Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление и характеристика легионелл в потенциально опасных водных системах и модельных биопленках

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выявление и характеристика легионелл в потенциально опасных водных системах и модельных биопленках"

□0345G803

Напшвах рукописи

ДРОНИНА Юлия Евгеньевна

Выявление и характеристика легионелл в потенциально опасных водных системах и модельных

биопленках.

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2008

12 тгщ

003456803

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Тартаковский Игорь Семенович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Бондаренко Виктор Михайлович доктор медицинских наук, профессор Белокрысенко Сергей Сергеевич

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава

Защита диссертации состоится "19 " декабря 2008 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.007.01 в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Автореферат разослан "18 " ноября 2008 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

Доктор медицинских наук, профессор

Русакова Е.В.

Актуальность работы

Легионеллезная инфекция известна уже более 30 лет и разработаны методы её диагностики и лечения, однако, возбудитель по-прежнему представляет существенную угрозу общественному здоровью, вызывая крупные эпидемические вспышки с летальными исходами в различных странах мира. Среди наиболее заметных эпидемических вспышек легионеллеза, например в Голландии 1999г. (188 случаев/16 летальных), Австралии 1999г. (98случаев/9летальных), Испании 2002г. (470 случаев /9 летальных), Франции 2004г. (86 случаев /16 летальных), Норвегии 2005г. (55 случаев /Юлетальных), своё место заняла и вспышка легионеллеза в Российской Федерации - г. Верхняя Пышма в 2007г., во время которой заболели 127 человек, при этом зарегистрировано 5 летальных исходов (Онищенко Г.Г., Покровский В.И., Тартаковский И.О. и др., 2008).

Наиболее распространенным фактором передачи возбудителя легионеллеза является мелкодисперсный аэрозоль, контаминированный легионеллами. Капли водного аэрозоля диаметром менее 5 микрон легко проникают в нижнюю часть респираторного тракта и далее в альвеолы легких, где вирулентные штаммы легионелл активно размножаются в альвеолярных макрофагах, вызывая острую тяжелую пневмонию. Альтернативным путем передачи является аспирация водопроводной воды. В связи с тем, что температура воды в системе горячего водоснабжения в большинстве Европейских стран и США не превышает 50°С, что крайне благоприятно для размножения возбудителя, все большее количество спорадических и групповых случаев легионеллеза связывают с аспирацией водопроводной воды (Edelstein Р.Н.,1994; Stout JE, 1997).

Легионеллы широко распространены в природных водоёмах, где они паразитируют в организме водных амёб и не представляют существенной опасности для человека. В инженерно-технических сооружениях, связанных с циркуляцией воды, концентрация возбудителя резко возрастает за счет

образования биопленок на поверхности оборудования, что является ключевым фактором накопления легионелл в потенциально опасных концентрациях, а в сочетании с возможностью аэрогенного распространения возникает угроза здоровью людей (Темежникова Н.Д., Тартаковский И.С., 2007). Сложность количественной оценки легионелл в сочетании с высокой устойчивостью к дезинфекционным препаратам создают существенные трудности в оценке потенциальной опасности данных систем и проведении профилактических мероприятий. В этом отношении разработка методов количественного выявления легионелл в потенциально опасных водных системах, создание экспериментальных моделей биопленок для оценки методов выявления возбудителя и действия дезинфекционных препаратов, является одним из наиболее перспективных подходов.

Цель работы: разработать методы выявления и количественного определения легионелл в потенциально опасных водных системах и модельных биопленках.

Задачи исследования:

1.Получить коллекцию отечественных штаммов легионелл, выделенных из потенциально опасных водных объектов окружающей среды.

2.Разработать и внедрить в практику алгоритм количественного выявления легионелл в модельных и природных образцах воды и биопленок с помощью сочетания бактериологического метода и ПЦР в реальном времени.

3.Изучить способность к формированию биопленок у различных видов и штаммов легионелл при различных условиях культивирования, выявить отличия в способности к образованию биопленок у разных штаммов легионелл.

4.Изучить способность легионелл к персистенции в ассоциативных биопленках образованных другими микроорганизмами.

5.Разработать методику оценки действия дезинфекционных средств. Изучить эффективность действия различных дезинфекционных препаратов против легионелл на модельных биопленках и в водных системах.

Научная новизна работы:

- Создана коллекция отечественных штаммов легионелл, выделенных из потенциально опасных водных объектов окружающей среды (градирни промышленных предприятий, система автономного водоснабжения, бассейн).

- Впервые разработан алгоритм выявления легионелл в потенциально опасных водных системах, основанный на сочетании ПЦР в реальном времени и бактериологических методов.

- Впервые выявлен различный уровень способности штаммов легионелл к формированию моновидовых биопленок.

Разработаны методические подходы к оценке действия дезинфицирующих препаратов на легионеллы на модели биопленок и в водных системах.

Практическая значимость работы:

- Разработанный алгоритм определения легионелл в водных системах и биопленках на основе скрининга с помощью ПЦР-РВ с последующим бактериологическим подтверждения включен в качестве базового метода в методические указания Роспотребнадзора МУК 4.2.2217-07. «Выявление бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды», 2007г.

Разработана методика определения эффективности действия дезинфекционных препаратов на модельных биопленках легионелл.

Апробация диссертационной работы состоялась на научной конфенции отдела медицинской микробиологии ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (18 сентября 2008г.)

Материалы диссертации доложены на IX съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, апрель 2007), 22 и 23 конференции Европейской рабочей группы по легионеллезу, (Лиссабон, 2006; Стокгольм, 2007), на 18 конгрессе Европейского респираторного общества (Берлин, 2008).

Объём и структура диссертации. Работа выполнена на 97 страницах машинописного текста и иллюстрирована 8 рисунками и 16 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 114 источников.

Содержание работы

Материалы и методы

Все штаммы легионелл выращивали на плотной агаризованной среде буферный угольно-дрожжевой агар (БУДРАГ, BCYEa) с ростовой и селективной добавкой («Oxoid») при 37С в течение 72ч., также в качестве ростовых добавок применяли L-цистеин 400мг/л (Япония) и пирофосфат железа растворимый 250мг/л («Sigma»), приготовленные в условиях лаборатории. Для выращивания легионелл в жидкой среде использовали Proteose-Pepton №3 («Difco») с добавлением L-цистеина, инкубировали на круговой качалке при 37С в течение 72ч.

Выделение штаммов Legionella spp. из окружающей среды. Выделение Legionella spp. проводилось в соответствии с методикой, описанной в ISO standard: Water quality-detection and enumeration of Legionella.1998.

Получение биопленок легионелл. Тестирование всех штаммов легионелл на способность формировать биопленки проводили в 96луночных плоскодонных пластиковых планшетах для иммуноферментного анализа (Costar). Выращенные в бульоне культуры тестируемых штаммов разводили свежей питательной средой 1:10. Полученные суспензии стерильно вносили по 150 мкл в лунки планшет (по 4 лунки для каждого штамма). Для контроля фона также в 4 лунки вносили питательную среду, в которой инкубировали культуры. Планшет помещали в термостат на 96ч (при температуре 28°С) для подращивания. Оптическую плотность выросших планктонных клеток определяли на фотометре iEMS Reader MF «Labsystems» (Швеция) при длине волны 540 нм. Затем содержимое лунок осторожно отсасывали и вносили по

150 мкл дистиллированной воды и 15 мкл 1% спиртового раствора кристалл виолста. Планшеты инкубировали при комнатной температуре (20°С) в течение 45 мин. Затем краситель осторожно отсасывали и промывали лунки дважды дистиллированной водой. В отмытые от несвязавшейся краски лунки вносили по 200 мкл этилового спирта и оставляли на 45 мин при комнатной температуре. Интенсивность окрашивания спирта в лунках планшеты оценивали на фотометре при длине волны 540 нм.

Сравнительную оценку способности штаммов Legionella spp. к формированию биопленок определяли при культивировании в питательной среде (96 часов) и воде (до 2 недель).

Данные средних арифметических значений, полученные для каждой из четырех лунок при определении оптической плотности клеток и при определении интенсивности окрашивания спиртового раствора, обрабатывали по программе Excel.

Получение биопленок других микроорганизмов. Для работы использовали типовые штаммы Salmonella typhimurium и Pseudomonas aeruginosa. Бактериальные культуры выращивали в жидкой Luria-Bertani (LB) или агаризованной среде MacCONCEY AGAR (DIFCO), SS-агаре, при 37С. Моновидовые биопленки получали в соответствии с методикой, предложенной Алексеевой Н.В. (ЖМЭИ, 4,2006).

Определение легионелл методом ПЦР-РВ. Для проведения ПЦР в реальном времени были выбраны следующие праймеры и флуоресцентные зонды: для выявления Legionella spp. - из последовательности гена, кодирующего 16S рРНК (GenBank СР00675): Lgl 5'-AGTGGGGAGGAGGGTTGATAGGTTA; Lg2 5'-

TCTCTACGCATTTCACCGCTACACC; Pb_Lg 5'-ROX-

AAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCA-RTQ2, для выявления Legionella pneumophila - из последовательности гена mip (GenBank AJ496381): mipl 5'-TATAGCATTGGTGCCGATTTGG; mip2 5'-

GCTTTGCCATCAAATCTTTCTGAA; Pb_Lmip 5'-R6G-

ACCCGGAAGCAATGGCTAAAGGCATGC - BHQ2. Выбранные флюоресцентные зонды были линейными и содержали флюорофоры на 5'-конце и соответствующие им гасители на З'-конце.

Тест-система АМПЛИ-ЛЕГ-РВ позволяет в одной пробирке одновременно провести три независимые реакции: реакцию на наличие специфического фрагмента ДНК гена 16S р РНК Legionella spp., реакцию на наличие специфического фрагмента ДНК гена mip L.pneumophila и реакцию внутреннего положительного контроля, позволяющую исключить недостоверные результаты. Для количественного определения L.pneumophila использовали калибровочные образцы плазмиды pGEM, содержащей фрагмент гена mip L.pneumophila с известными концентрациями.

Для проверки родо- и видоспецифичности системы в работе использовали ДНК бактерий Salmonella typhimurium, E.coli, Pseudomonas aeruginosa и различных видов легионелл. В работе использовали также коммерческие тест-системы Кванти-Legionella pneumophila и Квант-Legionella spp.

Определение чувствительности легионелл к действию дезинфицирующих препаратов. В качестве дезинфицирующих средств использовали препараты в следующих концентрациях: ЭКОСЕПТ (0,005%; 0,05%; 0,5%), СЕПТУСЕРИЛ (0,4%; 1%; 2%; 2,5%), ТРИЛОКС (0,1%; 0,5%; 1,5%), ЭКОБИОЦИД М (0,5%; 0,75%; 1%), СЕПТУСТИН М (0,2%; 0,3%; 0,4%; 0,6%; 0,8%), Саносил Супер 25 (0,5%; 1%; 2%; 6%; 8%)

Культуру и биопленки легионелл получали в соответствии с методикой, описанной ранее. Для оценки действия дезинфектантов на суспензию возбудителя использовали концентрации культур 10 и 104 КОЕ на мл. Экспозиция дезинфектанта с возбудителем для предотвращения образования биопленок на пластиковой поверхности и воздействия на сформированную биопленку составляли 15,30 и 60 мин; для суспензии клеток легионелл 15 и 30 мин.

Результаты н обсуждение

1. Выделение легионелл из объектов окружающей среды.

Нами была получена коллекция из 66 штаммов легионелл, выделенных из различных водных объектов на территории Российской Федерации (Москва, Московская область, Тверская область, Свердловская область, Ханты-Мансийский национальный округ).

Таблица 1. Коллекция легионелл выделенных в период 2005-2008 гг.

№ Штамм Вид Источник Дата выделения

1 ВЦ1-05 Ь.рпеиторЬПа Моек обл., вода из частного бассейна 06.2005г

2 ТОТАЬ-1 Ь.рпеиторЬПа Система автономного водоснабжения, вода, Ханты-Мансийский автономный округ (X-МАО) 10.2006г

3 ТОТАЬ-2 Ь.рпешпорЫ1а Система автономного водоснабжения, вода, Х-МАО 07.2007г

4 ТОТАЬ-З Ь.рпеиторЬПа Система автономного водоснабжения, вода, Х-МАО 10.2007г

5 ТОТАЬ-4 Ь.рпеиторЫ1а Система автономного водоснабжения, вода, Х-МАО 10.2007г

6 ТОТАЬ-5 Ь.рпеиторЬПа Система автономного водоснабжения, вода, Х-МАО 10.2007г

7 ТОТАЬ-6 Ь.рпеиторЬПа Система автономного водоснабжения, вода, Х-МАО 102007г

8 ТОТАЬ-7 Ь.рпеиторЬПа Система автономного водоснабжения, вода, Х-МАО 01.2008г

9 ТОТАЬ-8 Ь.рпеиторЬПа Система автономного водоснабжения, вода, Х-МАО 01.2008г

10 ТОТАЬ-9 Ь.рпеиторЬПа Система автономного водоснабжения, вода, Х-МАО 01.2008г

И ТОТАЫО Ь.рпеиторЬПа Система автономного водоснабжения, вода, Х-МАО 20.03.2008г

12 ТОТАЬ-11 Ь.рпеиторЬПа Система автономного водоснабжения, вода, Х-МАО 20.03.2008Г

13 ТОТАЫ2 Ь.рпеиторЫ1а Система автономного водоснабжения, вода, Х-МАО 20.03.2008г

14 ТОТАЬ-Н Ь.рпеиторЬПа Система автономного водоснабжения, вода, Х-МАО 27.05.2008г

15 ТОТАЫ5 Ь.рпеиторЬПа Система автономного водоснабжения, вода, Х-МАО 27.05.2008г

16 ТОТАЫб Ь.рпеиторЬПа Система автономного 23.06.2008г

водоснабжения, вода, Х-МАО

17 ТОТАЫ7 Ь.рпеиторЫ1а Система автономного водоснабжения, вода,Х-МАО 23 06.2008г

18 РузЬта-1 Ь.рпеиторЫ1а Легочная ткань (секционный материал), г. Верхняя Пышма (ВП) 08.2007г

19 Ру5Ьта-2 Ь.рпеиторЫ1а Дренажный канал городского теплопункта, биоплёнка, ВП 08 2007г

20 РуэЬта-З Ь.рпеиторЫ1а Квартира больного лепюнеллезом, смыв с сетки душа, ВП 08.2007г

21 Ру5Ьта-4 Ь.рпеиторЫ1а Дренажный канал городского теплопункта, вода, ВП 08.2007г

22 Ру^Ита-З Ь.рпеиторЬНа Градирня, вода, ВП 08.2007г

23 Ру5Ьта-6 Ь. апиа Коллекторный колодец, вода,ВП 08.2007Г

24 РуэЬта-? Ь. ^аЦапа Коллекторный колодец, вода, ВП 08.2007г

25 Р\'5Ьта-8 Ь.яогтапп Коллекторный колодец, вода, ВП 08 2007г

26 РуБЬша-Э Ь.рпеиторЬПа Дренажный канал, биопленка, ВГ1 08.2007г

27 РувЬта-Ю Ь.рпеиторЫ1а Градирня, насос, вода, ВП 12.2007Г

28 Ру5Ьта-12 Ь.рпеиторЫ1а Градирня, насос, вода, ВП 12.2007г

29 РузЬта-13 Ь.рпеиторЫ1а Градирня, чаша, водаВП 12.2007г

30 РуэЬта-М Ь.рпеиторЫ!а Градирня, чаша, водаВП 12.2007г

31 РузЬта-15 Ь. ^гаиала Отстойник, вода, ВП 12.2007г

32 Ру5Ьта-16 Ь.рпеиторЫ1а Отстойник, вода, ВП 12.2007г

33 РуБЬта-П Ь.рпеиторЫ1а Отстойник, вода, ВП 12.2007г

34 Ру5Ьта-18 Ь.рпеиторЬПа Отстойник, вода, ВП 12.2007г

35 Ру5Кта-19 Ь.рпеиторЬНа Градирня, насос, вода, ВП 12.2007г

36 Ру5Ьта-20 ирпеиторШа Градирня, насос, вода, ВП 12.2007Г

37 Ру8Ьта-21 Ь.рпеиторЫ1а Градирня, чаша, вода, ВП 12.2007г

38 Ру5Ьта-22 Ь.рпеиторЬПа Градирня, вода из чаши, ВП 12.2007Г

39 Ру5Ьта-24 Ь.рпеиторЬПа Градирня, насос, вода, ВП 12.2007г

40 Ру5Ьта-26 Ь.рпеиторЬПа Градирня, биопленка, ВП 12.2007г

41 Ру5Ьта-27 Ь.рпеиторЬПа Градирня, биопленка, ВП 12.2007г

42 Ру5Ьта-28 Ь.рпеиторЬПа Градирня, биопленка, ВП 12.2007Г

43 Ру5Нта-29 Ь.рпеиторЬПа Отстойник, биопленка, ВП 07.2008г

44 РувЬта-ЗО Ь.рпеиторЬПа Отстойник, биопленка, ВП 07.2008Г

45 РухЬта-З1 Ь.рпеиторЬПа Отстойник, биопленка, ВП 07.2008г

46 РуэИта-Зг Ь.рпеиторЬПа Бассейн для сброса воды СУГРЭС, биопленка, ВП 07.2008г

47 РузЬта-ЗЗ Ь.рпеиторЬПа Градирня, биопленка, ВП 07.2008г

48 Ру5Ьта-34 Ь.рпеиторЬПа Градирня, биопленка, ВП 07.2008г

49 Ру$Ьта-35 Ь.рпеиторЬПа Градирня, биопленка, ВП 07.2008Г

50 Ру$Ьта-36 Ь.рпеиторЬПа Градирня, биопленка, ВП 07.2008г

51 Ру$Ьта-37 Ь.рпеиторЬПа Градирня, биопленка, ВП 07.2008г

52 РувЬта-Зв Ь.рпеиторЬПа Градирня, биопленка, ВП 07.2008г

53 Ру5Ьта-39 Ь.рпеиторЬПа Градирня, биопленка, ВП 07.2008г

54 РувЬтаЦО Ь.рпеиторЬПа Градирня, биопленка, ВП 07.2008г

55 Ру$Ьта-41 Ь.^йапа Градирня, биопленка, ВП 07.2008г

56 Ру5Ьта-42 Ь.рпеиторЬПа Градирня, биопленка, ВП 07.2008г

57 Ру8Ьта-43 Ь.рпеиторЬПа Градирня, биопленка, ВП 07.2008г

58 РувЬта-ФФ Ь.рпеиторЬПа Градирня, вода, ВП 07.2008г

59 Ру51тта-45 Ь.рпеиторЬПа Градирня, насос, вода, ВП 07.2008г

60 Pyshma-46 L.pneumophila Градирня, чаша, вода, ВП 07.2008Г

61 Pyshma-47 L.pneumophila Градирня, чаша, вода, ВП 07.2008Г

62 Pyshma48 L pneumophila Градирня, насос, вода, ВП 07.2008Г

63 Tver 123.30 L pneumophila Техническая вода промпредприятия, Тверская область 07.2008Г

64 Tver 220.1 L.pneumophila Техническая вода промпредприятия, Тверская область 07.2008Г

65 Tver 869.1 L.pneumophila Техническая вода промпредприятия, Тверская область 07.2008Г

66 Moscow 4.7 L.pneumophila Техническая вода промпредприятия, Москва 07.2008Г

Х-МАО - Ханты-Мансийский Автономный Округ, ВП - Верхняя Пышма

Таблица 2. Источники выделения легионелл.

Источник Количество штаммов

Вода и биопленки градирен промышленных предприятий 35

Вода и биопленки систем автономного и городского водоснабжения 26

Техническая вода 4

Вода частного бассейна 1

В 21 случае возбудитель был выделен из природных биопленок. Из выделенных штаммов: 23 принадлежат к Legioneila pneumophila серогруппы 1, с которыми связаны более 90% эпидемических вспышек и спорадических случаев легионеллеза , 40 - к другим серогруппам Legionella pneumophila. Впервые на территории России выделены культуры, принадлежащие к Legionella gormanii и Legionella gratiana.

2. Отработка методики ПЦР в реальном времени для легионелл.

Для отработки метода выделения мы провели несколько модельных

экспериментов. В качестве образцов для исследования использовали различные

разведения смеси культур L.pneumophila и L.micdadei и модельные

монобиопленки культур L.pneumophila штамм Philadelphia 1; L. pneumophila

штамм BLR-05; L.dumoffr, L.longbeachae; на стадии пробоподготовки

сравнивали 2 вида фильтров (нитроцеллюлозные, поликарбонатные). Для

9

количественного определения L.pneumophila использовали калибровочные образцы плазмиды pGEM (рис 1), содержащей фрагмент гена mip L.pneumophila с известными концентрациями.

Legionella spp. и Legionella pneumophila «АМПЛИ-ЛЕГ-РВ»

По результатам экспериментов чувствительность системы АМПЛИ-ЛЕГ-РВ составила для L.pneumophila: 102/500 мл и 102/100 мл - при использовании поликарбонатных фильтров и 103/500 мл, 102/100 мл - при использовании нитроцеллюлозных фильтров. Для L.micdadei чувствительность составила 102/500 мл в реакции определения родоспецифического маркера - ДНК гена 16S рРНК Legionella spp., в реакции определения видоспецифического маркера Legionella pneumophila - ДНК гена mip результат был отрицательный. Анализ экспериментальных биопленок также подтвердил видоспецифичность тест-системы при определении ДНК гена mip и родоспецифичность при определении ДНК гена 16SpPHK.

3. Применение ПЦР в реальном времени для выявления легионелл в воде и биопленках потенциально опасных водных систем.

Метод ПЦР-РВ был использован нами для определения легионелл при профилактическом мониторинге централизованной системы

кондиционирования воздуха, автономной системы водоснабжения используемой в полевых условиях, градирен промышленного предприятия.

Таблица 3. Выявление легионелл бактериологическим и ПЦР-РВ методами при профилактическом мониторинге блоков увлажнения централизованной системы кондиционирования воздуха, градирен промышленного предприятия и образцов воды системы автономного

водоснабжения.

Образец Источник взятия пробы ПЦР-РВ (геномных копий на литр) Бактериологический метод (КОЕ/л)

Legionella pneumophila Legionella spp Legionella pneumophila Legionella spp.

Блок увлажн.№ 1 Централизованна - 4x10' - -

Блок увлажн.№ 2 я система кондиционирования воздуха - 6x102 - -

Блок увлажн.№ 3 3,4х102 1,8x10' - 1,4x102

Градирня № 1А Промышленное предприятие 1,9x105 + 2x10' -

Градирня № 1В 9x10" + 1x10' -

Градирня № 2А 3,6x10" + 9x10' -

Градирня № 2В 1,9x10" + 7x10' -

Градирня № ЗА 4,3x10" + 4x10' -

Градирня № ЗВ - + 8x102 -

Отстойник 1,6x105 + 1x10' -

Жилой корпус А холодная вода Система 5x10' - l^xIO3 -

Жилой корпус В, холодная вода автономного водоснабжения - + -

Жилой корпус С, холодная вода 1,6x105 - 1,7x10' -

Жилой корпус А, горячая вода 6x10' - - -

Жилой корпус В, горячая вода 2,3x10' - - -

Жилой корпус С, горячая вода 5,5x10" - - -

Холодная вода до водоподготовки 6,2x10' - 4x10" -

Холодная вода после водоподготовки 8,3x10' - 2x10" -

Горячая вода после котельной 1,0x10" - - -

Полученные результаты свидетельствовали об удовлетворительной корреляции результатов ПЦР-РВ и бактериологического метода. Концентрация легионелл определяемая с помощью ПЦР-РВ (число геномных копий на литр) в большинстве образцов превышала концентрацию легионелл, выявляемую бактериологически (число КОЕ на литр) на 1- 2 порядка. Данный феномен может быть объяснен естественным содержанием в соответствующих экосистемах планктонных форм легионелл, выявляемых как с помощью ПЦР-РВ так и бактериологически, и некультивируемых форм легионелл, выявляемых только с помощью ПЦР-РВ (Garrelly L., 2007). Отсутствие бактериологического выделения возбудителя при достаточно высоком числе геномных копий Legionella pneumophila в образцах воды из системы горячего водоснабжения, по всей видимости, связано с амплификацией ДНК мертвых клеток легионелл после нагревания воды в котельной.

Метод ПЦР-РВ использовался также в качестве скринингового экспресс-метода для анализа образцов внешней среды во время эпидемической вспышки пневмоний легионеллезной этиологии в г. Верхняя Пышма Свердловской области (Таблица 4). Полученные результаты свидетельствовали о широком распространении Legionella spp. в природных и хозяйственных водных системах Верхней Пышмы. Вместе с тем выделение культуры Legionella spp. {Legionella gratiana, L.gormanii) лишь из одного образца воды свидетельствует о низкой концентрации непатогенных видов легионелл, находящихся в воде преимущественно в некульти виру емом состоянии. Присутствие L.pneumophila методом ПЦР-РВ выявляли значительно реже, чем Legionella spp., но в данном случае корреляция ПЦР-РВ и результатов бактериологических исследований более выражена. Скрининг с помощью ПЦР-РВ позволил исключить систему городских фонтанов и воды сбросного канала теплой воды СУГРЭС в качестве возможного источника распространения возбудителя и подтвердил контаминацию бактериями Legionella pneumophila различных участков системы

горячего водоснабжения города и технической воды промышленного предприятия.

Таблица 4. Результаты исследования образцов окружающей среды во время эпидемической вспышки пневмоний в г. Верхняя Пышма с помощью ПЦР-РВ на наличие Legionella spp. и L. pneumophila.

№ п/п Описание образца Результаты оценки методом ПЦР-РВ Выделение культуры

Legionella spp. Legionella pneumophila

Образцы воды

1. Дренажная Еода теплопункта 1 + Lpneumophila серогруппа 1

2. Обводной трубопровод в теплопункте 2 +

3. Дренажный колодец, промывная вода после фильтра, СУГРЭС +

4. Сбросный канал теплой воды + - -

5. Вода из трубы подающего трубопровода теплопункта 1 —

6. Вода из колодца 1 + — L gratiana, L. gormanii

7. Вода из колодца 2 + - -

8. Вода из фонтана № 1 + - -

9. Вода из фонтана № 2 + - -

10. Вода техническая промышленного предприятия + + Lpneumophila серогруппа 3

Смывы биопленок

11. Смыв с поверхности дренажного канала теплопункта 1 + + Lpneumophila ceporpynnal

12. Смыв из дренажной трубы из теплопункта2 — —

13. Смыв из дренажного колодца, СУГРЭС +

14. Смыв из дренажного колодца над кромкой воды, СУГРЭС

15. Внутренняя поверхность трубы подающего трубопровода теплопункта 1

16 Смыв с сетки дренажного канала теплопункта 1 + —

17. Смыв с душевой сетки в квартире больного 1 —

18. Смыв с душевой сетки в квартире больного 2 ■ + Lpneumophila серогруппа 3

4. Формирование моиовидовых биопленок легионелл.

Нами были подобраны оптимальные условия роста бактерий, позволяющие количественно тестировать формируемые ими биопленки. В качестве основных параметров, влияющих на формирование биопленок, определяли начальную концентрацию клеток при засеве, температуру и время инкубации, поверхности планшет.

При подборе начальной концентрации клеток при засеве показано, что оптимальным является разведение 72х часовой культуры в 10 раз, позволяющее получить видимый рост планктонных форм легионелл после инкубации, определяемый с помощью спектрофотометра по оптической плотности при длине волны 540 нм. В качестве минимального срока формирования биопленок легионелл при культивировании в питательной среде использовали инкубацию в течение 96ч. В условиях эксперимента было выявлено, что оптимальной температурой для образования биопленок является 28°С. Поскольку легионеллы являются широко распространенным водным микроорганизмом, мы сравнили способность к формированию биопленок при инкубации клеток в питательном бульоне и воде. При культивировании в воде формирование биоплёнок происходило более медленно. У большинства исследовавшихся штаммов визуальные и фотометрические данные отличались от фоновых незначительно.

После отработки условий культивирования мы сравнивали способность формировать биопленки у 26 штаммов легионелл (10 видов Legionella spp), в том числе были использованы 8 свежевыделенных из объектов окружающей среды штаммов L. pneumophila (L. pneumophila BLR-05, Total 1, Pyshma-1, Pyshma-2, Pyshma-3, Pyshma-4, Pyshma-5, Pyshma-9) и впервые выделенный в России вид L .gratiana.

штамм

Рис. 2. Образование биопленок легионелл в воде через 7 дней. 1 -Legionella pneumophila, Philadelphia 1; 2 — L. pneumophila 194-N; 3 - L. pneumophila 4-M; 4 - Legionella pneumophila BLR-05; 5 - L.longbeachae, Long Beach-4; 6 -L. micdadei; 7 - L.pneumophila, Philadelphia 1 вирулентный; 8 - фон.

Сравнительный анализ выявил различия в способности к формированию монобиопленок в статических условиях у штаммов различных видов легионелл и у штаммов принадлежащих к виду L. pneumophila (рис 3).

0.8

Рис. 3. Эффективность планктонного роста и биопленок в воде на 7-е сутки. Ряд 1 - планктонные клетки; ряд 2 - биопленки.

По результатам проведенных нами экспериментов, все штаммы по

способности к формированию биопленок можно разделить на 3 группы:

15

1. В первую входит штамм L. pneumophila BLR-05 выделенный из воды во время группового случая легионеллеза в Московской области и обладающий наиболее выраженной способностью к формированию моновидовых биопленок и к персистенции в ассоциации с биопленокой Р. aeruginosa.

2. Штаммы с хорошо выраженной способностью к образованию биопленок, выделенные во время эпидемической вспышки в Пышме и при обследовании автономной системы водоснабжения в Ханты-Мансийском округе, а также коллекционные штаммы легионелл: Legionella pneumophila, Philadelphia 1; Legionella pneumophila, Philadelphia 1 - вирулентный; Legionella pneumophila Total-1; Pyshma-1; Pyshma-2; Pyshma-3; Pyshma-4; Pyshma-5 ;Pyshma-9; L. pneumophila 4-M; L. pneumophila 194-N; L. gratiana; L.dumoffli; L.longbeachae, Long Beach-4; L.bozemanii; L.anisa; L.oakridgensis; L. feeleii; L. hackeliae;

3. Штаммы со слабо выраженной способностью или неспособные к формированию биопленок: L. pneumophila Los-Angel es-]; L. pneumophila 1-M; L. pneumophila 2-M; L. pneumophila 3-M; L.erythra; L. micdadei.

5. Биопленки легионелл в ассоциации с другими микроорганизмами.

На следующем этапе исследований анализировалась способность легионелл сохранять жизнеспособность и персистировать в биопленках, формируемых Р. aeruginosa и S. typhimurium в течение 7 и 14 дней. Проведенные эксперименты показали, что легионеллы способны персистировать в совместных биоплёнках, сохраняя жизнеспособность. Показано, что штаммы L. pneumophila различаются по способности к персистенции в биопленке, образованной Р. aeruginosa. Для штамма BLR-05 показана способность не только к сохранению, но и увеличению числа жизнеспособных клеток в течение 2х недель инкубации. (Рис.4). Для других

использованных в работе штаммов легионелл показано снижение числа жизнеспособных клеток в процессе эксперимента. Одновременно с бактериологическим методом применяли метод ПЦР-РВ, однако разницы в количестве генных копий через 7 и 14 дней выявлено не было.

Рис 4. Персистенция штаммов легионелл в ассоциации с биопленками, образованными Pseudomonas aeruginosa. 1 - Legionella pneumophila, Philadelphia 1, ATCC 33152; 2 - L. pneumophila BLR-05; 3-1. pneumophila TOTAL 1.

6. Изучение действия дезинфицирующих препаратов на модели бноплснок легионелл.

Мы предположили, что модель разработанных нами моновидовых биопленок может стать полезным инструментом оценки действия дезинфицирующих средств.

В работе изучалась активность ряда дезинфицирующих веществ с различным механизмом действия на основе поверхностно-активных веществ и окислителей, разрешенных к применению в РФ. В эксперименте использовали 5 препаратов: «Экосепт», «Септустерил», «Трилокс», «Экобиоцид М» и «Септустин М». Задачей исследования было сравнение эффективности действия препаратов на суспензию клеток и сформированную биопленку легионелл, а также на способность препаратов препятствовать формированию биопленки при предварительной обработке поверхности пластика.

Установлено, что для всех исследованных препаратов бактерицидные концентрации для суспензии легионелл ниже концентраций, необходимых для деградации или предотвращения формирования моновидовых биопленок. Каких-либо различий между концентрациями препарата, необходимыми для деградации или обеспечивающими предотвращения биопленок не выявлено.

Таблица 5. Минимальная бактерицидная концентрация препарата при действии

на суспензию легионелл.

Концентрация Суспензия Суспензия

^^\легионелл легионелл легионелл

102 КОЕ/мл 104 КОЕ/мл

Дезинфектант

Экосепт 0,05% 0,5%

Септустерил 0,4% 1,5%

Трилокс 0,1% 0,2%

Экобиоцид М 0,5% 0,75%

Септу стин М 0,25 0,3%

Таблица 6. Минимальная концентрация препарата необходимая для деградации и препятствующая формированию биопленки легионелл.

Дезинфектант концентрация препарата

Экосепт 0,5%

Септу стерил 2,5%

Трилокс 1,5%

Экобиоцид М 1%

Септу стин М 0,8%

Среди изучавшихся препаратов, наибольшей активностью в отношении

биопленок легионелл обладал ЭКОСЕПТ в концентрации 0,5%, в качестве

действующего вещества содержавший полигуанидин, при этом она значительно

превосходит бактерицидную концентрацию рекомендуемую для дезинфекции

(0,003 - 0,18%). Наибольшая концентрация, также превосходящая

рекомендуемую при их использовании, требовалась для СЕПТУСТЕРИЛА и

ТРИЛОКСА. Концентрация ЭКОБИОЦИДА, необходимая для бактерицидного

18

действия на биопленки (1%) находилась на максимальном пределе рекомендуемого уровня по перекиси водорода. Полученные результаты подтверждают наши предположения о необходимости применения более высоких концентраций дезинфекционных препаратов для биопленок легионелл, по сравнению с суспензией клеток, выращенных на агаровых средах.

Изученные нами препараты рекомендуются в основном для обработки поверхностей и могут применяться для профилактики внутрибольничного легионеллеза, поэтому далее мы изучали действе препарата САНОСИЛ СУПЕР 25 на основе перекиси водорода и серебра, используемого за рубежом в градирнях промышленных предприятий и рекомендованного для разрушения природных биопленох микроорганизмов в потенциально опасных водных системах. С октября 2007г. данный препарат используется в градирнях УГМК Верхней Пышмы и в настоящее время проходит утверждение в НИИ дезинфектологии.

Полученные результаты по данному препарату свидетельствуют о заметных различиях в концентрации препарата при одинаковом времени контакта (15мин.) необходимых для гибели суспензии клеток, деградации сформированных биопленок легионелл и предотвращения формирования биопленок после обработки поверхности: 0,5%; 2% и 8% соответственно и подтверждают необходимость применения более высоких концентраций препаратов при действии на биопленки.

7. Изучение действия препарата «СаносилСупер 25» на легионеллы в градирне промышленного предприятия.

Эффективность препарата Саносил Супер 25 определялась в Зх градирнях промышленного предприятия, контаминированных легионеллами. Препарат применяли в течение 7 месяцев в концентрации 10-20 мг/л с 2х кратным применением шоковых доз 100 мг/л. Первоначально для всех градирен были выявлены высокие концентрации возбудителя в циркулирующей воде и наличие значительных поверхностей покрытых природными биопленками,

содержащими L. pneumophila. В градирне №1 применяли только Саносил Супер 25 без элиминации биопленок, в градирне №2 биопленки были устранены механически в процессе применения препарата, в градирне №3 - ранее применяли другой дезинфектант (таблица 7).

Таблица 7. Действие препарата «Саносил Супер 25» на легионеллы в градирнях

промышленного предприятия.

До применения препарата август 2007г Начало применения препарата, декабрь 2007г 7 мес. после применения препарата, июнь 2008г

Градирни Планктонные формы легионелл а о X 4> § § Планктонные формы легионелл к S i § Планктонные формы легионелл а 0 К и 1 1

Бактер. метод КОЕ/л | : ПЦР-РВ геномных ! копий/л § у vo о U = § ж tu lis ПЦР-РВ геномных копий/л ° ё УО О 5 О X Бактер. Метод | КОЕ/л ПЦР-РВ геномных копий/л s я ю о « Е 5 « £ 4 5 X

№1 1.2x10* ЗхЮ5 + IxlOJ 9х104 + 2x10' ю4 +

№2 4x103 2,4x10s + вхЮ-1 2xlOJ + 1,5x1 о2

№3 3,6х104 5x106 + 7x10' 1,9х104 + 6x10J ю4 +

Проведенные исследования с помощью бактериологии и ПЦР-РВ показали наибольшую эффективность препарата в том случае, когда его применение сопровождалось механическим устранением биопленок. В этом случае возбудитель выявляли в образцах воды только с помощью ПЦР-РВ при отсутствии бактериологического выделения культуры легионелл. В градирнях, в которых биопленки не были устранены, возбудитель выявляли в воде как бактериологически, так и с помощью ПЦР-РВ. Конечная концентрация легионелл в воде в этих градирен находилась на грани допустимых концентраций - 2-6х103, несмотря на 2х кратное применение шоковых доз препарата.

Таким образом, в результате проведенных исследований, выявлен

существенный уровень контаминации легионеллами потенциально опасных

водных систем в Российской Федерации, способный привести к возникновению

эпидемических вспышек легионеллеза. Разработан и внедрен в практику

20

алгоритм исследования потенциально опасных водных систем, основанный на сочетании ПЦР-РВ и бактериологии. На базе разработанной модели выявлен различный уровень способности штаммов легионелл к формированию биопленок. Разработаны методические подходы к оценке действия дезинфицирующих препаратов на легионеллы на модели биопленок и в водных системах.

Выводы:

1. Получена коллекция 66 штаммов возбудителя из потенциально опасных водных систем на основе отработанной методики выделения легионелл из окружающей среды. Впервые в Российской Федерации выделены культуры видов Legionella gratiana и Legionella gormanii.

2. Впервые разработан и внедрен на базе отечественной тест-системы АМЛИ-ЛЕГ-РВ алгоритм количественного выявления легионелл в природных образцах воды и биопленках с помощью бактериологического метода и ПЦР в реальном времени.

3. Разработана методика формирования моновидовых биопленок легионелл в питательной среде и воде. На основе разработанной методики впервые показан различный уровень способности к формированию моновидовых биопленок у штаммов Legionella pneumophila и Legionella spp.

4. Показана способность штаммов легионелл с высоким уровнем формирования моновидовых биопленок персистировать в биопленках, образованных другими микроорганизмами.

5. Разработана методика оценки действия дезинфекционных средств против легионелл на модели биопленок. Показана необходимость применения более высоких концентраций дезинфектантов при действии на модельные биопленки, по сравнению с бактерицидными

концентрациями, рекомендованными для действия на суспензию легионелл. Показано, что элиминация природных биопленок, содержащих легионеллы является необходимым условием успешной дезинфекции потенциально опасных водных объектов.

Список работ по теме диссертации.

1. Tartakovskiy I., Karpova T.I., Dronina Yu., Temznikova N., Alekseeva N., Romanova Yu. Biofilm formation by Legionella spp. In Abstracts of 21 annual meeting of the European working group for Legionella infections. Lisbon, 2006,94.

2. Тартаковский И.С., Лазикова Г.Ф., Федоров Ю.М., Дронина Ю.Е., и др. Определение бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды. Методические указания 4.22.17.07 Роспотребнадзора 2007.

3. Dronina Yu., Karpova Т., Alyapkina Yu., Romanova Yu., Tartakovskiy I., The ability to form biofilms as a marker for Legionella spp. isolates. In Abstracts of 22th meeting of EWGLI group on Legionella infection.Stocholm, 2007,34-35.

4. Тартаковский И.С., Карпова Т.Н., Темежникова Н.Д., Дронина Ю.Е., Ермолаева С.А. Дифференциация штаммов Legionella pneumophila. Сборник «профилактическая медицина - практическому здравоохранению». Москва. Вып.3,2007, с. 274-276.

5. Дронина Ю.Е., Карпова Т.Н., Тартаковский И.С., Аляпкина Ю.С., Романова Ю.М. Определение легионелл в окружающей среде с помощью ПЦР в реальном времени. Материалы IX съезда ВНПОЭМП. Москва, томЗ, 2007, с.25.

6. Карпова Т.И., Дронина Ю.Е., Тартаковский И.С., Алексеева Н.В., Романова Ю.М., Темежникова Н.Д. Особенности образования биопленок легионелл. Материалы IX Съезда ВНПОЭМП, том 2, 2007, с.109-110.

7. Тартаковский И.С., Гинцбург АЛ., Михайлова Д.О., Дронина Ю.Е. и др. Применение стандартов лабораторной диагностики легионеллеза во время эпидемической вспышки пневмоний в городе Верхняя Пышма Свердловской области. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, вып.4, 2007, с.361-368.

8. Дронина Ю.Е., Карпова Т.И., Тартаковский И.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Особенности формирования биопленок легионеллами в природных и искусственных системах, В сборнике трудов «Экология и гигиена помещений Московского региона», вып.З,

2007, с.12-18.

9. Карпова Т.И., Дронина Ю.Е., АлексееваН.В., Романова Ю.М. Формирование биопленок Legionella spp. в эксперименте. ЖМЭИ №1,

2008, с.3-7.

10. Карпова Т.И., Дронина Ю.Е., Тартаковский И.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Природные биопленки легионелл и их роль в эпидемиологии инфекции: методы изучения и моделирования. ЖМЭИ №2,2008, с.13-16.

11. Тартаковский И.С., Гинцбург АЛ., Лазикова Г.Ф., Чистякова Г.Г., Демина Ю.В., Дронина Ю.Е.,и др. Стандарты лабораторной диагностики легионеллеза и их применение во время эпидемической вспышки пневмоний в г. Верхняя Пышма. ЖМЭИ №2, 2008, с. 16-19.

12. Дронина Ю.Е., Пантелеева Л.Г., Карпова Т.И., Шустрова Н.М., Романова Ю.М., Тартаковский И.С., Шандала М.Г., Гинцбург АЛ. Оценка бактерицидной активности дезинфицирующих средств против легионелл на модели биопленок. ЖМЭИ №2,2008, с.117-119.

13. Alyapkina Y., Tartakovskiy I., Karpova T., Varlamov D., Pashko Y., Dronina Y. Quality and quantity detection of Legionella in environment water samples. In Abstracts 18th ERS Annual Congress. Berlin, 2008,385.

Подписано в печать 17.11.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 1282 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Дронина, Юлия Евгеньевна

Содержание.

Глава 1. Введение.

Глава 2. Обзор литературы.

2.1. Современные представления о легионеллезной инфекции и её возбудителе.

2.1.1. Современные представления о легионеллезной инфекции.

2.1.2 Общая характеристика легионелл.

2.2. Особенности экологии легионелл и их значение в распространении легионеллеза.

2.2.1. Взаимодействие легионелл с простейшими и другими микроорганизмами.

2.2.2. Биопленки легионелл.

2.3. Методы выявления и идентификации легионелл в объектах окружающей среды.

2.3.1. Бактериологический метод выделения легионелл.

2.3.2. Другие методы выявления легионелл в объектах окружающей среды.

2.3.3. Методы идентификации и типирования легионелл.

Глава 3. Материалы и методы.

3.1. Использованные в работе штаммы легионелл.

3.2. Методы культивирования легионелл.

3.3. Получение биоплёнок.

3.3.1. Получение биоплёнок легионелл.

3.3.2. Получение биоплёнок других микроорганизмов.

3.4. Бактериологическое выделение легионелл.

3.5. Определение легионелл методом ПЦР-РВ.

3.5.1. Определение легионелл с помощью тест-системы Кванти Legionella spp. и Кванти Legionella pneumophila.

3.5.2. Определение легионелл с помощью тест-системы АМПЛИ-ЛЕГ-РВ

3.6. Определение чувствительности легионелл к действию дезинфицирующих препаратов.

3.7. Статистические методы обработки результатов.

Глава 4. Результаты.

4.1. Выделение легионелл из объектов окружающей среды.

4.2. Выявление легионелл в объектах окружающей среды с помощью ПЦР в реальном времени.

4.2.1. Отработка методики ПЦР в реальном времени в модельных системах.

4.2.2. Применение ПЦР в реальном времени для выявления легионелл в воде и биоплёнках потенциально опасных водных систем.

4.3. Формирование биопленок легионелл.

4.3.1. Формирование моновидовых биоплёнок легионелл.

4.3.2. Биоплёнки легионелл в ассоциации с другими микроорганизмами.

4.4. Изучение эффективности действия дезинфицирующих препаратов на легионеллы.

4.4.1. Изучение действия дезинфицирующих препаратов на модели биопленок легионелл.

4.4.2. Изучение действия препарата «СаносилСупер 25» на легионеллы в градирне промышленного предприятия.

Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление и характеристика легионелл в потенциально опасных водных системах и модельных биопленках"

Легионеллезная инфекция известна уже более 30 лет и достаточно хорошо разработаны методы её диагностики и лечения, однако возбудитель по-прежнему представляет существенную угрозу общественному здоровью, вызывая крупные эпидемические вспышки с летальными исходами в различных странах мира. Среди наиболее заметных эпидемических вспышек легионеллеза, например в Голландии в 1999г (188 случаев, 16 летальных), Австралии 1999 г. (98/9), Испании 2002 г. (470/9), Франции 2004 г. (86/16), Норвегии 2005 г. (55/10), свое место заняла и эпидемическая вспышка легионеллеза в Российской Федерации - г. Верхняя Пышма в 2007 г., во время которой заболели 127 человек, при этом зарегистрировано 5 летальных исходов (2).Легионеллы широко распространены в природных водоёмах, где они паразитируют в организме водных амёб и не представляют существенной опасности для человека. В инженерно-технических сооружениях связанных с циркуляцией воды (поверхности труб и оборудования систем водоснабжения, градирен, систем кондиционирования и увлажнения воздуха), концентрация легионелл резко возрастает, за счёт образования биоплёнок, что является ключевым фактором накопления потенциально опасных концентраций возбудителя (9). В сочетании с возможностью аэрогенного распространения или аспирации возбудителя, возникает угроза возникновения эпидемии легионеллеза (обычно возникают в местах массового скопления людей).Сочетание высокой концентрации легионелл в водной среде с источниками мелкодисперсного аэрозоля, позволяет возбудителю инфекции проникать в нижнюю часть респираторного тракта и легкие человека, где происходит контакт с альвеолярными макрофагами, в которых легионеллы активно размножаются.Сложность количественной оценки легионелл в сочетании с высокой устойчивостью к дезпрепаратам в перечисленных водных объектах создают существенные трудности в оценке потенциальной опасности данных систем и проведении профилактических мероприятий. В этом отношении, экспериментальное изучение процесса образования биоплёнок и анализ эффективности на данной модели различных методов ускоренного выявления возбудителя и оценка действия дезинфекционных средств является одним из наиболее перспективных подходов.Цель и задачи исследования Цель работы: разработать методы выявления и количественного определения легионелл в потенциально опасных водных системах и модельных биопленках.Задачи исследования: 1. Получить коллекцию отечественных штаммов легионелл, выделенных из потенциально опасных водных объектов окружающей среды.2. Разработать и внедрить в практику алгоритм количественного выявления легионелл в модельных и природных образцах воды и биопленок с помощью сочетания бактериологического метода и ПЦР в реальном времени.3. Изучить способность к формированию биопленок у различных видов и штаммов легионелл при различных условиях культивирования, выявить различия в способности к образованию биопленок у разных штаммов легионелл.4. Изучить способность легионелл к персистенции в ассоциативных биопленках, образованных другими микроорганизмами.5. Разработать методику оценки действия дезинфекционных средств.Изучить эффективность действия различных дезинфекционных препаратов против легионелл на модельных биопленках и в водных системах.Научная новизна работы: - Создана коллекция отечественных штаммов легионелл, выделенных из потенциально опасных водных объектов окружающей среды (градирни промышленных предприятий, система автономного и городского водоснабжения, бассейн). - Впервые разработан алгоритм выявления легионелл в потенциально опасных водных системах, основанный на сочетании ПЦР в реальном времени и бактериологических методов. - Впервые выявлен различный уровень способности штаммов легионелл к формированию моновидовых биопленок.Разработаны методические подходы к оценке действия дезинфицирующих препаратов на легионеллы на модели биопленок и в водных системах.Практическая значимость работы: • Разработанный алгоритм определения легионелл в водных системах и биопленках на основе скрининга с помощью ПЦР-РВ, с последующим бактериологическим подтверждением, включен в качестве базового метода в методические указания Роспотребнадзора МУК 4.2.2217-07. «Выявление бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды». • Разработана методика определения эффективности действия дезинфекционных препаратов на модельных биопленках легионелл.Материалы диссертации доложены на IX съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, апрель 2007); 22 и 23 конференции Европейской рабочей группы по легионеллезу (Лиссабон, 2006; Стокгольм, 2007); 18 конгрессе Европейского респираторного общества (Берлин, 2008).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Дронина, Юлия Евгеньевна

Глава 6. ВЫВОДЫ.

1. На основе отработанной методики выделения легионелл из окружающей среды получена коллекция 66 штаммов возбудителя из потенциально опасных водных систем. Впервые в Российской Федерации выделены культуры видов Legionella gratiana и Legionella gormanii.

2. Впервые разработан и внедрен на базе отечественной тест-системы АМПЛИ-ЛЕГ-РВ алгоритм количественного выявления легионелл в природных образцах воды и биопленках с помощью бактериологического метода и ПЦР в реальном времени.

3. Разработана методика формирования моновидовых биопленок легионелл в питательной среде и воде. На основе разработанной методики впервые показан различный уровень способности к формированию моновидовых биопленок у штаммов Legionella pneumophila и Legionella spp.

4. Показана способность штаммов легионелл с высоким уровнем формирования моновидовых биопленок персистировать в биопленках, образованных другими микроорганизмами.

5. Разработана методика оценки действия дезинфекционных средств против легионелл на модели биопленок. Показана необходимость применения более высоких концентраций дезинфектантов при действии на модельные биопленки, по сравнению с бактерицидными концентрациями, рекомендованными для действия на суспензию легионелл. Показано, что элиминация природных биопленок, содержащих легионеллы, является необходимым условием успешной дезинфекции потенциально опасных водных объектов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Дронина, Юлия Евгеньевна, Москва

1. МУК 4.2.22-17-07 «Методические указания по выявлению бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды», 2007г.

2. Онищенко Г.Г., Покровский В.И., Тартаковский И.С. и др. Современные взгляды на эпидемиологию легионеллеза: алгоритм действия при эпидемических вспышках и профилактическом мониторинге. Журн. Микробиол., 2008 , 2: 5 9.

3. Покровский В.И., Прозоровский С.В. ,Малеев В.В.,Тартаковский И.С. Этиологическая диагностики и этиотропная терапия острых пневмоний. «Медицина» Москва 1995г.

4. Прозоровский С.В., Васильева В.И., Тартаковский И.С. Выявление болезни легионеров на территории СССР. Журн. микробиол. 1980,7:105107.

5. Прозоровский С.В., Покровский В.И., Тартаковский И.С. Выявление случаев легионеллеза среди больных острыми пневмониями. Сов.мед.,1982,3:96-98.

6. Прозоровский С.В., Покровский В.И., Тартаковский И.С. Болезнь легионеров. Москва «Медицина» 1984, с. 67-80.

7. Тартаковский И.С., Прозоровский С.В., Попов B.JI. Выделение первых штаммов Legionella pneumophila в СССР. Журн. микробиол.1983, 11:41-45.

8. Тартаковский И.С., Болезнь легионеров: итоги 25-летнего изучения инфекции, проблемы и перспективы исследования. Вестник РАМН.,2001,11:11-14.

9. Темежникова Н.Д., Тартаковский И.С. Легионеллёзная инфекция. Москва «Медицина» 2007.

10. Abraham W.R. Controlling biofilms of gram-positive pathogenic bacteria. CurrMed Chem. 2006; 13(13):1509-24.

11. Atlas R.M. Legionella: from environmental habitats to disease pathology, detection and control. Environ Microbiol. 1999 Aug; l(4):283-93.

12. Barbeau J., Gauthier C., Payment P. Biofilms, infectious agents, and dental unit waterlines: a review. Can J Microbiol. 1998 Nov; 44(11): 1019-28.

13. Benson R.F., Fields B.S. Classification of the genus Legionella. Semin Respir Infect. 1998 Jun;13(2):90-9.

14. Berry D., Xi C., Raskin L. Microbial ecology of drinking water distribution systems. Curr Opin Biotechnol. 2006 Jun; 17(3):297-302.

15. Blanc D.S., Carrara P., Zanetti G., Francioli P. Water disinfection with ozone, copper and silver ions, and temperature increase to control Legionella: seven years of experience in a university teaching hospital. J Hosp Infect. 2005 May; 60(l):69-72.

16. Borella P., Guerrieri E., Marchesi I., Bondi M., Messi P. Water ecology of Legionella and protozoan: environmental and public health perspectives. Biotechnol Annu Rev. 2005; 11:355-80.

17. Brenner D.J., Steigerwalt A.G., McDade J.E. Classification ofthe Legionnaires' disease bacterium: Legionella pneumophila, genus novum, species nova, of the family Legionellaceae, familia nova. Ann Intern Med. 1979 Apr; 90(4):656-8.

18. Colbourne J.S., Dennis P.J. Distribution and persistence of Legionella in water systems. Microbiological Sciences. 1985, 2:40-43.

19. Cooper A, Barnes HR, Myers ER. Assessing risk of Legionella. ASHRAE Journal.2004, 46(4):22-26.

20. Costa J., Tiago I., da Costa M.S., Verissimo A. Presence and persistence of Legionella spp. in groundwater. Appl Environ Microbiol. 2005 Feb; 71(2):663-71.

21. Cuhna B.A. Clinical features of Legionnaires Disease. Seminars in Respiratory Infection. 1998, 13(2): 116-127.

22. Den Boer J.W., Yzerman E.P. Diagnosis of Legionella infection in Legionnaires' disease. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2004 Dec; 23(12):871-8.

23. Drozanski W. Fatal bacterial infection in soil amoebae. Acta Microbiol Pol. 1956; 5(3-4):315-7.

24. Edelstein P.H. Improved semiselective medium for isolation of Legionella pneumophila from contaminated clinical and environmental specimens. J Clin Microbiol. 1981 Sep; 14(3):298-303.

25. Edelstein P.H., Snitzer J.B., Bridge J.A. Enhancement of recovery of Legionella pneumophila from contaminated respiratory tract specimens by heat. J Clin Microbiol. 1982 Dec; 16(6): 1061-5.

26. Edelstein P.H., Meyer R.D. Legionella pneumonias. 1994. In: Pennington JE .Respiratory infections, diagnosis and management, New York, Raven Press Ltd.

27. Enright M.C., Spratt B.G. Multilocus sequence typing. Trends Microbiol. 1999 Dec; 7(12):482-7.

28. European Guidelines for control and prevention of travel associated legionellosis.2002.

29. Exner M., Kramer A., Lajoie L., Gebel J., Engelhart S., Hartemann P. Prevention and control of health care-associated waterborne infections in health care facilities. Am J Infect Control. 2005 Jun; 33(5 Suppl l):S26-40.

30. Feeley J.C., Gibson R.J., Gorman G.W., Langford N.C., Rasheed J.K., Mackel D.C., Baine W.B. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. J Clin Microbiol. 1979 Oct; 10(4):437-41.

31. Fields B.S. The molecular ecology of legionellae. Trends in Microbiology. 1996, 4:286-290.

32. Fields B.S., Benson R.F., Besser R.E. Legionella and Legionnaires' disease: 25 years of investigation. Clin Microbiol Rev. 2002 Jul; 15(3):506-26.

33. Feeley J.C., Gorman G.W., Weaver R.E. Primary isolation media for Legionnaires diasease bacterium. J Clin Microbiol. 1978 Oct; vol.8:320-325.

34. Fliermans C.B. Philosophical Ecology: Legionella in Historical Perspective. State of the Art Lecture. In Proceedings of the 2nd international symposium Legionella, Atlanta, USA, 1983; 285-289.

35. Fox K.F., Brown A. Application of numerical systematics to the phenotypic differentiation of legionellae. J Clin Microbiol. 1989 Sep; 27(9): 1952-5.

36. Fry N.K., Warwick S., Saunders N.A., Embley T.M. The use of 16S ribosomal RNA analyses to investigate the phylogeny of the family Legionellaceae. J Gen Microbiol. 1991 May; 137(5):1215-22.

37. Fry N.K., Bangsborg J.M., Bernander S., Etienne J., Forsblom В., Gaia V., Hasenberger P., Lindsay D., Papoutsi A., Pelaz C., Struelens M., Uldum

38. Gaia V., Fry N.K., Harrison T.G., Peduzzi R. Sequence-based typing of Legionella pneumophila serogroup 1 offers the potential for true portability in legionellosis outbreak investigation. J Clin Microbiol. 2003 Jul; 41(7):2932-9.

39. Garrity G.M., Brown A., Vickers R.M. Tatlockia and Fluoribacter: two new general organisms resembling Legionella pneumophila. Int J Syst Bacteriol. 1980; 30:609-14.

40. Geary DF.New guidelines on Legionella. ASHRAE Journal.2000, 42(9):44-49.

41. George J.R., Pine L., Reeves M.W., Harrell W.K. Amino acid requirements of Legionella pneumophila. J Clin Microbiol. 1980 Mar; 11(3):286-91.

42. Gilbart J. Detecction of Legionella spp. in Water Samples by Electronj

43. Captor Gas Chromatography. In Proceedings of the 2 international symposium Legionella, Atlanta, USA, 1983; 296-298.

44. Gimenez D.F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 1964 May; 39:135-40.

45. Gorelik O., Lazarovich Z., Boldur I., Almoznino-Sarafian D., Alon I., Modai D., Cohen N. Legionella in two splenectomized patients. Coincidence or causal relationship? Infection. 2004 Jun; 32(3): 179-81.

46. Harrison T.G., Uldum S., Alexieu-Daniel S.et.al., A multicenter evaluation of the Biotest legionella urinary antigen EIA.Clinical microb. and Infection, 1998, 4(7):359-365.

47. Health and Safety Commission and Executive. Legionnaire's disease. The control of legionella bacteria in water systems. Approved code of practice and guidance. 2000.

48. Hebert G.A. Hippurate hydrolysis by Legionella pneumophila. J Clin Microbiol. 1981 Jan; 13(l):240-2.

49. Huerta M., Castel H., Grotto I., Shpilberg O., Alkan M.5 Harman-Boehm I. Clinical and epidemiologic investigation of two Legionella-Rickettsia co-infections. Isr Med Assoc J. 2003 Aug; 5(8):560-3.

50. ISO standard: Water quality-detection and enumeration of Legionella. 1998.

51. Janssen P., Coopman R., Huys G., Swings J., Bleeker M., Vos P., Zabeau M., Kersters K. Evaluation of the DNA fingerprinting method AFLP as an new tool in bacterial taxonomy. Microbiology. 1996 Jul; 142 ( Pt 7): 1881-93.

52. Jimenez-Lucho V., Shulman M., Johnson J. Bordetella bronchiseptica in an AIDS patient cross-reacts with Legionella antisera. J Clin Microbiol. 1994 Dec; 32(12):3095-6.

53. Joly J.R., McKinney R.M., Tobin J.O., Bibb W.F., Watkins I.D., Ramsay D. Development of a standardized subgrouping scheme for Legionella pneumophila serogroup 1 using monoclonal antibodies. J Clin Microbiol. 1986 Apr; 23(4):768-71.

54. Joseph C. European surveillance of travel-associated Legionnaires disease.Eurosurveillance, 2004, 9(2), 15-18.

55. Katz S.M., Hammel J.M. The effect of drying, heat, and pH on the survival of Legionella pneumophila. Ann Clin Lab Sci. 1987 May-Jun; 17(3): 150-6.

56. Koide M., Saito A. Diagnosis of Legionella pneumophila infection by polymerase chain reaction. Clin.Infect.Dis., 1995, 21:199-201.

57. Legionella and the prevention of Legionellosis.WH0.2006.

58. Liu Z, Lin Y.E., Stout J.E., Hwang C.C., Vidic R.D., Yu V.L. Effect of flow regimes on the presence of Legionella within the biofilm of a model plumbing system. J. Appl Microbiol. 2006 Aug; 101(2):437-42.

59. Lo Presti F., Riffard S., Vandenesch F., Reyrolle M., Ronco E.,1.hai P., Etienne J. The first clinical isolate of Legionella parisiensis, from a liver transplant patient with pneumonia. J. Clin Microbiol. 1997 Jul; 35(7):1706-9.

60. Loret J.F., Robert S., Thomas V., Cooper A.J., McCoy W.F., Levi Y. Comparison of disinfectants for biofilm, protozoa and Legionella control. J. Water Health. 2005 Dec; 3(4):423-33.

61. Luck P.C., Helbig J.H., Drasar V., Bornstein N., Fallon R.J., Castellani-Pastoris M. Genomic heterogenicity amongst phenotypically similar Legionella micdadei strains. FEMS Microbiol. Lett. 1995 Feb 1; 126(1):49-54.61.

62. Management of spa pools: controlling the risk of infection.2006.London.Health Protection Agency.

63. McDade J.E., Shepard C.C., Fraser D.W., Tsai T.R., Redus M.A., Dowdle W.R. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. N Engl J Med. 1977 Dec 1; 297(22): 1197-203.

64. Medzhitov R., Janeway C.A., Jr. Decoding the patterns of self and nonself by the innate immune system. Science. 2002 Apr 12; 296(5566):298-300.

65. Mermel L.A., Josephson S.L., Giorgio C.H., Dempsey J., Parenteau S. Association of Legionnaires' disease with construction: contamination of potable water? Infect Control Hosp Epidemiol. 1995 Feb; 16(2):76-81.

66. Molofsky A.B., Swanson M.S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 2004 Jul; 53(l):29-40.

67. Muder R.R., Yu V.L. Infection due to Legionella species other than L. pneumophila. Clin Infect Dis. 2002 Oct 15; 35(8):990-8.

68. Murdoch D.R. Diagnosis of Legionella infection. Clin Infect Dis. 2003 Jan 1; 36(l):64-9.

69. Murga R., Forster T.S., Brown E., Pruckler J.M., Fields B.S., Donlan R.M. Role of biofilms in the survival of Legionella pneumophila in a model potable-water system. Microbiology. 2001 Nov; 147(Pt 11):3121-6.

70. Pasculle A.W., Feeley J.C., Gibscon R.J. Pittsburgh pneumonia agent direct isolasion from human lung tissue. J. Infect. Dis. 1980, 141:727-732.

71. Piao Z., Sze C.C., Barysheva O., Iida K., Yoshida S. Temperature-regulated formation of mycelial mat-like biofilms by Legionella pneumophila. Appl Environ Microbiol. 2006 Feb; 72(2): 1613-22.

72. Pine L., George J.R., Reeves M.W., Harrell W.K. Development of a chemically defined liquid medium for growth of Legionella pneumophila. J. Clin Microbiol. 1979 May; 9(5):615-26.

73. Pourcel C., Vidgop Y., Ramisse F., Vergnaud G., Tram C. Characterization of a tandem repeat polymorphism in Legionella pneumophila and its use for genotyping. J Clin Microbiol. 2003 May; 41(5): 1819-26.

74. Rogers J., Keevil C.W. Immunogold and fluorescein immunolabelling of Legionella pneumophila within an aquatic biofilm visualized by using episcopic differential interference contrast microscopy. Appl Environ Microbiol. 1992 Jul; 58(7):2326-30.

75. Rogers J., Dowsett A.B., Dennis P.J., Lee J.V., Keevil C.W. Influence of plumbing material on biofilm formation and growth of Legionella pneumophila in a potable water systems. Appl Environ Microbiol. 1994; 6:1842-51.

76. Rogers J., Dowsett A.B., Keevil C.W. A paint incorporating silver to control mixed biofilms containing Legionella pneumophila. J. Ind Microbiol. 1995 Oct; 15(4):377-83.

77. Rowbotham T.J. Pontiac fever explained? Lancet. 1980 Nov 1; 2(8201):969.

78. Scaturro M., Losardo M., De Ponte G., Ricci M.L. Comparison of three molecular methods used for subtyping of Legionella pneumophila strains isolated during an epidemic of Legionellosis in Rome. J Clin Microbiol. 2005 Oct; 43(10):5348-50.

79. Schwartz Т., Hoffmann S., Obst U. Formation of natural biofilms during chlorine dioxide and u.v. disinfection in a public drinking water distribution system. J Appl Microbiol. 2003;95(3):591-601.

80. Steele T.W. Legionnaires' disease in South Australia, 1979-1988. Med J Aust. 1989 Sep 18; 151(6):322, 5-6, 8.

81. Steinmetz I., Rheinheimer C., Hubner I., Bitter-Suermann D. Genus-specific epitope on the 60-kilodalton Legionella heat shock protein recognized by a monoclonal antibody. J Clin Microbiol. 1991 Feb; 29(2):346-54.

82. Stout JE, Yu V.L. Legionellosis. New England Journal of Medicine. 1997.337:682-687.

83. Storey M.V., Langmark J., Ashbolt N.J., Stenstrom T.A. The fate of legionellae within distribution pipe biofilms: measurement of their persistence, inactivation and detachment. Water Sci Technol. 2004; 49(11-12):269-75.

84. Surman S.B., Morton L., Keevil C. Growth of Legionella pneumophila in aquatic biofilms is not dependent on intracellular multiplication. In: Keevil CW et.al. Biofilm in the aquatic environment. Cambridge, 1999.160-170.

85. Thomas V., Bouchez Т., Nicolas V., Robert S., Loret J.F., Levi Y. Amoebae in domestic water systems: resistance to disinfection treatments and implication in Legionella persistence. J Appl Microbiol. 2004; 97(5):950-63.

86. Walker J.T., Bradshaw D.J., Bennett A.M., Fulford M.R., Martin M.V., Marsh P.D. Microbial biofilm formation and contamination of dental-unit water systems in general dental practice. Appl Environ Microbiol. 2000 Aug; 66(8):3363-7.

87. Wellinghausen N., Frost C., Marre R. Detection of Legionella in hospital water samples by quantative real-time lightcycler PCR. Appl. And Environm. Microbiol., 2001, 67(9):3985-3993.

88. WHO Recommended Surveillance Standarts.1999.

89. William Т. Martin, James M. Barbaree, and James C. Feeley.

90. Detecction and Quantitation of Legionella pneumophila by Immunej

91. Autoradiography. In Proceedings of the 2 international symposium Legionella; Atlanta, USA, 1983; 299-300.

92. Wilson D.A., Yen-Liberman В., Reischl U. et.al. Detection of Legionella pneumophila by real-time PCR for the mip gene. J.clin.microb., 2003., 41(7):3327-3330.

93. Uzel A., Ucar F., Hames-Kocabas E.E. Prevalence of Legionella pneumophila serogroup 1 in water distribution systems in Izmir province of Turkey. Apmis. 2005 Oct; 113(10):664-9.