Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление и характеристика легионелл, циркулирующих в водных системах лечебно-профилактических учреждений

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выявление и характеристика легионелл, циркулирующих в водных системах лечебно-профилактических учреждений"

Мариненко Оксана Владимировна

ВЫЯВЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ЛЕГИОИЕЛЛ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В ВОДНЫХ СИСТЕМАХ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ УЧРЕЖДЕНИЙ.

03.02.03 - микробиология 14.02.02 - эпидемиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2014 г.

2 ОКТ 2014

005552964

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранении Российской Федерации (ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России)

Научные руководители; Доктор биологических наук, профессор Тартаковский Игорь Семенович

Кандидат медицинских наук, доцент Груздева Ольга Александровна

Официальные оппоненты:

- Кочероьец Владимир Иванович, доктор медицинских наук, профессор кафедры фармакологии с курсом технологии лекарств ГБОУ ВПО Первый Московский Государственный Медицинский Университет им. И.М.Сеченова;

- Тутельян Алексей Викторович, доктор медицинских наук, зав. лабораторией инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи ФБУН Центральный НИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «31 » октября 2014г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д. 208.130.01 в ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д.18

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России и на сайте института www.gamaleya.org

Автореферат разослан «29 »сентября 2014г Ученый секретарь диссертационного совета, (}

доктор медицинских наук, профессор /У \ 41 Русакова Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Легионеллезная инфекция («Болезнь легионеров», «Лихорадка Понтиак» и др.) известна уже более 30 лет, разработаны методы ее диагностики и лечения, однако, эта инфекция по-прежнему представляет существенную угрозу общественному здоровью, протекая в виде не только спорадических случаев, но и в виде крупных эпидемических вспышек с высоким процентом летальных исходов в различных странах мира, в том числе и в России. Легионеллез это сапронозное острое инфекционное заболевание, обусловленное различными видами микроорганизмов, относящихся к роду Legionella. Главным местом обитания легионелл являются абиотические объекты окружающей среды. Резервуар возбудителя — это вода природных водоемов, в природе легионеллы обнаруживаются в пресных водоёмах как симбионты сине-зелёных водорослей или паразиты некоторых организмов. Оптимальная для размножения легионелл температура внешней среды — это 40-60 °С. Наряду с естественной нишей, где обитают легионеллы, существует и искусственная — созданная человеком — ниша, а именно водные системы, где циркулирует вода оптимальной температуры. В таких системах создаются условия для образования в воздухе мелкодисперсного бактериального аэрозоля, что позволяет отнести легионеллез к техногенным инфекциям (Edelstein Р.Н.,1994; Stout J.E., 1997)

Вспышки легионеллеза были зарегистрированы во многих странах мира (США, Голландия, Хорватия, Дания, Испания и др), число заболевших варьировало от 8 случаев до нескольких сотен, были зарегистрированы летальные исходы. Заражения были связаны с использованием кондиционеров, вентиляторов, душевых установок и пр. Заболевания возникали у строителей, посетителей гольф-клуба, торгового центра, выставки цветов, бассейнов и других сооружений, там, где возникала возможность образования инфицированного легионеллами водного аэрозоля и попадания его в нижние отделы респираторного тракта человека. В 2007г была зарегистрирована вспышка легионеллеза в России в г. Верхняя Пышма Свердловской области (более 100 заболевших, 5 летальных исходов) (Онищенко Г.Г., Покровский В.И., Тартаковский И.С. 2008).

Впервые возбудитель легинелпеза был выделен и изучен сотрудниками CDC (США) J.E.McDade и C.C.Shepard (J. E.McDade, C.C.Shepard, Fraser D.M. et. al 1977). В 1978 году в СССР исследование по легионеллезу были начаты под руководством академика РАМН C.B. Прозоровского. В рамках этих исследований были изучены биологические свойства штамма, циркулирующего на территории СССР, разработаны и внедрены в практику серологические методы лабораторной диагностики. Показано, что легионеллез отличается от остальных респираторных инфекций отсутствием контагиозности, неординарными путями и факторами передачи возбудителя, отсутствием периодичности и цикличности в динамике заболеваемости (C.B. Прозоровский 1979г., В.И Васильева с соавт., 1986, Тартаковский И.С., 1982).

Легионеллы - широко распространенный водный микроорганизм, вызывающий при определенных обстоятельствах случаи пневмоний с тяжелым клиническим течением и высоким процентом летальных исходов. Наличие природных хозяев - сво-

бодноживущих в воде и почве амеб и простейших, в которых легионеллы паразитируют и сохраняются длительное время при благоприятных температурных условиях (выше 25 0 С), недостаточно для достижения возбудителем высоких концентраций, представляющих угрозу человеку. Для возникновения эпидемического неблагополучия необходимо достижение легионеллами высоких концентраций в искусственных водных системах антропогенного характера (градирня, система горячего водоснабжения, джакузи, душевые установки, кондиционеры и др.), а также контакт восприимчивых контингентов с мелкодисперсным водным аэрозолем, содержащим легионеллы (Legionella and prevention of Legionellosis, 2007).

Образование биоплёнок на внутренних поверхностях труб, шлангов, соединительных узлов систем водоснабжения и охлаждения воздуха способствует достижению высоких эпидемиологически значимых концентраций легионелл (Rogers J. et.al., 1994)

В настоящее время известны 3 основных типа потенциально опасных водных систем, размножение в которых легионелл может привести к возникновению эпидемических вспышек легионеллеза (Тартаковский И.С., Груздева O.A., и соавт. 2013) :

1. Водная система охлаждения промышленных предприятий и общественных зданий;

2. Система горячего водоснабжения (при температуре воды менее 60° с);

3. Бассейны и ванны с циркулирующей под давлением водой (типа джакузи).

Одной из наиболее важных типов систем является система горячего водоснабжения при температуре ниже 60 °С, что благоприятно для размножения легионелл и возникновения случаев легионеллезной инфекции. (Ricketts K.D., Joseph С., Lee J., Wewalka G., 2008).

К клинико-эпидемиологическим особенностям легионеллеза можно отнести наличие трех основных групп заболеваний по характеру приобретения инфекции: внебольничная пневмония (эпидемические вспышки и спорадические случаи), нозо-комиальный легионеллез (внутрибольничная инфекция) и легионеллез, связанный с поездками, путешествиями (travel - associated Iegionellesis).

Изучению эпидемиологии и профилактики нозокомиального легионеллеза до настоящего времени в России не уделяли достаточного внимания, хотя уже было известно, что для нозокомиального легионеллеза характерны как спорадические случаи, так и достаточно крупные эпидемические вспышки.

Случаи нозокомиального легионеллеза, связанные с аспирацией пациентами госпиталя воды, контаминированной легионеллами, описаны в центре трансплантации органов в Оксфорде (Великобритании), в медицинском Центре Лос-Анжелеса (США), в больничных комплексах Ноттингема и Питтсбурга ( Stout J.O., Yu V.L. Vickers R.M. 1982, Edelstein P.H., Meyer R.).

За последние годы в Российской Федерации разработана современная методическая база для выявления легионелл в окружающей среде и внедрены эффектив-

ные методы эпиднадзора за легионеллезной инфекцией (Онищенко Г.Г., Демина Ю.В., Тартаковский И.С., 2009).

Целью эпидемиологического надзора за легионеллезной инфекцией является оценка эпидемической ситуации, особенностей проявления и тенденций развития эпидемического процесса для принятия управленческих решений и разработки адекватных санитарно-противоэпидемических и профилактических мероприятий, направленных на предупреждение возникновения случаев легионеллеза, формирования очагов с групповыми заболеваниями и летальных исходов.

Периодический количественный мониторинг потенциально опасных водных объектов и систем на предмет наличия в них легионелл является необходимым условием эффективной профилактики легионеллеза.

К водным системам, потенциально опасным в отношении легионеллеза, относятся системы горячего и холодного водоснабжения. Система горячего водоснабжения до недавнего времени представлялась наименее значимой для Российской Федерации по сравнению с водными системами охлаждения типа «Cooling towers" и джакузи массового пользования. Прежде всего, это связано с формальными требованиями СанПина СП 3.1.2.2626 -2010 « Профилактика легионеллеза», регламентирующего температуру горячего водоснабжения у нас в стране выше 60°С., тогда как за рубежом эта температура, как правило, не превышает 55°С, что благоприятствует колонизации легионеллами. Наиболее вероятна колонизация легионел-лами систем горячего водоснабжения закрытого типа, в которых циркулирующая холодная вода нагревается до требуемой температуры с помощью специального теплоносителя, что характерно для большинства зданий общественного пользования в Российской Федерации: гостиницы, офисные и торговые центры, лечебно-профилактические учреждения. Поэтому для этой группы зданий анализ уровня возможной контаминации легионеллами представляется наиболее важной задачей (YuV. 1998).

Наличие застойных участков и зон в системе водоснабжения, способность к колонизации микроорганизмами поверхности труб и другого водопроводного оборудования системы, способствует накоплению возбудителя легионеллеза в высоких концентрациях, что объясняет потенциальный риск возникновения нозокомиального легионеллеза. Для пациентов групп риска на фоне иммуносупрессии (отделения трансплантологии, гематологии, онкологии, интенсивной терапии) высока вероятность заражения в результате аспирации контаминированной водопроводной воды, что может приводить к возникновению нозокомиальных вспышек легионеллеза (Anassie E.I., Penzak S.R. et. al. 2002).

В Российской Федерации до начала настоящей работы исследования по анализу уровня контаминации легионеллами систем водоснабжения общественных зданий не проводились ввиду отсутствия необходимой методической базы,

Цель работы: Изучение уровня и особенностей контаминации легионеллами систем водоснабжения лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) в Москов-

ском регионе и обоснование адекватной тактики профилактики нозокомиального легионеллеза.

Для достижения данной цели поставлены следующие задачи:

• разработать методику обследования систем горячего водоснабжения ЛПУ на наличие легионелл с помощью бактериологического метода исследования и ПЦР-РВ;

• провести мониторинг частоты и уровня контаминации легионеллами водных систем ЛПУ в Московском регионе;

• охарактеризовать штаммы легионелл, циркулирующих в водных системах ЛПУ с помощью панели моноклональных антител;

• изучить распространение глюкозилтрансфераз различного типа среди штаммов легионелл, выделенных из различных источников;

• изучить морфологические особенности формирования биопленок, содержащих легионеллы, в системе горячего водоснабжения ЛПУ;

• обосновать тактику профилактики легионеллеза в отделениях ЛПУ и оценить ее эффективность.

Научная новизна работы:

Впервые проведен мониторинг уровня и частоты колонизации легионеллами систем горячего водоснабжения лечебно-профилактических учреждений в Московском регионе. Показано, что Legionella pneumophila присутствует во всех 10 обследованных комплексах и 85% из 20 обследованных зданий ЛПУ, в том числе в 8 отделениях групп риска (нейрохирургии, гематологии, реанимации, интенсивной терапии, трансплантации печени, психосоматики, ожоговом). Уровень колонизации образцов из систем горячего водоснабжения зданий ЛПУ был различен и колебался в диапазоне от 6 х 101 до 6,4 х 105 КОЕ/ на литр воды.

Впервые охарактеризовано серологическое разнообразие легионелл, циркулирующих в системах горячего водоснабжения ЛПУ. Показано, что в водных системах данного типа преобладают штаммы Legionella pneumophila серогруппы 6 (38%), се-рогруппы 5 (П%), серогруппы 3 (16%), роль которых значима в этиологии пневмоний, связанных с оказанием медицинской помощи. Для штаммов легионелл, циркулирующих в системе горячего водоснабжения ЛПУ, характерна гомогенность популяции: в 80% положительных образцов выделен штамм одной из серогрупп Legionella pneumophila, в 20% - штаммы не более 2х серогрупп.

Впервые показано распространение глюкозилтрансфераз (Lgtl,2,3) различных типов у штаммов Legionella, pneumophila, выделенных из различных источников. Lgtl и Lgt3 присутствуют у всех штаммов Legionella pneumophila и отсутствуют у Legionella species. Данные типы глюкозилтрансфераз можно рассматривать в качестве видоспецифических маркеров Legionella pneumophila. Lgt2 в 2 раза чаще (46%) встречается у клинических штаммов легионелл, по сравнению со штаммами Legionella pneumophila, выделенных из окружающей среды.

Впервые показана высокая скорость формирования организованных смешанных микробных биопленок (в течение 2-3 недель) с образованием номад на поверхности защитных фильтров, вмонтированных в водопроводные краны системы водоснабжения ЛПУ, с помощью сканирующей электронной микроскопии. Наряду с ле-гионеллами, в составе биопленок, формируемых в системе водоснабжения ЛПУ, выявлены и другие бактерии, вызывающие внутрибольничную инфекцию.

Практическая значимость работы:

1. Разработан порядок обследования, позволяющий выявлять уровень контаминации легионеллами системы водоснабжения ЛПУ на основе скрининга с помощью ПЦР-РВ, с последующим бактериологическим подтверждением.

2. Современные методы мониторинга легионелл в системе горячего водоснабжения внедрены в систему государственного санитарно-гигиенического нормирования. По результатам работы в практику здравоохранения внедрены:

• Санитарно — Эпидемиологические правила СП 3.1.2.262-10 «Профилактика легионеллеза», 2010г.

• Методические рекомендации MP 02.039-09 «Выявление и количественное определение легионелл в водных образцах внешней среды методом полимераз-ной цепной реакции в реальном времени», 2009г.

3. Показана эффективность профилактического действия фильтров конечной фильтрации в контаминированной легионеллами системе водоснабжения отделения групп риска ЛПУ.

Основные положения, выносимые на защиту;

1. Разработан порядок обследования, позволяющий выявлять контамини-рованные легионеллами участки и зоны потенциально опасных водных объектов в системе водоснабжения ЛПУ на основе скрининга с помощью ПЦР-РВ, с последующим бактериологическим подтверждением.

2. Осуществлен мониторинг уровня и частоты колонизации легионеллами систем горячего водоснабжения лечебно-профилактических учреждений в Московском регионе. Показано, что Legionella pneumophila присутствует во всех 10 обследованных комплексах и 85% из 20 обследованных зданий ЛПУ, в том числе в 8 отделениях групп риска (нейрохирургии, гематологии, реанимации, интенсивной терапии, трансплантации печени, психосоматики, ожоговом). Уровень колонизации образцов из систем горячего водоснабжения зданий ЛПУ был различен и колебался в диапазоне от 6 х 101 до 6,4 х 105 КОЕ/ на литр воды.

3. Проведен анализ серологического разнообразия легионелл, циркулирующих в системах горячего водоснабжения ЛПУ. Показано, что в водных системах данного типа преобладают штаммы Legionella pneumophila серогруппы 6 (38%), се-рогруппы 5 (17%) .серогруппы 3 (16%), роль которых значима в этиологии пневмоний, связанных с оказанием медицинской помощи. Для штаммов легионелл, циркулирующих в системе горячего водоснабжения ЛПУ, характерна гомогенность попу-

ляции: в 80% положительных образцов выделен штамм одной из серогрупп Legionella pneumophila, в 20% - штаммы не более 2х серогрупп.

4. Анализ распространения глюкозилтрансфераз (Lgt 1,2,3) различных типов у штаммов Legionella pneumophila, выделенных из различных источников показал, что Lgtl и Lgt3 присутствуют у всех штаммов Legionella pneumophila и отсутствуют у Legionella species. Данные типы глюкозилтрансфераз можно рассматривать в качестве видоспецифических маркеров Legionella pneumophila. Lgt2 в 2 раза чаще (46%) встречается у клинических штаммов легионелл, по сравнению со штаммами Legionella pneumophila, выделенных из окружающей среды.

5. Показана высокая скорость формирования организованных смешанных микробных биопленок (в течение 2-3 недель) с образованием номад на поверхности защитных фильтров, вмонтированных в водопроводные краны системы водоснабжения ЛПУ, с помощью сканирующей электронной микроскопии. Наряду с легио-неллами, в составе биопленок, формируемых в системе водоснабжения ЛПУ, выявлены и другие бактерии, вызывающие внутрибольничную инфекцию.

6. Профилактика легионеллеза в отделении группы риска ЛПУ с помощью метода конечной фильтрации в системе водоснабжения, контаминированной легио-неллами, обеспечивала полную защиту пациентов от контакта с возбудителем.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Международной конференции «Legionella 2009» (Париж, 2009), на Пленуме Научного совета по экологии и гигиене окружающей среды РАМН (Москва, 2009), 25 конференции Европейской рабочей группы по легионеллезу (Copenhagen, 2010), 26 конференции Европейской рабочей группы по легионеллезу (Wienna, Austria,2011).

Апробация диссертации состоялась на научной конференции отдела медицинской микробиологии и отдела эпидемиологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. - 28.05.2014г., протокол № 3

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

\ Обьем и структура работы. Диссертация изложена на 125страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты собственных исследований и их обсуждения, выводы и список литературы, содержащий ссылки на 24отечественных и 107 иностранных источников. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 17 рисунками и 1 схемой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы микроорганизмов. В данной работе использовали 56 штаммов -Legionella pneumophila- из коллекции лаборатории легионеллеза, выделенные из окружающей среды; 103 штамма, выделенные из системы горячего водоснабжения ЛПУ и других общественных зданий - гостиниц; и 17 клинических штаммов из коллекции Германского и Российского референс-центра по легионеллезу.

Бактериологический метод. Образцы воды, биопленок, смывов из систем горячего водоснабжения исследовали в соответствии с МУК 4.2.2217-07 «Выявление бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды».

Все штаммы легионелл выращивали на плотной агаризованной среде буферный угольно-дрожжевой агар (БУДРАГ, BCYEa) с ростовой и селективной добавкой («Oxoid») при 37°С в течение 72ч, также в качестве ростовых добавок применяли L-цистеин 400мг/л (Япония) и пирофосфат железа растворимый 250мг/л («Sigma»), стерилизованные через фильтр с диаметром пор 0,4 мкм.

Для идентификации бактерий рода Legionella, подозрительные колонии высевали на среду БУДРАГ без селективной и ростовой добавок. В качестве контрольной среды использовали среду БУДРАГ без добавления L-цистеина и растворимого пирофосфата железа. Легионеллы растут на среде БУДРАГ и не растут на контрольной среде. Идентифицированные подобным образом колонии относили к роду Legionella. После подтверждения латексной тест-системой, культуры Legionella pneumophila подсчитывали количественно для последующего определения легионелл в 1 литре воды.

Для определения принадлежности выросших колоний к виду Legionella pneumophila, использовали тест-систему латекс-агглютинации. С помощью петли подозрительные колонии переносили в каждую из лунок и тщательно перемешивали с изотоническим солевым раствором в течение 2 минут. В каждую из лунок последовательно добавляли одну каплю латексного реагента Legionella 1, в другую - одну каплю латексного реагента Legionella 2-15, в третью - одну каплю латексного реагента Legionella spp. Перемешивали каждую латексную суспензию отдельной стеклянной палочкой и, осторожно покачивая стекло, наблюдали за появлением агглютинации в течение 1 минуты.

Определение легионелл методом ПЦР-РВ. Отработку методики и исследование образцов с помощью ПЦР-РВ проводила на приборе АНК-32 (Институт аналитического приборостроения, Санкт-Петербург).

ЗАО «Синтол» совместно с НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН разработаны отечественные тест-системы для одновременного количественного выявления Legionella pneumophila и качественного выявления Legionella spp. и Pseudomonas aeruginosa (АМПЛИ-ЛЕГ+РВ) в водных образцах при профилактическом мониторинге потенциально опасных водных объектов.

Набор реагентов «АмплиЛег+РВ» предназначен для одновременного качественного выявления в образцах ДНК Legionella spp., Legionella pneumophila и Pseudomonas aeruginosa и количественного определения ДНК Legionella pneumophila. В данном наборе одновременно в одной пробирке проходит четыре независимых реакции: первая - для обнаружения специфического фрагмента ДНК гена 16S рРНК Legionella spp., вторая - для обнаружения и количественного определения специфического фрагмента ДНК гена mip Legionella pneumophila, третья реакция - реакция внутреннего положительного контроля (ВПК)- позволяет исключить недостоверные результаты и контролировать наличие ингибиторов, четвертая реакция позволяет обнаружить ДНК специфического фрагмента гена gyrB Pseudomonas aeruginosa.

Эпидемиологическое обследование Jill У. Профилактический мониторинг легионелл осуществляли в 10 лечебно-профилактических учреждений в Московском

регионе, в 7 из которых были отделения с высоким риском инфицирования госпитализированных в них больных возбудителями легионеллезной инфекции (нейрохирургия, онкология, реанимация, гематология и трансплантологии), из-за наличия у таких больных выраженного иммунодефицитного состояния. В отделениях ЛПУ с высоким риском инфицирования отсутствовали централизованные системы кондиционирования воздуха и единственным возможным путем заражения была аспирация воды из системы водоснабжения ЛПУ. Во всех обследованных ЛПУ функционировала система горячего водоснабжения закрытого типа, в которых циркулирующая холодная вода нагревается до требуемой температуры с помощью специального теплоносителя. Для данной системы водоснабжения температура горячей воды обычно не превышает 60° С, что благоприятно для колонизации легионеллами.

Типирование легионелл с помощью панели моноклональных антител.

Серотипирование выделенных штаммов Legionella pneumophila осуществляли с помощью Дрезденской панели моноклональных антител иммуноферментным методом. Панель моноклональных антител предоставлена Др. Ю. Хельбиг и Др.КЛюк (Германский референс - центр по легионеллезу, Институт медицинской микробиологии и гигиены, Технический университет, Дрезден, Германия).

Использовали следующие реактивы:

• PBS (Phoshphatebufferedsaline): 200мл 10xPBS:16rp NaCl, 0,4 rp КС1, 2,88rp Na2HP04x2H20 и 0,48гр КН2Р04Н20 к 200мл, рН 6,8. При разведении в 10 раз - рН 7,4.

• Tween 20 10% (по навеске)

• КРС - сыворотка крупного рогатого скота

• 3% перекись водорода

• Фосфатно-цитратный буфер с 5,0:Na2HP04xl2H20 (Mw358) - 41 мл 0,8 М +0,4М лимонная кислота (COOH-CH2-COH(COOH)-CH2-COOHMw 192,12) готовим 160мл., приливаем до рН 5,0. Субстрат o-phenilenediamine (PHDA). Навеску растворяем перед применением. Концентрация в рабочем растворе 1мг\мл

• Серная кислота 2М «Диаэм» - Россия

• Конъюгат антител кролика к иммуноглобулинам мыши с пероксидазой хрена - «Имтек» (1мг/мл). Рекомендуют разводить 1:5000раз

Определение гена глюкозилтрансферазы легионелл.

Для выявления Lgtl и Lgt2 штаммы легионелл выращивали на твердой питательной среде BCYE (Oxoid) в течение Зх суток. Для определения Lgt3 культуру выращивали на жидком питательном бульоне ProteosePeptonN3 (Difco) в течение 6 часов на шейкере при 37°С. Бактериальные клетки отделяли центрифугированием в течение 5 минут при 10000 оборотах в мин, после чего лизировали ультразвуком. Полученные пробы смешивали со стандартным буфером Лэммли и подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. После электрофореза осуществляли электроперенос на нитроцеллюлозные мембраны. Мембраны обрабатывали сыворотками к Lgtl, Lgt2, или Lgt3, пероксидазным конъюгатом и

реагентом для хемилюминисценции ECL (GEHealthcare, Россия) и оценивали сигнал на хемилюминисцентном детекторе (Vilber-Lourmant, Франция).

Выделение ДНК осуществляли феноловым методом. Определение внутренних фрагментов генов lgtl, lgt2 и lgt3 проводили с помощью ПЦР на амплификаторе Master Cyclerpersonal (Eppendorf, Германия) с праймерами #56-#150, #274-#275 и #276-#277 соответственно.

Электронная микроскопия биопленок легионелл.

Исследования проведены в комплексе с д.м.н. Л.В.Диденко (лаборатория ано-томии микроорганизмов ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России). В работе исследовали образцы биопленок из систем горячего водоснабжения ЛПУ Москвы. Для исследования формирования биопленок Legionella pneumophila в системах горячего водоснабжения ЛПУ, на водопроводные краны в отделениях групп риска монтировали антибактериальные фильтры Pall («Аквасейф»). После экспозиции в течение 1,2 и 3 недель соответственно фильтры демонтировали и исследовали биопленку, сформировавшуюся на внешней поверхности фильтра.

Для изучения биопленок методами сканирующей электронной микросокопии, полученные образцы были фиксированы по методу Ito-Kanjorski.

Образцы были изучены в сканирующем двулучевом электронном микроскопе Quanta 200 3D («FEICompany» США). Пробоподготовка образцов для этого метода исследования заключалась в упомянутой выше фиксации и напылении нанослоем золота толщиной 5 нм, что позволяло сохранить нативную структуру образца.

Статистические методы обработки результатов. Анализ и статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами, используемыми в биологии (Лакин Г.Ф., 1990). Достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по разностному методу Стьюдента-Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Разработка порядка обследования системы горячего водоснабжения лечебно-профилактических учреждений.

Нами была разработана методика обследования системы горячего водоснабжения ЛПУ для оценки уровня их контаминации легионеллами (Схема 1). Показано, что принципиально важным при исследовании на легионеллы из системы горячего водоснабжения было взятие образцов воды и смывов с внутренней поверхности водопроводных кранов, сеток душа, внутренней поверхности труб концевых, редко используемых и «застойных» участков системы горячего водоснабжения. Для исследования брали первую порцию горячей воды из крана или душа без предварительного слива воды. Бактериологическому обследованию на легионеллы предшествует анализ температуры воды в системе и выявление концевых (наиболее отдаленных от бойлерной), редко используемых участков и «застойных» зон и тупиковых точек системы горячего водоснабжения. Анализ проводили совместно с пред-

стайителями инженерной службы организации, объект которой подлежал обследованию.

Особое внимание следует уделить закрытым системам ЦГС, в которых, в соответствии с постановлением правительства РФ от 23.05 2006г. №307 «О порядке предоставления коммунальных услуг гражданам», Приложение 1, допускается температуры горячей воды 50° С. В закрытых системах ЩС горячая вода в бойлерной подогревается за счет внешнего водного теплоносителя, имеющего высокую температуру. Данный тип горячего водоснабжения является основным для общественных зданий г. Москвы.

Схема 1. Алгоритм обследования горячего водоснабжения на наличие легио-нелл -.

2. Скрининг систем водоснабжения ряда общественных зданий, в том числе ЛПУ. на наличие легионелл

Нами проведено скрининговое обследование систем горячего водоснабжения зданий общественного пользования, в том числе ЛПУ, в Москве и Московской области (2008-2012гг) с целью определения частоты и количественного уровня их контаминации Legionella pneumophila. В процессе исследования разработан порядок обследования, позволяющий выявлять контаминированные легионеллами участки и зоны потенциально опасных водных объектов.

Для исследования уровня контаминации Legionella pneumophila систем горячего водоснабжения были выбраны здания или комплексы зданий с централизованной системой холодного водоснабжения. Горячее водоснабжение объектов обеспечивалось нагреванием холодной воды в калориферах бойлерной до температуры + 56° - 65°С. Отбор проб воды и смывов осуществляли в «застойных», концевых и редко используемых участках системы горячего водоснабжения объекта. Исследовали образцы воды объемом 500-1000мл и смывы с внутренней поверхности труб, сеток душа, водопроводных кранов.

Контаминация Legionella pneumophila выявлена в «застойных», концевых или редко используемых участках системы горячего водоснабжения во всех 8 обследованных объектах (Таблица 1). Концентрация Legionella pneumophila в положительных пробах составляла от 6 хЮ до 3,6х105 КОЕ /на литр воды. Концентрация возбудителя, превышающая Ю3КОЕ/ на литр, выявлена на 7 объектах. Максимальная температура нагрева воды в калорифере бойлерной составляла 56-65°С на всех 8 объектах. По степени колонизации Legionella pneumophila объекты могут быть разделены на 2 группы: 1) пять объектов, на которых выявлен только 1 участок, конта-минированный возбудителем; 2) три объекта, на которых выявлено от 2 до 5 участков, контаминированных Legionella pneumophila, т.е. колонизация носит системный характер. Из двух объектов системы водоснабжения общественных зданий, в том числе ЛПУ, помимо легионелл, были выделены изоляты Pseudomonas aeruginosa. Также был обнаружен и ряд других микроорганизмов: Staphylococcus spp., Staphylococcus Hemolyticus, Aspergillus, Staphylococcus Epidermidis, Pseudomonas spp., Bacillus spp..

Таблица 1. Уровень контаминации Legionella pneumophila систем горячего водоснабжения зданий общественного пользования, в том числе ЛПУ

Объект Концентрация L.pneumophila (КОЕ/л) Температура горячей воды (С °) Количество участков системы водоснабжения объекта, контаминированных Присутствие в воде P.aerugin osa

минимальная максимальная максимальная минимальная

L.pneumophila

1. 1,3 хЮ2 3,6 хЮ4 57 36 2 -

2. - 2,8 хЮ4 56 42 1 -

3. 6x10 3,6 хЮ3 61 46 3 -

4. - 1,8 хЮ' 65 52 1 -

5. 3,1 хЮ2 3,4 хЮ4 57 36 5 +

6 - 3,6 хЮ5 60 36 1 -

7 - 8,4 хЮ4 60 45 1 +

8 - 2 хЮ2 60 44 1 -

3. Анализ эффективности использования ПЦР-РВ для выявления легио-нелл в системе водоснабжения лечебно-профилактических учреждений

В работе исследовали образцы воды, смывов и биопленок из систем горячего водоснабжения 10 ЛПУ Москвы, обследованных в 2008-2012гг. на предмет контаминации Legionella pneumophila, Legionella spp., Pseudomonas aeruginosa.

С помощью тест-системы «АмплиЛег+РВ» были проанализированы 117 образцов воды из системы горячего водоснабжения ЛПУ (таблица 2),

Из 65 положительных проб, корреляция результатов ПЦР-РВ и бактериологического метода определения Legionella pneumophila была в 83,3% случаев. В 5-ти случаях наблюдали ингибирование при положительном результате бактериологического анализа, в 16 пробах положительные результаты ПЦР-РВ не были подтверждены бактериологически.

Pseudomonas, aeruginosa в системе горячего водоснабжения ЛПУ был обнаружен в 4-х образцах методом (ПЦР-РВ), в 6 образцах методом исследования бактериологическим. Для синегнойной палочки корреляция составила 66,6%.

ДНК Legionella spp. обнаружена качественно в 52 образцах воды, в то время как культуры Legionella spp. из этих же образцов не были выделены.

Таблица 2. Выявление Legionella pneumophila, Legionella spp., и Pseudomonas aeruginosa в системе горячего водоснабжения ЛПУ

№ ЛПУ Бактериологический метод (КОЕ\л) П Ц Р — РВ (геномных копий на литр)

L. pneumophila L. species P.aerugin osa L. pneumophila L. species P. aeruginosa

1 1,2* 1026,4 * 105 - 1,9* 103 -6,3 * 105 +

2 3,6 -* 105 - ингибирова-ние +

3 8,4 * 10" 103 8,5 * 10" +

4 6* 1021,2* 10' 5,6* 103 -1,7 * 10" +

5 2* 102 2,2 * 104 +

6 1,2* Ю} 2,57,6 * 103 +

7 6* 103 ю'-ю6 1,2* 103 -5,1 * 104 + +

8 5,6 * 103 104 +

9 6,1* 1033,6 * 10" 2,2* 102 -6,8* 104 +

10 1,2 * 102 -4,9 * 10" - 2,8 * 103 -3,3 * 104 +

4. Анализ контаминации легионеллами систем горячего водоснабжения больничных комплексов.

Нами изучены особенности колонизации легионеллами систем водоснабжения крупных многопрофильных лечебно-профилактических учреждений г. Москвы.

В работе исследовали образцы воды, смывов и биопленок систем горячего водоснабжения 7 крупных многопрофильных лечебно-профилактических учреждений г. Москвы, обследованных в 2008-2012гг. на предмет контаминации Legionella pneumophila.

Всего обследовано 17 корпусов больниц с централизованной системой холодного водоснабжения. Горячее водоснабжение объектов обеспечивалось нагреванием холодной воды в калориферах бойлерной ЛПУ до температуры + 49° - +63°С. Отбор проб воды и смывов осуществляли в «застойных», концевых и редко используемых участках системы горячего водоснабжения объекта. Исследовали образцы воды объемом 500-1000 мл и смывы с внутренней поверхности сеток душа и водопроводных кранов.

Последовательно нами было обследованы следующие крупные многопрофильные лечебно-профилактические учреждения.

Многопрофильная больница А. (нейрохирургический корпус').

При обследовании системы горячего водоснабжения на наличие Legionella pneumophila, нами были отобраны 13 образцов воды (таблица 3).

При анализе данных образцов воды Legionella pneumophila была обнаружена в

2 5

11 образцах (84,6%). Концентрация колебалась в интервале от 8,9 х 10 - 6,4x10 КОЕ/ на литр воды. Самая большая концентрация наблюдалась в микробиологиче-

ской лаборатории (14 этаж), а также в нейрореанимации интенсивной терапии (10 этаж), пациенты которой относятся к группам риска.

Таблица 3. Уровень контаминации больницы А.

№ п\п Материал для исследования Количество легионелл (КОЕ\литр) Концентрация других микроорганизмов (КОЕ\литр)

1 Микробиологическая лаборатория, 14 этаж 2,5 х 10' -6,4x105 Bacillus spp. 103

2 Нейрореанимация, интенсивная терапия, 10 этаж 8,9 х Ю-1 -5 х 105 Не обнаружено

3 Отделение детской нейрохирургии, 5 этаж 9 х 10J Не обнаружено

4 Бойлерная не обнаружено Не обнаружено

Многопрофильная больница Б. Нами было обследованы следующие 6 корпусов: ожоговое отделение, отделение трансплантологии, новое отделение трансплантологии, отделение психосоматики, плановый оперблок (анестезиология, реанимация), ангиография.

Контаминация легионеллами системы горячего водоснабжения была выявлена во всех корпусах, что составило 100%. Из 14 образцов положительными оказались 9 (64,3%). Контаминация легионеллами варьировалась в промежутке от 1,2x101 до 1,2 х 105 КОЕ/ на литр воды (таблица 4). Концентрация возбудителя, превышающая 103 КОЕ на литр, выявлена в ожоговом отделении, в оперблоке (реанимации), отделении трансплантологии и психосоматики, которые и относятся к группам риска развития внутрибольничной пневмонии.

Таблица 4. Уровень контаминации Legionella pneumophila системы горячего водоснабжения больницы Б

№ п/п Наименование корпуса Количество легионелл (КОЕ\л) Концентрация других микроорганизмов (КОЕ\л)

1 Ожоговое отделение 1,5x10" - 1,2х105 Не обнаружено

2 Отделение трансплантологии 2,4x10' -3,6x10" единичные Р-гемолитичес-кие н/ф Грамм+ бактерии

3 Новое отделение трансплантологии 1,2x102 Астеи>Ьайег 1\уоЯи 102 ЗрЬтоп.раиатоЫз 102

4 Отделение психосоматики 1,1x10" Не обнаружено

№ п/п Наименование корпуса Количество легионелл (КОЕ\л) Концентрация других микроорганизмов (КОЕ\л)

5 Ангиография 2,4x102 Acinetobacter spp. 102 Micrococcus luteus 102

6 Плановый оперблок (анестезиология- реанимация) 1,2x102 - 1,6x10" Brevibacterium vesicularis 103 Micrococcus luteus 102

Многопрофильная больница В. Нами были обследованы следующие б корпусов: нейрохирургический корпус (оперблок), оперблок тарвмотологии (ремонт), отделение гематологии, урологии, пульмонологии и инфекционное отделение.

Контаминация легионеллами системы горячего водоснабжения была выявлена в 4 корпусах, что составило 66% (таблица 5). Из 14 образцов положительными оказались 8 (57%) образцов. Контаминация легионеллами находилась в интервале от 1,2x102 до 4,9 хЮ4 КОЕ/ на литр воды. Концентрация возбудителя, превышающая 103 КОЕ на литр, выявлена в оперблоке травматологии (ремонт), отделении урологии, и инфекционном отделении, которые и относятся к группам риска развития внутрибольничной пневмонии. Кроме легионелл, также обнаружена культура -Pseudomonas aeruginosa.

Таблица 5. Уровень контаминации Legionella pneumophila системы горячего водоснабжения больницы В

№ n/n Наименование корпуса Количество легионелл (KOEVi) Концентрация других микроорганизмов (КОЕ\л)

1 Оперблок нейрохирургический корпус 1,2x102 Р.аепщтова - 10

2 Оперблок травматологии, ремонт 7,7x103 - 3,6x10" Р.ае^това -102

3 Отделение урологии 6x10J Не обнаружено

4 Отделение пульмонологии Не обнаружено Не обнаружено

5 Отделение гематологии Не обнаружено Р.аегийтова- 102

6 Инфекционное отделение 1,8x10" -4,9x10" Не обнаружено

7 Бойлерная l,9xlOJ Не обнаружено

Таким образом, контаминация L.pneumophila в различной степени выраженности была выявлена во всех семи крупных клиниках. Культура Legionella pneumophila была выделена в 14 (82%) из 17 обследованных зданий ЛПУ, в том числе в 8 отделениях групп риска (отделении нейрохирургии, отделении гематологии, отделении реанимации, отделении интенсивной терапии, отделении трансплантации печени, отделении психосоматики и в ожоговом отделении). В 4 зданиях лечебно-

профилактических учреждениях выявлена системная колонизация Legionella pneumophila (культура легионелл выявлена в трех и более участках системы водоснабжения здания). Уровень контаминации Legionella pneumophila в обследованных зданиях колебался в интервале от 1,2х102 до 6,4 хЮ5 КОЕ/литр. Из 85 образцов воды и смывов культура Legionella pneumophila была выделена в 34 (40 %) образцах. 26 (30%) положительных проб выявлены в отделениях групп риска. В 9% образцов в ассоциации с Legionella pneumophila были выделены другие микроорганизмы-возбудители внутрибольничных инфекций: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Brevibacterium vesicularis, Micrococcus luteus. Всего из исследованных образцов воды выделено 42 штамма Legionella pneumophila.

5. Серологическая характеристика штаммов легионелл. циркулирующих в системах горячего водоснабжения, в том числе Jill У

В работе типировали 103 штамма Legionella pneumophila, выделенных из системы горячего водоснабжения Московской и Свердловской области, Ямало-Ненецкого автономного округа, Самары, Твери, Екатеринбурга. Серотипирование выделенных штаммов Legionella pneumophila осуществляли с помощью Дрезденской панели моноклональных антител иммуноферментным методом.

Показано таксономическое разнообразие штаммов Legionella pneumophila, циркулирующих в данных системах в Российской Федерации. Выделенные штаммы 1-ой серогруппы Legionella pneumophila принадлежат к четырем из 9 подгрупп (таблица 6).

Таблица 6. Результаты серотипирования штаммов Legionella pneumophila серогруппы 1, выделенных из системы горячего водоснабжения

подгруппа Кпох-ville Philadelphia Benid orm France/ Allent OLDA Oxford Bel-ing-ham Hey sham Camper down

Система горячего водоснабжения ЛПУ 1 4 2 3

12% штаммов, выделенных из системы горячего водоснабжения, в том числе ЛПУ, принадлежали к 1-ой серогруппе Legionella pneumophila. Штаммы первой серогруппы являются основным возбудителем внебольничных пневмоний легионел-лезной этиологии. Вместе с тем выделен один штамм Legionella pneumophila серогруппы 1, типируемый моноклоном МАЬ 3/1 (ассоциированный с ЛПС эпитоп, выявляемый только у наиболее вирулентных штаммов легионелл).

Для воды систем горячего водоснабжения характерно присутствие штаммов серогруппы 6 (38%), серогруппы 5(17%), серогруппы 3 (16%), серогруппы 1 (12%) (рисунок 1).

Рисунок 1. Распределение серотипов среди штаммов Legionella pneumophila, выделенных из системы горячего водоснабжения

Из систем горячего водоснабжения в 80% положительных образцов выделен штамм одной из серогрупп, а штаммы 2 и более различных серотипов обнаружены лишь в 20% образцов (рис. 2).

Рисунок 2. Серологическое разнообразие штаммов Legionella pneumophila, циркулирующих в водных системах водоснабжения лечебно-профилактических учреждений.

80%

70% —

60% —

50% —

40% — ДЦ

30% —

20% — 10% —• 70%

■Hl ИИ :

Ни ИИ

серотип 2 и более серотипов

6. Идентификация генов глюкозилтрансферазы у различных штаммов легионелл. Нами проведен анализ присутствия различных представителей семейства глюкозилтрансфераз Lgt среди микроорганизмов рода Legionellaceae из коллекции музейных и недавно выделенных в Российской Федерации и Германии штаммов легионелл.

Наличие трех типов глюкозилтрансфераз определяли у 73 штаммов Legionella pneumophila и Legionella spp. Из 53 штаммов Legionella pneumophila, 37 принадлежали коллекции НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, 20 из которых были выделены в 20082012 гг. из градирен промышленных предприятий, систем водоснабжения лечебно-профилактических учреждений и гостиниц, а также клинического материала в России. Были выделены от больных тяжелой пневмонией в Германии 16 штаммов, 20 штаммов Legionella spp. относятся к 15 видам легионелл, из них 11 штаммов были выделены из градирен из потенциально опасных водных систем в России в 20082012гг.

Гены Igt 1 и lgt3 определялись только у представителей Legionella pneumophila, независимо от источника выделения и отсутствовали в штаммах Legionella spp. Это указывало на вероятность признака видоспецифичности у данных маркеров бактерий.

Принципиально иными выглядят результаты по определению lgt2 ( рисунок 3). Данный ген также отсутствует у штаммов Legionella spp., однако он определяется далеко не во всех штаммах Legionella pneumophila. Сравнительный анализ частоты выявления lgt2 у клинических штаммов и штаммов Legionella pneumophila, выделенных из окружающей среды, показал, что у клинических штаммов ген выявляется значительно чаще (46%) по сравнению со штаммами из окружающей среды (23%). Присутствие lgt2 у штаммов не коррелирует с принадлежностью к различным серо-группам Legionella pneumophila. Данные по характеристике штаммов легионелл, полученные методом ПЦР, были идентичны результатам выявления Lgt методом ве-стерн-блоттинга.

Рисунок 3. Наличие гена глюкозилтрансфераз Lgt 1,2,3 у штаммов Legionella pneumophila

Наличие гена глюкозилтрансфераз Lgt Наличие гена глюкозилтрансфераз Lgt 1,2,3 у штаммов 1,2,3 у штаммов

L. pneumophila, выделенных L. pneumophila, выделенных

из окружающей среды. из клинического материала.

7. Морфологическая характеристика формирования биопленок в системе водоснабжения лечебно-профилактических учреждений, с помощью сканирующей электронной микроскопии.

Нами совместно с лабораторией анатомии микроорганизмов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, возглавляемой JI.B. Диденко, было проведено исследование особенностей структурной организации биопленок, образуемых с участием легионелл, в системах водоснабжения лечебно-профилактических учреждений.

В работе исследовали образцы биопленок из систем горячего водоснабжения ЛПУ г. Москвы. При обследовании ЛПУ были выбраны отделения с высоким уровнем контаминации воды глюкозилтрансферазной активности серогруппы 1 (более Ю4КОЕ\литр воды). Внутренняя поверхность труб системы водоснабжения ЛПУ была недоступна для исследования, а взятие соскобов с внутренней поверхности головок душа и водопроводных кранов приводило к нарушению структуры биопленки. Поэтому для исследования формирования биопленок Legionella pneumophila в системах горячего водоснабжения ЛПУ на водопроводные краны в отделении монтировали антибактериальные фильтры Pall (Аквасейф) (рисунок 4). После экспозиции в течение 1и 3 дней, 1, 2 и 3 недель, соответственно, фильтры демонтировали и исследовали биопленку, сформировавшуюся на внешней поверхности фильтра.

Скорость образования биопленок на фильтрах достаточно высока — через первые сутки, и через неделю на поверхности фильтров можно было видеть отдельные микроколонии (рисунок 5).

Рисунок 4. Исходная микропористая Рисунок 5. Адгезия и формирование поверхность фильтрующего элемента микроколоний (1сут.): кокки палочки ft на фильтре Pall в системе водоснабжения лечебно-профилактических учреждений.

Через 2-3 недели наблюдали организованные смешанные биопленки с хорошо видимыми отдельными бактериями при растрескивании экзополисахаридного матрик-са внутри биопленок, и при формировании номад (рисунок 6).

Рисунок 6. Образование биопленки на фильтре Pall (14 сут.) в системе водоснабжения лечебно-профилактических учреждений

Номады - совокупность бактерий, способных покинуть резидентную биопленку и колонизировать новые поверхности.

Полученные результаты, дают представление о формировании и структуре биопленок, содержащих легионеллы, в потенциально опасных водных системах. Высокая скорость формирования биопленок на поверхности защитных фильтров Pall в системе водоснабжения ЛПУ свидетельствует о высоком уровне контаминации горячей воды в ЛПУ микроорганизмами. В диапазоне температуры воды 45-52°С на поверхности фильтра, установленного на водопроводном кране, в течение 3 недель наблюдали активное формирование биопленок.

Формирование биопленок в системах городского горячего водоснабжения общественных зданий, в том числе ЛПУ, скорее гигиеническая, чем эпидемиологическая проблема. В целом, этот процесс не представляет опасности для здорового населения, поскольку в данном случае нет условий для возникновения мелкодисперсного аэрозоля, а возможна лишь аспирация воды, содержащей легионеллы и другие бактерии, входящие в состав биопленки. В отделениях групп риска ЛПУ ситуация принципиально меняется. Ассоциации микроорганизмов в биопленке могут быть причиной нозокомиальной инфекции в результате аспирации воды пациентами групп риска на фоне иммуносупрессии или сопутствующих заболеваний.

Наиболее распространенные микроорганизмы в биопленках систем водоснабжения ЛПУ г. Москвы в ассоциации с легионеллами: Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas spp., Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter spp., Brevibacterium vesicularis, Micrococcus luteus.

8. Анализ эффективности применения защитных антибактериальных фильтров для профилактики легионеллеза в отделениях групп риска лечебно-профилактических учреждений.

Оценку эффективности метода конечной фильтрации для полной элиминации легионелл в системах горячего водоснабжения ЛПУ проводили с использованием водного антибактериального фильтра Аквасейф AQF3 с принадлежностями производства Палл Медикал (Pall Medical) (Великобритания) в отделении реанимации медицинского учреждения г. Москвы. Фильтры предназначены для разового применения и могут использоваться в течение 14 дней или 31 дня в зависимости от модели.

Ранее проведенные исследования выявили достаточно высокий уровень контаминации L.pneumophila системы водоснабжения ЛПУ (таблица 7).

Таблица 7. Определение уровня контаминации легионеллами горячей воды ЛПУ до и после установки антибактериальных фильтров.

Место отбора проб Концентрация ле-гионелл(КОЕ/л) до установки фильтра Концентрация легионелл (КОЕ/л) через 3 дня после установки фильтра Концентрация легионелл (КОЕ/л) через 7 дней после установки фильтра

Клинико- диагностическая лаборатория 2,8 х 103 4,1х103 3,2x103

Отделение интенсивной терапии 9,9 х 103 не обнаружено не обнаружено

Отделение детской хирургии 9,0 х 103 4,0x103 5,3x103

Помещение бойлерной не обнаружено не обнаружено не обнаружено

Фильтры Аквасейф в сборке монтировали на водопроводные краны в отделении реанимации, образцы воды после фильтра отбирали через 3 дня и через 7 дней после установки фильтра. Легионеллы в пробах воды в отделении интенсивной терапии отсутствовали при сохранении исходного уровня контаминации воды в других помещениях ЛПУ.

ВЫВОДЫ

1. Впервые охарактеризованы уровень и частота колонизации легионелла-ми систем горячего водоснабжения лечебно-профилактических учреждений в Московском регионе. С помощью разработанной методики обследования на основе бактериологического метода и ПЦР в реальном времени. Показано, что Legionella pneumophila присутствует во всех 10 обследованных больничных комплексах и в 85% обследованных зданий ЛПУ. Уровень колонизации образцов воды из систем горячего водоснабжения зданий ЛПУ был различен и колебался в диапазоне от б х 101 до 6,4 х 105 КОЕ на литр воды.

2. С помощью разработанной тест-системы АМПЛИ-ЛЕГ РВ+ показано, что наряду с Legionella pneumophila, в системе горячего водоснабжения ЛПУ присутствует Pseudomonas aeruginosa и ДНК Legionella species.

3. Анализ серологического разнообразия легионелл, циркулирующих в системах горячего водоснабжения ЛПУ, показал, что в водных системах данного типа преобладают штаммы Legionella pneumophila серогруппы б (38%), серо-группы 5 (17%), серогруппы 3 (16%), роль которых наиболее значима в этиологии пневмоний, связанных с оказанием медицинской помощи.

4. Для штаммов легионелл, циркулирующих в системе горячего водоснабжения ЛПУ, характерна гомогенность популяции: в 80% положительных образцов выделен штамм одной из серогрупп Legionella pneumophila, в 20% - штаммы не более 2-х серогрупп.

5. Анализ распределения семейства Lgt среди Legionella pneumophila и Legionella spp., показал, что гены Lgtl и Lgt3 присутствуют у всех штаммов Legionella pneumophila и отсутствуют у Legionella spp., данные типы глюкози-лтрансфераз можно рассматривать в качестве видоспецифических маркеров Legionella pneumophila. Lgt 2 в 2 раза чаще (46%) встречается у клинических штаммов легионелл по сравнению со штаммами Legionella pneumophila, выделенных из окружающей среды (23%).

6. Анализ формирования ассоциированных с легионеллами биопленок на поверхности защитных фильтров, вмонтированных в водопроводные краны системы водоснабжения ЛПУ, с помощью сканирующей электронной микроскопии показал высокую скорость формирования организованных смешанных микробных биопленок (в течение 2-Зх недель) с образованием номад. Наряду с легионеллами, в состав биопленок, формируемых в системе водоснабжения ЛПУ, выявлены и другие бактерии, вызывающие внутрибольничную инфекцию.

7. Профилактика легионеллеза в отделении группы риска ЛПУ с помощью метода конечной фильтрации в системе водоснабжения, контаминированной легионеллами, обеспечивала полную защиту пациентов от контакта с возбудителем.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Садретдинова (Мариненко) О.В. Контаминация Legionella pneumophila систем горячего водоснабжения зданий общественного назначения, в том числе лечебно-профилактических учреждений / О. В. Садретдинова (Мариненко), О. А.

Груздева, Т. И. Карпова, Ю. С. Аляпкина, Ю. Е. Дронина, В.Г. Фокина // Клиническая микробиология и антимикробная терапия -2011. - № 2. - 163-168.

2. Садретдинова (Мариненко) О.В. Распространение глюкозилтрансферазы Lgt среди штаммов Legionella pneumophila , выделенных из различных источников / О.

B. Садретдинова (Мариненко), К. Люк, Т.И. Карпова, Ю.Ф. Белый, И. С. Тарта-ковский //Журн. Микробиологии -2012. -№ 3. - 8-12.

3. Тартаковский И.С. Изучение частоты и уровня контаминации и Legionella pneumophila потенциально опасных водных объектов в Московском регионе / И. С. Тартаковский, И. В. Новокшонова, О. В. Садретдинова (Мариненко), О. А. Груздева, Ю. С. Аляпкина, Т. И. Карпова, Ю. Е Дронина, В. Г Фокина, Н. М. Шустрова// Журн. Микробиологии - 2010. - № 6. - 21-26.

4. Дронина Ю.Е. Моноклональные антитела к липополисахариду легионелл и их значениедля типированя возбудителя / Ю. Е. Дронина, К. Люк, Ю. Хельбиг, И. С. Тартаковский, О. В. Садретдинова (Мариненко), Т. И. Карпова, Н. В. Каражас, Т. Н. Рыбалкина, И. В. Новокшонова, О. А. Груздева, С. С. Смирнова, Е. Ю. Кочеров-ская // Жизнь без опасностей - Москва, 2010. - № 4. - 122-125.

5. Диденко Л.В. Морфологические особенности биопленок в потенциально опасных водных системах / Л. В. Диденко, О. В. Садретдинова (Мариненко), Н. В. Шевлягина, Г. А. Автандилов, И. В. Новокшонова, Т. И. Карпова, О. А. Груздева, И.

C. Тартаковский // Эпидемиология и инфекционные болезни - 2012. - №1,- 1014.

6. Дронина Ю.Е. Особенности формирования биопленок легионелл в искусственных и природных водных системах / Ю. Е. Дронина, Т. И. Карпова, О. В. Садретдинова (Мариненко), Л. В. Диденко, И. С. Тартаковский // Журн. Микробиологии - 2012. - № 4. - 76-80.

7. Дронина Ю.Е. Серологическая характеристика штаммов Legionella pneumophila, выделенных из потенциально опасных водных систем в Российской Федерации в 2007-2011 годах / Ю. Е. Дронина, И. С. Тартаковский, О. В. Садретдинова (Мариненко), Т. И. Карпова, И. В. Новокшонова, О. А. Груздева, Н. В. Каражас, Т. Н. Рыбалкина // Журн. Микробиологии - Москва, 2012. - № 2. - 23-27.

8. Груздева O.A. Анализ уровня и частоты контаминации Legionella pneumophila систем горячего водоснабжения лечебно-профилактических учреждений Москвы / О. А. Груздева, Н. Н. Филатов, О. В. Садретдинова (Мариненко), Т. И. Карпова, Ю. Е. Дронина, Н. М. Шустрова, Ю. С. Аляпкина, В. Г. Фокина, Г. Ю. Никитина, Н. Е. Дроздова, Ю. В. Никольская, И. С. Тартаковский // Эпидемиология и инфекционные болезни - 2012. - № 1. -10-14.

9. Демина Ю.В. Болезнь легионеров как проблема биобезопасности / Ю. В. Демина, Т. И. Карпова, О. В. Садретдинова (Мариненко), Ю. Е. Дронина // Материалы конференции «Теоретические и практические аспекты современной эпидемиологии» посвященной 75-летию Б. Л. Черкасского - 2009. - 95-99.

10. Yu. Alyapkina, Т. Karpova, О. Sadretdinova (Marinenko), J. Alekseev, I. Novokshonova Quality and quantity detection of Legionella in environmental water samples // Abstracts of international conference Legionella - Paris, 2009. - 263

11. O. Voronina, M. Kunda, V. Bikina, O. Sadretdinova (Marinenko), T. Karpova, Ch. Luck Distribution of Legionella pneumophila serogroups and monoclonal antibody subgroups in environmental isolates from Russia (2005-2009) // Abstracts of international conference Legionella - Paris, 2009. - 263

12. O. Sadretdinova (Marinenko), Yu. Belyi Distribution of glucosiltransfrases Lgt among Legionella // Abstracts of 25th EWGLI meeting, September -Copenhagen, 2010.- 63

13. O. Sadretdinova (Marinenko), T. Karpova, Yu. Dronina, Yu. Alyapkina, I. Novokshonova, O. Grusdeva Evaluation of Legionella pneumophila contamination of potentially dangerous water systems in Moscow region // Abstracts of 25 th EWGLI meeting, September - Copenhagen,2010. - 74

14. Yu. Dronina, P. C. Luck, J. Helbig, O. Sadretdinova (Marinenko), T. Karpova Sero- and subgroup distribution of Legionella pneumophila strains isolated from potentially dangerous water systems in Russia during 2007-20117/ Abstract book of 26th meeting European working group on Legionella infection - Vena,2011. - Austria,2011. -

166-173.

Список сокращений

ЛПУ

ПЦР-РВ

КОЕ

LGT 1/2/3

кДа

Sg

Лечебно-профилактическое учреждение

Полимеразно-цепная реакция в режиме реального времени

Колониеобразующая единица

Глюкозилтрансферазы легионелл 1/2/3

Килодальтон

Серогруппа

Подписано в печать: 11.09.14 Тираж: 80 экз. Заказ № 1198 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект, д. 74 (495)790-47-77; www.reglet.ru