Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика цитотоксических глюкозилтрансфераз Legionella pneumophila

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика цитотоксических глюкозилтрансфераз Legionella pneumophila"

На правах рукописи /й

005534000

Совкова Ирина Владимировна

Характеристика цитотоксических глюкозилтрансфераз Legionella pneumophila

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з OKI 2013

Москва 2013

005534000

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учрежденш «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имен! почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения РоссийскоГ Федерации (ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России)

Официальные оппоненты:

Тартаковский Игорь Семенович,

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией легионеллеза ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Демкин Владимир Витальевич,

кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией молекулярной диагностики Института Молекулярной Генетики РАН

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова» Минздрава России

Защита диссертации состоится « 18 » октября 2013 г. в «-/-/ » часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 в ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи»№ Минздрава России по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Автореферат разослан «17» сентября 2013 г.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Белый Юрий Федорович

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Русакова Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Легионелла является грам - отрицательной бактерией, вызывающей острую тяжелую пневмонию - болезнь легионеров (В. S. Fields, R. F. Benson et al., 2002). Всего известно более 50 видов легионелл, для 22 из них доказана роль в инфекционной патологии человека. Более чем в 90% случаев заболевания основной возбудитель - Legionella pneumophila. Другие легионеллы -L. longbeachae, L. Bozemanii, L. dumoffii и L. micdadei - являются следующими по значимости этиологическими агентами легионеллеза, составляющие менее 10% легионеллезных инфекций в Европе и в США (Müder R.R., Yu V.L., 2002). В России вспышка легионеллезной пневмонии была зафиксирована на Среднем Урале в июле 2007 года в Верхней Пышме.

С инфицированным аэрозолем легионеллы попадают в легкие, где и происходит их контакт с клетками-мишенями. Бактерии активно размножаются в макрофагах, моноцитах крови и эпителиальных клетках, что приводит к накоплению возбудителя в высокой концентрации и развитию острого воспалительного процесса. Вслед за проникновением в клетку в составе фагосомы легионеллы индуцируют ряд нарушений процессов фагоцитоза такие, как подавление закисления содержимого фагосомы, предотвращение слияния фагосом и лизосом и формируют так называемые «репликативные вакуоли», где и происходит активное размножение возбудителя (Bozue J. A., Johnson W., 1996; Tzivelekidis Т., Jank Т. et al., 2011; Horwitz M. A., 1983; Summersgill J. Т., Raff M. J. et al. 1988). В завершении внутриклеточного цикла эукариотические клетки гибнут в результате индукции апоптоза или некроза, а микроорганизмы выходят во внеклеточную среду и вновь инфицируют фагоциты.

Сложный механизм взаимодействия легионелл с эукариотическими клетками говорит о вовлечении в процесс специализированных молекул, продуцируемых бактериями и направленных на определенные эукариотические мишени. Были выделены и охарактеризованы многочисленные факторы, которые потенциально могут участвовать в процессах взаимодействия бактерий и хозяина (низкомолекулярный цитотоксин, жгутики, белок теплового шока Hsp60, цитолизин - метаплопротеиназа, фосфолипазы, фосфокиназы (Dowling J. N., Saha А. К. et al., !,гч

1992). Однако на сегодняшний день нет информации об эукариотических субстратах этих факторов, а данные об их участии в патогенезе инфекции противоречивы.

Значительный прогресс в исследовании механизмов патогенности легионелл был достигнут с использованием различных генетических подходов. В результате была показана важная роль нескольких генетических локусов и продуктов конкретных генов во внутриклеточной биологии возбудителя. К подобным продуктам относились белок Mip, PilD и система белковой секреции II типа, аргинин - зависимый транслокационный аппарат, жгутики IV типа, продукты локусов Ivh, enh, mil, pmi и так (Heuner К., Bender-Beck L., et al., 1995). Однако наиболее полно изучена система секреции IVB типа, известная как Dot/Icm (Aragon V., S. Kurtz A. et al., 2000; Brand В. С., Sadosky A. В. et al., 1994). Этот секреторный комплекс участвует в биогенезе репликативных фагосом путем транспорта в клетку-мишень многочисленных белков-эффекторов, нарушающих нормальный эндосомальный путь в эукариотических клетках.

К группе новых факторов патогенности легионелл относится глюкозилтрансфераза Lgtl - бактериальный фермент, модифицирующий фактор элонгации 1А и вызывающий гибель эукариотических клеток путем блокирования синтеза белка. Данный токсический фактор был впервые обнаружен и охарактеризован в лаборатории молекулярных основ патогенности ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (Belyi I., Popoff M. R. et al., 2003). Предварительные данные говорили о возможности существования у легионелл и иных белков со сходной ферментативной активностью. Это послужило основанием для проведения настоящей диссертационной работы.

Цель диссертационной работы: идентификация и молекулярная характеристика новых глюкозилирующих ферментов L. pneumophila.

В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:

• провести в базе данных секвенированных геномов легионелл поиск нуклеотидных последовательностей, предположительно кодирующих глюкозилирующие токсины;

* клонировать, экспрессировать гены и получить рекомбинантные, очищенные, растворимые и биохимически активные глюкозилирующие ферменты;

• исследовать биохимические и цитотоксические свойства полученных рекомбинантных белков легионелл;

• исследовать продукцию глюкозилтрансфераз при росте Legionella pneumophila на питательных средах и в амебах.

Научная новизна работы. Впервые была обнаружена и охарактеризована группа глюкозилирующих эффекторных белков у возбудителя болезни легионеров, обладающих ферментативной активностью и блокирующих синтез белка, а также цитотоксической активностью на эукариотические клетки. Наряду с уже описанным ранее ферментом Lgtl к этой группе относились вещества Lgt2 и Lgt3. Показано, что субстратом глюкозилирующих белков легионелл являлся эукариотический фактор элонгации 1А (eEFIA), компонент аппарата трансляции эукариотических клеток. Участком модификации eEFIA служил аминокислотный остаток серин в положении 53, глюкозилирование которого сопровождалось остановкой белкового синтеза и гибелью клеток млекопитающих. С использованием метода ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) впервые показано, что присоединение остатка глюкозы к серину-53 под действием фермента легионелл происходит с сохранением а-конфигурации гликозидной связи, что позволяет отнести Lgtl к семейству "Retaining glucosyltransferases" GT88 (http://vwvw.cazy.org/GT88.htmn. Впервые установлено, что продукция Lgtl и Lgt2 осуществляется преимущественно в стационарной фазе роста микробной популяции, тогда как Lgt3 синтезируется в начальной фазе, предшествующей экспоненциальному росту культуры.

Практическое значение работы. Установлено, что гены, кодирующие белки Lgtl, Lgt2 и Lgt3, обнаруживались у представителей наиболее патогенного для человека вида - L. pneumophila. Эти результаты говорят о возможности использования данных белков и кодирующих их нуклеотидных последовательностей в качестве видоспецифических маркеров для индикации наиболее значимого в инфекционной патологии человека вида легионелл -L. pneumophila.

По результатам работы подготовлены Методические рекомендации «Способ выявления высоковирулентных штаммов легионелл», утвержденные Советом по внедрению научных достижений в практику ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи

Минздрава России 22 ноября 2012 г., протокол № 22 и «Определение токсичности факторов патогенности бактерий с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae», утвержденные Советом по внедрению научных достижений в практику ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России 25 января 2013 г., протокол № 23.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Показано, что белки, кодируемые 11 рамками считывания, обнаруженными среди пяти секвенированных геномов штаммов L. pneumophila, высокогомологичны глюкозилтрансферазе Lgtl и образуют три семейства: Lgtl, Lgt2 и Lgt3.

2. Впервые показано, что глюкозилтрансферазы Lgt2 и Lgt3 L. pneumophila обладают глюкозилирующей активностью и блокируют белковый синтез путем модификации эукариотического фактора элонгации 1А в положении серин - 53.

3. Впервые выявлено, что синтез ферментов клетками L. pneumophila подвержен строгому контролю. Глюкозилтрансферазы Lgtl и Lgt2 вырабатываются бактериями в поздней стационарной фазе их роста in vitro в жидкой питательной среде и на поздней стадии взаимодействия с амебами in vivo в отличие от Lgt3, который определяется в культурах на ранней стадии роста in vitro и на ранних этапах взаимодействия с эукариотическими клетками.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Международной заочно - практической конференции «Современные вопросы науки и образования - XXI век» (Тамбов, 2012), на Международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012), на X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012), на Международной заочно - практической конференции «Биология, Химия, Физика: вопросы и тенденции развития» (Новосибирск, 2012).

Апробация работы состоялась 11.06.2013 на научной конференции отдела медицинской микробиологии и отдела бактериальных инфекций ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 научные статьи в зарубежных изданиях, рекомендованных ВАК, а также опубликовано 4 тезисов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и список использованной литературы, содержащий ссылки на 159 источников. Работа иллюстрирована 5 таблицами и 28 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и культуры клеток. В работе использовали следующие бактериальные штаммы и клеточные линии: L.pneumophila: штаммы первой серогруппы Philadelphia-1, Lens, Paris, 130b, штамм седьмой серогруппы (АТСС 33823), штамм восьмой серогруппы (АТСС 35096), штамм тринадцатой серогруппы (АТСС 43136) и штамм четырнадцатой серогруппы 1169 - MN-H. Также использовались штаммы других видов легионелл: L. longbeachae (АТСС 33462), L. gormanii (АТСС 33297) и L. steigerwaltii (АТСС 35302); штаммы Е. coli DH10B и BL21 (DE3).

Эукариотические клеточные линии: EBL (клетки легкого эмбриона коровы); Сасо2 (клетки колоноректальной аденокарциномы человека); HeLa (клетки карциномы шейки матки).

Культивирование бактериальных штаммов. Используемые в работе L.pneumophila выращивали на угольно - дрожжевом агаре (BCYE) в течение двух дней при температуре 37°С (Edelstein, Р. Н., 1981) или на жидком питательном бульоне Proteose Pepton №3 (ВРРВ) (Ristroph J.D., Hedlund K.W. et al., 1980; Warren W. J., Miller R.D., 1979). Штаммы E. coli выращивали на среде LB с добавлением соответствующих антибиотиков и, при необходимости, изопропил-тио-гапактопиранозида.

Молекулярное клонирование фрагментов ДНК. Синтез соответствующих кодирующих нуклеотидных последовательностей lgt2 и lgt3, а также гена субъединицы А дифтерийного токсина DT осуществлялся с использованием ПЦР. В качестве матрицы для ПЦР использовалась бактериальная геномная ДНК L.pneumophila, выделенная феноловым методом (Sambrook J., Fritsch E.F. et al., 1989) или плазмида p28-DT (любезно предоставленная Ю.В. Вертиевым). Гибридные плазмиды, полученные клонированием амплифицированных генов в

соответствующие векторные системы (рЕТ или pGEX), трансформировали электропорацией (Electroporator 25100, "Eppendorf") в компетентные клетки E.coli штаммов DH10B или BL-21. Работу с нуклеиновыми кислотами проводили согласно общепринятым методам (Sambrook J., Fritsch E.F. et al., 1989).

Очистка и анализ выделенных белков. Хроматографическое выделение экспрессированных рекомбинантных белков осуществляли с использованием сорбента Glutation - Sepharose Fast Flow (при клонировании в плазмиды pGEX) или Nickel - Sepharose Fast Flow (при клонировании в плазмиды рЕТ) согласно рекомендациям к использованию сефарозы соответствующего типа. Концентрацию белков определяли с использованием красителя Кумасси бриллиантовый голубой G-250 и бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта (Bradford М. М., 1976). Для определения гомогенности выделенных препаратов, а также для определения молекулярной массы белков использовали метод электрофореза в полиакриламидном геле в системе додецилсульфата натрия (SDS) (Laemmli U. К., 1970).

Ферментативные исследования. Реакция глюкозилирования проводилась согласно стандартному протоколу в 20 мкл смеси, состоящей из 20 мМ Трис-НС1 (рН 7.5), 150 мМ NaCl, 1 мМ МпС12, 2 - 5 мкг рекомбинантных белков легионелл (GST-Lgtl, GST-Lgt2 и GST-Lgt3), 50 - 70 мкг неочищенного клеточного экстракта или 2-4 мкг очищенного рекомбинантного фактора элонгации eEFlAl (плазмида, кодирующая фактор элонгации была любезно предоставлена Charlotte R. Knudsen, Дания) и 10 мкМ УДФ-[14С]глюкозы (ARC). Смеси были проинкубированы в течение 1 часа при температуре 37°С. После этого реакции были остановлены добавлением стандартного буфера Лэммли и нагреванием в течение 5 минут при температуре 100°С. Пробы подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле в системе додецилсульфата натрия и сканированы при помощи сканера для радиоактивных гелей Storm 820 (Molecular Dynamics, Vienna, Austria).

Интоксикация эукариотических клеток электропорацией. Интоксикация клеток EBL рекомбинантными белками L. pneumophila или субъединицей А дифтерийного токсина DT-A в различных концентрациях, проводилась электропорацией. Количество клеток в суспензии подсчитывали в гемоцитометре.

Одновременно определяли жизнеспособность клеток методом исключения красителя трипанового голубого.

Реакция транскрипции/трансляции in vitro. Изучение in vitro реакции транскрипции/трансляции выполнялось с использованием коммерческой системы, одним из компонентов которой является лизат кроличьих ретикулоцитов, в соответствии с рекомендациями производителя (L4610; Promega, Mannheim, Germany). Для визуализации синтезированных продуктов с помощью электрофореза в реакционную смесь вносили 358-метионин.

Определение уровня белкового синтеза в клетках. Изучение белкового синтеза на клетках EBL проводилось методом определения уровня включения 35S-метионина после электропорации рекомбинантными белками L.pneumophila GST-Lgtl, GST-Lgt2, GST-Lgt3 или дифтерийным токсином (DT - А). После инкубации клетки отмывались TBS и лизировались 0.1% SDS, с добавлением бычьего сывороточного альбумина в концентрации 0.2 мг/мл. Белки осаждались 10% трихлоруксусной кислотой и переносились на нитроцеллюлозный фильтр. Количество включенного 35Б-метионина измерялось с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика.

Изучение внутриклеточной инфекции Acanthamoeba castellanii. Изучение внутриклеточной инфекции проводилось на амебах Acanthamoeba castellanii СЗ, выращенных в соответствии со стандартной методикой в PYG среде. После прикрепления амеб A. castellanii к поверхности чашек Петри (30-40 минут, tK0MH ) вносилась суспензия L. pneumophila Philadelphia-1. Ко-инкубацию проводили в течение 72 часов при температуре 37°С. Определение концентрации микроорганизмов осуществляли путем титрования на чашках с BCYE агаром.

ПЦР в режиме реального времени. Используя набор для выделения РНК RNeasy mini kit (Qiagen), была выделена общая РНК из клеток L. pneumophila Philadelphia-1, выращенных на протеозо-пептоном бульоне или в амебах A. castellanii. Обратная транскрипция выполнялась с использованием набора QuantiTect Rev transcription kit (Qiagen) в соответствии с рекомендациями производителя. ПЦР в режиме реального времени выполняли при помощи набора

QuantiTect SYBR green PCR kit (Qiagen), в котором используется флуоресцентный индикатор SYBR green.

Определение антигенной специфичности белков методом иммуноблоттинга. Антигенная специфичность полученных проб изучалась при помощи вестерн-блоттинга с моноспецифичными мышиными сыворотками против очищенных полигистидин-меченых рекомбинантных белков Lgtl, Lgt2 и Lgt3. Сигнал оценивали на хемилюминисцентном детекторе LAS-3000 mini device (Fujifilm).

Статистическая обработка результатов. Анализ и статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами, используемыми в биологии (Лакин Г.Ф., 1990). Достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по разностному методу Стьюдента-Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Обнаружение генов потенциальных глюкозилтрансфераз в секвенированных геномах L. pneumophila

Как известно, одним из новых факторов патогенности является глюкозилтрансфераза Lgtl, которая играет, по-видимому, важную роль в вирулентности L. pneumophila. Было предположено, что данный фермент не является единственным, и существуют иные белки со сходной ферментативной активностью.

Изучение геномных баз данных пяти штаммов L. pneumophila привел к обнаружению нами 11 открытых рамок считывания, кодирующих подобные белки. Продукты обнаруженных генов были сгруппированы в три семейства: Lgtl, Lgt2 и Lgt3. Подобное разделение основано на уровне гомологии кодируемых белков. Кодирующие последовательности показаны на рисунке 1. Идентичность среди представителей внутри семейства составляла >80%, в то время как идентичность между различными группами находилась в интервале от 20 до 40%.

Lgt

Lgt-1 Lgt-2 Lgt-3

группа группа группа

Lens Alcoy Paris Corby: Phil.-1 Phil.-1 Lens Paris Alcoy Corby

; Ipl1319 1ра02017 Ipp1322 Ipc0784 Ipg2862 IPQ1488 lpt1540 Ipp1444 lpa03!68 Ipc0903

Рис. 1. Три семейства глюкозилтрансфераз легионелл: Lgtl, Lgt2 и Lgt3. Курсивом выделены кодирующие последовательности, принадлежащие каждому семейству.

Выравнивание аминокислотных последовательностей белков из групп Lgtl, Lgt2 и Lgt3 демонстрирует высокую гомологию в области, содержащей «DXD мотив», которая является типичной для глюкозилтрансфераз типа А (Busch С., Hofmann F., et al., 1998). Предполагаемые ферменты легионелл в этой области показывают значительное сходство с глюкозилирующими цитотоксинами клостридий.

У всех пяти представителей L. pneumophila (Philadelphia-1, Lens, Paris, Corby и Alcoy) обнаруживались открытые рамки считывания, кодирующие белки Lgtl и Lgt3. Продукты трансляции имели молекулярную массу в интервале 60 - 65 и 87 -100 кД соответственно. В отличие от этого, ген, кодирующий Lgt2, отсутствовал у штаммов Paris, Corby, Alcoy и Lens и обнаруживался лишь у единственного штамма с известным геномом Philadelphia-1. Молекулярная масса предполагаемого белка, кодируемого геном lpg2862 (единственным представителем группы Lgt2 белков) составляла ~70 кД.

Изучение распределения генов Igt среди большого числа штаммов легионелл методом полимеразной цепной реакции показало, что lgtl- и Igt3- содержащие последовательности определялись у всех тестируемых представителей L. pneumophila. И, напротив, /¿^-специфические последовательности определялись только в трех из шести штаммах. Это может говорить о том, что пара представителей Lgtl и Lgt3 является обязательной, в то время как роль Lgt2 не является таковой, по крайней мере, для некоторых штаммов. В штаммах других видов легионелл таких, как L. longbeachae, L. gormanii и L. steigenvaltii, мы не смогли обнаружить Igt - подобные последовательности.

2. Клонирование и экспрессия генов lgtl и lgt3

Для дальнейшего изучения продуктов обнаруженных /gr-подобных генов, нами были амплифицированы и клонированы кодирующие последовательности lgt2 и lgt3 из различных штаммов L. pneumophila с помощью праймеров, синтезированных на основании информации о геноме L. pneumophila Philadelphia-1. Продукты этих клонированных генов и были использованы нами в дальнейшем в качестве белков Lgt2 и Lgt3. Для обеспечения эффективной экспрессии интересующих нас генов, были сконструированы соответствующие плазмиды, содержащие в своем составе гены, кодирующие глюкозилтрансферазы Lgtl, Lgt2 и Lgt3.

Следующим этапом исследования было изучение глюкозилирующей активности полученных ферментов. Согласно данным электрофореза в ПААГ молекулярные массы рекомбинантных глюкозилтрансфераз составляли -90, -100 и -130 кД для Lgtl, Lgt2 и Lgt3 соответственно (рис. 2), что соответствовало расчетным размерам белков с учетом добавленной молекулярной массы глютатион-трансферазы (28 кД).

130К 90К

I 1 2 3 | %% ^

Рис. 2. Электрофорез в полиакриламидном геле GST-содержащих белков Lgtl, Lgt2 и Lgt3 (дорожки 1, 2 и 3 соответственно). Нагрузка на гель каждого очищенного белка составляла приблизительно 2 мкг.

3. Глюкозилирующая активность новых белков L. pneumophila - Lgt2 и

Lgt3

Изучение глюкозилтрансфераз Lgtl, Lgt2 и Lgt3 в реакции глкжозилирования в присутствии меченой УДФ - [14С] глюкозы, показало, что все три белка (Lgtl, Lgt2 и Lgt3) глюкозилировали эукариотические белки с одной и той же молекулярной массой - 50 кД (рис. 3, дорожки 5-7).

. . . + + + + Клеточные экстракты

т ш mm—50К

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 3. Ферментативные активности глюкозилтрансфераз Lgtl, Lgt2 и Lgt3. Дорожки 1-3: GST-содержащие белки Lgt без эукариотического субстрата; дорожка 4: клеточный экстракт EBL без белков легионелл; дорожки 5-7: GST-содержащие белки Lgt вместе с клеточным экстрактом EBL. На дорожках 1, 2, 5 и 6 заметна реакция автоглюкозилирования Lgtl и Lgt2.

В исследованиях, проведенных ранее, было показано, что глюкозилтрансфераза Lgtl модифицирует эукариотический фактор элонгации eEFIA в положении серии - 53 (Belyi Y., Niggeweg R. et al., 2006). С целью подтверждения, что Lgt2 и Lgt3 также модифицируют фактор элонгации eEFIA, мы протестировали данный фактор в виде очищенного белка, а также получили варианты фактора элонгации с точечными заменами серина. У одного из мутантов остаток серина в положении 53 был заменен на треонин, у другого - остаток серина был заменен на аланин. Как показано на рис. 4, все три глюкозилтрансферазы L. pneumophila модифицировали дикий тип фактора элонгации eEFIA (рис. 4, дорожки 1,4 и 7).

Однако, значительно меньшая степень глюкозилирования проявлялась у мутанта с замещением серина на треонин в положении 53, а мутант с замещением серина на аланин в положении 53 и вовсе не подвергался модификации (рис. 4, дорожки 3, 6, 9 и 2, 5, 8 соответственно).

WT S/A S/T WTS/A Sif Ш S/A S/T

-шш Щш0 Шт feijit

12 3 4 5 6 7 8 9

-80К

I д 1 1 Ь д 1 2 I. д { 3

Рис. 4. Ферментативные активности глюкозилтрансфераз Lgt2 и LgtЗ. Дорожки 1, 4, 7: эукариотический фактор элонгации еЕР1А1 вместе с глюкозилтрансферазами Lgt; дорожки 2, 5, 8: мутант фактора элонгации с заменой серина на аланин в положении 53 вместе с глюкозилтрансферазами Lgt; дорожки 3, 6, 9: мутант фактора элонгации с заменой серина на треонин в положении 53 вместе с глюкозилтрансферазами Lgt. На дорожках 4, 5 и 6 заметна выраженная реакция автоглюкозилирования Lgt2.

Это являлось доказательством того, что ферменты ЬцИ, и 1^3

модифицируют один и тот же акцепторный аминокислотный остаток.

В параллельных экспериментах, с целью дополнительного подтверждения того, что все три глюкозилтрансферазы модифицируют серии в положении 53 эукариотического фактора элонгации, была проведена реакция реглюкозилирования. Для этого, сначала клеточные экстракты ЕВЬ были обработаны или диким типом или инактивированным (мутантом в регионе 024бЮ248) в присутствии 2 шМ "холодной" УДФ-глюкозы в стандартной реакционной смеси. Затем реакционная смесь была диализована (см. Материалы и методы) и использована для реакции реглюкозилирования белками или Ь^З в присутствии меченой

УДФ-[ИС] глюкозы в роли кофактора. Как показано на рис. 5, в результате исследования с использованием клеточных экстрактов, предварительно обработанных дикого типа, проявляющийся сигнал с глкжозилтрансферазами 1^1, и Ь^З был минимальный (рис. 5, дорожки 2 - 4). Результаты

эксперимента, в котором использовались клеточные экстракты, предварительно обработанные инактивированным мутантом (у которого инактивирован ОХЭ-мотив), показали, что все три глюкозилтрансферазы катализировали включение метки в белок с молекулярной массой ~50кД (рис. 5, дорожки 5 - 7).

Клеточные экстракты

—50К

NT Lgt1(WT)+yfl«>^niOK. Щг1(М(Л)-УДФ-глюк

1 2 3 4 5

% % % % % % %

Рис. 5. Реакция реглюкозилирования клеточных экстрактов EBL, необработанных (non-treated, NT, дорожка 1), предварительно обработанных немеченой УДФ-глюкозой и диким типом Lgtl (WT, дорожки 2-4) или мутированным типом Lgtl (дорожки 5-7), в присутствии ферментов Lgtl (дорожки 1, 2, 5), Lgt2 (дорожки 3, 6) и Lgt3 (дорожки 4, 7).

Таким образом, результаты, полученные на данном этапе исследования, находятся в соответствии с предположением, что все три глюкозилтрансферазы являются гомологичными, но не идентичными, и что все они с одинаковой эффективностью модифицируют один и тот же аминокислотный остаток фактора элонгации - серин в положении 53.

4. Механизм реакции глкжозилирования при участии Lgt L.pneumophila

В исследованиях, параллельно проводимых в лаборатории молекулярных основ патогенности ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (Д.И. Тартаковская и Ю.Ф. Белый), был обнаружен продукт eEFIA - 10-амино кислотный пептид (50GKGSFKYAWV59), который эффективно глюкозилировался Lgtl. Подобная идентификация небольшой молекулы, которая подвергалась глюкозилированию глюкозилтрансферазой Lgtl, позволила изучить стереохимическую структуру образующейся О-гликозидной связи с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Данный эксперимент выполнялся совместно с Peter Kaden и Burkhard Luy, Department Chemie, Organische Chemie II, Technische Universität München, Germany.

Аномерная конфигурация продукта глюкозилирования может быть либо "retaining" либо "inverting" относительно донорного ко-субстрата (Lairson L. L., Henrissat В. et al., 2008). Основным вопросом, на который необходимо было получить ответ в ходе данного исследования, являлось определение того, какую аномерную конфигурацию имеет продукт глюкозилирования Lgtl — "сохраненную" ("retaining") или "инвертированную" ("inverting"). В ходе проведения ЯМР спектроскопии сравнивались два образца, один из них состоял из смеси УДФ-глюкозы и декапептида фактора элонгации eEFIA (отрицательный контроль), второй состоял из декапептида, УДФ-глюкозы и фермента Lgtl (рис. 6).

Рис. 6. Идентификация и распределение сахарных сигналов глкжозилированного декапептида фактора элонгации еЕР1А. А. Одномерный спектр смеси УДФ-глюкозы и декапептида. Показана область с потенциальными сигналами, полученными от сахара. В. Соответствующая область очищенной реакционной смеси. Сигналы со значениями 4.46, 4.52, 4.56 и 4.83 ррш не перекрываются и сдвинуты относительно спектра на рис. А, или вообще не присутствуют. С. Двумерный спектр ТОС8У спектр очищенной реакционной смеси.

с

В результате этого исследования был получен двумерный TOCSY спектр, связывающий все протоны внутри спиновой системы, и показывающий, что только один из четырех сигналов (4.83 ррт) может происходить от связывания глюкозы с эукариотическим фактором элонгации eEFIA (рис. 6, С).

Изучение структуры кросс-пиков, полученных в результате использования TOCSY экспериментов показало, что центральной константой спин-спинового взаимодействия для характеристики глюкозилирования является 3J(H1, Н2) = 4 Hz, которая, в соответствии с уравнением Карплуса, указывает на то, торсионный угол между Н1-С1 и Н2-С2 близок к 60°. Все остальные константы спин-спинового взаимодействия 3J(H, Н) составляют примерно ~9 Hz, и их соответствующие торсионные углы близки к 180°, а это может говорить о том, что глюкозное кольцо в продукте реакции имеет конформацию "кресло", а конфигурация аномерного центра может быть идентифицирована как а-гликозидная.

Вследствие идентичности констант спин-спинового взаимодействия и, следовательно, конфигураций УДФ-глюкозе, можно однозначно сказать, что реакция глюкозилирования проходит по механизму, в результате которого образуется продукт, имеющий конформацию "retaining" (рис. 7).

Глюкоз ил трансферта

V-----/ --- ----"

ЭДФ-гякжоад (д н_(> </"">.-

■.О

Глюкоз илтрансфераза

Продукт С КО И фор или и

"Reainiag"

Промежуточный продукт

Рис. 7. Механизм образования продукта реакции глкозилирования с конформацией "retaining".

5. Ингибирование белкового синтеза и цитотоксическая активность Lgt2

и Lgt3

С целью изучения цитотоксической активности глюкозилтрансфераз Lgt2 и Lgt3, мы сравнили их действие с аналогичным действием молекулы дифтерийного токсина DT, которая модифицирует фактор элонгации 2 (рис. 8).

I 24ч 48ч 72ч

j

\ Клетки HBL не интоксицированные ферментами

j

| Клетки, интоксицированные Lgtl

Клетки, интоксицированные Lgt2 Клетки, интоксицированные Lgt3 Клетки, интоксицированные Lgtlmut Клетки, интоксицированные DT-A

Рис. 8. Цитотоксическая активность глюкозилтрансфераз Lgt L. pneumophila и субъединицы А дифтерийного токсина DT-A через 24, 48 и 72 часа инкубации.

В ходе эксперимента было показано, что клетки EBL, электропорированные рекомбинантными ферментативно-активными белками в количестве 40 мкг/мл, не образовывали монослой и погибали в течение 48-72 часов после электропорации.

Отметим, что основные морфологические изменения и клеточная гибель были вызваны минимальными количествами белка, которые не определялись в клеточных экстрактах с помощью вестерн-блоттинга с моноспецифическими анти-Lgt сыворотками (данные не показаны). Цитотоксичность проявлялась только в том случае, когда клетки были электропорированы рекомбинантными глюкозилтрансферазами. Простое же добавление ферментов (Lgtl, Lgt2, Lgt3 и DT-А) в культуральную среду не вызывало цитотоксичности. При электропорации клеток мутантом Lgtl с неактивным DXD-мотивом (D246N/D248N), а также в том случае, когда электропорация проводилась в отсутствие бактериальных ферментов, цитотоксичности не наблюдалось (рис. 8).

Аналогичные результаты, были получены в ходе прямого подсчета выживших EBL клеток спустя 24, 48 и 72 часа после интоксикации (рис. 9).

§ 2 24 48 72

Время инкубации (ч)

Рис. 9. Подсчет оставшихся живых клеток EBL после интоксикации белками Lgt и DT-A (на графике показано среднее значение, полученное из трех опытов, и стандартное отклонение). Электропорация эукариотических клеток без добавления белка изображена на графике пустыми кружками, электропорация мутантом Lgtl представлена пустыми треугольниками. Закрашенными кружками и треугольниками представлена электропорация клеток белками DT-A и Lgtl соответственно. Графики, отображающие интоксикацию Lgt2 и Lgt3 были очень схожи с графиком Lgtl, поэтому они не показаны на схеме.

На рисунке показано, что интоксикация Lgtl, Lgt2 и Lgt3 менее выражена, чем интоксикация субъединицей А дифтерийного токсина. Значительное уменьшение количества клеток в результате действия ферментов Lgt наблюдалось спустя 48 часов, в то время как действие субъединицы А дифтерийного токсина проявлялось раньше. Количество живых клеток снижалось уже через 24 часа. Однако спустя три дня после интоксикации разница в количестве выживших клеток была незначительная для всех исследуемых ферментов.

На следующем этапе исследования нами были проведены специальные эксперименты, направленные на изучение уровня белкового синтеза, такие, как анализ in vitro транскрипции/трансляции и анализ включения метионина in vivo.

Анализ транскрипции/трансляции показал, что Lgtl и Lgt2 полностью подавляли in vitro трансляцию гена люциферазы в количестве 2 мкг/мл, в то время как Lgt3 и DT-A обладали более сильным действием и блокировали продукцию люциферазы в концентрации 0.2 мкг/мл (рис. 10).

.006 .02 .06 0.2 0.6 2 6 |jg/ml

NT NT NT NT

.. (> m

NT NT NT NT

Lgtl Lgt2 Lgt3 DT-A

Рис. 10. Ингибирующая активность глюкозилтрансфераз L. pneumophila и субъединицы А дифтерийного токсина (DT-A) на белковый синтез. Анализ in vitro транскрипции/трансляции.

17

В ходе проведения анализа включения меченого [358] метионина во вновь синтезированные белки клеток, было показано, что интоксикация клеток ЕВЬ электропорацией глюкозилтрансферазами Ь§£1, 1^2, 1^3 и АДФ-рибозилтрансферазой ЭТ-А с нарастающими концентрациями, приводило к значительному снижению уровня включенного меченого [33Б] метионина (рис.11).

4п

О 3 X

о.

О

Ii.IIi.IIi.Ik.

о О о о^Ъо о ,гЬо о ¿"о ■OjJ -OJ? Oj? Oj}

цд/ml

С Lgt1 Lgt2 Lgt3 DT-A

Рис. 11. Ингибирующая активность глюкозилтрансфераз L. pneumophila и субьединицы А дифтерийного токсина (DT-A) на синтез белка эукариотической клетки. Анализ включения меченого [3!S] метионина.

Результаты исследований, направленных на изучение цитотоксичности и

изучение уровня включенного метионина, показали незначительные различия в

действии Lgt3 и глюкозилтрансфераз Lgtl и Lgt2. Однако, в экспериментах,

направленных на изучение процессов транскрипции/трансляции in vitro,

глюкозилтрансфераза Lgt3 проявляла себя наиболее активно.

6. Продукция глюкозилтрансфераз L.pneumophila in vitro

Продукция глюкозилтрансфераз исследовалась во время роста L. pneumophila

на питательных средах (рис. 12).

Lgt1

а н т и -Lgt2 Lgt3

70 кД

Q J- Q J- Q J-\ % \ % % %

% 4 % \ \ \

Рис. 12. Анализ продукции глюкозилтрансфераз штаммом L.pneumophila Philadelphia-1. Дорожки 1, 3, 5: очищенные трансферазы GST-Lgtl, GST-Lgt2 и GST-Lgt3 (по 100 нг) соответственно. Дорожки 2, 4, 6: неочищенный ультразвуковой лизат штамма L.pneumophila Philadelphia-1 (по 40 мкг). Дорожки 1, 2: реакция с сывороткой a-Lgtl; дорожки 3, 4: реакция с сывороткой a-Lgt2; дорожки 5, 6: реакция с сывороткой a-Lgt3.

Исследование выполнялось при помощи вестерн-блоттинга с моноспецифическими мышиными сыворотками, полученными иммунизацией очищенными рекомбинантными Lgtl, Lgt2 и Lgt3 белками. Было показано, что антитела a-Lgtl, a-Lgt2 и a-Lgt3 специфически реагируют с соответствующими трансферазами (рис. 12). Однако при использовании неочищенного ультразвукового лизата L.pneumophila Philadelphia-1, сыворотки специфически выявляли только два ; фермента - Lgtl и Lgt2 (-60 кД и -70 кД соответственно).

Сыворотка a-Lgt3 с неочищенным препаратом L.pneumophila не реагировала. Это позволило предположить, что, в используемых условиях выращивания L.pneumophila Philadelphia-1, синтезировались только ферменты Lgtl и Lgt2 в количествах, которые могут определяться в вестерн-блоттинге. Продукция Lgt3 в данных условиях не наблюдалась или была ниже уровня чувствительности метода.

На следующем этапе исследовали динамику синтеза глюкозилтрансфераз легионелл при культивировании микроорганизмов в жидкой питательной среде в течение до 96 часов (что соответствовало поздней стационарной фазе роста бактерий) на шейкере (рис. 13).

4 Н __48ч

о 3 -8 24ч/ |

О 9 О 2 1 - / |Начапо пигментации!

12ч./ 6ч. / Зч. У

Lgtl ----_ '-- ~ 60 kD

Lgt2 —----_ ——" ~ 70 kD

Lgt3 -100 kD

RalF ~ 45 kD

«С |-------- — — - 50 kD I

Вестерн-блотгинг

Реакция глюкоз ил ирования

0 3 6 12 24 36 48 Время культивации (ч.)

Рис. 13. Анализ продукции глюкозилтрансфераз в жидкой питательной среде. Данные вестерн-блоттинга и глюкозилирующая (14С) активность 1^1, 1^2, и Яа1Р в

различные временные интервалы.

Результаты экспериментов по изучению ультразвуковых лизатов, полученных в ходе культивирования в течение 3, 6, 12, 24 и 48 часов, посредством вестерн-блоттинга со специфичными сыворотками а^12, a-LgtЗ и а-Ка1Р, показали,

что глюкозилтрансферазы и Lgt2 продуцировались на ранней стадии роста (в

лаг-фазе). Однако максимальная продукция отмечалась в период стационарной фазы роста при использовании разных типов питательных сред. Подобным же образом продуцировался эффекторный белок системы IV типа секреции ЯаШ, используемый нами как положительный контроль.

На продукцию глюкозилтрансферазы Ь^З не оказывали стимулирующего действия ни питательная среда ВУЕВ, ни ВРРВ. Ферментативная активность клеточных экстрактов совпадала с экспрессией глюкозилтрансфераз и 1^2 и была максимальна на ранней стадии роста и стационарной фазе (рис.13)

В параллельных экспериментах мы проводили изучение уровня экспрессии генов глюкозилтрансфераз легионелл с помощью ПЦР в режиме реального времени, где в качестве мишеней использовались гены и (рис. 14). Результаты этого исследования совпадают с данными, полученными в результате определения продукции Ь§£1 в вестерн-блоттинге и показывают, что в период лаг-фазы уровень транскрипции был высокий, но ниже, чем в период постэкспоненциальной фазы. Во время логарифмической фазы роста легионелл транскрипция репрессировалась.

Рис. 14. Анализ экспрессии генов Igtl и Igl3 с помощью ПЦР в режиме реального времени.

Белые колонки - уровень транскрипции Igtl, черные колонки - уровень транскрипции lgt3.

Также были получены положительные результаты с праймерами, синтезированными для lgt3 в качестве мишени, которые показали экспрессию соответствующего гена. Особенность экспрессии lgt3 в данном случае отличались от экспрессии Igtl (рис. 14). Синтез мРНК lgt3 сильно индуцировался в период лаг -фазы и снижался с началом размножения бактерий.

Дальнейшее изучение динамики экспрессии глкжозилтрансфераз Lgtl и Lgt3 мы проводили в двух других штаммах L.pneumophila - штаммах Paris и Lens, в которых отсутствовал ген lgt2 (рис.15).

<8 J 24ч. t

а О 21 - 12ч. 10ч. 346V ¡Начало пигментации!

Lgtl ---- ----- - 60 kD

Lgt3 ----- -100 kD

14C —--- --- - 50 kD

Вестерн-блотгинг

Реакция глюкозилирования

О 3 6 10 12 24 36 48 Время культивации (ч.)

Рис. 15. Анализ продукции глкжозилтрансфераз и глюкозилирующей активности штамма Paris L.pneumophila в протеозо-пептонной жидкой питательной среде.

Продукцию ферментов определяли в ультразвуковых экстрактах штамма Paris, взятых через 3, 6, 10, 12, 24, 36 и 48 часов от начала культивирования, используя сыворотки против Lgtl и Lgt3 посредством вестерн-блоггинга. В параллельных экспериментах ультразвуковые экстракты подвергали реакции глюкозилирования с меченой УДФ-['4С] глюкозой, используя при этом клеточный экстракт EBL в качестве субстрата (рис. 15).

Из рис. 13 и рис. 15 видно, что рост штамма Paris был схож с ростом штамма Philadelphia-1, индукция синтеза Lgtl наблюдалась в начальной фазе роста и в стационарной фазе, в то время как максимальный уровень синтеза Lgt3 приходился на преэкспоненциальную (лаг-) фазу и репрессировался, когда бактерии достигали логарифмической стадии роста.

Изучение продукции Lgtl и Lgt3 на более раннем этапе проводилось нами на штамме Paris L.pneumophila, проинкубированном в буфере ACES-K, не содержащем питательных веществ, или в протеозо-пептонном бульоне в течение 4 часов. Результаты исследования полученных образцов посредством вестерн-блотгинга показали, что уровень Lgt3 в протеозо-пептонной среде значительно увеличивался уже спустя 1-2 часа после начала инкубации в питательной среде, оставаясь стабильным в растворе ACES-K. на протяжении 4 часов, в то время как количество Lgtl не изменялось в процессе культивирования (рис. 16). Роста бактерий в течение

этого временного интервала, в буфере АСЕБ-К или в среде ВРРВ, не наблюдалось (данные не показаны).

АВАВАВАВ

Lgt1 \----------60 kD

Lgt3 l_ ....... — ~100 kD

0 12 3 4 Время культивации (ч.)

Рис. 16. Анализ продукции Lgtl и Lgt3 ультразвуковых экстрактов штамма Paris, прокультивированных в буфере ACES-K (А) или в среде ВРРВ (В), при помощи вестерн-блоттинга с соответствующими сыворотками.

7. Продукция глюкозилтрансфераз L.pneumophila in vivo

Следующим этапом исследования было изучение экспрессии Lgtl и Lgt3 на модели амебы A. castellanii, одного из природных хозяев легионелл. Для этого мы использовали культуру L. pneumophila Philadelphia-1, выращенную на твердой питательной среде. Со-культивирование продолжалось в течение 3, 24, 48 и 72 часов, после чего клетки были лизированы и изучены на уровень специфической мРНК при помощи ПЦР с обратной транскрипцией (рис. 17, 18).

С целью анализа динамики размножения легионелл, культура амеб после 3, 24 и 48 часов инкубации была отмыта от внеклеточных бактерий и лизирована, после чего производился подсчет колоний L.pneumophila, вышедших из амеб, на чашке Петри с твердой питательной средой (рис. 17).

Препараты, полученные в моменты времени "0" ч. и 72 ч., были использованы без предварительной отмывки. Это связано с тем, что точка "0" характеризуется началом инфицирования, когда бактерии еще находятся во внеклеточном пространстве, а через 72 часа культивирования большая часть бактерий уже находится во внеклеточном пространстве после лизиса амеб.

— в

£ 5 о

ff -t

О 3 24 4S 72 Время инфицирования <ч t

Рис. 17. Рост L. pneumophila Philadelphia-1 во время инфицирования A. castellanii с течением времени. Черными точками показано количество внеклеточных бактерий в момент времени "0" и 72 часа от начала культивирования. Данные получены в ходе трех независимых экспериментов.

Как показано на рис. 18, максимальный уровень экспрессии lgtl наблюдался в начале инфекции (через 3 часа) и в самый поздний момент времени (через 72 часа), когда большинство микроорганизмов находилось во внеклеточном пространстве после гибели амеб, в отличие от lgt3, максимальная экспрессия которого наблюдалась только через 3 часа от начала культивирования. После чего, с началом бактериального размножения, синтез продукта подавлялся (рис. 17, 18).

S

S

I 20 л

s 15-

0>

10

гг

■I 5

-е-

СО

Л,

1

О 3 24 48 72 Время инфицирования (ч.)

Рис. 18. Уровень экспрессии мРНК Igt1 (белые столбцы) и Igt3 (черные столбцы) во время инфицирования A. castellanii культурой L.pneumophila Philadelphia-1.

В результате исследований было установлено, что глюкозилтрансферазы Lgtl и Lgt2 вырабатываются бактериями в период лаг-фазы и в поздней стационарной фазе их роста в жидкой питательной среде и в период лаг-фазы и на поздней стадии взаимодействия с амебами. В противоположность этим результатам Lgt3 определялся в культурах на ранней стадии роста in vitro (лаг-фаза) и на ранних этапах взаимодействия с эукариотическими клетками. Установленный характер синтеза ферментов позволяет предположить, что Lgt3 может своим действием переводить клетку в «беззащитное» «парализованное» состояние, способствуя тем самым беспрепятственному размножению легионелл, в то время как Lgtl/2 нужны для уничтожения «использованной» клетки.

Таким образом, в нашей работе мы показали, что глюкозилтрансферазы Lgt представляют собой семейство молекул - новую группу факторов патогенности L. pneumophila, которые способны модифицировать эукариотический фактор элонгации eEFlA. Все исследованные штаммы L. pneumophila обладают парой белков Lgtl и Lgt3, в то время как некоторые другие штаммы дополнительно несут Lgt2. Синтез всех ферментов подвержен регуляции и контролируется разными

механизмами, предполагая специализированную роль каждого из белков в жизненном цикле легионелл.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что геномные последовательности штаммов L. pneumophila Philadelphia-1, Lens, Paris, Alcoy и Corby содержат 11 открытых рамок считывания, кодирующих гомологичные глюкозилтрансферазе Lgtl белки. Кодируемые белки образуют три семейства: Lgtl, Lgt2 и Lgt3.

2. Установлено, что клонированные гены глюкозилтрансфераз lgtl, lgt2 и lgt3 экспрессируются в Е. coli с образованием растворимых ферментов, сохраняющих свою биологическую активность, что позволяет получать ферменты в препаративных количествах.

3. Показано, что все исследованные штаммы L. pneumophila обладают генами lgtl и lgt3, в то время как ген lgt2 присутствует не у всех штампов легионелл.

4. Показано, что субстратом глюкозилирующих белков легионелл Lgtl, Lgt2 и Lgt3 является эукариотический фактор элонгации 1A (eEFIA). Сайтом модификации субстрата служит серин-53, а реакция протекает с сохранением альфа-конфигурации гликозидной связи.

5. Выявлено, что глюкозилирование eEFIA приводит к остановке белкового синтеза и гибели клеток млекопитающих.

6. Впервые показано, что синтез глюкозилтрансфераз вирулентными клетками L. pneumophila подвержен специфичному контролю. Lgtl и Lgt2 вырабатываются преимущественно в стационарной фазе роста микробной популяции, тогда как Lgt3 синтезируется в лаг-фазе, предшествующей экспоненциальному росту культуры.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Belyi Y. Lgt: a family of cytotoxic glucosyltransferases produced by Legionella pneumophila / Y. Belyi, I. Tabakova, M. Stahl, K. Aktories II J. Bacteriol. - 2008. - Vol. 190. - P. 3026 - 3035.

2. Belyi, Y. Region of elongation factor 1A1 involved in substrate recognition by Legionella pneumophila glucosyltransferase Lgtl: identification of Lgtl as a retaining glucosyltransferase / Y. Belyi, M. Stahl, I. Sovkova, P. Kaden, B. Luy, K. Aktories // J. Biol. Chem. - 2009. - Vol. 284, № 30. - P. 20167 - 20174.

3. Совкова И. В. Ферменты Legionella pneumophila, модифицирующие эукариотичкские мишени // Тезисы Международной заочной научно - практической конференции «Современные вопросы науки и образования - XXI век». - Тамбов, 2012.

4. Совкова И. В. Глюкозилтрансферазы легионелл - новая группа факторов патогенности // Тезисы X съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 2012.

5. Совкова И. В. Глюкозилтрансферазы легионелл // Тезисы Международной заочно - практической конференции «Биология, Химия, Физика: вопросы и тенденции развития». - Новосибирск, 2012.

6. Совкова И. В. Новая группа факторов патогенности // Тезисы Международной конференции «Биология - наука XXI века». - Москва, 2012.

Подписано в печать: 11.09.2013 Тираж: 80 экз. Заказ № 971 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Совкова, Ирина Владимировна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ имени ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф. ГАМАЛЕИ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

СОВКОВА

04201361510

Ирина Владимировна

ХАРАКТЕРИСТИКА ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ГЛЮКОЗИЛТРАНСФЕРАЗ

LEGIONELLA PNEUMOPHILA

03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Ю. Ф. Белый

Москва 2013

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................................5

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................11

1.1. Бактериальные токсины...................................................................11

1.1.1 .Механизмы действия бактериальных токсинов на клетку.......................12

1.1.1.1. Токсины, воздействующие на клетку снаружи...................................12

1.1.1.2. Токсины, подавляющие синтез белка эукариотической клетки..............15

1.1.1.3. Токсины, влияющие на митотический цикл эукариотической клетки...............................................................................................18

1.1.1.4. Токсины, влияющие на процессы экзоцитоза эукариотической клетки..............................................................................................19

1.1.1.5. Токсины, влияющие на передачу сигналов в эукариотической клетке..............................................................................................21

1.1.1.6. Токсины, влияющие на актиновый скелет эукариотической клетки..............................................................................................27

1.2. Токсические факторы бактерий с глюкозилирующей активностью............30

1.3. Глюкозилтрансфераза Lgtl L. pneumophila - родоначальник новой группы бактериальных эффекторов системы IV типа секреции..................................33

1.4. Заключение..................................................................................41

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................42

2.1. Материалы..................................................................................42

2.1.1. Материалы для клонирования.....................................................42

2.1.2. Реактивы...............................................................................42

2.1.3. Вещества, используемые при культивировании...............................43

2.1.4. Бактериальные штаммы и клеточные линии...............................................44

2.1.5. Материалы для хроматографии....................................................................44

2.1.6. Радиоактивные материалы..........................................................44

2.1.7. Лабораторное оборудование.......................................................44

2.2. Методы......................................................................................45

2.2.1. Культивирование бактериальных штаммов......................................45

2.2.2. Постановка ПЦР......................................................................45

2.2.3. Молекулярное клонирование фрагментов ДНК................................48

2.2.4. Экспрессия рекомбинантных белков.............................................48

2.2.5. Определение концентрации белков...............................................49

2.2.6. Электрофорез в SDS - полиакриламидном геле................................49

2.2.7. Ферментативные исследования....................................................50

2.2.8. Введение рекомбинантных белков в эукариотические клетки методом электропорации...................................................................................51

2.2.9. Реакция транскрипции/трансляции in vitro......................................52

2.2.10. Определение уровня белкового синтеза в клетках...........................52

2.2.11. Изучение внутриклеточной инфекции Acanthamoeba castellanii..........53

2.2.12. ПЦР в режиме реального времени..............................................54

2.2.13. Определение антигенной специфичности белков методом имму ноб лоттинга................................................................................54

2.2.14. Статистическая обработка результатов..........................................55

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ........................56

3.1. Обнаружение генов потенциальных глюкозилтрансфераз в секвенированных геномах L. pneumophila..........................................................................56

3.2. Клонирование и экспрессия генов lgt2 и lgt3.......................................60

3.3. Глюкозилирующая активность новых белков L. pneumophila - Lgt2 и Lgt3..................................................................................................65

3.4. Механизм реакции глюкозилирования при участии Lgt L. pneumophila........................................................................................69

3.5. Ингибирование белкового синтеза и цитотоксическая активность Lgt, Lgt2 и Lgt3..................................................................................................72

3.6. Продукция глюкозилтрансфераз L. pneumophila in vitro..........................76

3.7. Продукция глюкозилтрансфераз L. pneumophila in vivo........................84

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..................................................87

ВЫВОДЬ1..........................................................................................96

Список использованной литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

иптг изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид

КД килодальтон

КОЕ колониеобразующая единица

1^1/2/3 глюкозилтрансферазы легионелл 1/2/3

БТ дифтерийный токсин

ВТ-А субъединица А дифтерийного токсина

еЕР1А эукариотический фактор элонгации 1А

ЕВЬ клетки легкого эмбриона коровы

Сасо2 клетки колоноректальной аденокарциномы человека

НеЬа клетки карциномы шейки матки

ВСУЕ забуференный угольно - дрожжевой экстракт

ВРРВ забуференный бульон на основе Протеозо-пептона №3

ЬВ среда Луриа - Бертани

МЕМ модифицированная среда Игла

ЭДТА этилендиамин тетраацетат

взт глутатион - Б - трансфераза

с№? дезоксинуклеозидтрифосфат

БОБ додецилсульфат натрия

ТАЕ трис - ацетатный буфер

ТЕМЕБ N,N,14' ,Ы'тетраметилэтилендиамин

ТВ 8 трис солевой буфер

ИАБ никотинамид аденин-динуклеотид

мкКи микрокюри

ПЛАТ полиакриламидный гель

УДФ уридиндифосфат

ТОСвУ полная корреляционная спектроскопия

ррт миллионная доля (единица химического сдвига)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Легионелла является грам - отрицательной бактерией, вызывающей острую тяжелую пневмонию - болезнь легионеров (В. S. Fields, R. F. Benson et al., 2002). Известно более 50 видов легионелл, для 22 из них доказана роль в инфекционной патологии человека. Более чем в 90% случаев заболевания основной возбудитель - Legionella pneumophila. L. longbeachae, L. bozemanii, L. dumoffii и L. micdadei являются следующими по значимости этиологическими агентами легионеллеза, составляющие менее 10% легионеллезных инфекций в Европе и в США (Müder R.R., Yu V.L., 2002). Интересно, что в Австралии и Новой Зеландии L.longbeachae отвечает за 30% случаев заболевания легионеллезом (Yu V. L., Plouffe J. F. et al., 2002).

В России также фиксируются случаи заболевания легионеллезом. Так например, в 2003 и в 2004 годах зафиксировано 18 случаев легионеллеза (Беляев E.H., Ясинский A.A. и др., 2005). В 2005 году всего описано 26 случаев легионеллеза в России (Верещагин А.И., Чернявская О.П. и др., 2006). В 2004 году по 7 случаев легионеллеза отмечалось в Воронежской области и Санкт-Петербурге. В 2005 году из всех зарегистрированных случаев заболевания 3 отмечалось в Воронежской области, 12 случаев— в Санкт-Петербурге, по 2 в Ставропольском крае и Волгоградской области, 7 случаев в Мордовии (Верещагин А.И., Чернявская О.П. и др., 2006). Вспышка легионеллезной пневмонии была зафиксирована на Среднем Урале в июле 2007 года в Верхней Пышме.

С инфицированным аэрозолем легионеллы попадают в легкие, где и происходит их контакт с клетками-мишенями. Бактерии активно размножаются в макрофагах, моноцитах крови- и эпителиальных клетках, что приводит к накоплению возбудителя в высокой концентрации и развитию острого воспалительного процесса. Вслед за проникновением в клетку в составе фагосомы, легионеллы индуцируют ряд нарушений процессов фагоцитоза включая подавление закисления содержимого фагосомы, предотвращение слияния фагосом и лизосом, и формируют так называемые «репликативные

вакуоли», где и происходит активное размножение возбудителя (Bozue J. А., Johnson W., 1996; Tzivelekidis T., Jank T. et al., 2011; Horwitz M. A., 1983; Summersgill J. T., Raff M. J. et al., 1988). В завершении внутриклеточного цикла эукариотические клетки гибнут в результате индукции апоптоза или некроза, микроорганизмы выходят во внеклеточную среду и вновь инфицируют фагоциты.

Сложность взаимодействия легионелл с эукариотическими клетками обусловелена вовлечением в процесс специализированных молекул, продуцируемых бактериями и действующих на определенные эукариотические мишени. Действительно, были выделены и охарактеризованы многочисленные факторы, которые потенциально могут участвовать в процессах взаимодействия бактерий и хозяина. Они включали в себя низкомолекулярный цитотоксин, жгутики, белок теплового шока Hsp60, цитолизин - металлопротеиназа, фосфолипазы, фосфокиназы (Dowling J. N., Saha A. К. et al., 1992).

Значительный прогресс в исследовании механизмов патогенности легионелл был достигнут с использованием различных генетических подходов. В результате была показана важная роль нескольких генетических локусов и продуктов конкретных генов во внутриклеточной биологии возбудителя. К подобным продуктам относились белок Mip, PilD и система белковой секреции II типа, аргинин - зависимый транслокационный аппарат, жгутики IV типа, продукты локусов Ivh, enh, mil, pmi и так (Heuner К., Bender-Beck L. et al., 1995). Система секреции IVB типа, известная как Dot/Icm (Aragon V., S. Kurtz A., et al., 2000; Brand В. С., Sadosky А. В. et al., 1994) транспортирует в клетку-мишень многочисленные эффекторы, нарушающие сигнальные пути в эукариотических клетках (Belyi Y., Jank Т, Aktories К., 2011).

К группе новых факторов патогенности легионелл относится глюкозилтрансфераза Lgtl - бактериальный фермент, модифицирующий фактор элонгации 1А и вызывающий гибель эукариотических клеток путем блокирования синтеза белка. Lgtl был впервые обнаружен и охарактеризован в нашей лаборатории и представлял собой новый эффектор системы секреции IVb типа (Belyi I., Popoff M. R., Cianciotto N. P., 2003). Предварительные данные говорили о

возможности существования у легионелл и гомологичных белков со сходной ферментативной активностью. Это послужило основанием для проведения настоящей диссертационной работы по поиску новых глюкозилирующих токсинов у данных бактерий.

Цель диссертационной работы. Целью работы являлось идентификация и молекулярная характеристика новых глюкозилирующих ферментов L. pneumophila.

В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:

• идентифицировать нуклеотидные последовательности, кодирующие глюкозилирующие токсины, в базе данных секвенированных геномов легионелл;

• клонировать, экспрессировать гены и получить рекомбинантные, очищенные, растворимые и биохимически активные глюкозилирующие ферменты;

• исследовать биохимические и цитотоксические свойства полученных рекомбинантных белков легионелл;

• исследовать продукцию глюкозилтрансфераз при росте Legionella pneumophila на питательных средах и в амебах.

Научная новизна работы. Впервые была обнаружена и охарактеризована группа глюкозилирующих эффекторных белков у возбудителя болезни легионеров. Наряду с уже описанным ранее ферментом Lgtl к этой группе относились вещества Lgt2 и Lgt3. Показано, что субстратом глюкозилирующих белков легионелл являлся эукариотический фактор элонгации 1А (eEFIA), компонент аппарата трансляции эукариотических клеток. Участком модификации eEFIA служил аминокислотный остаток серии в положении 53, глюкозилирование которого сопровождалось остановкой белкового синтеза и гибелью клеток млекопитающих. С использованием метода ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) впервые показано, что присоединение остатка глюкозы к серину-53 под действием фермента легионелл происходит с сохранением а-конфигурации гликозидной связи, что позволяет отнести Lgtl к семейству "Retaining glucosyltransferases" GT88 (http://www.cazy.org/GT88.html). Впервые

установлено, что продукция Lgtl и Lgt2 осуществляется преимущественно в стационарной фазе роста микробной популяции, тогда как Lgt3 синтезируется в начальной фазе, предшествующей экспоненциальному росту культуры.

Практическое значение работы. Установлено, что гены, кодирующие белки Lgtl, Lgt2 и Lgt3, обнаруживались у представителей наиболее патогенного для человека вида - L. pneumophila и являются видоспецифическими маркерами для индикации наиболее значимого в инфекционной патологии человека вида легионелл - L. pneumophila.

По результатам работы подготовлены Методические рекомендации «Способ выявления высоковирулентных штаммов легионелл», утвержденные Советом по внедрению научных достижений в практику ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России 22 ноября 2012 г., протокол № 22 и «Определение токсичности факторов патогенности бактерий с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae», утвержденные Советом по внедрению научных достижений в практику ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России 25 января 2013 г., протокол № 23.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Показано, что белки, кодируемые 11 рамками считывания, обнаруженными среди пяти секвенированных геномов штаммов L. pneumophila, высокогомологичны глюкозилтрансферазе Lgtl и образуют три семейства: Lgtl, Lgt2 и Lgt3.

2. Впервые показано, что глюкозилтрансферазы Lgt2 и Lgt3 L. pneumophila обладают глюкозилирующей активностью и блокируют белковый синтез путем модификации эукариотического фактора элонгации 1А в положении серин - 53.

3. Впервые выявлено, что синтез ферментов клетками L. pneumophila подвержен строгому контролю. Глюкозилтрансферазы Lgtl и Lgt2 вырабатываются бактериями в поздней стационарной фазе их роста in vitro в жидкой питательной среде и на поздней стадии взаимодействия с амебами in vivo в отличие от Lgt3, который определяется в культурах на ранней стадии роста in vitro и на ранних этапах взаимодействия с эукариотическими клетками.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Международной заочно - практической конференции «Современные вопросы науки и образования - XXI век» (Тамбов, 2012), на Международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012), на X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012), на Международной заочно - практической конференции «Биология, Химия, Физика: вопросы и тенденции развития» (Новосибирск, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 научные статьи в зарубежных издательствах, рекомендованных ВАК, а также опубликовано 4 тезисов докладов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и список использованной литературы, содержащий ссылки на 159 источников. Работа иллюстрирована 5 таблицами и 28 рисунками.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Бактериальные токсины

В 1872 году Edwin Klebs впервые предпринял попытку экспериментально продемонстрировать продукцию бактериями токсинов на примере стафилококков. Эта попытка потерпела неудачу. Следующие неудавшиеся попытки были предприняты в 1884 г. Robert Koch для возбудителя холеры и Friedrich Loeffler для дифтерийной палочки. Удача улыбнулась Emile Roux и Alexandre Yersin лишь в 1888 г. Работая в Институте Пастера, они обнаружили первый бактериальный яд - дифтерийный токсин (Roux Е., Yersin А., 1888). Они же предположили, что дифтерийный токсин является «диастазой», то есть ферментом. Это было подтверждено спустя восемьдесят лет работами Honjo с соавт. (1968 г.) и Gill с соавт. (1969 г.).

В последующем десятилетии были обнаружены еще два новых токсина -столбнячный токсин (Faber, 1890 г.; Tizzoni и Cattani, 1890 г.) и ботулинический токсин (Van Ermengem, 1896 г.). В дальнейшем, за первую половину XX века, было обнаружено около 100 новых бактериальных токсинов. Это было связано с началом первой мировой войны и интенсивным исследованием анаэробных микроорганизмов, в первую очередь клостридий, изучением патогенеза газовой гангрены, разработкой новых методов ее лечения и профилактики. Однако, наряду с токсинами клостридий, в этот период были обнаружены токсины стрептококков группы А (стрептолизины и эритрогенные токсины), токсины возбудителя сибирской язвы и другие важные продукты бактерий.

Вторая половина XX столетия и начало XXI века ознаменовано наступлением эры молекулярной биологии, что способствовало обнаружению и детальной характеризации новых бактериальных токсинов. В этот период были обнаружены вакуолизирующий цитотоксин Helicobacter pylori, несколько токсических экзоферментов Pseudomonas aeruginosa, токсин токсического шока и новые энтеротоксины и суперантигены Staphylococcus aureus, энтеротоксин-протеиназа Bacteroides fragilis, цитолетальные гигантоклеточные токсины,

бинарные токсины, новые типы ботулинического токсина, эксфолиативные токсины стафилококков, токсины Clostridium difficile, новые энтеротоксины бактерий кишечной группы и др. В общей сложности за этот период было обнаружено и детально исследовано более 200 бактериальных токсинов, были определены нуклеотидные последовательности кодирующих генов, изучены механизм действия, особенности генетической регуляции и молекулярная структура.

Микробные токсины были признаны основными факторами вирулентности различных патогенных бактерий и были определены как растворимые вещества, которые изменяют нормальный метаболизм клеток хозяина и оказывают тем самым вредное влияние на макроорганизм (Schiessinger D., Schaechter М., 1993). Бактериальные токсины определяют основные симптомы многих инфекционных болезней таких, как дифтерия, коклюш, холера, сибирская язва, ботулизм,