Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование серологической диагностики легионеллеза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование серологической диагностики легионеллеза"

На правах рукописи

КАРБЫШЕВ ГЕРИАРД ЛЬВОВИЧ

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА

чу V'

7

□030В220Е

03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Ростоо-на-Дону 2007 г

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения Ростовском - на — Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и блаюполучия человека

Научный консультант доктор медицинских наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор Ломов Юрий Михайлович

Официальные оппоненты-

доктор медицинских наук, профессор, Липницкий Анатолий Васильевич доктор медицинских наук, профессор Ценева Галина Яковлевна доктор медицинских наук, доцент Терновская Лариса Николаевна Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны РФ

Защита состоится « 6 » апреля_ 2007 г в Ю часов на заседании диссертационного совета Д 208.082.01. при ГОУ ВПО Ростовском государственном медицинском университете (344022, г Ростов-на-Дону, пер Нахичеван-ский, 29)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО Ростовского юсударственного медицинского университета

Автореферат разослан «¿2» марта 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Н Я Корганов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Болезнь легионеров - острое лихорадочное заболевание, вызываемое группой микроорганизмов, относящихся к семейству Legionellacaea Ведущее значение играет Legionella pneumophila серогруппы 1, с воздушно-капельным механизмом передачи и поражением верхних дыхательных путей в виде респираторной лихорадки Понтиак и нижних дыхательных путей в виде острых пневмоний (Прозоровский С В с соавт, 1984)

История изучения болезни легионеров началась с 1976 г и была связана с изучением вспышки острых респираторных заболеваний среди участников конференции «Американского легиона», который проходил с 21 по 28 июля 1976 г в отеле Белью-Стратфорд в Филадельфии Уже 2 августа в Центр по контролю за болезнями в г Атланте поступила информация о смерти трех пациентов с диагнозом тяжелой пневмонии Вскоре было установлено массовое поступление больных с симптомами атипичной пневмонии, а эпидемиологическое расследование показало, что подавляющее большинство больных были участниками указанной конференции Всего был госпитализирован 221 участник конференции с симптомами пневмонии, из которых 34 умерли

В последние годы в различных странах отмечен ряд крупных эпидемических вспышек легионеллеза В 1996 г во время круизных рейсов по Карибскому морю зарегистрировано 50 случаев легионеллеза (Jernigan D В et al, 1996) В 1999 г в Бельгии при проведении торговой ярмарки зарегистрировано 93 случая легионеллеза, из которых 5 больных умерли (Pascual MF et al, 2002) В 1999 г в Нидерландах при проведении выставки цветов зарегистрировано 188 случаев легионеллеза (Den Boer J W et al, 2002, Lettinga К D et al, 2002) В 2001 г во Франции от больных с пневмониями выделено 259 культур легио-нелл различных видов и серогрупп (Doleans A et al, 2002) В 2001 г в Испании зарегистрирована крупнейшая вспышка легионеллеза, во время которой заболело около 800 человек (Garcia-Fulgueiras A et al, 2003)

Частота легионеллеза среди лиц, госпитализируемых в стационары с диагнозом «пневмония», в среднем в Европе и США оценивается от 2 до 15% (Muder R R et al, 1989) По данным Центра по контролю за болезнями в г Атланте (CDC), ежегодно в США регистрируют от 10000 до 18000 случаев легионеллеза По данным агентства производственной безопасности и здравоохранения США (OSHA) число ежегодных случаев легионеллеза составляет 25000, из которых 4000 умирают, а по данным Американского общества микробиологов (ASM) среди больных с пневмониями, госпитализируемых в отделения интенсивной терапии, легионеллез является причиной 15-30% случаев (Legionella 2003, AWT, 2003)

Частота внутрибольничного легионеллеза может колебаться от 16,3% среди больных с приобретенными пневмониями до 76% среди больных с различ-

ными формами вторичных иммунодефицитных состояний (Grosserode М , 1993, Junge-Mathys Е, Mathys W , 1994)

На территории нашей страны легионеллез впервые зарегистрирован в 1979 г (Прозоровский С В с соавт, 1984, 1987), а в последующем отмечены спорадические и отдельные групповые вспышки заболеваний (Беленький С Н , 1984, Покровский В И с соавт , 1988, Прозоровский С В с соавт, 1987, Сакварелидзе Л А с соавт, 1990)

Частота выявления легионеллеза среди больных пневмонией колеблется от 10,7% до 12,2% (Покровский В И с соавт, 1988, Тартаковский И С с соавт, 1989, Меморандум ВОЗ, 1990) При сероэпидемиологическом исследовании в группах риска частота положительных результатов колеблется от 1% до 55,4% (Васильева В И с соавт, 1986, Герчикова Н М с соавт, 1990)

В настоящее время описано 48 видов Legionella, включающих 69 отдельных серогрупп (Fields В S et al, 2002). Вид L pneumophila представлен 15 серо-группами В США 90% случаев легионеллеза связаны с L pneumophila и 79% из них - с серогруппой 1 (Marston В J et al, 1994) По данным Weekly Epidemiology Record (WER), возбудителем легионеллеза в Европе в 95,9% случаев является L pneumophila, а среди них лидирующее место занимает серогруппа 1, которую выделяют от больных в 70,8% случаев Среди других серогрупп от больных выделяют серогруппу 3 в 5% случаев и серогруппу 6 - в 3,1% случаев

Однако это заболевание продолжает оставаться малоизвестным в нашей стране Отсутствие патогномоничной клинической картины, зачастую неопределенные данные эпидемиологического анамнеза делают лабораторные методы решающими при установлении диагноза болезни легионеров

Безусловно, «золотым стандартом» диагностики инфекционных заболеваний является бактериологический метод В то же время, практика диагностики инфекционных болезней свидетельствует о большой роли и значимости серологических методов диагностики

Анализ данных литературы свидетельствует о важной роли серологических методов диагностики легионеллеза, необходимости использования коммерческих тест-систем для выявления возбудителя, его растворимых антигенов в клиническом материале и объектах окружающей среды, идентификации й серологического типирования По данным WER, удельный вес серологических методов диагностики колебался от 70% до 78,2%, бактериологического метода -от 17% до 21,6% и ПЦР - диагностики - от 0,83% до 11%

В настоящее время для выявления антител к возбудителю легионеллеза используют три метода реакцию непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), иммуноферментный анализ (ИФА) и микроагглютинацию (РА) (Меморандум ВОЗ, 1990) Кроме общепринятых медодов используют и реакцию латексной агломерации, которая является более чувствительной, чем РНИФ и выявляет антитела в диагностических титрах на ранних стадиях заболевания - до 10 дня (Harrison ТС et al, 1987, Friis-Moller A et al, 1986, Marrie T J. et al, 1986, Scar-liniG etal, 1986)

Методы обнаружения легионеллезного антигена используют в качестве

экспрессных на ранних стадиях заболевания и широко применяют для диагностики легионеллеза Они включают ИФА, радиоиммунный анализ и реакцию прямой иммунофлюоресценции (РИФ) (Меморандум ВОЗ, 1990) Легионеллез-ный антиген методом ИФА был обнаружен в моче больных еще во время вспышки заболеваний в Филадельфии в 1976 г (Berdal BP et al, 1979) Дальнейшие исследования позволили предложить метод ИФА для окончательного подтверждения диагноза (Plouffe J Г et al, 1995) на ранних стадиях заболевания - в первые 2-3 дня (Birtles R J et al, 1990, Formica N et al, 2001, Helbig J H et al, 1989, Kashuba AD et al, 1996, Plouffe J F et al, 1995) По данным WER, среди серологических методов, используемых для диагностики в Европе, доля методов выявления антигена в моче в ИФА выросла с 16% до 45%

Для выявления и серологической дифференциации легионелл японские исследователи предложили реакцию коагглютинации (Yoh М et al, 1985) Показано преимущество реакции коагглютинации в сравнении с агглютинацией на стекле по чувствительности и специфичности, поскольку коагглютинирующий диагностикум не давал перекрестных реакций (Yoh М et al, 1985)

В настоящее время в России отсутствуют сертифицированные тест-системы для серологической диагностики легионеллеза

В связи с изложенным, актуальной проблемой в настоящее время является совершенствование серологической диагностики легионеллеза путем создания надежных отечественных препаратов и тест-систем для выявления специфических антител в сыворотках крови, антигена в биологическом материале и объектах окружающей среды, идентификации и серологического типирования возбудителей а также разработка критериев диагностики

Цель и задачи исследования

Целью работы является научное обоснование методических подходов к конструированию препаратов для серологической диагностики легионеллеза, создание антигенных и иммуноглобулиновых диагностикумов с известными свойствами, получение диагностикумов для серологической идентификации L pneumophila, оценка диагностической значимости методов и разработка критериев и алгоритма диагностики легионеллеза

Для достижения указанной цели необходимо решение следующих задач

1 Изучение антигенной структуры L pneumophila различных серогрупп, поиск иммуногенных белковых и липополисахаридных антигенов, имеющих диагностическое значение

2 Подбор условий получения растворимого антигена L pneumophila серо-группы 1 с известным антигенным составом для использования его в качестве сенситина при конструировании антигенных вариантов диагностикумов и характеристика его антигенных свойств

3 Подбор схем иммунизации и получение различных вариантов гипериммунных кроличьих легионеллезных сывороток

4 Конструирование диагностикума легионеллезного серогруппы 1 антигенного полимерного сухого для реакции объемной агломерации (РАО) Изуче-

ние чувствительности и специфичности Изучение препарата в практике диагностики заболеваний органов дыхания

5 Конструирование диагностикума легионеллезного серогруппы 1 имму-ноглобулинового полимерного сухого для РАО Изучение чувствительности и специфичности Определение показаний к практическому использованию диагностикума

6 Конструирование набора легионеллезных коагглютинирующих диагно-стикумов Изучение чувствительности и специфичности Изучение препаратов в практике бактериологических исследований на легионеллез

7 Разработка критериев оценки результатов использования комплекса тестов и алгоритма диагностики легионеллеза

Научная новизна

Впервые с использованием современных методов изучен антигенный состав L pneumophila семи серогрупп, наиболее часто встречающихся в патологии человека Получены новые данные об иммуногенных свойствах белковых и липополисахаридных антигенов, имеющих диагностическое значение при конструировании тест-систем

Впервые показано, что, несмотря на гетерогенность по степени иммуно-генности, белковые антигены L pneumophila являются общими для различных серогрупп

Впервые научно обоснован процесс оптимизации получения растворимого антигена с известными антигенными свойствами для использования его в качестве сенситина при производстве диагностических препаратов

Впервые получен легионеллезный антигенный полимерный диагностикум для определения в сыворотках крови специфических антител к различным се-рогруппам L pneumophila

Разработаны новые научно-методические подходы к получению гипериммунных сывороток для конструирования иммуноглобулиновых полимерных и коагглютинирующих диагностикумов, а также для анализа антигенной структуры L pneumophila различных серогрупп

Получены новые данные о спектре антигенспецифических антител при формировании гуморального иммунного ответа в результате иммунизации лабораторных животных L pneumophila семи серогрупп

Разработаны критерии для оценки результатов применения комплекса диагностических тестов при проведении диагностики болезни легионеров

Теоретическая значимость

Анализ перекрестных иммуноблоттингов L pneumophila семи серогрупп с кроличьими гипериммунными сыворотками против семи серогрупп позволил классифицировать белковые антигены по свойству иммуногенности на высоко, средне и низкоиммуногенные, что несет высокую степень информативности и перспективно для дальнейшего изучения антигенной структуры L pneumophila

Полученные на основе отработанных методических подходов кроличьи

гипериммунные сыворотки против L pneumophila семи серогрупп, обогащенные антителами к белковым и липополисахаридным антигенам, перспективны для дальнейшего изучения антигенной структуры L pneumophila различных серогрупп и конструирования новых диагностикумов

Предложенные методические подходы иммобилизации растворимого ле-гионеллезного антигена позволяют оптимизировать процесс создания препаратов для диагностики легионеллеза и получать антигенные варианты диагностикумов с заданными свойствами

Анализ перекрестных иммуноблоттингов L pneumophila семи серогрупп с кроличьими гипериммунными сыворотками против семи серогрупп позволил оценить гуморальный иммунный ответ экспериментальных животных по аффинности образующихся специфических антител, что перспективно для изучения особенностей иммунного ответа у людей при легионеллезе

Практическая значимость

Разработана технология получения растворимого антигена L pneumophila серогруппы 1 с известными антигенными свойствами для использования в качестве сенситина при конструировании антигенных вариантов тест-систем для серологической диагностики легионеллеза

Разработана технология получения кроличьих гипериммунных сывороток против L pneumophila семи серогрупп, обогащенных антителами к белковым и липополисахаридным антигенам, с целью анализа антигенной структуры и конструирования иммуноглобулиновых полимерных и коагглютинирующнх диагностикумов

Сконструирован и внедрен в практику диагностикум легионеллезный серогруппы 1 антигенный полимерный сухой для РАО, предназначенный для серологической диагностики легионеллеза у людей, вызванного L pneumophila различных серогрупп Диагностикум прошел Государственные испытания в ГИСК им J1 А Тарасевича и решением Комитета медицинских иммунобиологических препаратов рекомендован к регистрации в РФ (Протокол №7 от 19 12 2002 г)

Сконструирован диагностикум легионеллезный серогруппы 1 иммуногло-булиновый полимерный сухой для РАО Диагностикум может быть использован для выявления легионеллезного антигена в моче у больных с целью серологической диагностики заболевания, а также для серологической идентификации L pneumophila серогруппы 1 Диагностикум прошел комиссионные испытания, на него написана инструкция по изготовлению и контролю, утвержденная Ученым Советом РостНИПЧИ (Протокол № 4 от 14 06 2006 г)

Сконструирован и предложен для практического использования набор диагностикумов коагглютинирующнх легионеллезных серогрупп 1-7, предназначенный для скрининга колоний и серологической идентификации L pneumophila серогрупп 1 - 7 при проведении бактериологических исследований на легионеллез Диагностикум прошел комиссионные испытания, на него написана инструкция по изготовлению и контролю, утвержденная Ученым Советом РостНИПЧИ (Протокол № 4 от 14 06 2006 г )

Разработаны и предложены для практического использования критерии диагностики легионеллеза на основании анализа эпидемиологических, клинических, рентгенологических данных и результатов дифференцированных лабораторных исследований различного материала от больных

Положения, выносимые на защиту;

1 Растворимый легионеллезный антиген с известным составом иммуно-генных белков, полученный в результате изучения антигеннои структуры L pneumophila семи серогрупл с использованием современных методов, может быть использован в качестве сенситина при конструировании антигенных вариантов диагностикумов

2 Гипериммунные кроличьи сыворотки, полученные на основе разработанных научно-методических подходов, позволяют конструировать специфичные и высокочувствительные диагностические иммуноглобулиновые препараты для серологической диагностики легионеллеза и идентификации возбудителя

3 Специфичные и высокочувствительные тест-системы для выявления антител и антигенов в биологическом материале позволяют повысить диагностическую ценность серологических методов исследования на разных стадиях инфекционного процесса у больных легионеллезом, вызванном L pneumophila различных серогрупп

4 Набор легионеллезных коагглютинирующих диагностикумов семи серогрупп позволяет проводить скрининг, идентификацию и серологическое тонирование культур L pneumophila различных серогрупп при проведении бактериологических исследований

5 Разработанные критерии и алгоритм серологической диагностики легионеллеза позволяют давать объективную оценку результатов исследования материала от больных и лиц, входящих в группы риска и определить место серологических методов в диагностике легионеллеза

Апробация работы

Результаты исследований были представлены на научных конференциях

Конференция Ростовского отделения Всероссийского общества микробиологов, Ростов-на-Дону, 1996 г

VII съезд Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 1997 г

Конференция Ростовского отделения Всероссийского общества микробиологов, Ростов-на-Дону, 1999 г

4-ая Межгосударственная научно-практическая конференция государств -участников СНГ Современные технологии в диагностике особо опасных болезней Саратов, 2003 г

Научно-практическая конференция «Актуальные проблемы эпидемиологического надзора за природно-очаговыми и особо опасными инфекциями в регионе Северного Кавказа», Ставрополь, 2005 г

VI Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ «Санитарная охрана территории государств-участников Содружества Независимых Государств Проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях», Волгоград, 2005 г

V-ая Межвузовская международная биохимическая научно-практическая конференция «Обмен веществ при адаптации и повреждении», Ростов-на-Дону, 2006 г

Материалы диссертации получены при выполнении четырех плановых научных тем Per № 01 93 0 003251 «Легионеллез на Северном Кавказе», Per № 01 95 0 003715 «Особенности эпидемиологии легионеллеза в условиях крупного города», Per № 01 99 0 002823 «Конструирование препаратов для серологической диагностики легионеллеза», Per № 01 200 2 12993 «Изучение Legionella pneumophila с целью поиска антигенов, имеющих диагностическое значение»

Публикации результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 27 научных работ, из них 7 - в изданиях, рецензируемых ВАК

План диссертационной работы утвержден на заседании Ученого совета ФГУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора (протокол № 4 от 19 04 2005 г)

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 301 страницах и состоит из введения, материалов и методов, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, каждая из которых включает результаты собственных исследований, их обсуждение, за которым следуют заключение, выводы и список цитируемой литературы Диссертация иллюстрирована 36 таблицами, 22 рисунками Библиографический указатель содержит 395 источника, в том числе 58 работ отечественных и 337 -зарубежных авторов

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение антигенной структуры Legionella pneumophila серогрупп 1-7

При проведении исследований использовали следующие штаммы Legionella pneumophila штамм Philadelphia серогруппы 1 АТСС 33152, штамм Togus серогруппы 2 АТСС 33154, штамм Blumington серогруппы 3 АТСС 33155, штамм Los-Angeles серогруппы 4 АТСС 33156, штамм Dallas серогруппы 5 АТСС 33216, штамм Chicago 2 серогруппы 6 АТСС 33215, штамм Chicago 8 серогруппы 7 АТСС 33823 в виде бактериальных взвесей с концентрацией 109 м к /мл, прогретые при температуре 80° С в течение 30 мин Подобный температурный режим позволяет в максимальной степени сохранить структуру белков и, в то же время, обеззаразить бактериальную взвесь, что соответствует требо-

ваниям противоэпидемического режима

Изучая электрофоретические профили L pneumophila семи серогрупп, нам удалось показать наличие 27 белков, из которых 14 были общими для всех семи серогрупп, 10 - общими для отдельных серогрупп и 3 - уникальными для конкретных серогрупп, в частности, 3 и 7 серогрупп

Полученные нами результаты соответствуют данным литературы по изучению белковых профилей L pneumophila Так, Е Pearlman et al, (1985) показали наличие около 30 белков, доминирующими из которых были белки с молекулярными массами 19, 22, 24, 29, 43, 46, 48, 53, 63, 76, 78 kDa N С Engleberg et al, (1984) выявили наличие поверхностных белков с молекулярными массами 19, 20, 23,5 и 28 kDa Р S Hoffman et al, (1992) показали наличие белков с молекулярными массами 31, 29, 28, 27, 16, 14 и 12 kDa Однако необходимо отметить, что все вышеперечисленные исследования проводились только с L pneumophila серогруппы 1 и сравнительный анализ электрофоретических профилей с другими серогруппами не проводился

Для анализа иммуногенных белков нами был использован метод иммуноб-лоттинга в двух вариантах постановки анализ высокомолекулярных и низкомолекулярных антигенов Для этого использовали гипериммунные кроличьи сыворотки против референтных штаммов L pneumophila указанных семи серогрупп С точки зрения конструирования диагностических тест-систем, этот этап экспериментальных исследований является ключевым, поскольку именно иммуногенные антигены формируют иммунный ответ и, в частности, гуморальный, при котором организм продуцирует широкий спектр специфических антител различных классов к указанным антигенам

В иммуноблоттинге с серогруппами 1-7 кроличья гипериммунная сыворотка против серогруппы 1 идентифицирует 20 иммуногенных антигенов Общими для всех семи серогрупп являются восемь антигенов с молекулярными массами 60, 56, 52, 38, 30, 28, 19 и 16 kDa Кроме того, нами выявлено три неспецифических антигена с молекулярными массами 72, 60 и 56 kDa, которые взаимодействовали с нормальной кроличьей сывороткой В то же время необходимо отметить, что сыворотка против серогруппы 1 выявляет иммуногенные антигены с молекулярными массами 83, 85, 96 и 111 kDa у других серогрупп, не представленные у серогруппы 1

При исследовании в иммуноблоттинге различных штаммов гетерологич-ных микроорганизмов Y pestis, F tularensis, Y pseudotuberculosis сероваров 1 -6, В abortus, В melitensis, В suis, Y enterocolitica серовара 09, V cholerae eltor, E coh, С jejuni, S aureus и S typhimurmm с кроличьими сыворотками против семи серогрупп L pneumophila каких либо антигенов не выявлено, что подтверждает специфичность вышеуказанных антигенов L pneumophila

В дальнейшем изучены перекрестные взаимодействия белковых антигенов между серогруппами 1-7 L pneumophila Анализ результатов перекрестного иммуноблоттинга L pneumophila семи серогрупп с каждой из семи кроличьими сыворотками против указанных серогрупп позволил классифицировать все изучаемые белковые антигены L pneumophila

1 Группа антигенов, представленная у всех семи серогрупп, определяется всеми семью сыворотками Она локализуется полосой в диапазоне молекулярных масс от 30 до 20 kDa с выраженной интенсивностью и обладает выраженными антигенными и иммуногенными свойствами На основании данных литературы и результатов собственных исследований, мы полагаем, что данная группа антигенов состоит из субъединиц МОМР с молекулярными массами 30 и 28 kDa, фрагментов ЛПС (возможно липида А) в диапазоне молекулярных масс от 30 до 20 kDa, димеров Mip - белка с молекулярной массой 24 kDa и, вероятно, фрагментов пептидогликана Подобное предположение обосновано тем, что все указанные компоненты структурно связаны друг с другом и формируют наружную мембрану бактериальной клетки Указанная группа антигенов является мажорной и, в основном, определяет иммуногенные свойства L pneumophila Образующиеся к ним антитела являются высокоаффинными Выявленный нами неспецифический компонент с молекулярной массой 28 kDa у 1-ой и 2-ой серогрупп при изучении денситограмм по величине профиля интенсивности составляет менее 10% от всей группы и, таким образом, существенно не влияет на специфичность указанной группы антигенов

2 Антиген с молекулярной массой 38 kDa представлен у всех серогрупп, определяется большинством, но не всеми, сыворотками против семи серогрупп Указанный антиген является, по нашему мнению, цитолизином, связанным с бактериальной клеткой Антиген с молекулярной массой 38 kDa является мажорным, обладает высокими иммуногенными свойствами, а образующиеся против него антитела являются высокоаффинными

3 Группа антигенов, представленная у всех серогрупп, однако определяется только сыворотками против других отдельных серогрупп Эта группа включает следующие антигены 49, 43, 40, 34, 31, 20, 19 и 17 kDa Они являются гетерогенными по свойству иммуногенности, на них есть высоко и низко отвечающие лабораторные животные, популяция образующихся антител гетероген-на по свойству аффинности, однако эти антигены являются общими для всех семи серогрупп L pneumophila

4 Группа антигенов, которые определяются у отдельных серогрупп сыворотками против других отдельных серогрупп Эта группа включает следующие антигены - 64, 63, 60, 54, 50, 46, 44, 36, 35, 33 и 18 kDa Они являются низко-иммуногенными, на них большинство лабораторных животных отвечают слабым иммунным ответом, популяция образующихся антител преимущественно низкоаффинная, указанные антигены являются общими, но не для всех серогрупп

Изучены антигенные и иммунногенные свойства ЛПС L pneumophila семи серогрупп Препараты ЛПС из семи серогрупп L pneumophila выделяли по методу Р J Hitchcock, Т М Brown (1983), модифицированному J D Urgens, F J Fehrenbach (1997) Анализ перекрестных иммуноблоттингов препаратов ЛПС семи серогрупп L pneumophila при взаимодействии с сыворотками против семи серогрупп свидетельствует о том, что ЛПС-антигены являются серогруппоспе-цифичными и присущи только своим серогруппам Они распределяются в элек-

трофорезе широкими зонами с колебаниями молекулярных масс в верхней границе в диапазоне 140 - 85 Юа и в нижней границе - в диапазоне 30 - 17 kDa Для L pneumophila серогрупп 1, 2, 4, 5 и 7 характерна электрофоретическая картина классической «лесенки» распределения ЛПС Подобная «лестничная» картина электрофоретического профиля препаратов ЛПС отсутствует у серогрупп 3 и 6 Для серогрупп 1, 2 и 7 достаточно четко представлена электрофоретическая картина распределения ЛПС на высоко- и низкомолекулярные зоны Остальные антигенные детерминанты ЛПС, определяемые сыворотками против различных серогрупп L pneumophila, являются минорными, имеют низкую интенсивность полос и существенно не влияют на электрофоретическую картину препаратов ЛПС L pneumophila семи серогрупп Указанные минорные ЛПС -антигены, в основном, локализуются в зоне молекулярных масс от 30 до 17 kDa и представляют собой, по-видимому, не до конца разрушенные фрагменты белков и пептидогликана, а также фрагменты липида А

Таким образом, проведенный нами анализ антигенной структуры L pneumophila семи серогрупп позволил не только классифицировать иммуногенные антигены L pneumophila, но и явился основой целенаправленного конструирования антигенных и иммуноглобулиновых вариантов препаратов для серологической диагностики легионеллеза

Конструирование и испытания диагностикума легионеллезного серо-группы 1 антигенного полимерного сухого для РАО

Для конструирования диагностикумов в качестве носителей антигенов и иммуноглобулинов нами использована технология полимерных микросфер Монодисперстные полимерные частицы в виде коллоидных растворов с реакционно-способными группами на поверхности представляют интерес для биотехнологии как носители биологически активных веществ, обеспечивающие их ковалентное связывание и последующее участие полученных конъюгатов в им-мунохимических процессах Микросферические частицы органической или не органической природы, сенсибилизированные антителами или антигенами, ведут себя как указанные молекулы, хотя представляют собой крупные макрообъекты В связи с этим в серологических реакциях в один акт элементарного взаимодействия антиген - антитело вовлекается большое количество вещества, что приводит к уменьшению необходимого числа актов взаимодействия для регистрации результатов реакции Таким способом, реализуется частный случай амплификации При постановке реакции в лунках планшета образовавшийся агглютинат физически взаимодействует с поверхностью лунки В зависимости от массы агглютината он скатывается на дно лунки или удерживается на стенках Этот процесс седиментационного распределения похож на центрифугирование в градиенте плотности и, таким образом, усиливает визуальную регистрацию реакции

Преимущество полимерных носителей связано с тем, что они стабильны, поверхность биологически инертна и физико-химическая связь с сенситиноч известна и зависит от характера носителя Используя метод двойной полимери-

зации полиакролеина - щелочью в водной среде и обработкой сафранином -были получены сшитые, стабильные, нерастворимые в органических растворителях микросферы, окрашенные в красный цвет, диаметром 1,5 мкм, содержащие 1,3 мМоль/г альдегидных групп Полученные серии полиакролеинового микросферического носителя использовали для конструирования антигенного и иммуноглобулинового легионеллезных диагностикумов

В качестве сенситина для получения диагностикума легионеллезного серо-группы 1 антигенного полимерного сухого для РАО применяли специфический растворимый легионеллезный антиген, полученный дезинтеграцией бактериальной массы L pneumophila Philadelphia 1 Растворимый антиген получали тремя способами обработкой бактериальной массы 1%-ным раствором дезок-сихолата натрия, обработкой бактериальной массы ультразвуком и комбинирование ультразвука с обработкой дезоксихолатом

Для отработки оптимальных параметров разрушения бактериальной клетки и максимального выхода иммуногенных белков изучали содержание белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот в получаемых сериях растворимого легионеллезного антигена Установлено, что разрушение клеток только ультразвуком малоэффективно и количество освобождаемых основных веществ невелико Использование только 1%-ного раствора дезоксихолата натрия приводит к существенному увеличению выхода белка и нуклеиновых кислот, но количество углеводов и липидов остается практически на уровне концентрации ультразвукового дезинтеграта Комбинированное разрушение клеток ультразвуком и дезоксихолатом приводит к существенному увеличению выхода белка Варьирование рН реакционной смеси в процессе ультразвуковой дезинтеграции и последующей обработки дезоксихолатом натрия позволило максимально освободиться от липополисахаридных фрагментов в растворимом легионеллезном антигене В соответствии с данными литературы, мягкий кислотный гидролиз приводит к значительной деградации ЛПС антигенов, что подтверждается им-муноблоттингом (Otten S et al, 1985) Так, если при комбинированном разрушении при рН 6,0-6,5 выход белка составил 0,8-3,0 мг/мл, а липидов - 4 4-5,2 мг/мл, то при рН 5,5-6,0 выход белка составил 1,1-3,1 мг/мл, а липидов -1,3-1,8 мг/мл

Исследование белкового спектра растворимого легионеллезного антигена методом диск-электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии 0,1% -ного додецил сульфата натрия (SDS) показало, что комбинированный метод разрушения клетки приводит к получению 23 белков со средними молекулярными массами 109, 107, 91, 82, 77, 72, 69, 66, 58, 55, 51, 47, 45, 42, 40, 38, 37,35,34, 29, 25, 20 и 15 kDa

При исследовании растворимого легионеллезного антигена методом им-муноблотгинга с кроличьей гипериммунной сывороткой против серогруппы 1 выявлены 14 иммунногенных антигенов 81, 71, 63, 60, 55, 51, 44, 41, 39, 38, 31, 30, 26 и 20 kDa При исследовании растворимого легионеллезного антигена методом иммуноблоттинга с пулом нормальной кроличьей сыворотки выявлены пять неспецифических антигенов 70, 58, 55 47 и 28 kDa

Для изучения спектра белковых антигенов, которые сорбируются на поверхность сферического носителя, нами использован следующий методический прием После сенсибилизации носителя подобранной дозой растворимого ле-гионеллезного антигена в оптимальных условиях сферы осаждали центрифугированием и полученный супернатант исследовали в иммуноблоттинге с кроличьей гипериммунной сывороткой против серогруппы 1 с целью изучения антигенов, не связавшихся с поверхностью сферического носителя

При исследовании супернатанта растворимого легионеллезного антигена после иммобилизации на полимерный носитель с кроличьей гипериммунной сывороткой против серогруппы 1 методом иммуноблоттинга установлено, что пять антигенов не сорбировались на носитель 71, 58, 46, 32 и 29 kDa Четыре из пяти не сорбированных антигенов относятся к неспецифическим, реагирующим с пулом нормальной кроличьеи сыворотки Таким образом, на поверхности полимерного микросферического носителя в процессе иммобилизации сорбируются 12 иммуногенных антигенов, из которых одиннадцать - с молекулярными массами 20, 26, 30-31, 38-39, 40, 44, 50-51, 56-58, 60, 62 и 80 kDa - являются специфичными для L pneumophila и один - с молекулярной массой 28 kDa - неспецифический, взаимодействующий с нормальной кроличьей сывороткой

Представленные данные позволяют полагать, что полученный нами растворимый легионеллезный антиген содержит полноценные антигенные компоненты L pneumophila, отвечающие за антигенность, вирулентность и иммуно-генность возбудителя и эффективно сорбируются на полимерный носитель

В результате подбора и стандартизации условий иммобилизации (растворимый легионеллезный антиген с концентрацией по белку 2,2 мг/мл на 25 мг полиакролеиновых микросфер на фосфатном буферном растворе с концентрацией 0,15 моль/л, рН 7,1 ±0,1) получен диагностикум легионеллезный серогруппы 1 антигенный полимерный Лиофилизацию диагностикума осуществляли в 3% желатозо-сахарозной средой высушивания во флаконах по 1 мл в камере вакуум-сушильного аппарата в течение (23±1) ч и конечной температуре (22±2) ° С Срок годности с сохранением специфической активности диагностикума - 3 года

Полученный диагностикум легионеллезный серогруппы 1 антигенный полимерный сухой взаимодействовал с экспериментальными и коммерческими (производства института им Н Ф Гамалеи) кроличьими легионеллезными гипериммунными сыворотками с титрами от 1 320 до 1 2560

Изучение специфичности диагностикума проводили с панелью гетероло-гичных гипериммунных коммерческих сывороток различных серий и постановкой реакции торможения с теми гетерологичными сыворотками, которые давали положительные титры в реакции объемной агломерации Были использованы различные серии сывороток против 15 видов гетерологичных микроорганизмов чумная, туляремийная, лептоспирозная к 15 серогруппам, холерная, бруцеллезная, псевдотуберкулезная, стафилококковая, сальмонеллезная, ши-геллезная, эшерихиозная, дифтерийная, риккетсиозная (Провачека), риккетси-озная Q, а также нормальный человеческий донорский у-глобулин, который

представляет собой пул сывороток, собранных от 2-3 тыс доноров Выявлены следующие результаты титры 1 40 с сыворотками двух сероваров лептоспир -L hebdomadis, L camcola, титры 1 20 с сыворотками L pyrogenes и сыворотки против возбудителя лихорадки Q Неспецифичность результатов подтверждается реакцией торможения суспензией возбудителя легионеллеза в концентрации 109 м к/мл

Изучена специфичность диагностикума с сыворотками крови здоровых лиц Исследованы сыворотки от 143 доноров крови и только в четырех образцах обнаружены антитела в титре 1 40, что составило 2,8% Положительных результатов в титре 1 80 не обнаружено

При дальнейшем изучении специфичности диагностикума нами исследованы образцы сывороток крови больных острыми заболеваниями органов дыхания, расшифрованных этиологически Исследованы группы больных с острыми заболеваниями органов дыхания бактериальной природы, диагноз у которых подтвержден бактериологически, больные с респираторной хламидийной и микоплазменной инфекциями, диагноз у которых подтвержден серологически Исследованы сыворотки крови от 99 больных с острыми заболеваниями органов дыхания, у которых при бактериологическом исследовании мокроты и бронхиальных смывов после бронхоскопии обнаружены возбудители бактериальной природы в концентрации от 106 КОЕ и выше (S aureus, S pneumonia, В с a! at г hahs, N subßava, К pneumonia) Исследованы сыворотки крови от 438 больных серопозитивных на хламидиоз и 330 сывороток серопозитивных на микоплазмоз с тест-системами «ХламиБест-IgG-CTpim» и «Mycoplasma pneumonia IgG/IgM» Результаты исследования сывороток крови больных с острыми заболеваниями органов дыхания установленной природы представлены в таблице 1

Таблица 1 Результаты исследования сывороток крови больных с заболеваниями органов дыхания установленной природы с диагностикумом легионеллез-ным антигенным серогруппы 1 полимерным в РАО

Группы исследованных лиц Всего исследовано Титры в РАО

1 40 1 80 1 160

Больные заболеваниями органов дыхания бактериальной этиологии 99 2 2,0% 0 0

Больные заболеваниями органов дыхания хламидийной этиологии 438 19 4,3% 1 0,2% 0

Больные заболеваниями органов дыхания микоплазменной этиологии 330 14 4,2% 1 0,3% 0

Представленные данные свидетельствуют о высокой специфичности диаг-ностикума легионеллезного антигенного полимерного сухого

Для изучения чувствительности диагностикума исследовано в РАО 50 сывороток лиц, серопозитивных в отношении легионеллезной инфекции Указанные сыворотки исследовались при проведении Государственных испытаний в ГИСК им JI А Тарасевича Серопозитивность всех сывороток была подтверждена в РНИФ производства института им Н Ф Гамалеи Все 50 сывороток от серопозитивных лиц давали положительные результаты в РАО с диагностику-мом с титрами от 1 80 до 1 640 Среднегеометрический титр составил 1 95,8±13,5

Таким образом, установлено, что чувствительность диагностикума составила 100%, специфичность - 99,1%, а его диагностический титр - 1 80

При проведении сравнительных исследований диагностикума легионеллезного серогруппы 1 антигенного полимерного с наборами для РНИФ и ИФА производства института им Н Ф Гамалеи, на 509 сывороток крови от 429 больных острыми пневмониями, установлено, что в РНИФ, ИФА и РАО положительные результаты получены с частотой 12,7%, 23,1% и 9,2% соответственно Несмотря на то, что наиболее высокая частота положительных результатов отмечена при использовании метода ИФА - 23,1%, именно ИФА давал наибольшее число положительных результатов, не подтверждаемых другими методами -63,9% Это может свидетельствовать о регистрации ложноположитель-ных реакций Подтверждению этому является наименьшая частота положительных результатов в ИФА, подтверждаемых другими методами - 11,1% Частота совпадений положительных результатов ИФА с РНИФ составила 13,9%, а с РАО-11,1%

Разработанный нами диагностикум в РАО показал наибольший процент положительных результатов, подтверждаемых двумя другими методами -25,5%, и наименьший процент положительных результатов, не подтверждаемых другими методами - 12,8% Это свидетельствует о высокой чувствительности и специфичности диагностикума и метода РАО Наиболее высокая частота совпадений положительных результатов РАО отмечена с методом РНИФ -38,3% При повторном исследовании сывороток крови больных в стадии выздоровления отмечено, что при использовании метода РАО определяется наиболее высокая частота нарастания титров - 35,3% и наименьшая частота неизмененных титров - 17,7%, в то время как для РНИФ частота нарастания титров в парных сыворотках составила только 21,1% Представленные данные свидетельствуют о том, что метод РАО может быть использован как самостоятельный метод серологической диагностики легионеллеза

При изучении антигенной структуры нами установлено, что подавляющее количество белковых антигенов L pneumophila являются общими для семи изученных серогрупп, при этом 11 из них сорбированы на полимерный носитель Это позволило предположить, что разработанный нами диагностикум будет выявлять специфические антитела к другим серогруппам В таблице 2 представлены данные исследования диагностикума в РАО с экспериментальными

сыворотками против L pneumophila различных серогрупп

Таблица 2 Результаты исследования различных серий кроличьих иммунных сывороток против L pneumophila семи серогрупп с диагностикумом легионел-_лезным серогруппы 1 антигенным полимерным в РАО_

Гипериммунные сыворотки против Серия Разведения сывороток

1 40 1 80 1 160 1 3201 1 640 1 1280 1 2560

Серогруппы 1 1048 .... +-t++ ++++ +++ — —

1049 ++++ +++I- 44++ ++ — —

458 ++++ ++++ ++++ 4+++

459 ++++ ++++ ++++ ++++ 44

461 ++++ ++++ ++++ 4444 +44

927 ++++ ++++ 1-444 ++++ ++++ 44

1513 +4++ ++++ +4+4- ++++ 4444 44+

Серогруппы 2 1363 44+ — — —

1507 ++++ ++++ +++ — — — —

Серогруппы 3 1366 +++ — — - -

1508 ++++ 4-++ — — - —

Серогруппы 4 1205 ++++ ++++ 4+++ — — —

1509 ++++ 4 f + — — — —

Серогруппы 5 1369 .... ++++ ++++ 4+4 +++ — —

1510

Серогруппы 6 1371 +-Н-+ ++++ +4++ +++ +++ — —

1511 ++-Н- ++++ 444 — — — —

Серогруппы 7 1374 ++++ 44+4 +++ +44 — —

++++ 4+4 — — — —

Контроль с ИКС отр отр отр отр отр отр отр

Диагностикум легионеллезный серогруппы 1 антигенный полимерный взаимодействует с гомологичной сывороткой против серогруппы 1 с титрами от 1 640 до 1 2560 в зависимости от серии сыворотки С сывороткой против серогруппы 2 диагностикум взаимодействует с титрами от 1 160 до 1 320, с сывороткой против серогруппы 3-е титрами 1 160, с сывороткой против серогруппы 4 - с титрами от 1 160 до 1 320, сывороткой против серогруппы 5-е титрами от 1 80 до 1 640, с сывороткой против серогруппы 6-е титрами от 1 160 до 1 640 и с сывороткой против серогруппы 7 - также с титрами от 1 ■] 60 до 1 640

Представленные данные свидетельствуют о перекрестном взаимодействии диагностикума легионеллезного серогруппы 1 антигенного полимерного с экспериментальными сыворотками против серогрупп 2-7 Это позволяет полагать, что полученный нами диагностикум будет определять в сыворотках крови больных антитела к L pneumophila других серогрупп, во всяком случае, серогрупп 2-7

Препарат прошел Государственные испытания в ГИСК им JI А Тарасеви-ча (протокол № 7 от 19 12 2002 г ) н по результатам этих испытаний диагности-

кум легионеллезный серогруппы 1 антигенный полимерный сухой для РАО рекомендован к внедрению в практику здравоохранения страны

Конструирование и экспериментальные испытания диагностикума легионеллезиого серогруппы 1 иммуноглобулинового полимерного сухого для РАО

Для конструирования диагностикума и получения контрольных сывороток для проверки активности легионеллезиого антигенного диагностикума использованы кроличьи гипериммунные сыворотки, полученные различными способами

Учитывая данные литературы и результаты собственных исследований о том, что белковые антигены являются общими для всех серогрупп L pneumophila, а ЛПС присущи только конкретным серогруппам, мы попытались получить сыворотки, обогащенные антителами к белковым антигенам и сыворотки к ЛПС С этой целью использован следующий подход При получении сывороток, обогащенных антителами к белковым антигенам, для иммунизации была использована бактериальная масса L pneumophila серогруппы 1, прогретая при 80 °С в течение 30 минут При этом способе обработки бактериальной массы в значительной степени сохраняется структура белковых антигенов и при иммунизации идет выработка антител преимущественно к указанным антигенам Для получения сывороток, обогащенных антителами к ЛПС, были использованы бактериальные массы L pneumophila серогрупп 1-7, подвергнутые обработке при 100 °С в течение 2 часов При этом способе обработки полностью разрушаются белковые антигены и при иммунизации идет выработка антител преимущественно к ЛПС

Использованы три схемы иммунизации классический метод с последовательным подкожным введением антигена в полном адъюванте Фрейнда, модифицированный нами метод с предварительным введением кроликам иммуно-модулятора тактивина и метод с применением способа эмульгирования корпускулярного антигена (бактериальной массы L pneumophila) в полном адъюванте Фрейнда

Для получения сывороток, обогащенных антителами к белковым антигенам, нами использованы две схемы иммунизации классическая схема и схема с предварительным введением иммуномодулятора тактивина Для иммунизации брали бактериальную массу L pneumophila, прогретую при 80 °С в течение 30 минут Установлено, что предпочтительней является схема иммунизации с предварительным введением кроликам иммуномодулятора тактивина Полученные этим методом сыворотки содержат большую концентрацию белка, чем сыворотки, полученные классическим способом Указанные кроличьи гипериммунные сыворотки были использованы в качестве положительных контрольных образцов при постановке РАО с легионеллезным антигенным полимерным диагностикумом, зарегистрированы в качестве СОП - стандартного образца предприятия при проведении Государственных испытаний в ГИСК им Л А Тарасевича и методика их получения отражена в нормативной документа-

ции на диагностикум легионеллезный серогруппы 1 антигенный полимерный сухой Помимо применения их в качестве положительного контроля, эти сыворотки использованы для изучения антигенной структуры L pneumophila семи серогрупп при постановки иммуноблоттинга

При конструировании легионеллезного иммуноглобулинового полимерного диагностикума нами были использованы гипериммунные сыворотки, обогащенные антителами к липополисахаридным фракциям L pneumophila Это обусловлено тем, что разрабатываемый диагностикум предназначается, в первую очередь, для выявления легионеллезного антигена в биологических жидкостях организма человека, в первую очередь - в моче, и объектах окружающей среды Мы полагаем, что в моче больного появляется не целая бактериальная клетка, а ее фрагменты, существенно деградированные под воздействием бактерицидных и бактериостатических факторов внутренней среды организма В этой ситуации страдают, в первую очередь, белковые антигены и сохраняются липополисаха-ридные фрагменты (Domínguez JA et al, 1998)

Для получения сывороток, обогащенных антителами к липополисахаридным антигенам, нами применены три схемы иммунизации классическая схема, схема с предварительным введением иммуномодулятора тактивина и схема с применением способа эмульгирования корпускулярного антигена (бактериальной массы L pneumophila) в полном адьюванте Фрейнда Для иммунизации использовали бактериальную массу L pneumophila, прогретую при 100 °С в течение 2 часов В качестве контроля использована коммерческая сыворотка производства института им Гамалеи Характеристика сывороток, условия конструирования и активность полученного диагностикума представлены в таблице 3

В результате подбора и стандартизации условий выделения иммуноглобу-линовой фракции и ее иммобилизации получен диагностикум легионеллезный серогруппы 1 иммуноглобулиновый полимерный Лиофилизацию диагностикума осуществляли в 3 % желатозо-сахарозной среде высушивания во флаконах по 1 мл в камере вакуум-сушильного аппарата в течение (23±1) ч и конечной температуре (22±2) "С Срок годности с сохранением специфической активности диагностикума - 3 года

Чувствительность диагностикума проверена в имитационных опытах с образцами мочи человека в двух вариантах для определения количества микробных клеток и определения концентрации растворимого антигена

Для определения количества микробных клеток взвесь L pneumophila серогруппы 1 в конечной концентрации 109 м к/мл в 5,0 мл мочи титровали до 103 м к/мл Чувствительность диагностикума в имитационных опытах колебалась в диапазоне от 5х 105 до 106 м к /мл

Для определения концентрации антигена в 1,0 мл мочи добавляли растворимый легионеллезный антиген до конечной концентрации 2 мг/мл по белку (по методу Лоури) Полученный образец титровали по 50 мкл, начиная с разведения 1 40 до 1 2560 и результат определяли в РАО с полученным диагности-кумом Для количественного определения растворимого легионеллезного антигена была построена калибровочная кривая Диапазон специфической

Таблица 3 Характеристика сывороток, использованных для конструирования, посадочные дозы и активность экспериментальных серий иммуноглобули-

новых препаратов

Схемы иммунизации Титры в РА Титры в РАО Белок по Лоури (мг/мл) Посадочная доза (мг на 100 мг сфер) Активность препарата (м к /мл)

Коммерческая сыворотка производства института им Гамалеи 1 1601 320 1 801 160 5,6 8,0 > 108

1 320 1 801 160 5,4 6,0-8,0 > 10s

1 3201 640 1 1601 320 5,9 6,0-8,0 10s

Классическая схема 1 3201 640 1 1601 320 4,5 6,0 - 7,0 10s

1 3201 640 1 1601 320 4,9 6,0 - 7,0 10s

1 640 1 3201 640 5,8 5,0-6,0 108

Схема с эмульгированным антигеном 1 3201 640 1 3201 640 5,9 4,0 - 5,0 108

1 640 1 3201 640 6,4 4,0 - 5,0 5x10'

1-640 1 640 6,8 4,0 - 5,0 10'

Схема с тактивином 1 6401 1280 1 6401 1280 7,0 3,0-4,0 5xl06

1 6401 1280 1 6401 1280 7,5 2,0-3,0 10"

1 1280 1 6401 1280 7,7 2,0 - 3,0 106

1 2560 1 2560 8,0 2,0 - 3,0 5x10"

чувствительности составил от 50 до 2 мкг/мл легионеллезного антигена по белку Предел чувствительности диагностикума - 2 мкг/мл по белку Отсекающее значение от неспецифических результатов (cut-off) составил 50 мкг/мл растворимого антигена по белку Полученные данные свидетельствуют о высокой чувствительности и специфичности легионеллезного иммуноглобулинового полимерного диагностикума

При изучении специфичности диагностикум давал отрицательные результаты с 23 изученными штаммами 14 видов гетерологичных микроорганизмов с концентрацией бактериальной взвеси от 10б до 108 м к /мл Y pestis,

F tularensis, Y pseudotuberculosis сероваров 1-6, Br abortus, Br melitensis, Br suis, Y enterocohtica серовар 09, V cholerae eltor, E coli, Campylobacter jejuni, С diphtheriae gravis, L monocytogenes серогруппы 1, S typhimurium, культуры 5 aureus, S pneumonia, К pneumonia, выделенные от больных Полученные данные свидетельствуют о высокой специфичности диагностикума, который давал отрицательные результаты со всеми изученными штаммами с концентрацией от 106 до 108 м к /мл Диагностикум в РАО слабо (на +++) взаимодействовал только со штаммами К pneumonia, В abortus В melitensis, В suis с концентрацией 109 м к /мл, что является показателем неспецифических реакций

Нами изучена специфичность диагностикума с микроорганизмами, которые по данным литературы имеют родственные антигены и дают перекрестные взаимодействия в серологических реакциях С этой целью в РАО с иммуногло-булиновым диагностикумом исследованы препараты растворимых антигенов L grippotyphosae, L ротопае, L sejroe, СИ pneumonia и С burnetii Перечисленные препараты взаимодействовали с диагностикумом в РАО до разведения 1 40, что соответствовало концентрации свыше 50 мкг/мл и свидетельствовало о неспецифических реакциях В диапазоне специфических реакций - от 2 до 50 мкг/мл, получен отрицательный результат Таким образом, данные экспериментальных исследований диагностикума свидетельствуют об отсутствии перекрестных реакций в РАО с большой коллекцией гетерологичных микроорганизмов

Диагностикум исследован с референтными штаммами L pneumophila семи серогрупп с целью выявления перекрестных серологических реакций Полученные данные свидетельствуют о том, что иммуноглобулиновый диагностикум является специфичным для L pneumophila серогруппы 1 Диагностикум взаимодействовал с L pneumophila серогруппы 2 с концентрацией взвеси 108 м к/мл с сомнительной реакцией (на ++) и с взвесью L pneumophila серогруппы 6 со слабоположительной реакцией (на +++) Таким образом, диапазон специфической чувствительность диагностикума составил с корпускулярными антигенами 106 - 107 м к /мл Незначительными реакциями диагностикума с микробными взвесями 107 м к /мл и выше можно пренебречь

С помощью полученного диагностикума исследовано 36 штаммов L pneumophila, выделенных из объектов окружающей среды девять штаммов серогруппы 1, четыре штамма серогруппы 2, девять штаммов серогруппы 3, пять штаммов серогруппы 4, три штамма серогруппы 5, три штамма серогруппы 6 и три штамма серогруппы 7 Диагностикум давал четкую положительную реакцию (на ++++) со всеми девятью штаммами L pneumophila, выделенными из окружающей среды Диагностикум взаимодействовал с двумя штаммами серогруппы 2 с концентрацией взвеси 108 мк/мл с сомнительной реакцией (на ++) Кроме того, диагностикум взаимодействовал с двумя штаммами L pneumophila серогруппы 6 с концентрацией взвеси 108 м к/мл с сомнительной реакцией (на ++) Представленные данные подтверждают высокую специфичность иммуноглобулинового полимерного диагностикума для L pneumophila серогруппы 1

При проведении полевых испытаний диагностикума с целью обнаружения легионеллезного антигена исследованы 74 пробы мочи от больных и 107 проб воды из различных объектов окружающей среды Среди больных с острыми заболеваниями органов дыхания у лиц, занятых на предприятиях угольной промышленности и, в первую очередь, у шахтеров, работающих под землей, частота положительных проб мочи составила 21,4% со средней концентрацией легионеллезного антигена в моче 14,9 мкг/мл Параллельные исследования указанных проб мочи в ИФА производства института им Н Ф Гамалеи, выявило примерно сходную частоту положительных проб - 23,5%, что позволило предполагать наличие у больных легионеллеза, в основном, в клинической форме респираторной лихорадки Понтиак Подтверждением этого является тот факт, что в указанный период времени из различных водных источников подземной внутришахтной среды выделяли штаммы L pneumophila различных серогрупп, в том числе и серогруппы 1 При исследовании проб мочи больных с острыми заболеваниями органов дыхания, проживающих в микрорайонах города, обеспеченных централизованным горячим водоснабжением, частота положительных проб мочи на наличие растворимого антигена L pneumophila серогруппы 1 составила 16,7% при средней концентрации антигена в моче 12,5 мкг/мл При параллельном исследовании этих проб мочи в ИФА производства института им Н Ф Гамалеи, выявлена такая же частота положительных проб В период проведения указанных исследований также выделяли L pneumophila различных серогрупп и в том числе серогруппы 1 в пробах воды, взятых из различных участков ТЭЦ и в отдельных случаях из домашних душевых головок

Кроме того, нами предпринята попытка оценить возможности разработанного диагностикума для серологического выявления легионеллезного антигена в водных объектах окружающей среды Исследованы 61 проба внутришахтной воды (центральные водосборники, водосливные канавки и смывы с вентиляционных коллекторов), 36 проб воды из систем ТЭЦ и 10 проб воды из домашних душевых головок Частота положительных проб колебалась от 10,3% до 18,6% с концентрацией легионеллезного антигена от 9,9 до 15,6 мкг/мл Положительные результаты в РАО подтверждали положительными результатами в ИФА Частота положительных проб в ИФА была несколько выше, чем в РАО, с колебаниями от 12,8% до 19,4%, однако разница оказалась статистически не достоверной

Таким образом, результаты полевых испытаний диагностикума легионеллезного серогруппы 1 иммуноглобулинового полимерного свидетельствуют о возможности использования его для серологической диагностики заболевания у людей, идентификации культур и выявления легионеллезного антигена в водных объектах окружающей среды Чувствительность диагностикума составила для корпускулярных антигенов 106 м к/мл, а для растворимого антигена 2-50 мкг/мл Специфичность диагностикума подтверждена при проведении экспериментальных исследований с референтными штаммами L pneumophila семи серогрупп, коллекцией гетерологичных микроорганизмов и коллекцией штаммов L pneumophila семи серогрупп, выделенных из объектов окружающей сре-

ды Диагностикум прошел комиссионные испытания в РостНИПЧИ, на него написана нормативная документация (инструкция по изготовлению и контролю), которая утверждена Ученым Советом института (протокол №4 от 14 06 2006 г)

Конструирование и экспериментальные испытания набора легнонел-лезных серогруппы 1 — 7 коагглютинирующих диагностикумов

Для конструирования коагглютинирующих препаратов нами отработаны условия получения стафилококкового реагента с высокой иммуноглобулинсвя-зывающей активностью

Показано, что для увеличения содержания белка А в клеточной стенке стафилококка необходимо культивирование S aureus штамм Cowan 1 на агаре Хотгингера рН 7,0-7,2 с повышенным содержанием аминного азота (1,5 г/л) в течение 14-22 часов Нами изучена иммуноглобулинсвязывающая активность культур S aureus штамм Cowan 1, выращенных на агаре Хотгингера с различным содержанием аминного азота в различные сроки культивирования Иммуноглобулины классов М, G и А определяли радиальной иммунодиффузии в агаре в супернатантах культур S aureus после взаимодействия их со стандартной сывороткой человека с известной концентрацией иммуноглобулинов Использовали серии агара Хотгингера с обычным (0,8 - 1,0 г/л) и повышенным содержанием аминного азота (не менее 1,5 г/л) и различные сроки культивирования Установлено (рисунок 1), что наиболее оптимальным является условия культивирования референтного штамма стафилококка в течение 20 часов на агаре Хоттингера с концентрацией аминного азота не менее 1,5 г/л

Используя различные варианты агара Хоттингера с содержанием аминного азота не менее 1,5 г/л получено восемь серий стафилококкового реагента, у которых иммуноглобулинсвязывающая активность по иммуноглобулинам класса G составляла 1,6 - 2,0 мг/мл Серии стафилококкового носителя лиофильно высушивались и хранились при температуре 4 °С Высушенный стафилококковый реагент не утрачивал своих свойств на протяжении 5 лет (срок наблюдения) Реагент представлял собой гигроскопическую пористую массу белого цвета, полностью растворимую при добавлении дистиллированной воды в течение 1-2 мин Полученный раствор гомогенный, не прозрачный и не дает спонтанной агглютинации Стафилококковый реагент прошел комиссионные испытания в РостНИПЧИ, на него написана нормативная документация, утвержденная Ученым Советом РостНИПЧИ

Как было указано выше, ЛПС антигены присущи только конкретным серо-группам L pneumophila и, следовательно, именно они должны явиться основой конструирования коагглютинирующих диагностикумов, предназначенных для серологической идентификации различных серогрупп L. pneumophila Для получения сывороток, обогащенных антителами к ЛПС, были использованы бактериальные массы L pneumophila серогрупп 1 - 7, подвергнутые обработке при 100 °С в течение 2 часов При этом способе обработки полностью разрушаются белковые антигены и при иммунизации идет выработка антител

Рисунок 1

Иммуноглобулинсвязывающая активность в РИД 10%-ной суспензии взвеси стафилококка, выращенного при различных условиях кул ьтивирования

Время культивирования (час)

^ Иммуноглобулинсвязывающая активность стафилококка, выращенного на агаре Хоттингера, рН 7,0-7,2

—d—- Иммуноглобулинсвязывающая активность стафилококка, выращенного на агаре Хоттингера, рН 7,0-7,2 с повышенным содержанием аминного азота (1,5 г/л)

преимущественно к ЛПС Для получения сывороток, обогащенных антителами к липополисахаридным антигенам, нами была подобрана схема иммунизации с предварительным введением кроликам иммуномодулятора тактивина С использованием указанной схемы было проведено три серии иммунизаций по 2-3 кролика на каждую серогруппу I. pneumophila Получено от шести до девяти серий кроличьих гипериммунных легионеллезных сывороток к L pneumophila серогрупп 1 - 7 с титрами в реакции объемной агглютинации от 1 320 до 1 1280 Сыворотки фасовали по флаконам объемом 2,0 мл, замораживали и лиофильно высушивали для последующего хранения Для дальнейшего конструирования набора коагглютинирующих диагностикумов были отобраны сыворотки против L pneumophila семи серогрупп с титрами от 1 640 до 1 1280 в реакции объемной агглютинации

В результате экспериментально подобранных условий сенсибилизации стафилококкового реагента кроличьими гипериммунными сыворотками, обогащенными антителами к ЛПС - антигенам L pneumophila серогрупп 1 - 7, получен набор легионеллезных серогрупп 1 - 7 коагтлютинирующих диагности-кумов Лиофилизацию диагностикума осуществляли в 3 % желатозо-сахарозной средой высушивания с предварительным замораживанием в парах азота в течение (10±2) мин Лиофилизацию проводили в течение (23±1) часов Срок хранения сухих диагностикумов с сохранением специфической активности - 3 года (срок наблюдения)

Специфическая активность полученных легионеллезных коагглютини-рующих диагностикумов с гомологичными культурами составила 5х 10s - 109 м к /мл

При изучении специфичности набора коагглютинирующих диагностикумов получены отрицательные результаты с 23 изученными штаммами 14 видов гетерологичных микроорганизмов с концентрацией бактериальной взвеси от 109 м к /мл Y pestis, F tularensis, Y pseudotuberculosis сероваров 1-6, Br abortus, Br melitensis, Br suis, Y enterocolitica серовар 09, V cholerae eltor, E coli, Campylobacter jejuni, С diphtheriae gravis, L monocytogenes серогруппы 1, S typhi-murium, культуры S aureus, S pneumonia, К pneumonia, выделенные от больных Полученные данные свидетельствуют о специфичности набора коагглютинирующих диагностикумов

В качестве препарата сравнения использовали коммерческую тест-систему Legionella latex test производства фирмы Oxoid, England, которая предназначена для серологической идентификации легионелл и широко используется в различных странах мира Указанный набор состоит из трех латексных диагностикумов, которые выявляют штаммы L pneumophila серогруппы 1, штаммы L pneumophila серогрупп 2 - 7 и штаммы легионелл других видов

При изучении специфичности набора легионеллезных коагглютинирующих диагностикумов семи серогрупп на коллекции референтных штаммов L pneumophila семи серогрупп установлена строгая специфичность каждого ко-агглютинирующего диагностикума соответствующей серогруппе L pneumophila и отсутствие перекрестных реакций с другими серогруппами

При изучении специфичности набора легионеллезных коагглютинирующих диагностикумов семи серогрупп на коллекции штаммов L pneumophila семи серогрупп, выделенных из объектов окружающей среды (36 штаммов различных серогрупп) в сравнении с тест-системой Legionella latex test также установлена строгая специфичность каждого коагглютинирующего диагностикума соответствующей серогруппе L pneumophila и отсутствие перекрестных реакций с другими серогруппами

Таким образом, разработан набор легионеллезных коагглютинирующих диагностикумов, предназначенный для скрининга колоний и серологической идентификации L pneumophila серогрупп 1 - 7 при проведении бактериологических исследований на легионеллез Специфическая чувствительность набора диагностикумов составила 109 м к/мл, а высокая специфичность подтверждена

экспериментальными исследованиями с референтными штаммами L pneumophila семи серогрупп, коллекцией гетерологичных микроорганизмов и коллекцией штаммов L pneumophila семи серогрупп, выделенных из объектов окружающей среды Набор диагностикумов L pneumophila серогрупп 1 - 7 прошел комиссионные испытания в РостНИПЧИ, на него написана нормативная документация (инструкция по изготовлению и контролю), которая утверждена Ученым Советом института (протокол №4 от 14 06 2006 г)

Критерии серологической диагностики легионеллеза

Анализ методов серологической диагностики легионеллеза, применяемых в настоящее время в мире, и оценка их диагностической значимости свидетельствуют о следующем Существует ряд методов и тест-систем для серологической диагностики легионеллеза Комитет экспертов ВОЗ, Европейская рабочая группа по изучению легионеллезной инфекции (EWGLI), Центр по контролю заболеваемости (CDC, США), предлагая проводить дальнейшие исследования по разработке методов диагностики и тест-систем, сходятся на том, что в настоящее время общепринятыми являются два метода серологической диагностики - РНИФ с целью обнаружения специфических антител в крови и ИФА с целью обнаружения легионеллезного антигена в моче больных Для этих методов разработаны стандартные коммерческие наборы и они проходят широкие международные испытания

Комплексный анализ эпидемиологических, клинико-рентгенологических данных и результаты лабораторных исследований позволяет ставить окончательный и предварительный диагноз болезни легионеров

Окончательный диагноз устанавливают при наличии клинической картины острого заболевания нижних дыхательных путей и рентгенологических данных, а также одного или более лабораторных критериев выделение культуры из респираторных секретов, ткани легкого, плеврального экссудата, крови и четырехкратном и более нарастании титров антител к L pneumophila серогруппы 1 в РНИФ или в реакции объемной агглютинации

Предварительный диагноз устанавливают при наличии клинической картины и рентгенологических данных, а также одного или более лабораторных критериев определение специфического легионеллезного антигена в респираторных секретах или моче, определение возбудителя методом прямой имму-нофлюоресценции в респираторных секретах или ткани легкого при использовании моноклональных реагентов

ВОЗ предлагает разделение заболевания на две клинико-эпидемиологические формы болезнь легионеров (пневмоническая форма) и лихорадка Понтиак (непневмоническая форма) Обе формы заболевания начинаются остро с анорексии, рвоты, мышечных и головных болей, повышения температуры и озноба. При пневмонической форме появляется мало продуктивный кашель, боли в животе и диарея, спутанность сознания и инфильтра-тивные или очаговые изменения в легких При лихорадке Понтиак изменений в легких не регистрируют. Клинически разграничить болезнь легионеров от дру-

гих пневмоний не представляется возможным Только эпидемиологические данные позволяют заподозрить легионеллез путешествия, нахождение в медицинских стационарах, массовые скопления людей в закрытых помещениях, наличие иммуносупрессивной терапии Факторами риска являются возраст старше 50 лет, мужской пол, курение и употребление алкоголя

Таким образом, анализ критериев ведущих научных центров мира позволяет их сгруппировать следующим образом эпидемиологические, клинические, рентгенологические критерии, бактериологические, серологические и молеку-лярно-биологические

Обязательным для постановки диагноза является анализ эпидемиологических и клинических данных Во всех представленных критериях диагностики предлагается деление на две клинические формы собственно болезнь легионеров (пневмоническая форма) и лихорадка Понтиак без клинических признаков пневмонии Особенностью критериев диагностики в Великобритании является выделение такого диагноза, как бессимптомная легионеллезная инфекция

Выделение культуры при бактериологическом исследовании любого клинического материала позволяет окончательно подтвердить диагноз

Важнейшим методом лабораторного подтверждения диагноза являются серологические реакции Они регламентированы всеми критериями диагностики Четырехкратное нарастание антител к L pneumophila серогруппы 1 в РНИФ при исследовании парных сывороток является лабораторным подтверждением диагноза легионеллеза За исключением критериев ВОЗ, четырехкратное нарастание антител к различным серогруппам (кроме серогруппы 1) и видам легио-нелл в РНИФ является лабораторным подтверждением предварительного диагноза При этом критерии диагностики, предложенные в Великобритании и Европейской рабочей группой по изучению легионеллезной инфекции (EWGLI), позволяют поставить предварительный диагноз на основании однократного исследования сывороток крови в РНИФ при наличии титров от 1 128 и выше Критерии, предложенные в Великобритании, позволяют заподозрить легионеллез даже при наличии титров в РНИФ 1 32 - 1 64, а при текущей эпидемической вспышке-даже 1 16 - 1 32

Выявление антигена в моче при использовании рекомендованных тестов -Biotest Legionella Urin Antigen, Германия и Вшах Legionella urinary antigen EIA, США - во всех критериях диагностики, кроме рекомендаций ВОЗ, является лабораторным методом окончательного подтверждения диагноза

Реакция прямой иммунофлюоресценции при использовании как поликло-нальных сывороток, так и моноклональных реагентов, является лабораторным подтверждением предварительного диагноза в критериях диагностики, предложенных в Великобритании и Европейской рабочей группой по изучению легионеллезной инфекции (EWGLI)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является лабораторным подтверждением предварительного диагноза в критериях диагностики предложенных Центром по контролю за заболеваемостью, США и Европейской рабочей группой по изучению легионеллезной инфекции (EWGLI)

Таким образом, анализ критериев диагностики легионеллеза, предложенных ведущими научными центрами Европы и США, свидетельствует об обязательном анализе клинико-эпидемиологических данных при постановке диагноза легионеллеза и достаточно широкой интерпретации результатов серологических исследований

Учитывая рекомендации ВОЗ о разработке национальных систем диагностики заболевания и наличии в России общепринятых, в том числе и утвержденных ГИСК им Л А Тарасевича серологических диагностических тест систем, нами, на основании многолетних исследований, предложен алгоритм комплексной диагностики болезни легионеров

Разработанный нами алгоритм комплексной диагностики болезни легионеров включает ряд последовательных этапов определение клинико-эпидемиологических показаний к лабораторному обследованию на легионеллез и алгоритм лабораторного обследования, интерпретацию получаемых результатов и выработку рекомендаций для дальнейших обследования пациентов с наличием клинической картины заболевания и результатов рентгенологического обследования

Критерии определения клинико-эпидемиологических показаний к лабораторному обследованию на легионеллез вырабатываются на основании анализа эпидемиологических, клинических и рентгенологических данных

Сбор эпидемиологического анамнеза включает выяснение связи пациента с предприятиями, на которых имеют место централизованные системы пылепо-давления и увлажнения воздуха, работой на угледобывающих шахтах, нахождение в крупных медицинских учреждениях, где имеются централизованные системы кондиционирования и вентиляции воздуха, проживание в гостиницах с централизованными системами кондиционирования и вентиляции воздуха Кроме того, мы предлагаем обращать внимание на факт проживания пациента в квартирах с городскими системами горячего водоснабжения

При наличии эпидемиологического анамнеза и отсутствии клинической картины заболевания показания к лабораторному обследованию определяются в связи с мероприятиями по осуществлению эпидемиологического надзора за легионеллезом

Для пациентов с клинической картиной заболевания (кашель с мокротой или без и при наличии температуры или ее отсутствии) и наличием эпидемиологического анамнеза показано рентгенологическое обследование с последующим лабораторным обследованием на легионеллез.

Алгоритм лабораторного обследования, интерпретация получаемых результатов и выработка рекомендаций для дальнейших исследований пациентов с наличием клинической картины заболевания и рентгенологическим доказательством пневмонии представлены в таблице 4

Для правильного выбора материала, подлежащего лабораторному обследованию на легионеллез, нами, в отличии от критериев ведущих научных центров Европы и США, введен временной критерий В первые семь дней от начала заболевания показано исследование мочи и мокроты, а при ее отсутствии и воз-

можности проведения бронхоскопии - бронхиальных смывов Исследование крови в этот период не рационально, поскольку определяемые титры специфических антител класса М могут появляться только с 6-7 дня от начала заболевания

Мокрота и бронхиальные смывы исследуют бактериологически и в РИФ Посев мокроты осуществляют на утвержденные питательные среды среда элективная легионеллезная (СЭЛ) производства РостНИПЧИ и среда для культивирования легионелл (легионеллбакагар) производства ЗАО ННПЦГП, Обо-ленск При выделении культуры и ее идентификации ставят окончательный диагноз и регистрируют заболевание При отрицательном результате бактериологического исследования ставят диагноз пневмонии неуточненной этиологии, однако в связи с невысокой чувствительностью бактериологическою метода рекомендуется исследование крови на наличие специфических антител после 10 дня от начала заболевания для окончательной постановки диагноза

Для исследования мокроты и бронхиальных смывов в реакции РИФ используют иммуноглобулины легионеллезные диагностические люминесцентные производства института им Н Ф Гамалеи При наличии положительного результата ставят предварительный диагноз и дают рекомендации по дальнейшему исследованию Дальнейшие исследования включают бактериологический посев материала, исследование мочи в РАО с иммуноглобулиновым диаг-ностикумом или в ИФА производства института им Н Ф Гамалеи и исследование крови на наличие специфических антител после 10 дня от начала заболевания При выделении и идентификации культуры легионелл или при положительном результате исследования мочи на наличие легионеллезного антигена в ИФА или РАО ставят окончательный диагноз болезни легионеров и регистрируют заболевание При выявлении в сыворотках крови после 10 дня заболевания диагностических титров антител в РАО с антигенным полимерным диагно-стикумом (1 80) или в РНИФ (1 64) рекомендуют исследование парных сывороток с интервалом в 2 недели и при 4-х кратном нарастании титров ставят окончательный диагноз и регистрируют заболевание

При отрицательном результате РИФ ставят диагноз пневмонии неуточненной этиологии, однако рекомендуется исследование крови на наличие специфических антител после 10 дня от начала заболевания для уточнения диагноза

Таблица 4 Алгоритм лабораторного обследования, интерпретация результатов и рекомендации для пациентов при наличии кашля с мокротой и инфильтративных и очаговых изменений в легких

Сроки Материал Метод Результат Заключение Рекомендации для уточнения диагноза

1-7 день заболевания Исследование мокроты Бактериологический посев Выделение культуры Окончательный диагноз легионеллеза Регистрация заболевания

Отрицательный резучьтат Пневмония неуточненной этиологии Исследование крови посче 10 дня заболевания

Прямая имчу- нофлгооресцен- ция Положительный результат Предварительный диагноз чегионеллеза Бактериологический посев мокроты

Исследование мочи

Иссчедование крови после 10 дня заболевания

Отрицательный результат Пневмония неуточненной этиологии Иссчедование крови после 10 дня заболевания

Исследование мочи ИФА или РАО ичмуноглобу-линовым диагноста кумом Положительный резучьтат Окончательный диагноз легионеллеза Регистрация заболевания

Отрицательный результат Пневмония неуточненной этиологии Исспедование крови после 10 дня забочевания

Посте 7 дня заболевания Исследование мочи ИФА или РАО иммуногчобу-линовым диаг-ностнкумом Потожительный резучьтат Окончательный диагноз легнонечлеза Регистрация заболевания

Отрицательный результат Пневмония неуточненной этиологии Иссчедованне крови после 10 дня заболевания

Исследование крови РНИФ или РАО с антигенным диагности-кумом Титр 1 64-1 128 Титр 1 80-1 160 Подозрение на легионе-лез Исследование крови через 2 недели При 4-х кратном нарастании-окоичательный диагноз легионеллеза

Титр 1 256 Титр 1 320 Окончательный диагноз легионечлеза Регистрация заболевания

Отрицательный результат Пневмония неуточненной этиологии Исследование крови после 10 дня заболевания

Пробы мочи от больных в первые семь дней от начала заболевания исследуют на наличие специфического антигена в ИФА производства института им Н Ф Гамалеи или в РАО При положительном результате пациенту ставят окончательный диагноз заболевания и осуществляют его регистрацию

При отрицательном результате исследования мочи ставят диагноз пневмонии неуточненной этиологии, однако рекомендуют исследование крови на наличие специфических антител после 10 дня от начала заболевания При выявлении в сыворотках крови после 10 дня заболевания диагностических титров антител в РАО с антигенным полимерным диагностикумом (1 80) или в РНИФ (1 64) рекомендуют исследование парных сывороток с интервалом в 2 недели и при 4-х кратном нарастании титров ставят окончательный диагноз и регистрируют заболевание При отрицательном исследовании крови диагноз легионел-леза исключают

У пациентов с историей заболевания более семи дней показано исследование мочи и сывороток крови Исследование мокроты в этот период нецелесообразно в связи с широким ранним использованием антибактериальных препаратов, недостаточной чувствительностью бактериологического метода и его не эффективностью в поздние сроки заболевания

Пробы мочи от больных исследуют на наличие специфического антигена в ИФА производства института им Н Ф Гамалеи или в РАО При положительном результате пациенту ставят окончательный диагноз заболевания и осуществляют его регистрацию При отрицательном результате исследования мочи ставят диагноз пневмонии неуточненной этиологии, однако рекомендуют исследование крови на наличие специфических антител после 10 дня от начала заболевания При выявлении в сыворотках крови после 10 дня заболевания диагностических титров антител в РАО с антигенным полимерным диагностикумом (1 80) или в РНИФ (1 64) рекомендуют исследование парных сывороток с интервалом в 2 недели и при 4-х кратном нарастании титров ставят окончательный диагноз и регистрируют заболевание При отрицательном исследовании крови диагноз легионеллеза исключают

Сыворотки крови исследуют в РНИФ с диагностикумом производства института им Н Ф Гамалеи и в РАО с антигенным полимерным диагностикумом производства РостНИПЧИ При наличии диагностического титра в РНИФ -1 64 и в РАО - 1 80 у пациентов повторно исследуют кровь через две недели, после чего решают вопрос о постановки диагноза За этот период пациенты рассматриваются как подозрительные на легионеллез При выявлении 4-х кратного нарастания титров антител в парных сыворотках ставят окончательный диагноз заболевания и осуществляют его регистрацию

При выявлении высоких титров - четырехкратных диагностическому — для РНИФ - 1 256, для РАО - 1 320 пациенту ставят окончательный диагноз и осуществляют его регистрацию

При отрицательном результате исследования крови в РНИФ или РАО пациенту ставят диагноз пневмонии неуточненной этиологии, однако в связи с динамикой продукции иммуноглобулинов класса О, которые нарастают со вто-

рой - третьей недели, рекомендуют повторное исследование крови через две недели

У пациентов при отсутствии пневмонии также исследуют мокрота при ее наличии и моча

Мокроту исследуют бактериологически и в РИФ При выделении культуры и ее идентификации ставят окончательный диагноз лихорадки Понтиак и регистрируют заболевание При отрицательном результате бактериологического исследования ставят диагноз острого заболевания органов дыхания неуточненной этиологии и рекомендуют исследование крови на наличие специфических антител после 10 дня от начала заболевания При выявлении в сыворотках крови после 10 дня заболевания диагностических титров антител в РАО с антигенным полимерным диагностикумом (1 80) или в РНИФ (1 64) рекомендуют исследование парных сывороток с интервалом в 2 недели и при 4-х кратном нарастании титров ставят окончательный диагноз и регистрируют заболевание При отри-_ цательном исследовании крови диагноз лихорадки Понтиак исключают

При наличии положительного результата в РИФ ставят предварительный диагноз лихорадки Понтиак и дают рекомендации по дальнейшему исследованию бактериологический посев материала, исследование мочи в РАО с имму-ноглобулиновым диагностикумом или ИФА производства института им Н Ф Гамалеи и исследование крови на наличие специфических антител после 10 дня от начала заболевания При выделении культуры легионелл или обнаружении легионеллезного антигена в моче ставят окончательный диагноз и регистрируют заболевание Если при исследовании крови после 10 дня заболевания выявляют диагностические титры в РАО с антигенным полимерным диагностикумом (1 80) или в РНИФ (1,64), рекомендуют исследование парных сывороток с интервалом 2 недели и при 4-х кратном нарастании титров ставят окончательный диагноз лихорадки Понтиак и регистрируют заболевание

При отрицательном результате прямой иммунофлюоресценции ставят диагноз острого заболевания органов дыхания неуточненной этиологии, однако рекомендуется исследование крови на наличие специфических антител после 10 дня от начала заболевания При выявлении в сыворотках крови после 10 дня заболевания диагностических титров антител в РАО с антигенным полимерным диагностикумом (1 80) или в РНИФ (1 64) рекомендуют исследование парных сывороток с интервалом в 2 недели и при 4-х кратном нарастании титров ставят окончательный диагноз и регистрируют заболевание При отрицательном исследовании крови диагноз лихорадки Понтиак исключают

Пробы мочи от больных в первые семь дней от начала заболевания также исследуют на наличие специфического антигена в ИФА или в РАО При положительном результате пациенту ставят окончательный диагноз лихорадки Понтиак и осуществляют его регистрацию При отрицательном результате исследования мочи ставят диагноз острого заболевания органов дыхания неуточненной этиологии и дальнейшие исследования на легионеллез прекращают

После седьмого дня от начала заболевания при лихорадке Понтиак, как правило, наступает выздоровление и дальнейшие исследования можно считать

нецелесообразными Однако, в случае затяжного течения острого заболевания органов дыхания без клинико-рентгенологических признаков пневмонии показано лабораторное исследование мочи и крови, которые проводят также, как и в случае клинической картины заболевания с доказанной пневмонией

Таким образом, анализ критериев диагностики легионеллеза, предложенных ведущими научными центрами ВОЗ, Европы, США и Великобритании и результаты собственных исследований позволили предложить критерии диагностики, применимые в нашей стране

В отличие от существующих в Европе, США и Великобритании критериев, нами предлагается алгоритм, включающий два этапа На первом этапе, на основании клинико-эпидемиологических и рентгенологических данных осуществляют отбор пациентов, подлежащих лабораторному исследованию на легионел-лез В связи отсутствием специфических клинических черт заболевания, важнейшим мероприятием является тщательный сбор эпидемиологического анамнеза, результаты которого, в первую очередь, определяют показания к лабораторному исследованию На втором этапе предлагается алгоритм лабораторного обследования, оценка получаемых результатов и выработка рекомендаций для дальнейшего обследования пациентов с наличием пневмонии (клинико-рентгенологически) или ее отсутствии Предложена дифференциация исследуемого материала в зависимости от сроков заболевания В первые семь дней от начала заболевания исследуют мочу и мокроту, а при ее отсутствии и возможности проведения бронхоскопии - бронхиальных смывов Мокроту исследуют бактериологически и в реакции прямой иммунофлюоресценции, а мочу в ИФА и в РАО с иммуноглобулиновым диагностикумом В сроки после седьмого дня заболевания исследуют мочу в ИФА и в РАО с иммуноглобулиновым диагностикумом и кровь в РНИФ и РАО с антигенным диагностикумом В зависимости от результатов исследования предлагаются варианты заключения и рекомендации по регистрации заболевания или по дальнейшему обследованию пациентов

ВЫВОДЫ

1 Впервые установлено наличие 20 белковых антигенов у L pneumophila серогрупп 1-7, которые разделены по свойству иммуногениости и аффинности образующихся антител на высоко, средне и низко иммунногенные Несмотря на гетерогенность по иммуногениости, все белковые антигены являются общими для семи серогрупп

2 Вгврвые научно обоснована технология получения растворимого антигена L pneumophila серогруппы 1 с известным антигенным составом, который может быт1 использован в качестве сенситина для конструирования любых антигенных вариантов диагностикумов

3 Скоклруирован диагностикум легионеллезный серогруппы 1 антигенный полимерчый сухой для РАО с известным антигенными свойствами Проведенные экспериментальные, клинические и Государственные испытания позволили установить, что чувствительность диагностикума составила 100%, специфичность - 99Д%, а его диагностический титр - 1 80

4 Установлено, что диагностикум легионеллезный серогруппы 1 антигенный полимерный взаимодействует с сыворотками против L pneumophila серог-рупп 2 -7 с титрами от 1 80 до 1 640, что позволяет предполагать возможность определения в сыворотках крови больных антитела к L pneumophila других се-рогрупп

5 Разработана технология получения кроличьих гипериммунных сывороток L pneumophila семи серогрупп, обогащенных антителами как к белковым, так и липополисахаридным антигенам

6 Сконструирован диагностикум легионеллезный серогруппы 1 иммуног-лобулиновый полимерный сухой для выявления в РАО легионеллезного антигена в моче у больных и серологической идентификации L pneumophila серогруппы 1 Чувствительность его составила для взвесей L pneumophila 5x10s -10б м к /мл и для легионеллезного растворимого антигена - от 2 до 50 мкг/мл

7 Сконструирован набор легионеллезных серогрупп 1-7 коагглютини-рующих диагностикумов, предназначенный для скрининга колоний и серологической идентификации L pneumophila серогрупп 1 - 7 при проведении бактериологических исследований на легионеллез

8 Сформулированы критерии и последовательный двухэтапный алгоритм диагностики болезни легионеров, включающий анализ эпидемиологических, клинических, рентгенологических данных и результаты лабораторных исследований материала от больных

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1 Карбышев Г Л , Мишанькин Б Н , Ломов Ю М, Кучин В В , Шелохович А И , Рыжков В Ю , Подоляко М П , Баташев В В , Ефанова Е А , Пичурина Н Л , Иванова Н Г Опыт эпидемиологического надзора за легионеллезом в Ростовской области //Журн микробиол , эпидемиол и иммунобиол - 1993 -№6 -С 37-38

2 Шелохович АИ, Мишанькин БН, Карбышев ГЛ, Подоляко МН, Сучков И Ю , Валенцев В Е , Рыжков В Ю , Арутюнов Ю М Результат серологического обследования людей в Ростове-на-Дону в очагах, связанных с выделением легионелл из водопроводной системы // Иммунол и спец профилакт ООИ Матер Рос науч конф - Саратов, 1993 -С 271-272

3 Безуглова Е В , Король В В , Кочеткова А П , Наркевич А Н , Козлова В А , Карбышев Г Л , Шелохович А И Серологическая диагностика легионел-леза с применением антигенного полимерного диагностического препарата // Матер межгос науч -практ конф «Акт вопр чумы и др инф заболеваний» -Ставрополь, 1994 - С 219-220

4 Карбышев Г Л , Новиков Д Н , Подоляко М П , Шелохович А И , Пичурина Н Л , Кучин В В , Иванова Н Г , Бекетов А П , Бекетова Е В , Грецев Ю В Эффективность активного эпиднадзора за легионеллезом на предприятиях угольной промышленности//Сб науч тр - Новороссийск, 1994 - Вып 1 -С 271-273

5 Карбышев Г Л , Мишанькин Б Н , Рыжков В Ю, Шелохович А И , Ива-

нова Н Г , Баташев В В , Москвитина Э А , Пичурина Н J1 и др Активный эпидемиологический надзор за легионеллезом в Ростовской области // Среда обитания и здоровье населения Рост обл-ти / II Обл науч -практ конф Сб тез -Белая Калитва, 1996 - С 22-23

6 Карбышев Г Л , Рыжков В Ю , Шелохович А И , Иванова Н Г , Пичурина Н Л , Баташев В В Активный эпидемиологический надзор за легионеллезом на крупных промышленных предприятиях // Эпидемиол и клинико-иммунол аспекты профилактики важнейших инфекц заболеваний Матер конф - Астрахань, 1996 - С 19-20

7 Шелохович А И, Рыжков В Ю , Мишанькин Б Н , Москвитина Э А , Ва-ленцев В В , Карбышев Г Л , Сучков И Ю , Иванова Н Г, Баташев В В Зараженность воды системы горячего водоснабжения возбудителем легионеллеза Legionella pneumophila, выявленная при исследовании проб, отобранных на ТЭЦ-2 г Ростова-на-Дону // Среда обитания и здоровье населения Рост обл-ти / II Обл науч -практ конф Сб тез - Белая Калитва, 1996 - С 40-41

8 Карбышев Г Л , Мишанькин Б Н , Москвитина Э А , Рыжков В Ю , Шелохович А И , Иванова Н Г, Бекетова Е , Михайлова Т , Пашенцева Н Активный эпидемиологический надзор за легионеллезом // Матер VII съезда Всерос об-ва эпидемиол, микробиол и паразитол Сб ст -М, 1997 - Т 1 -С 122123

9 Шелохович А И, Мишанькин Б Н , Рыжков В Ю , Сучков И Ю , Москвитина Э А , Карбышев Г Л , Иванова Н Г , Баташев В В , Харабаджахьян Г Д, Шеремет О В , Савельева И К Полевые испытания новой питательной среды для выделения легионелл (СЭЛ) // Матер науч -практ конф , посвящ 100-лет образ противочум службы - Саратов, 1997 -Т 2 - С 150-151

10 Карбышев Г Л , Терентьев А Н , Безуглова Е В , Божко Н В , Кочеткова А П , Симонова И Р , Рожков Е В , Ларионова Л В , Шелохович А И Совершенствование серологической диагностики легионеллеза // Идеи Пастера в б-бе с инфекциями Матер 2-ой Междунар конф , посвящ 75-лет ин-та им Пастера -С-Пб, 1998 -С 157

11 Карбышев Г Л , Безуглова Е В , Терентьев А Н , Наркевич А Н , Ларионова Л В , Кочеткова А П , Симонова И Р , Божко Н В , Рожков Е В , Шелохович А И , Барабаш Г П Подходы к критериям серологической диагностики легионеллеза // Диагност , лечение и профилакт опасн инф забол. Биотехнология Ветеринария Матер юбил науч конф , посвящ 70-лет НИИ микробиол МОРФ - Киров, 1998 - С 114-115

12. Орлова Г М , Сивкова О В , Шелохович А И , Терентьев А Н , Карбышев Г Л , Харабаджахьян Г Д, Кудрякова Т А , Рожков Е В Применение коагг-лютинирующего препарата и элективной среды для идентификации легионелл // Разраб и пр-во диагн сухих питат сред и микротестсистем Матер междунар науч конф , посвящ 70-лет НПО «Питательные среды» - Махачкала, 1998 - С 115-116

13 Шелохович А И , Мишанькин Б Н , Харабаджахьян Г Д , Москвитина Э А , Кудрякова Т А , Карбышев Г Л , Савельева И К , Терентьев А Н Новая

питательная среда для выделения возбудителя легионеллеза // Инфекционные болезни новое в диагностике и терапии Тез докл науч конф / III съезд Итало-Российского общ-ва по инф бол -С-Пб, 1998 - С 97

14 Карбышев Г JI, Терентьев А Н , Безуглова Е В , Наркевич А Н , Рожков Е В , Кочеткова А П , Симонова И Р , Ларионова Л В , Божко Н В , Шело-хович А И Значение серологической диагностики при осуществлении активного эпидемиологического надзора за легионеллезом // Диагност, лечение и про-филакт опасн инф забол Биотехнология Ветеринария Матер юбил науч конф , посвящ 50-лет Центра военно-технич пробл биол защиты НИИ мик-робиол МО РФ - Екатеринбург, 1999 - С 79-82

15 Карбышев Г Л , Безуглова Е В , Терентьев А Н , Наркевич А Н , Кочеткова А П , Рожков Е В , Симонова И Р , Ларионова Л В , Некляев В Н Серологические методы исследования для осуществления активного эпидемиологического надзора за легионеллезом // Инфекционные болезни диагностика, лечение и профилактика Матер VI Росс -Итал науч конф - С -Пб, 2000 - С 104105

16 Карбышев Г Л , Безуглова Е В , Наркевич А Н , Ящухин А А , Симонова И Р , Кочеткова А П Этиологическая структура атипичных пневмоний по материалам пульмонологических стационаров г Ростова-на-Дону П Инфекци-он болезни в практике терапевта Матер науч -практ конф с Международн участием - Харьков, 2001 - С 123

17 Карбышев Г Л , Терентьев А Н , Сивкова О В , Лысова Л К , Веркина Л М , Плужникова Н А , Телесманич Н Р , Кадетов В В Конструирование и испытание диагностикума коагглютинирующего легионеллезного серогруппы 1 // Матер VIII съезда Всерос об-ва эпидемиол , микробиол и паразитол Сб ст -М , 2002 - Т 3 - С 281

18 Карбышев Г Л , Лысова Л К , Терентьев А Н , Веркина Л М, Кочеткова А П , Шелохович А И , Сивкова О В Конструирование и экспериментальные испытания легионеллезного серогруппы 1 коагглютинирующего диагностикума // Совр технологии в диагност особо опасн болезней Матер 4-ой Межгос науч -практ конф гос-в - участ СНГ - Саратов, 2003 - С 92-94

19 Саяпина Л В , Адамова Г В , Анисимова Т И , Карбышев Г Л , Мала-хаева А Н , Касина И В , Веркина Л М , Гальцева Г В , Швагер М М, Оценка качества диагностикума легионеллезного серогруппы 1 антигенного полимерного по результатам государственных испытаний // Пробл ООИ - Саратов, 2004 -Вып 1 (87) - С 61-63

20 Карбышев Г Л , Терентьев А Н , Шелохович А И , Харабаджахьян Г Д , Симонова И Р , Кочеткова А П , Веркина Л М , Наркевич А Н Современное состояние проблемы лабораторной диагностики легионеллеза // Сан охр террит гос-в - участ СНГ пробл биол безопас и противодейст биотеррор Матер VI Межгос науч -практ конф - Волгоград, 2005 - С 244-246

21 Карбышев Г Л , Терентьев А Н , Веркина Л М , Наркевич А.Н , Безуглова Е В , Симонова И Р , Кочеткова А П Конструирование препаратов для серологической диагностики легионеллеза Сообщение 1 Конструирование и экс-

периментальные испытания легионеллезного серогруппы 1 антигенного полимерного диагностикума//Пробл ООИ -2005 -Вып 2(90) - С 55-57

22 Шелохович А И , Кудрякова Т А , Москвитина Э А , Мишанькин Б Н , Харабаджахян Г Д, Карбышев Г J1, Савельева И К Распространение Legionella pneumophila в экосистеме крупного города // Сан охр террит гос-в - участ СНГ пробл биол безопас и противодейст биотеррор Матер VI Межгос науч -практ конф - Волгоград, 2005 -С 110-111

23 Карбышев Г J1, Терентьев А Н , Безуглова Е А , Симонова И Р , Верки-на JI М , Кочеткова А П , Склярская В Я , Матер А А Конструирование препаратов для серологической диагностики легионеллеза Сообщение 2 Испытания легионеллезного серогруппы 1 антигенного полимерного диагностикума в практике диагностики заболеваний органов дыхания // Пробл ООИ - 2006 -Вып 1 (91) -С 75-77

24 Карбышев Г J1, Терентьев А Н, Безуглова Е А , Симонова И Р , Кочеткова А П , Веркина J1М , Наркевич А Н Конструирование препаратов для серологической диагностики легионеллеза II Обмен веществ при адаптации и повреждении Тр V Межд конф - Ростов-на-Дону, 2006 - С 84-88

25 Карбышев Г JI, Терентьев А Н , Наркевич А Н , Кочеткова А П , Веркина Л М , Симонова И Р , Ларионова Л В , Некляев В Н , Лысова Л К Серологическая диагностика болезни легионеров // Научная мысль Кавказа - Приложение -2006 -№6 -С 242-252.

26 Карбышев Г Л, Ломов Ю М, Терентьев А Н Структурно-функциональная организация факторов патогенности и антигенная структура Legionella pneumophila И Научная мысль Кавказа - 2006 - №3 - С 60-67

27 Карбышев Г Л , Лысова Л К , Терентьев А Н , Веркина Л М , Кочеткова А П Конструирование и экспериментальные испытания набора легионеллез-ных серогрупп 1-7 коагглютинирующих диагностикумов // Научная мысль Кавказа - Приложение - 2006 - №8 - С 276-280

28 Ломов 10 М , Карбышев Г Л , Терентьев А Н Критерии диагностики легионеллеза // Чрезвыч ситуации междунар значения в общ здравоохр в решениях С-Петербург саммита «Группы восьми» и сан охр террит госуд -участи содруж независим госуд-в Матер VII межгосуд науч -практ конф госуд-участн СНГ-Оболенск,2006 -С 217-218

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

РНИФ - реакция непрямой иммунофлюоресценции

РИФ - реакция прямой иммунофлюоресценции

ИФА - иммуноферментный анализ

РКОА - реакция коагглютинации

РАО - реакция агломерации объемной

РМА - реакция микроагглютинации

МКА - моноклональные антитела

ЛПС - липополисахарид

МОМР - главный белок наружной мембраны

SDS - додецилсульфат натрия ПААГ - полиакриламидный гель

WER - Еженедельная эпидемиологическая информация (сборник)

КРС - крупный рогатый скот

РИД - реакция иммунодиффузии

СЭЛ - среда элективная легионеллезная

РостНИПЧИ - Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противс чумный институт

СОП - стандартный образец предприятия

КАРБЫШЕВ ГЕРИАРД ЛЬВОВИЧ

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Сдано в набор 14 02 2007 г Подписано в печать 14 02 2007 г Формат 84x108 1/16 Печать лазерная Гарнитура Тайме

Объем 2,0 ус п л Тираж 100 экз Отпечатано в компьютерном центре Ростовского НИПЧИ

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Карбышев, Гериард Львович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЛЕГИОНЕЛ

ЛЕЗА [ОЫОР Л ИТЕРАТУ РЬ1)

1 I Характеристика возбудшелл. экология к таксономическое положе- 16 вне

1.2. Антигенная структура и структурно-функциональная оргаиимшы 22 факторов гатогенкостн I, pneumophila

1.3, Распространение предстпмгтслсЛ рола Legionella среди человек- 57 с it ей популяции 11 в объектах окружающей среды .4. Серологическая диагностика аспинсллеш

1.4Л. Реакция непрямой ■имунофлюоресдяшни

1 А 2 Ими\ноферме1ТП1ЫЙ анализ

1.43. Реакция ынхроштлкггннвцни S

4.4, Реакция непрямой гемагглютииаини

1 AS, Реакция латексиой агломерации S

14.6, Ролноиммунный анализ SS

1.4.7. Реакция прямо» иммуиофлюорсеиениин

1.4.8. Им му н охро м это графический »налил »

1.4.9. Реакция агглютинации 90 М-10. Реакция коагглщтинацни 91 СОБСТВЕННЫ Е ИССЛ ЕДОВАННЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ Ы И МЕТОДЫ

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ АНТИГ ЕННОЙ СТРУКТУРЫ £. pneumophila [

3.1, Изучение белков L pneumophila серо групп 1 - 7 10S

3.2. Изучение белковым антигенов L pneumophila ceporpyim ! - 7 lit 3-3. Изучение ЛПС лнтигеноя L pmtiMOphtb ссрогрупп 1

ГЛАВА 4, КОНСТРУИРОВАНИЕ И ИСПЫТАНИЯ ДИАГНО-СТИКУМА ЛЕГИОНЕЛЛЕЗНОГО СЕРОГРУИПЫ I АНТИГЕННОГО ПОЛИМЕРНОГО СУХОГО ДЛЯ РАО Г52 4,1. Получение м характеристика полимерного носители 153 4 J. Подбор условий получения растворимого лепмхнеллмhoj-o антигена в качестве сенситина и «га характеристик:!

4.3. Патучение диапюсткуча деикжеллсэиого серогрутш 1 антнгсл

1ЮГО полимерного сухого для РАО

4.4. ЭксперимеНтиЛШИе исследования днапюстнкума дзгионеллсзного еерогрушш ] антигенного полимерного сухого

4.5. Исследования больных с острыми заболеваниями органов дыхания с помощь» диагностику ив легиоиедлезного серогруплы 1 антигенного полимерного сухого

4,6- Изучение длительности сроков xpiuien их диагностику мм

4,7. Государственные испытания дилгиостихуыа легиоиелленюго серо-фуппи [ антигенного полимерною а ГИСК им. Л, А. Тарасовича

4.S. Свойства дкогностикума ВМЯЛЛять антитела к L pneumophila других серогрупп

ГЛАВА Я, КОНСТРУИРОВАНИЕ И ИСПЫТАНИЯ ДИАГНОСТИКУ МА ЛЕГИОНЕЛЛЕЗНОГО СЕРОГРУИПЫ I ИММУНОГ-ЛОБУЛИНОВОГО ПОЛИМЕРНОГО СУХОГО

3.1. Получение кроличьих легиоиелдезнык сывороток

5.1 Конструирование диагностику*« летонеллечною серогруппы 1 шмуноглсбулл нового Полимерного сухого для РАО

SJ. Экспериментальные нсслсдоточшя днапюешкума ]

5.4. Испытания днвгноепшума легнонеллстного серогруплы 1 нмму-коглобу лннриого полимерного

ГЛАВА 6. КОНСТРУИРОВАНИЕ I! ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИСПЫТАНИЯ НАБОРА ЛЕГИОНЕЛЛЕЗНЫХ СЕРОГРУПП I -7 КОАГГЛЮТИИ ИРУ Hilm IX дн АГНОСШКУМОВ

6.1. ПшуЮик стафилококкового реагента 206 6 2 Получение гниернммуннык кроличьих сывороток протнк /■ рп?иторЬИа еерогрупп 1

6 3 Коиструнроганпк побора ЛвГППШйНШ Ссрчгрупп 1-7 коагтлюти пирующих диагнастикумоя

6.4. Изучение специфичности набора лепнммшдоных серогрумн 1 воягглютинирующих диашоетикумов

ГЛАВА 7, КРИТЕРИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА

7.1. Диагностическая ценность методов выявления аипггсл

Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование серологической диагностики легионеллеза"

А 1сгуал1. коси. орайлемы

Болезнь легионеров - острое лихорадочное заболевание, вшиваемое группой микроорганизмов, относящихся к семейстпу [х^юпсПаака. Ведущее гкя-челне имеет ^юпеЧа р/нптор)»1а ссротруппы I. с иомушио-квиелъным мс-хяшгиюм передач» и поражением верхних дыхательных п>тей в виде респираторной лихорадки Поитнак и нижних дыхательных путей н виде острых пиел-мояиЯ (Прозоровский С В, с соавт.» 1984),

История изменил болезни лепюнеров начхзаеь е 1976 Г- и били сдагвна с иэ>-кинем вспышки острых респираторных заболеваний среди участников конференции <[Американского легиоиа», которая проходила с 2? по 28 июля 1976 г. в отеле Белио-Стратфорд и Филадельфии. Уже 2 августа в Центр па контролю за болезнями в г. Атланте поступила информации о смерти трех пациентов с диагнозом тяжелой пнеямонии из г ТЪгпсбурга Вскоре было установлено масса нос поступление больных е симптомами атипичной пневмонии, а эпидемиологическое расследование покоило, что большинство больных были участниками указанной конференции Всего был гоетгталнзирован 221 участник конференции с симптомами пневмония, из которых 34 умерли.

В последние годы отмечен ряд крупных эпидемических вспышек лепю-нелдеза. В [996 г. во время круизных рейсов 1га теплоходах по Карибскому морю зарегистрировано 50 случаев лепнжеллеза (¿сп^^аи О.В е1 1996), В 1999 г. в Бельгии при проведении торговой ярмарки зарегистрировали» 93 случая ле-гионедлеи. щ которых 5 больных умерли (Раястм! МТ. « а!, 2002). В г. в Нидсрлаидох при проведении выставки цветов зарегистрировано 188 случаев легионеллеза (Осп ВоетЫ а]., 2002; 1.сшпва К .О , е< Ы-, 2002), В 2001 Г- во Франции от больных с пневмониями иыдслено 259 игтамчов лепюнелл различ» пых мыии и серогрупп (Е)о1сап* А- е! а1,2002). В 2001 г. в Испании зарегистри* ровллл крупнейшая вспышка легионеллеза, во время которой заболело около «Ю больных (ОогсЪ-РЫ^иигаз А.« а1„ 2003).

Частота иппними среди Genutws. roc питал иэ1грусчых в стационары с jummcnOM «гаиевдоиня», » среднем * Еиропе и США оценивается от 2 до 15% (Muder R-R-. «я »1-. 1W). По даннмч Центра по контролю и болезнями в г. Атланте (CDC) (ЯЩП» " США регистрируют от 10000 до 18000 случаев легионе ллеза По данным агснтстал но производственной безопасности it здравоохранению США (OSHA) число ежегодник случаен легионсл-теза составляет 25000, из потиры* 4000 умирают, a ito данным Американского общества микробиологов (ASM) среди больных с пневмониями, госпитализируемы* и отделения интенсивной терапии, легнонедлез является причиной 15-30% случили (LcgHmtlia 2003, AWT. 2003 > Частота внутрнбольничиого лепюиеялеза может колебаться от 16,3% среди больных е приобретенным« пиемзиишн до 76% среди больных с различными формами вторичных пшуяоифншпных состоя* ний (Gresserode М„ 1993; Jun^-Mathys Е, Maihys W„ 1994).

На территории нашей страны легионеллез впервые зарегистрирован в 1979 1', (Прозоровский СБ с еоавт., 1984; 19871, а в последующем отмечены спорадические ir отдельные групповые ВСПЫШКИ нббМШМЙ (БелекькнП С.Н„ 1984; Покровский В.И. с еоавт., 1988; Прозоровский С.В, с соявт., 1987; Сакварелндзс J1.А. с еоавт , 1990) Частота выявления лепюнеллеза средн больных пневмонией колеблется от 10,7% до 12,2% (Покровский В .И. е еоавт., 19fl.fi, ТартлковскиЙ НС, с соявт,, 19»9; Меморандум ВОЗ, >990).

Спорадический лепюнемеэ cpe;ui населения по данным пассивного зни-днздзора в США составляет 0,2, 9 по данным активного мйнкмм ■ 12 на 100000 тселеиня (Меморандум ВОЗ, 1940). При сероэпндемнолотческом ik-следованин а группах риска частота положительных результатов колеблется от 1% до 55.4% (Васильева В.И. с еоавт,, 1986).

В своем обзоре «Лспюисллез: 25 лет изучению В S Fields, ft S: Benson, R,E Besser (2002) xnpaticpHiytor лепюнеллез как экзотическую чуму,

В настоящее время описано 4S видов Legion*На, включающих 69 отдельных серогрупи (Fields В.5. ci al-, 2002). Вид! pneumophila представлен 15 серогруппами. В США 90% случаен летиммядей склоны с L рпеияюрЫЬ и 79% и-» них - с ceporpynnofl t (Marsien BJ.et al. I99J).

По данным Weekly Epidemiology Record (WER>, мпбулктелем Легионелле-за в Европе в период с 1996 по 1999 гг. в 95.9% случае» яилялась L pneumophila, а среди еерогрупп лидирующее место шшчала серотруппа I. которую выделили от больных в 70,8% случаен- Среди других есрогрунп от больных ЯЫДОМИ еерогруппу 3 в 5% случае» »г еерогруппу 6 - в 3,! % случаен

Однако это заболевание продолжает оставить» малоизвестным и нашей стране. Все вышеизложенное делает проблему диагностики легионеллеза актуальной ли практического здравоохранении. Отсутствие патопюмоннчноП клинической картины, нчоесу» неопределенные данные эпидемиологического анамнеза делают лабораторные методы решающими при установлении дин поза Солезн и легионеров

Безусловно, «золотым стандартом» диагностики инфекционных зоболем-ний ямяетс* боиермологическн& метод. В то же время, практика диагностики инфекционных болезней сиидетел«твует о большой роли и значимости серологических методов,

Анализ данных литературы Свидетельствует о важной рати серологических методов диагностики легионеллеза, необходимости иелолмошния коммерческих тест-систем для выявления возбудится *, его pací »зримых антигенов в клиническом матермшк к объектах окружающей среды, шкигтифмкшши и серологического тмпмрОМЛНЯ, Г1о данным WTUt. информирующего о заболеваемости легнонеллезом в Европе, с 3995 по [999 tr. удельный вес серологических методов диагностик и колебался от 70% до 78,2%, бактериологического метода от 17% до 21,6% и 1ЩР - от 0.83% до 11 %.

П настоящее время для выявления днтител к возбудителю легионеллеза нстюльзуют три метода: реакцию непрямой нчмунофдюоресценнин (РНИФ1. иммунофсрмснтпыЙ «ЮЛЮ (ИФА) и михроагглютнианию (РА) (Меморандум ВОЗ. 1990) Неполную* II реакцию латексноП агломерации, которая является более чувствительной, чем РНИФ и выявляет антитела в диагностических тнтрах нв ранних, стадии заболевания - до 10 дня (Harrison Т.С с( ni. 1987: Friis-MnUcr A. et al. 1986; Marrie TJ. et al . 1986; Sewlinj G. ci al, 1986).

Методы обнаружения легион елдо H «o антигена используют я качестве экспрессных ИЛ pUINHX егадцях здбопеЫШН* к широко применяют ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ легионеллгм Они включают ИФА, родноимыуииый аиалю и реакцию прямой иммуиофлюоресиенцнн (РИФ) (Меморандум ВОН, 1990) Легнонеллеэ-ный антиген методом ИФА был обнаружен в моче больных еще во прем я ucrluuuiit заболеваний в Филадельфии в 1976 г. (lkrdni B P el al., 1979). Дальнейшие ИССЛеДОваИНЯ 1КЯНЛ11ЛИ ПрСЛЛОЖИТЬ МГТОД ИФА ЦДЛ ОКОИЧЛ ttlI.HÙfO подтверждения диагноза (Ploufie J.F. et al., 1995) на ранних стадиях заболевания - в первые 2-3 дн* (Birttes RJ, « 1990; Formica N. et al., 2001, HelbiglH. et в!. 1989: Knsluifca A,D. « Al. 1996; Plotiffe J.F. et al , 1995). По данным WER, среди серологических методов, используемых для диагностики я Европе, доля методов выявления антигена в моче в ИФА выросла с 16% до >15%.

Особый интерес представляют данные по нсполкммннню других методом выявления антигена к. в частности, метода латексноЛ агглютинвиии, Этот метод исиодь-юпался для идентификации культур (Rictowisofl I.R. ci al., 1992)t обнаружения лепюнелл о oGkknX окружающей ерелы и в клиническом материале (плевральном экссудате и мокроте) (Délia F et в]., 1993).

Для выявления и серологической дифференциации легмонеяя японские неследователи впервые предложили реакцию юттяютмацш iYoh M, et al. I9B5). Показано преимушеетт» рМКщн ЖШТЛЮТюищин в сравнении с лгглю-пашивй на стекле по чувствительности и специфичности, поскольку коагтлю-тинкрмочдий днагностпкум не давал перекрестных реакций (Yoh M et aL, 1985) В сравнении e РИФ, реакция копгглкпннвшш проста в исполнении и не требует дорогостоящего приборного обеспечения, оставаясь по чувствительности и специфичности щ одном уровне.

В настоящее время я России отсутствуют сертифицированные тест-сиетемы для серологической диагностики легнонедле». О

В связи с изложенным, актуальной проблемой в настоящее время является соиеровснсггиованне серодошческой л»*пмспкк легионеллеза путем создания НШШКК отечеотжшшх препрпп И тест-систем для выявлении специфических а мл «тел ■ сыадротках крови, антигена в биологическом материале и объектах окружающей среды, идентификации и серологическою тпнроиння во1-булителей. а также раадебот ка критериев диагностики

Цгп. и нцачи нее^едпиаиии

Цель» работы яыястсм научное обоснование метолнческнч подходов к конструированию препаратов для серологической диагностики легконелдста, создание антигенных н нмыуноглобу лнновых дналюетикумов с известными свойствам». получение диагиосгнку.мов для серологической идентификации I ртиторШа. оценка диагностической значимости методов н разработка крипе» риса н илгор1гтма днплюстики лепюнеллем

Дяв достижения указанной цели необходимо решение следующих тадач:

1. Изучение антигенной структуры £ рптторИНа различии* серофунп, поиск иммутгепнх белковых и лцлополисяхаридных антмгемм, имеющих диагностическое значение.

2. Полбор условий получения растворимого антигена £ рнптсрЫЬ серо-группы I с известным Лнтнгсикыы составам дд* использования его п качестве сенснтин.1 1гр» конструировании антигенных вариантов днагностнкумов и характеристика сю антигенных свойств.

3. Подбор схем иммуннзаани и екмучеяяе рпшшк вариантой гкпернм-ыунних кролич ьнх легиоаюллезных сыкороюк.

4. Конструирование днагиостикума ЖГММШШШ ссрогруппы I антигенного Iполимерного сухого для реакции объемной впяом«ршни (РАО) Изучение чувстшгтедьности и специфичности Оценка диагностической иенноети препарата.

5. Конструирование днагностнкума легнонеллезиого серогруппы 1 нмму-I(оглобулIтоного полимерного сухого для РАО. Изучение чувствительное™, специфичности и определение наказаний к использованию диагностику™

6. Конструирование набора лепгамеялезных коштяктешфующнх дкогно-стикумов Изучение чувствительности и специфичности Изучение препаратов в практике бактернолопгчсскнх исследований но легноиеллез.

7. Разработка критериев оцпми результатов использования комплекел тестов и алгоритма диагностики легиоиеллеэв

Низва imm«?™

Впервые с использованием современных методов изучен антнгенный состав L p/Kumophila семи серогрунп наиболее часто встречающихся и патологии человека. Получены новые лонные об иммуиогенных свойствах белковых и ли-пешолиеахаридпых антигенов, имеющих диагностическое течение при конструирований тест-систем.

Впервые показано, что, несмотря на гетерогенность по степени кммуни-генности. белковые антигены L paeumopktía являются общими для различных серогрупп

Впсрвые научно обосновал процесс ОПТКЫИЯЩЩ получения растворимого антитела с известными олтзггеиными свойствами для использования его в качестве сснснтмнв при производстве диагностических препаратов.

Впервые получен легионеллезный антигенный полимерный .диаг ностикум для определения в сыворотка* кропи специфических вкпгтед к различным серо группам L pwííinoptiiia

Впервые разработаны новые научно-методические подходы к получению гипернммуниых сывороток для конструирования иммуноглобулинояых полимерных и коаггдюппннрутцнх лиагностнкумов, А также для анализа антигенной структуры L pmmr/iophito различных серо групп,

Впервые получены новые данные о спектре лгшпеиспеиифичсскнх шггн-тсл при формировании iyморальною иммунного ответа в результате имму низании лабораторных животных L ртшркИа семи серагрупп.

Разработаны критерии для оценки результатов применения комплекса ли-олмеплеспи тестов при проведении диагностики болезни легионеров д^аддвям аияииа

Анализ перекрестных нммуноблогг«шоп L pneumophila сечи серогрупп с кроличьими гниернммуиньшн сыворотками прошв семи «prpjnn позволил класс и фнillфоаапь белкопие итнпны по свойству иммуногенностн на высоко, средне и итконммуногениые, что песет высокую степень ннформлгниийстн н перспективно для дальнейшего изучения антигенной структуры L pneumophila Полученные на основе отр»бспМ1ИШ методических подходов Кроличьи гипериммунные сыворотки против I. pmrumophita семи серагруип, обогащенные антителами к белковым и ляпоЕкыгнсахарнлныч лнтнгенач, перспективны для дальнейшего (пучения шгтигеиной стру ктуры L pneumophila различных се-рогрупп и конструирования новых диагностику мов.

Предложенные методические подходы кммобилнмщии растворимого де-гноиеллезиого антигена оозво.'счют оптимизировать проиесс сотлдння препаратов для диагностики легиоиедлеза н получать антигенные варианты диагности-кумов с ыданными свойствамн

Аналит перекрестных кммуиоблотгинго® I, pneumophila сечи серо групп с кроличьими тнериммуиными сыворотклмн против семи серогрупп позволил оценить гуморальный иммунный ответ экспериментальны* животных по аффинности образующихся cneitinjMPtecKiix антител, что перспективно для изучения особенностей иммунного ответа у людей при легионеллеэе Ппвк-гичесння 1нячнм<к11.

Разработана технология получения растворимого антигена L pneumophila ссрогрупны 1 с известным и антигенными свойствами дл* использования в качестве сеиситнна при конструировании антигенных вариантов тест-енстем для серологической диагностики легиоиедпеи.

Разработана технология получения кроличьих гнпериммунных сывороток против L pneumofMh семи серофупп, обогащенных антителами к белковым н лмиоподиеахаридным антигенам с целью анализа антигенной структуры и конструирования иммуноглобулиновых полимерных и коагглютинируюши* диаг-ностику'мои,

Сконструирован и внедрен в практику диагностнкум лсгноисллезный ееро-грулпы I антигенный полимерный сухой дли РАО. предназначенный для серологической диагностики дегиомедлем у людей, мтинога L pneumophila различных мрогрутш. Дклпюсттаум прошел Государственные испытания в ГИСК им, Л.А, Тарасовича и решением Коми teta медицинских нмыумобиологнческнх препаратов рекомендован к регистрвоин d РФ (Протокол №7 от 19.(2.2002 г,).

Сконструировал диагностику* легноиеллезный серогрупш 1 имчуногло-СудииооыЯ полимерный сухой для РАО, Диагностику« может быть нсгамьзо-№И1 для выявления легионеллезиого яшзггена в моче у больных с ислью серологической диагностики заболевания, л также для серологической идентификации L pneumophila серо группы I. Диагностику*! прошел комиссионные испытания, на него няпмсаил инструкция но изготовлению и контролю, одобренная Ученым Ометом РостНИПЧИ (Протокол Ss А от 14.06.2006 г. >.

Сконструирован и предложен для практического использования набор ди-лпгостнкумов коягглютинирующнк лепюиеллезиых ееро<(рулп 1 - 7, предназначенный для «ршиип колоний и серолопсчсской идентификации L pneumophila серо групп 1 - 7 при проведении бикгериолотчсскнх исследований на легиоиедлез Дингностикум прошел комиссионные испытания, на него имжю-иа инструкция по изготовлению и контролю, одобренная Ученым Советом РостНИПЧИ (Протокол №4 от 14.06.2006 г,).

Разработаны и Предложены для практического использования критерии диагностики легноиеллеза на основании анализа эпняемнадогаческвх, клинических, рентгенологических данные и результатов дифференцированных лабораторных исследований различного материала от больных

Положен ня^иПР^ЧНГ К" НИНУ! ГУ

1, Растворимый лсгнонсллезный антиген с известным составом иммуно-Генных белков может быть использован в качестве Сеиситинл при конструировании антигенных вариантов диагностнхумоь

2. Гинсриммуиные кроличьи сыворотки, полученные на основе разработанных наумо-мотодокскнх подходов. (ЮЭКЫНЮТ конструировать слсцифнчные н высокочувствительные дютюстнческне иммуноглобулине«* лрспдрл-ти для серологической лил ностнкн лелшкяяен и идентификации ветбудите-д* i, СпСИифнЧМЫС II IHJСОKÜ4JUCTBИТСЛЬНЫС ТССТ'СНСТСМЫ для выяйлския ЛИ' пггел к niггнгенов в биологическом материале позволяют повысить диагностическую ценность осилен-и'»ее к их методой исследования ira разных стадиях нн-фешоюнисно процесса у больных легнонеллеэом, вызванном L рпеияюрШа различных оерогрупп

4. Набор лсгнонеллезных к оаттаю т i u i и р укн ШК диагностикумов семи се-рогрупп позволяет Проводить скрининг КОЛОНИЯ, идентификацию к серологическое типнрооание куяьтурL pneumophtía различных серогрупл при проведении бактериологических исследований

5. Разработанные критерии и алгоритм серологической диагностики легно-нелдо»ПОЖМЮТ да «а«. объектную «кику результат» жеяыпнм материала от больных и лни, входящих в группы риска, к определить место сероло-гаческих методов в диагностик« лсгнонсллст

Результаты исследований были представлены на НЦЧННХ конферепшк

Конференция Ростовского отделения Всероссийского общества микробиологов. Ростома-Дону. IWi

VII съезд Всероссийского обшестм эпидемиологов. ыюфобнолого» и гм-разитологон, Москва. 1997 г.

Конференция Ростовского отделения Всероссийского общества мнкробноло-гов. Ростов-нп-Дону. ] 999 г.

4-ая Межгосударственная научно-практическая конференция государств -УЧАСТНИКОВ СНГ Современные технологии в диагностике особо опасных болезней Саратов. 2003 г

Научно-практическая конференция «Актуальные проблемы эпидемиологического надзора за природно-очаговыми н особо опасными ннфекииямн в регионе Северного Кавказа», Ставрополь, 2005 г,

VI Межгосударственная научно-практическая конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территории государств-участников Содружества Независимых Государств: Проблемы биологической беэопасиоста и противодействия бнотеррорнзму в современных условиях». Волгоград, 2005 г.

V-ÍM Межвуэокжн международна* биохимическая научно-практическая конференция «Обмен веществ при ллиггацин и повреждении», Ростов-на-Дону, 2006 г.

Ма ИЦИД.1М inrctoi д л ни получены при выполнении четырех плановых научных тем Per Si 0193 0 003251 «Легнонелло na Северном Кавказе^, Per ft 01.95.0 003715 «Особенности зинлемнолоти легионеллеза в условиях крупного города*. Per. № 01.99.0 002823 «Конструирование препаратов для ее-ролотчесхой диагностики легионеллеза». Per. № 01.200.2 12993 «Изучение Legionella pneumophila с цель» поиска антигенов, имеющих диагностическое вгаченне».

ЦДдщдщ рмульпио» исследования

Но теме диссертации опубликовано 27 научных рчбог, и» ни* 7 - в и шяии-я\. рецензируемых ВАК

План диссертации идЦ утвержден на меедАиин УчетЮГО совет

ФГУЭ РостНИПЧИ Роепотребиалзорл (протокол № 4 от 19.СИ. 2005 г.)

Структура работу

Диссертация изложена на 301 страницах, состоит нз введения, материалов и методов, обзора литератур«, пяти глав ообепкяных исследований, кяжда* in которых ижлючает результаты собственных исследовании, их обсуждение, за которым следуют заключен!«, выводы и список цитируемой литературы. Диссертация иллюстрирована 36 таблицами. 22 рисунками, Кнблиотрофтпеский указатель содержит 395 источника, в тон числе 58 работ отечественных и 337 -зар>бежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Карбышев, Гериард Львович

260 Вывозы

1. Установлено наличие 20 белковых антигенов у L pneumophila серогрупп I - 7, которые разделены по свойству1 иммуногснности и аффинности образующихся антител на высоко, средне н низко имчуниогенные Несмотря на гетерогенность по нммуногеиностн, все белковые антигены являются общими для семи серогрупп.

2. Впервые научно обоснована технология получения растворимого антигена L pneumophila серо группы Ï с известным антигенным составом, который может быть использован в качестве сенситина для конструирования любых антигенных вариантов днагностикумов.

3. Сконструирован диагностику!» лепюисплетиЯ серогрупиы 1 антигенный полимерный сухой для РАО с известным антигенными свойствами Проведенные экспериментальные, клинические н Государственные испытания позволили установить, что чувствительность диагжсзнкума составила 100%, спсвд-фичностъ - 99,1%, а его ЛНПЮвптсай титр - 1 ;80,

4. Установлено, что днагноетнкум логионеллезныЯ серо группы 1 антигенный полимерный взаимодействует с сыворотками против L pneumophila серогрупп 2 -7 с титрами or 1:80 до t :640, что позволяет предполагать возможность определения а сыворотках крови больных антитела к L pneumophila других серогрупп.

5. Разработана технология получения кроличьих гилернммунных сывороток L pneumophila семи серогрупп, обогащенных антителами как к белковым, так н яиподалнеахаркяным антигенам

6. Сконструирован диалюстикум лелюнеллезный серогрупны I иммуног-лобудииолый полимерный сухой для выявления в РАО легнонеллезного антигена в моте у больных и серологической щкигифнкыщн L pntumoptíh серо-группы 1. Чувств1гтелыюсть его составила для ММ№Й L pneumophila 5*10* -10* ы,к./мл и для легнонеллезного растворимою антигена - от 2 до 50 мкг/мл.

1, Сконструирован побор легнонештсзных серо групп I - 7 коагтлютнни* рующнх днвгностикумов, предназначенный для скрининга колоний л серологической идентификации L pneumophila серо групп I ■ 7 при проведении бактериологических исследований иа легнонсллст

В Сформулированы критерии и последовательный длухэтапный алгорагтч диагностики болезни легионеров, включающий анализ эпидемиологических, клинических, рентгенологических данных и результаты лабораторных исследований материала от больныхж

24« Заключение

Диагностики болезни легионеров и лабораторный контроль за циркуляцией возбудители и объектах окружающей среды, является ключевым звеном в системе эпндсмлолопгческого надзора за заболеванием.

Количество новых видов и серогрули лето и едя с каждым голом увеличивается и в настоящее время семейство Legioneffacaea включает 48 видов и 69 ссрогрупп. Известно 15 серо групп для L pneumophila и но две сермруппы для I- ЫяетапИ, L longbeachae, L fetieit, L hacMfae.L taimhelenal, L eryt/rra и L ^HinihtMri. Ит 4S индоп лепюиелл только 20 видов имеют значение в патологии человека. Лидирующим видом является L pneumophila, частота, которой среди штаммов, выделенных от больных, колеблется от 91,3 до 98,8%. Среди них удельный вес ссрогруппы I варьирует от 61,7 до 95,4%. Среди других серог-рупп наиболее часто встречаются серогруппы 3, б и 4. Среди штаммов, выделенных из объектов окружающей среды, частота выделения L ¡mcumophib варьирует от 75,5 до 93,5%, in которых серогруппы I - от 18,2 до 46%, серо-ipyratw 5 - от 4 до 20,3%, серогруппы 6 - от 11Л до 13,2%, серогруппы 3 - от (0,2 до 10,8%.

Безусловно, «золотым стандартом» диапыктикн легионеллсза является баггериолскшческнй метол. В то же врем« практика свидетельствует о большой доле и значимости серологических методов,

Серологические методы являются простыми, ускоренными, экономичными и, что самое главное, обнаружение в крови специфических антител позволяет подтвердить ответ организма на возбудитель, а. следовательно, и доказать наличие инфекционного процесса, связанного с данным микроорганизмом. Последнее обстоятельство является решающим фактором в доказательстве этиологической роли выделенного микроорганизма на ранних стадиях изучения нового инфекционного заболевания. Обнаружение специфических антител в крови серологическими методами подтверждает этнологическую роль микроорганизма. Именно этот способ доказательства этнологической роли выделенного микроба был предложен рядом авторов в 1976 - 1977 ГГ- при изучении филадельфийской вспышки болезни Лсгиомерол

Анализ дтгтературы также свидетельствует о важной роли серологических методов диагностики легнонеллеза, необходимости использования коммерческих тест-систем для выявления возбудителя, его антигенов в клиническом материале и объектах внешней срелы и серологического типироаання. Поданным еженедельника ПОЗ в практике удельный все серологических методов варьирует от 70% до 78,2% бактернодопгкского метода от (7% до 21.6% и Л ЦР-диагностики - от 0.8354 ДО 3%,

В настоящее время для выявления мгтнтел к возбудителю легноиеллеза используют три метода: реакцию непрямой иммунофдюорссценции, иммунсн ферментный анализ и ми кроил л юти и м ш ю. Методы обнаружения антиген* широко применяются и включают нммуиоферментныИ. радиоиммунный анализы, прямую нммутгофлнюрссисншпо н латексную агломерацию (Меморандум ВОЗ. 1990).

В связи с изложенным, актуальной проблемой в настоящее время является создание надежных сертифицированных отечественных тест-систем для выявления сиеиифм'сескмх лимкл. выя&лсии* антигена в биологическом материале и обьектах внешней среда, идентификации и серологического типнроваиия возбудителей, а также разработка критериев серологической диагностики легнонеллеза.

При консгрунроваиии диагностических препарате важное значение имеют знания анпггенной структуры возбудителя и характер сенснтнна, используемого для создания препарата- Выявление высоконммуиогснных антигенов и их комплексов, получение к ним моноспецифическнх сывороток является основой конструирования антигенных и аитительных вариантов тест-систем для диагностики инфекционных заболеваний

Анализ обширной литературы позволил прелепштть современные взгляды на в1ттиге1П1ую структуру возбудителя болезни легионеров -1. рпешяоркИа и структурно-функшюиальиую организацию факторов пвтогеииости, Описана структура и функциональные свойства мембранных белков: главною белка наружной мембраны (МОМР). жгутиков, ЛПС н белка тепловою тока (Н»р-60). Охарактеризованы основные факторы вирулентности р/ютюрЬ^а- М1р-белок ^тплсторЬвве тГеС№иу р<иети1о1огч шлолиим, 1>о1А-белок, Охарактеризована 2-ая секреторная система, обеспечивающая продукцию дополнительных факторов вирулентности - секрецию шести РИО - зависимых белков: протеазы, кислой фосфатазы, нитрофенилфосфоридхштнн (р№РРС И идродизы. липазы, фосфолипзма А и лнзофосфолкпазы А, Представлены данные о генах, кодирующих основные белки и факторы вирулентности микроба, Описаны механизмы внутриклеточной псрснстснции £ рпеиторАи!а в клетках свободножн-•УШКХ простейших и альвеолярных макрофагов, обеспечивающих механизмы патогенен заболевания. Систематизированные данные по антигенной структуре Iд. рпеияюркИа имеют решающее значение при конструировании тест-систем для диагностики болезни легионеров^

Изучение антигенной структуры мы осуществляли с использованием ре-фсрентных штаммов 1гфопс!1а рпсхторЫЬ, штамм РЫккШрМа А'ГСС 33152 серогруппы I, щтамм То%ил АТСС 33154 серофуппы 2, штамм В1ит*п$оп АТСС 33155 серогруппы 3, штамм 1оз*Лп&1а АТСС 33156 серогруппы 4. штамм ОаШи АТСС 33216 серогруппы 5, штамм СЫащо 2 АТСС 33215 серофуппы 6, штамм С1исахо 8 АТСС 33823 серогруппы 7

При изучении здсктрофоретическнх профилей I. рпгиторНИа семи серог-рупп нами было показано наличие 27 белков, из которых 14 были общими для всех семи серогрупн, 10 - общими для отдельных серофупп и 3 - уникальными для конкретных серогрупп, в частности, 3 и 7 серофупп,

Дм изучения иммунотенных свойств белков нами был использован метод нммуиоблотписга с кроличьей гиперкммуниой сывороткой против ¡, рпсито-рЬ>)а серофуппы 1, а для изучения специфичности - с пулом нормальных кроличьих сывороток С точки зрений конструирования диагностических тест-систем этот этап экспериментальных исследований является ключевым, поскольку именно нммуиогенные антигены формируют иммунный ответ н. в частиости. гуморальный, с широким спектром специфически* антител различных классе» к укатанным антигенам,

В нммуиоблоггоиге кроличья гнпсрнммуииая сыворотка против серофуп-ны 1 выявляла 20 иммуиогенных втгтигенов, из которых пять являются песне-пифическим л, взаимодействующими с НКС Общими для всех семи серофупн являются восемь антигенов с молекулярными массами 60, 56,52, 38, 30. 28, 19. 16 kDa, из которых 3 являются («специфическими ■ 72. 60, 56 кПо- В то же время, необходимо отметать* что сыворотка против СсрОфутгпы Í выявляет антигены с молекулярными массами 83, 85,96 н 112 kDa у других серогрупп, которые отсутствуют у ссрогруппы I.

Анализируя полученные результаты, * сравнении с данными литературы, мы предполагаем, что из 8 антигенов, общих лля всех семи серотрупп, шесть являются присущими L pneumophila.

Антиген с молекулярной массой 60 kDa соответствует хоропю известному белку теплового шока (Ivcat shock protelas, Hjp-60). Указанный антиген является родоспсцифичным и широко встречается у лрутх микроорганизмов, являясь наиболее широко рвепроетраиенным ai пшеном различных бактериальных клеток (Plilcaytis B.B. el ûl„ 1987; Lema M.W. et al., 1988; Hoffman P.S. el al , 1989; Urna M.W„ Brown A., 1995; Ze^d U„ Kaufmann S.H. 1999).

Антиген с молекулярной массой 38 kDa. по нашему мнению, соответствует цитолизину (эхетрацеллюлярная протеаза, цннк-металлопротсаза, главный секреторный белок, легиодизии). который имеется у всех серогрупп /- pneumophila (Baifie W.B., 1985; Dreyfus LA, I&Écwïki B.H. 1986; Белый Ю.Ф. с соавт. 1986; Белый Ю.Ф. с соавт. 1988; Белый Ю Ф. с соапг. 1989; Keen M.G-, Hoffman P.S., 19S9; Blander S.J., HofWÎtZ M.A, 1989, 1991«; Wmienneyer E. el al., 1994, Sabney N N. et al., 2001). Несмотря на то, что цитолизин является внеклеточной протеа-jofl, L Síeto, H.A. Shuman (1990) пшии его пито- н псрнпдазматичесхую локализацию, в связи с чем, как мы полагаем, он может выявляться при злектро-форезе не только бульонных экстрактов, но и бактериальных лнзатов.

Антигены с молекулярными массами 30 и 28 kDa, по нашем}' мнению, соответствуют двум мономерным формам главного белка наружной мембраны (MQMP) МОМР является родоспеиифнчсскнм белком и выполнит фуикпни поринп (Htndahl M.S., Iglewskl В Н. 1984. 1986; Ehret W. Л а!. 1984; Butler CA. et а]. 1985; Bull« C.A НоШпвл P-S-. 1990; Hoflhwn PS, e< al„ 1992).

Антиген с молекулярной массой 24 kDa соответствует MIP - белку (macro-pftage infeciivity poienlinior), родоспецифнчеи и является основным фактором вирулентности легионелл (Engleberg N С, с< а!. 1984, Engleberg N. С , Peariman Е-, В Eisenstein 1., 1984; Peaitman Е. « al, 1985; Eisenstein В. I , EngkbctgN. С., 1986; Eoglcfcerg N. С. et al., 1986; Ctanciouo N .P et al., 1990; Wimermeyer E. et al-, 1995; Susa M. et al., 1996; Köhler R. el al., 2003).

Антиген с молекулярной массой 19 kDa также отмечен у всех семи серог-pynn L pneumophila По данным литературы, 19 kDa - белок является пегттн-догликаном, встречается у всех серо групп L pneumophila и других видов ле-moite.ii и участвует в структурной организации мембраны бактериальной клетки (Ott М- et al., 1991; Engleberg N. С et al,, 1991; Ludwig В. et al-, 1991).

При исследовании в иммуноблоттниге различных штаммов тетеролопгч-ных микроорганизмов У pestis, F. häartnsa, 1' pieudonibeteulosis ссроваров 1 -6, В. obortus, В m eh loa is, H mit, К «ueroeohnea cepooapa 09, V. einlerne ettar, £ coli, С jejuni, S. aureus и S typhimwium с кроличьими сыворотками против семи ссрогрунп L pneumophila каких либо родственных антигенов не выявлено, что подтверждает специфичность вышеуказанных антигенов L pneumophila.

В дальнейшем нами были изучены перекрестные взаимодействия белковых антигенов между различными серогруппами L pneumophila. Анализ результатов перекрестного Иммуноблотгн нга L pneumophila семи серо групп с каждой из семи кроличьих сывороток против указанных серо групп позволил сгруппировать все изучаемые белковые антигены L pnetanaphda в следующем порядке Группа антигенов, предстанлешна у всех семи ссрогрунп, которая определяется всеми семью сыворотками Она локализуется широкой полосой в диапазоне молекулярных масс от 30 до 21 kDa, проявляется всеми сыворотками с выраженной интенсивностью и обладает выраженными антигенными с но Истцами На основании данных литерату ры и результатов собственных исследований мы полагаем, что дойная группа антигенов состоит из субьсдиниц МОМР с молекулярными массами 30 и 2® kDa, фрагментов ЛПС (возможно линида А) в диапазоне молекулярных масс от 30 до 20 kDa. лидеров Mip - белка с молекулярной массой 24 kDa и. вероятно, фрагментов пептнлоглнкана Подобное предположение обосиовазю тем, что все указанные компоненты структурно связаны друг с другом н формируют наружную мембрану бактериальной клетки. Указанная группа антигенов является мажорной н, a основном, определяет антигенные свойства /, ртыяюрЫЬ. Образующиеся к ним антитела являются высокоаффнниыми. Выявленный нами исспецнфический компонент с молекулярной массой 28 kDa у I н 2 серо групп, при изучении деиентограмм по величине профиля интенсивности составляет менее 1(М от всей группы н, таким образом, существенно не влияет на специфичность указанной группы антигенов

2» Антиген, представленный у всех серо групп, который определяется большинством, но не всеми, сыворотками против семи серо групп. Антиген с молекулярной массой 38 kDa не определяется сывороткой против 4-ой серотруллы у всех серогрупп, Сыворотка против ссрогруппы 5 не определяет его у 3-еЙ и 5-ой серо групп Сыворотка против ссрогруппы 6 ire определяет его у 2-ой, 5-ой и 7-ой серо групп. Сыворотка против ссрогруппы 7 не определяет его у 1-ой, 2-ой, З-ей, 4-ой и 5-ой серегрупп.

3. Группа антигенов, представленная у всех серогрупп, однако определяется только сыворотками прогни других отдельных серогрупп, Эта ipymia включает следующие антигены: 49» 43,40. 34. 31, 20, 19 н 17 kDa. Они являются гетерогенными по свойству иммуногениостн, на hik есть высоко и низко отвечающие лабораторные животные, популяция образующихся антител гетсротеина по свойству аффинности, однако эти антигены являются обидами для всех семи серогрупп L pneumophila.

I Группа антигенов, которые определяются у отдельных серогрупп сыворотками против других отдельных серогрупп. Эта группа включает следующие антигены - 64. 63.60. 54. 50, 46, 44. 36,35, 33 и 18 kDa. Они являются низко-иммуногеинымн, на них большинство лабораторных животных отвечают слабым иммунным ответом» популяция образующихся антиген преимущественно ниткдаффишмя, указанные антигены являются общими, !ю не для всех серог-рупп,

Налги также изучены антигенные и нымунногенные свойства ЛПС L pneumophila семи серогрупп, Препараты ЛПС семи серо групп L pneumophila выделяли по методу P. J. Hitchcock, T. M Brown (I9S3), woднф ицнрованвоку J.D. Urgens, FJ. Fehrenbach ( 1997). Анализ перекрестных иммуноблоттингов препаратов ЛПС семи серогрупп L pneumophila при взаимодействии с сыворотками против семи серогрупп свидетельствует о том. 'по ЛПС-антигены являются се-рогруппоспецнфнчиымп к присущи только своим серогрунпам Они распределяются в электрофорезе широкими зонами с колебаниями молекулярных масс в верхней границе в диапазоне 140 - 85 kDa и в нижней границе - в диапазоне 30 - 17 kDa. Для L pneumophila серогрупп 1.2,4.5 н 7 характерна злеюрофоретн-ческая картина классической «лесенки» распределения ЛПС- Подобная «лест-гагпгая« картина элехтрофорстичсского профиля препаратов ЛПС отсутствует у серогрупп Зкб. Кроме того, для серогрупп I, 2 и 7 достаточно четко представлена элсктрофорегическая картина распределения ЛПС на высоко- и низкомолекулярные зоны. Остальные антигенные детерминанты ЛПС, определяемые сыворотками против различных серогрупп L pneumophila, являются минорными. имеют низкую интенсивность полос и существенно не влияют на элсктро-форспгкскую картину препаратов ЛПС L pneumophila семи серогрупп Указанные минорные ЛПС - антигены, в основном, локализуются в зоне молекулярных масс 30-17 kDa и представляют собой, по-видимому, пс до коиио разрушенные фрагменты белков и пептидоглиханв, а также фрагменты липнда А

Таким образом, проведенный нами анализ антигенной структуры I- pneumophila семи серогрупп позволил не только классифицировать нммуногениые антигены L pwumophila. но н явился основой целенаправленного конструирования антигенных и иммуноглобулнновых вариантов препаратов для серологической диагностики легнонеллеэа.

Дня конструирования диагностикумов в качестве носителей антигенов н иммуноглобулинов нами использована технология полимерных микросфер. Моиодиеперстные полимерные частицы в виде коллоидных растворов с реак-шкиню-способиымн труппами на поверхности представляют итгтерес дня биотехнологии как носители биологически активных веществ, обеспечивающие их ковзлентное с вязывание и последующее участие полученных конъюгятов в нм-мунохимических процессах. Преимущество полимерных носителей связано с тем, что они стабильны, поверхность биологически инертна и физико-химическая свя л с ееиситниом известна и зависит от характера носителя. Используя метод двойной полимеризации полнакролениа - щелочью в водной среде и обработкой сафранином - были получены сшитые, стабнлызьк, нерастворимые в органических растворители* микросферы, окрашенные в красный цвет, диаметром 1,5 мкм, содержащие 1*3 мМоль/г азвдегидных групп. Полученные серии полнахродеииового мнкросфсрического носителя использовали для конструировали* антигенного и иммуногаобуяиипого легионеллезимх дн-йгиостнкумов.

Для конструирования антигенного варианта диапюстнкуыа нами отработана оригинальная технология получения растворимого легнонеллезного шттн-геиа При его патучении использована двойная технология; ультразвуковой дезинтеграции и обработкой дезокенхолатом натрия бактериальной мвссы L pneutMrphiia серогрушты I в условиях слабокислотной среды. Это позволило в значительной степени избавиться от фрагментов ЛПС и подучить растворимый антиген, обогащенный белками, При злекгрофорегическом исследовании растворимого антигена установлено наличие 23 белков с молекулярными массами от 109 до 15 Ша~ В иммуноблоттинге выявлены 13 нммунногенных антигенов с молекулярными массами от 81 ло 20 kDa, взаимодействующих с кроличьей сывороткой против серогруппы I к пять неспеинфических лтгтитенов <70, 58, 55 47 it 28 к Da), взаимодействующих с пулом нормальной кроличьей сыноротхн. Таким образом. отработана стаидартнаи технологи* получение докнгииа с известными антигенными свойствами для конструирования airra генных вариантов любых диагностикумов.

Отработана стандартная технология иммобилизации растворимого легно-неллезиого антигена и получена антигенная характеристика сенсибилизированного полимерного микросфернческого носителя. На поверхности полимерного микросферического HOCMTCJU в процессе иммобилизации сорбируются [2 им-ыуиогенных антн генов, нз которых одиннадцать с молекулярными массами 20 kD*. 26 kix 30-31 kDa, 38-39 kDa. 40 kDa, 44 kDa. 50-5] kDa, 56-58 kDa, 60 kDa, 62 Шв. 80 kDa являются специфичными для L pitewmtphUa и один, с молекулярной массой 28 kDa - неегкпифический, взаимолействуюший с ИКС. Представленные данные позволяют полагать, что полученный нами растворимы Л лсгно№1лезиыЙ антиген содержит известные полноценные антигенные компоненты L pneumophila, отиечаюиме за аитигенность. вирулентность н нм-муногенноегь возбудителя, которые эффективно сорбируются на полимерный носитель.

При изучении чувств1ггельностн лиапюстнкум взаимодействовал с различными сериями дегионеллезных гипериммунных сывороток с титрами от 1:320 до 1; 2560, При исследовании 50 сывороток больных легнонеллезом. подтвержденных в 1:95Д±]3.5. При эксперименгалмюм изучении специфичности с различными сериями сывороток против 12 гетерологичных микроорганизмов установлено, что днагностикум взаимодействовал в РАО в титре 1.40 с сыворотками против двух Серова род лсптоспир • L. hebdomadij. L. can kola, в титре 1:20-е сывороткой против L pyroxenes и сывороткой против возбудителя лихорадки Q.

При изучении специфичности с сыворотками крови 520 здоровых лиц установлено, что диагносгикум взаимодействовал в РАО в титре 1:40 с частотой 4.8%. я в титре 1 ;80 - с частотой 0,6%, При исследовании сывороток 99 больных острыми заболеваниями органов дыхания установленной бактериальной тлюлогин диагностику« взаимодействовал в РАО с титром I ;40 н с частотой 2,0%. Среди больных взрослых и детей, ссропознтнвпых в отношении хлвмиднй-ной и миколдазмснной инфекциях, чистота положительных результатов в РАО с титрами 1М составила в среднем 4,3%, в с титрами 1:60 - 0,3%.

Таким образом, исследования по определенны чувствительности и специфичности диагиостикума легнонеллезгаго серофуцпы ] антигенного полимер лого позволили установить, что чувстмггеныюсть дногиостикума составила 100%, специфичность - 99,1%. а диагностический ззпр - 1:80.

При проведении сравнительных исследований диагиостикума дегионел-лезиого серотруипы 1 антигенного нолииерного с РНИФ и ИФА, производства ннстзпутв им. Н.Ф. Гамалеи, на 509 сыворотках крови от 429 больных острыми пневмониями. установлено, что он оказался не только сопоставим с РНИФ. но и превысил era по частоте выпадения нарастания титров специфических антител в динамике инфекционного процесса, Метод ИФА с набором реактивов производства института им Н.Ф. Гамалеи давал высокий процеш дожноположй-тельных результатов. Представленные донные свидетельствуют о том, что РАО может быть использован как самостоятельный метол серологической диагностик:! легнонеллеза.

Проведенные экспериментальные исследования о наличии общих белковых 01пигенов у L рпеаяорЛИа семи серофупд н результаты исследования дногиостикума с экспериментальными сыворотками против семи ссрогрупп позволили установить возможность перекрестного взаимодействия диагностикуыв легнонеллезнога ссрогрутгпы 1 антигенного полимерного с сыворотками против других ссрогрупп 2-7. Это позволяет полагать, что полученный нами диагно-сти кум будет определять в сыворотках крови больных антитела к L ptifima-phíta других ссрогрупп, во всяком случае, серофупп 2-7.

По результатам Государственных испытаний в П1СК км. Л А. Тарасовича (протокол №7 от 19Л2.2002 г.) дишзюегнкум легиокеллезный серофупгш 1 антигенный полимерный сухой для РАО рекомендован к внедрению в практику здравоохранения страны. В настоящее время указанный диагностику» широко используется практическими медицинскими учреждениями строим для диагностики легиоиеллеза.

Для конструирования иымуногиобуИКЧОВОГО полимерного диигноетнкума и получения контрольных сывороток для проверки активности антигонкого диагност кума иамн были использованы различные схемы иммунизации.

Для получения сывороток, обогащенных антителами к белковым антигенам, для иммунизации была использована бактериальная масса L pneumophila ссрогруппы I, прогретая при Sût в течение 30 минут Наиболее предпочтительной оказалась схема с предварительным введением кроликам иммуномоду-лятора такгквина. Получены сыворотки с концентрацией белка в диапазоне 6,0 - 7,0 мг/мл, которые зарегистрированы в качестве СОП - стандартного образна предприятия при проведении Государственных испытаний в ГИСК им. ЛА. Тарасевичз и методика их получения отражена в нормативной документации на лнагноетнкум легионеллезиый ссрогруппы 1 антигенный полимерны й сухой. Эта сыворотки также использованы при изучении антигенной структуры ¿ pneumophila

Дал получения сывороток, обогащенных антителами к Л ПС. били использованы бактериальные массы L pneumophila серогрупп 1 - 7, подвергнутые обработке при 100й С в течение 2 часов. Эти сыворотки использованы для конструирования легнонеллезного иммуноглобулине веГо полимерного диагностику -ма, который предназначен для выявления антигеио а биологических жидкостях организма человека (моча), где предполагается наличие не целой бактериальной клетки, а ее фрагментов, деградированные под воздействием факторов внутренней среды организма и. в первую очередь, ЛПС. Наиболее аффектавтюй также оказались сыворотка, полученная с предварительным введением такта-вина, в которой титры в РА и РАО были одинаковы и составляли 1:640 -1:2560,

На основе указанных сывороток получен днагноетикум легионеллезный иымуноглобулнновый полимерный сухой, чувствительность которого составила 5*10* - 10* м.кУмл L pneumophila серогруппы I и от 2 до 50 мкг/мл легноиеяяезного растворимого антигена ЕЮ бедку, При изучении специфичности ди-агностикум давал отрицательные результаты с 23 изученными штаммами И видов гетерологичиых микроорганизмов с концентрацией бактериальной взвеси от 10* до 101 м.кЛи. что подтверждает его высокую специфичность. Диаг-ностикум не выявлял растворимые антигены /„ ффр/НурЬмОт, I ротагше. I и'/гое. С ргкитопк! и С. ВиглсШ в концентра пнях свыше 50 ыхг/ыд, Кроме того, диагностику™ не выявлял !■ ртгяторкИа есрогрупп 2 - 7 п концентрациях 10* - 10' м.кЛиз, что подтверждают высокую специфичность иммуноглобулН-нового полимерного диагноетнкума для рпеюпорЬМа серогруппы I. Представленные дойные свидетельствуют о возможности использования днагностн-кума для серологической идентификации £ рпеитвр/п/а серогруппы 1.

Результаты полевых испытаний диагноетнкума легионешюзиого иммуног-лобулниового полимерного в сравнении с НФА, производства института им Н.Ф. Гамалеи, на 74 пробах мочи от больных с острыми заболеваниями органов дыхания и 107 пробах воды из объектов окружающей среды выявили совпадающие результаты, что с в ндетел ьству ет о возможности использования иммуноглобулинов»! о препарата для серологической диагностики заболевания у людей, а также для серологического выявления легноиедлезного антигена в водных объектах окружающей среды,

Разработанный диагностику« летионслаезный ыгрогруппы I нммуногло-булиновый полимерный сухой предназначен для выявления лсгнонеллеэного антигена в моче у Больных с целью серологической диагностики заболевания, а также для серологической идентификации I рпгиторНИа серофуппы 1. Днаг-ностикум прошел коииссзгоиные испытания в Рост НИИ ЧИ, на него написана нормативная документация (инструкция по изготовлению и контролю), которая утверждена Ученым Советом института (протокол от 14,06-2006 г )

Дпя конструирования набора мнитлютиннруюшнх диапюстнкумов для се-ролотзтческой идентификации /. рпеыторкНа семи серогрупп нами была разработана технология получения стафилококкового реагента с высокой иммуног-лобулинсаязывающей активностью На основании экспериментальных мсследеланий подобрана рецептура агара Хоггингера с повышенным содержанием амишюго nota (не менее 1,5 г/л) и оптимальные сроки культивирований S доне штамм »Covi-an 1» с целью получения стафилококковое реагента- Используя сыворотки, обогащенные антителами к ЛПС - антигенам L pneumophila серо групп 1 - 7, получен набор легиоиеллезных ceporpyrai ! - 7 коогглю-тпирущп диагноста кумов Чувствительность легаоишезнш коагглюти-ннруюищх лиагностнкумоп с гомологичными культурами составила 5х 10* - \0 hjuW

При изучении специфичности набора легионелдемых коагглютинирую-щнх лиагностикумов с 23 штаммами 14 видов гетерологичных мнкроорганиз-мов, коллекцией референтных штаммов L pneumophila рапичных серо групп и 36 штаммами L pneumophila различных ceporpynri, ШВЙКНПК m объектов окружающей среды с концентрацией бактериальной взвеси 10* м.кУыл, в сравнении с коммерческой тест-системой Leginnella latex test производства фирмы Oxoïd, Hampshire, England, установлена строгач спсщ|фнчнйеть каждого коагг-лютиинрующего диагмосгикумя соответствующей серо группе L pneumophila и отсутствие перекрестных реакций с другими серогруппами и полное совпадение результатов с коммерческой тест-системой Legtonella latex test,

Набор лспюнеллезиых коягглютникрующих дивгностнкуыов предназначен дтя скрининга колоний и серологической идентификации L pneumophila серо групп 1 - 7 при проведении бактериологических исследований на легяо-неллеэ. Чувств1Гтель»ость набора днагноегнкумов составила 10 ы.к./ыл, a высокая специфичность подтверждена экспериментальными («следованиями

Набор коогтлютнпирующих диагностику мое L pneumophila серогруПП I -7 пропил комиссионные испытания в РостННПЧИ, на него нагшеана нормативная документация (инструкция по изготовлению н контролю), которая утверждена Ученым Советом инстзпуто (протокол ЛИ от 14,06,2006 г.),

Экспериментальные и клинические испытания разработанных нами дегио-нсляезиых антигенного и иммуноглобулинового диагностикумов, а также анализ критериев диагностики лсгиоисппея, предложенных ВОЗ и ведущими научными центрами, Европы, СШЛ к Великобритании, позволили нам сформули-ропать алгоритм диагностики болезни легионеров

В отличие от существующих в £врочс.СЛ1А и Великобритании кртстерисв, ночи предлагается алгоритм, включающий два зтапп 11л первом этапе, на основании клинико-сюнйемиологнческих и рентгенологических данных осуществляют отбор пациентов, подлежащих лабораторному исследованию на лепгонел-лез. В связи отсутствием специфических клинических черт заболевания, важнейшим мероприятием является тщательный сбор зпндемиологического анамнеза, результаты которого, л первую очередь, определяют показания к лабораторному исследованию

На втором этапе предлагается алгоритм лабораторного обследования, оценки получаемых результатов и выработки рекомендаций для дальнейших исследовании пациентов с наличием клинической картины заболевания с наличием пневмонии (клинико-рентгеиологнчсскн) или ее отсутствии,

Нами впервые предложена дифференциация исследуемого материала в зависимости от сроков заболевания, В первые семь дней от начала заболевания исследуют мокроту, а при ее отсутствии к возможности проведения бронхоскопии - бронхиальных смывов, в также мочи Мокроту исследуют бактериологически и в реакции прямой иммуиофлюоресценнии, а мочу п ИФА и в РАО с иммуногдобулнновым днатностнкумом. В сроки после седьмого дни заболевания исследуют мочу в ИФА и в РАО с иммуногдобулнновым диагтюстнкумом и кровь в РНИФ и РАО с 01гтигенным днапюстнкумом В зависимости от результатов исследования предлагаются варианты щелочения и рекомендации для регистрации заболевания или по дальнейшему исследованию

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Карбышев, Гериард Львович, Ростов-на-Дону

1. Белая Ю-А., Гвйлоиская H.H., Быстром С.М., Ферапонтов Г. К. Определение холерного энтеро токсина с тюмошыо реакции коагтлютн нации tt Вестник A Mtl. -1984. № 10. - С, 69-73,

2. Белля Ю.А., Шеконян Ci"., Дроздов С,Г, и др. Диагностика рогпинруспоЯ инфекции с помощью реакции коагтлютн нации ft Вопр. вирусологии. -im-Л 2,-С. 233-236.

3. Беленький С.И. Соиремениые аспекты миологической расшифровки острых пневмоний U Сборник научных трудов 1-ш Моек мед. ин-та км. И.М,Сече1юва- • М., 1984. ■ С. 57-61.

4. Белый Ю.Ф, Верш» Ю.В., Тартаковский И,С и др. Характеристика ци-толюнкя Legionella pneumophila If Ж>рн. микробиол,. зпндемиол. N КМ» мутюбиол -l938 -Nr2.-C.4-7

5. Белый Ю.Ф., Тартаковский КС., Гульннк С,В, и др. Цнтолитичсская активность Legionella pneumophila ti Ж>рн. микробиол , зпидемнол. н имму-нобнол. 1989. 2. - С. 14-16.

6. Белый Ю.Ф., Тартаковский И,С, Нсустроева В.В. и др, Изучение условий культивирования Legionella pneumophila, влияющих на продукцию цито-токеннв И Жури микробиол., элидемиол. и иммуиобиол. 1986, - 4 ■ С, 34-37.

7. Бериет Ф Клеточная иммунологии M : Мир» 1971, - 542 с,

8. Бойд У. Основы иммунологии. М.г Мир. 1969. - 647 с.

9. Васильева В.И., Прозоровский C.B., Русакова Е В. и др. Иммуиосзруктура населения некоторых районов СССР к Legionella pneumophila I/ Журн. микробиол,,эга1Демиол, и иммуиобиол. 19Í6, - № 7, - С, 75-79.

10. Васильева В.II, Прозоровский С.В , Русакова Е В. и др. Этиология острых пневмоний в организованных коллективах И Жури, микробиол,, зпидемнол. и иммуиобиол. -1987. Nu 4. - С- 44-47.

11. Гальпева Г.В., Темежникова НД, Стержонтова Л,В. Экспресс-диагностика легионеллеза // Энилемиол . микробиол, и иммуиол. бактер. и внрусн, миф.: Тез. докл. Ростов-н/Д, 1989. - С. 114-116.

12. Гревннип ГС , Ионтова U.M. Артюхов А.И. и др. Новый метод экспресс-днагностикн острой стрептококковой инфекции Н Жури, микробиол , эпидемией, и иммуиобиол. ■ 1990. № 12. - С 22-26.

13. Грижсбовскнй Г.М., Ледовская А .П., Зарсвина Л.И. Лопаткин О.Н. К вопросу об использовании реакции коагглюгннацни для дналюстнкн холеры. //Особо опвс, ииф, ira Кавказе; Тез, дохл, Ставрополь, 1987. - С. 158160.

14. Гурлева Г.Г., Хаяяпнна Е.Г., Смо.чикова ЛЖ Коагглютинирующнс днаг-носгикумы для серологической идентификации Yertinía етегосЫМса /1

15. Лвб. дело, 1989. - Не 10. - С 66-68

16. Дюскалиева Г У Разработка и оценка ->ффсктнвиос1и легиоиеллезных эритрошпарных днагкосгикумоь C/XVII с«зд Bcecoi об-ы эпидемнол., микробиол. и парозитол. М„ 1989,-T. II - С. 11Í-112,

17. Ерохни Е-П., Тартаковекий КС, Радченко О-В. ti др. Метод пассивной агглютинации полимерных дисперсий для диагностики легионеллеза // Жури. микробиол., зпидемиол. и иммунобиол 1988. - № 11. - С. 41-43.

18. Клиника, лечение н диагностика легионеллеза. Метод, рекоы, МИН зпнд. и микр. им. Гамалеи. Подгот, Покровским В.И, ■ М„ 198?, -31 с.

19. Костр Юкона И.Н., Точнлкниа М.Х., Знатно И.Ю. Реакция контлютнна-иин и ее применение с целио экспресс-диагностики меннигохоккового менингита и Жури, микробиол. зпидемиол и иммунобиол 1981 . - Jfe. 3. -С 62-46.

20. Лабораторная диагностика лепиииыше»; Метод, реком. НИН шил. и микр. им. Гамалея. Подгот. ГОокроаским В.И- М., 1987. -28 с,

21. Махрова ИЛ., Комбфом Ю С,, Яровая Л,М. и др. Реакция коагглютнна-ции для выделения дифтерийного токсина К Жури, микробиол . эпидемией. и иммунобиол. 1989. ~ Jfe 3, - С. 68-71.

22. Мамедов ЗЛ, ИйНШШШе чумного когитдютинируюшего диапюстн-кума в изучении штаммов чумы, выделенных в Центрально-Кавказском очаге чумы Н Акту ал. вопр. особо-опасных инфекций: Матер, региональной иауч -практ, конф, Нальчик, 2000, - С. 39-40,

23. Небожина Л В. Петросов В В., Конюхов В.Ф. и др. Применение различных иммуносералогнчсскнх мегодов дня диагностики легионеллеза /! Иммуио-бнол. препараты нового поколения il методы их контроля М., 1988,-С. 98-102.

24. Орлова Г-М-, Алимов Л.Б., Снвкова О.В. н др Набор еухкх коагглютини-рузощкх ли л п гости кум о в для обнаружения и илентификаиин возбудителей опасных заболеваний H Жури, микробиол , эпндемнол. и иммунобиол. -1992 171-172,

25. Паши» ЛЮ. Пономарев Н.Г, Джапаридзе М.Н. Чумной ннлоспецнфич-ный коагглютинирующий днагностикум И Состояние, пробл и перспективы рштаи диалюст. бахт. инф, Оболенск, 1990. - С. 86.

26. Петров Р-Е), Иммунология. М.: Медицина. 1983. - 368 е.

27. Петров Р. В., Хаитов Р.М, Маиько В.М., Михайлова А. А. Контроль и регуляция иммунного ответа. Л.: Медицина. 1981. - 311 с.

28. Пожалотана Л.В. Лнхшккая С.И. О возможности применения реакции хооггактотаиии для индикации антигенов Мигеля Зоние в молоке н молочных продуктах И Новое в практике лаб неследований инф. заболеваний.- Горький, 1987. С 75-78.

29. Покровский В.И, Прозоровский СВ., Тлртаковенй НС., и др. Вспышка летноиеллезной инфекции в Армавире // Жури, мнкробнод. зпидеыиол. и иымунобиол. 1988 - Jfe 10. - С. 24-27.

30. Покровский В,И , Островский Н-Н. Легиоиеллез // Р> к-во но клин , диагн. и лечению опое. инф. болеззкй. -М., 1994, С. 22-23.

31. Прозоровский C.B., Покровский В.И,, Тартаковский И.С. Болезнь легионеров (легионеллез). М.: Медицина, 1984, ■ 207 с.

32. Прозоровский СВ., Покровский В.И, Тартаковский НС. н др. Выявление случаев лепюнеллеза (болезнь легионеров) среди больных острыми пневмониям» П Сое. медицина. -1982. & 3. - С. 96-98.

33. Прозоровский C.B., Русакова Е.В., Рычнев А.Е, к др. Значение Lcgioneila ptteiunophila в респираторной патологии человека И Жури, микробиод., зинлемиол. и нммуиобиол.-1987,- J6 4. С. 34-37.

34. Радченко О.В., Павлова ИЛ,, Тартаковский И.С , Шахонина К.Л. Использование иммуиоферментного анализа для определения легнонеллезного антигена // Новое в практике лаб. исследований инф- заболеваний- Горький, 1987.-С. 39-44.

35. Ройт А- Основы иммунологии М.: Мир, 1991, - 327 с,

36. Сакварелндзе Л-А„ Иерсесо» В,А,. Мгелалзе Ю,Г. и лр, Случаи заболевания дегионеллезом в Тбилиси Н Журн. микробиол. эпидемиол. и иммуиобиол. 1990. - Si I,-С. 42-44.

37. Саяпина Л.В. Адамова Г В , Аннеимова Т.Н. и др. Оценка качества диагностику ма МПНКПШО ceporpymiH I антигенного полимерною по результатам I Ъсудирствснных испытаний // 1Тробл особо опас. инф. Саратов 2001. - Вып. I (87). - С. 61 -63.

38. Сивковл OB, Павлович H B., Аднмов Л.Б. и др. 1применение реакции ко-агглютинации дла серологической ндснтификонни бескллсульных вариантов туляремиЙного микроб« И Акту ал. пробл. профилакт. туляремии: Тез, докл. Всесоюз, конф. М., 1991, -С. 169-170.

39. Сиицин С-В. Бархатова О-А, Дробышевска* э.И. и др, Исследование бножшесш смйсти нстоимвиишх антител к цитолизину Legionella pneumophila И Жури, микробнол,, злидсчиол. и иммунобиол. 1990. - Jir1. П.-С-72-75.

40. Спииин С В , Бархатова ОН, Дробышсвскоя Э.И. и лр, Моноклоиалытые антитела х цитолизину Legioneila pneumophila Ii Жури, микробнол. энн-демиол. и иммунобиол, I9S9. - Л 10, - С. 83-87,

41. Спнцын С.В. Дробышевская Э,И, Бархатова О.И. и Др Стимуляция иммунного ответа к цитолизину Legionella pneumophila с помощью моно-клонмьных антиндиотипических антител И Имчунология 1991. -Л 1. -С. 26-28.

42. Тартакогекий И.С., Литвин В Ю-, Проюровский С В Экологические аспекты легнонеллсза И Жури чнкробиол . mi идем иол н нмыушбнол, -1988.-Л*® 8. -С. 122-125.

43. ТартаковскнЙ И.С. Радченко О.В., Русакова Е В. и др. Выявление антител х Legionella pneumophila шшуиофермеитннм методом в сыворотке крови больных пневмонией It Микробиология. • 1988 Jfe 11. - С. 79-81.

44. Тартаковеккй И.С. Темежиикова НД, Карпова Т. И. Легиеиеллеа: проблемы и перспективы лабораторной диагностики N Проблемы особо шгас. ннф,- Саратов, 2005. Выл 90, - С. 17-23.

45. Тсмсжннкова Н.Д., Белова MB. Канатов Ю.В. Легионеллезные пригреют тарные диагиостикумы // Гомеоетаэ и ннф, процесс; Тез. докл. К Мсж-дуиарод. конф. Саратов, 1996- - Ч, II, - С, 334,

46. Хазвнеон С Л- Коаляютннирующис шигсллезные решен ты разработка технологии получения, использование для ееротииироваиия и индикации ишгелл: Автореф. дис. Кй11Д. бнол, наук. М, 1983. - 24 с.

47. Чубовя Н.В., Абеиова У-А. Экспресс-метод индикации ротавирусиого антигена // (Спин. лаб. диагностика. 1992 - № Е1-12. - С.64 - 66.

48. Эпидемиология, профилактика легионеллеза и борьба с ним: меморандум совещания ВОЗ И Бюллетень ВОЗ. 1990, - 'Г, 68, - С, 7-17.

49. Adetekc A-, Pnieklcr J., Benson К. el al, Legionclla-like ameba! pathogens -phylogenetic status and possible role in respiratory discase U Emerg. Infecí. Di», -1996. Vol. 2, - P 225-230.

50. Baine W.B. Cytolytic and phospholipase C activity in Legionella species ti J. Gen- Microbiol. ■ 1985, • Vol 13L P. 1383-1391.

51. Bangsborg 1 \f, Shaad G, Ptarinun F, HoJby N. Cross-reactive Legionella antigens and the anybody response during infection it APMIS- 1991. - Vol. 99. • P 854-865.

52. Bangsborg J-M-, Shand G,H„ Hansen K„ Wright JJ, Performance of fow different indirect enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) to detect specific IgG, IgA, and IgM in legionnaires disease/-1 APMIS. 1994. - Vol. 102, №7. -P 501-508.

53. Barfca N , Tomosi JI . Stadisbaedci S. ELI&A using whole Legionella pneumophila cells as antigen. Comparison between monovalent and polyvalent antigen for the serodiagnosis of human legioncllosis U J, Immunol. Mcthocb -1986.-Vol.93,Ht I.-P.77-81.

54. Barthe t\, Joly J.R, Ramsay D. cl al. Common epitope on the tipopolysaceha-ridc of Legionella pneumophila recognized by a monoclonal antibody !l J. Clin. Microbiol 19S8. - Vol. 26, to 5, - P, 1016-1023,

55. Bazovska S Differentiation of serologically related «regroups of Legionella pneumophila H ZcntralbL Bakteriol, Mlkrobiol. Hyg, A- 1988. Vol. 267. № 3,-P. 457-461.

56. Ba/ovska S., Spalekova M L.egionello3is in Slovakia It Bralia. tec. Listy. -1994,-Vol. 95. Jfc 11- P. 515-517,

57. Beer S„ Boldur I , Kazak R. ct al. Scrum antibodies to Legionella agent in bronchial asthma // Arch. Dis. Child. 1985. - Vol. 60.№ 3. - P. 225-230.

58. Ben Vaafcov M, La/arovieh Z. Beer S. ct al. Prevalence of Chlamydia pneu-mxmioe antibodies in patients with acute respirnloty infections in Israel H J, Clin. Pathol. -1994 Vol. 47, Л3, - P. 232-235.

59. Benaccraff В., Ojeda Л., Manner P H. Studies on artificial antigen. II. The antigenicity in guinea pigs of arsaniltc acid conjugates of copolymer* of D or L amino acid Hi. E*p, Med. 1963, - Vol. II», - P. 945-951

60. Benson R.F, Fields B.S. Classification of the a*005 Legionella II Scmin. Rcs-ptr. Infect- 1998. - Vol. 13. - P. 90-99.

61. Berdal B.P., Faulty C.E., Feeley J C Detection of Legionella pneumophila antigen in urine by enzint-linked immimospesiflc assay H J. Clin. Microbiol- -979. Vol. 9, № 9. - P. 575-57«.

62. Berger K.H., tsberg R.R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila tt Mol, Microbiol -1993.-Vol.7.-P. 7-19,

63. Berger K.H., Menriam J J., Isberg R R. Altered intracellular targeting properties associated with mutations in the Legionella pneumophila dotA gene ft Mol. Microbiol, 1994. - Vol, 14.- P. 809-822.

64. Birtlcs RJ. Harrison T.G., Samuel D-, Taylor A.G. Evalution of urinary antigen EL1SA for diagnosing Legionella pneumophila serogroup 1 infection И J. Clin. Pathol. 1990. - Vol 43, Si 8 - P <$5-690.

65. Blonder S J., Horwrtz M.A, Vaccination with the major secretory protein of Legionella pneumophila induced cell mediate and protective immunity in a guinea pig model of Legionnaires' disease// i. Exp. Med. 1989- - Vol. 169. - p. 691

66. Bosshardl S- C., Benson R. F-, Fields B. S. Flagella are a positive predictor for virulence in LegionellaHMicrob. Pathog. 1997- - Vol. 23. - P. 107-112,

67. Boswell T-C. Serological cross reaction between Legionella and Campilobacter in the rapid mictwiggtatmatton lesi //J. Clin. Patho*. -1996. Vol. 49, № 7- ■ P. 584-586.

68. Brand B.C. Sadosfcy A.B., Simmon HA. The Legionella pneumophila ¡cm locus: a set of genes required for intracellular multiplication in human macrophages // Mol- Microbiol- -1994. Vol. 14. - P. 797-808.

69. Brenner D.J., Streigerwall A.G-. MeDade Classification of the Legionnaif« disease bacterium: Legionella pneumophila, genus novum, specie» new«, of the family Legiomtllaceae, familia nova U Ann, Int. Med. 1979, -Vol. 90, - P. 656-658.

70. Brindlc RJ.r Bryant T.N., Draper P.W. Taxonomtc investigation of Legionella pneumophila using monoclonal antibodies II J. Clin. Microbiol. 1989 - Vol 27. - P 536-539

71. Brindfe RJ, Nosocomial Legionnaires' disease in diagnosis and typing t! J. Hosp. Inject. -1988, JfelL-P. 196-200

72. Brindlc RJ. Stannett P.J., Toten J.Q. Legionellapneutnophilcr, monoclonal antibody typing of clinical and environmental isolates// Epidemiol. Infect. 1987. -Vol. 99, ^2.-P. 235-239.

73. Butler СЛ., Hoffoian P.S. Characterization of a major 31 -kilodalton pepti-doglycan-btHHid protein of Legionella pneumophila // J. Bacterio. 1990. -Vol, 171 -P. 2401-2407.

74. Butter C.A. Street E D , Hatch T P . Hoffman P.S. Dnnil fide-bonded outer membrane proteins in the genus Legionella // Infect tmmun. 1985. - Vol, 48. -P. 14-18.

75. Byrne В., Swim son MS. Expression of Legionella pneumophila virulence traits in response to growth conditions II Infect Immun 1998 - Vol. 66. • P. 30293034.

76. Carrillo de Albornoz M.M., Perez de Heredia J.H., Sochcz Alvares J , Tiberio Lopez G. Epidemiology of community attired pneumonia in the health arta of Navarra// Med. Clin. Bare. 1991, - Vol. 97, Jfc 2. ■ P. 50-52.

77. Chen S, Hicks L., Yuen M. et al. Serological cross-reaction between Legionella tpp. and Capnocytophaga ochracea by using latex agglutination lest H J. Clin. Microbiol, 1994. - VoJ. 32, № 12. - P. 3054-3055,

78. Cianciotlo N.P., O'Canmetl W, Daseh G-H., Mallavia L P. Detection of Mip-like sequences and Mip-related protein* within the family Rlekeitxiacwe II Cutr. Microbiol 1995. - Vol. 30. - P 149-153.

79. Cianciotto N.P., Eiscnstein B.I, Mody C.H. Engleberg N.C. A mutation in the imp gene results in an attenuation of Legionella pneumophila virulence 1/ J. Infect. Dis. 1990. - Vol, 162. - P. 121-126.

80. Cianciotlo N.P., Fields B.S- Legionella pneumophila mip gene potentiates intracellular infection of protozoa and human macrophages It Proc Natl, Acad Sci, 1992. - Vol 89- - P- 5188-5191,

81. Ciiillo JJ3., Tompkins L.S-, Falkow S. Growth of Legionella pneumophila in Acanlhamoeba caslellanii enhances invasion U Infect. Immun. 1994. - Vol. 62.-P. 3254-3261.

82. Cirillo S., Bctmudez L., El-Etr S. et aL Legionella pneumophila entry gene rtxA is involved in virulence// Infect Immun. 2001. - Vol. 69. - P. 508-517.

83. Costa J., Tiago l da Costa M, Vcrissimo A Presence and persistence of Legionella /pp. in groundwater // Appl. Environ. Microbiol, 2005- - Vol, 71. - P 663-671.

84. De Ory F., Echevarria J.M-, Pclaz C. et al. Detection of specific IgM antibody in the investigation of an outbreak of pneumonia due lo Legionella pneumo-phita serogroup I// Cltn. Microbiol. Infect. ■ 2000. Vol. 6, № 2. - P. 64-69.

85. Dc-Crcswnzo G,, Federico G Research on lg Cr and lg M anti Legionella jnteitntophila group 1 in 101 subjects with pneumonitis II Quad. Sclav«. Diagn. -1985. Vol. 21, № 4. - P. 419-423.

86. Delia F , Tort J., Morera M.A. et at. Value of bacterial antigens detection in the diagnostic yield of transthoracic needle aspinwion in severe community acquired pneumonia //Thorax. -1993, ■ VoJ. 18, № 12, P. 1237-1229,

87. Den Boer J, W„ Yaermwt P.F., Schellefcens J. et al. A large outbreak of Legionnaires' disease at a flower show, the Netherlands, 1999 H Emerg, Infect. Dis. -2001-Vol.8,№ I.-P. S-16.

88. IS, Dirven K, I even M., Peeters M. F. et al Comparison of three Legionella urinary antigen assays during an outbreak of legionellosis in Belgium UI Med. Microbiol. 2005.-Vol. 54, - P, 1213-1216.

89. Dole®» A-, Aurell l-l., ReyTolle M. et al. Cluneal and environmental distributions of Legionella itraina in France are different II J, Clin. Microbiol, 2004. -Vol. 42. - P. 458-460.

90. Dubois M., Gilles A., Hamilton IK- ct al. Cotarimetrie method for determination of sugars and related substances U Anal. Chem, 1956. - Vol. 28. № 3. - P. 350-356.

91. Hi, Clin. Mkrobwl. 1989. - Vol. 27, ¿fr IL - P 2455-2458127, Ehret W Methods and problems of Legionella diagnosis // Immun, Infect. -1989.-Vol. 17, Jfe 1. - P. 4-12.

92. Ehrci W.t Ruelcdcschel G. Membrane proteins of Legionellaeeae I Memhrane proteins of different strains and serogroups of Legionella pneumophila II Zen-trafbl. Bakieriol, Mikrobiol. Hyg. A. -1985. Vol. 259. - P. 433-445.

93. Eisenstein B.I,, Engleberg N.C. Applied molecular genetics; new tools for themicrobiologist Olid clinician fit. Infect- Dis- J9S6 ■ Vol- 153. • P 416-429,

94. Elliot J A. Johnson W. Immunological and biochemical relationship among flagella isolttled from Legionellapneumophila semigroups I, 2 and 3 H Infect Immun -1981. Vol- 33. - P, 602-610.

95. England AC., McKjnney R.M, Skalty P, Gorman G.W, A fifth serogroup of Legionella pneumophila//Am. lot, Med, • 1980. ■ Vol 93 . P. 58-59.

96. Englefccrg RC., Carter C„ Weber DJL ci al DNA sequence of mtp, a Legionella pneumophila gene associated with macrophage inactivity H Infect Immun. -1989. Vol- 57, - P. 1263-1270.

97. Englebeig N.C., Pearlmoii £., №xon l>„ EisCMtefa B l Antibodies isolated by using cloned surface antigens recognize antigenicalty related components of Legionella pneumophila and other Legionella species II J. Immunol. 1986. -Vol. I36.-P. I4J5-I417,

98. Fields B. S. Legionellas and Legionnaires disease // Manual of environmental microbiology- Washington, D.C., 1997 - Vol-1. - P. 666-675.

99. SM Fields B- S, Procedure* for the recovery of Legionella from the Mtvironmenl,vol 2, U S. Depoitmenl of Health and Human Services, Atlanta. Gn,

100. HI. Fields В S-The molecular ecology of Legionella И Trends Microbiol. 1996. -Vot, 4, - P. 286-290,

101. Fields B.S„ Benson R.F., Betoer R.E. Legirmdla and legionnaires disease: 25 years of mvesligaiion it Clin. Microbiol. Rev. 2002. - Vol. 15. - P. 506-526.

102. Fischer G, Bang Ft. Ludwig B. ct at. Mlp protein of Legionella pneumophila exhibits peptidyl-prolyl ci^rans isomcrase (PPI-ase) activity II Mol. Microbiol. -1992. -Vot. 6.-P. 1375-1183.

103. Flesher A.R-, Ito S„ Manshcim BJ., Kaspcr D.L. The cell envelope of Legionnaires" diseoie bacterium: ttuwpholo&ic and biochemical cbaracleristics // Ann Int. Med. t979. - Vol. 90, ■ P. 628-630.

104. Flesher A.R. Jennings 11J . Ludowski C., Kaspcr D.L. Isolation of a scrogroup 1 • specific antigen inm Legionella pneumophila IIУ Infect. Dis. 1982, - Vol. 145,№2,-P. 224-233.

105. Fliemtans C.B., Cherry W.B. Orrison L. et al. Ecological distribution of gionella pneumophila II Appl, Environ. Microbiol, 1981 ■ Vol 41 - P. 9-16.

106. Formica N. Vales M. Beers M. ei at. The impact of diagnosis by Legionella urinary antigen test on the epidemiology and outcomes of legionnaires' disease li Epidemiol. Infect 2001 - Vol, 27, 2. ■ P, 275-280.

107. Fotos P.O. Westfall H.N„ Snyder I S. ct al. Prevalence of Legionella specific IgG and IgM antibody in a dental clinic population II J. Dental- Res. ■1985 -Vol64,> 12.-P. 1382-1385.

108. Fox K.F. Brown A. Properties of the genus Ttrtlockie. Difierennaijon of Tailoekia (Legionella) moceochernii and mtcdadei from each other and from other Legionella /I Can, J, Microbiol 1993. - Vol. 39. - P. 486-491

109. Foy H.M- Legionnaires disease in the prepaid medical care group in Seattle < 1963-1975) II Lancet. -1979. Vol. I - P, 767-770.

110. Franzin L-, ScrammuKEa F. Prevalence of Legionella pneumophila serogroup 1 antibodies in blood donor// Eur. J- Epidemiol. • 1995- Vol- I lt№ 4. - P 475478,

111. Fraser D.W., Tsai T.R., Orenstctn W. « al. Legionnaires disease; description of an epidemic of pneumonia H N. Engl. J. Med, 1977. - Vol, 297, • P. 11891197,

112. Gabay 3-Е., Blake M, Nilcs W.D.r Korwitz M.A. Purification of Ij*gi(mrlia pneumophila major outer membrane protein and demonstration that и b а роли Hi. ftaclerioi, ■ 1985- Vol, 162, - P, 85-91.

113. Gao L Y., Abu Kwaik Y Apoptosis in macrophages and alveolar epithelial cells during early stages of infection by Legionella pneumophila and its role in cytopathogenieity H Infect Immun. -1999. VoL67. - P. 862-870.

114. Goo L.Y., Ab« Kwaik Y, The mechunism of kilting and exiting the protozoan host Acamltamoeba ¡yolyphago by Legionella ptieumophila H Environ. Microbiol. 2000. - Vol, 2.-P. 79-90.

115. Gao L.Y , Harb, O.S. Abu Kwaik Y. Utilization of similar mechanisms by Legionella pneumophila to parasi«« two evolutionarily distant host cells, mammalian macrophages and protozoa U Infect. Immun. ■ 1997 Vol, 65, - P 4738-4746.

116. Gareia-Fulgueir» A-, Navarro C„ Fenoíl D. et al- Legionnaires disease ow-break in Murcia, Spain // Emerg, lnf«t. Dis, 2003. - Vol. 9, - P, 915-921.

117. Garduño R.A., Faulkner G., Trevors M.A- et al. Immunolocaliiation of Hsp60 in Legionella pneumophila Hi. BacterioL 1998. - Vol. 180. - P. 505-513.

118. Garduño R A , Garduno E., Hoffman P.S. Surface-associated Hsp60 chaperöflin of Legionella pneumophila mediates invasion in a Hetji cell model // Infect Immun, 1998. ■ Vol- 66. - P. 4602-4610.

119. Gamty G.M., Brown A , Vickeis R,M. Tailockia and h'luoribacler: two newgenera of organisms resembling Legionella pneumophila ¡1 In1 J. Syst. Bactc-rioL-1980.-VoL 30, ■ P 609*614.

120. Gordon AJi, I^Arcy Hart P., Young. M.R. Ammonia inhibits phagosome-ysosonw fusion in macrophages// Nature.- 1980. Vol. 286.- P. 79-80.

121. Gosling L.H., Cabrian K , Siurge J.C., finldsiesn L.C. Identification of a specie*-specific antigen in Legfondfapneumophila by a monoclonal antibody // J. din. Microbiol. 1984. - Vol, 20. - P. (031-1035.

122. Gump D.W., Keegan M. Pulmonary infections due to Legionella in immunocompromised paliems // Sem in. Rcspir. Infect. 1986. - Vol.1, Jfe 3- - P- 151159.

123. Hagele S., Hacker J,, Brand B.C Legionella pneumophila kills human phagocytes but ikX protozoan best cells by inducing apoptotic cell deaih // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - Vol. 169. - P Sl-58.

124. Hammer BJC. Swanjon MS, Co-ordination of Legionella pneumophila virulence with amy into stationary phase by ppGpp // Mol. Microbiol. 1999. -VoJ. 33.-P. 721-731

125. Hancock R.Ë.W., Mikado H. Outer membranes of gram-negative bacteria- XIX. Isolalion From Pseudomonas aeruginosa PAOI und use in reconstitution and definition of the permeability barrier//I- Bacterio!. ■ 1978, Vol. 136. - P. 381390.

126. Harnldsson A., Rechnitzer C. Friis-Moller A., Dricm H. Prevalence of IgM anybodies to nine Legionella species in Icelandic children // Sctmd, J. Infect Dis, -1090 Vol. 22>№t,- P. 115-119.

127. Harrison T.C., Doumon E. Taylor Л-С. Evaluation of seraittvicy of two serological tests for diagnosing pneumonia caused by Legionella pneumophila ж-togroop I //J, Clin, Pathol -1987, Vol, 10, Mr I. - P. 77-82,

128. Hebert ОЛ- Hippurale hydrolysis by Legionella pneumophila. // J, Clin. Microbiol 1981. - Vol-13- - P 240-242

129. Helbig J.H., Lück P.C. Kntrd Y. A. el nl. Molecular characterization of a viru-letKC-Bssociatcd epitope on tlie lipo polysaccharide of Legionella pneumophila scrogroup I II Epidemiol, Infect. 1995. - Vol. 115, - P. 71-78,

130. Helbig J II, Ludwig В., Lílck P C et al Monoclonal antibodies to Legionella Mip proteins recognize genus- and species-specific epitopes II Clin Diagn Lab, Immunol 1995, - Vol. 2. - P, 160-165,

131. Helbig J Л, Lflck P.C., Jacobs E., Witt M. Localization of Legionella pneumophila Mip protein inside phagosomes of Aeamhamoeba cajtelanii 11 Legionella;5th Intern. Conf. on Legionella. Washington: «ASM Press». 2002. - P 49-51,

132. Helbig J H. Ladt P.C., Pilz C. Witxleb W Common epitope on urinary antigen derived from different Legionella pneumophila serogroup 1 strains recognized by a monoclonal antibody // Int. i, Med. Microbiol. -1990. Vol. 273, Kt 4. - P, 473-480.

133. Helbig J.H„ Lftcfc P.C., PÍU C., Wiulcto W. Determination of Legionella antigens using monoclonal antibodies It Z, Gesamte. Hyg. 1991. - Vol. 37. - P 87-89.

134. Helbig Ш. Lftck P.C., Witzteb W. Diagnosis of Legi,mella рптамрШа by detection of antigenuria using an enzymimmunoossay with 6 antibody specificities H 2, Oesarme, Hyg. -19*9. Vol. 35. Jfc 10. - P. 591-593.

135. Heltbcrg t , Jepscn O B , Larsen S.O., Lind K. Scrocpidemiologocal study of Legionella infection in Denmark. A 28-mo«lh retrospective survey U Dan-Med. Bull- -1988. Vol. 35, № 1, - P 95-98.

136. Heuner K-, Steinen M., Dietrich С. et ¿I- Function and expression of Legionella pneumophila surface factors H Legionella; 5th Intern, Conf. on Legionella. -Washington: «ASM Press«, 2002. p. 43-48,

137. Heuner К , Bender-Beek L, Brand B.C. et al. Cloning and genetic eliaractcrlza-tion of the flagellum subunii gene (flnA ) of Legionella /meumophila serogroup I tt Infect. Immun, 1995, - Vol. 63, - P. 2499-2507.

138. Heuner K, Hacker J,, Brand B.C. The alternative sigma factor sigma2S of Legionella pnetjmofihila restores nagellotion and motility to an Escherichia coli fliA mutant //1. Bacterio!. 1997, - Vol. 179. - P. 17-23,

139. Htggtttt C-F. The ABC of channel regulation H Cell. (995. - Vol, 81 - P. 693696,

140. Hindahl M.S., Jglewsfci B.H. Isolation and characterization of the Legionella pneumophila outer membrane ft I- Bacterial. -1984. Vol, 159, № L - P. 107113,

141. Hindahl M-S,, Iglewski B.H, Outer membrane prolem from Legionella pneumophila scrogroups and other Uglonella species И Enfect. Immun 1986.1. Vol. 51, Jfe L-P 94-101

142. Hitchcock PJ.r Brov.n T.M. Morphologocal heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemoiypes in wlvcr-siamcd Polyacrylamid gib It I. Bactc-fiol. -1983. Vol. 154. - P. 269-277.

143. Hoffman P.S,, Butler CA., Quinn F.D. Cloningnnd tcin pe raiure-de pen dent expression m Escherichia «fi oí a Lcgiuneffn pneumophila gene coding fw a genus-common 60-ktlodaUon antigen It Infect. Immun. ■ 1989. Vol. 57r - P 1731-1739.

144. Hoffman P S„ Ripley M. Weeratnn R Cloning and nucleoide sequence of a gene (oflipS) encoding the major outer membrane proietn of Legionella pneumophila NJ. Bacterio!. 1992. Vol. 174. - P. 914-920.

145. Holliday M.G. Latex agglutination test for Legionella antibodies /I Lancet -1986.-Vol. 16.№2.-P. 465-466.

146. Jemigan D.B., Hofmaim J., Cetron M.S. et al. Outbreak of Legionnaires" disease among cruise stop passengers exposed to a contaminated whirlpool spa I/ Lancd. -1996. Vol. 24. - P. 494-499,

147. Jibtki K., Nakaimura S , Ooi S. el al. Detection of urinary' Legionella antigen by radioimmunoassay. I. Method and basic studies H Kansenshogaku, ¿osshi -19*5.-Vol. 59. t-S,

148. Johnson W. Elliott JA., Helms C-M, Refiner E.D A high molecular weight in the Legionnaires disease bacterium: isolation and partial characterisation II Ann. Int. Med. 1979, - Vol. 90. - P 638-641.

149. Johnson W.T Pesanti E. Elliott J.A, Scrospeeiftdfy and opsonic activity of an-tisem to Ugioneiia pneumophila ft Infect, fromun 1979. - Vol. 26- - P. 698704.

150. Joly J.R ► McKmncy R,M,, Tobin J. et al. Devclopmenl of в standardized sub-grouping scheme for Legionella pneumophila serogroup 1 using monoclonal antibodies //J. Clin. Microdot. -1986 Vol, 23. - P- 768-771.

151. Joseph C.A., Wesson J.M. Harrison T.G.t Bartlett C.L.R. Nosocomial Legionnaires' disease in England and Ш*. 1980-1992II Epidemiol Infect -1992. -Vol. 112. P. 329-345.

152. Junge-Mathys E, Mathys W. Legionellosis—an example of environmentally caused infections it tmenstv 1994. - Vol, 2. • P. 29-33,

153. Katx S.M., Hammel J.M. The effect of drying, heal, and p| . on the survival of LegionellapneumophilaH Ann. Clin. Lob, Sei, 198? - VoL 17, - P. 150-156.

154. Keen M.G., Hoffman P,S. Characterization of a Legionella pneumophila extracellular protease exhibiting hemolytic and cytotoxic activities It Infect tm-mun. -1989. • Vol. 57, P 732-738,

155. Knirel Y A. Moll H., Zahringcr U Structural study of a highly Q-aceiylawd core of Legionella pneumophila setogroup 1 lipo polysaccharide // Carbohydf-Res -1996. Vol, 293. - P.223-234.

156. KniTel Y-A-, Rieteebel E.T., Mar« R., Zahringer U. The slracturc of the O-specifpc chain of Legionella pneumophila scrogroup I lipopolysaccharvde // Eur, I Bioch. -1994, Vol 221 - p. 239-245.

157. Ко К.S , Hong S.K-t Ьее 11 К . et al. Molecular evolution of Iii« doiA gene in Legtonella pneumophila II i. Bacterid. 2003. - Vo4-185,-P. 6269-62TJ,

158. Köhler R.B, Antigen detection for the rapid diagnosis of Mieopiasma and Legionella pneumophila II Diagn. Microbiol. Infect- Dis. 1986. - Vol 4. - P 47S-S9S.

159. Köhler R.B,, Zimmermann Sli , Wilson E. ct a I Rapid radioimmunoassay diagnosis of Legionnaires disease, detection and partial characterization of urinary' antigen// Ann. Int. Med. -1981. « Vol. 94. P. 601-605.

160. Koide M. Higa F., Arakaki N , Saito A isolation of Legionella longbeachac and Legionella ipp from Japanese potting soll» // Legtonella: 5th Intern. Conf. on Legionella. Washington: «ASM Press». 2002. - P. 356-359.

161. KooiïtrB О., Herfurth L„ Lüne berg E. et al. Epitope mapping of die O-chain polysaccharide of Lesione!¡a pneumophila serogroup I tipopofysaecharidc by saturation-tnmsfer-di FTereiwx NMR spectroscopy H Eur. J. Bîochem. 2002. -Vol- 269 - P 5*73-582.

162. Kronwal I G A rapid slide-agglutination method for typing pncumococci by means of specific antibody absorbed to protein A containing staphylococci H J, Med. Microbiol. 1973. - Vol.6. - P.I358-1361.

163. KuritAy J.N. Sporadic Legionelíosij in (be United States, 1970 to 1982 // Legionella: Proc. of the 2nd Intern. Svmpos. Washington, D.C., 1988. - P.243-245.

164. Kusnetsov J„ Tiittanen M , Méntula S„ Jousintiea-Somer Ii Hot water systems with low concentrations of l^egtortelloe may be n risk on cruise ships H Legionella 5th Intern. Conf on Legionella. ■ Washington: «ASM Presa», 2002, -P. 349-352.

165. Lebrun L., Tram C-, d Azambuja S., Pillol J. Immunofluorescence characterization of Legionella, narrow specificity of polyclonal imnnnvosera to various se-rogroups and species ¡i Acta Microbiol. Hung, 1986. - Vol. 33, № I. - P. 4349.

166. Legionella 2003; An update and statement by the association of water technologies. USA, 2003. - 33 p.

167. Legionnaires' disease associated with a whirlpool spa display U MMWR. -1997. Vol. 46 - P, 83-86

168. Legionnaires discase in Europe, 1996 // Weekly Epidemiol. Ret ■ 1997. VoL 72. - P. 253-257,

169. Legmimaires" disease in Europe, 1997 fl Weekly Epidemiol, Rec 1998. - Vol 73- - P. 257-261.

170. Legionnaires' disease in Europe, 1998 H Weekly Epidemiol. Rec 1999. - Vol.74. P 273-280.

171. Legionnaires' disease in Europe. 1999// Weekly Epidemiol. Rec, 2000- - Vol,75, P. 347-352.

172. Leland D.S„ KMiler R.B. Evaluation of the L-CLONE Legionella pneumophila serogroup 1 urine antigen latex lest 1/ 3. Clin. Microbiol 1991 - Vol. 29, ife 10. -P. 2220-2223.

173. Lena M .W ., Brown A, Legionella pneumophila has two 60-kilodalion heat-shock proteins It Cuir. Microbiol. 1995. - Vol. 31. - P. 332-335.

174. Letna M.W., Brown A., Butter C-A,, Hoffman P S Hcat-slh>ck response in Legionella pneumophila it Can. J. Microbiol, 1988. - Vol. 34. - P. 1148-1153.

175. Letlinga K.D. Vcriwn A-, Wealing G. et al. Legionnaires' disease al a Dinch flower show; prognostic factors and impact of therapy // Emerg. Infect. Dis. -2002,-VoL 8,^12.

176. Lilcs M.R., Edelstcin P.H., Cianeiouo N.P. The prepilin peptidase is required for protein secretion by and the vnulcnce of (lie intracellular pathogen Legionella pneumophila /1 Mol Microbiol -1999. Vol. 31. - P, 959-970.

177. Lit« M R , Viswanalhan V. K, CiancioHO KP. Identification and temperature regulation o( Legionella pneumophila genes involved in type IV pi lus biogenesis and type II protein secretion // Infect, mntun, 1998 - Vol. 66. - P. 17761782.

178. Lowiy O H , Rosebrough N.G, Farr A.L. Bandal RJ. Protein measurement with the Folin phenol «agent // J. Btol, Chem. ■ 1931. Vol 193, № I . - P 265-275.

179. Luck P.C,, Helbig J.H., Pilz C„ Wtlzleb W Detection at Legionellas in clinical samples using FlTC-marked antibodies H Z. Gesamte. Hyg, 1989. - Vol. 35. -P. 601-604.

180. Ludwig B., Rahfcld J , Schmidt B et al. Characterization of Mip proteins of1.gionella pneumophila >1 PEWS Microbiol. Lett. 1994. - Vol. US. - P, 2330.

181. Ludwig B-. Schrctid R-, Manx R, Hacker I. Cloning, gcnctic analysis, and nucleotide sequence of a determinant coding for a 19-kilidahon peptidoglycan-associoted protein (Ppl) of Legionella pneumophila H InfecL Immun 1991. -Vol.59-P25li.252l.

182. Lflneberg E.P Zahringer U-, Knirel Y.A. et at. Phase-variable expression of Iipopolysncc hantJc contributes (o the virulence of Legionella pneumophila 11 J. Exp. Med, -1998. Vol. 188 - P, 49-60,

183. LOneberg E , Zctzmann N . Albcr D, el al. Cloning and functional characterization of a 30 Vb gene locus required for lipopolysucchoride biosynthesis in Legionella pneumophila it bit J. Med. Microbiol. 2000, - Vol. 290. - P. 37-49.

184. Maiwnld M,, Helbig J.H., l.uck P.C Laboratory methods for the diagnosis of Isgkmetia infections II J. Microbiol Methods -199». Vol. 33. • P. 59-79.

185. Marra A-, Blander SJ„ Borwitz M.A. Shuman H,A- Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages// Proc. Natl, Acad. Sci. -1992. Vol. 89. - P. 9607-9611.

186. Manic TJ , George J , Macdonald S. Haasc D. Are health care workers ■< risk for infection during an outbreak of nosocomial Legionnaire»' diseases? // Am. J. Infect. Control. 1986. - Vol. 14. /fe 5. - P. 209-213.

187. Marston BJ-, Lipman I1B, Breimon R.F. Surveillance for Legionnaires* disease, Risk factors for morbidity and mortality II Arch, Intern Med. 1994, -VoL 154. - P. 2417-2422.

188. Mayberry W.R. Dthydroxy and monohydroxy fatty acid in Legionella pneumophila II J. Bacterid, 1981. - Vol. 147. - P. 373-381.

189. Maztcn N.A, De Oodoy C-V. Legionellosis associaied with pneumopathies tn San Paulo. Study of the etiologic conllTmation and serology // Rev. Inst Med. Trop, San Paulo, -1993. Vol- 35, Jft |. - P 1-tO.

190. McDade J.E. Legionnaires' disease 25 years Inter: lessons learned II Legionella: 5th Intern. Conf. on Legionella ■ Washington; «ASM Press», 2002. P. -10.

191. McDade J.E , Shepard C.C, Eraser D. W. et al Legionnaires disease, isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease // N, Engl, J. Med, 1977.- Vol- 297. - P. 1197-1203,

192. Mclniyre M„ Kuitz J.B., Seiko« J-B- Prevalence of antibody to 15 antigens of Leglonellaeeae in patients with community acquired pneumonia II Epidemiol Infect. -1990, Vol, 104, № 1. - P. 39-45.

193. Merriam JJ„ Mathur R, Maxfield-Boumil R„ Isberg R. Analysis of the Legionella pneumophila flit gene: intracellular growth of defined mutant defective for flageUum biosynthesis II Infect. Immun. 1997. - Vol. 65. - P. 24972501.

194. Miyazaka T„ Nakashima M , Kono 5. et al Enzime-linkcd immunosorbent assay (ELISA) for Legionellapneumophila using outer membrane protein II Kan-senshogaku Zasshi. -1986. Vol. 60. to 5. - P, 443-452.

195. Mo Y.Y., Cianciotto N.P. Mai avia L.P. Molecular cloning of a Coxidla burnetii gene encoding a macrophage infectivity potentiaior (Mip) analogue II Microbiology 1995. - Vol. Ml. - P, 2SÖJ-2S71,

196. Mo«anaio-Pun2engnibcr J.C., Hicks L., Meyer W, Gitberl G.L, Australian isolates of Ixgtonella longbeachae are not a clonal population H J. Clin. Microbiol. -1999. Vol- 37. - P. 3249-3254.

197. Moore N. Gentile D- Evaluation of a rapid immunchromatogniphic assay for detection of Legionella pneumophila in urine U Legionella: 5th Intern. Conf, on Legionella. Washington «ASM Piess»,2002. - P. 211-213.

198. Morimolo T, Enzime-linked immunosorbent assay (ELISA) for Legionella pneumophila using 60 kD protein antigen H Kansenshogaku Zasshi. ■ 1990. -Vol-64,to It,-P. 1454-1461.

199. Morimoto T. Serum antibodies to Legionella pneumophila by indirect immwofluörescem antibody te« in 269 hemodialysis paticnLs and 153 healthy subjects ft Rinsho, Byori, -1991, • Vol, 39.3ft I. P. 71-75.

200. Moro A„ Ruiz-t'abello F., Femandez-Cano A. et of Secretion by Trypanosoma cnai of a peptidyl-prolyl cis-trans isomcrase involved in cell infection It EMBQ J. 1995. - Vol. 14. - P. 2483-2490.

201. Moss C,W„ Weaker RE., Dees S.B,, Cheny W.B. Cellular fatty acid composition of isolates from Legionnaires' disease It I. Clin. Microbiol. 1977- - Vol. 6. - P. 140-143.

202. Murga R., Foretcr T,S- Brown E- et al, The role of biofilms in the survival of ¡¿rgionetta fmeumophila in a model potable water system It Microbiology -2001. VoL 147. - P. 3121-3126.

203. Nadarajah M., Singam S, lalil HA. Sero-survey foe LegirmeHa pneumophila antibodies • Singapore experience It Ann. Acad. Med- Singapore, -1987- Vol, 16, As 4,-P. 583-585.

204. Nagai H., Roy C R. The DotA protein from Legionella pneumophila is secreted by a novel process thai requires ihe Doblcm transporter II EMBO i. 2001. -Vol. 20. - P. 5962-5970.

205. Neumeister B.„ Faiglc M., Sommer M. et al. Low endoioxic potential of Legionella pneumophila lipopolysaccharide due to failure of interaction with ihe monocyte lipopolysaccharide receptor CD! 4 If Infect. Immun. 1998. - Vol. 66.-P 4ISM157.

206. Neumeister B„ Susa M., Nowak B, et al. Enzim immunoassay for detection of antibodies against isolated flagella Legionella pneumophila /1 Eur. J. Clin, Microbiol, Infect. Dis-- 1995. Vol, 14, Hi9, - P. 764-767.

207. Newhall WJ., Jones R.B, Disulfide-linked oligomers of the major outer membrane protein ofchtamydiae Hi. Bacteriol. 1983, - Vol. 154 - P, 998-1001,

208. Nguyen T., Matsiota-Bemard P, Nauctel C. Evaluation of an ELISA technique for the scrodiagnosis of Legionnarircs disease H Pathol. Biol, Paris. 1995- -Vol. 43, A 5. -P. 407-410,

209. Otten S., Iyer S., Johnson W., Montgomery R. Serospecific antigens of £«-ghnellapneumophila 111- Bacteriol. -1986. • Vol. 167. P. 893-904.

210. Outbreak of Legioimnires" disease among automotive plant workers Ohio, 24)01 If MMWR. - 2001. - Vol. 50. - № 18

211. P&sctial M.F. Ronveaux O., De Schrijver K. Von Loock F. Lcgioneltotis outbreak at a commercial fair in Kapellcn, Belgium. 1999; a case-control study // Legionella; 5th Intern Conf. on Legionella. Washington: «ASM Press», 2002. -P. 342-345.

212. Pay C.P. Pltkavtis B. B, Carton* G.M-, Warner I.M. Purification, partial characterization and sen)reactivity of a genuswide 60-kitodahon Legionella protein antigen 1/1. Clin. Microbiol. 1988. - Vol. 26. - P, 67-71.

213. Payne N. R , Horwiiz M. A. Phagocytosis of Legionella pneumophila is mediated by human monocyte complement receptors H J. Exp. Med. 1987. • Vol. 166.-P. 1377-1389,

214. Pearlman EL, Engleberg N.C , Eisenstein L Identification of protein antigens of Legionella pneumophila serogroup I II Infect Immun. 1985. - Vol. 47. - P. 74-79.

215. Percira Comes J-C-, Mazieri NA, De Godoy C.V, Roeha A. Legionella pneumophila associated with acute respiratory insufficiency- 1-st isolation in Brazil 11 Rev. Inst Med Trap. San Paulo. 1989. - VoL 31, № 6 - P 368-376,

216. Petitjean F-, Guillet J.G-, Vray B, et al. Partial characterization of a Legionella pneumophila serogroup I immunodominant antigenic determinant recognized by a monoclonal antibody )t Comp Immun. Microbiol. InfccL Dis. 1987. -Vol, 10, - P. 9-23.

217. Phakkey A„ Lfcndqvist KJ,, Omland T„ Berdal B P. I^gktnella antibodies in human and animal populations in Kenya H APMtS, 1990, - Vol- 98, Jfc 1. - P43.49.

218. Plikaylis B.B. Cartone G.M. Pay C P„ Wilkinson H.W. Purified 60-kilodalton ¡Legionella protein antigen with LesioMcrtci-speciftc a^d noflspetiik epitopes II J. ctin. Microbiol. 1987. - Vol, 25- - P, 2080-2084.

219. Ploufle J.F., File T-M. Brermon R.F. el al. Recvaluation of die difinition of Legionnaires disease; use of the urinary antigen assay. Community based pneumonia incidence study group it Clin. Infect Dis. 1995. - Vol. 20, Jft 5. - P. 1286-1291.

220. Pringle? N„ Brydov P„ Uldum S.A. Occurrence of Legionella in Danish hot water systems // Legionella: 5th Intern. Conf- on Legionella. Washington: «ASM Press», 2002- - P. 298-301.

221. Pruckfer J. M., Benson R. F„ Moyenuddin M et at. Association of flagcllum expression and intracellular growth of Leguinella pneumophila It Infect- Im-muji 1995, - Vol. 63. - P. 4928-4932.

222. Rahman M., Sack D A ., Wadood A. el al Rapid identification of Vibrio chot-eroe serotype 01 from primary isolation plates by coaggl illation lest // J. Med. Microbiol. -1989. -Vol, 28.Hi I. P.39-41.

223. Ramirez J A., Sutnmersgill J.T. Rapid tests Tor the diagnosis of Legionella infections 111. Med Assoc. -1994, Vol. 92, Mi 2- - P. 62-65.

224. Ratcliff R-M., Donnelian S.C., Lanser 1A. et al Interspecies sequence differences in the Mip protein from the genus Leglottella: implications for function and evolutionary relaledness it Mol. Biol. -1997. Vol. 25. - P-1149-1158

225. RatcliffR.M., Lanser J.A., Manning P.A., Keuzenrocdcr M.W, Scquence-based classification scheme for the genus Legionella targeting ihe mip gene // J. Clin. MictoWol. I99S. - Vol, 36. - P, 1560-1567.

226. Ratshikhopha M l: , Klugman K P-, Koomhof H J. .An evaluation of two indirect fluorescent antibody tests for the diagnosis of Legionnaires diseases in South Africa // S. Afr. Med. J. 1990. - Vol. 77, № 8. - P. 392-395.

227. Reinthatcr F., Masehet F„ Sturaner D. Ugwnella pneumophila: seroepidenii-ologic studies of demist ond dental personnel in Austria It Zemralbl Baktcriol

228. Mikrobtot. Hyg. В. 1987. - Vol. 185, № 1-2.• P. 164-170.302, Ren thai er F.F., Mischer F„ Summer D. Serological examinations for antibodies against Legionella species in dental personnel it J. Den Res. 1988- - Vol. 67, № 6. - P. 942-943.

229. Rigby E.W„ l'louffe JF, Hacfcman В-Л. et al. Stability of Legionella urinary antigens over time// Diag. Microbiol. Infect. Dis. -1997. Vol, 28, № I. - P l-3.

230. Rodgers F.G., Greaves P W, Macrae A,D. Flagella and fimbriae on Legionella organtuna//Lancet- -1979, P, 753-754.

231. Rogers J. Dowsett A.B., Keevil C,W. A paint incorporating silver to controlmixed bio films containing Legbnefía pneumophila ИJ. Ind. Microbiol. 1995 -Vol. 15-P. 377-383.

232. Rogers J., Keevil C.W. mmunogold and fluorescein immunoleieling of Legionella pneumophila within an aquatic biofilm visualized by using episcopic differential interference contrast microscopy II Appl Environ. Microbiol. -1992 Vol, 58 - P. 2326-2330.

233. Rolf M. A study of Legionnaires' disease in Zambia II Ann. Trap Med Parasi-toL -1986. Vol. 80. St 3. - P. 325-328,

234. Romano FRibera G-, D' Errico M M. ct at, Level of onti-Legionella antibodies in a heallhy Neapolitan popululion II Ann. Ig, 1989. - Vol. 1, Ж 3-4. - P. 629636.

235. Roscnfeld M.E , Edclstcin P.H. Retrospective evolution of the DuPont radioimmunoassay kit for detection of Legionella pneumophila serogroup I anti-genuria in human fl I. Clin. Microbiol. 198«. - Vol- 26, № 9. P, 1775-1778,

236. Rosser O., F.delstein PH-, CiamcioUo N.P- Role of the II protein secretion pathway in pathogenesis of Legionella pneumophila II Legionella: 5th Intern. Conf. on Legionella. Washington: «ASM Press», 2002. - P. 13-17.

237. Rowbotham TJ. Current views on the relationships between amoebae, Ic-gioncllae and man It tsr. J. Med. Set. -1986. Vol. 22. - P. 678-689.

238. Rowbotham TJ. Legmnella-ltke amocbal pathogens tt Legionella: current status and emerging perspectives. Washington, D.C , 1993, - P, 137-140.

239. J2J. Roy C.R., Isbcrg R.R- Topology of Legionella pneumophila DotA: an inner membrane protein required for replication in macrophages // Infect, Immun. -1997.-Vol.65.-P. 571-578.

240. Ruf B, Scbunnann D., Borboch I et iL The incidence of Legionella pneumophila: a 1-ycar prospective study in a large community hospital // Lung. ■ 1989. -Vol. 167,№ I.-P. 11-22.

241. Ruf B , Schurmann D, Pohle H.D. Fatal Legionella pneumonia: retrospective cxamation of lung tissue direct and indirect fluorescent antibody methods II Zentralbl, Bakteriol. Mikrobtol, Hyg. A. 1987. - Vol. 266. - P. 443-448.

242. Salmcy Nr N , Summcrsgil J.T, Ramires J A. Miller R-D. Inhibition of oxidative burst and chcmotaxis in human phagocytes by Legionella {.mnimonia. jrmc mctaHoproteasetfJ, Med. Microbiol 2001 - Vol. 50. - P 517-525.

243. Sampson I, A. Prevalence of antibody to Legionella pneumophila in aborigine* and non aborigines in Western Australia // Med- J. Aus 1988. • Vol- 148. Jfc L-P. 16-19.

244. Sampson J-S„ O'Connor S.P. HoJloway B,p, et al. Nucleotide sequence of htpB, the Legionella pneumophila gene encoding 58-kilodallon (kDa) common antigen, formerly designated the 60-kDa common antigen It Infect. Immun. -1990. Vol. 58. - P. 3154-3157.

245. Sampson J.S., Plikaytis B.B. Aloisio C. et al. Immunologic characterization and specificity of three monoclonal antibodies against the 58-kilodation prole m of Ugiofu-llopneumophila 1/). Clin. Microbiol. 1991, - Vol 29 - P 836-841.

246. Sandkvist M. Type II Secretion and Pathogenesis U Infect lmmun. 2001. -Vol 69. - P 3523-3535.

247. Schramck S J., Kaznr J » Bm»vsJia S. Lipid A in Legionella pneumophila II

248. ZemL Bukt Parasit, Infekt, Hyg. 1982. - Vol. 252- - P. 401-404.

249. Schuimann D, Ruf B. Fehrenbach FJ. et al, Falal Legionnaircs pneumonia: frequeney of legäoncllosis in auuipsied patients with pneumonia from 1969 to 1985 HL Pathol -198® Vol. 155. - P.35-39,

250. Segal G-, Pweell M, Shuman H.A. Host ccll killing and baüerial conjugation Tequire overtnpping sets of genes with in a 22-kb region of die ¡.egtomila pneumophilagenome//Proe. Mall. Acad- Sei. 1998. - Vol. 95. - P. 16690 674,

251. Segal G. Shuman RA, GerteUc analysis of Unioneila pneumophila imracellu-lar ntulljplkation in human and protozoon ho»! // l.egioneJln: Sth Intern. Conf. on Lcgionella. Washington: «ASM Press», 2002. - P. 90-96.

252. Sprtsin S.V., Drobishevskaya B.J, Barkhatova O.I. et al. Induction of the immune response to Legionella pneumophila cytolysin by monoclonal antiidiotype antibodies HI- Immunol. -1991 Vol. 147. - P. 2QQb2005.

253. Stainmentz Í., Rheinheimer C., Bitter-Suermann D. Rapid identification of Lo gionelto by colony dlot assay based on a genus-specific monoclonal antibody I/ I. Clin. Microbiol. • 1992, Vol. 30, Hi 4. - P, 1016-1018.

254. Steele T. W Légionnaires' disease in South Australia. 1979-1988 It Med. J. Aust. 1989. - Vol. 151, - P, 322-328.

255. Steele T W, Moore C,V, Songster N. Distribution of Legionella Itmgheachae serogroup t and other Legionella in potting soils tn Australia tl Apfrf. Environ. Microbiol. 1990. - Vol. 156. - P. 29S4-298S.

256. Steinen M„ Lngelharg H-. Flugel M et ul- The Lfy protein protects Legionella pneumophila from light but does not directly influence its intracellular survival in HartmaitnclEa vermiformis Л1 Appl- Environ. Microbiol, 1995. - Vol, 61. - P 2428-2430.

257. Steinmetz L, Rheinheimer C., Bitter-Suermann D, Genus-spccific epitope on the 60-kilodaltoti antigen Legionella heat shock protein tccogmzed by mooo-ctonaJ antibody It J. Clin, Microbiol, -1991, Vol, 29. - P. 346-354.

258. Steinmetz L, Rheinheimer C , Bittcr-Suemvann D. Rapid identification of Le-gtonellae by a colony blot assay based on a genus-specific monoclonal antibody //1. Clin. Microbiol- -1992, Vol. 30. - P. 1016-10 \ 8

259. Stone BJ., Abu Kwatk V. Expression of multiple pili by Legionella pneumophila. identification and characterization of ï type IV piiiri gene and its role in adherence to mammalian and protozoan cells // Infect. Immun. 1998 - Vol, 66 -P 176*-1775.

260. Stone В J,, Abu К walk Y. Naiural competence for DNA transformation by Legionefla pneumophila and Ha association Willi expression of type IV pili // J. Bacteriol 1999. - Vol, 181 - P, - 1395-1402.

261. Susa M., Hacker J., Man* R De novo synthesis of Legionella pneumophila antigens during intracellular growth in phagocytic cells// Infect, Immun ■ 1996. -Vol 64.-1679-16*4.

262. Sw'anson M.S., Bachman M A The Legionella pneumophila life cycle; connections between growth phase, virulence expression, and replication vacuole biogenesis 1/ Legionella 5th Intern. Conf. on Legionella. Washington: «ASM iWt,2Q02.-P- 74-81.

263. Svranson M.S., Hammer B.K, Legionella pneumophila pathogenesis: a fateful journey from amoebae to macrophages U Annu. Rev. Microbiol. 2000. - Vol. 54, - P. 567-613.

264. S/cto L.r Sliuman M A The Legionella pneumophila major secretory protein, a protease, is not requires for intracellular grows or eel I killing U Infect. Immun, -1990, Vol. 58. - P. 2585-2592,

265. Taflg P-W. Toma S., Rajkumar W,D. Pctcction of urinary antigen of Legionella pneumophila scrogroup 12 by broad spectrum cnzim-linked immu-noMMbcnt assay II J. Clin. Mkrotooi -1989, Vo4.27, № 4, - P. 783-784,

266. Tat lock H. A Ricketlsia-like organism recovered from guinea pigs // Proc, Soc. Exp. Biol. Med. 1944. - Vol. 57. - P. 95-99.

267. Tcmperanza A.M , Di-Capuo A-, Ckttotttf S. et al. Mote experience on the mtcroagglutination test in the diagnosis of the Legionella pneumophila infection U Microbiologies 1986. - Vol - 9. № I . - P 71-79,

268. Thomason B,M , Chntdhf P.W., Hellis DG. Flagell* on Legionnaires diseasebacteria: an interim repon 11 Ann. Int. Med. 1979- • Vol. 91- - P. 22-1-226.

269. Van Alpen L , Riemens T., Poolrnm J. Zanen H C. Characteristics of major outer membrane proteins of Haemophilus influenzae H J. Bacterio!. 1983. -Vol. ISS. - P. 878-885.

270. Vertstreate D,R., Creasy M-T„ Caveney N,T. et al. Outer membrane proteins of Brucella abortus, isolation and channcterbjition. //Infect. Immun, -1982. Vol. 35- - P. 979-989,

271. Vogel i, P , Andrews H. L , Wong S К , Isberg R. R- Conjugntive transfer by the virulence system o( I^gumella pneumophila 11 Science, 1998. - Vol. 279. -P. 873-876.

272. Wan C.Q. Use of ELISA til detecting antibodies agamst Legionella ptieumO' phila serogroup I in 195 healthy persons in Tianjin /I Chung Hua Ltu. Hsing Ping. Hsueh. Tsa. Chih. 198$. - Vol. 6. Ns 3. - P. 139-140,

273. Wang Б.Е., Manson B„ Corey M. et al. False positively of Legionella serology in patients with cystic fibrosis // Pediatr. Infect Dis. J. 1987. - VoL 6, № 3, ■ P. 256-259.

274. Wang N, Frequency of seroreactors to Legionella among the patients with pulmonary infections H Chung. Hua. Liu. Hsing. Ping. Hsueh. Tsa Chih. 1991. -VoL 14,^ 2.-P 126-127,

275. Wcgmuller E., Wei dm aTHl I*., Hess T. Reubi F,C. Rapidly progressive glomerulonephritis accompanying l.egionnnires disease II Archiv. m. Med. ■ 1985. -Vol- I46.J&9.-P. 1711-1713.

276. Weiser J.N. Lindbci® A.A., Manning E.J ct al. Identification of fl chromosomal loo» for expression of lipopolysaccharide epitopes in Haemophilus influenza II Inrcct. Immun. 1989. - Vol. 57. - P. 3045-3052.

277. West fall H.N., Goldwoser R.A., Weiss E-, Hussong D, Prevnlcnce of antibodies >o Legionella species in a series of patterns in Israel II 1st. i. Med. Sci. -1986. -Vol. 22. №2.-P. 131-138.

278. Wmtermeyer E., Flogel M., Ol M ct ttl- Sequence determination and mutational analysis of the lly lokus of Legionella pneumophila // Infect Immun -1994, Vol. 61 - P 1109-HI7.

279. Wjntermeyef E , Ludwig B, Stcinert M. ct al. Influence of site specifically altered Mip proteins on intracellular survival of Legionella pneumophila in eu-karyotic cells tl Infect Immun. -1995. Vol. 63. - P. 4576-4583.

280. Wong Kil, Fee ley J,c. Lipopolysaccharide of Legionella its adjuvant for intrinsic and extrinsic antigens If Proc, Soc, Exp. Biol. Med. 19S4. - Vol. 177, -P, 475-481.

281. Wong K.H-, Moss C.W., Hochstein D.H. et al. «Endoioxicity» of the Legionnaires' disease bacterium U Ann. Int. Med. 1979. - Vol. 90- - P- 624-627.

282. Xu L , Wang P. Chen S Detection of antibodies against Legionella ftneumo* phita from pleural effusion a case report of Legionnaires pneumonia withpleural eíTusion // Cliung. Hua Liu. Itiiíig l'ing. Hsueh. Isa CWh ■ 1994, -Vol. 15, Nt 3, ■ PI71-I73.

283. Yobuudii EMorí M„ Sallo A, m ít. An oulbreak of Pontiac fever due to Legión?! ta pnetmopltib «rogroup 7, ||, Epidemiotogkal aspeeCs H Kanscn-shogaku ZascchL 1995. - Vol. 69, № 6- - P. 654-665.

284. Yaraashiro Y., Higa F. líoide M rt al. Serodiagnosis of Legioncila pncumo-phita • data of our luboratory in the rccenl 3 yenrs // lúuiscnshogaku Zasechi. -1994. Vol. 68, № 10. -P. 1256-1263.

285. Yang Q.L., Gotschhch E.C Variation of gonoeoetal I ipoohgosaeehaíide scruc-une is due lo altcraiions in poly-G traets in lg( genes encoding glycosyl Inrns-ferases tt i. Exp. Mcd -1996. Vol. 183, - P. 323-327.

286. Ynhinuut F., Zalman US-, Nikatdo H. Purification aibd propcíties of Pseudomonas vertiginosa porin U J. Biol, Chem, -1983. Vol, 258. - P, 2308-2314.

287. Zhao J.W, Application of the mieroogglutination test of the legionellosis in an epidemiological study ■■■' Chung Hub. Liu. Hsing. Ping, Hsueh Tsa. Chit). -198«.- Vol 7.IM.-P. 209-211.

288. Zink S.D., Podcrsen L., Cianciotlo N.P., Abu Kwaife V The Dot>1cm type IV secretion system of Legionella pneumophila is essential for the induction of apoptosis in human macrophages U Infect. Immun. 2002, - Vol. 70. - P. 16571663.

289. Zügel U-. Kaufmann S.H. Role of heai shock proteins in protection from and pathogenesis of infectious diseases /Г Ctin. Microbiol. Rev. ■ 1999. Vol. 12. -P, 19-39.

290. Zutmtn T., Gal-Мог O., Segal G. Characterization of a Legionella pneumophila relA insertion mutant and roles of RclA and RpoS in virulence gene expression H J. Bacterial. -2002. VoUW. - P. 67-75,