Генная диагностика легионеллеза с использованием полимеразной цепной реакции

Портенко, Светлана Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генная диагностика легионеллеза с использованием полимеразной цепной реакции
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генная диагностика легионеллеза с использованием полимеразной цепной реакции"

ПОРТЕНКО Светлана Анагольевыа

ГЕННАЯ ДИАГНОСТИКА ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕННОЙ РЕАКЦИИ

03.00.07 - микробиология 03.00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2009

Работа выполнена в ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор кандидат биологических наук

Куличспко Александр Николаевич Осина Наталия Александровна

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, старший научный сотрудник Доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Кацы Елена Ильинична

Ерошенко Галина Александровна

Ведущая организация: ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

ционного совета Д 208.078.01 по защите докторских н кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».

Автореферат разослан «Л!» -^¿^/^2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологический наук,

Защита состоится«л^» ОШ^Л^Ы- 2009 г. в

С-С

часов на заседании диссерта-

старший научный сотрудник

Слудскнй А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

2006]. В Российской Федерации в июле-августе 2007 г. в г. Верхняя Пышма (Свердловская область) была зарегистрирована вспышка легионеллезной инфекции, во время которой количество госпитализированных составило 202 человека, из них у 74 диагноз «легионеллез» был лабораторно подтвержден, в том числе у 4 пациентов посмертно [Беликов Е.С. с соавт., 2008; Онищенко Г.Г. с соавт., 2008].

Подавляющее большинство случаев легионеллеза (70-90 %) связано с видом Legionella pneumophila, включающим 16 серогрупп. Представители всех серогрупп этого вида являются патогенными для человека, однако более 90 % случаев легионеллезной пневмонии обусловлено L. pneumophila 1 серогруппы [Marston В.J., et al., 1994; Fields В.S. et al., 2002].

Причиной заболевания легионеллезом является контакт человека с искусственными водными системами (системы горячего и холодного водоснабжения, централизованные системы кондиционирования воздуха с водным охлаждением, градирни, вихревые бассейны, увлажнители воздуха, фонтаны и т.д.), контаминированными возбудителем инфекции. Это обусловлено тем, что в обозначенных выше объектах создаются благоприятные условия для размножения легионелл, что приводит к образованию биопленок и накоплению в них возбудителя в высокой концентрации [Тартаковский И.С. с соавт., 2005; Карпова Т.Н. с соавт., 2008; Atlas R:M., 1999; Zanetti F. et al., 2000]. В естественных местах обитания легионелл (пресноводные водоемы) их количество незначительно и они не представляют опасности для человека.

Основным направлением профилактики легионеллеза является организация регулярного микробиологического мониторинга потенциально опасных для человека водных объектов, а также оборудования и медицинского инструментария [Онищенко Г.Г. с соавт., 2008]. Не менее важно своевременное выявление возбудителя легионеллеза в биологическом материале от людей [Тартаковский И.С., Синопалышков А.И., 2001; Темежникова Н.Д., 2008].

2007]. Серологические тесты являются ретроспективными и неэффективны при обследовании людей со сниженным иммунитетом [Franzin L., Scramuzza F., 1995; Yzerman E.P. et al, 2006]. В связи с этим очевидна необходимость разработки быст-

рых и эффективных способов детекции возбудителя легионеллеза всех серогрупп. Наиболее перспективным решением данной проблемы является использование для индикации и идентификации легионелл молекулярно-генетических подходов, в первую очередь - полимеразной цепной реакции (ПЦР).

На сегодняшний день эффективность применения ПЦР для обнаружения ДНК легионелл в биологическом материале и объектах окружающей среды подтверждена в ряде работ отечественных и зарубежных авторов [Федоров Ю.Н. с соавт., 2003; Аляп-кина Ю.С. с соавт., 2007; Koide М., et al., 1993; Cloud J. L. et al, 2000; Wcllinghausen N. et al., 2001; Wilson D.A., et al, 2003; Yafiez M.A.ef al., 2005]. В большинстве публикаций исследования были направлены на разработку вариантов ПЦР для выявления ДНК Legionella spp. и/или L. pneumophila. Данные о регистрации ПЦР-тест-систем для детекции возбудителя легионеллеза в Российской Федерации отсутствуют.

При разработке препаратов для генной диагностики легионеллеза необходимо предусмотреть возможность, во-первых, количественной оценки содержания L. pneumophila в пробах из объектов окружающей среды, поскольку уровень контаминации возбудителем легионеллеза искусственных водных систем является эпидемически значимым показателем; во-вторых, исключения ложноотрицательных результатов, возникающих из-за наличия в пробах веществ, ингибирующих реакцию амплификации; в-третьих, осуществления детекции возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды и идентификации штаммов L. pneumophila с использованием отдельных тест-систем; в-четвертых, подтверждения первичного положительного ответа, полученного на этапе индикации патогена.

Вышеизложенное свидетельствует о необходимости разработки тест-систем для качественного и количественного выявления ДНК легионелл в исследуемом материале на основе технологий ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, а также методологии определения ингибирова-ния реакции за счет введения в исследуемые пробы внутреннего контрольного образца. Использование в качестве ДНК-мишеней для создания генодиагностических препаратов альтернативных видоспецифичных генов L. pneumophila в полной мере обеспечивает получение первичного ответа и его подтверждение. По данным А.А. Чура-кова с соавт. [2007] и J.H. Moor et al. [1999], применение такого подхода способствует повышению точности ПЦР-анализа.

Цель работы - конструирование тест-систем для выявления ДНК возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды, и для идентификации штаммов L.pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим и гибриди-зационно-флуоресцентным учетом результатов, разработка алгоритма генной диагностики легионеллеза.

Основные задачи исследования:

1. Подготовить и охарактеризовать целевую коллекцию штаммов L. pneumophila и гетеролошчных микроорганизмов для оценки специфической активности (чувствительности) и специфичности препаратов для генной диагностики легионеллеза.

2. Провести анализ нуклеотидных последовательностей генома легионелл на наличие видоспецифичных и консервативных для L. pneumophila локусов.

3. Подобрать к выбранным фрагментам ДНК олигонуклеотидные праймеры и зонды, оптимизировать условия проведения ПЦР с электрофорстическим и гибриди-зационно-флуоресцентным учетом результатов для качественного и количественного анализа.

4. Сконструировать тест-системы для выявления ДИК возбудителя легионеллеза в биологическом материале, объектах окружающей среды и для идентификации штаммов L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, охарактеризовать их диагностическую ценность.

6. Разработать алгоритм генной диагностики легионеллеза с использованием ПЦР-анализа, включающий два этапа: 1. выявление ДНК возбудителя в биологическом материале и объектах окружающей среды; 2. идентификация штаммов L. pneumophila и подтверждение первичного положительного ответа о наличии в пробе патогена.

Научная новизна работы

Проведен анализ нуклеотидных последовательностей генома L .pneumophila, позволивший определить мономорфные видоспецифичные участки, перспективные для создания генодиагностических препаратов.

Получены новые данные о нуклеотидной последовательности генов «системы жизнеобеспечения»: dnaX, ftsZ, mompS, trpS у штаммов возбудителя легионеллеза, выделенных на территории Российской Федерации.

Впервые для выявления и характеристики штаммов L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим учетом результатов в качестве ДНК-мишеней использованы мономорфные участки генов ftsZ и mompS.

Впервые на основе генов mip,ftsZ, trpS сконструированы тест-системы для детекции возбудителя лег ионеллеза и идентификации штаммов L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.

Впервые разработан алгоритм двухэтапной генной диагностики легионеллеза, предусматривающий поэтапное выполнение анализа с подтверждением первичного положительного ответа о наличии в пробе ДНК L. pneumophila.

Практическая значимость работы

В результате проведенных исследований созданы экспериментальные серии тест-систем для выявления ДНК возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с электрофоретическим и габридиза-ционно-флуоресцентным учетом результатов («Ген Legionella pneumophila - РЭФ» и «АмплиСенс Legionella pneumophila -FL», соответственно) и гест-сисгем для иденти-

фикации штаммов L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов («Ген Legionella pneumophila-РЭФ-идентификация» и «Ген ¡Legionella ряенторШа-РГФ-идентификация», соответственно). На тест-системы разработаны проекты нормативно-технической документации (ТУ, инструкция по применению).

В ходе межлабораторных испытаний «Ген Legionella pneumophila - РЭФ - тест-системы для выявления ДНК возбудителя лсгионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с электрофоретическим учетом результатов» подтверждена диагностическая ценность препарата: чувствительность - 1 * 103 м.к./мл, специфичность при исследовании чистых культур и секционного материала -100 % (акты внедрения, утвержденные директором ФГУЗ Ставропольский НИПЧИ (от 24.10.08 г.) и генеральным директором ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (от 13.11.08 г.)).

Разработаны методические указания МУК 4.2.22.17-07 «Методические указания по выявлению бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды» (утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 30 мая 2007 г.).

Материалы диссертационной работы представлены в практическом руководстве «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней» (глава «Легионеллез») (утверждено Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12 декабря 2007 г.).

Материалы диссертации используются при чтении лекций и проведении практических занятий на курсах повышения квалификации «ПЦР в диагностике инфекционных болезней и индикации патогенных микроорганизмов» в соответствии с программой (утверждена Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 08. 10. 2003 г.).

Основные положения, выносимые на защиту

1. На основе нуклеотидных последовательностей мономорфных участков гена mip (отвечающего за синтез полипептида 25 кДа, необходимого для персистенции возбудителя в макрофагах), генов «системы жизнеобеспечения» ßsZ и mompS (кодирующих синтез тубулиноподобного белка и белка внешней мембраны, соответственно), определенных в результате анализа генома возбудителя легионеллеза, возможно создание специфичных олигонуклеотидных праймеров и зондов для разработки тест-систем, направленных на индикацию и идентификацию L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.

2. Разработанные тест-системы для выявления ДНК возбудителя легионеллеза методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов (ДНК-мишень - ген mip) и электрофоретической детекцией (ДНК-мишень - ген ftsZ) обеспечивают индикацию L. pneumophila в материале от людей, больных пневмониями неясной этиологии, а также в пробах из объектов окружающей среды в концентрации не ниже 1><103 м.к./мл, со 100 % специфичностью.

3. Созданные тест-системы для идентификации штаммов L. pneumophila методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов (ДНК-мишень - ген ftsZ) и элсктрофоретической детекцией (ДНК-мишень - ген mompS), позволяют идентифицировать штаммы L. pneumophila и подтвердить первичный положительный ответ (наличие в исследуемой пробе ДНК возбудителя легионелллеза), полученный на этапе индикации. Специфическая активность - 1x103 м.к./мл, специфичность-100%.

4. Сконструированные тест-системы обеспечивают возможность проведения генной диагностики легионеллеза в учреждениях Роспотребнадзора в два этапа: 1. выявление ДНК возбудителя в биологическом материале и объектах окружающей среды («Ген Legionella pneumophila - РЭФ» и «АмплиСенс® Legionella pneumophila-FL»); 2. идентификация штаммов L. pneumophila и подтверждение первичного положительного ответа о наличии в пробе патогена («Ген Legionella pneumophila -РЭФ-идентификация» и «Ген Legionella /шеытор/н/а-РГФ-идентнфикация»).

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Новосибирск, 2005); VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий госу-дарств-учаетников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации» (Москва, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участников СНГ» (Саратов, 2007); Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (Минск, 2007); 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика» (Москва, 2007).

Публикации

Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях, из них 1 - в рекомендованном ВАК издании.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 62 отечественных и 201 зарубежный источников. Общий объем работы составляет 161 страницы компьютерного текста, иллюстрированного 15 таблицами и 10 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы

В качестве исследуемого материала использовали: бактериальные взвеси чистых культур микроорганизмов, биологический материал (мокроту, броихоальвеоляр-ный лаваж (БАЛ), плевральную жидкость, мазки из ротоглотки, кровь, мочу, секционный материал (пораженные участки легочной ткани), органы лабораторных животных); пробы из объектов окружающей среды (воду - питьевую из систем водоснабжения, открытых водоемов, смывы с оборудования водоснабжения и кондиционирования).

Работа выполнена на 104 коллекционных штаммах микроорганизмов, в том числе: 22 - Legionella pneumophila, 3 - Legionella spp., 8 - Staphylococcus spp., 7 -Escherichia coli, 6 - Shigella spp., 5 - Salmonella spp., no 4 - Bacillus spp., Proteus spp., Pseudomonas spp., Streptococcus spp., no 3 - Aeromonas spp., Alcaligenes faecalis, Comamonas spp., Corynebacterium diphteriae, Listeria monocytogenes, Plesiomonas shi-gelloides, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, no 2 - Enterococ-cus spp., по 1 - Citrobacter freundii, Erysepclotrix rhusiopthiae, Francisella tularensis 15 НИИЭГ, Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus casei, Sarcina aurantica, Yersinia pestis EV НИИЭГ, Yersinia pseudotuberculosis. Дополнительно для определения специфичности генодиагностических препаратов было исследовано 49 штаммов гетерологичных микроорганизмов, выделенных из клинического материала в ходе выполнения работы.

Методы

Микробиологические методы

Для культивирования микроорганизмов применяли общепринятые среды и методы. Работу с культурами возбудителя легионеялеза проводили в соответствии с Методическими рекомендациями «Клиника, лечение и диагностика легионеллеза», 1987, Методическими рекомендациями по лабораторной диагностике легионеллеза (болезни легионеров), 1987, МУК 4.2.22-17-01 «Методические указания по выявлению бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды».

Работу с пробами биологического материала и выделенными в процессе работы культурами микроорганизмов проводили в соответствии с СГ1 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», исследования с помощью иммунохроматографиче-ского (ИХА) и иммуноферментного (ИФА) анализов и в реакции агломерации (РАО) осуществляли с помощью коммерческих препаратов, в соответствии с инструкциями изготовителей.

Генетические методы

Анализ геномов легионелл проводили с использованием нуклеотидных последовательностей генетической базы данных NCBI GenBank, программы Mega З.1., алгоритмов AlignX - для выравнивания последовательностей и UPGMA - для кластер-

ного анализа. Подбор праймеров осуществляли с помощью программы Primer Express, алгоритма BLAST. Подбор зондов формата TaqMan проводили в онлайн-режиме на интернет-сайте www.genscript.com.

Выделение ДНК осуществляли с применением метода нуклеосорбции на сили-кагеле [Boom R. et al„ 1990].

Полимеразную цепную реакцию проводили в микропробирках объемом 0,6 и 0,2 мл на программируемых термоциклерах Терцик MC 2 («ДНК-технология», Россия), БИС-110 ("Вектор", Россия), PalmCycler, RotorGene 3000 и 6000 (Corbett Research, Австралия).

Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 2 - 2,5 %-ном агароз-ном геле, согласно рекомендациям, изложенным в руководствах JI.A. Остермана [1981] и Т. Маниатиса с соавт. [1984]. Для документирования полученных результатов гелевые пластинки сканировали с помощью системы "GelDoc 2000" (BioRad, США).

Клонирование ПЦР - продукта проводили с использованием набора «pGEM-T Vector Systems» (Promega, США). Очистку полученной плазмидной ДНК осуществляли с помощью набора DNA Purification System (Promega, США). Работу проводили в соответствии с инструкциями к препаратам. Определение количества плазмидной ДНК проводили спектрофотометрически, определяя поглощение раствора в областях с длинами волн 260 и 280 нм.

Результаты исследований

На первом этапе конструирования тест-систем для выявления и идентификации возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды нами была проведена работа по подготовки целевой коллекции специфичных и гете-рологичных микроорганизмов для определения специфической активности и специфичности ПЦР.

С использованием ресурсов ГКПБ «Микроб» РосНИПЧИ «Микроб» отобраны и охарактеризованы 79 штаммов гетерологичных микроорганизмов, относящихся к 27 родам. Однако в подготовленной выборке культур были представлены не все виды микроорганизмов, которые могут обусловливать развитие пневмоний и других инфекционных заболеваний дыхательных путей. Поэтому нами дополнительно проведено исследование 72 проб мокроты и мазков из зева от людей с различными заболеваниями дыхательного тракта (пневмония, бронхит, респираторная инфекция, ларингит, фарингит и др.) в период 2007-2008 гг. на территории г. Саратова. Из всех проб выделено и идентифицировано 49 культур микроорганизмов, из них 7 - Enterococcus spp., 2 - Escherichia coli, 1 - Haemophilus aprophilus, 2 - Haemophilus influenzae, 1 -Haemophilus parainfluenzae, 2 - Klebsiella oxytoca, 3 - Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, 1 - Moraxella catarrhalis, 2 - Pseudomonas aeruginosae, 1 - Pseudomonas maltophilia, 5 - Streptococcus spp. (а-гемолитический), 3 - Streptococcus pyogenes, 3 -Streptococcus pneumoniae, 1 - Streptococcus salivarius, 5 - Staphylococcus aureus, 5 -Staphylococcus epidermidis, a также 5 культур дрожжеподобных грибов рода Candida.

В качестве специфичных микроорганизмов из ГКПБ «Микроб» РосНИПЧИ «Микроб» выбраны 19 культур L. pneumophila (1,2,3,4 серогруппы), по 1 - L. dumoffl и L. micdadei. С целью расширения перечня штаммов возбудителя легионеллеза различных серогрупп при содействии сотрудников лаборатории легионеллеза ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (г. Москва), были получены препараты ДНК L. pneumophila 5, 6, 13 серогрупп и ДНК L. longbeachae.

С целью подбора праймеров и зондов для специфической индикации и идентификации возбудителя легионеллеза методом ПЦР с электрофоретической и гибриди-зационно-флуоресцентной детекцией результатов нами проведен анализ 712 нуклео-тидных последовательностей L. pneumophila и других видов легионелл, представленных в базе данных NCBI GenBank.

Для исследования были выбраны фрагменты генов, которые, по литературным источникам, нашли применение в качестве ДНК-мишеней при выявлении легионелл методом ПЦР:765 рДНК, 23S-5S рДНК, mip, а также 10 генов, продукты которых участвуют в процессе формирования поверхностных структур, метаболизме белков и нуклеиновых кислот легионелл, и в выполнении регуляторных функций: fliC, mompS, ftsZ, dotA, dnaX, trpS, rpoB, rnp, proA, gspA. Для каждого локуса определяли количество полиморфных нуклеотидов и процент гетерогенности у штаммов L. pneumophila, чем обусловлена вариабельность, гомология участка у штаммов L. pneumophila и других видов легионелл, гомология фрагмента с ДНК гетерологичных микроорганизмов, а также ДНК человека и белой мыши. В качестве нуклеотидной последовательности сравнения использовали полный сиквенс генома L. pneumophila str. Corby (GenBank № CP 000675).

В результате анализа установлено, что вариабельность фрагментов генов 16 S рДНК (1434 п.н.) и 23S-5S рДНК (336 п.н.) у штаммов L. pneumophila составила 2,1 % и 7,4 %, соответственно, между L. pneumophila и представителями других видами легионелл - от 2 до 6 % и от 14-20 %, соответственно. У всех видов легионелл наибольшее число полиморфных нуклеотидов наблюдалось в области между генами 23S и 5S рДНК размером 102 п.н.

Для фрагмента гена mip размером 496 п.н. гетерогенность у штаммов L. pneumophila представлена 40 нуклеотидами (8%), расположенными на протяжении всего локуса. Гомология данного локуса между L. pneumophila и другими видами легионелл от 65 до 81 %, с ДНК человека и белой мыши - 2% и 3 %, соответственно. Вариабельность участка между видами легионелл связана с чередованием консервативных и вариабельных нуклеотидов, сгруппированных от 3 до 15, и с наличием делеций и вставок размером 3-9 п.н.

В результате изучения фрагментов генов dotA, gspA и rpoB установлена высокая степень их полиморфности у штаммов L. pneumophila — 22,'4 %, 18 % и 12,3 %, соответственно. Для 7 других генов гетерогенность фрагмента у культур L. pneumophila не превышала 10 %.

Для локусов gspA и fliC гомология с ДНК человека и белой мыши составила 1213 %, для фрагментов генов rnp, rpoB, pro А - гомология с ДНК других видов легио-

нелл достигала 92-100 %, а для фрагментов гена dnaX (294-544 п.н.) и гена ftsZ (196396 н.н.) - гомология с ДНК гетерологичных микроорганизмов достигала 94 %.

Анализ нуклеотидной последовательности гена mompS показал, что первые 337 п.н. и последние 118 п.н. имеют одинаковую последовательность у всех изученных штаммов L pneumophila, тогда как участок между ними (706 п.н.) включает 88 полиморфных сайтов. Данный локус имеет низкую гомологию с ДНК человека и белой мыши - 7 %.

На основании полученных данных для дальнейшей работы были выбраны фрагменты гена dnaX (с 528 по 1127 нуклеотид в соответствии с полной последовательностью локуса), гена ftsZ (с 397 по 758 нуклеотид), гена mompS (с 2 по 336 нуклеотид), гена trpS (с 511 по 925 нуклеотид), характеризующиеся низкой гетерогенностью у штаммов L. pneumophila - не более 3,8 %, отсутствием гомологии с ДНК других видов легионелл, относительно невысокой гомологией с ДНК гетерологичных микроорганизмов - не более 50 %. Однако все обозначенные локусы представлены в геноме возбудителя легионеллеза несколькими копиями, что ограничивает их использования в качестве ДНК-мишеней при выявлении и количественном определении L. pneumophila методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. В качестве наиболее перспективной генетической матрицы для такого анализа может выступать ген mip, имеющий только одну копию в хромосоме легионелл. Введение в реакцию зонда, меченного флуоресцентными метками, позволит снизить вероятность образования неспецифичных реакций с другими видами легионелл из-за высокой гомологии данного локуса (до 81 %).

Поскольку последовательность dnaX. ftsZ, trpS локусов изучена только у 7 штаммов L. pneumophila, нами дополнительно было проведено секвенирование указанных фрагментов у культур L. pneumophila 17628, 17632, 17599, Bloomington (полученных из ГКПБ «Микроб») и их сравнение с нуклеотидной последовательностью аналогичных участков у штаммов L. pneumophila Philadelphia 1, Corby, Paris, Lens с известной последовательностью генома (GenBank NCBI: NC_002942, CP 000675, NC_006368, NC_006369, соответственно). По всей длине фрагмента гена dnaX отмечено наличие 43 полиморфных нуклеотидов (7,2 %), гена ftsZ - 5 полиморфных нук-леотидов: G447A, G459A, С516Т, С591Т, А651С (1,4 %), гена mompS- 2 полиморфных нуклеотидов: С16Т, G49A (0,6 %), trpS - 13 полиморфных нуклеотидов (3,1 %). Исходя из полученных результатов, наиболее перспективными ДНК-матрицами представляются фрагменты ген ftsZ (с 397 по 758 нуклеотид) и гена mompS (с 2 по 336 нуклеотид).

первым матрицам: при электрофоретической детекции - локус mompS, при гибриди-зационно-флуоресцентной - локус ftsZ.

Подбор праймеров и зондов на основе гена mip, а также дальнейшую оптимизацию условий реакции амплификации с их использованием осуществляли совместно с сотрудниками ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (г. Москва). На основании нуклео-тидных последовательностей гена mip, представленных в генетической базе данных GenBank NCB1, подобраны олигонуклеотидные праймеры и зонд формата Molecular Beacons. С целью регистрации результатов реакции в режиме «реального времени» на 5'-конец зонда пришивали флуоресцентную метку JOE, а на 3' - молекулу гасителя флуоресценции RTQ1.

С помощью online-программы на сайте www.genscript.com, используя моно-морфные участки гена ftsZ, определенные нами ранее, подобраны олигонуклеотидные праймеры, обеспечивающие амплификацию фрагмента данного локуса размером 185 п.н. Выбор праймеров осуществляли с учетом возможности их использования совместно с зондом формата TaqMan при создании ПЦР, направленной на идентификацию штаммов L. pneumophila с регистрацией результатов в режиме реального времени. Подбор зонда осуществляли с использованием аналогичного программного обеспечения. Для учета уровня флуоресценции зонд метили с 5'-конца флуоресцентной л*ет-кой ROX, с 3' -конца - молекулой гасителя флуоресценции RTQ2. Используя аналогичное программное обеспечение на основании изученного мономорфного участка гена mompS подобраны олигонуклеотидные праймеры, обеспечивающие амплификацию фрагмента размером 335 п.н.

Подбор праймеров и зондов проводился с учетом минимизации вероятности образования термодинамически значимых вторичных структур (димеры, внутренние петли, шпильки). Специфичность набора праймеров проверена по базе данных GenBank с использованием алгоритма BLAST. Все выбранные праймеры и системы праймеры-зонд специфически соответствовали последовательностям генов mip,ftsZ и mompSL. pneumophila.

Разработку и оптимизацию условий ПЦР проводили на термоциклерах Терцик МС-2 («ДНК-технология», Россия), БИС-110 («Вектор», Россия), PalmCycler, RotorGene 3000 и 6000 (Corbett Research, Австралия).

Для определения аналитической чувствительности ПЦР использовали количественно охарактеризованные разведения рекомбинантных плазмид с клонированными фрагментами генов mip,ftsZ, mompS. Помимо этого, тестировали препараты ДНК, выделенные из проб, содержащих L. pneumophila Philadelphia 1 (1 серогруппа), L. pneumophila Togus-1 (2 серогруппа), L. pneumophila Bloomington-2 (3 серогруппа) в концентрации 1х103, Iх 10", 1x10s м.к./мл.

Для характеристики специфичности ПЦР применяли выборку штаммов из подготовленной ранее целевой коллекции микроорганизмов: три референс-штамма L. pneumophila, 3 штамма - других видов легионелл, 27 штаммов гетерологичных микроорганизмов (по одной культуре каждого рода микроорганизмов, входящего в состав коллекции).

В экспериментах варьировали следующие параметры ПЦР: концентрации праймеров - от 5 до 16 пМ; зондов - от 2 до 8 пМ; MgCl2 - от 2 до 3 мМ; Taq-полимеразы - от 1 до 1,5 ед; температуру, при которой определяется уровень флуоресценции в пробах - от 54 до 60 °С; количество циклов, во время которых считыва-ется флуоресценция - от 30 до 40; температуру отжига праймеров - от 50 °С до 64 °С; время каждого шага цикла - от 30 до 60 секунд; количество циклов - от 35 до 40; время предварительной денатурации - от 1 до 5 минут; время завершающей элонгации - от 1 до 7 минут.

В ходе ряда экспериментов было установлено, что если для учета результатов реакции применяли метод электрофореза в агарозном геле, то оптимальная концентрация праймеров в реакционной смеси составляла 10 пМоль каждого, а при гибриди-зационно-флуоресцентной детекции - соотношение праймеров и зонда было 3:1. Вне зависимости от способа регистрации результатов, наибольший выход ПЦР-продукта наблюдался при осуществлении реакции в присутствии 2,5 мМ ионов Mg2+ и 1 ед. фермента.

Для амплификации фрагмента гена mip оптимальной являлась следующая программа: предварительная денатурация при температуре 95 °С в течение 5 мин, 10 циклов, включающих 95 °С - 10 с, 60 °С - 20 с, 72 °С - 10 с; 35 циклов, включающих 95 °С - 10 с, 56 °С - 20 с, 72 °С - 10 с. Поскольку для проведения реакции подобрана система «праймеры-зонд» формата Molecular beacons, измерение флуоресценции осуществляли при температуре 56 °С, значение пороговой линии - 0,05. При проведении ПЦР в соответствии с указанными параметрами чувствительность реакции составила 1х103 м.к./мл, специфичность - 100 % (наличие флуоресценции по каналу JOE наблюдалось только при исследовании проб, содержащих ДНК L. pneumophila) (рисунок 1).

ад

|о,

................................................................ с-г*. ................................................

Рисунок 1. Специфическая активность ПЦР с праймерами и зондом на основе нуклеотидной последовательности гена mip при исследовании препаратов ДНК, выделенных из бактериальных суспензий штамма L. pneumophila Philadelphia 1, по каналу JOE: 1 - 1х105 м.к./мл (С; - 21,37), 2 - 1х104 м.к./мл (С,-25,8), 3 - 1x10'м.к./мл (С,-28,0), 4-отрицательный контроль.

Для амплификации фрагмента гена ftsZ с учетом результатов в режиме «реального времени» подобрана следующая программа: предварительная денатурация при температуре 95 "С в течение 5 мин, 10 циклов, включающих 95 °С - 10 с, 60 "С - 20 с,

72 °С - 10 с; 35 циклов, включающих 95 °С - 10 с, 56 "С - 20 с, 72 °С - 10 с, учет уровня флуоресценции при температуре 72 °С в течение последних 35 циклов. Изменение температурного режима регистрации флуоресцентного сигнала связано с форматом используемого в данном случае зонда - ТацМап. Оптимальным значением пороговой линии являлось 0,1. Чувствительность ПЦР, осуществленной в таких условиях, составляла 1x103 м.к./мл (рисунок 2).

Рисунок 2. Специфическая активность ПЦР с праймерами и зондом на основе нуклеотидной последовательности гена ftsZ при исследовании чистых культур L. pneumophila по каналу ROX: 1,2,3 - L. pneumophila Philadelphia 1 с концентрацией 1х105 м.к./мл (С, - 19,13), 1х104 м.к./мл (С, - 22,23), 1хЮ3 м.к./мл (С, - 28,60), соответственно; 4,5,6 - L. pneumophila Togus 1 с концентрацией 1х105 м.к./мл (С( - 20,28), 1хЮ4 м.к./мл (С, - 23,35), 1х103 м.к./мл (С, -26,18), соответственно; 7 - отрицательный контроль.

При изучении специфичности такой ПЦР отмечено отсутствие флуоресцентного сигнала во всех пробах, содержащих ДНК других видов легионелл и гетерологич-ных микроорганизмов.

Для амплификации фрагментов генов ftsZ и mompS с учетом результатов методом электрофореза оптимальной являлась следующая программа: предварительная денатурация при температуре 95 "С в течение 5 мин, 35 циклов, включающих 95 °С -40 с, 60 (50) °С - 40 с, 72 °С - 40 с, заключительная достройка цепи нри температуре 72 °С в течение 5 мин. Температура отжига праймеров, подобранных на основании гена ftsZ, составляла 60 °С, гена mompS - 50 °С. Для учета результатов оптимальным является использование 2 % агарозного геля. При проведении ПЦР по таким параметрам чувствительность реакции составила 1хЮ3 м.к./мл. Образование ампликонов размером 185 п.н. и 335 п.н., соответственно, наблюдали только при исследовании проб, содержащих ДНК L. pneumophila (рисунки 3,4).

12.3456789

Рисунок 3. Специфическая активность ПЦР с электрофоретическим учетом результатов с праймерами на основе нуклеотидной последовательности fisZ гена: 1,9 -100 bp Ladder (Кат. № 50321, Lonza, США); 2,3,4 - L. pneumophila Philadelphia 1 в концентрации lxlO3 м.к./мл, 1*104 м.к./мл, 1x10 м.к./мл, соответственно; 5,6,7 - L. pneumophila Bloomington 2 в концентрации 1х103м.к./мл, 1х104 м.к./мл, 1><105 м.к./мл, соответственно; 8-отрицательный ко!ггроль.

'..........1.......2.....3........4.........5.......6............7...........8........9 .......

Рисунок 4. Специфическая активность ПЦР с электрофоретическим учетом результатов с праймерами на основе нуклеотидной последовательности mompS гена: 1,9 - 100 bp Ladder (Кат. № 50321, Lonza, США); 2,3,4 - L. pneumophila Philadelphia 1 в концентрации 1хЮ3 м.к./мл, 1хЮ4 м.к./мл, 1хЮ5 м.к./мл, соответственно; 5,6,7 - L. pneumophila Bloomington 2 в концентрации 1хЮ3 м.к./мл, 1><104 м.к./мл, 1х105 м.к./мл, соответственно; 8 -отрицательный контроль.

Полученные в ходе ряда экспериментов данные указывают на перспективность использования рекомбинантных плазмид с клонированными фрагментами генов mip, ftsZ и mompS в качестве положительных контрольных образцов (ПКО) при комплектации тест-систем: возможность стандартизации процесса подготовки образцов, количественная характеристика, стабильность хранения (препараты плазмид не утрачивали свою активность в течение 6 месяцев при температуре плюс 6-8 °С и минус 20 °С). Чувствительность разработанных ПЦР при исследовании 10-кратных разведений препаратов плазмид составила 1 х 103 ГЭ/мл.

Для того, чтобы снизить риск получения ложноотрицательных результатов, нами для ПЦР с праймерами и зондом на основе нуклеотидной последовательности гена mip проведена работа по созданию системы внутреннего контрольного образца

(ВКО), амплификация которого осуществляется в одной реакционной пробирке одновременно с ДНК-мишенью.

Для определения ингибирующего действия биологического материала на ПЦР был использован эндогенный внутренний контроль (эндогенный ВК) - генетический материал человека, который находится в исследуемом образце. Преимуществом такого типа ВКО является возможность определения не только ошибок при подготовке реакционной смеси и ингибирования фермента, но и адекватности забора материала, поскольку отсутствие амплификации контроля свидетельствует о незначительном количестве клеток человека в пробе или их отсутствии [Kellogg D.E. et al., 1990; Hoonan K.E. etal., 1990].

На основании нуклеотидной последовательности гена протромбина человека были подобраны специфичные олигонуклеотидные праймеры и зонд, меченный с 5'-конца флуоресцентной меткой РАМ, с 3'-конца молекулой гасителя флуоресценции RTQ1. При постановке ПЦР в мультилокусном формате регистрация результатов амплификации ДНК легионелл осуществляется по каналу JOE, амплификация эндогенного ВК - по каналу FAM.

В ходя ряда экспериментов установлено, что условия проведения ПЦР с прай-мерами и зондом к эндогенного ВК совпадают с таковыми для праймеров и зондов на основе нуклеотидной последовательности гена mip. Эффективность одновременной амплификации эндогенного ВК и ДНК-мишени легионелл была определена при исследовании проб крови и бронхоальвеолярного лаважа, искусственно инфицированных L. pneumophila Philadelphia 1 до конечной концентрации 1><103, 1*104, 1х105 м.к./мл в двух повторах (таблица 1).

Таблица 1. Определение эффективности амплификации эндогенного ВК при исследовании проб крови и бронхоальвеолярного лаважа, искусственно инфицированных L. pneumophila

Вид материала Концентрация L. pneumophila Philadelphia 1, м.к./мл Результаты реакции Значение Ct по каналам

FAM (эндогенный ВК) JOE (ген mip L. pneumophila

бронхоальвеолярный лаваж lxIO3 м.к./мл 19.14 23.94

1х103м.к./мл 19.42 24.57

1х104 м.к./мл 19.30 20.63

1х104 м.к./мл 19.58 20.56

1х105м.к./мл 18.89 16.43

1х105м.к./мл 19.38 16.25

кровь 1х103м.к./мл 20.10 26.22

1х103 м.к./мл 20.65 27.20

1х104м.к./мл 19.49 23.52

1х104 м.к./мл 18.99 23.24

1х105м.к./мл 19.73 18.32

1х105м.к./мл 19.82 18.54

Для оценки ингибирующего действия проб из объектов окружающей среды был разработан экзогенный внутренний контроль (экзогенный ВК), представляющий собой рекомбинантную плазмидную конструкцию, содержащую искусственную нук-леогидную последовательность ДНК, на основе pGEM (Promega, США). Принципиальной особенностью ВКО такого типа является то, что он добавляется в каждую пробу до начала выделения ДНК и его амплификация осуществляется, также как и в случае эндогенного ВК, в одной пробирке с ДНК-мишеныо. Для регистрации результатов амплификации экзогенного ВК были подобраны праймеры и зонд, меченный с 5'-конца флуоресцентной меткой FAM, с З'-конца молекулой гасителя флуоресценции RTQ1.

Условия амплификации экзогенного ВК совпадали с таковыми для праймеров и зондов на основе нуклеотидной последовательности гена mip. Учет потерь ДНК экзогенного ВК позволяет рассчитать реальную концентрацию ДНК L. pneumophila в каждом образце воды при осуществлении количественного ПЦР-анализа. В качестве калибраторов для проведения количественной ПЦР могут служить разведения препарата плазмиды с клонированным фрагментом гена mip с точно определенной концентрацией копий ДНК.

На основании полученных результатов нами сконструированы экспериментальные серии двух тест-систем для выявления ДНК L. pneumophila в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов: «Ген Legionella pneumophila - РЭФ» (ДНК-мишень - мономорфный участок ftsZ гена), совместно с сотрудниками ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора «АмплиСенс® Legionella pneumophila-FL» (ДНК-мишень - mip ген), соответственно. Для идентификации культур L. pneumophila и подтверждения первичного положительного ответа, полученного на этапе индикации возбудителя легионеллеза, подготовлены две тест-системы «Ген Legionella pneumophila - РЭФ-идентификация» (ДНК-мишень - мономорфный участок mompS гена, электрофоретический учет результатов) и «Ген Legionella pneumophila - РГФ-идентификация» (ДНК-мишень - мономорфный участок ftsZ гена, детекция результатов в режиме реального времени).

Сконструированные препараты включали в себя 3(2) комплекта реагентов: для выделения ДНК, для проведения ПЦР и для учета результатов методом электрофореза в агарозном геле (только в случае электрофоретической детекции продуктов амплификации). Для оценки специфической активности разработанных тест-систем использовали бактериальные суспензии штаммов L. pneumophila Philadelphia 1, Togas 1 и Bloomington 2 с концентрацией lxlO3 - lx 10s м.к./мл, а также пробы биологического материал (мокрота, БАЛ, кровь) и пробы из объектов окружающей среды (вода открытых водоемов, смывы с кондиционера), искусственно инфицированные L. pneumophila Philadelphia 1 до конечной концентрации lxlO3 - lx 10s м.к./мл, а также L. dumoffl TEX-KL и L. micdadei TATLOCK - до конечной концентрации 1x107 м.к./мл. Специфичность определяли при исследовании бактериальных суспензий подобран-

ных ранее штаммов целевой коллекции: 19 штаммов L pneumophila различных серог-рупп, три штамма Legionella spp., 128 штаммов гетерологичных микроорганизмов.

Установлено, что образование специфичных ампликонов размером 185 и 335 п.н. при использовании тест-систем «Ген Legionella pneumophila - РЭФ» и «Ген Legionella pneumophila - РЭФ-идентификация», соответственно, и специфичной флуоресценции по каналам JOE и ROX в случае применения тест-систем «АмплиСенс® ¿е-gionella pneumophila-VL» и «Ген Legionella pneumophila - РГФ-идентификация», соответственно, наблюдалось только в пробах, содержащих L. pneumophila всех серог-рупп, вне зависимости от вида материала. Со всеми гетерологичными микроорганизмами и тремя видами Legionella spp. во всех случаях отмечен отрицательный результат.

Специфическая активность разработанных тест-систем составила 1х103 м.к./мл, специфичность - 100 %. Во всех случаях первичные положительные ответы, полученные с помощью тест-систем «Ген Legionella pneumophila - РЭФ» и «АмплиСенс® Legionella pneumophila-VL», были подтверждены при использовании тест-систем «Ген Legionella pneumophila - РЭФ-идентификация» и «Ген Legionella pneumophila - РГФ-идентификация».

С целью изучения диагностической чувствительности и специфичности сконструированных препаратов проведено исследование проб биологического материала от людей и из объектов окружающей среды.

Тест-система «АмплиСенс® Legionella pneumophila-VL» была апробирована во время зарегистрированной в июле 2007 года вспышки легионеллезной инфекции в г. Верхняя Пышма (Свердловская область). Работа проведена совместно с сотрудниками ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (г. Москва), лаборатории легионеллеза ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (г. Москва) и ФГУЗ «ЦГиЭ в Свердловской области». Материалом для исследования служили 230 образцов от 133 человек, в том числе - 109 ротоглоточных смывов, два образца мокроты, 51 образец плазмы крови, 63 образца сыворотки крови, восемь образцов мочи, 10 образцов секционного материала (суспензии легочной ткани и селезенки) от четырех умерших пациентов, а также 81 проба из объектов окружающей среды.

С помощью тест-системы «АмплиСенс® Legionella pneumophila-VL» ДНК L. pneumophila выявлена во всех пробах секционного материала от четырех умерших пациентов, в одной пробе БАЛ, полученного от одного, впоследствии умершего пациента. Забор БАЛ был осуществлен на восьмые сутки от начата заболевания. В то же время от этого пациента получена сыворотка крови, в которой также обнаружена ДНК L. pneumophila. При исследовании проб мочи в семи случаях методом ИХА выявлен водорастворимый антиген L. pneumophila 1 серогруппы.

Анализ материала от больных с тяжелым течением заболевания показал наличие ДНК L. pneumophila в одной из семи изученных проб мочи, взятой на 5-11 сутки от начала заболевания, в одной из шести проб сывороток (7-11 сутки), в двух из семи мазков с задней стенки глотки (5 и 9 сутки). Помимо этого, ДНК возбудителя легио-

неллеза выявлена в одном мазке с задней стенки глотки и в одной пробе мокроты от больных с пневмонией средней тяжести.

Во всех остальных случаях в ГЩР отмечен отрицательный результат. Образцы секционного материала от трёх умерших пациентов и восьми проб мочи от пациенток с пневмонией крайней степени тяжести, были исследованы в лаборатории легионел-леза ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Из одного образца легочной ткани была выделена культура L. pneumophila 1 серогруппы, в семи образцах мочи обнаружен антиген L. pneumophila 1 серогруппы.

При исследовании образцов из объектов окружающей среды ДНК L. pneumophila выявлена в 15 случаях, в том числе в пробах технической воды из градирни (4) и воды разводящей сети с территории завода ОАО «Уралэлектромедь» (2), пробах горячей воды из теплопунктов (6) и разводящей сети (3). Концентрация ДНК возбудителя в исследованных пробах составляла от 9,8* 102 до 3x104 копий/л. Помимо этого, из 22 исследованных смывов с душевых насадок, взятых в квартирах людей, проживающих в г. Верхняя Пышма и госпитализированных с диагнозом «пневмония не-уточненная», в трех пробах также обнаружена ДНК L. pneumophila. При использовании бактериологического метода культура L. pneumophila 1 серогруппы выделена из одного смыва с поверхности дренажного канала теплопункта.

В ходе апробации тест-системы «Ген Legionella pneumophila - РЭФ» на базе ФГУН ГТЩ ВБ «Вектор» было исследовано 6 проб секционного материала (фрагменты легкого, трахеи, головного и спинного мозга) от умерших (клинически и лаборатории подтвержден диагноз «легионеллез») во время вспышки легионеллеза в г. Верхняя Пышма (Свердловская область). Образование специфичных ампликонов размером 185 п.н. наблюдали во всех случаях, что свидетельствует о наличии в указанных пробах ДНК L. pneumophila. Установлено, что результаты ПЦР-анализа секционного материала с помощью тест-системы «АмплиСенс® Legionella pneumophila-FL» и тест-системы «Ген Legionella pneumophila - РЭФ» совпадали в 100 % случаев.

Совместно с сотрудниками ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (г. Москва) и Государственной Смоленской медицинской академии (г. Смоленск) с помощью тест-системы «АмплиСенс® Legionella pneumophila-FL» был изучен биологический материал (мазки со слизистых носоглотки, ротоглотки и кровь) от практически здоровых индивидов и мокрота от пациентов с лабораторно подтвержденной пневмонией бактериальной или вирусной природы. Во всех случаях в ПЦР получен отрицательный результат. Также было исследовано 200 образцов мокроты от пациентов, госпитализированных в клиники г. Смоленска с сентября 2006 г по апрель 2007 г с диагнозом «внебольничная пневмония», подтвержденным рентгенологически. Одновременно этот же материал был изучен с помощью бактериологического анализа. В двух пробах в ПЦР зафиксирована флуоресценция по каналам JOE и FAM, что свидетельствует о наличии в образцах ДНК L. pneumophila. Выделить культуру L pneumophila ни в одном случае не удалось. Для верификации результатов ПЦР-анализа было проведено секвенирование полученных ампликонов. Установлено полное соответствие последо-

вательности ПЦР-продукта фрагменту гена mip L. pneumophila, фланкированного праймерами, входящими в состав тест-системы.

Совместно с сотрудниками ГМУ «Областная клиническая больница» (г. Саратов) с помощью тест-систем «Ген Legionella pneumophila - РЭФ» и «АмплиСенс® Legionella pneumophila-TL» проведено исследование проб биологического материала (бронхоальвеолярный лаваж, мазки из ротоглотки, кровь, моча) от 19 пациентов, госпитализированных с диагнозом «внебольничная пневмония» в ноябре-декабре 2008 г. Одновременно этот же материал был изучен с помощью бактериологического метода, ИХА, ИФА и в РАО. Методом ПЦР ДНК L. pneumophila во всех пробах не обнаружена. С помощью ИХА, РАО и ИФА легионеллезный антиген и антитела к L. pneumophila не выявлены, культура возбудителя легионелллеза при бактериологическом исследовании не выделена. В 100 % случаев наблюдалось совпадение результатов ПЦР и других использованных методов.

Совместно с сотрудниками ФГУЗ Ставропольского НИПЧИ и ФГУЗ Причерноморская противочумная станция (г. Новороссийск, Краснодарский край) с помощью бактериологического анализа и методом ПЦР с применением тест-систем «Ген Legionella pneumophila - РЭФ» и «АмплиСенс® Legionella pneumophila-FL» исследованы смывы и пробы воды из систем питьевого водоснабжения, отопления и кондиционирования (г. Новороссийск - 30 проб, г. Сочи - 21) и 10 образцов мокроты от больных с различными хроническими заболеваниями легких. Во всех пробах культуры L. pneumophila и ДНК возбудителя легионеллеза обнаружено не было.

На основании полученных результатов разработан алгоритм генной диагностики легионеллеза, включающий два этапа: 1. выявление ДНК возбудителя в биологическом материале и объектах окружающей среды с помощью тест-систем «Ген Legionella pneumophila - РЭФ» или «АмплиСенс® Legionella pneumophila-FL»; 2. идентификация штаммов L. pneumophila и подтверждение первичного положительного ответа о наличии в пробе патогена с применением тест-систем «Ген Legionella pneumophila - РЭФ-идентификация» и «Ген Legionella рпеи/ло/гй;7а-РГВ-идентификация». Использование на каждом из этапов отдельных генодиагностических препаратов с альтернативными ДНК-мишенями позволяет эффективно осуществлять подтверждение первичного положительного ответа, полученного на этапе индикации.

ВЫВОДЫ

1. Подготовлена и охарактеризована целевая коллекция, состоящая из 108 коллекционных культур и 49 штаммов, выделенных от больных пневмониями на территории г. Саратова за период 2007-2008 гг., позволяющая эффективно оценить специфическую активность и специфичность препаратов для выявления возбудителя легионеллеза методом ПЦР.

за синтез полипептида 25 кДа, необходимого для персистенции возбудителя в макрофагах, и гены «системы жизнеобеспечения» ftsZ и mompS, кодирующие синтез тубу-линоподобного белка и белка внешней мембраны, соответственно.

3. Сконструированы олигонуклеотидные праймеры и зонды для специфической амплификации фрагментов mip и ftsZ генов с регистрацией результатов ПЦР в режиме «реального времени», а также олигонуклеотидные праймеры для выявления генов JlsZ и mompS с детекцией ампликонов методом электрофореза; разработаны оптимальные параметры проведения качественной и количественной ПЦР, обеспечивающие специфическую активность реакции 1 х 103 м.к./мл при 100 % специфичности.

4. Сконструированы гест-системы для выявления ДНК возбудителя легионел-леза в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с гиб-ридизационно-флуоресцентным учетом результатов «АмплиСеис® Legionella рпеито-phila-FL» (ДНК-мишень - ген mip) и электрофоретической детекцией «Ген Legionella pneumophila - РЭФ» (ДНК-мишень - ген ftsZ), для качественного и количественного анализа, характеризующиеся специфической активностью - 1Х103 м.к./мл и специфичностью -100 %.

5. Сконструированы тест-системы для идентификации штаммов L. pneumophila методом ПЦР с гибридизационио-флуоресцентным учетом результатов «Ген Legionella рпеиторЫ1а-РГФ-идент^татя» (ДНК-мишень - ген ftsZ) и электрофоретической детекцией «Ген Legionella pneumophila - РЭФ-идентификация» (ДНК-мишень -ген mompS), характеризующиеся специфической активностью - 1х103 м.к./мл и специфичностью - 100 %.

6. Проведена апробация созданных генодиагностических препаратов при исследовании материала от людей, больных пневмониями неясной этиологии, и проб из объектов окружающей среды; подтверждена их диагностическая ценность: специфическая активность - 1хЮ3 м.к./мл, специфичностью - 100 %.

7. Разработан алгоритм двухэтапной генной диагностики легионеллеза, при котором для индикации возбудителя в биологическом материале, объектах окружающей среды и для идентификации штаммов L. pneumophila предусмотрено использование отдельных генамплификационных препаратов, что позволяет осуществлять подтверждение первичного положительного ответа о наличии в пробе L. pneumophila.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Портенко С. А., Темежникова Н.Д., Осина Н.А., Тартаковский И .С., Ку-личенко А.Н. Оптимизация параметров ПЦР для выявления ДНК Legionella pneumophila II Материалы Российск. научн.-практ. конф. «Генодиагностика инфекционных болезней» - Новосибирск, 2005. - С. 225-227.

2. Куличенко А.Н., Осина Н.А., Портенко С.А., Куклев В.Е., Кутырев В.В. Алгоритм многофакторной генной диагностики особо опасных инфекций // Материалы VIII Межгосударствен, научн.-практ. конф. «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-

Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» - Оболенск. - С. 215-216.

3. Куклев В.Е., Ивашенцева Л.Н., Шарова И.Н., Осина Н.А., Плотникова Е.А., Портенко С.А., Щербакова С.А., Куличенко А.Н. Оптимизация методов выделения ДНК ООИ из биологического материала и объектов внешней среды для исследований методом ПЦР // Материалы IX съезда Всероссийск. научн.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 2007. - С. 52.

4. Яцышина С.Б., Портенко С.А.. Астахова Т.С., Осина Н.А., Темежникова Н.Д., Червякова Н.С., Валова Т.В., Таргаковский И.С., Куличенко А.Н., Шипулин Г. А. Разработка методики для обнаружения Legionella pneumophila на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией // Материалы IX съезда Всероссийск. научн.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 2007.-С. 102-103.

5. Портенко С.А., Осина Н.А., Червякова Н.С., Валова Т.В. Новые ДНК-мишени для диагностики легионеллеза // Материалы международной научн.-практ. конф. «Молекулярная диагностика инфекционных болезней». - Минск, 2007. - С. 128.

6. Яцышина С.Б., Портенко С.А., Астахова Т.С., Осина Н.А. Разработка методики обнаружения Legionella pneumophila на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией // Материалы международной научн.-практ. конф. «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» - Минск, 2007. - С. 127.

7. Яцышина С.Б., Портенко С.А., Осина Н.А., Астахова Т.С., Червякова Н.С., Валова Т.В., Рачина С.А. Результаты апробации тест-системы для обнаружения Legionella pneumophila на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией // Материалы VIII Межгосударственной научн.-практ. конф. «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках Содружества Независимых Государств». - Саратов, 2007. - С. 325-326.

8. Портенко С.А., Осина Н.А., Кутырев В.В. Разработка ПЦР с учетом результатов методом электрофореза для выявления ДНК Legionella pneumophila в биологическом материале и объектах окружающей среды // Сборник трудов 6-ой Всероссийск. научн.-практ. конф. с международным участием «Молекулярная диагностика -2007». - Москва, 2007. - С. 365-366.

9. Яцышина С.Б., Портенко С.А., Астахова Т.С., Осина Н.А., Рачина С.А., Гаранина С.Б., Жукова Ю.В., Шишова А.В., Кондратьева Т.Ю., Червякова Н.С., Валова Т.В., Иванчик Н.В., Кречикова О.И., Дурасова A.JI., Куличенко А.Н., Романенко В.В., Шипулин Г.А., Тартаковский И.С., Малеев В.В. Использование методов молекулярной эпидемиологии при проведении эпидемиологического надзора за легионел-лезами // Сборник трудов 6-ой Всероссийск. научн.-практ. конф. с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007». - Москва, 2007. - С. 376-381.

10. Яцышина С.Б., Портенко С.А., Астахова Т.С., Осина Н.А., Рачина С.А., Г аранина С.Б., Жукова Ю.В., Шишова А.В., Кондратьева Т.Ю., Червякова Н.С., Валова Т.В., Иванчик Н.В., Кречикова О.И., Дурасова А.Л., Куличенко А.Н., Романенко

В.В., Тартаковский И.С., Малеев В.В., Шипулин Г. А. Разработка и применение ПЦР с гибрвдизационно-флуоресцентной детекцией для обнаружения Legionella pneumophila IIЖМЭИ. - 2008. - № 2. - стр. 29-37.

Подписано в печать 19.03.09.0бъем - 1 печ. Тираж 100.3аказ№290 Отпечатано в ООО «Техно-Декор», 410012, Саратов, ул. Московская, 160

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Портенко, Светлана Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика возбудителя легионеллеза.

1.2. Лабораторная диагностика легионеллеза.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объекты исследования.

2.1.1. Бактериальные штаммы.

2.1.2. Реактивы, питательные среды и диагностические препараты.

2.2. Микробиологические методы.

2.2.1. Культивирование микроорганизмов, полученных из ГКПБ «Микроб».

2.2.2. Выделение и идентификация гетерологичных микроорганизмов из клинического материала.

2.2.3. Подготовка проб.

2.2.4. Выявление возбудителя легионеллеза в пробах биологического материала и из объектов окружающей среды с помощью бактериологического анализа.

2.2.5. Идентификация культур Legionella spp.

2.2.6. Выявление растворимого антигена

L. pneumophila серогруппы 1 в моче.

2.2.7. Выявление в сыворотке крови иммуноглобулинов к L. pneumophila серогруппы 1, Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella bumetti методом иммуноферментного анализа.

2.2.8. Выявление в сыворотке крови иммуноглобулинов к L. pneumophila серогруппы 1 в реакции аггломерации (РАО).

2.3. Генетические методы.

2.3.1. Обеззараживание проб для исследований методом ПЦР.

2.3.2. Выделение ДНК из бактериальных суспензий, проб биологического материала и объектов окружающей среды.

2.3.3. Полимеразная цепная реакция.

2.4. Клонирование ПЦР-продукта в вектор pGEM-T.

2.4.1. Очистка ампликонов.

2.4.2. Клонирование в вектор pGEM-T.

2.4.3. Культивирование рекомбинантных штаммов Е. coli TGI

2.4.4. Выделение плазмидной ДНК рекомбинантного штамма Е. coli TGI.

2.5. Определение концентрации ДИК.

2.6. Программы и базы данных для анализа нуклеотидных последовательностей.

2.7. Статистическая обработка полученных данных.

Глава 3. ПОДГОТОВКА ВЫБОРКИ ШТАММОВ

L. PNEUMOHILA И ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

СПЕЦИФИЧНОСТИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ГЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ

ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА.

3.1. Подбор гетер о логичных штаммов микроорганизмов.

3.2. Подбор специфичных штаммов микроорганизмов.

3.3. Подготовка выборки штаммов L. pneumophila и гетерологичных микроорганизмов для определения специфической активности и специфичности тест-систем, направленных на индикацию и идентификацию возбудителя легионеллеза.

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК

ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ, ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ И ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ L. PNEUMOPHILA

4.1. Выбор ДНК-мишеней.

4.2. Подбор олигонуклеотидных праймеров и зондов, оптимизация условий проведения ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ

И ИДЕНТИФИКАЦИИ L. PNEUMOPHILA МЕТОДОМ

ПЦР С ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИМ И ГИБРИДИЗА-ЦОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ

РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1. Конструирование тест-систем для выявления ДНК возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизацнонно-флуоресцентным учетом результатов.

5.2. Конструирование тест-систем для идентификации штаммов L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцептным учетом результатов.

5.3. Изучение диагностической ценности разработанных тест-систем для выявления возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды и для идентификации штаммов L. pneumophila методом ПЦР с элекгрофоретическим и гибридизациионно-флуоресцентным учетом результатов.

Глава 6. АПРОБАЦИЯ СКОНСТРУИРОВАННЫХ

ТЕСТ-СИСТЕМ НА ПРОБАХ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ, РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМА ГЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ

ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА.

6.1. Апробация сконструированных тест-систем на пробах из биологического материала и объектов окружающей среды.

6.2. Алгоритм генной диагностики легионеллеза.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генная диагностика легионеллеза с использованием полимеразной цепной реакции"

Актуальность проблемы

Современная значимость проблемы легионеллеза определяется, прежде всего, постоянными случаями заболевания людей в различных странах мирах. Крупные вспышки имели место в России (1987 г.), в Голландии (1999 г.), Испании (2001 г.), Франции и Норвегии (2004-2005 гг.) [Покровский В.И. с соавт., 1988; Тартаков-ский И.С., 2001, Карбышев Г.Л., 2006, Joseph С., 2004, McNaught В. et al., 2005; Chartier B.J.Y. et al., 2007]. В Российской Федерации в июле-августе 2007 г. в г. Верхняя Пышма (Свердловская область) была зарегистрирована вспышка легио-неллезной инфекции, во время которой количество госпитализированных составило 202 человека, из них у 74 диагноз «легионеллез» был лабораторно подтвержден, в том числе у 4 пациентов посмертно [Беликов Е.С. с соавт., 2008; Онищепко Г.Г. с соавт., 2008].

Подавляющее большинство случаев легионеллеза (70-90 %) связано с видом Legionella pneumophila, включающим 16 серогрупп. Представители всех серогрупп этого вида являются патогенными для человека, однако более 90 % случаев легио-неллезной пневмонии обусловлено L. pneumophila 1 серогруппы [Marston В.J., et al., 1994; Fields B.S. et al., 2002].

Причиной заболевания легионеллезом является контакт человека с искусственными водными системами (системы горячего и холодного водоснабжения, централизованные системы кондиционирования воздуха с водным охлаждением, градирни, вихревые бассейны, увлажнители воздуха, фонтаны и т.д.), коптаминиро-ванными возбудителем инфекции. Это обусловлено тем, что в обозначенных выше объектах создаются благоприятные условия для размножения легионелл, что приводит к образованию биопленок и накоплению в них возбудителя в высокой концентрации [Тартаковский И.С. с соавт., -2005; Карпова Т.И. с соавт., 2008; Atlas R.M., 1999; Zanetti F. et al., 2000]. В естественных местах обитания легионелл (пресноводные водоемы) их количество незначительно и они пе представляют опасности для человека.

Онищенко Г.Г. с соавт., 2008]. Не менее важно своевременное выявление возбудителя легионеллеза в биологическом материале от людей [Тартаковский И.С., Сино-пальников А.И., 2001; Темежникова Н.Д., 2008].

Лабораторная диагностика легионеллеза бактериологическим методом длительна (выделение культуры занимает до 10-14 дней), а чувствительность анализа при исследовании клинического материала варьирует в пределах 10-80 % [WHO, 1999; Diederen B.M.W. et al., 2006]. Иммунодиагностические препараты позволяют детектировать L. pneumophila только 1 серогруппы [Plouffe J.F. et al., 1995; Castilla J. et al., 2007]. Серологические тесты являются ретроспективными и неэффективны при обследовании людей со сниженным иммунитетом [Franzin L., Scramuzza F., 1995; Yzerman E.P. et al., 2006]. В связи с этим очевидна необходимость разработки быстрых и эффективных способов детекции возбудителя легионеллеза всех серог-рупп. Наиболее перспективным решением данной проблемы является использование для индикации и идентификации легионелл молекулярно-генетических подходов, в первую очередь полимеразной цепной реакции (ПЦР).

На сегодняшний день эффективность применения ПЦР для обнаружения ДНК легионелл в биологическом материале и объектах окружающей среды подтверждена в ряде работ отечественных и зарубежных авторов [Федоров Ю.Н. с соавг., 2003; Аляпкина Ю.С. с соавт., 2007; ICoide М., et al., 1993; Cloud J. L. et al., 2000; Wellinghausen N. et al., 2001; Wilson D.A., et al., 2003; Yanez M.A.et al., 2005]. В большинстве публикаций исследования были направлены на разработку вариантов ПЦР для выявления ДНК Legionella spp. и/или L. pneumophila. Данные о регистрации ПЦР-тест-систем для детекции возбудителя легионеллеза в Российской Федерации отсутствуют.

При разработке препаратов для генной диагностики легионеллеза необходимо предусмотреть возможность, во-первых, количественной оценки содержания L. pneumophila в пробах из объектов окружающей среды, поскольку уровень контаминации возбудителем легионеллеза искусственных водных систем является эпидемически значимым показателем; во-вторых, исключения ложноотрицательпых результатов, возникающих из-за наличия в пробах веществ, ингибирующих реакцию амплификацию; в-третьих, осуществления детекции возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды и идентификации штаммов L. pneumophila с использованием отдельных тест-систем; в-четвертых, подтверждения первичного положительного ответа, полученного на этапе индикации патогена.

Вышеизложенное свидетельствует о необходимости разработки тест-систем для качественного и количественного выявления ДНК легионелл в исследуемом материале на основе технологий ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, а также методологии определения ингибиро-вания реакции за счет введения в исследуемые пробы внутреннего контрольного образца. Использование в качестве ДНК-мишепей для создания генодиагностических препаратов альтернативных видоспецифичных генов L. pneumophila в полной мере обеспечивает получение первичного ответа и его подтверждение. По данным А.А. Чуракова с соавт. [2005] и G. Jaschck et al. [1993] применение такого подхода способствует повышению точности ПЦР-анализа.

Цель работы — конструирование тест-систем для выявления ДНК возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды, и для идентификации штаммов L. pneumophila методом ПЦР с элекгрофоретиче-ским и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, разработка алгоритма генной диагностики легионеллеза.

Основные задачи исследования:

1. Подготовить и охарактеризовать целевую коллекцию штаммов L. pneumophila и гетерологичных микроорганизмов для оценки специфической активности (чувствительности) и специфичности препаратов для генной диагностики легионеллеза.

3. Подобрать к выбранным фрагментам ДНК олигонуклеотидные праймеры и зонды, оптимизировать условия проведения ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов для качественного и количественного анализа.

4. Сконструировать тест-системы для выявления ДНК возбудителя легионеллеза в биологическом материале, объектах окружающей среды и для идентификации штаммов L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, охарактеризовать их диагностическую ценность.

5. Апробировать созданные генодиагностические препараты при исследовании клинического материала от людей, больных пневмониями неясной этиологии, и проб из объектов окружающей среды. 6. Разработать алгоритм генной диагностики легионеллеза с использованием ПЦР-анализа, включающего два этапа: 1. выявление ДНК возбудителя в биологическом материале и объектах окружающей среды; 2. идентификация штаммов L. pneumophila и подтверждение первичного положительного ответа о наличии в пробе патогена. Научная новизна работы

Проведен анализ нуклеотидных последовательностей генома L.pneumophila, позволивший определить мономорфные видоспецифичные участки, перспективные для создания генодиагностических препаратов.

Получены новые данные о нуклеотидной последовательности генов «системы жизнеобеспечения»: dnaX,ftsZ, mompS, trpS у штаммов возбудителя легионеллеза, выделенных на территории Российской Федерации.

Впервые на основе генов mip, ftsZ, trpS сконструированы тест-системы для детекции возбудителя легионеллеза и идентификации штаммов L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.

Впервые разработан алгоритм двухэтаппой генной диагностики легионеллеза, предусматривающий поэтапное выполнение анализа с подтверждением первичного положительного ответа о наличии в пробе ДНК L. pneumophila. Практическая значимость работы

В результате проведенных исследований созданы экспериментальные серии тест-систем для выявления ДНК возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов («Ген Legionella pneumophila

РЭФ» и «АмплиСенс Legionella pneumophila -FL», соответственно) и тест-систем для идентификации L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим и гибри-дизационно-флуоресцентным учетом результатов («Ген Legionella pneumophila— РЭФ-идентификация» и («Ген Legionella /?яег/шор/7//<7—РГФ-идентификация», соответственно). На тест-системы разработаны проекты нормативно-технической документации (ТУ, инструкция по применению).

В ходе межлабораторных испытаний «Ген Legionella pneumophila - РЭФ -тест-системы для выявления ДНК возбудителя легиопсллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с электрофоретическим учетом результатов» подтверждена диагностическая ценность препарата: чувствио тсльность - 1x10 м.к./мл, специфичность при исследовании чистых культур и секционного материала - 100 % (акты внедрения, утвержденные директором ФГУЗ Ставропольский НИПЧИ (от 24.10.08 г.) и генеральным директором ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (от 13.11.08 г.)).

Материалы диссертационной работы представлены в практическом руководстве «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней» (глава «Ле-гионеллез») (утверждено Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12 декабря 2007 г.).

Основные положения, выносимые на защиту

1. На основе нуклеотидных последовательностей мономорфных участков гена mip (отвечающего за синтез полипептида 25 кДа, необходимого для перси-стенции возбудителя в макрофагах), генов «системы жизнеобеспечения» ftsZ и mompS (кодирующих синтез губулиноподобного белка и белка внешней мембраны, соответственно), определенных в результате анализа генома возбудителя ле-гионеллеза, возможно создание специфичных олигонуклеотидпых праймеров и зондов для разработки тест-систем, направленных на индикацию и идентификацию L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.

2. Разработанные тест-системы для выявления ДНК возбудителя легионел-леза методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов (ДНК-мишень - ген mip) и электрофорегической детекцией (ДНК-мишень - ген ftsZ) обеспечивают индикацию L. pneumophila в материале от людей, больных пневмониями неясной этиологии, а также в пробах из объектов окружающей среды в концентрации не ниже 1><103 м.к./мл, со 100 % специфичностью.

3. Созданные гест-системы для идентификации штаммов L. pneumophila методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов (ДНК-мишень - ген ftsZ) и электрофоретической детекцией (ДНК-мишень - ген mompS), позволяют идентифицировать штаммы L. pneumophila и подтвердить первичный положительный ответ (наличие в исследуемой пробе ДНК возбудителя легио-нелллеза), полученный на этапе индикации. Специфическая активность - 1 х 10J м.к./мл, специфичность - 100 %.

4. Сконструированные тест-системы обеспечивают возможность проведения генной диагностики легионеллеза в учреждениях Роспотребнадзора в два этапа: 1. выявление ДНК возбудителя в биологическом материале и объектах окружающей среды («Ген Legionella pneumophila — РЭФ» и «АмплиСенс® Legionella pneumophila-FL»); 2. идентификация штаммов L. pneumophila и подтверждение первичного положительного ответа о наличии в пробе патогена («Ген Legionella pneumophila - РЭФ-идентификация» и «Ген Legionella pneumophila-РГФ-идентификация»).

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Новосибирск, 2005); VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Пстербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации» (Москва, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участпиков СНГ» (Саратов, 2007); Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (Минск, 2007); 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика» (Москва, 2007).

Публикации

Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях, из них 1 - в рекомендованном ВАК издании.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 62 отечественных и 201 зарубежных источников. Общий объем работы составляет 161 страницы компьютерного текста, иллюстрированного 15 таблицами и 10 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Портенко, Светлана Анатольевна

121 ВЫВОДЫ

2. На основании анализа генома L. pneumophila выбраны гены, перспективные для использования в качестве ДНК-мишеней при создании тест-систем для индикации и идентификации возбудителя легионеллеза методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов: ген mip, отвечающий за синтез полипептида 25 кДа, необходимого для персистенции возбудителя в макрофагах, и гены системы «жизнеобеспечения» ftsZ и mompS, кодирующие синтез тубулиноподобного белка и белка внешней мембраны, соответственно.

3. Сконструированы олигонуклеотидные праймеры и зонды для специфической амплификации фрагментов mip и ftsZ генов с регистрацией результатов ПЦР в режиме «реального времени», а также олигонуклеотидные праймеры для выявления генов ftsZ и mompS с детекцией ампликонов методом электрофореза; разработаны оптимальные параметры проведения качественной и количественной ПЦР, обеспечивающие специфическую активность реакции 1x10 м.к./мл при 100 % специфичности.

4. Сконструированы тест-системы для выявления ДНК возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов «Ампли-Сенс® Legionella pneumophila-FL» (ДНК-мишень - ген mip) и электрофоре-тической детекцией «Ген Legionella pneumophila - РЭФ» (ДНК-мишень -ген ftsZ'), для качественного и количественного анализа, характеризующиеся специфической активностью - 1><10 м.к./мл и специфичностью - 100 %.

5. Сконструированы тест-системы для идентификации штаммов L. pneumophila методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов «Ген Legionella /?яешио/?/»7а-РГФ-идентификация» (ДНК-мишень - ген ftsZ) и электрофоретической детекцией «Ген Legionella pneumophila - РЭФидентификация» (ДНК-мишень - ген mompS), характеризующиеся специфической активностью - 1хЮ3 м.к./мл и специфичностью - 100 %.

6. Проведена апробация созданных генодиагностических препаратов при исследовании материала от людей, больных пневмониями неясной этиологии, и проб из объектов окружающей среды; подтверждена их диагностическая ценность: специфическая активность - 1*10J м.к./мл, специфичностью -100 %.

7. Разработан алгоритм двухэтапной генной диагностики легионеллеза, при котором для индикации возбудителя в биологическом материале, объектах окружающей среды и для идентификации штаммов L, pneumophila предусмотрено использование отдельных генамплификационных препаратов, что позволяет осуществлять подтверждение первичного положительного ответа о наличии в пробе L. pneumophila.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаем глубокую благодарность и искреннюю признательность к.б.н., старшему научному сотруднику ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (г. Москва) Светлане Борисовне Яцышиной и д.б.н., профессору, заведующему лабораторией легионеллеза ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (г. Москва) Игорю Семеновичу Тарта-ковскому за консультативную и практическую помощь при выполнении диссертационной работы.

Выражаем благодарность сотрудникам ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Кольцово, Новосибирская обл.): заместителю генерального директора по научной и эпидемиологической работе Александру Николаевичу Сергееву, заведующему отделом диагностики особо опасных инфекций Юрию Васильевичу Туманову, заведующему сектором молекулярной диагностики отдела молекулярной вирусологии флавиви-русов и вирусных гепатитов Владимиру Александровичу Терновому, заведующему лабораторией фило- и аренавирусных инфекций отдела эпидемиологии особо опасных вирусных инфекций Александру Петровичу Агафонову за помощь в апробации разработанных генодиагностических препаратов с электрофоретической детекцией результов при исследовании проб секционного материала, полученного от больных вовремя вспышки легионеллеза в г. Верхняя Пышма (Свердловская обл.).

Искреннюю признательность выражаем сотрудникам ФГУЗ Ставропольского НИПЧИ Роспотребнадзора (г. Ставрополь): Ольге Викторовне Малецкой, Александру Владимировичу Таран, Инне Вилорьевне Савельевой, Людмиле Семеновне Катуниной и сотруднику ФГУЗ Причерноморская противочумная станция (г. Новороссийск, Краснодарский край) Надежде Дмитриевне Темежниковой, за помощь, оказанную в ходе проведения межлабораторных испытаний разработанных генодиагностических препаратов с гибридизационно-флуоресцентной и электрофоретической детекцией результатов, при исследовании проб из объектов окружающей среды и биологического материала.

Выражаем благодарность заведующему кафедрой госпитальной терапии Саратовского государственного медицинского университета, д.м.н., профессору Реб-рову Андрею Петровичу и сотрудникам пульмонологического отделения ГМУ «Областная клиническая больница» (г. Саратов), за помощь в предоставлении образцов биологического материала от больных пневмониями для апробации созданных генодиагностических препаратов.

Глубокую благодарность выражаем заместителю директора ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» к.м.н. Алексею Константиновичу Никифорову за помощью в организации проведения апробации разработанных препаратов на биологическом материале от людей, госпитализированных в ГМУ «Областная клиническая больница» (г. Саратов).

Искренне благодарим сотрудников отдела диагностики инфекционных болезней ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»: заведующую к.б.н. Светлану Анатольевну Щербакову, главного научного сотрудника д.м.н., профессора, заслуженного деятеля науки Российской Федерации Любовь Владимировну Самойлову, с.н.с. к.б.н. Татьяну Васильевну Бу-горкову и других за консультативную и практическую помощь, оказанную в ходе выполнения и оформления данной диссертационной работы, а также за моральную поддержку.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы во многих странах мира наблюдается подъем заболеваемости легионеллезной инфекцией [Покровский В.И. с соавт., 1988; Зайденов A.M. с соавт., 1994; Тартаковский И.С., 2001, Карбышев Г.Л., 2006, Joseph С., 2004, Char-tier B.J.Y. et al., 2007]. В Российской Федерации в июле-августе 2007 г. в г. Верхняя Пышма (Свердловская область) была зарегистрирована вспышка легионеллезной инфекции (202 госпитализированных человека, 4 смертельных исхода) [Беликов Е.С. с соавт., 2008; Онищепко Г.Г. с соавт., 2008].

В большинстве случаев этиологическим агентом легионеллеза (70-90 %) является Legionella pneumophila 1-16 серогрупп, причем на долю возбудителя 1 серогруппы приходится до 90 % зарегистрированных случаев заболевания [Marston В.J., etal., 1994; Fields B.S. etal., 2002].

Установлено, что большинство эпидемиологических вспышек легионеллеза связано с искусственными водными системами (градирни, системы горячего водоснабжения, вихревые ванны, системы кондиционирования и т.д.), в которых возможно образование аэрозоля, контаминированного возбудителем инфекции [Joly Р. etal., 2006; Yaradou D.F., et al., 2007]. Поэтому основным направлением профилактики легионеллезной инфекции является организация регулярного микробиологического мониторинга потенциально опасных водных объектов. При развитии легионеллезной инфекции отсутствует выраженная специфическая симптоматика и изменение клинико-биохимических показателей, что представляет значительные трудности для дифференциальной диагностики. Поэтому важно своевременное выявление возбудителя (антигенов, ДНК и т.д.), либо антител к нему в биологическом материале от людей.

Выделение культуры легионелл занимает до 10-14 дней, причем чувствительность бактериологического анализа при исследовании клинического материала варьирует в пределах 10-80 % [Dicderen B.M.W. et al., 2006]. Иммунологические реакции направлены на выявление L. pneumophila только 1 серогруппы [Plouffe J.F. et al., 1995]. Серологические тесты являются ретроспективными и неэффективны при обследовании людей со сниженным иммунитетом [Franzin L., Scramuzza F., 1995; Yzerman E.P. el al., 2006]. В этой связи особую актуальность приобретает разработка и внедрение в лабораторную практику современных высокочувствительных и специфичных методов индикации и идентификации возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды. Наиболее перспективным решением данной проблемы является использование полимеразной цепной реакции (ПЦР). В настоящее время данные о регистрации ПЦР-тест-систем для детекции возбудителя легионеллеза в Российской Федерации отсутствуют и очевидна необходимость проведения работ по их созданию.

Разработка генодиагностических препаратов включает в себя этапы подбора оптимальных ингредиентов для проведения реакции амплификации, подготовка компонентов тест-системы и определение специфической активности (чувствительности), специфичности и воспроизводимости подготовленного набора реагентов.

Поэтому на первом этапе конструирования тест-систем для выявления и идентификации возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды нами была проведена работа по подготовки целевой коллекции микроорганизмов, включающей 3 референс-штамма L. pneumophila 1, 2 и 3 серогрупп - для определения специфической активности ПЦР, 16 штаммов L. pneumophila различных серогрупп, 2 - Legionella spp. и 126 - гетерологичных микроорганизмов - для оценки специфичности ПЦР. Перечень гетерологичных микроорганизмов охватывает широкий спектр возбудителей, которые могут встречаться в биологическом материале от больных пневмониями и в объектах окружающей среды, представляющих угрозу для заражения человека легиопеллезной инфекцией: 27 родов и 49 видов. Для формирования целевой коллекции были использованы коллекционные штаммы (108) и культуры, выделенные нами на базе лаборатории диагностики инфекционных болезней ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» из 72 проб мокроты и мазков из зева от людей с различными заболеваниями дыхательного тракта (пневмонии, бронхит, респираторная инфекция, ларингит, фарингит и др.) в период 2007-2008 гг. на территории г. Саратова (49).

Для подбора видоспецифичных ДНК-мишеней нами был проведен анализ нуклеотидных последовательностей генов 5S рДНК, 16 S рДНК, 23S-5S, mip L. pneumophila и других видов легионелл, нашедших широкое применение при разработке ПЦР для выявления возбудителя легионеллеза, а также ряда генов системы жизнеобеспечения»: fliC - синтез флагеллина, mompS — синтез белка внешней мембраны, ftsZ - синтез тубулиноподобного белка, dotA -синтез интегрального белка цитоплазматической мембраны DotA, dnaX - синтез тау субъединицы ДНК-полимеразы III, trpS - синтез триптофан 1РНК синтетазы, гроВ - синт ез бета субъединицы ДНК-зависимой РНК-полимеразы, гпр - синтез белкового компонента ри-бонуклеазы Р, ргоА - синтез гамма-глутамил-фосфат редуктазы, gspA - синтез стрессового белка GspA. Для анализа использовали 712 последовательностей генов, представленных в генетической базе данных GenBank NCBI, алгоритмы AlignX и BLAST.

В ходе проведенных исследований установлено, что гены 16 S, 23S и 5S рДНК имеют низкую вариабельность как у штаммов L. pneumophila - не более 2,1 %, так и между L. pneumophila и другими видами легионелл - от 2 до 20 %. Изменения связаны с полиморфизмом единичных нуклеотидов, расположенных на протяжении всего фрагмента.

Гетерогенность фрагмента гена mip размером 496 п.н. у штаммов L. pneumophila составила 8 %. Гомология данного участка между L. pneumophila и другими видами легионелл находилась в пределах 81-69 %, причем вариабельность была обусловлена чередованием полиморфных и вариабельных нуклеотидов сгруппированных от 3 до 15, а также делециями и вставками размером от 3 до 9 п.н. Такая структура гена у различных видов легионелл и то, что локус представлен в хромосоме L.pneumophila в одной копии позволяют рассматривать ген mip в качестве перспективной ДНК-мишсни при разработки ПЦР для выявления возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды с гибри-дизационно-флуоресцентной детекцией результатов с возможностью количественного анализа.

Для изученных фрагментов генов dotA, gspA, гроВ установлена высокая степень вариабельности у штаммов L. pneumophila - 22,4 %, 18 % и 12,3 %, соответственно. Для локусов gspA vifliC гомология с ДНК человека (белой мыши) составила 12-13 %, для фрагментов генов тр, гроВ, ргоА - гомология с ДНК других видов легионелл достигала 92-100 %, а для фрагментов гена dnaX (294-544 н.) и гена ftsZ (196-396 н.) - гомология с ДНК гетерологичных микроорганизмов была до 94 %. Для гена mompS определена мозаичность структуры: первые 337 п.н. и последние

118 п.н. имеют одинаковую последовательность у всех изученных штаммов L. pneumophila, тогда как участок между ними (706 п.н.) включает 88 полиморфных сайтов. Данный локус имеет низкую гомологию с ДНК человека (белой мыши) - 7 %.

На основании проведенного анализа для дальнейшей работы были выбраны фрагмент гена dnaX (с 528 по 1127 нуклеотид в соответствии с полной последовательностью локуса), гена ftsZ (с 397 по 758 нуклеотид), гена mompS (с 2 по 336 нуклеотид), гена trpS (с 511 по 925 нуклеотид). При дополнительном изучении данных участков у штаммов L. pneumophila 17628, 17632, 17599, Bloomington из ГКПБ «Микроб» установлено наличие по всей длине фрагмента гена dnaX 43 полиморфных нуклеотидов (7,2 %) (приложение 1, рисунок 1), гена ftsZ - 5 полиморфных нуклеотидов: G447A, G459A, С516Т, С591Т, А651С (1,4 %), гена mompS- 2 полиморфных нуклеотида: С16Т, G49A (0,6 %), trpS - 13 полиморфных нуклеотидов (3,1 %).

В соответствии с полученными результатами в качестве ДНК-мишеней были выбраны мономорфные участки гена mip (отвечающего за синтез полипептида 25 кДа, необходимого для персистенции возбудителя в микрофагах), генов системы «жизнеобеспечения» ftsZ и mompS (кодирующих синтез тубулиноподобного белка и белка внешней мембраны, соответственно).

Для разработки ПЦР, направленной на выявление возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды, из подобранных раннее ДНК-мишеней выбраны ген ftsZ в случае использования для учета результатов метода электрофореза в агарозном геле, и геи mip — при гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов реакции. Для создания систем идентификации штаммов L. pneumophila методом ПЦР в качестве ДНК-мишеней выступали гены альтернативные первым матрицам: при электрофоретической детекции результатов - локус mompS, при гибридизационно-флуоресцентной - локус ftsZ. На основании пуклеотидных последовательностей этих генов, представленных в генетической базе данных GenBank, и определенных нами ранее были подобраны оли-гонуклеотидные праймеры и зонды.

При оптимизации условий амплификации с выбранными праймерами и зондами варьировали следующие параметры: концентрации праймеров - от 5 до 16 пМ, концентрации зондов - от 1 до 5 пМ, концентрация MgCl2 - от 2 до 3 мМ, концентрация Taq-полимеразы - от 1 до 1,5 ед, температура, при которой определяется уровень флуоресценции в пробах - от 54 до 60 °С, количество циклов, во время которых считывается флуоресценция - от 30 до 40, температура отжига праймеров — от 50 °С до 64 °С, время каждого шага цикла - от 30 до 60 секунд, количество циклов - от 35 до 40, время предварительной денатурации - о г 1 до 5 минут, время завершающей элонгации — от 1 до 7 минут.

Установлено, что если для учета результатов реакции применяли электрофорез в агарозном геле, концентрация праймеров в реакционной смеси составляла 10 пМоль каждого, а при гибридизационно-флуоресцентной детекции - соотношение праймеров и зонда было 3:1. Вне зависимости от способа регистрации результатов наибольший выход ПЦР-продукта наблюдался при осуществлении реакции в присутствии 2,5 мМ ионов Mg2+ и 1 ед. фермента.

Для амплификации фрагмента гена ftsZ с учетом результатов в режиме «реального времени» подобрана следующая программа: предварительная денатурация при температуре 95 °С в течение 5 мин, 10 циклов, включающих 95 °С - 10 с, 60 °С - 20 с, 72 °С - 10 с; 35 циклов, включающих 95 °С - 10 с, 56 °С - 20 с. 72 °С - 10 с, учет уровня флуоресценции при температуре 72 °С в течение последних 35 циклов. Изменение температурного режима регистрации флуоресцентного сигнала связано с форматом используемого в данном случае зонда — TaqMan. Оптимальным значением пороговой линии являлось 0,1.

Для амплификации фрагментов генов ftsZ и mompS с учетом результатов методом электрофореза оптимальной является следующая программа: предварительная денатурация при температуре 95 °С в течение 5 мин, 35 циклов, включающих 95 °С - 40 с, 60 (50) °С - 40 с, 72 °С - 40 с, заключительная достройка цепи при температуре 72 °С в течение 5 мин. Отличие параметров реакции связано с разной температурой отжига праймеров, подобранных на основании данных генов: 60 "С — для гена ftsZ, 50 °С - для гена mompS. Для учета результатов предложено использование 2 % агарозного геля.

Для определения аналитической чувствительности разработанных ПЦР использовали количественно охарактеризованные разведения рекомбинантных плазмид с клонированными фрагментами генов mip, ftsZ, mompS. Клонирование ампли-фицироваиных участков ДНК-мишеней осуществляли в плазмиду pGEM. Помимо этого, тестировали препараты ДНК, выделенные из проб, содержащих L. pneumophila Philadelphia 1 ATCC 33152 (1 серогруппа) пли L. pneumophila Togus-1 ATCC 33154 (2 серогруппа) или L. pneumophila Bloomington-2 ATCC 33155 (3 серогруппа) в концентрации 1 x 103, 1 x 10'', 1 x 103 м.к./мл.

Для характеристики специфичности ПЦР применяли выборку штаммов из подготовленной ранее целевой коллекции микроорганизмов: три референс-шгамма L. pneumophila, 3 штамма — других видов легионелл, 27 штаммов гетерологичных микроорганизмов (по одному представителю для каждого рода, по выбору).

В ходе ряда экспериментов установлено, что специфическая активность и специфичность разработанных ПЦР составили 1x10 м.к./мл и 100 %, соответственно.

Для того, чтобы снизить риск получения ложноотрицательных результатов нами совместно с сотрудниками ЦНИИЭ (г. Москва) для ПЦР с праймерами и зондом па основе нуклеотидной последовательности гена mip проведена работа по созданию системы эндогенного внутреннего контроля и экзогенного внутреннего контроля.

Для создания эндогенного ВК на основании нуклеотидной последовательности гена протромбина человека были подобраны специфичные олигонуклеотидные праймеры и зонд, меченный с 5'-конца флуоресцентной меткой FAM, е З'-конца молекулой гасителя флуоресценции RTQ1. При исследовании проб биологического материала с помощью ПЦР, где в одной смеси находятся праймеры и зонды на основе нуклеотидной последовательности гена mip и фрагмента ДНК человека, регистрация результатов амплификации ДНК легионелл осуществляется по каналу JOE, амплификация эндогенного ВК - по каналу FAM.

Одним из преимуществ эндогенного ВК является возможность оценки адекватности забора материала, поскольку отсутствие амплификации контроля свидетельствует о незначительном количестве клеток человека в пробе или их отсутствии.

Для того, чтобы оценить ингибирующсе действие проб из объектов окружающей среды был разработан экзогенный внутренний контроль (экзогенный ВК), представляющий собой рекомбинантную плазмидную конструкцию, содержащую искусственную нуклеотидную последовательность ДНК, на основе pGEM. Экзогенный ВК добавляется в каждую пробу до начала выделения ДНК и его амплификация осуществляется, также как и в случае эндогенного ВК, в одной пробирке с ДНК-мишеныо. Для регистрации результатов амплификации экзогенного ВК подобраны праймеры и зонд, меченный с 5'-конца флуоресцентной меткой FAM, с 3'-конца молекулой гасителя флуоресценции RTQ1.

Учет потерь ДНК экзогенного ВК позволяет рассчитать реальную концентрацию ДНК L. pneumophila в каждом образце воды при осуществлении количественного ПЦР-анализа. В качестве калибраторов для проведения количественной ПЦР могут служить десятикратные разведения препарата плазмиды с клонированным фрагментом гена mip с точно определенной концентрацией копий ДНК.

На основании полученных результатов нами разработаны тест-системы для выявления возбудителя легионеллеза в биологическом материале и пробах из объектов окружающей среды методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизацион-по-флуоресцентным учетом результатов: «Ген Legionella pneumophila - РЭФ» и «АмплиСенс® Legionella pneumophila-FL», соответственно, а также для идентификации штаммов L. pneumophila с подтверждением первичного положительного ответа, полученного на этапе индикации патогена, методом ПЦР: «Ген Legionella pneumophila - РЭФ-идентификация» (учет результатов с помощью электрофореза) и «Ген Legionella pneumophila - РГФ-идентификация» (учет резуль татов по накоплению флуоресценции).

Изучение специфической активности разработанных препаратов проводили на препаратах ДНК, выделенных из бактериальных суспензий штаммов L. pneumophila Philadelphia 1 АТСС 33152, Togus 1 АТСС 33154 и Bloomington 2 АТСС 33155, с концентрацией 1 х 103 - 1 х 105 м.к./мл.

Оценку специфичности осуществляли, используя подготовленную ранее целевую коллекцию микроорганизмов, включающую 19 штаммов L. pneumophila различных серогрупп, три штамма Legionella spp., 126 штаммов гетерологичных микроорганизмов. Помимо этого, для определения эффективности разработанных тест-систем исследовали биологический материал (мокрота, бронхоальвеолярный ла-важ, кровь) и пробы из объектов окружающей среды (вода открытых водоемов, смывы с кондиционера), искусственно инфицированные L. pneumophila Philadelphia 1 АТСС 33152 до конечной концентрации lxlO5, lxlO'1, lxlOJ м.к./мл, а также L. dumoffi АТСС 33343 TEX-KL и L. micdadei АТСС 33218 TATLOCK, в концену трации 1x10 м.к./мл.

Установлено, что при проведении исследований с помощью тест-систем «Ген Legionella pneumophila - РЭФ» и «Ген Legionella pneumophila — РЭФ-идентификация» образование специфичных ампликонов размером 185 и 335 п.н. наблюдалось только в пробах, содержащих L. pneumophila всех серогрупп, вне зависимости от вида материала. Со всеми гетерологичными микроорганизмами и тремя видами Legionella spp. с данными препаратами получен отрицательный результат.

При использовании тест-систем «АмплиСенс L.pneumophila -FL» и «Ген Legionella pneumophila - РГФ-идентификация» специфическая флуоресценция по каналам JOE и ROX, соответственно, регистрировалась только при анализе препаратов ДНК, выделенных из проб, содержащих L. pneumophila всех серогрупп. С препаратами ДНК гетерологичных микроорганизмов и выделенных из проб биологического материала и объектов окружающей среды, контаминированными двумя видами Legionella spp., во всех случаях отсутствовал сигнал флуоресценции.

В тоже время, при работе с тест-системой «АмплиСснс® Legionella рпеито-phila-VL» по каналу FAM во всех случаях наблюдали сигнал флуоресценции, что указывает на амплификацию эндогенного или экзогенного ВК и свидетельствует об отсутствии в пробе ингибиторов ПЦР. Поэтому всс полученные отрицательные результаты можно считать истинными. Чувствительность реакции со всеми тест3 системами составила 1x10 м.к./мл, как при исследовании чистых культур, так и проб биологического материала и объектов окружающей среды.

Во всех случаях первичные положительные ответы, полученные с помощью тест-систем «Ген Legionella pneumophila - РЭФ» и «АмплиСенс® Legionella рпеи-mophila-Fh», были подтверждены при использовании тест-систем «Ген Legionella pneumophila — РЭФ-идснтификация» и «Геп Legionella pneumophila - РГФ-идентификация».

Для изучения диагностической ценности разработанных тест-систем были проведены исследования проб биологического материала от людей (мазки со слизистых носоглотки, ротоглотки, мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, кровь, моча, секционный материал) и из объектов окружающей среды (смывы и пробы воды из систем питьевого и технического водоснабжения, градирни, отопления и кондиционирования).

В результате апробации сконструированных тест-систем «Ген Legionella pneumophila — РЭФ» и «АмплиСенс® Legionella pneumophila-FL», при исследовании материала от людей, больных пневмониями неясной этиологии, и проб из объектов окружающей среды, установлена их диагностическая ценность: специфическая активность составила 1x10 м.к./мл, специфичность - 100 %.

В результате проведенных исследований нами разработан алгоритм двух-этаппой генной диагностики легионеллеза, при котором для индикации возбудителя в биологическом материале и объектах окружающей среды, а также и для идентификации штаммов L. pneumophila, предусмотрено использование отдельных ге-намплификациопных препаратов.

Предложенный алгоритм позволяет проводить генную диагностику легионеллеза в учреждениях Роспотребнадзора в соответствии с приказом № 88 («О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней» от 17.03.08). Проведение первого этапа исследования, предусматривающего индикацию легионелл в биологическом материале и объектах окружающей среды (с определением концентрации возбудителя), осуществляется на базе учреждений местного (территориального) уровня с помощью тест-систем «Геп Legionella pneumophila — РЭФ» или «АмплиСенс® Legionella pneumophila-FL». Второй этап, включающий идентификацию штаммов L. pneumophila и/или подтверждение первичного положительного ответа, полученного на первом этапе исследования, проводится в учреждениях Роспотребнадзора регионального (федерального) уровня, в этом случае применяют тест-системы «Ген Legionella pneumophila - РЭФ-идентификация» или «Ген Legionella риеитор/г/Лз-РГФ-идентификация».

Таким образом, итогом нашей работы стала разработка препаратов для генной диагностики легионеллеза методом ПЦР, а также методических подходов, обеспечивающих высокую точность и достоверность проведения ПЦР-анализа с их использованием.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Портенко, Светлана Анатольевна, Саратов

1. Ашмарин И. П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях / Л.: Медгиз, 1962. 180 с.

2. Беликов Е.С., Трифонова А.Г., Коцурак Л.М., Беликов И.Е., Михайлова Д.О. Патологическая анатомия легионеллезной пневмонии по материалам вспышки в г. Верхняя Пышма // ЖМЭИ. 2008. -№ 2. - С. 105-107.

3. Вишнякова Л. А, Путов Н. В. Этиология острых пневмоний. // Тер. архив. 1990. -№ 3. - С. 15-18.

4. Воронина О.Л., Кунда М.С., Лунин В.Г., Карпова Т.И., Тартаковский И.С. Молекулярно-генетическое типирование штаммов Legionella pneumophila и Legionella spp., выделенных на территории Российской Федерации // КМАХ. 2008. - Том 10. - № 2. - С. 154-162.

5. Воронина О.Л., Лунин В.Г. Молекулярно-генетическое типирование Legionella pneumophila серогруппы 1, выделенных в г. Верхняя Пышма, с использованием международных стандартов // ЖМЭИ. 2008. - № 2. - С. 20-23.

6. Герхард Ф. Методы общей бактериологии / Пер. с англ. М.: Мир, 1983. -Т. 1. - 536 с.

7. Герхард Ф. Методы общей бактериологии / Пер. с англ. М.: Мир, 1984. -Т. 3.-264 с.

8. Голубев Б.П. Экологические аспекты распространения вибрионов эль-тор в объектах окружающей среды. Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1993. - 24 с.

9. Григорьев А.А., Бондарев В.П., Борисевич И.В., Дармов И.В., Миронин А.В., Золотарев А.Г., Погорельский И.П., Янов Д.С. Умеренный легионел-лезпый бактериофаг: обнаружение и свойства // ЖМЭИ. 2008. - № 4. - С. 86-88.

10. Григорьев А.А., Бондарев В.П., Дармов И.В., Миронин А.В., Золотарев А.Г., Погорельский И.П., Янов Д.С. Умеренный легионеллезный бактериофаг: обнаружение и свойства // Проблемы ООП. 2007. - Вып. 94. - С. 4649.

11. Домотенко JI.B., Морозова Т.П., Сапогова А.В., Еруслаиов Б.В., Храмов М.В. Легионелбакагар: возможности и перспективы // ЖМЭИ. 2008. - № 2. -С. 62-66.

12. Дуков JI. Г., Борохов А. И. Диагностические и лечебно-тактические ошибки в пульмонологии / М.: Медицина, 1988. С. 272.

13. Дяченко С. С. Микробиологические методы диагностики инфекционных заболеваний / Киев: Медгиз, 1962. С. 534.

14. Замогаев И. П. Острые пневмонии / Болезни органов дыхания. / Под. ред. Н.Г. Палеева / М.: Медицина, 1989. Т. 2. - С. 17-102.

15. Карбышев Г.Л., Терентьев А.Н., Веркина Л.М., Симонова И.Р., Кочеткова А.Г1., Наркевич А.Н., Лысова Л.К., Ларионова Л.В. Серологическая диагностика легионеллеза // ЖМЭИ. 2008. - № 2. - С. 46-50.

16. Карпова Т.И., Дронина Ю.Е., Тартаковский И.С., Романова Ю.М., Гинцбург АЛ. Природные биопленки легионелл и их роль в эпидемиологии инфекции: методы изучения и моделирования // ЖМЭИ. 2008. - № 2. - С. 13-16.

17. Лабинская А. С. Практическое руководство по микробиологическим методам исследования / М.: Медгиз, 1963. 463 с.

18. Лабинская А. С., Блинкова Л.П. Ещина А.С. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований / М.: Медицина, 2005.-600 с.

19. Ломов Ю.М., Карбышев Г.Л., Терентьев А.Н. Критерии диагностики болезни легионеров // Мат. VIII Межгосударственной науч.-практ. конф., 3-5 октября 2006 г. Оболенск. - С. 217-218.

20. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование / Пер. с англ. М.: Мир, 1984. - 479 с.

21. Михайлова Д.О., Лещенко И.В., Бобылева З.Д., Скляр М.С., Бубнова Е.М. Первая вспышка легионеллезной инфекции в Свердловской области. Алгоритм диагностики и лечения // Уральский медицинский журнал. 2007. -Вып. 8.-С. 4-10.

22. Никонов Б.И., Романенко В.В., Жукова Ю.В., Дурасова А.Л., Астахова Т.С., Гаранина С.Б. ПЦР-диагностика при расследовании вспышки легионеллеза // ЖМЭИ. 2008. - № 2. - С. 44-46.

23. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса / Пер. с англ. М.: Мир, 1999. - В 2 томах. - 800 с.

24. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультра-центрифугирование / М.: Мир, 1981. 120 с.

25. Прозоровский С.В., Васильева В.И., Тартаковский И.С. Выявление болезни легионеров на территории СССР // Журн. микробиол. — 1980. № 7. -С.105-107.

26. Покровский В.И., Прозоровский С.В., Малеев В.В., Тартаковский И.С. Этиологическая диагностика и этиотропная терапия острых пневмоний / М.: Медицина, 1995.- 246 с.

27. Покровский В.И., Прозоровский С.В., Тартаковский И.С., Беленький С.Н., Акулов К.Н., Сучков Ю.Г., Котова Е.А., Калашников И.П., Васильева

28. B.И., Русакова Е.В., Ташпулагов Р.Ю., Маракуша Б.И., Радченко О.В., Белый Ю.Ф., Бархатова О.И., Брудный Р.А., Гальцева Г.В., Темежникова Н.Д. Вспышка легионеллезной инфекции в Армавире // ЖМЭИ. 1988. - № 10.1. C. 24-27.

29. Прозоровский С.В., Покровский В.И., Тартаковский И.С. Болезнь легионеров (легионеллез). М.: Медицина, 1984. - 207 с.

30. Пушкарева В.И. Патогенные бактерии в почвенных и водных сообществах (экспериментально-экологическое исследование): Автореф. дис. . докт. биол. наук. М., 1994. - 24 с.

31. Романенко В.В., Дурасова A.JL, Оленева Е.А., Жукова Ю.В., Мотус Т.М. Лабораторная диагностика при расследовании вспышки внебольничной пневмонии в г. Верхняя Пышма // ЖМЭИ. 2008. - № 2. - С. 54-56.

32. Тартаковский И.С. Болезнь легионеров: итоги 25-легнего изучения инфекции, проблемы и перспективы исследования // Вест. РАМН 2001. -Выпуск 11.-С. 11-14.

33. Тартаковский И.С. Современные подходы к диагностике атипичных пневмоний // КМАХ 2000. - Выпуск 1 (2). - С. 60-68.

34. Тартаковский И.С., Бархатова О.И., Темежникова Н.Д., Радченко О.В. Легионеллез // Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных заболеваний. Саратов. - 1998. - С. 166-173.

35. Тартаковский И.С., Синопальников А.И. Легионеллез // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.- 2001. Т. 3,- №1.- С. 4-16.

36. Тартаковский И.С., Темежникова Н.Д., Карпова Т.И. Легионеллез: проблемы и перспективы лабораторной диагностики // Проблемы особо опасных инфекций. 2005. - Выпуск 2 (90). - С. 17-23.

37. Темежникова Н.Д. Диагностика легионеллеза в Краснодарском крае: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1994. - 24 с.

38. Темежникова Н.Д. Лабораторная диагностика легионеллеза (обзор литературы) // Клин. лаб. диаги. 2008. - № 11. - С. 34-39.

39. Федоров Ю.Н., Янов Д.С., Кибирев Я.А., Филиппов Н.И. // Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней. — Саратов, 2003.-С. 184-185.

40. Чураков А.А., Куличенко А.Н., Казакова Е.С., Серебряник Н.Е., Суворов А.П., Глыбочко П.В., Кутырев В.В. К вопросу о лабораторной диагностике урогениталыюго хламидиоза // Клиническая лабораторная диагностика. 2005. - №2. - С.22-26.

41. Яфаев Р.Х., Зуева П. П. Эпидемиология внутрибольничной инфекции -Л.: Медицина, 1989. 168 с.

42. Методические указания по выявлению бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды. МУК 4.2.22-17-01. М,- 2007.

43. Клиника, лечение и диагностика легионеллеза. Методические рекомендации. М. - 1987. - С. 34.

44. Методические рекомендации по лабораторной диагностике легионеллеза (болезни легионеров). М. - 1987. - С. 30.

45. Приказ № 535 МЗ СССР от 22.04.1985. Об унификации микробиологических (бактериологических) исследований, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений. -М.- 1985.- С. 126.

46. Эпидемиологический надзор за легионеллезной инфекцией. Методические указания МУ 3.1.2.2412-08. М. - 2008. - С. 42.

47. EWGLI (http://www.ewgli.org)

48. The genomic sequence of the accidental pathogen Legionella pneumophila, http.V/www.sciencemag. org/cgi/data/305/5692/1966/DC1/1

49. Abraham W.R. Controlling biofilms of gram-positive pathogenic bacteria // Curr.Med. Chem.-2006.-Vol. 13, № 13. P. 1509-1524.

50. Abu-Zant A., Asare R., Graham J.E., Abu Kwaik Y. Role for RpoS but not RelA of Legionella pneumophila in modulation of phagosome biogenesis and adaptation to the phagosomal microenvironment. // Infect. Immun. 2006. - Vol. 74, № 5.-P. 3021-3026.

51. Adeleke A., Pruckler J., Benson R., Rowbotham Т., Halablad M., Fields B. Legionella-like amebal pathogens phylogenetic status and possible role in respiratory disease // Emerg. Infect. Dis. - 1996. - Vol. 2. - P. 225-230.

52. Al-Ali M.K., Batchoun R.G., Al-Nour T.M. Etiology of community-acquired pneumonia in hospitalized patients in Jordan // Saudi Med J. 2006. -Vol. 27(6).-P. 813-816.

53. Aoki S., Hirakata Y., Miyazafi Y., Izumikawa K., Yanagihara K., Tomono K., Yamada Y., Tashiro Т., Kohno S., Kamihira S. Detection of Legionella DNA by PCR of whole-blood samples in a mouse model // J. Med. Microbiol. 2003. -Vol. 52.-P. 325-329.

54. Arancibia H.F., Diaz P.O. Severe community-acquired pneumonia in adults // Rev. Chilena. Infectol. 2005. - Vol. 22. - P. 46-51.

55. Atlas R.M. Legionella: from environmental habitats to disease pathology: detection and control // J. Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 1 (4). - P. 283-293

56. Ballard A.L., Fry N.K., Chan L„ Surman S.B., Lee J.V., flarrison T.G., Towner K.J. Detection of Legionella pneumophila using a real-time PCR hybridization assay // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38, № 11. - P. 4215-4218.

57. Barbeau J., Gauthier C., Payment P. Biofilms, infectious agents, and dental unit walerlines: a review // Can. J. Microbiol. 1998. - Vol. 44, № 11. - P. 101928.

58. Barka N.J., Tomasi J.P., Stadtsbaeder S. ELISA using whole Legionella pneumophila cell as antigen. Comparison between monovalent and polyvalent angens for the serodiagnosis of human legionellosis // J. Immunol. Methods. 1986. -Vol. 93.-P. 77-81.

59. Benson R.F., Fields B.S. Classification of the genus Legionella II Semin. Respir. Infect. 1998. - Vol. 13, № 2. - P. 90-99.

60. Berdal B.P., Farshy C.E., Feeley J.C. Detection of Legionella pneumono-phila antigen in urine by enzyme-linked immunospecific assay // J. Clin. Microbiol. 1979. - Vol. 9, №5.-P. 575-578.

61. Berry D., Xi C., Raskin L. Microbial ecology of drinking water distribution systems // Curr. Opin. Biotechnol. 2006. - Vol. 17, № 3. - P. 297-302.

62. Bodmann K.F. Beatmungsassoziierte pneumonie prevention und diagnostic // Dtsch. Med. Wochenschr. - 2002. - Vol. 127. - P. 744-777.

63. Bohte R., van Furth R., van den Broek P.J. Aetiology of community-acquired pneumonia: a prospective study among adults requiring admission to hospital // Thorax. 1995. - Vol. 50, № 5. - P. 543-547.

64. Boom R., Sol C. J., Salimans M. M., et al., Rapid and simple method for purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28. - P. 495 -503.

65. Borella P., Guerrieri E., Marchesi I., Bondi M., Messi P. Water ecology of Legionella and protozoan: environmental and public health perspectives // Biotechnol. Annu. Rev. 2005. - Vol. 11. - P. 355-380.

66. Brassinga A.K., Hiltz M.F., Sisson G.R. et al. A 65-kilobase pathogenicity island is unique to Philadelphia-1 strains of legionella pneumophila // J Bacteriol. -2003.-Vol. 185.-P. 4630-4637.

67. Brenner D.J., Steigerwalt A.G., Gorman G.V. Ten new species of Legionella U Int. J. Syst. Bacteriol. 1985. - Vol. 35. - P. 50-59.

68. Brenner D.J., Steigerwalt A.G., McDade .Т.Е. Classification of the Legionnaires' disease bacterium: Legionella pneumophila, genus novum, species nova, of the family Legionellaceae, familia nova // Ann. Intern. Med. 1979. - Vol. 90, № 4.-P. 656-658.

69. Cazalet C., Buchrieser C. Genomics of Legionella pneumophila // Pathoge-nomics-Genome analysis of pathogenic microbes. Wiley-VCH Verlag GmbH&Co. KGaA, Weinheim. - 2006. - P. 125-152.

70. Cazalet C., Jarraud S., Ghave-Helm Y. et al. Multigenome analysis identifies a worldwide distributed epidemic Legionella pneumophila clone that emerged within a highly diverse species. Genome res. - 2008. - Vol. 18. - P. 431-441.

71. Chartier B.J.Y., Lee J.V., Pond K., Surman-Lee S. Legionella and the prevention of legionellosis // WHO. 2007. - P. 268.

72. Cheng Y.W., Chan R.C., Wong P.K. Disinfection of Legionella pneumophila by photocatalytic oxidation // Water. Res. 2007. - Vol. 41, № 4. - P. 842852.

73. Cirillo M., Bermudez L.E., El-Etr S.H. et al. Legionella pneumophila entry gene rtxA is involved in virulence. Infect Immun. - 2001. - Vol. 69. - P. 508517.

74. Cloud J.L., Carrol K.C., Pixton P., Erali M., Hyllyard D.R. Detection of Legionella species in respiratory specimens using PCR with sequencing confirmation// J. Clin. Microbiol. -2000. -Vol. 38, №5. -P. 1709-1712.

75. Cunha В.A. The atypical pneumonias: clinical diagnosis and importance // Clin. Microbiol. Infect. 2006. - Vol. 12. - P. 312-324.

76. Declerck P., Behels J., De Keersmaecker В., Ollevier F. Receptor-mediated uptake of Legionella pneumophila by Acanthamoeba castellanii and Naegleria lo-vaniensis II J. Appl. Microbiol. 2007. - Vol. 103, № 6. - P. 2697-2703.

77. Den Boer J.W., Yzerman E.P. Diagnosis of Legionella infection in Legionnaires' disease // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2004. - Vol. 23, № 12. - P. 871-878.

78. De Ory F., Guisasola M.E., Eiros J.M.Detection of Chlamydophila pneumoniae IgG in paired serum samples: comparison of serological techniques in pneumonia cases // APMIS. 2006. - Vol. 114, № 4. - P. 279-284.

79. Diederen B.M., Peeters M.F. Evaluation of the SAS Legionella Test, a new immunochromatographic assay for the detection of Legionella pneumophila serogroup 1 antigen in urine // Clin. Microbiol. Infect. 2007. - Vol. 13, № 1. - P. 8688.

80. Diederen B.M.W., de Jong C.M.A., Kiuytmans J.A.J.W. et al. Detection and quantification of Legionella pneumophila DNA in serum: case reports and review of the literature / J. Med. Microbiol. 2006. - Vol. 55. - P. 639-642.

81. Edelstein P.H. Improved semiselective medium for isolation of Legionella pneuniophila from contaminated clinical and environmental specimens // J. Clin. Microbiol. 1981.-Vol. 14, № 3. - P. 298-303.

82. Edelstein P.H. Antimicrobial chemotherapy for legionnaires' disease: a review // Clin. Infect. Dis. 1995. - Vol. 21, № 3. - P. 256-276.

83. Edelstein P.H., Edelstein M.A. In vitro activity of quinupristin/dalfopristin (Synercid, RP 59500) against Legionella spp. II Diagn. Microbiol. Infect. Dis. -2000. Vol. 36, № 1. - P. 49-52.

84. Erdogan H., Arslan H. Colonization of Legionella species in hotel water systems in Turkey // Travel. Med. 2007. - Vol. 14, № 6. - P. 369-373.

85. Ewig S., Dalhoff K., Lorenz J. Nosokomiale pneumonie: empfehlungen zur therapie und prophylaxe // Pneumologie. 2000. - Vol. 54. - P. 525-538.

86. Faris В., Faris C., Schousboe M., Heath C.FI. Legionellosis from Legionella pneumophila serogroup 1 // 3 Emerg. Infect. Dis. 2005. - Vol. 11, № 9. - P. 1405-1409.

87. Feeley J.C., Gibson R.J., Gorman G.W., Langford N.C., Rasheed J.K., Mackel D.C., Baine W.B. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila II J. Clin. Microbiol. 1979. - Vol. 10, № 4. p. 437. 441.

88. Fields B.S., Benson R.F., Besser R.E. Legionella and legionnaires'disease: 25 years of investigation // Clin. Microbiol. Rev. 2002. - Vol. 15. - P. 506-526.

89. Fischer G., Bang H., Ludwig В., Mann K., Hacker J. Mip protein of Legionella pneumophila exhibits peptidyl-prolyl-cis/trans isomerase (PPlase) activity // Mol. Microbiol. 1992.-Vol. 6, № 10.-P. 1375-1383.

90. Franzin L., Scramuzza F, Prevalence of Legionella pneumophila serogroup 1 antibodies in blood donors // Eur. J. Epidemiol. 1995. - Vol. 11. - P. 475-478.

91. Fox K.F., Brown A. Application of numerical systematics to the phenotypic differentiation of legionellae // J. Clin. Microbiol. 1989. - Vol. 27, №> 9. - P. 1952-1955.

92. Friedman H., Yamamoto Y., Klein T.W. Legionella pneumophila pathogenesis and immunity // Semin. Pediatr. Infect. Dis. 2002. - Vol. 13, № 4. - P. 273-279.

93. Fry N.K., Warwick S., Saunders N.A., Embley T.M. The use of 16S ribo-somal RNA analyses to investigate the phylogeny of the family Legionellaceae // J. Gen. Microbiol.-1991.-Vol. 137, №5.-P. 1215-1222.

94. Gaia V., Fry N. K., Afshar B. Consensus sequence-based scheme for epidemiological typing of clinical and environmental isolates of Legionella pneumophila // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43, № 5. - P. 2047-2052.

95. Gaia V., Poloni С., Peduzzi R. Epidemiological typing of Legionella pneumophila with ribotyping. Report of two clinical cases // Eur. J. Epidemiol. 1994. -Vol. 10, №3,- P. 303-306.

96. Gant V.A., Wren M.W., Rollins M.S., Jeanes A., Hickok S.S., Hall T.J.Three novel highly charged copper-based biocides: safety and efficacy against healthcare-associated organisms // J. Antimicrob. Chemother. 2007. - Vol. 60, № 2. - P. 294-299.

97. George J.R., Pine L., Reeves M.W., flarrell W.K. Amino acid requirements of Legionella pneumophila II J. Clin. Microbiol. 1980. - Vol. 11, № 3. - P. 286291.

98. Gorelik O., Lazarovich Z., Boldur I., Almoznino-Sarafian D., Alon I., Mo-dai D., Cohen N. Legionella in two splenectomized patients. Coincidence or causal relationship? // Infection. 2004. - Vol. 32, № 3. - P. 179-181.

99. Guyot S., Goy J.J., Gcrsbach P., Jaton K., Blanc D.S., Zanetti G. Legionella pneumophila aortitis in a heart transplant recipient // Transpl. Infect. Dis. 2007. -Vol. 9, № l.-P. 58-59.

100. Harrison T.G., Doshi N. Evaluation of the Bartels Legionella Urinary Antigen enzyme immunoassay // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2001. - Vol. 20, № 10.-P. 738-740.

101. Hebert G.A. Hippurate hydrolysis by Legionella pneumophila // J. Clin. Microbiol. 1981.-Vol. 13, № 1.-P. 240-242.

102. Helbig J.H., Benson R.F., Pelaz C., Jacobs E., Luck P.C. Identification and serotyping of atypical Legionella pneumophila strains isolated from human and environmental sources//J. Appl. Microbiol. 2007 -Vol. 102, № l.-P. 100-105.

103. Hindre Т., Briiggemann H., Buchrieser C., Hechard Y. Transcriptional profiling of Legionella pneumophila biofilm cells and the influence of iron on biofilm formation // Microbiology. 2008. - Vol. 154, № 1. - P. 30-41.

104. Hoonan K.E., Beck C., Plolzmayer T.A. Quantitative analyses of MDR 1 (multidrug resistance) gene expression in human tumor by polymerase chain reaction//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - P. 7160-7164.

105. Hwang M.G., Katayama IT, Ohgaki S. Inactivation of Legionella pneumophila and Pseudomonas aeruginosa: evaluation of the bactericidal ability of silver cations // Water. Res. 2007. - Vol. 41, № 18. - P. 4097-4104.

106. Jaschek G.,Gaydos C.A.,Welsh L. et al. Direct detection of in urine specimens from symptomatic and asymptomatic men by using a rapid polymerase chain reaction assay //J. Clin. Microbiol. 1993. - V.31. - P.1209-1212.

107. Jaulhac В., Nowicki M., Bornstein N., Meunier O., Prevost G., Piemont Y., Fleurette J., Monteil H. Detection of Legionella spp. in bronchoalveolar lavage fluids by DNA amplification // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30, № 4. - P. 920-924.

108. Jennings L.C., Anderson T.P., Beynon K.A., Chua A., Laing R.T., Werno A.M., Young S.A., Chambers S.T., Murdoch D.R. Incidence and characteristics of viral community-acquired pneumonia in adults // Thorax. 2008. - Vol. 63, № 1. -P. 42-48.

109. Jimenez-Lucho V., Shulman M., Johnson J. Bordetella bronchiseptica in an AIDS patient cross-reacts with Legionella antisera // J. Clin. Microbiol. 1994. -Vol. 32, № 12. - P. 3095-3096.

110. Jimenez P.P., Calvo A.M. Microbiologic diagnosis of community-acquired pneumonia in adults // Rev Chilena Infectol. 2005. - Vol. 22. - P. 32-38.

111. Jonas D., Rosenbaum A., Weyrich S., Bhakdi S. Enzyme-linked immunoassay for detection of PCR-amplified DNA of legionellae in bronchoalveolar fluid // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33, № 5. - P. 1247-1252.

112. Jones T.F., Benson R.F., Brown E.W., Rowland J.R., Crosier S.C., Schaff-ner W. Epidemiologic investigation of a restaurant-associated outbreak of Pontiac fever//Clin. Infect. Dis.-2003.-Vol. 15.-P. 1292-1297.

113. Joseph C.A. Legionnaires' disease in Europe 2000-2002 // Epidemiol. Infect. 2004. - Vol. 132.-P. 417-424.

114. Kawano K., Okada M., Kura F., Amemura-Maekawa J., Watanabc H. Largest outbreak of legionellosis associated with spa baths: comparison of diagnostic tests. // Kansenshogaku. Zasshi. 2007. - Vol. 81, № 2. - P. 173-182.

115. Kazandjian D., Chiew R., Gilbert G.L. Rapid diagnosis of Legionella pneumophila serogroup 1 infection with the Binax enzyme immunoassay urinary antigen test // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35, № 4. - P. 954-956.

116. Kellog D.E., Sninsky J.J., Kwok Quantitation of HIV 1 proviral DNA relative to cellular DNA by the polymerase chain reaction // Anal. Biochem. 1990. -Vol. 189.-P. 202-208.

117. Kessler H.H., Reinthaler F.F., Fschaid A. et al. Rapid detection of Legionella species in bronchoalveolar lavage fluids with the EnviroAmp Legionella PCR amplification and detection kit // J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol. 31. - P. 33253328.

118. Klont R.R., Rijs A.J., Warris A., Sturm P.D., Melchers W.J., Verweij P.E. Legionella pneumophila in commercial bottled mineral water // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2006. - Vol. 47, № 1. - P. 42-44.

119. Koide M., Saito A., Kusano N. et al. Detection of Legionella spp. In Cooling tower water by the polymerase chain reaction method // Appl. Enviroment. Microbiol. 1993.-Vol. 59, N6.-P. 1943-1946.

120. Ко K.S., Hong S.K., Lee H.K, Park M.-Y., Kook Y.-H. Molecular evolution of the dotA gene in Legionella pneumophila // J. Bacteriol. 2003. - Vol. 185, №21.-P. 6269-6277.

121. Ко K.S., Miyamoto H., Lee H.K., Park M.Y., Fukuda K., Park В.Т., Kook Y.H. Genetic diversity of Legionella pneumophila inferred from rpoB and dotA sequences // Clin. Microbiol. Infect. 2006. - Vol. 12, № 3. - P. 254-261.

122. La Scola В., Birtles R.J., Greub G., Harrison T.J., Ratcliff R.M., Raoult D. Legionella drancourtii sp.nov., a strictly intracellular amoebial pathogen // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. - Vol. 54, № 3. - P. 699-703.

123. Lebeau I., Lammertyn E., De Buck E., Maes L., Geukens N„ Van Mellaert L., Arckens L., Anne J., Clerens S. First proteomic analysis of Legionella pneumophila based on its developing genome sequence // Res. Microbiol. 2005. -Vol. 156, № l.-P. 119-129.

124. Lee T.C., Vickers R.M., Yu V.L., Wagener M.M. Growth of 28 Legionella species on selective culture media: a comparative study // J. Clin. Microbiol. -1993.-Vol. 31, № 10.-P. 2764-2768.

125. Lindsay D.S., Abraham W.H., Fallon R.J. Detection of mip gene by PCR for diagnosis of Legionnaires' disease // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. - P. 3068-3069.

126. Liu Y.N., Chen M.J., Zhao T.M. et al. A multicenter study on the pathogenic agents in 665 adult patients with community-acqired pneumonia in cites of China // Zhonghua Jie He He HuX: Za Zhi. 2006. - Vol. 29(1). - P. 3-8.

127. Lo Presti F., Riffard S., Vandenesch F., Reyrolle M., Ronco E., Ichai P., Etienne J. The first clinical isolate of Legionella parisiensis, from a liver transplant patient with pneumonia // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35, № 7. - P. 1706-1709.

128. Loret J.F., Robert S., Thomas V., Cooper A.J., McCoy W.F., Levi Y. Comparison of disinfectants for biofilm, protozoa and Legionella control // J. Water. Health. 2005. - Vol. 3, № 4. - P. 423-433. '

129. Lowry P.W., Tompkins L.S. Nosocomial legionellosis: a review of pulmonary and extrapulmonary syndromes. // Amer. J. of Infect. Contr. 1993. - Vol. 21, № l.-P. 21-27.

130. Luck P.C., Helbig J.H., Ehret W., Ott M. Isolation of a Legionella pneumophila strain serologically distinguishable from all known serogroups // Zentralbl. Bakteriol. — 1995.-Vol. l.-P. 35-39.

131. Luck P.C., Schneider Т., Wagner J., Walther I., Reif U., Weber S., Weist K. Community-acquired Legionnaires' disease caused by Legionella pneumophila se-rogroup 10 linked to the private home // J. Med. Microbiol. 2008. - Vol. 57, № 2.-P. 240-243.

132. Ma'ayeh S.Y., Al-Hiyasat A.S., Hindiyeh M.Y., Khader Y.S. Legionella pneumophila contamination of a dental unit water line system in a dental teaching centre // J. Int. Dent. Hyg. 2008. - Vol. 6, № 1. - P. 48-55.

133. Marra A., Blander S.J., Horwitz M.A., Shuman H.A. Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1992. Vol. 15, № 89. - P. 96079611.

134. Matsiota-Bernard P., Waser S., Vrioni G. Detection of Legionella pneumophila DNA in urine and serum samples from patients with pneumonia // Clin. Microbiol. Infect. 2000. - Vol. 6. - P. 223-225.

135. McDade J.E., Shepard C.C., Fraser D.W., Tsai T.R., Rcdus M.A., Dowdle W.R. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease // N. Engl. J. Med. 1977. - Vol. 297, № 1. - P. 11971203.

136. Mclntyre M., Kurtz J.B., Selkon J.B. Prevalance of antibodies to 15 antigens of Legionellaceae in patients with community-acquired pneumonia // Epidemiol. Infect. 1990. - Vol. 104, № 1. - P. 39-45.

137. McNaught В., Ricketts K., Joseph C. European surveillance of travel associated Legionnaire's disease // Abstract from 21st Annual Meeting of the European Working Group for Legionella Infections. 2005. - P. 16.

138. Marston B.J., Lipraan H.B., Breiman R.F. Surveillance for Legionnaires' disease. Risk factors for morbidity and mortality // Arch Intern Med. 1994. -Vol. 14.-P. 2417-2422.

139. Mermel L.A., Joscphson S.L., Giorgio C.H., Dempsey J., Parenteau S. Association of Legionnaires' disease with construction: contamination of potable water? // Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 1995. - Vol. 16, № 2. - P. 76-81.

140. Molofsky A.B., Swanson M.S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle // Mol. Microbiol. — 2004. Vol. 53, № 1. — P. 29-40.

141. Muder R.R., Yu V.L. Infection due to Legionella species other than L. pneumophila // Clin. Infect. Dis. 2002. - Vol. 15. - P. 990-998.

142. Murdoch D.R. Diagnosis of Legionella infection // Clin. Infect. Dis. 2003. -Vol. 36, № l.-P. 64-69.

143. Murdoch D.R., Walford E.J., Jennings L.C. et al. Use of the polymerase chain reaction to detect Legionella DNA in urine and serum samples from patients with pneumonia // Clin. Infect. Dis. 1996. - Vol. 23. - P. 475-480.

144. Musso D., Raoult D. Serological cross-reactions between Coxiella burnetii and Legionella micdadei II Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1997. - Vol. 4, № 2. -P. 208-212.

145. Nagai H., Kagan J.C., Zhu X. et al. A bacterial guanine nucleotide exchange factor activates ARF on Legionella phagosomes. Science. - 2002. - Vol. 295.-P. 679-682.

146. Nazaian E.G., Bopp D.G., Saylors A. et al. Design and implementation of a protocol for the detection of Legionella in clinical and environmental samples // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2008. - Vol. 62, № 2. - P. 125-132.

147. Newton H.J., Sansom F.M., Dao J. et al. Sell repeat protein LpnE is a Legionella pneumophila virulence determinant that influences vacuolar trafficking. -Infect. Immun. 2007. - Vol. 75. - P. 5575-5585.

148. O'Connor В.Л., Carman J., Eckert K., Tucker G., Givney R., Cameron S. Does using potting mix make you sick? Results from a Legionella longbeachae case-control study in South Australia // Epidemiol. Infect. 2006. - Vol. 19. - P. 1-6.

149. Pedro-Botet M.L., Sabria M. Legionellosis // Semin. Respir. Crit. Care. Med. 2005. - Vol. 26, № 6. - P. 625-634.

150. Pelaz C.L., Garsia A., Bourgon C.M. Cross-reactivity among Legionella species and serogroups // Epidemiol. Infect.- 1987. Vol. 99. - P. 641-646.

151. Pine L., George J.R., Reeves M.W., Harrell W.K. Development of a chemically defined liquid medium for growth of Legionella pneumophila II J. Clin. Microbiol. 1979. - Vol. 9, №5.-P. 615-626.

152. Plouffe J.F., File T.M., Jr., Breiman R.F., Hackman B.A., Salstrom S.J., Marston B.J., Fields B.S. Reevaluation of the definition of Legionnaires' disease: use of the urinary antigen assay // Clin. Infect. Dis. 1995. - Vol. 20, № 5. - P. 286-291.

153. Polat Y, Ergin C, Kaleli I, Pinar A. Investigation of Legionella pneumophila seropositivity in the professional long distance drivers as a risky occupation // Mi-krobiyol. Bui. 2007. - Vol. 41, № 2. - P. 211-217.

154. Pourcel C., Vidgop Y., Ramisse F., Vergnaud G., Tram C. Characterization of a tandem repeat polymorphism in Legionella pneiunophila and its use for geno-typing // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41, № 5. - P. 1819-1826.

155. Qasem J.A., Mustafa A.S., Khan Z.U. Legionella in clinical specimens and hospital welter supply facilities: molecular detection and genotyping of the isolates //Med. Princ. Pract. 2008. -Vol. 17, № l.-P. 49-55.

156. Robinson P.N., Heidrich В., Tiecke F. et al., Species-specific detection of Legionella using polymerase chain reaction and reverse dot-blotting // FEMS Mi-cobiol. Lett.-1996.-Vol. 140.-P. 111-119.

157. Rojas A., Navarro M.D., Fornes F.E., Serra E., Simarro E., Rojas J., Ruiz J. Value of serological testing for diagnosis of legionellosis in outbreak patients // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43, № 8. - P. 4022-4025.

158. Roig J., Sabria M., Pedro-Botet M.L. Legionella spp.: community acquired and nosocomial infections // Curr. Opin. Infect. Dis. 2003. - Vol. 16, № 2. - P. 145-151.

159. Rogers J., Dowsett A.B., Dennis P.J., Lee J.V., Keevil C.W. Influence of plumbing material on biofilm formation and growth of Legionella pneumophila in a potable water systems // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - Vol. 6. - P. 18421851.

160. Rossier O., Starkenburg S.R., Cianciotto N.P. Legionella pneumophila type II protein secretion promotes virulence in the A/J mouse model of Legionnaires' disease pneumonia // Infect. Immun. 2004. - Vol. 72, № 1. - P. 310-321.

161. Rowbotham T.J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae // J. Clin. Pathol. 1980. - Vol. 33, № 12.-P. 1179-1183.

162. Roy C.R., Berger K.H., Isberg R.R. Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within minutes of bacterial uptake // Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 28. - P. 663-674.

163. Ruscoe Q., Hill S., Blackmore Т., McLean M. An outbreak of Legionella pneumophila suspected to be associated with spa pools on display at a retail store in New Zealand // N. Z. Med. J. 2006. - Vol. 13. - P. 1243-1253.

164. Sansom F.M., Newton H.J., Crikis S. et al. A bacterial ecto-triphosphate di-phosphohydrolase similar to human CD39 is essential for intracellular multiplication of Legionella pneumophila. Cell. Microbiol. - 2007. - Vol. 9(8). - P. 19221935.

165. Shannon K.E., Lec D.Y., Trevors J.Т., Beaudette L.A. Application of realtime quantitative PCR for the detection of selected bactcrial pathogens during municipal wastewater treatment // Sci. Total. Environ. 2007. - Vol. 15, № l.-P. 121-129.

166. Sheehan K.B., Henson J.M., Ferris M.J. Legionella species diversity in an acidic biofilm community in Yellowstone National Park // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - Vol. 71, № i.p. 507-511.

167. Shelburne S.A., Kielhofner M.A., Tiwari P.S. Serebellar involvement in legionellosis // South. Med. J. 2004. - Vol. 97, № 1. - P. 61-64.

168. Soderberg M.A., Rossier О., Cianciotto N.P. The type II protein secretion system of Legionella pneumophila promotes growth at low temperatures // J. Bacterid. 2004. - Vol. 186, № 12.-P. 3712-3720.

169. Steele T.W. Legionnaires' disease in South Australia, 1979-1988 // Med. J. Aust.- 1989. -Vol. 151, №6.-P. 322-328.

170. Stojck N.M., Dutkiewicz J. Legionella and other gram-negative bacteria in potable water from various rural and urban sources // Ann. Agric. Environ. Med. -2006.-Vol. 13.-P. 323-335.

171. Stone B.J., Abu Kwaik Y. Expression of multiple pili by Legionella pneuimophila: identification and characterization of a type IV pilin gene and its role in adherence to mammalian and protozoan cells // Infcct. Immune. 1998. - Vol. 66. -P. 1768-1775.

172. Su H.P, Tseng L.R., Tzeng S.C., Chou C.Y., Chung T.C. A legionellosis case due to contaminated spa water and confirmed by genomic identification in Taiwan // Microbiol. Immunol. 2006. - Vol. 50, № 5. - P. 371-377.

173. Taylor Т.Н., Albrecht M.A. Legionella bozemanii cavitary pneumonia poorly responsive to erythromycin: case report and review // Clin. Infect. Dis. -1995. Vol. 20, № 2. - P. 329-334.

174. Thomas V., Bouchez Т., Nicolas V., Robert S., Loret J.F., Levi Y. Amoebae in domestic water systems: resistance to disinfection treatments and implication in Legionella persistence // J. Appl. Microbiol. 2004. - Vol. 97, № 5. - P. 950-963.

175. Tiaden A., Spirig Т., Carranza p. et al. Synergistic contribution of the Legionella pneumophila lqs genes to pathogen host interactions. J Bacteriol. -2008. - Vol. 190. - P. 7532-7547.

176. Tillet H.E., de Louvois J., Wall P.G. Surveillance of outbreaks of water-borne infectious disease: categorizing levels of evidence // Epidemiol. Infect. — 1998.-Vol. 120.-P. 37-42.

177. Tremolieres F. Current epidemiology of microbial low respiratory tract infections // Med. Mai. Infect. 2006. - Vol. 36, № 11. - P. 546-554.

178. Uzel A., Ucar F., Hames-Kocabas E.E. Prevalence о £ Legionella pneumophila serogroup 1 in water distribution systems in Izmir province of Turkey // Apmis. 2005. - Vol. 113, № 10. - P. 664-669.

179. Uzel A, Cogulu D, Oncag O. Microbiological evaluation and antibiotic susceptibility of dental unit water systems in general dental practice // Int. J. Dent. Hyg.-2008.- Vol. 6,№ l.-P. 43-47.

180. Veronesi L., Capobianco E., Affanni P., Pizzi S., Vitali P., Tanzi M.L. Legionella contamination in the water system of hospital dental settings // Acta. Biomed.- 2007. -Vol. 78, №2.-P. 117-122.

181. Vogel J.P., Andrews H.L., Wong S.K., Isberg R.R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila II Science. 1998. — Vol. 6. — P. 873-876.

182. Vonberg R.P., Sohr D., Bruderek J., Gastmeier P. Impact of a silver layer on the membrane of tap water filters on the microbiological quality of filtered water// Infect. Dis.-2008.-Vol. 8, № l.-P. 133.

183. Williams T.J., Clarke D.E. Characterization of alpha 1-adrenoceptors mediating vasoconstriction to noradrenaline and nerve stimulation in the isolated perfused mesentery of rat // Br. J. Pharmacol. 1995. - Vol. 114, № 2. - P. 531-536.

184. Wellinghausen N., Frost C., Marre R. Detection of Legionellae in hospital water samples by quatitative real-time LightCycler PCR // Appl. Environment. Microbiol. 2001. - Vol. 67, N 9. - P. 3985-3993.

185. Wilson D.A., Yen-Lieberman В., Reischl U., Gordon S.M., Procop G.W. Detection of Legionella pneumophila by real-time PCR for the mip gene // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41, № 7. - P. 3327-3330.

186. Yzerman E.P., den Boer J.W., Lettinga K.D., Schel A.J., Schellekens J., Peeters M. Sensitivity of three serum antibody tests in a large outbreak of Legionnaires' disease in the Netherlands // J. Med. Microbiol. 2006. - Vol. 55, № 5. -P. 561-566.

187. Zanetti F., Stampi S., De Luca G., Fateh-Moghadam P., Antonietta M., Sa-battini В., Checchi L. Water characteristics associated with the occurrence of Legionella pneumophila in dental units // Eur. J. Oral. Sci. 2000. - Vol. 108, № 1. -P. 22-28.

Информация о работе

Портенко, Светлана Анатольевна
кандидата биологических наук
Саратов, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Генная диагностика легионеллеза с использованием полимеразной цепной реакции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы