Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генотипирование штаммов бактерий рода Bifidobacterium и рода Legionella на основе секвенирования нескольких фрагментов генома

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генотипирование штаммов бактерий рода Bifidobacterium и рода Legionella на основе секвенирования нескольких фрагментов генома"

На правах рукописи

КУНДА МАРИНА СЕРГЕЕВНА

Гевотппироваяие штаммов бактерий „рода Bifidobacterium и рода Legionella ва основе секвенировання нескольких фрагментов генома

03.00.07. - микробиология 03.00.03. - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

OU34Ybbuu

003476808

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН.

кандидат биологических наук Воронина Ольга Львовна доктор биологических наук, профессор Бойченко Марина Николаевна кандидат биологических наук Прилипов Алексей Геннадьевич ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Минздравсоцразвития РФ

октября 2009 г. в 11 ч. на заседании диссертационного совета Д 001.007.01 в НИЙЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан «А» сентября 2009г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Защита состоится «с*—»

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Дифференциация штаммов и видов микроорганизмов - актуальная задача микробиологии и эпидемиологии. Методы идентификации бактерий, основанные на фенотипических признаках, ПЦР, фрагмент-анализе в большинстве случаев не характеризуются высоким значением коэффициента дифференциации, воспроизводимостью, требуют применения в каждом эксперименте референсных штаммов. Генотипирование на основе секвенирования фрагментов генома микроорганизмов свободно от указанных недостатков, что открывает более широкие возможности в идентификации штаммов.

Анализ последовательности 16S рДНК, проведенный Woese С., 1977, Stackebrandt Е., 1997, и другими исследователями, стал основой филогении доменов Bacteria и Archaea. Однако возможности данной мишени ограничены, поскольку с ее помощью нельзя различить генетически близкородственные виды и штаммы одного вида бактерий. Для решения этого вопроса были разработаны другие подходы, например, метод генотипирования на основе мультилокусного секвенирования (multilocus sequencing, MLST) Maiden M С. J., 1998. В настоящее время протоколы MLST используют для генотипирования 25 различных групп микроорганизмов. Один из них для штаммов бактерий вида Legionella pneumophila был разработан представителями Европейской рабочей группы по легионеллезу (EWGLI, European Working Group for Legionella Infections), www.ewgli.org.

Преимущества MLST заключаются в том, что, во-первых, оперируя «housekeeping» генами, эволюционирующими медленно и являющимися селективно нейтральными, этот метод различает штаммы по длительно сохраняющимся изменениям в геноме. Во-вторых, в рамках описываемого подхода можно создавать базы данных о штаммах на основе секвенированных аллелей, анализировать их и прогнозировать вирулентность, резистентность к антибиотикам и другие значимые свойства штаммов. В связи с вышесказанным, применение MLST для анализа штаммов бактерий открывает новые

перспективы в исследованиях как микробиологического, так и эпидемиологического направления.

Нестабильность экологической обстановки в условиях техногенной цивилизации вызывает существенные изменения в составе микробиома человека и видовом разнообразии потенциально опасных микроорганизмов в окружающей среде. В качестве моделей для изучения популяционного и динамического разнообразия бактерий на основе секвенирования нескольких локусов генома и выработки последующих рекомендаций по экологическому и эпидемиологическому мониторингу нами были выбраны микроорганизмы -представители внутренней среды организма человека (род Bifidobacterium) и окружающей среды (род Legionella).

Бактерии рода Bifidobacterium — важный компонент микрофлоры кишечника детей раннего возраста. Они участвуют в утилизации пищевых субстратов, синтезируют витамины (витамин К, пантотеновую кислоту, витамины группы В), способствуют защите от патогенных микроорганизмов, обладают иммуномодулирующим действием. Присутствие В. infantis в ЖКТ с первых дней развития ребенка оказывает положительное влияние на формирование всех систем организма (Mitsuoka Т. et al., 1974, Гончарова Г.И., 1986). Изменения в составе бифидофлоры грудных детей вызывают атопический дерматит, пищевую аллергию и экзему (Gore С. et al., 2008, Smehilova М. et al., 2008). Своевременная коррекция видового состава с помощью синбиотических препаратов и оценка ее эффективности может быть проведена только на основе информации о первоначальном и последующем состоянии бифидофлоры ребенка. Для выполнения такого исследования необходим метод секвенирования нескольких локусов генома.

Бактерии рода Legionella - возбудители легионеллезной инфекции. Только за период с 1997 года по май 2008 год они стали причиной 51 вспышки болезни легионеров. Принимая во внимание эпидемиологическую опасность бактерий рода Legionella, в 2008 г. в РФ были усовершенствованы методы эпидемиологического надзора за легионеллезной инфекцией.

Роспотребнадзором утверждены методические указания (МУК) по микробиологическому мониторингу систем (Тартаковский И.С. и др., 2008). Согласно МУК, особое внимание необходимо уделять искусственным водным системам с большим количеством циркулирующей теплой воды в сочетании с образованием водного аэрозоля. Для выполнения требований МУК необходимы анализ популяционного разнообразия штаммов рода Legionella на территории РФ и оценка их эпидемиологической значимости.

Таким образом, представляется актуальным мониторинг видового разнообразия бифидобактерий и популяционного разнообразия штаммов рода Legionella, выделенных на территории РФ, на основе эффективного метода мультилокусного секвенирования.

Цель исследования: Оценить популяционное и динамическое разнообразие бактерий внутренней среды человеческого организма и окружающей среды на примере бактерий рода Bifidobacterium и Legionella с использованием метода мультилокусного секвенирования.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить видовое разнообразие бифидофлоры группы клинически здоровых детей раннего возраста.

2. Проследить становление бифидофлоры детей раннего возраста после воздействия синбиотического препарата «Бифидум-Мульти-1».

3. На основе методов мультилокусного секвенирования и серотипирования с использованием моноклональных антител разработать систему ведения и контроля отечественной коллекции лешонелл.

. 4. Изучить популяционное разнообразие штаммов L. pneumophila в потенциально опасных водных системах РФ (градирнях и системах водоснабжения). Выявить характерные для штаммов РФ кластеры аллельных профилей и проследить взаимосвязь между ними.

5. На основе сравнения аллельных профилей выделенных штаммов РФ и клинических изолятов базы данных EWGLI, а также результатов

серологического типирования оценить потенциальную опасность штаммов L. pneumophila для человека.

Научная новизна. На основе двухлокусного типирования определено видовое разнообразие штаммов бактерий рода Bifidobacterium, выделенных из кишечника детей раннего возраста. Показано, что препарат «Бифидум-Мульти-1» стимулирует развитие собственной бифидофлоры грудных детей, ранее не имевших культивируемых бифидобактерий.

На основе методов MLST и серотипирования с использованием моноклональных антител разработана система и принципы ведения и контроля отечественной коллекции легионелл.

На основе изучения аллельных профилей штаммов L. pneumophila, выделенных на территории РФ в 2005-2008 гг., выявлены кластеры штаммов, характерные как для систем водоснабжения, так и для потенциально опасных водных систем. Изучено популяционное разнообразие и генетическая взаимосвязь проанализированных штаммов.

Практическая значимость. Метод секвенирования нескольких локусов генома позволил исследовать в динамике бифидофлору человека и оценить результаты синбиотикотерапии. Идентифицированные на основе примененной методики штаммы, наиболее характерные для бифидофлоры клинически здоровых детей, запатентованы и могут быть использованы для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов.

Принципы ведения и контроля коллекции, разработанные на основе изучения музея легионелл ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, использованы для пополнения коллекции штаммами 4 новых видов рода Legionella и 97 штаммами L. pneumophila разнообразных аллельных профилей.

Сравнение генетических характеристик штаммов L. pneumophila с базой данных EWGLI позволило оценить эпидемическую значимость штаммов L. pneumophila, выделенных при профилактическом мониторинге потенциально опасных водных систем и при эпидемических вспышках легионеллеза.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на 23-м съезде Европейской рабочей группы по легионеллезной инфекции (Мадрид, Испания, 2008), Международном междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, Украина, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Международной школе - конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 40-летию института ГосНИИгенетика (Москва-Пущино, 2008), Пятом Московском_международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009). Апробация диссертации состоялась 02.04.2009 в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН на научной конференции отдела генетики и молекулярной биологии бактерий.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 1 б научных работ (2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, тезисы докладов на 7-ми конференциях и 7 заявок на патенты).

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 127 страницах, содержит 16 таблиц и 9 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (2 главы), выводов и списка цитируемой литературы (128 источников, из которых 23 отечественных и 105 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

. В работе было проанализировано 30 штаммов бактерий рода Bifidobacterium, выделенных из кишечника II детей раннего возраста и предоставленных лабораторией биологии бифидобактерий, МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора. 7 детей имели культивируемую бифидофлору; у 4 детей бифидобактериии при первичной диагностике не обнаружены, им была проведена синбиотикотерапия препаратом «Бифидум-

Мульти-1». Повторно у этой группы детей выделение бифидобактерий проводили через 10 и 60 дней после окончания синбиотикотерапии.

Штаммы рода Legionella коллекции НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (Gamaleya Institute Collection of Legionellae (GICL)), а также штаммы рода Legionella, выделенные на территории РФ в 2005-2008 гг., были предоставлены лабораторией легионеллеза НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Выборка включала 39 коллекционных штаммов рода Legionella (28 из них относились к виду L. pneumophila)', 107 штаммов, выделенных на территории РФ из следующих источников: 63 штамма из градирен и системы водоснабжения г. Верхняя Пышма Свердловской области; 19 штаммов из автономной системы водоснабжения Ханты-Мансийского автономного округа (ХМАО); 9 штаммов из систем водоснабжения Московского региона; 3 штамма из воды промышленного предприятия г. Москва; 3 штамма из технической воды Тверской области. Панель №5 штаммов L. pneumophila была получена от EWGLI для проверки воспроизводимости протокола SBT 4.0.

Серологический анализ предоставленных штаммов L. pneumophila осуществляли методом ИФА с помощью моноклональных антител Дрезденской панели (3, 3/1, 8/4, 10/6, 20/1, 26/1, 7/1, 4/7, 7/4, 40/4, 5/2, 27/1, 4/5, 9/2, 13/1, 17/2, 33/3), любезно предоставленных Dr. LUck P. Ch., Institute of Clinical Microbiology and Hygiene, Dresden, Germany.

Выделение тотальной ДНК бифидобактерий и легионелл проводили согласно инструкции к набору ДНК «DNA Extra Sorb» лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИСБ.

Определение видовой принадлежности бактерий рода Bifidobacterium осуществляли согласно 2-х локусной схеме, разработанной в лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИСБ и основанной на секвенировании фрагментов генов трансальдолазы (tal) и 16S рибосомальной РНК (16S рДНК) (Карзанова М.Е. с соавторами, 2006).

Для типирования бактерий рода Legionella до уровня вида использовали методику, включавшую секвенирование гена mip (Ratcliff R.M. et al, 1998).

Дифференцирование штаммов вида L. pneumophila проводили согласно SBT протоколам version 3.0 и 4.0., преложенным EWGLI (http://wvAv.ewgli.org./). Протоколы основаны на определении последовательностей семи генов: JlaA - кодирующий флагеллин, pileE - пилин типа IV, asd - аспартат семиальдегиддегидрогеназу, тгр - фактор инфицирования макрофагов, mompS - большой белок наружной мембраны, ргоА - гамма-глутамил фосфат редуктазу (фермент, участвующий в биосинтезе пролина), пеиА - цитидил-синтазу N-ацетилнейраминовой кислоты. Представителями EWGLI была создана база последовательностей фрагментов по каждому гену (SBT database version 4.0). Сравнение с базой данных позволяет записать аллельный профиль штамма, перечисляя в установленном порядке (JlaA, pilE, asd, mip, mompS, ргоА, пеиА) номер аллеля, с которым обнаружено 100% сходство, для каждого их семи генов. После регистрации аллельного профиля в базе данных EWGLI ему присваивается номер типа секвенирования (ST, Sequence Туре).

Секвенирование проводили с использованием набора реактивов и согласно инструкции к прибору 3130 Genetic Analyzer, «Applied Biosystems / Hitachi», США.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Анализ иопуляционного разнообразия бактерий рода Bifidobacterium, выделенных из кишечника детей раннего возраста

Проведенные нами исследования показали, что только у 7 из 11 клинически здоровых детей раннего возраста при первичном обследовании была выявлена культивируемая бифидофлора.

При анализе видового состава бифидофлоры этой группы детей было показано, что в ней преобладают бактерии видов В. bifidum (36%), В. pseudocatenulatum (29%) и В. adolescentis (21%) (табл. 1). Бифидофлора 3-х детей представлена тремя и более штаммами, принадлежащими нескольким видам бифидобактерий; у четырех детей - штаммами одного вида. Штаммы

бифидобактерий, изолированные у ребенка №6, принадлежащие одному виду В. adolescentis, были четко различимы по морфологии.

Как видно из данных табл.1, у детей указанной группы не было обнаружено наиболее физиологичного вида В. infantis, который отмечался как преобладающий у детей 60-70-хх гг. Обращает на себя внимание наличие высокого процента штаммов вида В. adolescentis, ранее встречавшегося у детей, находившихся на искусственном вскармливании, и более характерного для организма взрослого человека. Наличие бифидобактерий группы В. adolescentis в раннем возрасте коррелирует, по мнению Gore С. et al., 2008; Smehilovä М. et al., 2008, с проявлением атопического дерматита, пищевой аллергии и экземы.

Результаты видовой идентификации штаммов бифидобактерий из кишечника детей раннего возраста первой группы

Таблица 1.

Ребенок Возраст, мес. Штаммы Идентификация штаммов по фрагментам генов

16S рДНК tal

1 1,0 FHHMB 213: OV17 В. pseudocatenulatum EU334365 В. pseudocatenulatum EU334366

2 1,0 FHHMB 211: OV2 В. pseudocatenulatum EU272010 В. pseudocatenulatum EU272016

FHHMB: OV8 В. bifidum FJ169930 В. bifidum FJ357019

FHHMB OV9 В. pseudocatenulatum FJ169931 В. pseudocatenulatum FJ357020

3 4,0 FHHMB OV18 В. bifidum FJ169939 В. bifidum FJ357026

4 5,0 FHHMB 212: OV15 В. angulatum EU272012 В. angulatum EU272020

5 6,0 FHHMB 217: OV19 В. bifidum EU272013 В. bifidum EU272019

FHHMB 214: OV20 В. longum EU272014 В. longum EU272018

FHHMB OV21 В. pseudocatenulatum FJ169940 В. pseudocatenulatum FJ357027

6 16,0 FHHMB OV5 В. adolescentis FJ169926 В. adolescentis FJ357018

FHHMB OV22 В. adolescentis FJ169941 В. adolescentis FJ357028

FHHMB OV23 В. bifidum FJ169942 В. bifidum FJ357029

FHHMB OV24 В. adolescentis FJ169943 В. adolescentis FJ357030

7 18,0 FHHMB 215: OV7 В. bifidum EU272011 В. bifidum EU272017

Детям, у которых при первичном обследовании культивируемая бифидофлора отсутствовала, была проведена синбиотикотерапия препаратом «Бифидум-Мульти-1», содержавшим консорциум бифидобактерий видов В. infantis, В. breve и В. bifidum и мальтодекстрин. Повторное обследование детей показало, что культивируемая бифидофлора была выявлена у всех детей упомянутой группы. Ведущую роль в бифидофлоре этих детей играл вид В. ruminantium, к которому относилось 50% штаммов. Также преобладали штаммы вида В. breve (19%) и природные рекомбинантные штаммы В. longum/B. pseudocatenulatum (13%) (табл. 2). Как видно из таблицы 2, у 3-х детей бифидофлора представлена 3-мя различными видами бифидобактерий, у ребенка №10 - единственным видом В, adolescentis.

При анализе динамики становления бифидофлоры в результате синбиотикотерапии (табл.2, ребенок №9) было отмечено, что после 10 дней с окончания курса приема препарата стимулировались бактерии видов В. ruminantium и В. breve. По истечении двух месяцев анализ не выявил бифидобактерий В. ruminantium, но показал закрепление бактерий вида В. breve и появление природного рекомбинантного штамма В. longum/B. pseudocatenulatum.

Последовательность событий в развитии кишечной бифидофлоры после приема синбиотика, включающая элиминацию бифидобактерий группы В. adolescentis (В. ruminantium) через 2 месяца после окончания приема «Бифидум-Мульти-1», сохранение бактерий В. breve и появление нового вида В. longum/B. pseudocatenulatum, напоминает становление бифидофлоры грудного ребенка. По данным Mevissen-Verhage Е.А.Е. et al., 1987, с 3-ей по 12-ю недели жизни в составе бифидобактерий ребенка на грудном вскармливании количество представителей вида В. adolescentis сокращается более чем в 2 раза, количество бактерий вида В. breve остается неизменно высоким, а бактерий вида В. longum увеличивается в 1,6 раза.

Проведенные нами исследования показали, что видом, присутствующим как в препарате «Бифидум-Мульти-1», так и в кишечнике ребенка №9 через 60

дней после окончания синбиотикотерапии, является В. breve. Проверка антибиотикоустойчивости штаммов В. breve препарата и ребенка позволила их дифференцировать, поскольку наблюдалось различие в чувствительности штаммов к 8-ми из 32 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике. Наиболее существенная разница выявлена по 3-м антибиотикам: оксациллину, тетрациклину и гентамицину.

Результаты видовой идентификации штаммов бифидобактерий из кишечника детей раннего возраста после проведения синбиотикотерапии

Таблица 2.

Ребенок Возраст, мес. Штаммы Идентификация штаммов по фрагментам генов Дни после синбиотико -терапии

16SpJWK tal

FHHMB OV1 В. longum FJ357032 B. pseudocatenulatum FJ357015

FHHMB OVlO-1 В. bifidum FJl 69932 B. bifidum FJ357021

8 4,0 FHHMB OV 10-3 В. ruminantium FJ169933 - 10

FHHMB OV 10-5 В. ruminantium FJ169934 -

FHHMB OV 6-1 В. ruminantium FJl69927 -

FHHMB OV 6-3 В. ruminantium FJ169928 - 10

FHHMB OV 6-3k В. ruminantium FJl69929 -

9 5,0 FHHMB OV14-1 В. breve FJ169937 B. breve FJ357024

FHHMB 216: OV12 В. breve EU272015 B. breve EU272021

FHHMB OV 13 В. longum FJ169936 B. pseudocatenulatum FJ357023 60

FHHMB OV11 В. longum FJ169935 B. pseudocatenulatum FJ357022

10 6,5 FHHMB OV16 В. adolescentis FJl69938 B. adolescentis FJ357025 10

FHHMB OV3 B. pseudocatenulatum FJ169922 B. pseudocatenulatum FJ357016

11 7,5 FHHMB OV 4-1 B. ruminantium FJ169923 - 10

FHHMB OV4-2 B. breve FJl 69924 B. breve FJ357017

FHHMB OV 4-3 B. ruminantium FJ169925 -

Следует отметить, что штамм В. longum/B. pseudocatenulatum, не имел аналогов по видовой принадлежности среди штаммов синбиотического препарата. Этот факт служит еще одним подтверждением возможности стимуляции собственной бифидофлоры ребенка с помощью «Бифидум-Мульти-1». Кроме того, косвенным доказательством стимуляции бифидофлоры детского' кишечника служит также повышенная способность к авто - и коагрегации бифидобактерий, выделяемых из фекалий ребенка через 10 дней после окончания курса приема синбиотического препарата.

Таким образом, исследование популяционного разнообразия бифидофлоры кишечника детей раннего возраста показало, что не у всех детей, находящихся на грудном вскармливании, выявляется культивируемая бифидофлора; у всей выборки клинически здоровых детей отсутствует наиболее физиологичный вид В. infantis и присутствуют виды, способствующие возникновению аллергических реакций. Эти данные указывают на необходимость коррекции видового состава бифидофлоры детей раннего возраста. Данные о смене видового состава детской бифидофлоры через 10 и 60 дней после проведения синбиотикотерапии, наличие природного рекомбинантного штамма В. longum/B. pseudocatenulatum, способность выделенных штаммов к ко- и автоагрегации, а также различия в антибиотикоустойчивости штамма ребенка и производственного штамма, свидетельствуют о том, что препарат «Бифидум-Мульти-1» стимулирует развитие собственной бифидофлоры грудных детей.

2. Анализ популяционного разнообразия бактерий рода Legionella 2.1. Разработка системы и принципов ведения и контроля GICL Для систематизации коллекционного материала прошлых лет была применена схема анализа, составленная на основе данных литературы и рекомендаций EWGLI и включающая следующие этапы:

1) видовую идентификацию штаммов легионелл на основе секвенирования фрагмента гена mip,

2) определение аллельного профиля штаммов, отнесенных к виду L. pneumophila,

3) определение серогруппы штаммов L. pneumophila с применением панели моноклональных анатител.

Результаты идентификации на основе секвенирования фрагмента гена mip подтвердили видовую принадлежность всех коллекционных штаммов. 28 штаммов отнесены к виду L. pneumophila, 11 - к иным видам рода Legionella. Последовательности гена mip штаммов большинства видов отличались между собой и от последовательностей штаммов L. pneumophila на 14% и более, что согласуется с данными Ratcliff R.M. et al, 1998. Штаммы вида L. longbeachae (Long Beach-4 и Tucker-1) совпали по последовательности на 99%, что подтверждает достоверность метода идентификации. Высокое сходство последовательностей штаммов L. parisiensis и L. anisa - 94%, свидетельствует о необходимости тщательной проверки результатов секвенирования.

Внутри вида L. pneumophila разнообразие проанализированных последовательностей гена mip составило 95-100%.

Анализ аллельных профилей штаммов L. pneumophila показал, что большинство из них принадлежит к ST 36, также были выявлены образцы с ST 1, 58, 62, 61, 80 и профилями, ранее не зарегистрированными в базе данных EWGLI. Например, штаммы из минеральных озер Болгарии: Bulgaria-Draginovo-1, Bulgaria-Draginovo-2, Bulgaria, идентичные по аллельному профилю, не имеют аналогов в базе данных EWGLI.

Большинство штаммов L. pneumophila (19 из 28) принадлежало к серогруппе 1; к серогруппам 2-9 и 13 - единичные штаммы.

Таким образом, проведенная систематизация коллекционного материала подтвердила состоятельность выработанных принципов ведения и контроля отечественной коллекции легионелл. Эти принципы были использованы при анализе штаммов бактерии рода Legionella, выделенных на территории РФ в 2005-2008 гг.

2.2. Анализ популяционного разнообразия штаммов бактерий рода Legionella, выделенных на территории РФ

Видовая идентификация штаммов бактерий рода Legionella, выделенных на территории РФ (табл. 3), показала, что в системах водоснабжения представлены следующие виды: L. brunensis, L. gratiana, L. gormanii, L. anisa и L. rubrilucens.

Видовое разнообразие штаммов бактерий рода Legionella, выделенных на

территории РФ в 2005-2008 гг. _Таблица 3.

Название штамма Вид Accession Источник

GICL 3017: Tver'868.1 L. brunensis FJ357014 Система водоснабжения

GICL 3013: Pyshma-7 L. gratiana FJ357012 Система водоснабжения

GICL 3016: Pyshma-15 FJ357011 Градирня

GICL 3018: Pyshma 41 FJ357010 Градирня

GICL 3014: Pyshma-8 L. gormanii FJ357013 Система водоснабжения

GICL 3012: Pyshma-6 L. anisa FJ431124 Система водоснабжения

GICL 3022: UNL-2 FJ593467 Система водоснабжения

GICL 3019: Pyshma 53 L. dumoffii FJ357009 Градирня

GICL 3020: Pyshma 57 FJ431125 Градирня

GICL 3021: Khimki-9 L. rubrilucens FJ556920 Система водоснабжения

Градирни несколько беднее по видовому составу легионелл. В них

обнаружены виды L. gratiana и L. dumoffii. Следует отметить, что виды L. anisa, L. gormanii, L. dumoffii способны вызывать легионеллез, причем вид L. dumoffii, выделенный из градирни, ассоциирован с 10% заболеваний легионеллезом, не связанных с L. pneumophila. (Bartram J. et al, 2007).

2.2.1. Анализ популяционного разнообразия штаммов L. pneumophila,

выделенных на территории РФ Аллельные профили 97 штаммов L. pneumophila были проанализированы и зарегистрированы в базе данных EWGLI. Им были присвоены следующие номера: EULV0968-0973, EULV0976-0991, EULV0993, EULV0994, EULV0996-1000, EULV1914-1933, EULV1936-1938, EULV1940-1948, EULV2003,

EULV2004, EULV2009, EULV2447, EULV2448, EULV2683-2707, EULV2741-2743.

Более 50% проанализированных штаммов было выделено из градирен одного объекта (табл. 4). Они отличались большим популяционным разнообразием: штаммы отнесены к 19 ST. Штаммы систем водоснабжения представляли популяции 8 различных регионов РФ и относились по результатам секвенирования к 24 ST.

Результаты анализа штаммов L. pneumophila, выделенных на территории РФ.

__Таблица 4.

количество

штаммов ST

всего 97 42

градирни 52 19

системы водоснабжения 45 24

Рассмотрим подробнее популяционное разнообразие штаммов 3-х наиболее крупных выборок: г. Верхняя Пышма, систем автономного водоснабжения ХМАО и Московского региона.

2.2.1.1. Анализ штаммов L. pneumophila г. Верхняя Пышма В состав данной популяции входят штаммы, изолированные из системы водоснабжения, градирен и отстойника промышленного предприятия г. Верхняя Пышма. Из системы водоснабжения было выделено 10 штаммов, относящихся к 9 ST, из градирен - 52 штамма, относящихся к 19 ST.

Отбор проб из градирен проводили в несколько этапов. В июле 2007 г. был осуществлен первичный анализ, далее следовал мониторинг, состоявший из 3-х этапов. Первичный анализ градирни № 3 был предпринят сразу после вспышки заболевания и позволил выявить 2 штамма L. pneumophila, близких по аллельному профилю; GICL 37: Pyshma-5 и GICL 39: Pyshma-199-5.

Во время первого и второго этапов мониторинга были выделены штаммы с наибольшим разнообразием аллельных профилей, 9 новых аллельных профилей идентифицировано в декабре 2007 г., 7 - в июне 2008 г. Третий этап мониторинга в декабре 2008 г. выявил только один новый тип секвенирования у

изолированных штаммов. Обращает на себя внимание тот факт, что наибольшее количество штаммов, 22, было изолировано в июне 2008 г.

На основе данных об аллельных профилях штаммов L. pneumophila, выделенных на территории г. Верхняя Пышма, было построено филогенетическое древо с использованием программы PHYLIP version 3.68 (рис.1). Из рисунка видно, что все штаммы формируют 2 больших кластера. Первый кластер включает ST 7 и 320, характерные для штаммов градирен.

Второй кластер представлен множественными подкластерами, что свидетельствует об интенсивном процессе генетической изменчивости в рассматриваемой популяции. Большинство штаммов системы водоснабжения (ST 147 и 191) сходны со штаммами из грунтовых вод разных регионов РФ, а штамм GICL 96: Ural 167-2 идентичен им по аллельному профилю.

Штаммы с ST 321 и 554 системы водоснабжения кластеризуются со штаммами градирен. Особое внимание необходимо обратить на штамм с ST 321. Штаммы с данным ST чаще встречаются среди штаммов градирен. Присутствие среди штаммов системы водоснабжения подобного нехарактерного для них штамма, а также образование единых подкластеров штаммами градирен и системы водоснабжения свидетельствует о переносе штаммов L. pneumophila из градирен в систему водоснабжения с потоками контаминированного легионеллами аэрозоля воздуха. Возможность переноса легионелл воздушным путем на расстояние до 6 км показана Nguyen Т.М et al., 2006, и другими авторами.

Анализ аллельного разнообразия по фрагментам семи генов профиля для штаммов градирен и отстойника показал наличие от 4 до 7 аллелей по каждому локусу. При исследовании нуклеотидных замен в последовательностях аллелей было выявлено, что наиболее вариабельным локусом является тотр, для которого замены отмечены в 8,0% от общего числа нуклеотидов, наименее вариабельным - mip (2,2% замен). Для фрагмента гена тотр из 28 замен в нуклеотидной последовательности 5 приводят к несинонимичным заменам в аминокислотных остатках, тогда как для фрагмента гена mip из 9 замен в

основаниях только одна выражается в несинонимичной замене в аминокислотной последовательности. Только для фрагмента гена тотр выявлены замены в нуклеотидной последовательности, состоящие из 2-х блоков по 3 нуклеотида - с 326 по 328 п.н. и с 333 по 335 п.н. анализируемого фрагмента. По мнению ряда авторов, подобные замены могут быть результатом рекомбинационного процесса ф1апсош1:е1 а!., 2007).

e.i

Рис 1. Филогенетическое древо штаммов, выделенных на объектах г. Верхняя Пышма Свердловской области.* - штаммы из системы водоснабжения.

Таким образом, полученные результаты подтверждают интенсивный мутационный процесс в геноме L. pneumophila при высокой концентрации бактерий в градирнях г. Верхняя Пышма.

2.2.1.2. Анализ штаммов L. pneumophila штаммов ХМАО

При анализе автономной системы водоснабжения рабочего поселка ХМАО было изолировано 19 штаммов, получивших название TOTAL. 15 из 19 штаммов имели идентичный аллельный профиль (ST 292), совпадавший с профилем штамма GICL 59: TOTAL-11, выделенного непосредственно из воды скважины. Еще 3 штамма (GICL 27: TOTAL-1, GICL 30: TOTAL-4 и GICL 31: TOTAL-5) отличались по одной позиции аллельного профиля от штамма GICL 59: TOTAL-11.

Особый аллельный профиль, существенно отличающийся от профилей штаммов основной группы, определен для штамма GICL 63: TOTAL-16, выделенного из водопроводной воды медпункта.

Наличие бактерий вида L. pneumophila даже в горячей воде автономной системы водоснабжения свидетельствует о необходимости контроля за температурным режимом таких систем и поддержания его на уровне не ниже

60 °С (МУК Роспотребнадзора 2008; Bartram J. et al, 2007).

В целом, следует отметить незначительный уровень генетических изменений штаммов легионелл автономной системы водоснабжения ХМАО.

2.2.1.3. Система водоснабжения Московского региона

При анализе системы автономного водоснабжения, расположенной в Московском регионе, было выделено 8 штаммов, относящихся к 6 ST. Данная система характеризовалась наличием застоявшейся воды, благоприятствующей образованию биопленок и активному размножению легионелл, поэтому ее отличало популяционное разнообразие штаммов легионелл. Полученные нами данные об аллельных профилях системы водоснабжения Московского региона позволили сделать несколько наблюдений.

Во-первых, было показано, что штамм GICL 102: Khimki-3 обладает аллельным профилем, аналогичным профилю штамма из грунтовой воды.

Во-вторых, штаммы GICL 101: Khimkí-2 и GICL 105 :Khimki-6 системы автономного водоснабжения были аналогичны штаммам, изолированным из градирен г. Верхняя Пышма. Таким образом, при несоблюдении санитарных норм эксплуатации систем водоснабжения, наличии большого количества

застоявшейся воды и биопленок наблюдается мутационный процесс, аналогичный протекающему в градирнях.

В-третьих, было установлено, что штаммы GICL 104: Khimki-5 из области с застоявшейся водой и GICL 100: Khimki-1 из вентиляционной камеры имеют идентичный аллельный профиль. Кроме того, идентичным профилем обладали штаммы GICL 103: Khimki-4 и GICL 106: Khimki-7, выделенные из области застоя воды и джакузи, соответственно.

Полученные данные свидетельствуют о необходимости строгого соблюдения санитарных норм и температурного режима при эксплуатации автономных водных систем. Особое внимание следует обращать на объекты, оборудованные вентиляционными системами, способствующими распространению контаминированными легионеллами аэрозоля воздуха.

Выделение из систем водоснабжения в отдаленных друг от друга на большие расстояния регионах РФ (г. Верхняя Пышма, ХМАО, Московский регион) штаммов, с аллельными профилями, аналогичными профилю штамма с ST 292 из грунтовой воды, свидетельствует о единообразии штаммов таких систем при соблюдении норм их эксплуатации.

2.2.2. Эпидемиологическая значимость MLST

Аналоги штаммов по аллельному профилю в базе данных EWGLI __Таблица 5.

ST Название штаммов Общее число аналогов Число аналогов из клинического материала Подгруппа серогруппы 1 по результатам серологического анализа

308 GICL 33:Pyshma-l 225 220 Philadelphia

7 GICL 39: Pyshma-199-5 GICL 47: Pyshma-19 GICL 49: Pyshma-22 GICL 51: Pyshma-26 GICL 46: Pyshma-18 GICL 76: Pyshma 34 118 102 Oxford

320 GICL 37: Pyshma-5

521 GICL 119: Pyshma 67 GICL 50: Pyshma-24 94 70 Benidorm

59 GICL 63: TOTAL-16 44 21 Bellingham

Жирным шрифтом выделены подгруппы, имеющие вирулентный эпитоп

Для анализа потенциальной опасности штаммов градирен мы провели сопоставление аллельных профилей российских штаммов L. pneumophila с аллельными профилями изолятов базы данных EWGLI. Результаты анализа представлены в таблице 5.

Анализ показал, что наибольшее число клинических аналогов имеют штаммы с ST 308, 7, 320, 521 и 59. Такие штаммы могут представлять потенциальную опасность для здоровья людей. Необходимо отметить, что штамм с ST 308 (GICL 33: Pyshma-1) выделен из клинического материала, а большинство других потенциально опасных штаммов было изолировано из градирен.

Таким образом, полученные нами данные подчеркивают необходимость мониторинга искусственных водных систем.

2.2.3. Иммуиоферментный анализ L. pneumophila.

Штаммы, относящиеся к разным серогруппам, имеют разную потенциальную опасность для здоровья людей. Наиболее опасны представители серогруппы 1. Кроме того, для людей с ослабленным иммунитетом, помимо упомянутой серогруппы, опасность представляют штаммы серогруппы 6. Для анализа потенциальной опасности российских штаммов легионелл нами было проведено их серологическое типирование.

По результатам проведенного анализа было выявлено, что наибольшее количество штаммов (38) было отнесено к серогруппе 6, 30 штаммов - к первой серогруппе. Среди первой серогруппы наиболее часто встречающейся подгруппой была подгруппа Oxford, в которую вошли 14 штаммов, 5 штаммов были отнесены к подгруппе Heysham, 4 - к подгруппе Benidorm, 3 - к подгруппе Bellingham и один - к подгруппе Philadelphia.

Следует обратить особое внимание на подгруппы Philadelphia и Benidorm. Штаммы обеих подгрупп реагируют с моноклональными антителами 3/1, которые, согласно данным Heibig J.H. et al, 1995, специфичны к поверхностной детерминанте, отвечающей за вирулентность легионелл. В нашем исследовании штаммы, относящиеся к подгруппе Philadelphia, были выделены из

клинического материала: СТСЬ 20: 194-Н и 01СЬ 33: РувЬта-Ь Подгруппе Beшdorm принадлежали штаммы СТСЬ 50: Руз1гта-24 и С1СЬ 119: РувЬта 67 (градирня), а также вГСЬ 100: КЫтМ-1 и вКХ 104: КЫтк1-5 (система водоснабжения).

Таким образом, результаты серологического анализа подтвердили потенциальную опасность штаммов градирен (в1СЬ 50: РузЬта-24 и ЫСЪ 119: РуБЪта 67).

2.2.4. Анализ образцов контрольной панели Е\¥СЫ как подтверждение точности применяемого метода Тестирование контрольной панели №5 EWGLI с помощью протокола 8ВТ 4.0 (табл. 6) показало идентичность аллельных профилей штаммов №32 и №36 и отличие от них штамма №34 по 2 позициям аллельного профиля (тр, пей). Штаммы №33 и 35 различались только по позиции пей. При таком высоком сходстве аллельных профилей штаммы, тем не менее, были успешно секвенированы и дифференцированы в 24 из 31 лабораторий мира, в том числе нашей. Полученные результаты служат дополнительным подтверждением высокой разрешающей способности и достоверности МЬБТ.

Результаты определения аллельных профилей контрольной панели Е\¥СЫ

Таблица 6.

Номер штамма Аллельный профиль БТ Серогруппа

32 2,3,6,25,2,1,15 78 1

33 1,4,3,1,1,1,1 1 1

34 2,3,6,10,2,1,6 22 1

35 1,4,3,1,1,1,3 152 1

36 2,3,6,25,2,1,15 78 1

Таким образом, результаты проведенного исследования послужили еще одним доказательством того, что типирование на основе секвенирования нескольких фрагментов генома является эффективным инструментом для выявления видового разнообразия микроорганизмов и позволяет различать штаммы в пределах одного вида. Полученные нами данные свидетельствуют о значимости метода не только для решения задач таксономии, но и диетологии, молекулярной экологии и молекулярной эпидемиологии.

выводы

1. В группе отобранных клинически здоровых детей раннего возраста, находившихся на грудном вскармливании и далее смешанном по возрасту, рожденных от клинически здоровых матерей, в культивируемой бифидофлоре отсутствуют бактерии вида В. infantis. В бифидофлоре преобладают бифидобактерии видов В. bifidum (36%), В. pseudocatenulatum (29%) и В. adolescentis (21%). У половины обследованных детей бифидофлора представлена двумя и более видами.

2. Синбиотический препарат «Бифидум-Мульти-1» стимулирует развитие собственной бифидофлоры у детей, ранее не имевших культивируемой бифидофлоры. Прослеженная в работе смена видового состава бифидобактерий в процессе становления бифидофлоры аналогична таковой, зарегистрированной при формировании сукцессионных рядов биоценоза кишечника детей в возрасте 3-12 недель.

3. На основе методов мультилокусного секвенирования и серотипирования с использованием моноклональных антител разработаны система и принципы ведения и контроля отечественной коллекции легионелл.

4. При мониторинге потенциально опасных водных объектов установлено генетическое единообразие штаммов систем водоснабжения из разных регионов страны; большое разнообразие аллельных профилей популяции штаммов градирен, среди которых выделено 2 основных кластера штаммов, относящихся к типами секвенирования 7 и 324. На основе филогенетического анализа продемонстрировано сходство аллельных профилей ряда штаммов градирен и систем водоснабжения РФ.

5. Наибольшую потенциальную опасность представляют штаммы градирен и автономной системы водоснабжения Московского региона со следующими типами секвенирования: 7, 59, 308, 320, 324, 498, 521, 522. Особая потенциальная опасность для штаммов с типами секвенирования 498 и 521 подтверждена с помощью серологического анализа.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах:

1. Воронина О.Л., Кунда М.С., Лунин В.Г., Карпова Т.И., Тартаковский И.С. «Молекулярно-генетическое типирование штаммов Legionella pneumophila и Legionella species , выделенных на территории Российской Федерации»// Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2008 - т. 10,- №2,- с. 154-162.

2. Воронина О.Л., Кунда М.С., Субботина М.Е., .Жиленкова О.Г., Амерханова A.M., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. «Анализ видового разнообразия бифидофлоры детей раннего возраста и влияние синбиотика «Бифидум-Мульги-1» на становление и развитие бифидобактерий детского кишечника»//Вопросы детской диетологии, 2008.- т. 6.- №5.- с. 59-64.

Тезисы докладов:

1. Voronina O.L., Kunda M.S., Lunin V.G., Karpova T.I., Tartakovskiy I.S «Legionella pneumophila and Legionella species stains, isolated in Russian Federation in 2005-2008 years: allelic profiles and features of distribution» //The 23rd meeting of the European Working Group for Legionella Infections (EWGLI). Madrid, 11-13 May 2008,-p. 53.

2. Кунда M. С., Воронина О. Л., Лунин В. Г., Тартаковский И. С., Гинцбург А. Л. «Многолокусное генотипирование в таксономии микроорганизмов и в анализе процессов рекомбинации»///Г съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая 2008.- с. 266.

3. Воронина О.Л., Кунда М.С., Елькова В.В., Карпова Т.И., Тартаковский И.С. «Обоснование необходимости мониторинга искусственных водных систем для предотвращения вспышек легионеллезной ии^чкпттИМеждународный междисциплинарный симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине». Судак, Крым, Украина, 19-30 сентября 2008,- с. 30-32.

4. Воронина О.Л., Кунда М.С., Субботина М.Е., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. «Бифидофлора детского кишечника - индикатор изменения экологической обстановки»//Международный междисциплинарный симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине». Судак, Крым, Украина, 19-30 сентября 2008,- с. 32-34.

5. Кунда М.С., Воронина О.Л. «Анализ экологического разнообразия штаммов Legionella pneumophilla посредством молекулярно-генического типирования бактериvy>HМеждународная школа - конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 40-летию института ГосНИИгенетика. Москва -Пущино, 20 - 24 октября 2008,- с. 147-149.

6. Субботина М.Е., Кунда М.С., Воронина О.Л. «Использование схемы двухлокусного типирования для идентификаци штаммов бифидобактерий, изолированных у детей раннего ъоъх>&<яъ>>ИМеждународная школа - конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 40-летию института ГосНИИгенетика. Москва - Пущино, 20 - 24 октября 2008,- с. 173174.

7. Воронина О.Л., Кунда М.С., Елькова В.В., Лунин В.Г., Карпова Т.И., Тартаковский И.С. «Применение MLST для мониторинга Legionella pneumophila в градирнях и системах водоснабжения городов Российской Федерации »//Пятый Московский Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва 16 - 20 марта 2009.- с. 215-216.

Заявки на патенты:

1. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботиаа М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. № 2008128539 ог 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium breve OV-12, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств».

2. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Куида М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. № 2008128540 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium bifldum OV-19...».

3. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. № 2008128541 от 15.07.2008 «ШтаммBifidobacterium bifldum OV-7...».

4. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. № 2008128542 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium longum OV-20...».

5. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Куида М.С., Лунин В.Г., Амерханова А.М., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. № 2008128543 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacteriumpseudocatenulatum OV-17...».

6. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова А.М., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. № 2008128544 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium angulatum OV-15...».

7. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. № 2008128545 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium pseudocatenulatum OV-2...».

Заказ № 423. Типография "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. 152-00-16 Тираж 120 шт.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кунда, Марина Сергеевна

Введение

Цель и задачи исследования.

Список сокращений

Глава 1. Обзор литературы

Раздел 1.1. Бифидобактерии

Раздел 1.2. Легионеллы

Раздел 1.3. Идентификация и классификация 32 микроорганизмов с использованием молекулярно-генетических методов.

Раздел 1.4. Серологические методы

Глава 2. Материалы и методы исследования

Раздел 2.1. Материалы

Раздел 2.2. Методы исследования

Глава 3. Результаты и обсуждение

Раздел 3.1 Определение видовой принадлежности бактерий 70 рода Bifidobacterium, выделенных из кишечника детей раннего возраста

Раздел 3.2 Генотипирование бактерий рода Legionella

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генотипирование штаммов бактерий рода Bifidobacterium и рода Legionella на основе секвенирования нескольких фрагментов генома"

Дифференциация штаммов и видов , микроорганизмов - актуальная задача микробиологии и эпидемиологии. Методы идентификации бактерий, основанные на фенотипических признаках, ПЦР, фрагмент-анализе в большинстве случаев не характеризуются высоким значением коэффициента дифференциации, воспроизводимостью, требуют применения в каждом эксперименте референсных штаммов. Генотипирование на основе секвенирования фрагментов генома микроорганизмов свободно от указанных недостатков, что открывает более широкие возможности в идентификации штаммов.

Анализ последовательности 16S рДНК, проведенный Woese С. [123, 124], Stackebrandt Е. [103] и другими исследователями, стал основой филогении доменов Bacteria uArchaea. Однако возможности данной мишени ограничены, поскольку с ее помощью нельзя различить генетически близкородственные виды и штаммы одного вида бактерий. Для решения этого вопроса были разработаны другие подходы, например, метод генотипирования на основе мультилокусного секвенирования (multilocus sequencing, MLST) [77]. В настоящее время протоколы MLST используют для генотипирования 25 различных групп микроорганизмов. Один из них для штаммов бактерий вида Legionella pneumophila был разработан представителями Европейской рабочей группы по легионеллезу (EWGLI, European Working Group for Legionella Infections).

Преимущества MLST заключаются в том, что, во-первых, оперируя «housekeeping» генами, эволюционирующими медленно и являющимися селективно нейтральными, этот метод различает штаммы по длительно сохраняющимся изменениям в геноме. Во-вторых, в рамках описываемого подхода можно создавать базы данных о штаммах на основе секвенированных аллелей, анализировать их и прогнозировать вирулентность, резистентность к антибиотикам и другие значимые свойства изолятов. В связи с вышесказанным, применение MLST для анализа штаммов бактерий открывает новые перспективы в исследованиях как молекулярно-биологического, так и эпидемиологического направления.

Нестабильность экологической обстановки в условиях техногенной цивилизации вызывает существенные изменения в составе микробиома человека и видовом разнообразии потенциально опасных микроорганизмов в окружающей среде. В качестве моделей для изучения популяционного и динамического разнообразия бактерий на основе секвенирования нескольких локусов генома и выработки последующих рекомендаций по экологическому и эпидемиологическому мониторингу нами были выбраны микроорганизмы - представители внутренней среды организма человека (род Bifidobacterium) и окружающей среды (род Legionella).

Бактерии рода Bifidobacterium - важный компонент микрофлоры кишечника детей раннего возраста. Они участвуют в утилизации пищевых субстратов, синтезируют витамины (витамин К, пантотеновую кислоту, витамины группы В), способствуют защите от патогенных микроорганизмов, обладают иммуномодулирующим действием. Присутствие В: infantis в ЖКТ с первых дней развития ребенка оказывает положительное влияние на формирование всех систем организма. Изменения в составе бифидофлоры приводят к проявлению аллергических реакций. Своевременная коррекция видового состава с помощью синбиотических препаратов и оценка ее эффективности может быть проведена только на основе информации о первоначальном и последующем состоянии бифидофлоры ребенка. Для выполнения такого исследования необходим метод секвенирования нескольких локусов генома.

Бактерии рода Legionella - возбудители легионеллезной инфекции. Только за период с 1997 года по май 2008 год они стали причиной 51 вспышки болезни легионеров. Принимая во внимание эпидемиологическую опасность бактерий рода Legionella, в 2008 г. В РФ были усовершенствованы методы эпидемиологического надзора за легионеллезной инфекцией. Роспотребнадзором утверждены методические указания (МУК) по микробиологическому мониторингу систем, согласно которым особое внимание необходимо уделять искусственным водным системам с большим количеством циркулирующей теплой воды в сочетании с образованием водного аэрозоля [17]. Для выполнения требований МУК необходимы анализ популяционного разнообразия штаммов рода Legionella на территории РФ и оценка их эпидемиологической значимости.

Таким образом, представляется актуальным мониторинг видового разнообразия бифидо бактерий и популяционного разнообразия штаммов рода Legionella, выделенных на территории РФ на основе эффективного метода многолокусного секвенирования.

Цель исследования:

Оценить популяционное и динамическое разнообразие бактерий внутренней среды человеческого организма и окружающей среды на примере бактерий рода Bifidobacterium и Legionella с использованием метода мультилокусного секвенирования.

Задачи исследования:

1. Изучить видовое разнообразие бифидофлоры группы клинически здоровых детей раннего возраста

2. Проследить становление бифидофлоры детей раннего возраста после воздействия синбиотического препарата «Бифидум-Мульти-1»

3. На основе методов мультилокусного секвенирования и серотипирования с использованием моноклональных антител разработать систему ведения и контроля отечественной коллекции легионелл

4. Изучить популяционное разнообразие штаммов L. pneumophila в потенциально опасных водных системах РФ (градирнях и системах водоснабжения). Выявить характерные для штаммов РФ кластеры аллельных профилей и проследить взаимосвязь между ними.

5. На основе сравнения аллельных профилей выделенных штаммов РФ и клинических изолятов базы данных EWGLI, а также результатов серологического типирования оценить потенциальную опасность штаммов L. pneumophila для человека.

Список сокращений, используемых в тексте 16S рРНК - 16S рибосомальная РНК tal (transaldolase) - трансальдолаза

FHHMB - Federal Human Host Microflora Bank - Государственная коллекция микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

АТСС (American Type Culture Collection) - американская коллекция типовых культур

DSM (Deutsche Sammlung von Microorganismen and Zellkulturen) - немецкая коллекция микроорганизмов

JCM (Japan Culture Collection of Microorganism) - японская коллекция микроорганизмов

EWGLI (European Working Group for Legionella Infections) - Европейская рабочая группа по легионеллезу

EULV - номер штамма в коллекции EWGLI dNTP - дезоксирибонуклеозидтрифосфаты ddNTP - дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты ST ( Sequence Туре) - тип секвенирования ЖКТ - желудочно-кишечный тракт ПЦР - полимеразная цепная реакция ПААГ - полиакриламидный гель ЭФ - электрофорез УФ - ультрафиолет

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Кунда, Марина Сергеевна

ВЫВОДЫ:

1. В группе отобранных клинически здоровых детей раннего возраста, находившихся на грудном вскармливании и далее смешанном по возрасту, рожденных от клинически здоровых матерей, в культивируемой бифидофлоре отсутствуют бактерии вида В. infantis. В бифидофлоре преобладают бифидобактерии видов В. bifidum (36%), В. pseudocatenulatum (29%) и В. adolescentis (21%). У половины обследованных детей бифидофлора представлена двумя и более видами.

2. Синбиотический препарат «Бифидум-Мульти-1» стимулирует развитие собственной бифидофлоры у детей, ранее не имевших культивируемой бифидофлоры. Прослеженная в работе смена видового состава бифидобактерий в процессе становления бифидофлоры аналогична таковой, зарегистрированной при формировании сукцессионных рядов биоценоза кишечника детей в возрасте 3-12 недель.

3. На основе методов мультилокусного секвенирования и серотипирования с использованием моноклональных антител разработаны система и принципы ведения и контроля отечественной коллекции легионелл.

4. При мониторинге потенциально опасных водных объектов установлено генетическое единообразие штаммов систем водоснабжения из разных регионов страны; большое разнообразие аллельных профилей популяции штаммов градирен, среди которых выделено 2 основных кластера штаммов, относящихся к типами секвенирования 7 и 324. На основе филогенетического анализа продемонстрировано сходство аллельных профилей ряда штаммов градирен и систем водоснабжения РФ.

5. Наибольшую потенциальную опасность представляют штаммы градирен и автономной системы водоснабжения Московского региона со следующими типами секвенирования: 7, 59, 308, 320, 324, 498, 521, 522. Особая потенциальная опасность для штаммов с типами секвенирования 498 и 521 подтверждена с помощью серологического анализа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, результаты проведенного исследования послужили еще одним доказательством того, что типирование на основе секвенирования нескольких фрагментов генома является эффективным инструментом для выявления видового разнообразия микроорганизмов и позволяет различать штаммы в пределах одного вида.

При идентификации вида микроорганизмов количество используемых для секвенирования мишеней зависит от степени родства видов внутри рода. Близкородственные виды бифидобактерий не различимы по одной мишени как 16S рДНК, так и по фрагментам операционных генов. Только двухлокусное секвенирование позволило различить виды В. longum - В. infantis, В. catenulatum - В. pseudocatenulatum. Эффективность такой схемы подтвердило проведенное нами исследование видового разнообразия бифидофлоры клинически здоровых детей раннего возраста. Анализ штаммов бифидобактерий на основе двухлокусного секвенирования позволил также доказать стимуляцию развития собственной бифидофлоры детей синбиотиком «Бифидум-Мульти-1» и проследить смену видового состава бифидобактерий при последующем формировании биоценоза кишечника.

Дифференциация штаммов одного вида микроорганизмов требует, как отмечалось выше, более подробной схемы идентификации - MLST.

Применение протокола MLST, разработанного EWGLI., позволило нам разделить 97 штаммов L. pneumophila, выделенных на территории РФ в 2005 - 2008 гг. на 42 ST. Дифференцирующая способность выбранного протокола была подтверждена также анализом штаммов L. pneumophila панели №5 EWGLI.

Благодаря использованию вышеуказанного метода, мы показали высокую популяционную изменчивость штаммов градирен и установили возможность переноса штаммов этих объектов с аэрозолем воздуха в системы водоснабжения, подтвердив потенциальную опасность таких искусственных водных систем.

Точная идентификация штаммов посредством схемы MLST позволила проследить штаммы, характерные для грунтовых вод, на всей проанализированной территории РФ.

Применение многолокусного секвенирования предоставило возможность провести систематизацию коллекционного материала GICL и дополнить уже существующие характеристики штаммов данными об их генетическом разнообразии.

Большое значение для эпидемиологической характеристики выделенных штаммов имеет возможность апелляции к базе данных EWGLI, содержащей информацию о 2735 изолятах 35 стран мира. Наличие большого количества аналогов среди клинических изолятов у штаммов с ST 7, 320, 521 и 498 позволило предположить, что они являются потенциально опасными для здоровья населения.

Серологическая характеристика штаммов L. pneumophila с помощью Mab Дрезденской панели подтвердила потенциальную опасность штаммов GICL 50: Pyshma-24, GICL 119: Pyshma-67, GICL 100: Khimki-1 и GICL 104: Khimki-5. Использование дополнительной характеристики повысило коэффициент дискриминации штаммов в выполненном исследовании. Он составил 0,96 для всей проанализированной выборки.

Проведенная нами работа продемонстрировала многогранные возможности типирования на основе секвенирования нескольких фрагментов генома не только при идентификации видов и штаммов микроорганизмов рода Bifidobacterium и Legionella, но и при анализе полученных аллельных профилей, которые являются самостоятельным объектом исследования. i i i

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кунда, Марина Сергеевна, Москва

1. Алпеева И.С. Анионные пероксидазы и их применение в биоанализе. Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук. Москва, 2007.

2. Амерханова A.M., Лаврова А.Е., Дмитриева В.Г., Пырикова И.А., Зубкова Е.С., Жиленкова О.Г., Кураленко А.А. Опыт применения БАД к пище «Бифидобактерии мульти» в педиатрической практике. Вестник Российской АМН, 2005, 12: 30-32.

3. Антонов АС. Геномика и геносистематика. Природа. 1999,6: 19-26.

4. Белозерский АН. Нуклеиновые кислоты и их связь с эволюцией, филогенией и систематикой организмов. (Пленарная лекция). Второй всесоюзный биохимический съезд 1969.

5. Вылегжанина У. Джинн из трубы Российская газета. 2008, 4707. http://mv\v.rg.ru/2008/07/16/reg-ui-al/legionelez.html

6. Газарян И. Г., Хушпульян Д. М., Тишков В. И. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений. Успехи биологической химии. 2006, 46: 303-322.

7. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека и необходимость ее оптимизации. Сборник научных трудов «Бифидобактерии и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве». М.; 1986: 10-17.

8. Гусев М. В., Л. А Минеева А. Микробиология. М.; Издательство Московского университета, 1992.

9. Жизнь растений. Введение. Бактерии и актиномицеты. Под ред. Красильникова Н.А., Уранова А.А. М.; Просвещение, 1974.

10. Карзанова М.Е., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. Доклады РАСХН, 2006, 5: 9-12.

11. П.Книрель Ю.А. Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А (обзор). Биохимия. 1993, 58(2): 166-181.

12. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. II. Структура кора (обзор). Биохимия. 1993, 58(2): 182-201.

13. Легионеллёз. Роспотребнадзор. http://marirpn.ru/index.php?option=comcontent&task=vicw&id=501&Itemid=267

14. Лисукова Т., Чекалина К. Легионеллез. Сестринское дело. 2000, 6. //http://medi.ru/doc/7100621.htm.

15. Методические рекомендации. Клиника, лечение и диагносика легионеллеза (ут. Минздравом РСФСР 02.01.1987)

16. Методические указания по выявлению бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды. МУК 4.2.2217—07.

17. Методические указания. Эпидемиологический надзор за легионеллезной инфекцией. МУ 3.1.2.2412-08.

18. Остерман. Л. А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлекгрофорезом и радиоизотопными методами М.; Наука, 1983.

19. Тартаковский И.С. Современные подходы к диагностике атипичных пневмоний. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000,2(1): 60-68.

20. Тартаковский И.С., Синопальников АИ. Легионеллез: роль в инфекционной патологии человека. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001,3(1): 4-16.

21. Томов А Легионеллез. София; Медицина и физкультура, 1986

22. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. Бифидобактерии: традиционный взгляд и современные генетические исследования. Вопросы практической педиатрии. 2007; 2 (5): 76-79.

23. Amemura-Maekawa J., Kura F., Chang В. and Watanabe H. Legionella pneumophila serogroup 1 isolates from cooling towers in Japan form a distinct genetic cluster. Microbiol. Immunol. 2005, 49(2): 1027-1033.

24. Benno Y., Sawada К., Mitsuoka Т. The intestinal microflora of infants: composition of fecal flora in breast-fed and bottle-fed infants. Microbiol. Immunol. 1984; 28: 975-986.

25. Benson R.F., Thacker W.L., Wilkinson H.W., Fallon R.J., Brenner D.J. Legionella pneumophila serogroup 14 isolated from patients with fatal pneumonia. Journal of clinical microbiology. 1988, 26(2): 382.

26. Biavati В., Castagnoli P., Crociani F., Trovatelli L.D. Species of the Bifidobacterium in the feces of infants. Microbiologica. 1984; 7(4): 341-5.

27. Biavati В., Mattarelli P. Bifidobacterium ruminantium sp. nov. and Bifidobacterium rnerycicum sp. nov. from the rumens of cattle. International journal of systematic bacteriology. 1991, 41(1): 163-168.

28. Biavati В., Vescovo M., Torriani S., Bottazzi V. Bifidobacteria: history, ecology, physiology and applications. Annals of Microbiology. 2000, 50: 117-131.

29. Breed R.S., Murray E.G.D., Smith N.R., eds. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th edn., Williams & Wilkins, Baltimore. 1957.

30. Bibb W.F., Arnow P.M., Dellinger D.L., Perryman S.R. Isolation and characterization of a seventh serogroup of Legionella pneumophila. Journal of clinical microbiology. 1983, 17(2): 346-348.

31. Bissett M.L., Lee J.O., Lindquist D.S. New serogroup of Legionella pneumophila, serogroup 8. Journal of clinical microbiology. 1983, 17(5): 887-891.

32. Bonjoch X., Balleste' E., R. Blanch A. Multiplex PCR with 16S rRNA gene-targeted primers of Bifidobacterium spp. to identify sources of fecal pollution. Applied and environmenyal microbiology. 2004, 70(5): 3171-3175.

33. Brodie E.L., De Santis T.Z., Moberg Parker J.P. et al. PNAS 2007; 104(1): 299-304.

34. Charteris W.P., Kelly P.M., Morelli L., Collins J.K. Antibiotic susceptibility of potentially probiotic Bifidobacterium isolates from the human gastrointestinal tract. Lett. Appl. Microbiol. 1998, 26: 333-337.

35. Coscolla M., Gonzalez-Candelas F. Population structure and recombination in environmental isolates of Legionella pneumophila. Environmental Microbiol. 2007, 9 (3): 643-656.

36. England A.C., McKinney R.M., Skaliy P., Gorman G.W. A fifth serogroup of Legionella pneumophila. Annals of internal medicine. 1980, 93(1, parti)): 58-59.

37. Edelstein P.H., Bibb W.F., Gorman G.W., Thacker W.L., Brenner D.J., Wilkinson H.W., Moss C.W., Buddington R.S., Dunn C.J., Roos P.J. Legionella pneumophila serogroup 9: a cause of human pneumonia. Ann Intern Med. 1984, 101(2): 196-198.

38. Everett K.D., Homung L.J., Andersen AA. Rapid detection of Ihe Chlaniydiaceae and other families in the order Chlamydiales: three PCR tests. Journal of clinical microbiology. 1999,37(3): 575-580.

39. Fenstersheib M.D., Miller M., Diggins C, Liska S., Detwiler L., Werner S.B., LindquistD., Thacker W.L., Benson RF. Outbreak of Pontiac fever due to Legionella anisa. Lancet 1990, 336(8706): 3537.

40. Fields B.S., Haupt Т., Davis J.P., Arduino M.J., Miller P.H., Butler J.C. Pontiac fever due to Legionella micdadei from a whirlpool spa: possible role of bacterial endotoxin. J Infect Dis. 2001, 184(10): 1289-1292.

41. Gabay J.E., Blake M., Niles W.D., Horwitz M.A. Purification of Legionella pneumophila major outer membrane protein and demonstration that it is a porin. Journal of bacteriology. 1985, 162(1): 85-91.

42. Gaia V., Fry N.K., Afshar B. et al. Consensus sequence-based scheme for epidemiological typing of clinical and environmental isolates of Legionella pneumophila. J. Clin. Microbiol. 2005, 43(5): 2047-2052.

43. Gibson G.R., Roberfroid M.B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. Journal of nutrition. 1995, 125: 1401-1412.

44. Gella F.J., Serraa J., Generx J. Latex agglutination procedure in immunodiagnosis. Pure&Appl. Chem. 1991, 63(8): 1131-1134.

45. George J.R., Pinel L., Reeves M.W., Harrell W.K. Amino acid requirements of Legionella pneumophila. Journal of clinical microbiology. 1980, 11(3): 286-291.

46. Gill S.R., Pop M., DeBoy R.T., Eckburg P.B., Turnbaugh P.J., Samuel B.S., Gordon J.I., Relman D.A., Fraser-Liggett C.M., Nelson K.E. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. 2006, 312(5778): 1355-1359.

47. Gore C., Munro K., Lay C. et al. Bifidobacterium pseudocatenulatum is associated with atopic eczema: a nested case-control study investigating the fecal microbiota of infants. J. Allergy. Clin. Immunol. 2008, 121(1): 135-40.

48. Helbig J.H., Ludvig В., Luck P.C., Groh A., Witzleb W., Hacker J. Monoclonal antibodies to Legionella mip proteins recognize genus- and species-specific epitopes. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 1995, 2(2): 160-165.

49. Helbig J.H., Luck P.C. Knirel Y.A., Witzleb W., Zahringer U. Molecular characterization of virulence-associated epitope on the lipopolisaccharide of Legionella pneumophila serogroup 1. Epidemiol. Infect. 1995, 115: 71-78.

50. Helbig J.H., Benson R.F., Pelaz C., Jacobs E., Luck P.C. Identification and serotiping of atypical Legionella pneumophila strains isolated from human and environmental sources. Juornal of applied microbiology. 2007, 102: 100-105.

51. Hindahl M.S., Iglewski B.H. Outer membrane proteins from Legionella pneumophila serogroups and other Legionella species. Infection and immunity. 1986, 51(1): 94-101.

52. Hunter P.R., Gaston M.A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity. J. Clin. Microbiol. 1988, 26(11): 2465-2466.

53. HC info. Legionella pneumophila. Outbreaks, http://hcinfo.com/outbreaks-news.htm

54. Isolation and identification of Legionella species an overview. Microgen bioproducts newsletter, 2002, 9. www.microgenbioproducts.com

55. Joly J.R., McKinney R.M., Tobin J.O., Bibb W.F., Watkins J.D., Ramsay D. Development of a standardized subgrouping scheme for Legionella pneumophila serogroup 1 usng monoclonal antibodies. Journal of clinical microbiology. 1986, 83(4): 768-771.

56. Kibbe W.A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Res. 2007, 35. http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html

57. Leahy S.C., Higgins D.G., Fitzgerald G.F., van Sinderen D. Getting better with bifidobacteria Journal of Applied Microbiology. 2005, 98: 1303-1315.

58. Legionella and the prevention of legionellosis. Editors: Bartram J., Chartier Y., Lee J. V., Pond K, Surman-Lee S. World Health Organization, 2007.

59. Legionella: Molecular Microbiology. Editors: Heuner K, Swanson M. ISBN: Caister Academic Press, 2008.

60. Lindquist D.S., Nygaard G., Thaker W.L., Benson R.F., Brenner D.J., Wilkinson H.W. Thirteenth serogroup of Legionella pneumophila isolated from patients with pneumonia. Journal of clinical microbiology. 1988, 26(3): 586-587.

61. Luck P.C., Schneider Т., Wagner J., et al. Community-acquired Legionnaires' disease caused by Legionella pneumophila serogroup 10 linked to the private home. J. Med. Microbiol. 2008, 57(Pt 2): 240-243.

62. McKinney R.M., Thacker L., Harris P.P., Lewallen K.R., Herebert G.A., Edelstein P.H., Thomason B.M. Four serogroups of Legionnaires' disease bacteria defined by direct immunofluorescence. Annals of internal medicine. 1979, 90(4): 621-624.

63. Mclnerney J.O., Mullarkey M, Wernecke M.E., Powell R. Bacteria and Archaea: Molecular techniques reveal astonishing diversity. Biodiversity, 2002,3(2): 3-10.

64. Method for detection of Legionella bacteria employing purified antigen-specific antibodies. European Patent EP1107773

65. Meghrous J., P.Euloge, A.M. Junelles, J. Ballongue H. Petitdemange screening of Bifidobacterium strains for bacteriocin production. Biotechnology letters. 1990, 12(8): 575-580.

66. Mevissen-Verhage E.A.E., Marcelis J.H., De Vos M.N. et al. Bifidobacterium, Bacteroides and Clostridium spp. in fecal samples from breast fed and bottle-fed infants with and without iron supplement. J. Clin. Microbiol. 1987, 25: 285-289.

67. Mitsuoka T. Vergleichende Untersuchungen uber die Bifidobakterien aus dem Verdauungstrakt von Menschen und Tieren. Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infek-tionskr. Hyg. Abt. 1 Orig. Reihe A. 1969, 210: 52-64.

68. Mitsuoka Т., Hayakawa K., Kimura N. The fecal flora of man. II. Communication: the composition of bifidobacterium flora of different age groups. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1 Abt. Orig. A. 1974, 226:469-478.

69. Moubareck C., Gavini F., Vaugien L., Butel M.J., Doucet-Populaire F. Antimicrobial susceptibility of bifidobacteria. 2005, 55: 38-44.

70. Murga R, Forster T.S., Brown E., Pruckler J.M., Fields B.S., Donlan RM. Role of biofilms in the survival of Legionella pneumophila in a model potable-water system. Microbiology. 2001, 147: 3121-3126.

71. Nielsen D.S., Moller P.L., Rosenfeldt V. et al. Case study of the distribution of mucosa-associated Bifidobacterium species, Lactobacillus species, and other lactic acid bacteria in the human colon. Appl. Environ. Microbiol. 2003,69(12): 7545-7548.

72. Ratcliff R.M., Lanser J.A., Manning P.A., Heuzenroeder M.W. Sequence-Based classification scheme for the genus Legionella targeting the mip gene. J. Clin. Microbiol. 1998, 36 (6): 1560-1567.

73. Reuter G. Vergleichende Untersuchungen uber die Bifidus-Flora im Sfuglings- und Erwachsenensthul. Zentralbl. 1-14. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1 Abt. Orig. 1963; 191: 486-507.

74. Reuter G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology. 2001, 2(2): 4353.

75. Sakata Sh., Kitahara M., Sakamoto M., Hayashi H., Fukuyama M., Benno Y. Unification of Bifidobacterium infantis and Bifidobacterium suis as Bifidobacterium longum. International journal of systematic and evolutionary microbiology. 2002, 52: 1945-1951.

76. Sakata Sh., Ryu Ch.S., Kitahara M., Sakamoto M., Hayashi H., Fukuyama M., Benno Y. Characterization of the genus Bifidobacterium by automated ribotyping and 16S rRNA gene seguences. Micrbiol. Immunol. 2006, 50(1): 1-10.

77. Satocari R.M., Vaughan E.E., Akkermans D.L., Saarela M., de Vos W.M. Bifidobacterial diversity in human feces detected by genus-specific PCR and denaturing gradient gel electrophoresis. Applied and environmental microbiology. 2001, 67(2): 504-513.

78. Scaturro M, Losardo M., De Ponte G., Ricci M.L. Comparison of three molecular methods used for subtiping of Legionella pneumophila strains isolated during an epidemic of legionellosi in Rome. Journal of clinical microbiology. 2005,43(10): 5348-5950.

79. Smehilova M., Vilkova E., Nevoral J. Comparison of intestinal microflora in healthy infants and infants with allergic colitis. Folia Microbiol (Praha). 2008; 53(3): 255-258.

80. Stackebrandt E., Rainey F.A., Ward-Rainey N.L. Proposal for a new hierarchic classification system, Actinobacteria classis nov. International journal of systematic bacteriology, 1997, 47: 479-491.

81. Standard European Working Group on Legionella Infections Amplified Fragment Length Polymorphism Protocol (Version 1.2)

82. Stone B.J., Kwaik Y.A. Expression of multiple pili by Legionella pneumophila: identification and characterization of type IV pilin gene and its role- in adherence to mammalian and protozoan cells. J. Clin. Microbiol. 1998, 66 (4): 1768-1775.

83. Thacker W.L., Benson R.F., Wilkinson H.W., Ampel N.M., Wing E.J., Steigerwalt A.G., Brenner D.J. 11th serogroup of Legionella pneumophila isolated from a patient with fatal pneumonia. Journal of clinical microbiology. 1986, 23(6): 1146-1147.

84. Thacker W.L., Wilkinson H.W., Benson R.F., Brenner D.J. Legionella pneumophila serogroup 12 isolated from human and environmental sources. Journal of clinical microbiology. 1987, 25(3): 569-570.

85. Thtirmer A, Helbig J.H., Jacobs E., Luck P.C. PCR-based 'serotyping' of Legionella pneumophila. J Med Microbiol. 2009,58(Pt5): 588-595.

86. Politi B.D., Fraser D.W., Mallison G.F., Mohatt J.V., Morris G.K., Patton C.M., Feeley J.C., Telle R.D., Bennett J.V. A major focus of Legionnaires' disease in Bloomington, Indiana. Ann Intern Med. 1979,90(4): 587-591.

87. Water recreation and disease. Plausibility of associated infections: acute effects, sequelae and mortality. Edited by: Kathy Pond World Health Organization, 2005.

88. Van Belkum A, Struelens M., Quint W. Typing of Legionella pneumophila strains by polymerase chain reaction-mediated DNA fingerprinting. Journal of clinical microbiology, 1993, 31(8): 2198-2000.

89. Ventura M., Elli M., Reniero R, Zink R. Molecular microbial analysis of Bifidobacterium isolates from (liferent environments by the species-specificc amplifed ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA). FEMS Microbiology Ecology. 2001,36:113-121.

90. Ventura M., Zink R. Rapid identification, differentiation, and proposed new taxonomic classification of Bifidobacterium lactis. Appl. Environ. Microbiol. 2002, 68(12): 6429-6434.1 r\ л

91. Vilkova E., Nevoral J., Jencikova В., Kopecny J., Godefrooij J., Trojanova I., Rada V. Detection of infant faecal bifidobacteria by enzymatic methods. J Microbiol Methods. 2005, 60(3): 365-73.

92. Wilson D.A., Reischl U., Hall G.S., Procop G.W. Use of partial 16S rRNA Gene sequencing for identification of Legionella pneumophila and non-pneumophila Legionella spp. Journal of clinical microbiology. 2007, 45 (91): 257-258.

93. Woese C, Fox G. Phylogenetic structure of the prokaiyotic domain: the primary kingdoms. Proc Natl Acad Sci USA 1977,74 (11): 5088-5090.

94. Woese C.R A new biology for a new century. Microbiology and molecular biology reviews. 2004,68(2): 173-186.

95. Yildirim Z, Johnson M.G. Characterization and antimicrobial spectrum of bifidocin В, a bacteriocin produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454. JFoodProt. 1998,61(1): 47-51.

96. Список публикаций по теме диссертации

97. Статьи в рецензируемых журналах:

98. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №2008128540 от 15.07.2008 «ШтаммBifidobacterium bifidum OV-19.».

99. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №2008128541 от 15.07.2008 «ШтаммBifidobacterium bifidum OV-7.».

100. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №2008128542 от 15.07.2008 «ШтаммBifidobacterium longum OV-20.».

101. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №2008128543 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium pseudocatenulatum OV-17.».

102. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №2008128544 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium angulatum OV-15.».

103. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №2008128545 от 15.07.2008 «Штамм. Bifidobacterium pseudocatenulatum OV-2.».1. Благодарности