстратного взаимодействия. В связи с этим был получен нативный эукариотический фактор элонгации 1А, выделенный из клеток дрожжей, который на 80% гомологичен фактору элонгации млекопитающих. Функционально активная конформация дрожжевой белковой молекулы была подтверждена методом определения ГТФазной активности, следовательно, дрожжевой фактор элонгации 1А может быть использован в ферментативной реакции с глюкозилтрансферазой Lgtl.

В проведенных начальных исследованиях было замечено, что интактный, с сохраненной структурой фактор элонгации 1А подвергается глюкозилированию в меньшей степени, чем деградированный, протеолитически расщепленный препарат. С целью исследовать способность Lgtl глюкозилировать не только нативный дрожжевой белок eEFIA, но и его фрагменты, белок eEFIA частично фрагментировали трипсином (рис. 1А) в концентрации 0,05 мкг/мл (рис. 1А, дорожка 2) и 0,5 мкг/мл (рис. 1А, дорожка 3). Цельный фактор элонгации 1А и протеолитически расщепленные варианты использовали в реакции глюкозилирования ферментом Lgtl в присутствии меченой УДФ-[14С] глюкозы (рис. 1Б). Авторадиографический анализ ферментативной реакции показал, что

глюкозилтрансфераза 1^(1 модифицирует нативный дрожжевой фактор элонгации 1А (рис. 1Б, дорожка 1), а также фрагмент данного белка (рис. 1Б, дорожка 3).

1 2 3 4 1 2 3

Рис. I. А. Электрофорез в полиакриламидном геле: еЕР1А необработанный трипсином (дорожка 1), еЕР1А обработанный 0,05 мкг/мл трипсина (дорожка 2), еЕР1А обработанный 0,5 мкг/мл трипсина (дорожка 3), маркер молекулярного веса (дорожка 4). Окраска геля - кумасси бриллиантовый голубой й-250. Б. Ферментативная активность глюкозилтрансферазы в

отношении: дрожжевого фактора элонгации 1А (дорожка I), еЕР1А, обработанного 0,05 мкг/мл трипсина (дорожка 2), еЕР1А, обработанного 0,5 мкг/мл трипсина (дорожка 3). Авторадиографический анализ.

Таким образом, результаты, полученные в ходе данного исследования дали основание предположить, что доменная структура фактора элонгации 1А не играет существенной роли в фермент-субстратном взаимодействии с глюкозилтрансферазой Lgt\.

2. Субстратные свойства укороченных молекул фактора элонгации 1А

На следующем этапе исследования было решено провести анализ субстратных свойств укороченных вариантов белка еЕНА и оценить вклад доменной структуры фактора элонгации 1А в реакцию глюкозилирования.

Методами молекулярного клонирования была создана серия плазмидных конструкций рЕТ28, которая кодировала цельный белок сЕ1-1А и его делетированные фрагменты с молекулярными массами: 38 кД, 29 кД, 19 кД, 10 кД, 7 кД и 5 кД. Изучение выделенных в чистом виде рекомбинантных белков в реакции глюкозилирования ферментом Г^И в присутствии меченой глюкозы,

показало, что все полученные фрагменты фактора элонгации 1А служат субстратом для глюкозилтрансферазы 1^1 (рис. 2).

50кД—

I» —

38кД— 29кД—

19кД— ЮкД — •

7кД_

Рис. 2. Схематическое изображения трехмерной структуры фактора элонгации 1А и его укороченных фрагментов. Красным цветом выделены делетированные участки фактора элонгации 1А. Авторадиографический анализ глюкозилирования фрагментов белка eEFlA ферментом Lgtl в присутствии меченной УДФ-[14С] глюкозы.

На следующем этапе было проверено, может ли пептид с молекулярным весом менее 7 кД служить субстратом для Lgtl. Методами молекулярного клонирования была создана серия плазмидных конструкций pGEX-4T, кодирующих пептиды фактора элонгации 1А с молекулярным весом 7 кД, 5 кД, а также состоящие из 10 аминокислотных остатков и менее. Все пептиды содержат аминокислотный остаток серина, по которому происходит моно-О-глюкозилирование белка eEFlA ферментом Lgtl. Полученные плазмиды были использованы для продукции рекомбинантных пептидов в экспрессионной системе E.coli. Выделенные в чистом виде пептиды белка eEFlA были протестированы в реакции глюкозилирования ферментом Lgtl в присутствии меченой УДФ-[14С] глюкозы (таблица 1).

Аминокислотная последовательность пептидов белка eEFlA Уровень глюкозилирования, %

29-YKCGGIDKRTIEKFEKEAAEMGKGSFKYAWVLDKLKAERERGIT1-73 21 ±6,7

50-GKGSFKYAWVLDKJLKAERERGIT1-73 32±1,1

50-GKGSFKYAWV-59 100

51-KGSFKYAWV-59 55±9,1

50-GKGSFKYAW-58 15±7,3

50-GKGSFKYA-57 1±0,7

50-GKGSFKY-56 1±0,7

50-GKGSFK-55 <1

50-GKGSF-54 <1

51-KGSFKYAW-58 11±4,9

52-GSFK.YAW-58 5±0,5

53-SFKYAW-58 4±3,6

1А

Результаты экспериментов по глюкозилированию коротких пептидов фактора элонгации 1А показали, что уменьшение размера субстрата глюкозилтрансферазы 1^1 до 10 аминокислотных остатков не понижает эффективность реакции. Более того, модификация определенного декапептида 50СКС8ЕКУА\\'У59 происходит с большей эффективностью, чем фрагментов с весом 7 кД (45 а/к) и 5 кД (24 а/к). Дальнейшее уменьшение размера пептида, менее 10 а/к, приводило к снижению способности фрагмента фактора элонгации 1А служить субстратом в реакции (таблица 1). При этом последовательное удаление аминокислотных остатков с СООН - концевой части пептида приводила к резкому снижению или отсутствию способности пептидов служить субстратом для 1^1:1. В свою очередь, деления аминокислотных остатков в №12 - концевой области декапептида фактора меньше влияла на свойства субстрата.

Следующим этапом исследования было сравнение эффективности модификации глюкозилтрансферазой 1^1 следующих субстратов: цельного дрожжевого еЕНА, рекомбинантного в - домена фактора элонгации млекопитающих, фрагмента еЕНА с молекулярным весом 5 кД и декапептида 50-ОКС8ЕКУА\¥У-59. Как показано на рис. 3, фермент 1^1 модифицирует декапептид в 10 раз эффективнее, чем фрагмент весом 5 кД, и в 20 раз эффективнее, чем полноразмерный дрожжевой белок и рекомбинантный О-домен белка еЕЕ1А млекопитающих.

2,5 -

О 5 10 15 20 25 ЗО Время инкубации (ллин)

Рис. 3. Анализ глюкозилирования ферментом различных субстратов - производных фактора элонгации 1А. Реакцию проводили с четырьмя разными субстратами: дрожжевой белок еЕР1А (черный квадрат), й-домен белка еЕР1 А (круг), фрагмент еЕР1А весом 5 кД (ромб), декапептид 50-СКС8РКУА\¥У-59 (квадрат). На графике показано среднее значение, полученное из трех опытов, и стандартное отклонение.

Для выяснения роли конкретной аминокислоты декапептида фактора элонгации 1А в субстрат-ферментном взаимодействии была проведена последовательная точечная замена аминокислот декапептида на аланин — «аланиновый сканирующий мутагенез». Методом точечного мутагенеза была получена серия плазмидных конструкций pGEX-4T, кодирующих декапептиды белка eEFlA с заменами аминокислотных остатков. Полученные плазмиды были использованы для продукции рекомбинантных пептидов в экспрессионной системе E.coli. Выделенные в чистом виде мутантные декапептиды белка eEFlA были протестированы в реакции глюкозилирования ферментом Lgtl в присутствии меченой УДФ-[14С] глюкозы (таблица 2).

Таблица 2. Субстратные свойства мутантных декапептидов белка eEFl А__

Аминокислотная последовательность декапептидов белка eEFl А Уровень глюкозилирования. %

50-GKGSFKYAWV-59 100

50-AKGSFKYAWV-59 84±2,8

50-GAGSFKYAWV-59 19±1,4

50-GKASFAYAWV-59 64±4,2

50-GKGAFKYAWV-59 <1

50-GKGSAKYAWV-59 <1

50-GKGSFKAAWV-59 5±0,7

50-GKGSFKYAWV-59 12±2,8

50-GKGSFKYAAV-59 2±0,5

50-GKGSFKYAWA-59 66±6,4

* - красным цветом выделен замененный аминокислотный остаток.

К полному отсутствию субстратных свойств декапептида приводит не только замена акцепторной аминокислоты серии, но также и следующей за ней аминокислоты фенилаланин в положении 54 (рис. 4). А пептиды фактора элонгации 1А с заменой тирозина в положении 56 и триптофан в положении 58 имели очень низкий процент глюкозилирования ферментом

^ ^ ^ ^ ^ ^<54 ^

"7

Рис. 4. Ферментативная активность глюкозилтрансферазы в отношении декапептида фактора элонгации 1А и его мутантных вариантов. Авторадиографический анализ.

Таким образом, результаты, полученные на данном этапе исследования,

показывают, что достаточным и эффективным субстратом для

глюкозилтрансферазы Lgtl служит определенный декапептид фактора элонгации 1 А, причем для реакции глюкозилирования фактора абсолютно необходимы как сам серин, так и расположенные рядом ароматические аминокислотные остатки (F54, Y56 и W58).

3. Идентификация нового субстрата глюкозилтрансферазы Lgtl -белка Hbsl

Поиск потенциального нового субстрата глюкозилтрансферазы L. pneumophila Lgtl был основан на выявлении эукариотического белка, аминокислотная последовательность которого содержит участок, гомологичный декапептиду фактора элонгации 1А. Методом in silico (http://blast.ncbi.nlm.ntih.gov/Blast.cgi) был обнаружен белок «Супрессор 1 белка теплового шока Hsp70 семейства В» 1 (heat shock protein 70 subfamily В suppressor 1, Hbsl), содержащий гомологичный декапептиду фрагмент (рис. 5).

Рис. 5. Аминокислотное выравнивание последовательностей белков eEFIA (Я. sapiens и S. cerevisiae) и Hbsl (Я. sapiens и 5. cerevisiae), состоящих из 30 аминокислотных остатков и имеющих в своем составе декапептид, гомологичный декапептиду белка eEFIA.

Для изучения белка Hbsl, как возможного субстрата глюкозилтрансферазы Lgtl, кодирующие последовательности гена hbsl S. cerevisiae и его декапептида были амплифицированы и клонированы в плазмиды рЕТ28 и pGEX-4T2, соответственно. Гибридные конструкции были использованы для продукции рекомбинантных белков в экспрессионной системе E.coli. Реакция глюкозилирования ферментом Lgtl очищенного белка Hbsl с молекулярным весом ~ 76 кД и его декапептида (210-GKSSFKFAWI-219), показала, что обе молекулы являются субстратом для глюкозилтрансферазы L. pneumophila (рис. 6).

11 sapiens S. ccrci'isiac

П. nipicns S. cerel'isiiic

(322) . |229|

i;ST-(..KSSFKFA\Vl

t Lgtl tlgtl

Рис. 6. Ферментативная активность глюкозилтрансферазы Lgtl в отношении рекомбинантного

белка Hbsl и его декапептида Авторадиографический анализ.

присутствии меченной УДФ-[ С] глюкозы.

Ранее было установлено, что основной субстрат - фактор элонгации 1А -глюкозилируется менее эффективно, чем его декапептид. Сравнение эффективности глюкозилирования нового субстрата - белка НЬз1, его декапептида и известного ранее субстрата — белка еЕР1А, показало, что декапептид белка НЬз1 глюкозилировался ферментом гораздо эффективнее, чем дрожжевой фактор элонгации 1А, но при этом хуже, чем цельный белок НЬб! (рис. 7).

Л

/Ж'

J**

ХО 15 2 О 25 ЗО Время инкубации {мин)

Рис. 7. Анализ глюкозилирования ферментом Lgtl следующих субстратов: дрожжевого белка eEFIA (черный квадрат), декапептида 210-GKSSFKFAWI-219 белка Hbsl (черный треугольник), рекомбинантного белка Hbsl (треугольник). На графике показано среднее значение, полученное из трех опытов, и стандартное отклонение.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов был найден ранее неизвестный субстрат фермента L. pneumophila Lgtl - белок Hbsl, который в ферментативной реакции in vitro глюкозилируется эффективнее, чем его декапептид и фактор элонгации 1А.

4. Модель S. cerevisiae для изучения токсического эффекта глюкозилтрансферазы Lgtl in vitro

В проведенных ранее исследованиях было показано, что активность Lgtl приводит к подавлению и остановке трансляции, и последующей гибели клеток млекопитающих (Belyi Y., Niggeweg R. et al., 2006; Belyi Y., Tabakova I. et al., 2008). Для изучения причины возникновения данного эффекта под действием глюкозилтрансферазы Lgtl было решено использовать модельную систему эукариот - дрожжи 5. cerevisiae.

Первоначально был проведен специальный эксперимент, направленный на изучение влияние глюкозилтрансферазы Lgtl на уровень белкового синтеза в системе in vitro S. cerevisiae. Анализ трансляции показал, что повышение концентрации глюкозилтрансферазы Lgtl приводит к дозозависимому подавлению трансляции мРНК люциферазы, причем подавление синтеза наблюдается уже при концентрации фермента 9нМ (рис. 8).

Рис. 8. Ингибирующая активность глюкозилтрансферазы Lgtl L. pneumophila в отношении трансляции мРНК люциферазы в трансляционном экстракте дрожжей.

В параллельном эксперименте, с целью наглядного представления зависимости подавления трансляции от эффективности глюкозилирования субстрата, была проведена реакция глюкозилирования дрожжевого фактора элонгации 1А при концентрациях Lgtl, соответствующих реакции трансляции in vitro (рис. 9).

eEF1 А

ojíf

Пр-

Рис. 9. Зависимость количества модифицированного дрожжевого фактора элонгации 1А от концентрации глкжозилтрансферазы Lgtl. Ферментативную реакцию проводили в присутствии меченной УДФ-[14С] глюкозы. Авторадиографический анализ.

Таким образом, была показана способность глкжозилтрансферазы Lgtl, даже в низкой концентрации, подавлять белковый синтез в системе трансляции in vi tro дрожжей.

5. Формы глкжозилтрансферазы Lgtl L. pneumophila с пониженной ферментативной активностью

Для дальнейшего изучения токсического действия фермента Lgtl в системе in vivo и для сравнительной оценки цитотоксического эффекта глкжозилтрансферазы в клетках S. cerevisiae было решено разработать варианты белка Lgtl с пониженной каталитической активностью.

На основании данных о вторичной структуре фермента Lgtl, было предложено произвести последовательную замену следующих аминокислотных остатков: аспартата в положении 246 (D246), который входит в состав энзиматического центра глюкозилирующих токсинов - DXD мотива; триптофана в положении 520 (W520), который входит в состав подвижной СООН - концевой петли белка и участвует в правильном расположении кофактора - УДФ-глюкозы; аспарагина в положении 293 (N293), который принимает участие во взаимодействии с субстратом - белком eEFlA (Hurtado-Guerrero, R., Zusman, Т., 2010; Lu, W., Du J., 2010).

Методом сайт-направленного мутагенеза была получена серия гибридных плазмид, кодирующих мутантные варианты глкжозилтрансферазы Lgtl с одной (D246N), двумя (D246N/W520A) и тремя (D246N/W520A/N293A) заменами аминокислотных остатков. Все конструкции были использованы для продукции рекомбинантных вариантов белка Lgtl в экспрессирующей системе Е. cotí.

Реакция глюкозилирования наиболее эффективного субстрата — декапептид фактора элонгации 1А, мутантными формами фермента показала, что

последовательная замена выбранных аминокислотных остатков приводит к ступенчатому снижению каталитической активности 1^1, вплоть до ее отсутствия у глюкозилтрансферазы с тремя аминокислотными заменами

(В246ЫЛУ520А/Ы293А) (рис. 10).

Рис. 10. Анализ глюкозилирования декапептида 50-GKGSFKYAWV-59 белка eEFIA ферментом Lgtl дикого типа (круг), ферментом Lgtl с одной аминокислотной заменой D246N (ромб), ферментом Lgtl с двумя аминокислотными заменами D246N/W520A (квадрат) и ферментом Lgtl с тремя аминокислотными заменами D246N/W520A/N293A (треугольник). На графике показано среднее значение, полученное из трех опытов, и стандартное отклонение.

Таким образом, были обнаружены аминокислотные остатки в белковой последовательности фермента Lgtl, которые играют важную роль в каталитической активности глюкозилтрансферазы.

6. Модель S. cerevisiae для изучения токсического эффекта глюкозилтрансферазы Lgtl in vivo

Следующим этапом исследования было изучение токсичности глюкозилтрансферазы Lgtl дикого типа и мутантных вариантов на модели S. cerevisiae. С этой целью были сконструированы штаммы дрожжей, способные синтезировать исследуемые формы фермента Lgtl при культивировании S. cerevisiae на питательной среде с индуктором - галактозой. Метод титрационного анализа «Drop test» показал, что продукция токсического фермента Lgtl без мутаций и с одной аминокислотной заменой (D246N) приводит к гибели клеток дрожжей (рис.11). В случае индукции экспрессии глюкозилтрансферазы с двумя

(D246N/W520A) и тремя (D246N/W520A/N293A) аминокислотными заменами, как и в системе in vitro (рис. 10), наблюдается ступенчатое снижение токсического эффекта, связанное со снижением глюкозилирующей активности.

контроль - вектор Lgtl

Igt! - D246N Lgtl - D246N/WS20A Lgtl - D246N/W520A/N293A

Рис. 11. Титрационный анализ токсичности глюкозилтрансферазы Lgtl и ее мутантных вариантов при индукции экспрессии в клетках дрожжей. В опыте использовали следующие штаммы: S. сег + [вектор]; S. сег + [Lgtl]: S. сег + [Lgtl-D246N]; 5. сег + [Lgtl-D246N/W520A]; S. сег + [Lgtl-D246N/W520A/N293A].

Таким образом, установлено, что глюкозилтрансфераза Lgtl останавливает белковый синтез в in vitro системе S. cerevisiae и приводит к гибели клеток дрожжей в системе in vivo.

7. Создание коллекций штаммов S. cerevisiae, содержащих мутантные варианты фактора элонгации 1А

Следующим этапом исследования было изучение роли аминокислотных остатков декапептида фактора элонгации 1А - эффективного субстрата Lgtl - в функционировании белка в клетке. Для этого была создана коллекция штаммов дрожжей, в которых были инактивированы хромосомные копии гена tef, кодирующие фактор элонгации 1А - Tefl и Tef2. Продукция жизненно важного белка - фактора элонгации 1А, а также его мутантных форм с единичными заменами аминокислот декапептида (G50A, S53A, S53E, S53C, S53K, F54A, К55А, Y56A, W58A, V59A) - осуществлялась с гибридной плазмиды. Влияние замен аминокислот в области декапептида (50-GKGSFKYAWV-59) фактора элонгации 1А исследовали по способности роста сконструированных штаммов S. cerevisiae на селективной питательной среде (рис. 12).

- индуктор транскрипции

« • « в • • « .

-

5х разведение культуры

+ индуктор транскрипции

-Э>-

5х разведение культуры

Рис. 12. Анализ выживаемости генетически-сконструированных штаммов S. cerevisiae, синтезирующих фактор элонгации дикого типа или с единичными заменами аминокислотных остатков. Буквенными символами обозначены замены аминокислот, цифрами - положение замененной аминокислоты. Вектор без вставки гена tefl представлен в качестве контроля.

Замена в факторе элонгации 1А аминокислотного остатка серина 53, который является сайтом глюкозилирования, на аланин, цистеин и лизин не приводила к видимым нарушениям роста штаммов дрожжей. Однако замена данного аминокислотного остатка серина на глутаминовую кислоту приводила к продукции такой формы фактора элонгации 1А, которая вызывала гибель клеток S. cerevisiae. Более того, была выявлена критическая роль аминокислот белка Tefl - тирозина, триптофана и фенилаланина в положении 56, 58 и 54, соответственно, для роста клеток соответствующих штаммов S. cerevisiae. Замена фенилаланина (F54) в факторе элонгации 1А приводила к резкому подавлению роста клеток дрожжей, а замена двух других аминокислот (Y56; W58) на аланин приводила к отсутствию роста соответствующих штаммов дрожжей.

Таким образом, была создана модель на основе организма S. cerevisiae для изучения жизненно необходимого белка эукариотической клетки и субстрата глюкозилтрансферазы Lgtl - фактора элонгации 1А. Как оказалось, модифицируемый ферментом Lgtl аминокислотный остаток серина (S53), а также расположенные с ним рядом ароматические аминокислотные остатки (F54, Y56, W58) важны не только для специфического фермент-субстратного узнавания, но и для нормального функционирования фактора элонгации 1А в клетке.

8. Токсический эффект глюкозилтрансферазы Lgtl в генетически-сконструированных штаммах S. cerevisiae

Обе мишени глюкозилтрансферазы L. pneumophila - eEFIA и Hbsl, являются важными компонентами комплекса трансляции эукариотической клетки (Browne

G.J., Proud C.G., 2002; Carr-Schmid A., Pfund С. et al., 2002). Связан ли цитотоксический эффект фермента L. pneumophila с модификацией только фактора элонгации 1А или также с глюкозилированием белка Hbsl неизвестно.

Для исследования причины гибели клеток под действием глюкозилтрансферазы Lgtl в системе in vivo были использованы генетически-сконструированные штаммы S. cerevisiae, способные синтезировать или фактор элонгации 1А дикого типа, или его мутантный вариант с заменой акцепторной аминокислоты серин. Штаммы дрожжей, которые продуцировали только мутантный вариант фактора элонгации 1А (Teil S53A) были устойчивы к воздействию глюкозилтрансферазы (рис. 13).

- индуктор транскрипции + индуктор транскрипции штамм Д te/2 Ate/2 мктоР | •• * ^ ^ • @ 9 9 * Í» .

Tefl ф LSu г # в ;

штамм Л tefl Д tef2 вектор

g, Ö « ® *'•■ 'mm •

TeflS53A LgtI ^ t • * « <' '

5х разведение культуры 5х разведение культуры

Рис. 13. Титрационный анализ токсичности глюкозилтрансферазы 1^1:1 при индукции ее экспрессии в следующих штаммах: Д1еП Д/е/2 8. сег + [ТеП]; Д1еАД 1е]2 5. сег + [ТеП 853А].

Для подтверждения того факта, что изменения в росте исследуемых штаммов обусловлены экспрессией глюкозилтрансферазы, был проведен иммуноблоттинг с экстрактом белков из клеток 5. сегеушае исследуемых штаммов с использованием моноспецифической мышиной сыворотки а-Ь§и (рис. 14). Следовательно, устойчивость клеток дрожжей к токсическому действию глюкозилтрансферазы связана с продукцией неспособного к модификации фактора элонгации 1 А.

индуктор транскрипции + - +

Ate/í Ate/2 Л te/1 Л te/2 Tefl Tefl S53A

Рис. 14. Анализ продукции глюкозилтрансферазы Lgtl в исследуемых штаммах S.cerevisiae.

На следующем этапе исследования были проведены эксперименты, направленные на изучение влияния на клетки дрожжей глюкозилирования другого субстрата фермента 1^1 - белка НЬз1. Для этого был сконструирован штамм 5. сегетшае с инактивированной хромосомной копией гена ЬЬз1. Для более чувствительной оценки фенотипа штаммов дрожжей, неспособных к синтезу белка НЬз1, в них осуществляли индукцию экспрессии глюкозилтрансфераз с пониженной каталитической активностью. Индукция экспрессии гена, кодирующего глюкозилтрансферазу с единичной аминокислотной заменой (Б24бН)

оказывает сильное цитотоксическое действие на клетки 5. сеге\чяше, независимо от наличия белка НЬз1 в этих штаммах. Фермент с пониженной ферментативной активностью (0246МЛ¥520А) позволяет клеткам дрожжей сохранять жизнеспособность, также независимо от продукции белка НЬз1 в штаммах (рис. 15).

- инду«тор транскрипции + индуктор транскрипции

вектор ill1 • т ф * 0. » О Ф Ф • 9 V-

штамм HBS1 t=> Lgtl - D246N/W52GA С> Ц • ф # * • 9 •

Lgtl - D246N г=> Ц d Ф # * <м ♦

вектор с> Ц # А Ф # • О О % • | i

штамм ДШ1 i=5- Iftl - D246N/WS20ft О lü А © Ф Ф ф т Ф

Lgtl - D24SN Щ В т 9 Ш Iii

5х разведение культуры 5х разведение культуры

Рис. 15. Титрационный анализ токсичности глюкозилтрансферазы Lgtl и ее мутантных вариантов при индукции их экспрессии в генетически-сконструированных штаммах S. cerevisiae.

Таким образом, последствия глюкозилирования белка Hbsl ферментом Lgtl для эукариотических клеток дрожжей не выявляется на фенотипическом уровне. Токсический эффект, который приводит к гибели клеток S. cerevisiae, связан с модификацией только фактора элонгации 1А.

ВЫВОДЫ

1. Фрагмент эукариотического фактора элонгации 1А, имеющий последовательность 50GKGSFKYAWV59, является эффективным субстратом для глюкозилтрансферазы Lgtl L. pneumophila.

2. Аминокислотные остатки F54, Y56 и W58 эукариотического фактора элонгации 1А являются необходимыми для узнавания глюкозилтрансферазой Lgtl белковой мишени и для нормального функционирования фактора в эукариотической клетке.

3. Наряду с фактором элонгации eEFIA мишенью Lgtl является белок Hbs 1 - компонент аппарата трансляции эукариотической клетки.

4. Исследование токсического эффекта глюкозилтрансферазы Lgtl на модели дрожжей S. cerevisiae, показало, что глюкозилирование эукариотического фактора элонгации 1А является основным процессом, приводящим к гибели клеток дрожжей под действием Lgtl.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Tartakovskaya D. Elongation factor 1А is the target of growth inhibition in yeast caused by Legionella pneumophila glucosyltransferase Lgtl / D. Tartakovskaya, Y. Belyi,, A. Tais, E. Fitzke, T. Tzivelekidis, T. Jank, S. Rospert, K. Aktories // J. Biol. Chem. - 2012. - Vol. 287, № 31. - P. 26029 - 26037.

2. Vertieva E. Genetic constructions, hyperexpressing recombinant fragments of cytolethal distending toxin of Aggregatibacter actinomycetemcomitans / E. Vertieva, M. Kobozev, D. Tartakovskaya, V. Araslanova, Y. Belyi // World J. Microbiol. Biotechnol.-2011.- Vol.27.-P. 1189-1196.

3. Тартаковская Д.И. Факторы патогенностн бактерий с гликозилирующей активностью / Д.И. Тартаковская, В.А. Арасланова, Ю.Ф. Белый // Вестник РАМН. - 2011. - 10.28 - 31 с.

4. Тартаковская Д.И. Эукариотические мишени цитотоксической глюкозилтрансферазы Legionella pneumophila 11 Тезисы X съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. -Москва, 2012.

5. Тартаковская Д.И. Дрожжевая модель для изучения токсина Lgtl L. pneumophila и механизмов трансляции эукариотической клетки // Тезисы Международной конференции «Биология - наука XXI века». - Москва, 2012.

6. Y.Belyi, D.Tartakovskaya, N.Levanova, T.Jank and K.Aktories Glucosyltransferases Lgt Legionella pneumophila // Тезисы 8-й Международной конференции по легионеллезной инфекции. - Мельбурн, 2013.

Подписано в печать: 01.04.14 Тираж: 100 экз. Заказ № 1101 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект, д. 74 (495)790-47-77; www.reglet.rn

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тартаковская, Дина Игоревна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ имени ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф. ГАМАЛЕИ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

04201457278

ТАРТАКОВСКАЯ Дина Игоревна

СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ЦИТОТОКСИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ

ГЛЮКОЗИЛТРАНСФЕРАЗЫ LGT1 LEGIONELLA PNEUMOPHILA

03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Ю. Ф. Белый

Москва 2014

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................7

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................13

1.1. Эффекторные белки и биология внутриклеточного паразитизма L. pneumophila....................................................................................13

1.1.1. Биология внутриклеточного паразитизма L. pneumophila..............................15

1.1.2. Эффекторные белки L. pneumophila..................................................18

1.2. Использование Saccharomyces cerevisiae как модели для изучения механизмов вирулентности легионелл и других патогенных микроорганизмов...................24

1.3. Гликозилтрансферазы...........................................................................................30

1.4. Lgt - семейство цитотоксичных глюкозилтрансфераз L. pneumophila............33

1.5. Заключение..................................................................................39

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................41

2.1. Материалы..................................................................................41

2.1.1. Реактивы для синтеза и модификации ДНК.......................................42

2.1.2. Общелабораторные реагенты..........................................................42

2.1.3. Питательные среды и вещества....................................................44

2.1.4. Олигонуклеотиды........................................................................45

2.1.5. Радиоактивные материалы................................................................................45

2.1.6. Лабораторное оборудование..........................................................45

2.2. Методы.......................................................................................47

2.2.1. Культивирование микроорганизмов.................................................47

2.2.2. Выделение ДНК...........................................................................47

2.2.3. Постановка ПЦР..........................................................................47

2.2.4. Молекулярное клонирование фрагментов ДНК.....................................53

2.2.5. Трансформация............................................................................57

2.2.6. Создание делеционных штаммов S. cerevisiae.....................................58

2.2.7. Определение токсического фенотипа у дрожжей титрационным методом.............................................................................................62

2.2.8. Экспрессия рекомбинантных белков................................................62

2.2.9. Выделение фактора элонгации 1А из клеток S. cerevisiae.........................64

2.2.10. Экстракция белков из клеток S. cerevisiae.........................................65

2.2.11. Получение поликлональных антител..............................................65

2.2.12. Электрофорез в SDS полиакриламидном геле....................................66

2.2.13. Иммуноблоттинг........................................................................66

2.2.14. In vitro трансляция в системе S. cerevisiae.........................................68

2.2.15. Определение ГТФазной активности.................................................68

2.2.16. Реакция глюкозилирования...........................................................69

2.2.17. Статистическая обработка результатов.............................................71

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...............................................72

3.1. Глюкозилирующая активность Lgtl в отношении нативного и обработанного трипсином белка EF1A S. cerevisiae.........................................................72

3.2. Субстратные свойства укороченных молекул фактора элонгации 1А...........76

3.3. Идентификация нового субстрата фермента Lgtl - белка Hbsl..................85

3.4. Подавление белкового синтеза ферментом Lgtl и его мутантными формами в системе S. cerevisiae............................................................................89

3.5. Создание коллекций штаммов cerevisiae, содержащих мутантные варианты фактора элонгации..............................................................................97

3.6. Токсическое действие 1^1 в генетически-сконструированных штаммах

.......................................................................................100

3.7. Заключение................................................................................106

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...............................................108

ВЫВОДЫ.......................................................................................119

Список использованной литературы......................................................120

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

иптг изопропил-(3-0-тиогалактопиранозид

КД килодальтон

ьв среда Луриа - Бертани

УРБ среда дрожжевой экстракт-пептон-декстроза

ЭБ синтетическая минимальная среда

ЭДТА этилендиамин тетраацетат

С8Т глутатион - Б - трансфераза

сЮТР дезоксинуклеозидтрифосфат

ЗББ додецилсульфат натрия

ТАЕ трис - ацетатный буфер

ТЕМЕБ тетраметилэтилендиамин

ТВБ трис солевой буфер

ПААГ полиакриламидный гель

УДФ уридиндифосфат

ЭР эндоплазматический ретикулум

ГТФ гуанозинтрифосфат

ГДФ гуанозиндифосфат

АДФ аденозиндифосфат

АМФ аденозинмонофосфат

АТФ аденозинтрифосфат

ОРС открытая рамка считывания

НЕРЕЭ К-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы'-2-этансульфоновая кислота

ТЕ трис - буфер

ДТТ дитиотреитол

РМ8Б фенилметилсульфонилфторид

ПЦР полимеразная цепная реакция

г грамм

нг нанограмм

мкл микролитр

мкМ микромоль

мкг микрограмм

V вольт

А ампер

мА миллиампер

ед единица

а/к аминокислота

ОДбоо оптическая плотность, длина волны 600

ТХУ трихлоруксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Инфекционным агентом острой пневмонии человека -легионеллеза, является грамотрицательная бактерия рода легионелла (Fields В., Benson R., et al., 2002). Среди множества видов данного рода бактерии наиболее опасным патогеном для человека является L. pneumophila, которая служит возбудителем болезни легионеров более чем в 90% случаев заболевания (Diederen В., 2008). Именно этот вид занимает приоритетное место в исследованиях, направленных на изучение механизмов вирулентности легионелл.

Развитие острой инфекции определяется способностью L. pneumophila активно размножаться в клетке-мишени за счет формирования так называемой «репликативной вакуоли» и транспортировать бактериальные белки в инфицированную клетку (Isberg R., O'Connor Т., et al., 2009). Патогенная бактерия продуцирует и доставляет посредством системы секреции IV типа в эукариотические ьслетки около 300 эффекторных белков (Segal G., 2013; Zhu W., Banga S., et al., 2011). Эти молекулы обладают высокоспециализированной биохимической активностью и воздействуют на различные клеточные процессы (везикулярный транспорт, метаболизм фосфолипидов, апоптоз, синтез белка, убиквитинирование и др.), за счет чего бактерия способна как создавать удобную нишу для пролиферации внутри эукариотической клетки, так и убивать ее. Определение функций эффекторов, поиск их мишеней и изучения их взаимодействия приводит к пониманию их роли в развитии инфекции, вызванной патогеном.

Первый бактериальный белок, обладающий глюкозилирующей активностью, был выделен из L. pneumophila штамма Philadelphia-1 и назван Lgtl (Legionella glucosyltransferase J_) (Belyi Y., Popoff M., et al., 2003). Биоинформатический анализ геномов известных штаммов L. pneumophila,

направленный на поиск новых глюкозилирующих эффекторов, показал, что патоген продуцирует целую группу гомологичных глюкозилтрансфераз, и они образуют три семейства: Lgtl, Lgt2 и Lgt3 (Belyi Y., Tabakova I., et al., 2008). Доставку в клетку-мишень всех представителей глюкозилтрансфераз Lgt осуществляет система секреции IV типа легионелл Dot/Icm (de Felipe К., Glover R., et al., 2008; Hurtado-Guerrero R., Zusman Т., et al., 2010).

Как было показано, синтез ферментов клетками L. pneumophila подвержен строгому контролю. Глюкозилтрансферазы Lgtl и Lgt2 вырабатываются бактериями в поздней стационарной фазе их роста в отличие от Lgt3, который определяется в культурах на ранней стадии роста и на ранних этапах взаимодействия с эукариотическими клетками (Belyi Y., Tabakova I., et al., 2008). Разрешение кристаллической структуры фермента Lgtl значительно способствовало характеристике механизма действия глюкозилтрансферазы, дало возможность выделить три структурных домена белка и отнести Lgtl к глюкозилтрансферазам типа A (Hurdato-Guerrero R., Zusman Т., et al., 2010; Lu W., Du J., et al., 2010).

Все глюкозилтрансферазы L. pneumophila модифицируют эукариотический фактор элонгации 1А и имеют единый сайт глюкозилирования - остаток серина в положении 53 (Belyi Y., Niggeweg R., et al., 2006). Эукариотический фактор элонгации 1А является одним из самых распространенных белков в клетке и неотъемлемым компонентом аппарата трансляции. Помимо своей основной роли в процессе синтеза белков, фактор элонгации участвует и во многих других жизненно важных клеточных процессах (Mateyak М., Kinzy Т., 2010). В системе in vitro добавление глюкозилтрансфераз Lgt приводит к остановке трансляции, а интоксикация клеток млекопитающих ферментами приводит к цитотоксическому эффекту (Belyi Y., Niggeweg R., et al., 2006). В какой мере эти нарушения связаны с модификацией фактора элонгации 1 А, остается неясным.

Таким образом, предшествующие исследования, проведенные в первую очередь совместно в лаборатории молекулярных основ патогенности ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ и Университете Альберта-Людвига (Фрайбург, Германия), привели к значительному прогрессу в понимании различных аспектов функционирования глюкозилирующих эффекторов легионелл. В то же время работы, посвященные изучению субстратной специфичности Lgt и детальной характеристике фактора элонгации 1А как мишени L. pneumophila не проводились. Это послужило основанием для проведения настоящей диссертационной работы.

Цели диссертационной работы. Целью работы являлись выявление и характеристика мишени глюкозилтрансферазы Lgtl L. pneumophila, модификация которой приводит к гибели эукариотических клеток.

В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:

• Осуществить анализ структуры эукариотического фактора элонгации 1А как субстрата, модифицируемого глюкозилтрансферазой Lgtl L. pneumophila;

• С применением компьютерных алгоритмов провести поиск новых потенциальных мишеней для глюкозилтрансферазы Lgtl L. pneumophila и оценить уровень их субстратной активности в реакции глюкозилирования;

• Разработать модель для изучения токсического действия Lgtl с использованием эукариотических микроорганизмов S. cerevisiae;

• Установить роль обнаруженных субстратов глюкозилирования в цитотоксическом эффекте Lgtl на дрожжевой модели.

Научная новизна работы. Впервые показана особенность субстратной специфичности глюкозилирующего эффекторного белка L. pneumophila, заключающаяся в модификации фрагмента белка eEFIA, состоящего из 10 аминокислотных остатков - 50-GKGSFKYAWV-59. Впервые обнаружена новая мишень фермента Lgtl - эукариотический белок Hbsl. Впервые была разработана модельная система дрожжей S. cerevisiae для изучения молекулярных механизмов интоксикации эукариотических клеток глюкозилтрансферазой Lgtl L. pneumophila, а также других ингибиторов белкового синтеза бактериальной природы. С использованием данной модели было установлено, что глюкозилирование именно эукариотического фактора элонгации 1А является основным процессом, приводящим к цитотоксическому эффекту. Впервые показано, что аминокислотные остатки, входящие в распознаваемую Lgtl область фактора элонгации 1А (фенилаланин-54, тирозин-56 и триптофан-58), необходимы как для нормального функционирования эукариотического фактора элонгации, так и для глюкозилирования белковой мишени ферментом легионелл.

Практическое значение работы. Разработана живая система на основе организма S. cerevisiae, позволяющая выявлять новые токсические факторы бактериальной природы, а также моделировать их взаимодействие с соответствующими эукариотическими субстратами in vivo. Разработанная модель может быть использована для поиска новых лечебных (антидотных) препаратов в отношении возбудителей опасных инфекционных заболеваний человека, а также токсинов. Выявление пептида - фрагмента фактора элонгации 1А, - может послужить основой для разработки низкомолекулярного структурного ингибитора реакции глюкозилирования для подавления токсического эффекта Lgt на клетки млекопитающих. По результатам работы подготовлены Методические рекомендации «Определение токсичности факторов патогенности бактерий с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae», утвержденные Советом по

внедрению научных достижений в практику ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России 25 января 2013 г., протокол № 23.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Субстратами эффекторной глюкозилтрансферазы Lgtl являются два эукариотических белка-компоненты аппарата трансляции - фактор элонгации eEFlA и Hbsl.

2. Участком узнавания и моноглюкозилирования ферментом Lgtl возбудителя легионеллеза является декапептид с последовательностью GK(G/S)SFKYAWV.

3. Глюкозилирование эукариотического фактора элонгации 1А является основным процессом, приводящим к гибели эукариотических клеток под действием Lgtl. Аминокислотные остатки фактора элонгации 1А F54, Y56 и W58 являются необходимыми не только для узнавания ферментом белковой мишени, но и для выполнения основной функции eEFl А в клетке.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012), на X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012), 8-й международной конференции по легионеллезной инфекции (Мельбурн, Австралия, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 научные статьи в издательствах, рекомендованных ВАК: Tartakovskaya D., Belyi Y., Tais A., Fitzke E.,Tzivelekidis Т., Jank Т., Rospert S., Aktories K. Elongation factor 1A is the target of growth inhibition in yeast caused by Legionella pneumophila glucosyltransferase Lgtl. J. Biol. Chem. - 2012. - Vol. 287, № 31. - P. 26029 - 26037; Vertieva E., Kobozev M., Tartakovskaya D., Araslanova V., Belyi Y. Genetic constructions, hyperexpressing

recombinant fragments of cytolethal distending toxin of Aggregatibacter actinomycetemcomitans. World J. Microbiol. Biotechnol. - 2011. - Vol. 27. - P. 11891196; Тартаковская Д.И., Арасланова В.А., Белый Ю.Ф. Факторы патогенности бактерий с гликозилирующей активностью. Вестник РАМН. - 2011. - 10. 28 - 31 е., а также опубликованы тезисы: «Эукариотические мишени цитотоксической глюкозилтрансферазы Legionella pneumophila», «Дрожжевая модель для изучения токсина Lgtl L. pneumophila и механизмов трансляции эукариотической клетки», "Glucosyltransferases Lgt Legionella pneumophila'''' (Y.Belyi, D.Tartakovskaya, N.Levanova, T.Jank and K.Aktories. 8-я международная конференция по легионеллезной инфекции, Мельбурн, Австралия, 2013).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и список использованной литературы, содержащий ссылки на 128 источников. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 29 рисунками.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эффекторные белки и биология внутриклеточного паразитизма

L. pneumophila

Факторы вирулентности являются неотъемлемой характеристикой патогенных микробов и определяют их способность вызывать инфекционное заболевание. К факторам, определяющим вирулентность бактерии можно отнести: адгезию, колонизацию, инвазивность, подавление иммунного ответа, токсины и эффекторы (Casadevall A., Pirofski L., 2009). Микробные токсины и эффекторы являются основными факторами вирулентности различных патогенных бактерий. Эффекторы направленно проникают в эукариотические клетки за счет специальных мультибелковых комплексов - систем секреции (Boyer L., Paquette N., et al., 2012). Эффекторные белки способны проявлять свою функциональную активность совместно с множеством других эффекторных белков, которые были доставлены в клетку посредством одной и той же системы секреции. Функциональная активность многих эффекторов зачастую малозаметна и направлена в большей степени на регуляцию клеточных функций, чем на необратимое нарушение клеточного гомеостаза, приводящее к гибели клетки (Galan J., 2009).

Интересной особенностью некоторых эффекторных белков является их способность мимикрировать эукариотические молекулы, используя каталитическую активность и механизм действия белков клетки-хозяина, обеспечивая выполнение своих функций в клетке-мишени (Stebbins С., Galan J., 2001). Помимо этого, многие эффекторы способны проявлять биохимическую активность за счет ковалентной модификации своих клеточных мишеней. Они проявляют ферментативную активность к различным молекулам и отделам клетки-хозяина. К их мишеням относятся: цитоплазматические и ядерные белки,

митохондрии, эндоплазматический ретикулум (ЭР), цитоскелет, плазматическая мембрана и др. Многие эффекторные молекулы способны влиять на сигнальные пути клетки хозяина, ответственные за внутриклеточную репликацию, организацию нуклеосом, межклеточную коммуникацию и иммунный ответ (Geissler В., 2012).

Продукция бактериальных белков строго координируется патогеном и зависит от этапа инфекции. После проникновения эффекторов в эукариотическую клетку, они могут быть доставлены к своим мишеням за счет сигнальных последовательностей или специальных модификаций, которым подвергается бактериальный фактор после попадания в цитозоль клетки-мишени (Rabin J., Veesenmeyer К., et al., 2006; Schlumberger M., Käppeli R., et al., 2007; Zhang Y., Barbieri J., 2005).

Подавляющее большинство известных и охарактеризованных эффекторных молекул транспортируются ми