Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая характеристика штаммов B. pertussis и совершенствование микробиологического мониторинга коклюшной инфекции

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика штаммов B. pertussis и совершенствование микробиологического мониторинга коклюшной инфекции"

На правах рукописи

ИВАШИННИКОВА ГАЛИНА АНТОНОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ В. PERTUSSIS И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА КОКЛЮШНОЙ

ИНФЕКЦИИ

03.02.03 - Микробиология 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

6 MAP 2013

■ШІШ

Москва - 2013

005050423

005050423

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

доктор медицинских наук Борисова Ольга Юрьевна

доктор биологических наук Алешкин Андрей Владимирович

Официальные опноненты:

академик РАЕН и РАМТН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией генетики вирулентности бактерий НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава РФ

профессор, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой микробиологии и вирусологии педиатрического факультета ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава РФ

Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Московская область, г. Оболенск).

диссертационного совета Д 208.046.01 в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д.

Бондаренко Виктор Михайлович

Кафарская Людмила Ивановна

Защита состоится

в 10 часов на заседании

10.

Г)

Автореферат разослан < Ч г

Ученый секретарь диссертационного сове доктор медицинских наук

Борисова Ольга Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Массовая специфическая вакцинопрофилактика коклюша в нашей стране позволила снизить заболеваемость коклюшем в последнее десятилетие более чем в 60 раз. Заболеваемость коклюшем в Российской Федерации за последние 5 лет стабилизировалась на уровне 2,5 - 3,8 на 100 тыс. населения. Вместе с тем, даже на фоне высокого уровня охвата профилактическими прививками (до 95,0%), по-прежнему регистрируются периодические подъемы заболеваемости, как за счет непривитых, так и привитых детей, тяжелые формы заболевания и единичные летальные исходы. Наибольшие показатели заболеваемости и летальные исходы отмечаются преимущественно среди детей в возрасте до года. Одной из особенностей эпидемического процесса коклюшной инфекции является увеличение заболеваемости среди школьников 6-10 лет, которые составляют 43,1% от числа всех заболевших, что свидетельствует о снижении противококлюшного иммунитета у детей данной возрастной группы (Лыткина И.Н., 2004; Герасимова А.Г., 2004; Озерецковский H.A., 2004; Чистякова Г.Г., 2005; Попова О.П., 2005, 2009; Таточенко В.К., 2004, 2009; Бабаченко И.В., 2006, 2009; Тимченко В.Н., 2005, 2007; Петрова М.С., 2008; Селезнева Т.С., 2009; Лобзин Ю.В., 2011; Онищенко Г.Г, 2006, 2008, 2012).

Многочисленные исследования, проводимые, как отечественными, так и зарубежными специалистами, в более чем 30 странах мира показали, что возбудитель коклюша подвержен изменчивости, которая формируется на фоне длительной массовой иммунизации (Mooi F., 1998, 1999, 2001, 2009, 2010; Boursaux-Eude С., 2000; Cassiday P., 2000; Fry N„ 2001; van Loo 1., 2002; Курова H„ 2003; Семенов Б.Ф., 2003; Packard E„ 2004; Schouls L., 2004; van Amersfoorth S., 2005; Мазурова И.К., 2005, 2008; Борисова О.Ю., 2008, 2010 ; Litt D„ 2009; Advani A., 2009, 2011; Kourova N„ 2010; Schmidtke A., 2012; и др.). Фенотипическая изменчивость проявляется не только в смене циркулирующего серотипа штаммов В. pertussis, но и в снижении их чувствительности к антибиотикам и появлении резистентных форм (Hill В., 2000, Gordon К, 2001; Yao S., 2008; Sitchenko V., 2010; Fry N., 2010). А генотипическая - в штаммовом SN-полиморфизме (SNP) В. pertussis, который к настоящему времени описан у 16 генов с наиболее выраженными изменениями в генах — ptxA, ptxC, prn, fim2, fimí, tcfA и ptxP, кодирующих антигенные детерминанты. Предыдущими исследованиями, проведенными во ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (Мазурова И.К., 2005, 2008; Борисова О.Ю., 2007, 2010; Гадуа Н., 2012), установлено, что распространяются штаммы с новыми «невакцинными» аллелями основных генов патогенности, которые несут мутационные изменения, затрагивающие иммуногенные области генома возбудителя.

В последние годы для унификации результатов генотипирования штаммов B.perussis, полученных в различных странах, применяется мультилокусное секвенирование ДНК (MLST) и его модификации (MAST), позволяющие оценивать клональный состав циркулирующих популяций возбудителя коклюша (van Loo I., 2002). Проведенный скрининг штаммов B.pertussis, циркулирующих в различных

3

странах мира, показал значительные изменения клонального состава и глобальность происходящих изменений состава популяций возбудителя на фоне эпидемических подъемов заболеваемости коклюшем (Schouls L., 2004; van Amersfoorth S., 2005; Advani A., 2009; Litt D„ 2009; King A., 2010; Mooi F., 2010; Schmidtke A., 2012; и др.).

Поэтому, в настоящее время большое значение имеет наблюдение за биологическими свойствами штаммов В.pertussis в нашей стране и разработка ускоренных молекулярно-биологических методов, позволяющих выявлять измененные клоны возбудителя, которые могут оказывать влияние на течение эпидемического и инфекционного процессов. Кроме того, особую актуальность приобретает использование современных фундаментальных достижений биотехнологии в области таксономической идентификации (генетического разнообразия). В частности, разработка инновационных биокибернетических продуктов - отечественного программного обеспечения, являющегося инструментом биотехнологии, применяемым для накопления биотехнологической информации (знаний о строении макромолекул ДНК/РНК/белков, изменения в строение генома микроорганизмов и т.д.), ее анализа (эволюционный биологический анализ), распространения и последующего применения (создание обширных и доступных баз данных), а так же создания новых способов проведения молекулярно-генетического мониторинга возбудителя коклюша в рамках совершенствования технологической базы системы надзора за патогенными микроорганизмами, направленной на решение медицинских проблем в целях улучшения охраны здоровья населения.

Целью исследования является совершенствование и проведение микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга для оценки фенотипических и генотипических свойств циркулирующих штаммов B.pertussis, а также разработка биоинформационного алгоритма для филогенетического анализа их нуклеотидных и белковых последовательностей.

Задачи исследования:

1. Провести микробиологический мониторинг циркулирующих штаммов В. pertussis, выделенных в 2006 - 2012 гг., по серологическим свойствам (с определением серотипа) и уровню их чувствительности к антибактериальным препаратам.

2. Оптимизировать методы проведения мультилокусного секвенирования ДНК (MLST, MAST1, MAST2), в соответствии с международными протоколами, и провести генотипирование штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в России, методами MLST, MAST1 и MAST2.

3. Выявить особенности клонального состава популяции штаммов B.pertussis, циркулировавших в различные периоды эпидпроцесса коклюшной инфекции, и провести анализ филогенетического родства с построением филогенетического дерева.

4. Разработать биоинформационный алгоритм и на его основе программное обеспечение для Intel х86 совместимом компьютере с системой Microsoft® для филогенетического анализа нуклеотидных и белковых последовательностей с

возможностью построения мультипараметрического дерева Minimum Spanning Tree (MST).

5. Разработать ускоренный молекулярно-биологический метод генотипирования штаммов В.pertussis по структуре промотора ptxP, основанный на изучении длин рестрикционных фрагментов амплифицированных продуктов (ПЦР-ПДРФ), и апробировать его для идентификации штаммов В.pertussis. Научная новизна

Проведенный микробиологический мониторинг штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем, показал, что по-прежнему циркулируют штаммы серотипа 1.0.3. и прослеживается тенденция снижения обшей антибиотикочувствительности штаммов возбудителя коклюша к антибактериальным препаратам. Установлено, что в последние 5 лет в популяции B.pertussis преобладают штаммы с промежуточной чувствительностью к эритромицину и азитромицину.

Впервые с помощью мультилокусного секвенирования ДНК (MLST и MAST) представлена генетическая характеристика штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в России, и выявлена поступательная смена штаммов с «вакцинными» на новые «невакцинные» сиквенс- и MAST-типы, которые в настоящее время заняли доминирующее положение в популяции, что расширило знания о клоналыюй организации, закономерностях циркуляции и формирования популяции возбудителя коклюша. Продолжение исследований по выявлению особенностей структуры генов ptxA, ptxC, flm3, prn, tcfA и промотора ptxP штаммов В. pertussis, выделенных в России в 2006-2012 гг., показало что, по-прежнему в популяции превалируют штаммы с новыми «невакцинными» аллелями этих генов и обнаружены новые значимые мутации в гене ргп, кодирующем пертактин.

Впервые разработан ускоренный молекулярно-биологический способ генотипирования штаммов В. pertussis, основанный на ПЦР-ПДРФ анализе, позволяющий выявлять штаммы с особенностями структуры промотора ptxP коклюшного токсина при проведении молекулярно-генетического мониторинга циркулирующей популяции штаммов возбудителя коклюша (заявка на изобретение «Способ молекулярно-генетического типирования штаммов В. pertussis» № 2012141063).

Впервые разработан биоинформационный алгоритм для филогенетического анализа нуклеотидных и белковых последовательностей, позволяющий накапливать и систематизировать данные о генетических особенностях В. pertussis и проводить построение минимального мультипараметрического остовного дерева (Minimum Spanning Tree - MST) для популяции возбудителя (заявка на изобретение «Способ молекулярно-генетического мониторинга циркулирующих штаммов В. pertussis» № 2012153853).

Практическая значимость

Определены возможности использования мультилокусного секвенирования на основе схемы MAST2 для генотипирования штаммов B.pertussis, что позволит создать подходы для выявления эпидемических значимых штаммов B.pertussis, слежения за

5

появлением новых генотипов, что будет, в свою очередь, способствовать повышению эффективности эпидемиологического надзора за коклюшной инфекцией. Новые данные о динамике распространения штаммов B.pertussis с промежуточной чувствительностью к антибактериальным препаратам могут быть использованы для оптимизации антибиотикотерапии при коклюшной инфекции.

Разработанный ускоренный молекулярно-биологический способ генотипирования штаммов В. pertussis, основанный на ПЦР-ПДРФ анализе, дает возможность проводить скрининг большого количества штаммов при мониторинге циркулирующей популяции для дифференцирования штаммов с особенностями структуры промотора ptxP коклюшного токсина

Разработанное на основе биоинформационного алгоритма программное обеспечение «SEQ» для Intel х86 совместимом компьютере с системой Microsoft® позволяет получить высокоинформативную характеристику популяции штаммов в виде графа, построенного с учетом определения степени родства штаммов между собой, частоты их встречаемости, места и периода (территориального и временного признака) их выделения, что дает возможность оценивать генетическую вариабельность и прогнозировать развитие клонального состава циркулирующей популяции возбудителя коклюша.

Создан банк ДНК B.pertussis, обладающих различным уровнем чувствительности к антибактериальным препаратам и генетической структурой (сиквенс-типами), который можно использовать в дальнейших исследованиях для прогнозирования распространения эпидемически значимых штаммов возбудителя коклюша, а так же изучения молекулярно-генетических механизмов их резистентности к антибактериальным препаратам. Внедрение результатов работы в практику

Поданы заявки на изобретения: 1) на новый молекулярно-генетический метод типирования штаммов В. pertussis, имеющих различную структуру промотора ptxP -«Способ молекулярно-генетического типирования штаммов В. pertussis» per. № 2012141063 от 26.09.2012; 2) на новый способ филогенетического анализа штаммов В. pertussis с помощью разработанного биоинформационного алгоритма - «Способ молекулярно-генетического мониторинга циркулирующих штаммов В. pertussis» per. № 2012153853 от 13.12.2012. Результаты проведенных исследований нашли применение в лекционном цикле и практических занятиях на курсах повышения квалификации для врачей- бактериологов «Актуальные вопросы современной медицинской микробиологии», проводимых на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (2009; 2010 гг.); семинаров тематического усовершенствования «Биологические свойства возбудителя коклюша и лабораторная диагностика» для врачей-бактериологов филиалов ФБУЗ ЦГиЭ г. Москвы (2009 г., 2010 г., 2012 г). Оптимизированные и разработанные молекулярно-биологические методики генотипирования штаммов B.pertussis используются в Референс-центре ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора при проведении

микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга штаммов возбудителя коклюша, циркулирующих на территории России. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Микробиологический мониторинг показал, что по-прежнему циркулируют штаммы B.pertussis серотипа 1.0.3 и произошли изменения уровня их чувствительности к антибактериальным препаратам - увеличилась частота выявляемое™ штаммов с промежуточной чувствительностью к эритромицину, азитромицину и ампициллину среди штаммов В. pertussis, выделенных в 20002012 гг.

2. С помощью методов MLST, MAST1 и MAST2 показаны изменения клонального состава популяции возбудителя коклюша - поступательная смена штаммов с «вакцинными» на новые «невакцинные» сиквенс-, MAST-типы и выявлена тенденция нарастания степени генетической гетерогенности современной популяции В. pertussis.

3. Разработаны новые биотехнологические подходы - молекулярно-биологический метод мониторинга возбудителя коклюша и биоинформационный алгоритм, являющийся основой программного обеспечения для анализа биотехнологической информации о строении макромолекул ДНК/РНК/белков и генома микроорганизмов в рамках совершенствования технологической базы системы надзора за патогенными микроорганизмами.

Апробация работы

Диссертация апробирована на совместном заседании секций Ученого совета «Медицинская биотехнология» и «Эпидемиология, микробиология, клиника инфекционных заболеваний» ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол № 7 от 13 декабря 2012 г.

Результаты диссертационной работы представлены на конференциях молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения» (г. Нижний Новгород, 2011 г.); III Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва, 2011 г.); «Фундаментальные и прикладные аспекты анализа рисков здоровья населения» (г. Пермь, 2012 г.); IV Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва, 2012 г.). Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, в том числе 5 статей — в рецензируемых изданиях, 1 статья - в другом издании, 6 работ - в материалах конференций. Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 187 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований, заключение и выводы. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 41

рисунком. Список литературы включает 258 источников, в том числе 53 -отечественных и 205 - зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы Штаммы микроорганизмов. В работе изучены фенотипические и генотипические свойства 313 штаммов В.pertussis, выделенных от больных коклюшем и полученных из бактериологических лабораторий ЛПО и ФБУЗ ЦГиЭ в субъектах Российской Федерации в период 2008-2012 гг., клинического материала от больных, госпитализированных в ИКБ №1 (г. Москва), а также штаммы В. pertussis, выделенные от больных коклюшем в 1948-2006 гг. (из коллекции ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) и три производственных штамма В. pertussis (№ 475, 267, 305), используемые для АКДС-вакцины в России (из коллекции ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава РФ).

Микробиологические методы. Штаммы В. pertussis засевали на плотную питательную среду КУА (производство ФБУН НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава РФ), термостатировали в течение 48-72 часов при температуре 36°С. и оценивали по культурально-морфологическим, тинкториальным и серологическим свойствам, согласно «Инструкции по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше» (1983 г.). Изучение серологических свойств В. pertussis проводили путем постановки реакции агглютинации на стекле с использованием диагностических сывороток (производство ФБУН НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава РФ) к типовым коклюшным агглютиногенам 1, 2, 3.

Изучение штаммов B.pertussis к антибактериальным препаратам осуществляли согласно МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотическим препаратам», стандартам комитета NCCLS (National committee for Clinical Laboratory Standards) и в соответствии с методикой В. Hill (2000), проводившего скрининговые исследования по выявлению резистентных штаммов возбудителя коклюша. Использовали два метода: диско-диффузионный и метод «Е-test» с антимикробными препаратами («HIMEDIA», Индия): эритромицин 15 мкг, ампициллин 10 мкг, гентамицин 30 мкг, спирамицин 30 мкг, кларитромицин 15 мкг. Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) препарата эритромицина проводили с использованием стрипов «E-test» с градиентом концентраций антибиотиков 0,001 -256 мкг/мл.

Молекулярно-генетические методы исследования. Хромосомальную ДНК выделяли методом кипячения согласно (Маниатис Т., 1984 г.) из 72-часовой культуры В. pertussis, выращенной на среде КУА. Выявление фрагментов генов ptxA, ptxC, ßm3, tcfA, prn и промотора ptxP осуществляли с помощью ПЦР согласно международным протоколам (Mooi F., 2000, 2009; van Loo I., 2002). Амплификацию участков генов проводили в термоциклере «Терцик» в автоматическом режиме с последующим горизонтальным электрофорезом в 1,8% агарозном геле, используя маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Особенности структуры

8

генаptxA выявляли с помощью ПЦР-ПДРФ-анализа (Борисова О.Ю., 2008); генаргп -«гнездовой» ПЦР (Muyldermans G., 2004). Секвенирование фрагментов генов ptxA, ptxC, ргп, tcfA, ßm3 и ptxP штаммов B.pertussis осуществляли согласно общепринятому методу Сенджера (Sanger F., 1977) с помощью ABI PRISM BigDye Terminator Cycle sequencing ready reaction kit на ABI DNA-секвенаторе («Perkin Elmer Applied Biosystems») в компании «ПИННИ». Генотипирование штаммов проводили по оптимизированному протоколу, основанному на международных схемах MLST, MAST1 и MAST2 для B.pertussis (van Loo I. 2004, Schouls L. 2004). Статистическая обработка результатов, анализ данных и программное обеспечение. Статистическую обработку результатов и анализ полученных данных осуществляли с помощью общепринятых алгоритмов в программах Microsoft Office 2007. В процессе работы использовали специальное программное обеспечение с целью подбора последовательности специфических праймеров DNASIS-MAX 5.0. (MiraBio, Hitachi); выбор эндонуклеаз рестрикции для ПЦР-ПДРФ анализа осуществляли с помощью on-line программы RebSites

(http://tools.neb.com/REBsites/index.php); результаты секвенирования, полученные в формате хроматограммы, обрабатывали в программе CromasLite, секвенированные последовательности сопоставляли с международной on-line базой данных EMBL/NCBI с помощью сервиса BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore). Филогенетическую реконструкцию осуществляли по алгоритму Neighbor joining с использованием программ MEGA 5.0 (Tamura К., Peterson D., Peterson N. et al., 2011) и DNASIS MAX 5.0. Выравнивание последовательностей проводилось автоматически с применением алгоритма ClastalW.

Работа выполнялась в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Эпидемиология, микробиология» Федеральной целевой программы «Научные исследования и разработки с целью обеспечения санитарно-эпидемического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в Российской Федерации 2011-2015 гг.» и деятельности Референс-центра ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора по мониторингу за возбудителями кори, краснухи, эпидемического паратита, коклюша и дифтерии при проведении микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга штаммов возбудителя коклюша, циркулирующих на территории России.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика штаммов В.

pertussis

Изучение серотипового пейзажа штаммов В. pertussis. Серологические свойства изучены у штаммов В. pertussis, выделенных в период 2006 - 2012 гг. Выявлено, что большинство (89,3%) штаммов относились к серотипу 1.0.3, 8,40% штаммов - к серотипу 1.2.3.; 1,15% штаммов - к серотипу 1.0.0. и 1,15% штаммов - к серотипу 1.2.0. Следовательно, штаммы B.pertussis серотипа 1.0.3, сменившие в середине 1960-х годов штаммы допрививочного периода - 1.2.0 и 1.2.3, продолжают превалировать в популяции штаммов возбудителя коклюша уже на протяжении 40 лет.

9

Определение чувствительности штаммов В.pertussis к антибактериальным препаратам. Изучение чувствительности проведено у 178 штаммов В. pertussis к 6 антибактериальным препаратам - эритромицину, азитромицину, спирамицину, кларитромицину, ампициллину и гентамицину (Рис. 1А, 1Б, 1В, 1Г). Для анализа полученных данных все выделенные штаммы В. pertussis были разделены на три группы в зависимости от периода их выделения - в первую группу вошли штаммы В. pertussis, выделенные в 1948-1989 гг., во вторую группу — штаммы, выделенные в 1990-2005 гг. и в третью группу - штаммы, выделенные в 2006-2012 гг.

Показано, что штаммы В.pertussis, выделенные в 1948-1989 гг., преимущественно (в 81,0% случаях) имели высокую чувствительность к эритромицину и 19,0% - обладали промежуточной чувствительностью к данному препарату (Рис. 1А). Во втором периоде (1990-2005 гг.) 78,0% штаммов характеризовались высокой и 22,0% штаммов - промежуточной чувствительностью к эритромицину. Среди штаммов В.pertussis, выделенных в последние 6 лет, 59,3% штаммов имели промежуточную чувствительность к эритромицину.

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

19°/i

22%

5Э,3(

□ штаммы с промежуточной % чувствительностью к эритромицину

■ штаммы с высокой чувствительностью к эритромицину

1948-1989 1990-2005 2006-2012

А

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

10%

90%

17%

27

■ штаммы, резистентные к ампициллину

□ штаммы с промежуточной чувствительностью к ампициллину

■ штаммы с высокой чувствительностью к ампициллину

1948-1989 1990-2005 2006-2012

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

14%

56%

$1%

□ штаммы с промежуточной чувствительностью к азитромицину

В штаммы С ВЫСОКОЙ ЧуВСГВИТбЛЬНОСГЬЮ К

азитромицину

1948-1989 1990-2005 2006-2012

100% 80% 60% 40% 20% 0%

78%

22%

74%

26%

■ промежуточно-чувствительные

□ штаммы с высокой чувствительностью

кларитромицин спирамицин

в г

Рисунок 1. Частота выявляемое™ штаммов В. pertussis с разным уровнем чувствительности к препаратам эритромицина (А), азитромицина (Б), ампициллина (В), кларитромицина и спирамицина (Г)

При количественной оценке МПК эритромицина, для 96,0% штаммов первого периода МПК составила менее 0,01 мкг/мл, во втором периоде увеличилась до 0,060 мкг/мл, а для штаммов В. pertussis, выделенных в последние 6 лет среднее значение МПК составило 0,125 мкг/мл.

В отношении азитромицина показана высокая чувствительность штаммов В. pertussis, выделенных на протяжении всех периодов наблюдения (Рис. 1Б). Среди штаммов, выделенных в первый период, 94% штаммов характеризовались высокой чувствительностью к азитромицину и только 2 штамма имели промежуточную чувствительность к данному антибиотику. Во втором периоде - 86,0% штаммов имели высокую чувствительность к азитромицину, однако, частота выявляемое™ штаммов с промежуточной чувствительностью к препарату увеличилась до 14,0% и в настоящее время достигла 32,0%.

Чувствительность штаммов В. pertussis к спирамицину и кларитромицнну изучена на примере штаммов, выделенных в последние 6 лет. В отношении кларитромицина высокочувствительными были 78,0% изученных штаммов и 22% -промежуточно чувствительными, в отношении спирамицина - 74,0% штаммов В. pertussis характеризовались высокой и 26,0% штаммов - промежуточной чувствительностью (Рис. 1Г).

Среди штаммов В. pertussis, выделенных в первый период, большинство были чувствительными к ампициллину и только 10,0% штаммов обладали промежуточной степенью чувствительности (Рис. 1В). Во втором периоде, частота выявляемое™ штаммов с промежуточной чувствительностью достигла 17,0%, однако доминирующее положение в популяции удерживали штаммы с высокой чувствительностью к этому препарату. Частота выявляемое™ штаммов, выделенных в 2006-2012 гг, с промежуточной чувствительностью составила только 6,0%, однако был выделен 1 резистентный штамм В. pertussis. Штаммы с высокой чувствительностью к ампициллину продолжают доминировать в настоящее время.

Исследование чувствительности штаммов В. pertussis к гентамицину показало, что все изученные штаммы, в том числе, и штаммы, выделенные в последние 6 лет, являются высокочувствительными к этому препарату. Следовательно, установлено, что за несколько десятилетий активного использования антибиотиков возбудитель коклюша претерпел ряд изменений, проявляющихся в снижении чувствительности штаммов В. pertussis к эритромицину и азитромицину.

Это может свидетельствовать о возможном снижении эффективности действия данных антибактериальных препаратов на возбудителя коклюша и расширении у него адаптационных механизмов на фоне длительного применения антибактериальной терапии. Показана высокая чувствительность циркулирующих штаммов В. pertussis к спирамицину, кларитромицину, ампициллину и гентамицину, однако применение последних двух препаратов ограничено у детей младенческого возраста.

Особенности структуры генов ptxA, ptxC, fim3, prn, tcfA и промотора ptxP штаммов В. pertussis, выделенных в России в 2006-2012 гг. Нами продолжены исследования по изучению динамики распространения штаммов В. pertussis с

11

различной структурой генов ptxA и ptxC, кодирующих S1 и S3 субъединицы коклюшного токсина, гена flm3, кодирующего фимбриальный белок Fim3, и промотора ptxP коклюшного токсина. Показано, что среди штаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем в России в 2006-2012 гг., доминирующее (в 92,3% случаев) положение продолжают занимать штаммы с новым «невакцинным» ptxAl аллелем, имеющим значительные мутационные изменения. Однако, продолжают выделяться штаммы с «вакцинными» ptxA2/A4 аллелями гена в 7,7% случаев, имевшими преимущественное распространение в допрививочный период и первые 10 лет проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной.

При изучении динамики распространения штаммов В. pertussis с различной структурой гена ptxC установлено, что большинство (91,5%) изученных штаммов несут «невакцинный» ptxC2 аллель гена ptxC, однако, штаммы с «вакцинным» ptxCl аллелем продолжают циркулировать в популяции в 8,4 % случаев.

По структуре промоторной области ptxP коклюшного токсина установлено, что большинство (92,2%) штаммов несут ptxP3 аллель промотора, который характеризуется значимыми мутационными изменениями в функциональной области этой регуляторной детерминанты, опосредующей экспрессию оперона ptx и влияющую на увеличение продукции коклюшного токсина. Однако штаммы с «невакцинным» ptxP2 и «вакцинным» ptxPl аллелями продолжают регистрироваться (до 3,9% случаев).

Исследование распространения штаммов В. pertussis с различной структурой гена tcfA выявило, что штаммы, несущие «вакцинный» tcfA2 аллель, доминируют в 99,4% случаев, однако в 2011 году был выделен штамм, несущий tcfA5 «невакцинный» аллель гена, который ранее на территории России не регистрировался, т.е. популяция штаммов В. pertussis по структуре гена tcfA практически не претерпела изменений и штаммы с «вакцинным» tcfA2 аллелем продолжают доминировать в популяции.

При изучении структуры гена flm3 штаммов В. pertussis, оказалось, что большинство (71,6%) штаммов несут «невакцинный»ßm3B аллель гена. Вместе с тем, продолжают выделяться штаммы с «вакцинным» ßm3A аллелем в 27,8% случаев. Среди штаммов B.pertussis, выделенных в 2012 году был выявлен 1 штамм, несущий уникальный «невакцинный»flm3A* аллель гена.

В отношении гена ргп, по сравнению с предыдущими исследованиями, при увеличении количества изучаемых штаммов В. pertussis и расширении исследований, охватывающих штаммы В. pertussis, выделенные в различных регионах России, обнаружены штаммы пяти аллельных вариантов - ргп!, ргп2, ргпЗ, ргп4 и ргп9. Из них 79,4% штаммов характеризовались «невакцинным» prrt2 аллелем, 10,3% штаммов - «невакцинным» ргп4 и 10,3% штаммов - «невакцинным» ргпЗ аллелями. В 2010 г. впервые был выделен штамм В. pertussis, несущий «невакцинный» ргп9 аллель, и в течение последующих двух лет частота выявляемое™ таких штаммов увеличилась до 38,4%, а штаммов с ргп2 аллелем снизилась до 53,6%. Штаммы с ргп4 и ргпЗ аллелями в период 2010-2012 гг. не выделялись. Следовательно, учитывая

12

нарастающую в последние два года динамику увеличения удельного веса штаммов В. pertussis с ргп9 аллелем, можно говорить о начале смены доминирующего аллельного варианта гена ргп с ргп2 на ргп9 аллель.

Мультилокусное секвенирование ДНК (MLST) штаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем в России, и филогенетический анализ циркулирующих сиквенс-типов. С использованием оптимизированного метода MLST изучено 313 штаммов В. pertussis, выделенных в 1948 - 2012 гг. На основании полученных при секвенировании результатов проведена идентификация аллельного профиля и определение сиквенс-типа (ST) каждого штамма. Среди изученных штаммов B.pertussis идентифицированы аллели, формирующие шесть сиквенс-типов - ST1, ST2, ST3, ST5, ST8 и ST11. Из которых, согласно международным протоколам, ST1 соответствовал ptxA4- ptxCl- tcfA2, , ST2 -ptxA2-ptxCl-tcfA2, ST3 -ptxAl-ptxCl-tcfA2, ST5 - ptxA l-ptxC2-tcfA2, ST8 - ptxA2-ptxC2- tcfA2 и ST11 - ptxA2-ptxCl-tcfA2 аллельные профили (Рис. 2A). Для штаммов B.pertussis, выделенных в 1948 - 1959 гг., характерными были аллельные профили, определяющие два сиквенс-типа - ST1 и ST2, (66,6% и 33,4% соответствнно) Данные сиквенс-типы, согласно международной базе данных, являются «вакцинными».

Среди изученных штаммов B.pertussis, выделенных в 1960 - 1969 гг., 40,0% штаммов характеризовались ST2 и 40,0% - ST1 сиквенс-типами, но в популяции появились штаммы с новым «невакцинным» ST3 сиквенс-типом (20% случаев). В 1970 - 1979 гг. только 20% штаммов имели сиквенс-тип ST2, 53,3% - ST1 и выявлено увеличение частоты выявляемое™ штаммов с «невакцинным» сиквенс-типом ST3 до 26,7%. В период 1980 - 1999 гг. большинство штаммов B.pertussis имели сиквенс-тип ST3 (95,3% случаев) и появились штаммы с новым «невакцинным» сиквенс-типом ST5 (4,7% случаев), в то время как штаммы с «вакцинными» сиквенс-типами ST1 и ST2 не были выявлены, то есть доминирующе положение в популяции заняли штаммы с новыми сиквенс-типами.

В начале 2000-х годов штаммы с сиквенс-типом ST-5 заняли доминирующее положение в популяции (в 86% случаях) на фоне снижения удельного веса штаммов сиквенс-типа ST-3 до 14%, а в последние пять лет, в циркулирующей популяции штаммов возбудителя коклюша отмечается дальнейшая перестройка с увеличением гетерогенности, которая выражается в появлении штаммов B.pertussis с «невакцинными» сиквенс-типами - ST8 (1,6% случаев) и ST11 (0,54% случаев). Следовательно, в настоящее время популяция штаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем в России, характеризуется гетерогенностью и представлена штаммами 6 сиквенс-типов, из которых доминирующее положение занимают штаммы с новой клональной структурой - «невакцинными» сиквенс-типами.

Для выявления родственных связей между штаммами различных сиквенс-типов, нами проведен филогенетический анализ выявленных нуклеотидных последовательностей штаммов B.pertussis с построением филогенетических деревьев. При проведении MLST штаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем в 1948 - 2012 гг., идентифицированы штаммы 6 сиквенс типов - ST1, ST2, ST3, ST5,

13

ST8 и ST11. Однако, для повышения информативности дендрограммы в работу включены штаммы сиквенс-типов, выявленных на территории стран Европы - ST4, ST7, ST9 и ST10 (Рис. 2Б).

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 66 20% 10% 0%

,6(1%

о?

26

,7(%

io%

53

95

,зф%

i6i

,3(%

14°/

87

5ф%

□ ST-11

□ ST-8

□ ST-5

□ ST-3

□ ST-2

□ ST-1

J? & С? & -sf>

О-' СЧ' С\' Г\' p^J

лг" -я" Л4 ^ лг

4 4 4 4 # #

А Б

Рисунок 2. А - частота встречаемости штаммов В.pertussis различных сиквенс-типов, выделенных в России в 1948 - 2012 гг.

Б - филогенетическое дерево, построенное методом NJ для штаммов В. pertussis MLST типов ST1-ST11

Показано, что наиболее древним (близким к гипотетическому предку) является сиквенс-тип ST1, который входит в одну клональную группу с сиквенс-типом ST9. Практически одновременно с сиквенс-типом ST1 сформировался сиквенс-тип ST2. Сиквенс-тип ST3 относится к одной из наиболее поздних клональных групп, в которую так же входят ST4, ST10 и ST7, однако штаммы данных MLST типов на территории России выделены не были.

В настоящее время большинство выделенных штаммов В. pertussis относятся к сиквенс-типам ST5 и ST8, входящим в современную клональную группу, сформировавшуюся одновременно с клональной группой сиквенс-типа ST4, которые могут стать основой для формирования новых сиквенс-типов на основе данного кластера.

Таким образом, применение MLST для наблюдения за циркулирующими штаммами B.pertussis позволяет оценить взаимосвязь между штаммами, выделенными на разных территориях, выявить закономерности распространения и прогнозировать формирование популяции возбудителя коклюша в России. Молекулярно-генетический мониторинг штаммов В. pertussis с помощью методов MAST1 и MAST2 и филогенетический анализ циркулирующих генотипов. Для каждого из 313 изученных штаммов В. pertussis определен MAST1 тип, путем изучения аллельных комбинаций генов prn-ptxP-tcfA (Рис. ЗА).

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

67,8 а

>.1,9 .7 °А

'/о

5,9'/°

г,г

□ 312

□ 115 125

□ 132 Я235 и 122 и 112 ■ 212

□ 932

□ 332 я 422 я 232

Рисунок 3. А - динамика распространения штаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем в России в 1948 - 2012 гг., с различными MAST1 типами. Б -филогенетическое дерево, построенное методом UPGMA для штаммов В. pertussis различных MAST1 типов

Среди штаммов В. pertussis, выделенных в 1948 - 1969 гг., выявлены штаммы трех типов - 122. 112 и 125, из которых наибольшую частоту выявляемое™ имели штаммы типа 122, штаммы с типом 112 регистрировали в 25.0% случаев и с типом 125 - в 7,15% случаев. В 1970 - 1989 гг. выделены штаммы четырех MAST1 типов -122. 112, 115 и 312. Частота выявляемое™ штаммов «вакцинного» типа 112 увеличилась до 58,5%, а другого «вакцинного» типа 122 уменьшилась до 17,0%. Вместе с тем. появились штаммы «невакцинных» типов - 312 (21.95%) и 115 (2,43%). В третьем периоде наблюдения (1990-2005 гг.) выявлены штаммы четырех MAST1 типов - «вакцинного» 112 и «невакцинных» - 132, 312 и 232. Так, частота выявляемое™ штаммов В. pertussis типа 232 составила 86,95%, типа 312 - 4,24%, так же зарегестрировано 3,2% штаммов типа 132, при этом частота встречаемости штаммов с «вакцинным» типом 112 снизилась до 5,43%. Следовательно, начиная с 1990-х годов в циркулирующей популяции возбудителя коклюша доминирующее положение заняли штаммы В. pertussis с «невакцинными» типами. Среди изученных штаммов В. pertussis, выделенных в последние 6 лет, выявлено 9 MAST1 типов - 232, 422, 332, 932, 212, 1 12, 122, 235 и 132, т.е. отмечается значительная генетическая вариабельность популяционной структуры возбудителя коклюша. Штаммы В. pertussis типа 232 сохранили доминирующее положение, однако, частота его выявления снизилась до 55,92%, в то же время, отмечается увеличение частоты встречаемости штаммов с новым типом - 932 до 32,2% случаев, т.е. можно полагать, что данный тип получил широкое распространение в циркулирующей популяции. Вместе с тем, зарегистрированы штаммы В. pertussis с другими новыми типами - 422, 332, 212. 235 и 132, которые выявляли в количествах, не превышающих 3,0%, и по-прежнему в популяции сохраняются штаммы с «вакцинным» типом 112 в единичном проценте случаев.

Следовательно, показана постепенная нарастающая тенденция увеличения гетерогенности в популяции В. pertussis. Так, в первом периоде наблюдения выявлены штаммы трех, в третьем - четырех, в четвертом - девяти типов. В настоящее время превалирующее положение занимают штаммы В. pertussis с новыми «невакцинными» типами с доминированием штаммов типа 232. Однако растущая динамика частоты встречаемости штаммов В. pertussis типа 932 дает возможность полагать, что в последующие годы данный тип займет доминирующее положение в популяции.

С целью выявления взаимоотношений между штаммами различных типов и прогнозирования дальнейшего развития популяции возбудителя коклюша нами проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей (Рис. ЗБ).

Показано, что все изученью штаммы В. pertussis, выделенные от больных коклюшем в России в течение 1948 - 2012 гг., сформировали три клональных комплекса, включающих в себя группу чрезвычайно близкородственных штаммов. Наиболее близкими к гипотетическому предку оказались штаммы В. pertussis типов 122 и 125. Далее произошло формировании более новой клональной группы (нового кластера популяции) - типов 112 и 312. Штаммы В. pertussis типов 232 и 932, циркулирующие в настоящее время принадлежат к современному кластеру.

Для каждого из 313 изученных штаммов В. pertussis определен MAST2 тип, путем изучения аллельных комбинаций генов ptxP-fim3-prn (Рис. 4А). В первом периоде наблюдения выявлены штаммы двух MAST2 типов — 211 (74,1 %) и 111 (25,9%). Во втором периоде - количество выявленных MAST2 типов увеличилось до 5 - 211, 111, 123, 121 и ИЗ, из них большинство (40,5%) штаммов имели «вакцинный» 111 тип и 18,9% штаммов — тип 211. Так же, во втором периоде выявлены штаммы «невакцинных» типов 123 (18,9%), 121 (16,2% ) и 113 (5,4%).

А Б

Рисунок 4 А - динамика распространения штаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем в России в 1948 - 2012 гг., с различными MAST2 типами; Б -филогенетическое дерево, построенное методом UPGMA для штаммов В. pertussis различных MAST2 типов

В третьем периоде наблюдения зарегистрированы штаммы В. pertussis семи MAST2 типов - 341, 113,123, 111, 122, 312 и 322, среди которых, доминирующее положение заняли штаммы двух новых «невакцинных» типов - 322 и 312 на фоне снижения частоты встречаемости штаммов «вакцинного» типа 111. Так же выявлены штаммы B.pertussis других новых типов - 123, 113 и 341, но их частота выявляемое™ не превышала 2,0%.

Среди изученных штаммов В. pertussis, выделенных в последние 5 лет, обнаружено 14 MAST2 типов - 322, 224, 323, 312, 329, 342, 122, 221, 319, 112, 311, 211, 219 и 111, т.е. отмечается выраженная генетическая вариабельность популяционной структуры возбудителя коклюша. Из них большинство (98,6%) штаммов принадлежат к «невакцинным» типам и популяция, в основном, представлена штаммами типа 322 (42,5% случаев). Так же выделено 24,32% штаммов В. pertussis нового типа 329 и 12,8% штаммов типа 312. Штаммы В. pertussis других типов выделены в минорных количествах. Следовательно, показана поступательная тенденция увеличения гетерогенности в популяции В. pertussis от циркуляции штаммов двух типов в 1948 - 1969 гг. до 14 типов в последние пять лет. Установлена смена старых «вакцинных» типов 211 и 111 на новые «невакцинные» 322 и 329, из которых 322 тип является доминирующим в циркулирующей популяции в настоящее время.

Для анализа формирования циркулирующей популяции штаммов возбудителя коклюша проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей (Рис. 4Б). Показано, что штаммы В. pertussis типов 211 и 111 относились к одной из старейших клональных групп. Штаммы В. pertussis типов 311 и 312 так же относятся к достаточно старым кластерам, сформировавшимся практически одновременно. Штаммы В. pertussis генотипов 322 и 329 относятся к новой клональной группе. Следовательно, проведенные исследования показали, что применение мультилокусного секвенирования ДНК позволяет генотипировать штаммы В. pertussis, получать генетическую характеристику эпидемически связанных штаммов, проводить филогенетический анализ в популяции штамов возбудителя коклюша, сопоставляя полученные данные с общедоступной международной базой. Использование схемы MAST2 является наиболее оптимальным для проведения мониторинга циркулирующей популяции В. pertussis, так как позволяет дифференцировать штаммы по большему количеству типов с возможностью более подробного описания популяции.

Совершенствование методов молекулярно-генетического типирования штаммов В. pertussis и проведения филогенетического анализа с помощью разработанного

биоинформационного алгоритма. Ускоренный молекулярно-генетический метод типирования штаммов В. pertussis по структуре промотора ptxP, основанный на ПЦР-ПДРФ анализе. Нами разработан ускоренный молекулярно-генетический метод типирования штаммов В. pertussis по структуре промотора ptxP, который дает возможность проводить скрининг большого количества штаммов B.pertussis при мониторинге

17

циркулирующей популяции. Ускоренный метод типирования штаммов В. pertussis включает в себя выделение ДНК штаммов, постановку полимеразной цепной реакции с использованием специфичных праймеров. последовательную обработку полученных ампликонов эндонуклеазами рестрикции KpnI. Mlul и проведением электрофореза. Дифференциацию штаммов осуществляют путем сравнения размеров полученных рестрикционных фрагментов с контрольными образцами ДНК, имеющими ptxPl, ptxP2 и ptxP3 аллели промотора коклюшного токсина. Показано, что последовательность нуклеотидов в положениях 313-318 ptxPl и ptxP2 аллелей промотора создают сайт рестрикции для эндонуклеазы KpnI (5'-GGTACC-3'), a ptxP2 аллеля промотора в положениях 206-211 создает сайт рестрикции для эндонуклеазы Mlul (5'-ACGCGT-3'). Последовательная обработка эндонуклеазами позволяет получить специфические рестрикционные профили для штаммов с тремя аллелями промотора ptxP. Так для штаммов с ptxPl аплелем характерно наличие двух фрагментов в рестрикционном профиле KpnI (размером 315 и 217 п.н.) и одного фрагмента в профиле MLU1 (размером 532 п.н.), для штаммов с ptxP2 аллелем - двух фрагментов в профиле KPN1 (размером 315 и 217 п.н.) и двух фрагментов в профиле MLUl (размером 321 и 211 п.н.), для штаммов, несущих ptxP3 аллель - один фрагмент в профиле KpnI (размером 532 п.н.) и один фрагмент в профиле MLU1 (размером 532 п.н.) (Рис. 5). Апробирование данного метода проведено на 313 штаммах В.pertussis, выделенных от больных коклюшем в 1948 - 2012 гг., показана специфичность разработанного метода и получено полное совпадение с результатами секвенирования участков промотора ptxP штаммов В. pertussis. Таким образом, новый метод мониторинга штаммов В. pertussis по структуре ptxP промотора на основе ПЦР-ПДРФ дает возможность дифференцировать штаммы с особенностями структуры промотора ptxP и выявлять высоковирулентные штаммы возбудителя коклюша. Метод может быть использован при мониторинге штаммов возбудителя коклюша для наблюдения за циркулирующей популяцией В. pertussis.

1 2 3 4 5 Н 7 8 9 10 11

оОработш щаиДОНЮоА оСраСогм мдо«)«жак>Л

prcipiuuiot kptll рктришаш Mlul

Рисунок 5. Рестрикционный профиль участка промотора ptxP исследуемых штаммов В. pertussis

Разработка биоинформационного алгоритма для проведения филогенетического анализа нуклеотидных и белковых последовательностей с возможностью построения Minimum Spanning Tree (MST). Для молекулярной биологии и молекулярной эпидемиологии одной из основных задач является мониторинг циркулирующих популяций микроорганизмов на молекулярно-генетическом уровне. Все полученные результаты генотипирования являются высокоинформативными биотехнологическими показателями, учитывающимися при разработке и совершенствовании вакцинных препаратов. Анализ полученных данных может осуществляться исключительно с помощью специализированного биоинженерного программного обеспечения, проводящего сбор и обработку биотехнологической информации и дающего возможность дальнейшего обмена и хранения информации в международных биотехнологических базах данных, таких как NCBI (National Center for Boitechnological Informaton). В настоящее время существует ограниченное количество такого рода программных продуктов, и большинство из них являются не доступными для России или требуют дополнительного оснащения дорогостоящим оборудованием. Целью данной разработки явилось создание биоинформационного алгоритма, на основе которого сформирован программный продукт, сочетающий в себе возможность работы с нуклеотидными последовательностями и построение большинства возможных филогенетических деревьев (включая MST), соответствующего требованиям, предъявляемым конкретными исследовательскими лабораториями к данного рода программному обеспечению.

В соответствии с поставленной задачей, совместно с сотрудниками кафедры математического моделирования численных методов и комплексов программ УРАН Института Автоматизации Проектирования Российской Академии Наук — н.с. Новиковым П.А. и аспирантом кафедры Васильевым A.C., разработан биоинформационный алгоритм - новый упрощенный способ филогенетического анализа с возможностью построения MST, на основании которого создано программное обеспечение «SEQ». Результатом данного изобретения является использование биоинформационного алгоритма для анализа и сравнения нуклеотидных и аминокислотных последовательностей с целью оценки их родственных связей и построения мультипараметрического дерева.

Основные этапы алгоритма, являющегося основой программного обеспечения представлены на рисунке (Рис. 6).

«Шаг 1» - приведение введенных данных (нуклеотидных последовательностей) к единому формату XML, «шаг 2» - вычисление попарных расстояний между секвенированными последовательностями (с оценкой вероятностей возникновения мутационных изменений, при этом строится матрица штрафов, где числовой коэффициент точечной мутации равен 3, начала делеции — 15, продолжения делеции — 6), «шаг 3» - последующее построение первичного дерева методом присоединения ближайших соседей, «шаг 4» - дальнейшее выравнивание последовательностей по дереву с построением минимального остовного дерева на основе полученных данных. При этом, биоинформационный алгоритм предусматривает возможность

19

введения вторичных данных (период выделения штамма, количество выделенных штаммов) для дальнейшего разделения узлов дерева.

Рисунок 6. Алгоритм анализа нуклеотидных последовательностей секвенированных фрагментов генов В. pertussis с построением MST

Построение MST для штаммов В. pertussis различных сиквенс-типов (ST1-ST11).

Используя разработанное программное обеспечение "SEQV построено Minimum Spanning Tree для штаммов В. pertussis, выявленных шести сиквенс-типов, однако, для информативности дендрограммы, в исследование были включены штаммы невыявленных сиквенс-типов - ST4, ST9, ST7 и ST10, циркулирующих в других странах мира. (Рис. 7). Показано, что штаммы В. perussis сиквенс-типов ST1, ST2 и ST3 являются близкородственными и являются базисом формирования трех основных клональных групп, их ближайшими последующими «родственниками» являются штаммы сиквенс-типов ST8, ST5 и ST11, которые выявлены в третьем (современном периоде). Это позволяет судить о том. что гипотетическое формирование популяции

20

возбудителя коклюша проходило от штаммов сиквенс-типов БТ1 и 8Т2 (занимали доминирующее положение в первом периоде наблюдения) с формированием сиквенс-типа 8ТЗ (занимал доминирующее положение во втором периоде - 1970 - 1999 гг.) в направлении сиквенс-типов 8Т5 и 8Т8. Исключением является штамм сиквенс-типа 8Т11, который принадлежит к «старой» клональной группе, однако, был выявлен лишь в третьем периоде.

I Штаммы, выделенные в период

1970-1999 гг. I Штаммы, выделенные в период 2000-2012 гг.

т

"м ■

Рисунок 7. MST, полученное при анализе нуклеотидных последовательностей штаммов В. pertussis с различными сиквенс-типами

Возможно, штаммы данного сиквенс-типа сформировались в более ранний период, однако, из-за небольшой выборки образцов, не были выявлены. Анализ данного графа позволяет предположить, что последующее развитие популяции В. pertussis будет проходить внутри новых клональных групп, сформированных сиквенс-типами ST8 и ST5, так как в последние 12 лет они являются доминирующими, а значит наиболее выгодными для адаптации возбудителя

Построение MST для штаммов В. pertussis различных MAST1 типов. С помощью разработанного программного обеспечения «SEQ» проведено построение MST для штаммов 12 MAST1 типов (Рис. 8). Показано, что штаммы типа 122 и 125, выделенные в первом периоде, стали основой для формирования клональной группы штаммов типа 112, который доминировал во втором периоде наблюдения. Тип 112, по-видимому, явился более выгодным для возбудителя, и сформировал большую клональную группу, состоящую из штаммов типов 132, 312 и 212. В дальнейшем, штаммы типов 312 и 132 были зарегистрированы в третьем периоде, но они явились не перспективными для популяции возбудителя коклюша и формирования клональных групп на их основе не произошло.

Штаммы, выделенные в 2006-2012 гг.

*

Штаммы, выделенные в 1990-2005 К.

Штаммы, выделенные в 1970-1989 гг. Штаммы, выделенные в 1948-1969 гт.

Рисунок 8. MST, полученное при анализе нуклеотидных последовательностей штаммов В. pertussis с различными MAST1 типами

Основным направлением развития возбудителя стало формирование штаммов типов 212 и 232, при этом, штаммы типа 232 явились основой современной клональной группы и дали начало формированию группы штаммов типа 932, частота выявляемое™ которого в настоящее время растет и, можно предположить, что дальнейшее развитие популяции В. pertussis продолжится по пути увеличения частоты выявляемое™ штаммов данного типа.

Построение MST для штаммов В. pertussis различных MAST2 типов. С помощью разработанного программного обеспечения «SEQ» проведено построение MST для штаммов 18 MAST2 типов. Показано, что формирование первой клональной группы произошло на основе штаммов типа 211 и 111, при этом штаммы типа 211 явились доминирующими в первом периоде наблюдения, а типа 111 - во втором. Штаммы типа 111 выявлены также в третьем и четвертом периодах, при этом они дали начало формированию нескольких современных MAST2 типов - 311,112 и 219. количество штаммов данных типов было единичным, что говорит о не перспективности этой клональной группы (Рис. 9). Более перспективным оказалось формирование штаммов типа 112 во втором периоде наблюдения. Данные штаммы стали основой промежуточной клональной группы и явились ближайшими «родственниками» последующих штаммов В. pertussis типов 341, 122 и 123, которые циркулировали в третьем периоде наблюдения. Показано, что у штаммов типов 341 и 122 отсутствуют «дочерние» MAST2 типы, следовательно, они явились невыгодными для дальнейшего развития популяции возбудителя.

Штаммы, выделенные в 2006-2012 гг. Штаммы, выделенные в 1990-2005 гг.

319

Штаммы, выделенные в 1970-1989 гг. Штаммы, выделенные в 1948-1969 гг.

Рисунок 9. MST, полученное при анализе нуклеотидных последовательностей штаммов B.pertussis с различными MAST2 типами

Современная клональная группа сформирована на основе штаммов типа 322 и представлена штаммами типов 322, 342 и 329, при этом частота выявляемое™ штаммов 329 резко увеличивается, что может свидетельствовать о начале базиса для новой клональной группы штаммов В. pertussis.

Таким образом, проведенная оценка клонального состава популяции возбудителя коклюша с использованием современных технологий биоинформационного анализа и прогнозирования с помощью разработанного программного обеспечения продемонстрировала практическую эффективность построения дерева MST, которое позволяет получить высокоинформативную характеристику популяции исследуемых штаммов, с учетом вторичных параметров, а так же позволила достичь четкой визуализизации клонального состава популяции с возможностью прогнозирования направления ее развития.

ВЫВОДЫ:

1. В 2006-2012 гг. доминирующее (в 89,3% случаях) положение в популяции, по прежнему, сохраняют штаммы В. pertussis серотипа 1.0.3, при этом, штаммы допрививочных серотипов 1.2.0 и 1.2.3 продолжают выделяться в минорных количествах не превышающих 2,0%.

2. За 50 лет широкого применения эритромицина частота выявляемое™ штаммов В. pertussis с промежуточной чувствительностью к антибиотику увеличилась с 19,0% до 59,3% случаев. За последние 7 лет аналогичная тенденция снижения чувствительности В. pertussis отмечена в отношении азитромицина (31,0% случаев) и ампициллина (выявлено 2,0% резистентных штаммов).

3. Проведенное генотипирование штаммов с использованием схем MLST, MAST1 и MAST2 показало, что за 60 лет проведения массовой иммунизации произошло изменение генотипического состава циркулирующей популяции. В допрививочный период доминирующими были «вакцинные» типы, частота встречаемости которых в настоящее время составляет не более 2,0%. В конце 1990-х годов произошла смена доминирующих типов на «невакцинные» - ST3, MAST1 - 322 и MAST2 - 232 и в последние 7 лет в стали превалировать штаммы новой «невакцинной» клональной группы ST3-ST5 и новых «невакцинных» типов MAST1- 232, 932 и MAST2 - 322, 329.

4. Филогенетический анализ показал, что наиболее близкими к гипотетическому предку явились штаммы типов ST1, MAST1 - 122 и MAST2 - 211, относящиеся к «старым» клональным группам. В последние 10 лет доминирующими в популяции являются штаммы «невакцинных» типов ST5, MAST1 - 232 и MAST2 - 322, относящиеся к «современным» клональным группам, а нарастающий удельный вес штаммов типов ST8, MAST1 - 932 и MAST2 - 329 может свидетельствовать об активном формировании новых клональных групп внутри популяции и возможной смене доминирующих генотипов.

5. Разработанный способ генотипирования штаммов В. pertussis, основанный на ПЦР-ПДРФ анализе, позволяет выявлять штаммы с особенностями структуры ptxP промотора при проведении молекулярно-генетического мониторинга циркулирующей популяции штаммов возбудителя коклюша.

6. Разработанное на основе биоинформационного алгоритма программное обеспечение «SEQ» позволяет проводить филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей с возможностью построения мультипараметрического дерева MST для характеристики циркулирующей популяции и прогнозирования направления ее дальнейшего формирования по степени родства, частоте встречаемости, места и периода (территориального и временного признака) выделения штаммов возбудителя коклюша.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Применение мультилокусного секвенирование ДНК позволяет генотипировать штаммы B.pertussis, получать генетическую характеристику эпидемически связанных штаммов с проведением филогенетического анализа и сопоставлять полученные данные с общедоступной международной базой сиквенс-типов. Использование схемы типирования MAST2 является наиболее оптимальной для проведения мониторинга циркулирующей популяции B.pertussis, так как позволяет дифференцировать штаммы по большему количеству генотипов с возможностью более подробного описания структуры популяции.

2. Разработанный ускоренный молекулярно-биологический способ генотипирования штаммов В. pertussis по структуре промотора ptxP коклюшного токсина, основанный на ПЦР-ПДРФ анализе, может быть использован для скрининга большого количества штаммов B.pertussis при мониторинге циркулирующей популяции штаммов возбудителя коклюша с целью выявления штаммов с повышенной продукцией коклюшного токсина.

3. Разработанное программное обеспечение «SEQ» может быть рекомендовано к использованию в практической микробиологии и биотехнологии для совершенствования мониторинга за возбудителями инфекционных заболеваний, пополнения баз данных биотехнологической информации и прогнозирования формирования популяции штаммов возбудителей.

4. Уникальная коллекция штаммов B.pertussis, пополненная штаммами, выделенными от больных коклюшем в современный период эпидемического процесса коклюшной инфекции, и созданный банк ДНК штаммов могут быть перспективны для проведения сравнительных исследований при изучении биологии возбудителя.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Борисова О.Ю., Антибиотикочувствительность циркулирующих штаммов B.pertussis /Борисова О.Ю., Ивашинникова Г.А., Гадуа Н.Т., Рудакова И.А., Мазурова И.К. //Материалы III Ежегодного Всеросс. конгресса по инфекционным болезням, 28-30 марта 2011 г. (г. Москва). - 2011. - С. 54.

2. Ивашинникова Г.А., Чувствительность штаммов В. pertussis к антибактериальным препаратам /Ивашинникова Г.А., Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т., Рудакова И.А., Мазурова И.К., Алешкин В.А. //Материалы Научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения», 20-21 апреля 2011 г. (г. Нижний Новгород).-2011.-С. 81.

3. Ивашинникова Г.А., Характеристика современных штаммов B.pertussis по структуре ptxP, кодирующего промоторную область коклюшного токсина /Ивашинникова Г.А., Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т., Рудакова И.А., Мазурова И.К. //Материалы IV Ежегодного Всеросс. конгресса по инфекционным болезням, 26-28 марта 2012 г. (г. Москва). - 2012. - С. 161.

4. Борисова О.Ю., Мультилокусное секвенирование штаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем в настоящее время в России /Борисова О.Ю., Ивашинникова Г.А., Гадуа H.T., Рудакова И.А., Мазурова И.К. //Материалы IV Ежегодного Всеросс. конгресса по инфекционным болезням 26-28 марта 2012 (г. Москва). - 2012 . - С. 64.

5. Борисова О.Ю., Мониторинг штаммов В. pertussis выделенных от больных коклюшем в России /Борисова О.Ю. Мазурова И.К., Гадуа Н.Т., Ивашинникова Г.А., Рудакова И.А. //Материалы X съезда ВНПОЭМП «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (г. Москва). - 2012. - том 2, № 1- 2. - С. 245.

6. Ивашинникова Г.А., Применение метода мультилокусного секвенирования для наблюдения за циркулирующими штаммами B.pertussis /Ивашинникова Г.А., Борисова О.Ю., Гадуа H.T., Рудакова И.А., Мазурова И.К. //Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Фундаментальные и прикладные аспекты анализа рисков здоровью населения», (г. Пермь). - 2012. - т. 1. - С. 243 - 247.

7. Борисова О.Ю., Особенности структуры генов, кодирующих А- и В-комплексы коклюшного токсина, штаммов B.pertussis /Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т., Салова Н.Я., Требунских И.П., Скачкова В.Г., Панферова P.A., Ивашинникова Г.А., Рудакова И.А., Мазурова И.К., Алешкин В.А. //Молекулярная медицина. - 2012. - № 1. - С. 44 - 48.

8. Борисова О.Ю., Характеристика штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в г. Москве, с помощью мультилокусного секвенирования /Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Ивашинникова Г.А., Гадуа H.T., Рудакова И.А., Салова Н.Я., Требунских И.П., Скачкова В.Г.,

Парфенова P.A., Mooi F., Алешкин B.A. //Журнал микробиол. - 2012. -№ 2. -С. 28-34.

9. Борисова О.Ю., Генетическая характеристика штаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем в России /Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Ивашинникова Г.А., Гадуа Н.Т., Рудакова И.А., Салова Н.Я., Абасова Ф.М., Требунских И.П., Наретя Н.Д., Алексеева Л.А., Якунина О.Ю., Mooi F., Алёшкин B.A. // Медицинский Альманах. - 2012. - № 2 (21). - С. 30 - 34. Ю.Борисова О.Ю. Особенности распространения штаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем, с различными аллельными вариантами гена, кодирующего промоторную область коклюшного токсина {ptxP) /Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Ивашинникова Г.А., Захарова Н.С., Мерцалова Н.У., Зайцев Е.М., Салова Н.Я., Абасова Ф.М.,Требунских И.П., Скачкова В.Г., Панферова P.A., Алексеева Л.А., Якунина О.Ю., Наретя Н.Д., van Gent М., Mooi F., Алешкин B.A. //Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы.-2012,-№2.-С. 14-19.

11.Ивашинникова Г.А. Применение метода мультилокусного секвенирования для наблюдения за циркулирующими штаммами

B.pertussis / Ивашинникова Г.А., Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т., Мазурова И.К. //Здоровье населения и среда обитания. - 2012. - № 9. - С. 28-30.

12. Ивашинникова Г.А. Ускоренный молекулярно-генетический метод типирования штаммов B.pertussis по структуре промотора ptxP коклюшного токсина / Ивашинникова Г.А., Борисова О.Ю., Алешкин A.B., Пименова A.C. // Астраханский медицинский журнал. - 2012. - №4. -

C. 121-124.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПЦР- - Метод изучения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ПДРФ амплифицированных продуктов

MAST " Ми11'1°си5 antigen sequence typing (мультилокусное секвенирование, основанное на изучении фрагментов антигенной структуры)

MLST - Multilocus sequence typing (мультилокусное секвенирование)

MST - Minimum spanning tree (минимальное остовное дерево)

NJ - Neighborhood joining (метод присоединения ближайших соседей)

I

ST - Sequence type (сиквенс-тип)

UPGMA " Unweighted pair group method with arithmetic mean (метод невзвешенного попарного среднего)

ptxA -ген, кодирующий SI субъединицу коклюшного токсина

ptxC - ген, кодирующий S3 субъединицу коклюшного токсина

ptxP - промоторная область оперона ptx

ргп -ген, кодирующий белок пертактин

tcfA -ген, кодирующий уникальный фактор колонизации трахеи

fim3 -ген, кодирующий фимбиальный Fim3 белок

Напечатано в Типографии на Брестской ООО "СТК-пресс", 121059, г. Москва, ул. Киевская д. 8, ИНН: 7730513833 КПП: 773001001 Подписано в печать «05» февраля 2013г. Формата А5 (148x210мм)

Тираж 100 экз. Заказ № 190 от 05.02.13