Микробиологический надзор за качеством коклюшного компонента комбинированных вакцин

Алексеева, Ирина Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Микробиологический надзор за качеством коклюшного компонента комбинированных вакцин
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологический надзор за качеством коклюшного компонента комбинированных вакцин"

На правах рукописи

АЛЕКСЕЕВА ИРИНА АНДРЕЕВНА

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ НАДЗОР ЗА КАЧЕСТВОМ КОКЛЮШНОГО КОМПОНЕНТА КОМБИНИРОВАННЫХ ВАКЦИН

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

2 О МАП 2015

Москва-2015 005569167

005569167

Работа выполнена в Государственном институте стандартизации и контроля медицинских иммунобиологических препаратов им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора РФ (реорганизованному в форме присоединения к Федеральному государственному бюджетному учреждению «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России)

Научный консультант:

Чупринина Раиса Павловна - доктор медицинских наук Официальные оппоненты:

Егорова Надежда Борисовна - доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки, ведущий научный сотрудник ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова

Шамшева Ольга Васильевна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой инфекционных болезней у детей № 2 педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России

Маслов Юрий Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий микробиологической лабораторией ЦНИЛ ГБОУ ВПО ПГМУ им. академика Е.А. Вагнера Минздрава России

Ведущая организация: ФБУН «Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии» Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится «19» июня 2015 года в 11 часов на заседании диссергаци -онного совета Д 208.130.01 при федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России и на сайте: www.gamaleya.org

Автореферат диссертации разослан «18» мая 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Русакова Екатерина Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Коклюшная инфекция остается значительной проблемой для практического здравоохранения всех стран мира. По данным ВОЗ во всём мире ежегодно регистрируется 16 млн случаев коклюша, 195000 заболеваний заканчиваются летальным исходом (WHO,Weekly epidemiological record, 2010, V.85, No 40).

В 40-е годы прошлого века в развитых странах была введена плановая иммунизация против коклюша цельноклеточной коклюшной моновакциной (ЦКВ). Позднее профилактику коклюша стали проводить одновременно с профилактикой дифтерии и столбняка - адсорбированной коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакциной (АКДС). Эффективность ЦКВ как монопрепарата, так и в ассоциации с дифтерийным и столбнячным анатоксинами, была убедительно доказана в 1940-1950-е годы в специальных наблюдениях Британского Комитета Медицинских Исследований в США, а также в СССР (Medical Reseach council. Vaccination against whooping-cough, 1959; Захарова M.C., 1983). В России, США, Японии, Англии, Исландии, Норвегии и др., где для профилактики коклюша применяли ЦКВ с высокой иммуногенной активностью, произошло значительное снижение заболеваемости этой инфекцией (Захарова М.С., 1983; Покровский В.И., 2003г.; International Bordetella pertussis assay standardization and harmonization meeting report, 2007). В Швеции, Канаде, Нидерландах, при использовании препаратов с меньшей иммуногенной активностью, отмечался рост заболеваемости коклюшем (Bentsi-Enchill A. et al, 1997; Mattoo S. et al., 2005).

Применение комбинированных вакцин с ЦКВ в ряде случаев сопровождалось поствакцинальными осложнениями (развитием поражений ЦНС, синдромом внезапной смерти, гипотензивно-респонсивным синдромом, анафилактическим шоком), большинство из которых, как было установлено позднее, не ассоциировалось с введением коклюшной вакцины (Cherry J.D., 1990; Adverse Effects of Pertussis and Rubella Vaccines, 1991; Gale G.L. et al., 1994; Mattoo S„ Cherry J.D., 2005; Ray P. et al., 2006; Ta-точенко B.K. с соавт., 2011). На основании специальных наблюдений и исследований в настоящее время в инструкциях по применению комбинированных вакцин с ЦКВ оставлены поствакцинальные осложнения: повышение температуры, судороги, эпизоды пронзительного крика, аллергические реакции. ,

С 1990-х годов в большинстве развитых стран ЦКВ заменили на менее реактоген-ные бесклеточные коклюшные вакцины (БКВ), которые содержали в своем составе от одного до пяти протективных антигенов (Edwards К.М. et al., 2004). В многоцентровых клинических испытанииях БКВ демонстрировали эффективность от 59 до 93 % (Greco D. et al., 1996; Gustafsson L. et al., 1996; Olin P. et al., 1997; Simondon F. et al., 1997). Однако после более 10-15 лет применения БКВ на фоне широкого охвата детского населения прививками в развитых странах наблюдалось увеличение роста заболеваемости коклюшной инфекцией, которая в США и Австралии приняла характер эпидемии (International Bordetella pertussis assay standardization and harmonization meeting report, 2007; MMWR, 2012, V.59, No 53; Clark Т., 2012).

Недавнее заключение ВОЗ свидетельствует, что бесклеточная коклюшная вакцина является главной причиной увеличения заболеваемости коклюшем в странах, применявших её для первичной вакцинации против коклюшной инфекции. Лицензированные БКВ обладают меньшей первичной эффективностью, при их использовании быстрее снижается иммунитет. Это связано с формированием цельноклеточными (подобно естественной инфекции) и бесклеточными коклюшными вакцинами разного типа иммунитета: Thl и Th2 соответственно. ВОЗ также придерживается мнения, что до настоящего времени не выявлено влияние серотиповых и генотипических изменений в циркулирующих штаммах В. pertussis на эффективность коклюшных цельноклеточных и бесклеточных вакцин (Redhead К. et al., 1993; Mahon В.Р. et al., 2000; WHO, Weekly epidemiological record, 2014, 89, No 21 и No 30).

Согласно заключению ВОЗ цельноклеточная коклюшная вакцина в настоящее время остается основным препаратом для первичной вакцинации против коклюша. Глобальный альянс по вакцинам и иммунизации (GAVI) рекомендует снабжать нуждающиеся страны пятивалентной вакциной только с цельноклеточным коклюшным компонентом (WHO, Weekly epidemiological record, 2014, 89, No 21).

Формирование полноценного противококлюшного иммунитета зависит от многих факторов, из которых важным является качество препарата. Анализ международных клинических испытаний свидетельствует, что эффективность ЦКВ может колебаться в значительных пределах: от 36 до 96 % (Greco, D., 1996; Gustafsson, L., 1996; Liese, J. G., 1997; Schmitt, H. J., 1996; Simondon, F„ 1997; Stehr K.,1998; Trollfors В., 1995; Halperin A.,2006; Mattoo S.,2005). По данным отечественных исследователей в конце 70-х и нача-

ле 80-х годов прошлого века лишь 50 % серий ЦКВ соответствовали принятым ВОЗ лимитам активности и только 79,7 % испытанных серий ЦКВ к концу срока годности сохраняли требуемую иммуногенную активность (Резепов Ф.Ф.,1979; Чупринина Р.П., 1987).

Для решения проблемы повышения качества ЦКВ отечественных комбинированных вакцин с учётом накопленных знаний о вариабельности коклюшных бактерий в лабораторных и производственных условиях, наблюдаемых клональных и серотиповых изменений структуры циркулирующих штаммов В. pertussis по сравнению с используемыми производственными штаммами, недостаточной стандартности и стабильности коклюшного компонента, а также необходимости разработки информативного метода сле-жения за стабильностью технологического процесса производства вакцины требовалось усовершенствование существующего надзора за производством коклюшной вакцины.

Степень разработанности проблемы. Первые рекомендации по производству коклюшной вакцины были сформулированы на международном уровне в 1953 г. (WHO, tech. rep. ser., 1953, No 61). Эти рекомендации были учтены М.С. Захаровой с сотрудниками (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), которые, начиная с 1955 г., последовательно разработали коклюшную (ЦКВ), коклюшно-дифтерийную (КД) и коклюшно-дифтерийно-столб-няч-ную (КДС) вакцины. В нормативную документацию были внесены соответствующие тому времени требования к производственным штаммам, промышленной продукции и методам контроля качества (Инструкция по изготовлению и контролю коклюшных и коклюшно-дифтерийных вакцин, 1957 г.). Разработанные вакцины характеризовались приемлемой иммуногенной активностью, но обладали достаточно высокой реактогенно-стью, что требовало совершенствования препарата (Захарова М.С., 1958; Гордина Р.В., 1964). В 1960 г. М.С. Захаровой была предложена методика изготовления и контроля адсорбированной КДС вакцины, которая отличалась от несорбированной КДС тем, что содержала в одной иммунизирующей дозе уменьшенное вдвое количество каждого антигена, т.е. 10 млрд обезвреженных коклюшных клеток, 15 Lf дифтерийного и 5 ЕС столбнячного анатоксинов (Захарова М.С., 1983). Реактогенность вакцины снизилась, но проблема качества и стандартности выпускаемой продукции до конца решена не была.

Большое значение в развитии системы надзора за производством коклюшной вакцины имело изготовление в РФ типоспецифических адсорбированных сывороток (Деми-

на A.A., 1971), а затем освоение их производственного выпуска на базе предприятия НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Важную роль в понимании развития и формирования проти-вококлюшного иммунитета имели исследования по выделению и изучению поверхностных протективных антигенов, в том числе агглютиногенов (Баева Е.А., 1958; Sato Y., Nagase К., 1967; Лапаева И.А., 1973; Эглит Ю.Х., Смирнов В.Д., 1980; Амелина И.П., 1980), опубликованные материалы по изменчивости возбудителя коклюша (Leslie Р.Н., 1931; Кандыба Л.Л., 1935; Тереза Л.И., 1940; Kasuga Т., 1953;Novotny Р., 1979; Лапаева И. А., 1981).

В дальнейшем надзор за качеством коклюшной вакцины, выпускаемой разными предприятиями страны, осуществлял ГИСК им. Л.А. Тарасевича. С учетом изменившегося типоспецифического состава циркулирующих штаммов, проведено обновление производственных штаммов В. pertussis. Для оценки токсичности штаммов коклюшных бактерий введены новые методы и разработаны критерии оценки; обоснована целесообразность использования в производстве коклюшной вакцины штаммов, обладающих средней токсигенностью при высокой иммуногенной активности. В нормативной документации указана только количественная оценка иммуногенной активности коклюшного компонента АКДС вакцины в международных единицах ME (Чупринина Р.П., 1987). Оценка активности по выживаемости животных допускалась при испытании коклюшной суспензии и новых штаммов В. pertussis.

Рекомендации и требования ВОЗ к производству коклюшной вакцины указывают на необходимость подтверждения присутствия в вакцине агглютиногенов 1, 2 и 3 (WHO, tech. rep. ser., 1979, 638, 30; 1990, 800, 40). Рекомендации носят общий характер без указания конкретных критериев. В научной литературе также отсутствуют сведения о величине количественного содержания агглютиногенов в популяции коклюшных бактерий, которая позволяла бы судить о получении вакцины с требуемой иммуногенной активностью. Поэтому актуальными являлись исследования, направленные на установление необходимого количественного содержания агглютиногенов в коклюшном компоненте, которое отражало бы его высокую иммуногенную активность. Кроме того, требовалась разработка методов исследования, направленных на повышение стабильности отечественной коклюшной вакцины. Решение этой важной проблемы возможно при совершенствовании надзора за условиями производства и контроля препарата, выпускаемого разными предприятиями страны.

Цель исследования: совершенствование микробиологического надзора за качеством коклюшного компонента комбинированных вакцин. Задачи исследования

1. Провести сравнительное исследование иммунобиологических свойств (серологических, серотиповых, вирулентных, токсических, молекулярно-генетической характеристики, дермонекротической и иммуногенной активности) производственных штаммов и посевных серий В. pertussis для оценки стабильности этих свойств в производственных условиях на различных предприятиях страны. Выявить взаимосвязь количественного содержания агглютиногенов 1, 2, 3 в посевных сериях В. pertussis с иммуногенной активностью коклюшных вакцин, полученных из соответствующих посевных серий.

2. Для повышения иммуногенной активности коклюшной вакцины усовершенствовать методику приготовления посевных серий В. pertussis с учётом количественного содержания в них агглютиногенов 1,2 и 3; установить критерии пригодности посевных серий для производства коклюшной вакцины.

3. Выявить факторы, влияющие на вариабельность основного показателя качества коклюшной вакцины - иммуногенную активность; изучить стабильность этого свойства на этапах изготовления и при хранении готового препарата

4. Исследовать стабильность аттестуемых характеристик отраслевого стандартного образца ОСО-3 для подтверждения надежности и достоверности калибрования иммуногенной активности коклюшной вакцины. В связи с истощением запаса ОСО-3 изготовить новую серию стандартного образца иммуногенности коклюшной вакцины с использованием штаммов, отобранных с учетом новых национальных требований.

5. Для дополнительной характеристики качества отечественных комбинированных АКДС и Бубо-Кок вакцин исследовать гуморальный иммунный ответ к протективным антигенам коклюшного микроба (коклюшному токсину, филаментозному гемагглюти-нину, пертактину), формируемый после их введения у мышей, в сравнении с ответом, наблюдаемым после введения зарегистрированных в РФ зарубежных вакцин с бесклеточным коклюшным компонентом.

6. Для оценки стабильности технологического процесса производства коклюшной вакцины на разных предприятиях изучить/апробировать возможность применения адаптированного нами метода статистического управления процессом изготовления вакцины путем мониторинга показателей качества с помощью контрольных карт Шухарта.

Научная новизна исследования

Впервые предложен новый метод подготовки посевных серий В. pertussis, основанный на микробиологической селекции культуры по признаку экспрессии поверхностных протективных антигенов - агглютиногенов.

На основе разработанного метода подготовки посевных серий В. pertussis впервые предложен способ повышения иммуногенной активности цельноклеточной коклюшной вакцины по показателю количественного содержания агглютиногенов в посевной серии и коклюшной суспензии. Патент на изобретение № 2540014.

Впервые определено минимально допустимое количественное содержание агглютиногенов в посевной серии и коклюшной суспензии (выявляемое типоспецифической сывороткой в разведении не менее 1:1280), прогнозирующее регламентированную им-муногенную активность (не менее 8 ME/мл) в коклюшной вакцине на протяжении срока годности вакцины (1,5 г.).

Впервые предложен метод и критерий прогнозирования длительной стабильности иммуногенной активности коклюшной вакцины (более 2,5 лет) по показателю количественного содержания в ней агглютиногенов, выявляемых адсорбированными сыворотками при разведении не менее 1:3200.

Впервые проведено сравнительное исследование генома всех штаммов В. pertussis, используемых в разное время в производстве коклюшной вакцины. Выявлены различия генов, кодирующих протективные антигены - коклюшный токсин (ptxА), фим-брии (ftml, flm3), пертактин (ргп) по сравнению с циркулирующими штаммами. По заключению ВОЗ влияние изменений циркулирующих штаммов В. pertussis на эффективность коклюшных вакцин пока не выявлено.

Впервые в эксперименте показано, что отечественная коклюшная вакцина индуцирует гуморальный иммунный ответ к основным протективным антигенам коклюшного микроба - коклюшному токсину, филаментозному гемагглютинину, пертактину - на уровне сравниваемых бесклеточных коклюшных вакцин.

Впервые показана возможность и эффективность слежения за стабильностью технологического цикла изготовления коклюшной вакцины с помощью метода статистического управления производственным процессом с использованием контрольных карг Шухарта.

Теоретическая и практическая значимость исследований

Усовершенствован порядок надзора за качеством коклюшной вакцины, включающий слежение за

- состоянием иммунобиологических свойств производственных штаммов В. pertussis и посевных серий при их использовании в производственных условиях;

- качеством коклюшной вакцины в процессе изготовления;

- соблюдением условий производства цельноклеточной коклюшной вакцины, позволяющих выпускать коклюшный компонент АКДС и Бубо-Кок вакцин с регламентированными показателями, стабильными на протяжении срока годности.

Разработан селективный метод приготовления посевных серий В. pertussis по признаку экспрессии коклюшными бактериями агглютиногенов. Метод, позволяющий за короткий промежуток времени оценить пригодность посевной серии для производства коклюшной вакцины, включен в методические указания МУК 4.2.2317-08.

Разработан способ повышения иммуногенной активности коклюшной вакцины, основанный на определении количественного содержания агглютиногенов в коклюшной суспензии. Установлен минимальный показатель содержания агглютиногенов (1:1280), прогнозирующий выпуск ЦКВ с регламентированной иммуногенной активностью не менее 8 ME/мл. Метод и критерии оценки количественного содержания агглютиногенов внесены в соответствующие разделы регламентов производства АКДС и Бубо-Кок вакцин.

На основании результатов исследования иммуногенной активности на конце срока годности вакцин АКДС производства ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова и Бубо-Кок производства ЗАО «НПК «Комбиотех» установлено, что показатель количественного содержания агглютиногенов в коклюшной суспензии (1:3200 и выше) прогнозирует выпуск комбинированных вакцин с высокой иммуногенной активностью коклюшного компонента (не менее 10 ME/мл), стабильной на протяжении более 2,5 лет. Эти результаты послужили основанием для увеличения срока годности АКДС и Бубо-Кок, выпускаемых указанными предприятиями, с 1,5 до 2,5 лет, что отражено в соответствующих ФСП, инструкциях по применению и регламентах производства.

В лабораторных опытах показано, что отечественная цельноклеточная коклюшная вакцина индуцирует выработку гуморального иммунного ответа к протективным антигенам В. pertussis на уровне, аналогичном уровню после введения бесклеточных

коклюшных вакцин. Полученные нами данные дополнительно характеризуют качество отечественной коклюшной вакцины.

Подтверждена стабильность аттестуемых характеристик «ОСО 42-28-89 иммуно-генности коклюшной вакцины» при калибровании с международными стандартами коклюшной вакцины выпуска 1957 г., № 66/302 и № 66/303 на протяжении более 35 лет. Результаты исследований обосновывают возможность дальнейшего применения ОСО 42-28-89 в качестве референс-препарата для калибрования иммуногенной активности коклюшной вакцины (в моно и комбинированных вакцинах) и свидетельствуют об информативности и надежности метода измерения иммуногенной активности, достоверности получаемых результатов оценки качества препарата.

Разработана, аттестована и внесена в Реестр ОСО новая серия «Отраслевого стандартного образца иммуногенности коклюшной вакцины» - ОСО 42-28-89-2014. При изготовлении ОСО использованы штаммы, прошедшие селекцию по признаку экспрессии агглютиногенов.

Разработаны методические рекомендации по системе статистического управления процессом изготовления коклюшного компонента комбинированных вакцин. Использование карт Шухарта позволит отделам обеспечения качества (ООК) своевременно оценивать стабильность технологического процесса, обнаруживать отклонения в производственном процессе и предотвращать появление некачественной продукции. Внедрение результатов исследования

Требования к показателю количественного содержания присущих штаммам и посевным сериям В. pertussis агглютиногенов введены в соответствующие разделы производственных регламентов изготовления коклюшных суспензий ПР на АКДС вакцин № 1895039-11-07; ПР на вакцину АКДС-Геп В № 04862997-78-10; ПР на Коклюшную суспензию № 04862997-25-10; ПР на Коклюшную суспензию № 04863057-57-11.

Продление срока годности препарата до 2,5 лет вместо 1,5 лет внесены в ФСП Р №002666/01-210912 на АКДС вакцину, ФСП № 42-4892-08 на вакцину Бубо-Кок (вакцина против дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В) и в инструкции по применению указанных препаратов.

Требования к иммунобиологическим свойствам производственных штаммов В. pertussis, описание отбора колоний по признаку количественного содержания в культуре агглютиногенов, приготовление посевных серий изложены в МУК 4.2.2317-08 «Отбор,

проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и брон-хисептикозных бактерий», М. 2009.

ОСО-4 аттестован и включен в реестр стандартных образцов и референс-пре-пара-тов как ОСО иммуногенной активности коклюшной вакцины ОСО 42-28-89-2014;

Система надзора за условиями производства коклюшной вакцины изложена в Методических рекомендациях «Оценка стабильности технологического процесса производства медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) с помощью контрольных карт Шухарта», М. 2011 г. После апробации метод внедрен на всех предприятиях, изготавливающих коклюшный компонент.

Разработан проект фармакопейной статьи «Вакцина коклюшно-дифтерийно-столб-нячная (АКДС-вакцина)» для Государственной Фармакопеи XIII, в которой предусмотрено определение уровня агглютиногенов 1, 2 и 3 в коклюшной вакцине до сведения с другими компонентами комбинированных вакцин.

Разработан сводный протокол производства и контроля коклюшной вакцины, содержащий результаты контроля коклюшной суспензии и коклюшного компонента комбинированных вакцин на всех этапах технологического процесса.

Выводы и разработки, содержащиеся в диссертации, могут быть также использованы при разработке качественной и стабильной бесклеточной коклюшной вакцины и решении проблем ее стандартизации.

Методология и методы исследования

Методологической основой послужили рекомендации и требования ВОЗ к производству коклюшной вакцины и ее показателям качества; материалы ВОЗ, регламентирующие деятельность национальных органов контроля МИБП; разработанные нами сводные протоколы производства и контроля коклюшного компонента АКДС и Бубо-Кок вакцин для всех отечественных предприятий, выпускающих данные препараты; результаты анализа материалов при инспектировании предприятий; труды отечественных и зарубежных ученых по вопросам усовершенствования и поиска способов повышения качества и стабильности коклюшных вакцин. Основу диссертационного исследования составил системный подход в изучении рассматриваемой проблемы.

Проведение исследования было осуществлено с использованием микробиологических, биологических, серологических, молекулярно-генетических методов исследования. При изложении материала был использован анализ литературных источников.

Использованные методы исследования и статистическая обработка полученных в эксперименте данных, позволили объективно и достоверно оценить полученные результаты и сделанные выводы. Апробация работы

Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на IX Конгрессе педиатров России, Симпозиуме «Актуальные проблемы педиатрии», Москва, 10 февраля 2004 г.; Первой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва, 10-11 ноября 2004 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 21-22 ноября 2006 г.; Всероссийской научно-практическая конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 11-12 ноября 2008 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 9-10 ноября 2010 г.; II Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинопрофилактика и иммунореабилитация в практике врача», Москва, 2-3 июня 2011 г.; Рабочем совещании ВОЗ по внедрению Руководства по оформлению разрешений на выпуск серий вакцин. Рига, Латвия 29 ноября-1 декабря 2011 г.; Научно-практической конференции памяти профессора A.B. Казьянина, Пермь, 20 ноября 2014 г.; III Конгрессе детских инфекционистов, Москва, 11-13 декабря 2014 г.; апробация диссертационной работы состоялась на межсекционном заседании Ученого совета ФГБУ НЦЭСМП 03.07.2014 г. (протокол №5).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 39 научных работ, включая 13 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 1 методические указания, 2 методических рекомендаций, 1 патент. Основные положения, выносимые на защиту

1. Комплекс методов исследования, применяемый для оценки состояния иммунобиологических свойств производственных штаммов и посевных серий В. pertussiss (морфологических, серологических, серотиповых, иммуногенных, вирулентных, токсических), используемый на предприятиях для изготовления коклюшного компонента комбиниро-

ванных вакцин позволяет своевременно выявить изменения, произошедшие в производственных штаммах и посевных сериях, оценить и, при необходимости, предотвратить влияние этих изменений на качество готового препарата

2. Надзор за качеством коклюшной вакцины, дополнительно включающий метод количественного определения агглютиногенов 1, 2 и 3, информативен и прогнозирует выпуск качественных АКДС и Бубо-Кок вакцин с регламентированной и стабильной на протяжении срока годности (1,5 г.) иммуногенной активностью. Показатель количественного содержания агглютиногенов, равный 1:3200 и выше, надежно прогнозирует выпуск АКДС и Бубо-Кок вакцин, стабильных по иммуногенной активности на протяжении 2,5 лет.

Использование стабильного по аттестуемым характеристикам ОСО 42-28-89 подтверждает надежность и информативность методов исследования иммуногенной активности коклюшной вакцины и достоверности оценки ее основного показателя качества.

3. Адаптированный метод статистического управления технологическим процессом производства коклюшной вакцины с помощью контрольных карт Шухарта, включающий мониторинг показателей внутрипроизводственного контроля ее качества в полуфабрикате и в АКДС и Бубо-Кок вакцинах позволяет оценить стабильность технологического процесса и предупредить выпуск некачественной продукции.

Личный вклад автора. Автор лично провела теоретическое обоснование необходимости проведения предложенного исследования, ею были сформулированы цель и основные задачи для решения обозначенной проблемы, предложен план по реализации научной работы. Автор лично провела анализ литературных источников, обработала и обобщила полученные в эксперименте данные. Материалы, изложенные в диссертации, получены лично Алексеевой И.А. на базе ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Данные, полученные при участии других авторов, использовались при условии участия автора от 75 % до 85 %. Работа была проведена, как одна из тем отраслевой научно-исследовательской программы: «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации (на 2006 - 2010 гг.).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации и результаты проведенного исследования соответствуют паспорту научной специальности 03.02.03 - микробиология.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 307 страницах компьютерного текста, содержит 56 таблиц, 25 рисунков и 1 приложение. Список литературы включает 470 источников, из них 74 отечественных и 396 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы и методы исследования

Производственные штаммы и посевные серии В. pertussis. Изучены регламентированные иммунобиологические свойства двадцати одного производственного штамма В. pertussis, которые использовались в разные годы для производства коклюшной моно- и АКДС вакцины. Семь штаммов (20, 39, 178, 298, 312, 345, 475) относятся к серотипу 1.2.3, три штамма (38, 187, 305) - к серотипу 1.2.0, одиннадцать штаммов (80, 108, 160, 262, 267, 277, 429, 58001, 613, 688, 703) - к серотипу 1.0.3, тест-штамм 18323 относится к серотипу 1.2.3. Все штаммы, кроме 58001, были выделены в нашей стране от больных коклюшем детей в 1955 - 1971 гг.

Для оценки иммуногенной активности и остаточной токсичности производственных, свежевыделенных штаммов и посевных серий из каждого штамма нами были приготовлены экспериментальные серии коклюшных вакцин (более 300 серий) в соответствии с первично утвержденным производственным регламентом изготовления коклюшной вакцины № 136-69.

В исследовании молекулярно-генетической характеристики производственных штаммов использованы «дикие» циркулирующие штаммы В. pertussis - 275 (выделен в 2009 г.), 284, 285, 287, 289 (выделены в 2011 г.). Кроме того для проведения исследования в пульсирующем поле (ЭФПП) использованы референс-штаммы В. pertussis, полученные из коллекции Unite des Bordetella (Centre National de Reference des Bordetelles), Institut Pasteur, Paris, France: штамм 18323; штаммы 1414 и 1416 (французские вакцинные штаммы); 134 - выделенный в США; 902 - выделенный в Нидерландах; Fr 287 - выделенный во Франции (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика рефереис-шта.ч.мов В. pertussis для ЭФПН

Название референс-штамма Место Год ЭФПП-

выделения выделения группа

АТСС 18323 США 1947 I

референс-штамм ВОЗ

1414 французский США до 1959 II

вакцинный штамм

1416 французский США до 1959 III

вакцинный штамм

134 США до 1960 III

902 Нидерланды 1992 IV

Рг 287 Франция 1996 V

Стандартные образцы. Для калибрования иммуногенной активности ЦКВ использовали два стандартных образца коклюшной вакцины:«Национальный стандарт коклюшной вакцины № 1» и «ОСО 42-28-89 иммуногенности коклюшной вакцины». Стабильность показателей иммуногенной активности и остаточной токсичности ОСО 42-28-89 подтверждалась на протяжении 35 лет. Калибрование ОСО 42-28-89 на соответствие количества международных единиц в ампуле проводили в сравнении с тремя международными стандартами: выпуска 1957 г. (MC №1) и 1980 г. (сер. 66/302 и 66/303). Калибрование иммуногенной активности было проведено в 45 опытах; остаточной токсичности - в 230 опытах с общим количеством использованных мышей - 10200 голов. Сыворотки. Для изучения серологических свойств коклюшной культуры использованы: сыворотки диагностические коклюшные поливалентные для реакции агглютинации, сухие; сыворотки диагностические паракоклюшные поливалентные для реакции агглютинации, сухие. Для изучения серотиповых свойств штаммов на первом этапе были использованы лабораторные серии сывороток к агглютиногенам 1, 2, 3, изготовленные проф. Деминой A.A. (ЦНИИЭ), затем - сыворотки диагностические коклюшные к агглютиногенам 1, 2, 3 и паракоклюшные к агглютиногену 14, адсорбированные, для РА с титром не менее 1:1280 производства филиал «Медгамал» ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Питательные среды. Микробиологическое исследование культур В. pertussis осуществляли на питательных средах Борде-Жангу и казеиново-угольном агаре (КУА) с 30 и 10 % крови соответственно, приготовленные в соответствии с действующими ПР коклюшной вакцины.

Вакцины. Были использованы коммерческие серии АКДС и Бубо-Кок вакцин, выпускаемые отечественными производителями, и поступавшие на сертификационный

контроль серии зарубежных комбинированных вакцин, содержащих цельноклеточный или бесклеточный коклюшный компонент. Всего было использовано 348 серий вакцин, из них 284 серии отечественных производителей.

Животные. Иммунобиологические свойства производственных штаммов В. pertussis исследовали на аутбредных мышах; иммуногенную активность производственных штаммов, посевных серий и коклюшной вакцины — на аутбредных и инбредных (линии CBWA или Fl (C57Bl/6JxCBA) мышах массой тела 10-12 г.

Стабильность иммуногенной активности ОСО-3 исследовали на аутбредных или инбредных мышах. Стабильность остаточной токсичности, лейкоцитозстимулирующей и гистаминсенсибилизирующей активности отраслевых стандартных образцов определяли на аутбредных мышах массой тела 14-16 г.

Дермонекротическую активность изучали на белокожих кроликах «шиншилла» массой тела 1,5-2,0 кг или 4-х дневных мышах-сосунках.

Общее количество использованных мышей более 400 тыс. голов; кроликов белокожих «шиншилла» массой 1,5-2,0 кг - 800 голов; мышей-сосунков - 70 голов. Методы. Оценку иммунобиологических свойств коклюшных бактерий (культураль-но-морфологических, серологических, вирулентных, токсических, антигенной структуры, дермонекротической и иммуногенной активности) проводили в соответствии с Инструкцией по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий, 1987 г. и МУК 4.2.2317-08 «Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий».

Оценку иммуногенной активности и остаточной токсичности проводили в коклюшной вакцине, приготовленной из соответствующих штаммов и содержащей 20 млрд/мл обезвреженных коклюшных бактерий.

Гуморальный иммунный ответ после введения мышам отечественных и зарубежных (с БКВ) комбинированных вакцин исследовали по двум оригинальным методикам ИФА, разработанным фирмами-производителями бесклеточных коклюшных вакцин «ГлаксоСмитКляйн», Бельгия и «Санофи Пастер», Франция.

Молекулярно-генетические исследования производственных штаммов осуществлены на базе ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера». Исследование ДНК изучаемых штаммов осуществляли с помощью электрофореза в пульсирующем поле. Постановку ЭФПП прово-

дили по методике, описанной F.R. Mooi., 2000 г. После разрушения клеточной стенки ДНК подвергали обработке рестриктазой Xbal. Профили ДНК исследуемых штаммов сравнивали с профилями ЭФПП референс-штаммов, представляющих основные группы.

Хромосомные локусы, содержащие «выпадающие» гены, получившие название регионы различий - RD (Regions of Difference), изучали с помощью ПЦР отдельных генов в составе RD: для выявления RD2 - ПЦР гена ВР1136, RD3 - ВР1160, RD4 - ВР1966 (Bouchez V., 2008). ДНК из бактериальной суспензии выделяли набором «Рибо-преп» (ЦНИИЭ, Москва). Постановку ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» (ДН-К-Тех-нология, Москва). Продукты ПЦР выявляли методом электрофореза в агарозном геле.

Секвенирование генов ptxA (Fry N.K.., 2001),ßm2, ßm3 (Zhang L., 2010), фрагментов гена prn (Mooi F.R., 2000) осуществляли методом Сэнгера с использованием коммерческого набора DTCS Quick Start Master Mix. Продукты ПЦР очищали на silica spin колонках согласно общепринятой методике с использованием этанола. Секвенирование последовательностей проводили с помощью прямого и обратного праймеров в трех повторно-стях на секвенаторе Genomelab GeXP (Beckman Coulter Inc., USA). Полученные нуклео-тидные последовательности сравнивали с материалами, размещенными в GenBank.

Стабильность технологии изготовления коклюшной вакцины оценивали методом статистического управления производственным процессом. Графическим средством метода является контрольная карта, при ее заполнении используют статистическую обработку используемых данных. Этот подход был предложен и обоснован У. Шухартом в 1924 г. Назначение контрольных карт - выявить изменения в результатах из повторяющихся процессов и обозначить критерий, подтверждающий отсутствие стабильности процесса (статистической управляемости). Выделено 8 критериев, проявление одного или нескольких на карте говорит о влиянии особых причин на производственный процесс, т.е. появление критерия (тренда - особого расположения точек, отражающих значения контролируемого показателя) является статистическим сигналом для немедленного анализа ситуации на данном этапе технологического процесса

Построение карт Шухарта и их анализ проводили в соответствии с ГОСТ Р 50779.42-99 (ИСО 8258-91) «Статистические методы. Контрольные карты Шухарта».

Оценку эффективности надзора за иммунобиологическими свойствами производственных штаммов и посевных серий, стабильностью аттестуемых характеристик

ОСО, качеством выпускаемого коклюшного компонента, стабильностью технологического процесса изготовления вакцины проводили по собственным данным и данным предприятий производителей.

В рамках надзора за качеством производственных штаммов и ЦКВ проанализировано более 1500 Сводных протоколов по производству и контролю АКДС и Бубо-Кок вакцин.

Расчет коэффициента парной ранговой корреляции по Спирмену осуществляли с помощью компьютерной статистической программы в редакции Л.Е. Полякова, 1971 г.

Точность розлива ОСО иммуногенной активности и токсичности (ОСО №№ 3, 4, 5) определяли по коэффициенту вариации сухого вещества, определенного в 20 образцах высушенной вакцины.

Полученные результаты подвергали статистической обработке с использованием программы Exel: расчет среднего арифметического и среднего геометрического значений, стандартного отклонения, стандартной ошибки среднего, достоверности различия результатов..

2. Результаты и их обсуждение

2.1. Надзор за производственными штаммами и посевными сериями В. pertussis

Способность бактерий В. pertussis изменять иммунобиологические свойства под влиянием разных факторов окружающей среды является большим препятствием для сохранения исходных свойств производственных штаммов и посевных серий в процессе их длительного культивирования в лабораторных и, особенно, в производственных условиях (Kasuga Т. et al., 1956; Aprile М.А., 1972; Захарова М.С.,1978; Лапаева И.А. с соавт., 1981). В требованиях к коклюшной вакцине ВОЗ подчеркивает, что на протяжении производственного процесса бактерии В. pertussis должны сохранять исходные свойства Для проверки сохранности первоначальных свойств следует применять соответствующие тесты (WHO, Techn. rep. ser., 1964, № 274; 1979, 638, 30; 1990, N 800, 40). В связи с этим при надзоре особое внимание уделено контролю за постоянством исходных свойств производственных штаммов в посевных сериях.

Результаты исследования иммунобиологических свойств штаммов В. pertussis, выделенных в 1950-1970-х годах, представлены в таблице 2. Как следует из таблицы штаммы по дермонекротической активности значительно не различались. Отличие проявлялось в серотиповом составе и способности экспрессировать агглютиногены. Кроме того,

штаммы различались по вирулентности и иммуногенной активности. Так, иммуногенная активность вакцины (20 млрд клеток/мл), изготовленной из соответствующего Таблица 2. Показатели иммунобиологических свойств производственных штаммов В. pertussis, выделенных в 1950-1958 гг. и в 1966-1971 гг., поданным

ГИСК им. Л.А. Тарасовича

№ штамма Иммуногенная активность, МЕ/мл Дермонекро-тическая активность, некроз/ см Вирулентность при интраназа-льном заражении, млн. микр. кл. Титр серотиповой сыворотки к агглютиногенам:

1 2 3

Выделены в 1950-1958 гг

187 3,5 1,1 х 1,0 35,4 320 80 -

262 9,4; 15,2 1,3 х 1,4 1,6 х 1,5 31,0-64,2 6400 0 3200

305 6,7 1,1 х 1,3 64,9 800 800 0

312 9,0; 16,4 1,5 х 1,0 1,3 х 1,8 70,0 35,3 3200 12800 1600 3200 800 6400

345 12,2 1,4 х 1,6 34,6 3200 3200 160

Выделены в 1966-1971 гг

38 19,1 1,0 х 1,5 42,1 5120 2560 0

39 20,4 1,6 х 1,7 74,3 10240 5120 5120

108 4,8 0,8 х 1,0 101,0*; 47,1** 1280 0 640

160 19,7 1,9х 1,8 24,0** 10240 0 5120

178 14,9 1,1 х 1,1 30,8 10240 5120

267 11,7 1,1 х 1,2 43,2 5120 0 2560

298 9,9; 23,1 1,2 х 1,7 83,1*; 25,8** 5120 5120 1280

429 21,8 10,3 1,6 х 1,6 1,1 х 1,6 24,0; 64,7 5120 0 10240

475 13,6 1,3 х 1,3 76,7 5120 640 1280

688 7,3 1,4 х 1,7 51,4 640 0 160

703 15,1 2,0 х 1,9 94,1*;53,8** 5120 0 5120

Примечание: * - вирулентность штамма, выделенного от больного; **- вирулентность штамма после культивирования на среде БЖ

штамма, колебалась от 2,9 до 25,0 МЕ/мл при нормативном требовании ВОЗ не менее 8 МЕ/мл. Полученные результаты требовали организации регулярного надзора за состоянием производственных штаммов и посевных серий при хранении, за условиями подготовки посевных серий к лиофильному высушиванию для своевременного выявления факторов, отрицательно влияющих на их иммуногенную активность. Анализ данных ежегодного испытания иммунобиологических свойств посевных серий производственных штаммов, продемонстрировал наличие связи между количественным содержанием агглютиногенов в посевных сериях и иммуногенной активностью коклюшных вакцин, изготовленных из них. Серии, в которых агглютиногены (АГГ)1, 2 и 3 выявлялись типо-специфическими сыворотками в конечных разведениях 1:200-1:800, характеризовались невысокой иммуногенной активностью. Посевные серии, где агглютиногены 1, 2 и 3 выявлялись большим разведением сывороток: 1:2560-1:10240, имели высокую иммуногенную активность (>10 МЕ/мл) (табл. 3 и 4).

Таблица 3. Характеристика иммунобиологических свойств посевных серий

В. pertussis. Данные ОАО «Биомед» им. H.H. Мечникова

Пока- № 2002 г. 2003 г. 2004 г. 2005 г. 2006 г. 2007 г. 2008 г. 2009 г.

за-тель шта

мма

Иммуно- 305 8,7 9,0 9,6 10,8 15,5 16,1 12,6 15,9

генная ак- 267 9,2 8,9 10,9 11,7 13,0 13,5 17,6 15,6

тивность, 312 8,1 8,5 9,6 12,0 10,9 н.и.** н.и н.и.

МЕ/мл 475 8,0 9,1 11,3 12,4 14,4 15,3 16,0 14,8

Вирулен- 305 69,1 94,4 75,6 30,8 34,9 90,0 40,0 64,3

тность* 267 54,8 48,0 60,1 15,8 70,7 31,1 45,0 59,0

млн 312 92,1 76,2 37,9 33,2 41,3 н.и. н.и. н.и.

микр. кл. 475 55,0 59,9 85,6 41,0 60,3 56,5 71,18 50,0

Дермоне- 305 0,7x1,0 0,9x1,0 1,1x1,2 1,0x1,0 1,6x1,6 1,4x1,5 1,2x1,4 1,2x1,5

кроти-че- 267 1,0x0,8 1,0x1,1 0,9x1,0 1,0x1,2 1,5x1,5 2,0x1,6 1,4x1,7 1,3x1,4

ская ак- 312 1,0x1,0 1,1x1,1 0,9x1,1 1,1x1,1 1,2x1,2 н.и. н.и. н.и.

тивность, 475 0,9x1,7 0,9x1,1 1,0x1,0 0,9x1,1 1,5x1,5 1,3x1,6 1,1x1,3 1,1x1,5

некроз в

см

Остаточ- 305 65,6 74,4 71,2 65,5 68,4 61,2 78,6 70,8

ная ток- 267 71,8 65,4 66,9 72,1 73,0 72,0 68,8 68,8

сичность, 312 64,8 68,9 70,4 69,4 70,2 н.и. н.и. н.и.

% 475 68,3 70,9 65,3 65,8 74,0 73,0 69,3 72,4

Примечание: * - при шгграназальном введении культуры; ** - н.и. - штамм не использовали

С помощью коэффициента парной ранговой корреляции Спирмена была подтверждена прямая взаимосвязь между показателями содержанием АГГ1, АГГ2, АГГЗ в коклюшной вакцине и иммуногенной активностью. Величина коэффициента составила Таблица 4-Титр серотиповой сыворотки к агглютиногенам, выявляющий

количественное содержание агглютиногенов в посевных сериях В. pertussis

(продолжение таблицы 3)

№ штам -ма Серо-тип 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009

1 800 1600 3200 10240 5120 10240 10240 10240

305 2 200 800 800 5120 2560 2560 2560 5120

3 0 0 0 0 0 0 0 0

1 1600 3200 3200 2560 2560 10240 10240 5120

267 2 0 0 0 0 0 0 0 0

3 400 1600 1600 10240 10240 10240 10240 5120

1 800 1600 1600 3200 2560 н.и. н.и. н.и.

312 2 200 800 800 1600 800 H.H. н.и. н.и.

3 400 800 1600 1600 1280 н.и. н.и. н.и.

1 800 1600 3200 2560 10240 10240 10240 10240

475 2 400 400 3200 640 1280 1280 1280 2560

3 400 800 1600 5120 10240 5120 5120 2560

0,80, 0,77 и 0,62 соответственно, что демонстрирует высокую и умеренную (для последнего значения) связь между ними. Впервые определен нижний допустимый показатель количественного содержания агглютиногенов в коклюшной суспензии до ее сведения с дифтерийным и столбнячным анатоксинами (l:1280-lg 3,1), при котором иммуногенная активность коклюшной вакцины соответствовала минимальному регламентированному требованию ВОЗ (8 ME/мл). Более высокий уровень агглютиногенов (l:3200-lg 3,5 и выше), отражает более высокую иммуногенную активность коклюшной вакцины (10 ME/мл и выше) (рисунок 1). Установленный показатель 1:1280 был включен в соответствующий раздел регламентов производства коклюшной вакцины.

Причину разного содержания агглютиногенов в производственных штаммах В. pertussis выявили при исследовании однородности популяции лиофилизированных культур (таблица 5). Показано, что лиофилизированные культуры В. pertussis в большинстве случаев представляли собой гетерогенную популяцию, содержащую бакте-

риальные клетки, экспрессирующие разное количество поверхностных протективных антигенов - агглютиногенов 1, 2, 3. Наряду с типичными мелкими полупрозрачными колониями. клетки которых содержали более высокий уровень соответствующих агглюти-

Рисунок 1. Зависимость иммуногенной активности коклюшной вакцины от содержания в ней агглютиногенов 1. 2 и 3. Ось ординат - иммуногенная активность вакцины в ME/мл, ось абсцисс - титр типоспецифической сыворотки в lg, отражающий количественное содержание агглютиногенов.

генов, имели место колонии матового цвета среднего и крупного размера, в которых содержание агглютиногенов 1 и/или 2, и/или 3 обнаруживалось в меньшем количестве или вообще не выявлялось. Наши наблюдения подтвердили данные Cameron J., 1967; Standbridge T.N., 1974, которые установили, что культуры из разных колоний могут различаться по типоспецифическому составу. Результаты наших исследований показали, что в процессе хранения лиофилизированные культуры В. pertussis становятся гетерогенными в разной степени по морфологии колоний, отмечается снижение способности экспрессировать агглютиногены. что отражается на показателях иммуногенной активности производственных штаммов. Продемонстрировано, что используемый ранее отбор колоний В. pertussis только по морфологическим характеристикам не достаточен и не отражает способность коклюшных бактерий экспрессировать агглютиногены в требуемом количестве.

Выявление гетерогенности популяции штаммов и подтверждение прямой связи между количественным содержанием аггл юти но генов в посевной серии и ее иммуноген-ной активностью послужило основанием для усовершенствования подготовки посевных серий к лиофильному высушиванию. Предложен новый метод приготовления посевных серий, основанный на микробиологической селекции колоний культуры по приз-

Таблица 5. Результаты реакции агглютинации изолированных колоний

В. pertussis, характерных I фазе роста, с типоспецифическими сыворотками

№ штам- Количество Агглютинация культур из разных колоний типоспе-

ма исследован- цифическими сыворотками к агглютиногенам:

ных колоний 1 2 3

39 12 9+++* 5+++* 10+*

1++* 4++* 2-

2+ 2-й 1 -*

187 11 7+++ 4+++ 11 -

1++ 3++

3+ 1+

312 12 9+++ 3+++ 1 ++

2++ 3++ 5 +

1+ 4+; 2 - 6-

38 10 5+++ 3+++ 10-

4++ 4++

1 + 2+; 1 -

305 11 5+++ 4+++ 3+++

3++ 3++ 4++

2+; 1 - 3+; 1 - 2+; 3 -

345 12 7+++ 5+++ 3+++

4++ 3++ 1++

1 + 2+; 1 - 4+ 3-

475 11 10+++ 6+++ 5+++

1++ 3++ 3++

2+ 2+; 1 -

267 10 10+++ 1 - 8+++

2++

18323 10 10+++ 9+++ 7+++

те- 1++ 1++

ст-штам 2+

Примечание: здесь и далее: * — оценка реакции агглютинации на стекле

наку экспрессии агглютиногенов. Агглютиногены 1, 2, 3 должны выявляться в посевной серии типоспецифическими сыворотками в разведении не менее 1:1280. Если однократ-

ной селекции для повышения количественного содержания агглютиногенов в микробных клетках недостаточно, то селекцию следует провести повторно (таблица 6).

Селекция колоний В. pertussis по экспрессии агглютиногенов направлена на стандартизацию и повышение надежности получения достаточно высокой по однородности популяции микроорганизмов. Подготовленная таким образом культура коклюшных бактерий обладает высокой иммуногенной активностью и после лиофильного высушивания стабильно сохраняет эти свойства на протяжении не менее 5 лет. После установления Таблица 6. Содержание агглютиногенов в посевной серии до н после

проведенной селекции колоний

Штамм, сушка 1 серо-тип 2 серо-тип 3 серо-тип Штамм, сушка 1 серо-тип 2 серо-тип 3 серо-тип

До использования После селекции

305 04.80 800* 200 - 305 02.98 3200 800 -

305 02.98 3200 800 0 305 05.06 5120 1280 0

187 02.81 1600 400 - 187 06.97 3200 800 -

475 10.82 1600 200 800 475 05.97 3200 400 800

475 05.97 2560 320 640 475 01.04 5120 1280 10240

267 10.1990 12 80 0 1280 267 12.04 5120 0 10240

703 03.98 800 0 800 703 03.08 10240 0 10240

Примечание: * - титр серотиповой сыворотки к агглютиногенам

данной зависимости на предприятия для производства ЦКВ нами (специализированной лабораторией ГИСК им. Л.А. Тарасевича) стали высылаться посевные серии В. pertussis, прошедшие селекцию по признаку количественного содержания агглютиногенов. Введение требования об обязательном ежегодном контроле посевных серий на предприятии гарантирует использование при изготовлении коклюшной вакцины посевных серий, отвечающих требованиям нормативной документации.

Требования к иммунобиологическим свойствам производственных штаммов, включая их обязательный контроль, система подготовки штаммов к лиофильному высушиванию отражены в технологической нормативной документации, в МУК 4.2.2317-08 «Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и

бронхисептикозных бактерий». Метод определения содержания агглютиногенов в посевных сериях и коклюшной суспензии введен в промышленные регламенты производства коклюшной вакцины.

Результаты оценки воспроизводимости иммуногенной активности коклюшной вакцины, изготовленной из соответствующих посевных серий штаммов В. pertussis в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и на предприятиях страны, свидетельствуют о воспроизводимости и сопоставимости результатов (таблица 7).

Таким образом, по показателям иммунобиологических свойств, в том числе по активности коклюшных вакцин, посевные серии в течение длительного периода времени отвечают национальным требованиям и требованиям ВОЗ. Использование селекции коклюшных бактерий позволило с 2003-2004 гг. повысить иммуногенную активность в культуре и коклюшной вакцине, изготовленной из нее, о чем свидетельствуют данные, представленные в таблице 7.

Таблица 7. Показатели иммуногенной активности коклюшных суспензий

(ME/мл), изготовленных из соответствующих посевных серий*

№ штамма 2000 г. 2001 г. 2002 г. 2003 г. 2004 г. 2005г. 2006г 2007 г. 2008 г.

703 9,2 8,9 7,5; 10,6 14,7 13,3 12,8 15,2; 16,8 13,5

8,3; 8,7 9,5; 9,9 10,1; 9,2 10,5 11,0 15,3 19,1 18,2 16,4

267 8,5 7,7; 12,8 11,2 16,6 14,3 13,8 15,1 8,0; 16,6 15,9;

8,8;9,0 8,8; 9,0 10,9; 9,8 11,2 12,9 10,8;12,8 13,8 12,3; 10,1 13,8

38 9,2; 10,0; 5,8; 11,6 9,4; 12,3 11,6 14,3 10,2 15,2 14,2;

8,4 10,8 13,7 11,6 14,2 14,9 13,8 16,1 15,4

305 8,1 11,0 10,1 9,9; 9,1; 15,3 13,4 12,8 14,9

8,6; 8,9 9,4 10,2; 11,0 12,2 11,6 14,7 15,0 10,0; 9,4 13,2

312 10,1 9,7 8,3 12,3 13,0 14,8 13,7 15,2 15,9

9,5 8,1; 9,8 10,1 14,6;11,6 14,5 16,1 10,9 12,7 16,0

475 9,2 9,9 8,4; 7,3 ;21,9 10,1 15,5 13,9 14,0 12,8

9,7 8,3; 10,8 14,8; 9,1 14,3 9,8; 11,5 12,1 11,8 15,1 13,8

Примечание: * - данные ГИСК им. Л.А. Тарасевича - верхняя строка, производственных предприятий ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова, филиалов ФГУП «НПО «Микроген» в городах Уфа и Пермь - нижняя строка

Согласно опубликованным материалам, использование для изготовления коклюшных вакцин производственных (вакцинных) штаммов с иной генотипической структурой по сравнению с циркулирующими штаммами может отразиться на эффективности применяемых вакцин (Preston N.W., 1963; Демина A.A., 1970; De Melker Н.Е., 2000;

Mooi F.R. et al., 2001). В ранее проведенных исследованиях (Kourova N., 2003; Borisova О., 2007) при изучении хромосомной ДНК нескольких вакцинных штаммов 267, 39, 305, 475, тест-штамма 18323 и штаммов, выделенных от больных в разные годы, методом ЭФПП были установлены генетические различия исследуемых штаммов, что согласуется с данными других исследователей о генетическом различии внутри вида В. pertussis (Weber С., 2001; Bouchez V., 2008). Актуально было провести молекулярно-генетиче-ские исследования всех производственных штаммов, используемых в нашей стране для изготовления коклюшного компонента комбинированных вакцин.

В результате проведенных исследований было установлено, что геномные составы производственных штаммов, выделенных в 1955-1970 гг. и штаммов В. pertussis, выделенных в 2009 и в 2011 гг. от больных детей, различаются. Из производственных штаммов, относящихся ко II (штамм 475) и III (штаммы 38, 39, 187, 267, 305, 312, 345, 703) ЭФПП-группам, аллель ptxA4 гена коклюшного токсина обнаружен у штаммов 475 и 345, аллель ptxAl - у штаммов 38, 39, 187, 267, 305, 312, ptx А1 - у штамма 703. Все изученные производственные штаммы имели аллель гена пертактина prn 1 и аллели fiml-\ иßm3A генов фимбрий. Изоляты от больных коклюшем детей, содержали как «вакцинные» аллели ßm2-\ и ßm3A, так и аллели ßml-2 и ßm3B, аллель ргп2 и аллель ptx Al. Тест-штамм 18323, который используют при оценке защитной активности коклюшных вакцин по рекомендованному ВОЗ методу экспериментального менингоэнцефалита, отнесен к I ЭФПП-группе и содержит аллели ptxS 1Е, ргпб, tcfA5 (Mooi F.R., 2000). Также было установлено, что фрагмент генома RD2 (регион различий - Regions of Difference) был утрачен всеми отечественными производственными штаммами, кроме штамма 475, относящегося ко II ЭФПП-группе, и штамма 312, относящегося к III группе, но выделенного до начала вакцинации (в 1956 г.). По данным других авторов этот фрагмент генома встречается главным образом у штаммов, выделенных в довакцинальный период и относящихся ко II ЭФПП-группе. Локус RD4 выявлен у изученных производственных штаммов (38, 39, 267, 305, 312, 475, 703) и отсутствует у циркулирующих штаммов, что также совпадает с данными публикаций зарубежных авторов (Bouchez V., 2008)(табл. 8). Вместе с тем, локус RD3, который другими авторами обнаруживался преимущественно у штаммов, выделенных до 1980 г. и отсутствовал у всех изученных штаммов, выделенных после 2000 г., в данном исследовании был выявлен у всех изученных штаммов, в том числе циркулирующих.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что производственные и свежевыделенные штаммы в большей или меньшей степени различаются по структуре генов коклюшного токсина (ptxA), фрагмента AFR пертактина (prri) и фимбрий fiml и fim3.Использование в производстве вакцины рекомендованных нами штаммов В. pertussis с некоторыми изменениях генов в протективных антигенах в настоящее время

Таблица 8. Характеристика вакцинных и циркулирующих штаммов по

содержанию отдельных генов

штаммы Серо-тип ptx prn fiml firrii RD2 RD3 RD4 Группа ЭФПП

Выделены в 19551970 гг.: 38 1.2.0 ptxAl prnX fiml-X fim3A + + III

39 1.2.3 ptxAl prrtX fiml-X fim3A + + III

187 1.2.0 ptxAl prnX fiml-X fiml A + + III

267 1.0.3 ptxAl prnX fiml-X fim ЗА + + III

305 1.2.0 ptxAl prn 1 fiml-X /Jm3A + + III

312 1.2.3 ptxAl prnX firril-X fim3A + + + III

345 1.2.3 ptx A A prnX fiml-X fim3A + + III

475 1.2.3 ptx A4 prnX fiml-X fim3A + + + II

703 1.0.3 ptxAX prnX fiml-X fim3A + + III

Выделены в 20092011 гг.: 275 1.0.3 ptxAX prril fiml-X fim3A + IV

284 1.0.3 ptxAX prril fiml-l fim3B + IV

285 1.0.3 ptxAX prril fiml-1 fim3A + IV

287 1.0.3 ptxAX prril fiml-X fim3A + IV

289 1.0.3 ptxAX prril fiml-X fim3A + IV

влияет на формировании адекватного поствакцинального иммунитета, что подтверждается уровнем заболеваемости коклюшем в нашей стране при высоком охвате детей прививками. По заключению ВОЗ в настоящее время пока не установлена связь между генетическими изменениями протективных антигенов в циркулирующих штаммах и ростом заболеваемости коклюшем (WHO,Weekly epidemiological record, 2014, 89, No 21). Требуется дальнейшее наблюдение за циркулирующими штаммами с целью, при необходимости, своевременной коррекции используемых производственных штаммов.

Введение на производстве обязательного ежегодного контроля иммунобиологических свойств посевных серий В. pertussis, разработка метода отбора колоний по экспрессии агглютиногенов 1, 2 и 3, установление критериев пригодности посевных серий для производства коклюшной вакцины позволило усовершенствовать надзор за производством коклюшной вакцины. В результате предложен способ повышения стабильности иммунобиологических свойств посевных серий и увеличения иммуногенной активности производственных штаммов и посевных серий В. pertussis, используемых для изготовления коклюшного компонента АКДС и Бубо-Кок вакцин.

2.2. Надзор за качеством коклюшного компонента комбинированных вакцин и его эффективность

Эффективность иммунопрофилактики коклюша зависит от качества и стандартности используемой коклюшной вакцины. Поэтому актуальной задачей исследования являлось выяснение причины нестабильного качества коклюшного компонента в АКДС вакцине и разработка мер для повышения качества препарата. Оценку иммуногенной активности коклюшной вакцины, как полуфабриката, так и в готовом комбинированном препарате, проводят в РФ в сравнении с отраслевым стандартным образцом (ОСО), откалиброванным по международному стандарту коклюшной вакцины. ВОЗ утвердил единый метод измерения иммуногенной активности коклюшной вакцины в тесте экспериментального менингоэнцефалита и единый способ выражения иммуногенной активности в условных международных единицах - МЕ.

В рамках надзора за производством коклюшной вакцины основополагающим являлось исследование надежности калибрования иммуногенной активности коклюшной вакцины в сравнении с ОСО. Исследования стабильности аттестованных характеристик стандартных образцов, используемых на протяжении длительного времени для калибрования иммуногенной активности коклюшной вакцины проводили периодически в сравнении с действующими международными стандартами.

Первая серия национального стандарта коклюшной вакцины (НС-1), изготовленная в 1963 г. из штамма В. pertussis 305 и содержащая в ампуле 28 МЕ, была стабильна по показателю иммуногенной активности на протяжении более 15 лет (Захарова М.С., 1972). В 1980 г. была аттестована вторая серия стандарта коклюшной вакцины - ОСО-3, зарегистрированная под номером ОСО 42-28-89. Обе серии изготовлены по единой технологии, разработанной М.С. Захаровой. В отличие от НС-1 ОСО-3 был изготовлен из

трех штаммов - 312, 305, 267 ееротипов 1.2.3, 1.2.0 и 1.0.3 соответственно для обеспечения в стандарте наличия агглютиногенов 1, 2 и 3. ОСО-3 с содержанием в ампуле 30 МЕ, до настоящего времени используют для калибрования иммуногенной активности коклюшной вакцины на всех этапах технологического процесса

Результаты надзора за стабильностью аттестованных показателей ОСО-3 демонстрируют, что, несмотря на использование разных по качеству и чувствительности мышей и разных международных стандартов, ОСО по содержанию в ампуле МЕ активности стабилен на протяжении более 35 лет (табл. 9). Использование стабильного по показателю иммуногенной активности ОСО-3 для калибрования иммуногенной активности коклюшного компонента позволяет подтвердить, что регламентированный метод исследования активности коклюшной вакцины достоверен, информативен, а также адекватно

Таблица 9. Стабильность показателя иммуногенной активности ОСО-3 за

период с 1977 по 2010 гг.

Показатель 1977-1980 гг.* (МС 1957 г.) 1981-1990 гг.** (МС 1980 г-№ 66/302) 1991-2000 гг.** (МС 1980 г,-№ 66/302) 2001-2010гг*** (МС 1998 г. № 66/303)

Иммуногенная активность, МЕ/амп (р > 0,05) Среднее геометрическое значение 30,18 19,56-46,14 29,53 12,19-71,56 33,72 20,10-56,59 31,0 18,52-52,48

Коэффициент вариации, % 11,3 18,5 10,4 5,4

Примечание: *- испытания проведены на аутбредных мышах; **- испытания проведены на мышах линии СВ\¥А (тетрагибриды); ***- испытания проведены на мышах И! (С57

В1/63 х СВА)

оценивает качество выпускаемого препарата В связи с истощением запаса ОСО-3 изготовлена в производственных условиях по той же технологии, что и ОСО-3, новая серия отраслевого стандартного образца иммуногенности коклюшной вакцины - ОСО-4. Для изготовления ОСО-4 были использованы три производственных штамма, взятых в равных соотношениях - 475 серотип 1.2.3, 305 серотип 1.2.0 и 267 серотип 1.0.3 (табл. 10). С культурами отобранных штаммов была проведена селекционная работа: отобраны отдельные колонии, активно экспрессирующие агглютиногены. Содержание междуна-

родных единиц установлено при калибровании в тринадцати опытах в сравнении с международным стандартом и ОСО-3: 28 МЕ в ампуле (табл. 11).

Оценка сопоставимости результатов испытания иммуногенной активности коклюшного компонента комбинированных вакцин при параллельном (в одном опыте) Таблица 10. Сравнительная характеристика стандартных образцов

иммуногенной активности коклюшной вакцины ОСО-3 и ОСО-4

Показатели Стандарт

ОСО-3 ОСО-4

Технические характеристики

Наполнитель декстран 6 % декстран 6 %

Штамм Bordetella pertussis, 305,312, 267 305, 475, 267

серотип 1.2.0., 1.2.З., 1.0.3. 1.2.О., 1.2.З., 1.0.3.

Обезвреживание коклюшной мертиолят мертиолят

культуры 1:5000 1:5000

Аттестованные характеристики

Средняя масса сухого 61,8 ±0,9 90,2 ± 1,99

зещества в ампуле, мг Р=0,95 Р=0,95

Коэффициент вариации, % 3,66 2,2

Остаточная влажность, % 1,08 0,45

Количество коклюшных 60 ±2,4 60 ± 3,0

микробных клеток, Р=0,95 Р=0,95

млрд в ампуле

Количество МЕ в ампуле 30 28

Таблица 11. Иммуногенная активность ОСО-4 при сравнении с ОСО-3 и международным стандартом коклюшной вакцины № 66/303

Показатель Количественное содержание МЕ в амп. ОСО-4

при сравнении с ОСО-3 При сравнении с MC 66/303

Иммуногенная активность, МЕ/амп 30,2* (17,69-44,90) 29,3 (11,26-47,31)

Коэффициент вариации, % 21,7 30,8

Примечание: испытания проведены на мышах Р1(С57В1Лу х СВА); *- средняя геометрическая величина с указанием доверительных интервалов

сравнении с ОСО-3 и новой серией ОСО-4 выявила высокую связь (табл. 12). Коэффициент ранговой корреляции г составил 0,87 при р<0,01. На основании результатов исследования аттестуемых характеристик и калибрования в сравнении с МС и ОСО-3 новая серия ОСО-4 внесена в Реестр ОСО под № 42-28-89-2014.

Изготовление, контроль и работа со стандартными образцами, используемыми в испытаниях для оценки иммуногенной активности коклюшной вакцины является чрезвычайно важным разделом в системе надзора, поскольку использование стабильного ОСО коклюшной вакцины гарантирует правильность калибрования иммуногенной активности изготовленных АКДС и Бубо-Кок вакцин и выпуск качественной продукции.

Таблица 12. Сравнительная иммуногенная активность коклюшного компонента комбинированных вакцин, калиброванная по отношению к ОСО-3 и ОСО-4

Препарат Иммуногенная активность, рассчитанная по сравнениию с ОСО-3, МЕ/мл Иммуногенная активность, рассчитанная по сравнению с ОСО-4, МЕ/мл

Бубо-Кок, сер. 025 17,1 17,4

Бубо-Кок, сер. 027 13,9 14,1

Бубо-Кок, сер. 036 13,2 13,4

Бубо-Кок, сер. 041 11,7 11,8

Бубо-Кок, сер. 046 9,9 8,9

АКДС сер. 14 8,7 7,9

АКДС сер. 88 8,3 8,4

АКДС сер. 84 8,4 6,6

АКДС сер. 108 13,8 9,7

АКДС сер. 015 10,5 8,3

В рамках надзора регулярно проводили исследование качества коклюшного компонента АКДС и Бубо-Кок вакцин, выпускаемых разными предприятиями страны. Актуальным было провести сравнительное исследование качества отечественных вакцин в сравнении с зарегистрированными зарубежными препаратами, содержащими цельнокле-точные (Тетракок (Франция) и Тританрикс-Геп В (Бельгия)) и бесклеточные коклюшные вакцины (Инфанрикс, Инфанрикс-гекса (Бельгия), Тетраксим и Пентаксим, (Франция)). Результаты исследования продемонстрировали, что иммуногенная активность отечественных и зарубежных ЦКВ соответствовала регламентированному значению > 8 МЕ/мл. Однако необходимо подчеркнуть, что требуемый показатель активности (не менее 8 МЕ/мл) обеспечивает разное количество коклюшных бактерий в дозе препарата: отечественные АКДС и Бубо-Кок вакцины содержат по 10 млрд микробных клеток; Тританрикс-Геп В -15 млрд, Тетракок -20 млрд (табл. 13).

Остаточная токсичность (специфическая безопасность) является одним из основных показателей качества коклюшной вакцины. Поэтому этот показатель играет важную роль при проведении биологической стандартизации коклюшного компонента Согласно Таблица 13. Сравнительная характеристика иммуиогенной активности коклюшного компонента отечественных и зарубежных комбинированных вак-

цин (МЕ/мл)

Год ы АКДС ОАО «Биомед» им. Мечникова АКДС «Иммуно препарат» , Уфа Бубо-Кок «НПК «Комбио- тех», Москва АКДС «Пермско е НПО «Биомед» АКДС-Геп В «Пермско е НПО «Биомед» Тет- ра-кок, Франция Три- тан-рикс-Геп В, Бельгия

1995 10,6* 9,6

- от 8,0 до от 8,0 до

1998 12,8** 11,1

2000 11,7 9,4 10,1 13,2 8,9 15,6 14,1

- от 8,1 до от 8,1 до от 8,5 до от 9,3 до от 8,3 до от 8,1 от 11,4

2005 18,3 12,1 11,2 16,7 10,3 до 26,4 до 17,9

2006 12,0 8,6 19,1 9,6 9,1

- от 8,0 до от 8,1 до от 10,0 до от 8,5 до от 8,0 до

2010 18,1 11,0 29,7 13,2 10,2

Примечание: * - здесь и далее - при вычислении средних геометрических величин были использованы результаты контроля 4-30 серий. ** - здесь и далее - указаны данные минимального и максимального значения активности среди испытанных серий

требованиям ВОЗ остаточную токсичность определяют в тесте изменения массы тела мышей. Этот показатель качества оценивают при внутрибрюшинном введении мышам не менее половины разовой дозы для человека (0,25 мл по рекомендации ВОЗ). Национальные требования к остаточной токсичности коклюшной вакцины жестче: препарат должен соответствовать требованиям ВОЗ при введении мышам одной прививочной дозы для человека - 0,5 мл вместо 0,25 мл. Критерием возможности применения вакцин является увеличение общей массы тела группы опытных животных не менее, чем на 60 % от аналогичного показателя животных контрольной группы. Последующий контроль коммерческих серий АКДС и Бубо-Кок вакцин, поступавших в ГИСК им. Л.А. Тарасевича продемонстрировал, что все серии соответствовали требованиям действующей нормативной документации и ВОЗ (табл. 14). Использование в производстве штаммов, активно экспрессирующих агглютиногены, не отразилось на остаточной токсичности коклюшной вакцины. Зарубежные Тетракок и Тританрикс соответствуют требовани-

ям ВОЗ только при введении животным по 0,25 мл. БКВ (группы Инфанрикс и группы Пентаксим), обладающие меньшей реактогенностью, отвечают критериям ВОЗ при введении 0,5 мл препарата. Меньшее количество бактериальных клеток в отечественных

Таблица 14. Оценка остаточной токсичности коклюшного компонента

комбинированных вакцин в тесте изменения массы тела мышей

Вакцина, изготовитель, содержание коклюшных микробных клеток/доза Увеличение средней массы тела в группе иммунизированных мышей (% от увеличения средней массы тела мышей контрольной группы) при введении:

0,25 мл/мышь 0,5 мл/мышь

АКДС, ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова, 10 млрд коклюшных клеток (80,4±6,6)* %

АКДС, «НПО «Микроген», Филиал в г.Уфа 10 млрд коклюшных клеток (70,7±5,3) %

Бубо-Кок, ЗАО «НПК«Ком- биотех», Москва 10 млрд коклюшных клеток (77,5±6,0) %

Тританрикс-геп В, Бельгия 15 млрд коклюшных клеток (73,7±26,8) % Не соответствуют < 60 % гибель животных

Тетракок, Франция 20 млрд коклюшных клеток (81,1±7,1)% Не соответствуют < 60 % гибель животных

Примечание: * - при вычислении средних величин были использованы результаты контроля 10 и более серий

вакцинах обусловливает и их меньшую реактогенность по сравнению с аналогичными зарубежными препаратами, что отражено в инструкциях по применению вакцин. Так, использование изготовленной серии отечественной АКДС или Бубо-Кок допускается при условии, что подъем температуры тела выше 38,5 °С может наблюдаться не более чем у 1 % вакцинированных детей. Использование вакцины Тетракок, содержащей в дозе обезвреженных коклюшных бактерий в 2 раза больше по сравнению с АКДС, допускается, если подъем температуры тела выше 38,5 °С наблюдается не более, чем у 4 % привитых. Вакцинация Тританрикс-Геп В возможна, если подъем температуры тела выше 39,5 °С отмечен не более, чем в 1,1 % случаев. Применение Инфанрикс в 0,1- 1,0 % случаев вызывает повышение ректальной температуры > 39,1 °С, что соответствует

38,1 °С при аксиллярном измерении. Вакцина Пентаксим может вызывать у 0,1 % - 1 % привитых повышению ректальной температуры > 39 °С; у 0,01 % - 0,1 % - свыше 40 "С.

Приведенные данные свидетельствуют, что общая реактогенность отечественной ЦКВ в составе комбинированных вакцин значительно меньше по сравнению с зарубежными аналогами и, в то же время, ненамного больше реактогенности бесклеточных коклюшных вакцин, что подтверждается клиническими исследованиями.

В связи с выявленной взаимосвязью количественного содержания агглютиногенов 1, 2, 3 в посевных сериях и иммуногенной активностью коклюшных вакцин, полученных из них, актуальным было проведение исследований по оценке информативности и надежности использования показателя количественного содержания агглютиногенов 1, 2 и 3 в качестве маркера для прогнозирования иммуногенной активности готовой продукции.

Анализ показал, что на предприятии ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова в 2000 г. уровень агглютиногенов 1 и 3 только в пяти группах из шести достигал требуемого уровня 1:1280. Агглютиноген 2 выявлялся меньшими разведениями сыворотки. С конца 1990-х и начала 2000-х гг., после начала использования посевных серий, полученных из ГИСК им. Л.А. Тарасевича, клетки которых активно экспрессировали агглютиногены, наблюдалось постепенное увеличение показателей содержания агглютиногенов и иммуногенной активности коклюшной вакцины (рис. 2). В последующие годы содержание агглютиногенов 1, 2 и 3 постепенно увеличивалось. К 2010 г. показатели значительно выросли и выявлялись типоспецифическими сыворотками в разведениях 1:8000 (АГГ1), 1:2300 (АГГ2), 1:6000 (АГГЗ). Параллельно наблюдалось увеличение показателя иммуногенной активности вакцины, среднее значение которой в 2010 г. составило более 16,0 МЕ/мл.

На рисунке 3 представлены схемы, построенные по данным филиала ФГУП «НПО «Микроген» в г. Уфа, за 2000 г., 2005 г. и 2009-2010 гг. Проведенный анализ установил, что в 2000 г. только АГГ1 выявлялся соответствующей типоспецифической сывороткой в разведении =1:1000, а АГГ2 и АГГЗ - в значительно меньших разведени- ях. В 2005 г. ситуация улучшилась и уже практически все АГГ выявлялись в разведении сыворотки 1:1280. Обращает на себя внимание разная высота столбцов в рассматриваемых парах. Это говорит о нестабильности технологического процесса. При инспекционных поездках на предприятие были выявлены проблемы, которые сказывались на ста

I Серотип 1 I I Серотип 2 I I Серотип 3

39.

267,

305

305, 475

305, 312

Ш, 305. 312, 312. 475 475

305. 312. 475

I I Серотип 1 Б] Серотип 2 Ц] Серотип 3

J Серотип 1 I Серотип 2 ] Серотип 3

шт.№: 267,305,475

Рисунок 2.

Среднегеометрические значения количественного содержания агглюти-ногенов в посевных сериях, коклюшной вакцине и иммуноген-ной активности (МЕ/мл) в АКДС вакцинах по данным Сводных протоколов коклюшной вакцины предприятия ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова за 2000 г. (верхний рисунок), за 2005 г. (средний), за 2010 г. (нижний).

Лервая пара столбцов-1-ый столбец - уровень агглютиногена 1 в посев-юй серии; 2-ой столбец - уровень [гглютиногена 1 в коклюшной вак-шне, приготовленной из этой серии; ггорая пара - 1-ый столбец - уро-юнь агглютиногена 2 в посевной сети; 2-ой столбец - уровень агглю-•иногена 2 в коклюшной вакцине, григотовленной из этой серии; ретья пара - 1-ый столбец - уровень [гглютиногена 3 в посевной серии; !-ой столбец - уровень агглютино-ена 3 в коклюшной вакцине, приготовленной из этой серии; 7-ой столбец - иммуногенная активность коклюшной вакцины; цифры под столбцами - производственные штаммы, вошедшие в посевные серии и, соответственно, в вакцину.

I §

305, 38, 38, 38,

262. 262. 262, 262. 262,

475. 475 475. 475 312.

703 305 475

I I Ссротип I Щ Ссротип 2 13 Ссротип 3

I I Ссротип I 3 Ссротип 2 I] Ссротип 3

38. 267,

ШТ.ЛЬ; 475

38Г 267, 305. 475

267. 305. 475

■ 16 ^

2 Щ

14 2

12 1 2 а

ю м

Рисунок 3.

Среднегеометрические значения количественного содержания агглю-тиногенов в посевных сериях, коклюшной вакцине и иммуноген-ной активности (МЕ/мл) в АКДС вакцинах по данным Сводных протоколов филиала ФГУП «НПО «Микроген» в г. Уфа, за 2000 г. (верхний рисунок), 2005 г. (средний) и 2009-2010 гг. (нижний). Первая пара-1-ый столбец - уровень агглютиногена 1 в посевной серии; 2-ой столбец - уровень агглютиногена 1 в коклюшной вакцине, приготовленной из этой серии; вторая пара-1-ый столбец - уровень агглютиногена 2 в посевной серии; 2-ой столбец - уровень агглютиногена 2 в коклюшной вакцине, приготовленной из этой серии; третья пара - 1-ый столбец - уровень агглютиногена 3 в посевной серии;

2-ой столбец - уровень агглютиногена 3 в коклюшной вакцине, приготовленной из этой серии; 7-ой столбец - иммуногенная активность коклюшной вакцины; цифры под столбцами - производственные штаммы, вошедшие в посевные серии и, соответственно, в вакцину.

бильности производства: смена поставщиков реагентов, компонентов питательных сред, недостаточное качество лабораторных животных, сложности с кадровым составом. К 2010 г., после выполнения сделанных комиссией замечаний и использования «улучшенных» штаммов, предприятию удалось устранить негативные причины, что привело к -стабилизации технологического процесса. Уровень всех агглютиногенов в коклюшной суспензии стал выявляться типоспецифическими сыворотками в разведении = 1:20001:2600. Стабильно высокой стали показатели иммуногенной активности.

ЗАО «НПК «Комбиотех», выпускающий Бубо-Кок вакцину с 2003 г., жестко соблюдал требования к качеству закупаемой коклюшной суспензии. Для производства Бубо-Кок использовали коклюшную вакцину с показателями количественного содержания агглютиногенов 1:1280 и более. По данным Сводных протоколов за 2008-2010 гг. показатель содержания агглютиногена 1 в используемых коклюшных суспензиях составлял » 1:10000; агглютиногена 3 - от 1:2500 до 1:8000, а агглютиногена 2 - от 1:1280 до 1:2500. При использовании указанных суспензий иммуногенная активность коклюшного компонента Бубо-Кок вакцины колебалась на высоком уровне - от 11 до 18.5 МЕ/мл (рис. 4).

Рисунок 4

Среднегеометрические значения количественного содержания агглютиногенов в посевных сериях, коклюшной вакцине и иммуногенная активность вакцины Бубо-Кок по данным предприятия «НПК «Комбиотех», Москва (2008-2010 гг.). шт.№: 267, 305, 475

Первая пара-1-ый столбец - уровень агглютиногена I в посевной серии; 2-ой столбец - уровень агглютиногена 1 в коклюшной вакцине, приготовленной из этой серии;

вторая пара - 1-ый столбец - уровень агглютиногена 2 в посевной серии; 2-ой столбец - уровень агглютиногена 2 в коклюшной вакцине, приготовленной из этой серии; третья пара - 1-ый столбец - уровень агглютиногена 3 в посевной серии;

2-ой столбец - уровень агглютиногена 3 в коклюшной вакцине, приготовленной из этой серии;

I I Серотип 1 Ш Серотип 2 Ш Серотип 3

сер.1-5 сер.6-10 сер.11-15 сер.16-20 сер.21-24

7-ой столбец - иммуногенная активность коклюшной вакцины; цифры под столбцами - производственные штаммы, вошедшие в посевные серии и, соответственно, в вакцину.

Таким образом, подтверждена взаимосвязь между уровнем агглютиногенов 1, 2, 3 в посевной серии и иммуногенной активностью коклюшного компонента АКДС вакцины. Установлена информативность показателя количественного содержания агглютиногенов 1, 2 и 3 в качестве маркера для прогнозирования иммуногенной активности коклюшной вакцины. Посредством использования посевных серий с высоким содержанием агглютиногенов удалось повысить качество и стабильность готовой продукции на протяжении регламентированного срока годности (1,5 г.). На способ повышения иммуногенной активности коклюшной вакцины получен патент № 2540014.

Эффективность иммунопрофилактики зависит не только от качества препарата при выпуске, но и сохранения этого качества на протяжении всего срока годности. В рамках надзора было предусмотрено слежение на всех этапах технологического процесса за качеством и стабильностью АКДС и Бубо-Кок вакцин, выпускаемых разными производителями. Исследование проводили по данным сертификационного контроля препарата и материалам, представляемым предприятиями. Анализ материалов оценки стабильности АКДС и Бубо-Кок и результаты проверки серий в ГИСК им. Л.А. Тарасевича показали, что коклюшный компонент комбинированных АКДС и Бубо-Кок вакцин, изготовленный из штаммов, экспрессирующих уровень агглютиногенов, выявляемый при разведении типоспецифических сывороток 1:1280 и выше, сохранял иммуногенную активность на протяжении срока годности (1,5 г.). В процессе исследований установлено, что использование штаммов с высоким количественным содержанием агглютиногенов (выявляемым типоспецифическими сыворотками в разведении 1:3200 и выше), позволяет повысить стабильность иммуногенной активности ЦКВ на протяжении срока, превышающего регламентированный (1,5 г.).

В таблицах 15 и 16 представлены данные по стабильности ЦКВ, полученные на предприятии ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова и в ГИСК им. Л.А. Тарасевича Несмотря на значительный срок, прошедший с даты изготовления АКДС вакцины - 2 г. 4 мес - 3 г. 9 мес., - коклюшный компонент по иммуногенной активности соответствовал требованиям ВОЗ.

Результаты оценки стабильности всех компонентов 10 серий вакцины Бубо-Кок, полученные от ЗАО «НПК «Комбиотех», 8 серий АКДС, полученные от ОАО «Биомед»

им. И.И. Мечникова, и 10 серий Бубо-Кок, отконтролированных в ГИСК им. Л.А. Тарасовича, свидетельствуют о сохранении иммуногенной активности АКДС и Бубо-Кок вакцин на протяжении от 2,5 до 3,5 лет (срок наблюдения). На основании этих данных срок годности вакцин АКДС и Бубо-Кок, выпускаемых ОАО «Биомед» им. И.И. Мечни-

Таблица 15. Пммуногенная активность коклюшного компонента АКДС

вакцины. Данные ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова

№ серии АКДС Иммуногенная активность при выпуске, МЕ/мл Иммуногенная активность (МЕ/мл) на конце срока годности (через 1,5 г.) Иммуногенная активность (МЕ/мл)/через .... мес после даты изготовления

50 12,4 13,0 10,0 / Згода 7 мес

55 9,9 10,1 8,4 / 3 года 5 мес

60 12,4 12,0 9,9 / 3 года 6 мес

65 8,4 9,5 8,6 / 3 года 7 мес

70 9,9 9.4 9,0 / 3 года 9 мес

125 11,6 - 8.8 / 2 года 9 мес

130 11,0 - 9,5 / 2 года 6 мес

135 9,0 - 8,8 / 2 года 4 мес

Таблица 16 —Пммуногенная активность коклюшного компонента в вакцине

Бубо-Кок. Данные ГИСК им. Л.А. Тарасовича

№ серии Иммуногенная активность на дату выпуска, МЕ/мл Иммуногенная активность (МЕ/мл) / срок, прошедший с даты изготовления

010/2 21,5 24,0 / 2 года 6 мес

015/2 10,7 11,8 / 2 года 6 мес

016/2 9,3 11,9 / 2 года 6 мес

019/1 12,2 13,4 / 2 года 7 мес

020/1 9,4 14,9 / 2 года 7 мес

021/1 11,4 10,0 / 2 года 7 мес

022/2 12,7 14,0 / 2 года 7 мес

023/1 12,7 11,8/2 года 7 мес

025/1 14,3 17,3 /2 года 6 мес

027/2 14,3 14,0 / 2 года 6 мес

кова и ЗАО «НПК «Комбиотех», был увеличен до 2,5 лет (вместо ранее установленных 1,5 лет).

Для дополнительной характеристики качества отечественной коклюшной вакцины было проведено сравнительное исследование гуморального иммунного ответа, формируемого у мышей, в ответ на введение АКДС, Бубо-Кок и зарубежных комбинирован-

ных вакцин, содержащих БКВ. Впервые в лабораторных испытаниях методом ИФА с использованием стандартов и антигенов фирм-производителей БКВ показано, что АКДС и Бубо-Кок вакцины вызывают выработку антител к ведущим протективным антигенам коклюшных бактерий - коклюшному токсину, филаментозному гемагглютини-ну и пертактину на таком же уровне, что и БКВ. Все серии ЦКВ, входящие в состав АКДС и Бубо-Кок вакцин, соответствовали требованиям, разработанным для БКВ зарубежными фирмами (табл. 17). Максимальный уровень антител при введении отечествен-Таблица 17. Иммунный ответ на введение отечественных целыюклеточных вакцин и зарубежных бесклеточных вакцин, рассчитанный в относительных единицах но отношению к стандартным образцам Пеитаксима и Инфанрикса

Препарат По отношению к стандартам Пен-таксима По отношению к стандартам Инфанрикса

КА ФГА КА ФГА ПРИ

Критерии фирмы <3,39 <3,39 >0,54 >0,48 >0,31

АКДС сер. 5, (15 сут) * 1,92 3,8 0,21 0,27 0,89

АКДС сер. 5, (30 сут) 2,60 1,24 0,39 0,42 0,93

АКДС сер. 10, (15 сут) 3,31 2,50

АКДС сер. 10, (30 сут) 1,15 1,02

АКДС сер. 145, (19 сут) 1,83 5,09 0,39 0,36 1,13

АКДС сер. 150, (19 сут) 0,46 0,98 0,95

АКДС сер. 140, (28 сут) 1,17 1,77 0,59 0,64 2,46

АКДС сер. 155, (28 сут) 3,15 1,15 0,76 0,70 2,76

Бубо-Кок с. 10/2, (28 сут) ** 1,28 1,34 0,35 1,65 1,02

Бубо-Кок с. 24/2, (28 сут) ** 1,43 0,39

Инфанрикс сер. 18031208 (2830 сут) 1,22 0,69 0,63

Инфанрикс-пента сер. АС21В093 В А -«-- 3,15 1,25 0,95 0,76 0,59

Инфанрикс-гекса сер. А21 СА 261В-«-- 2,49 2,16 0,78 1,36 1,38

Пентаксим, сер. Ъ 2011-1 --«-- 1,98 1,52 0,54 0,79

Пентаксим, сер. Ъ 2007-2 --«-- 2,71 1,15 0,55 0.75

Тетраксим , сер. ОО 388-1 --«-- 0,93 1,02

Примечание: * - в скобках указан срок забора крови; ** - забор крови у выживших после заражения мышей.

ных вакцин обнаружен в сыворотках крови мышей на 28-30 сутки, то есть в срок, оптимальный для бесклеточных коклюшных вакцин. Из научной литературы известно, что при коклюшной инфекции основную защитную роль играет клеточная форма иммунитета ЦКВ, также как и естественная инфекция, вызывает развитие клеточного иммуните-

та, что обеспечивает более длительную защиту детей от коклюшной инфекции по сравнению с БКВ.

Проведенное сравнительное исследование установило, что отечественные вакцины АКДС и Бубо-Кок, содержащие, по сравнению с зарубежными аналогами, в дозе для человека меньшее количество коклюшных бактерий, обладают требуемой ВОЗ иммуно-генной активностью, низкой остаточной токсичностью, способностью формировать клеточный и гуморальный иммунитет к основным протективным коклюшным антигенам.

Таким образом, применение разработанного нами метода подготовки посевных серий, основанного на отборе колоний В. pertussis, экспрессирующих агглютиногены, выявляемые типоспецифическими сыворотками в разведении не менее 1:3200, использование полученных посевных серий для изготовления коклюшной вакцины, введение в технологический процесс дополнительного контроля коклюшной суспензии на содержание агглютиногенов позволило повысить иммуногенную активность и стабильность коклюшного компонента АКДС и Бубо-Кок вакцин. Срок годности указанных вакцин увеличен с 1,5 до 2,5 лет.

2.3. Оценка стабильности производства с помощью метода статистического управления технологическим процессом

Технология производства ЦКВ, как и других иммунобиологических препаратов, характеризуется вариабельностью, обусловленной как особенностью самого биологического агента, так и особенностью биотехнологических процессов изготовления вакцины. Учесть вариабельность процесса, оценить ее возможное воздействие на качество препарата и тут же принять меры по предотвращению этого влияния возможно только при использовании статистических методов управления производством.

В связи с этим актуальным было изучить/апробировать возможность применения адаптированного нами метода статистического управления процессом производства для оценки стабильности технологического процесса изготовления коклюшной вакцины. Для анализа был использован главный показатель качества коклюшной вакцины - им-муногенная активность. По данным «Сводных протоколов производства и контроля АКДС вакцины» двух предприятий - ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова и уфимского предприятия ФГУП «НПО «Микроген» за период 2002 - 2008 гг. была проведена ретроспективная оценка стабильности технологического процесса.

Проведенный анализ данных предприятия ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова свидетельствует о высоком качестве коклюшного компонента АКДС вакцин. Средняя арифметическая величина показателя иммуногенной активности была высокая и составляла в разные годы от 10,6 до 12, МЕ/мл. По данным за 2002 г. технологический процесс протекал благополучно. Об этом говорит отсутствие на Х-картах трендов (особого расположения точек, обусловленное неслучайными (особыми) причинами) (рис. 5). Хотя средняя арифметическая величина показателя иммуногенной активности достаточно высокая (11,3 МЕ), имеются явные угрожающие тенденции: это 8 точек подряд по одну сторону от центральной линии, не хватает всего одной точки до критерия для особых причин 2 (9 точек подряд по одну сторону), который свидетельствует о выходе процесса из состояния стабильности. Кроме того, одна точка вышла за «предупреждающую» границу +2 б. 52 % выпущенных серий по иммуногенной активности находились ниже средней арифметической величины, а 48 % - выше; из них 24,1 % серий выпущены с иммуногенной активностью от 13,1 до 16,5 МЕ.

Наметившаяся в 2002 г. неблагополучная тенденция выразилась в появлении в 2003 г. определенных трендов. Так, имели место 15 последовательных точек в зоне С (± 1б) и 6 убывающих точек подряд (тренды отмечены овальными линиями). В соответствии с критериями для особых причин 7 и 3, технологический процесс в тот промежуток времени был статистически неуправляемым. Средняя арифметическая величина показателя иммуногенной активности понизилась до 10,6 МЕ; 62 % выпущенных серий находились ниже средней арифметической величины иммуногенной активности, приближаясь к 8 МЕ. В 2004-2005 гг. значения показателей активности не выходили за пределы статистических границ, тренды выявлены не были, но имелись предостережения, на которые необходимо было бы обратить внимание. Овальными линиями выделены расположения точек, в которых не хватает всего по одной точке до критерия, говорящего об отсутствии стабильного процесса В 2006-2007 гг. процесс остается статистически управляемым, но также имеются предостережения, на которые необходимо было обратить внимание: это приближение к верхней контроль ной границе; приближение к критерию 3-5 возрастающих точек подряд и 5 убывающих точек подряд; приближение к критерию 2-7 точек подряд по одну сторону от центральной линии. Наблюдается увеличение размаха показателя иммуногенной активности между выпущенными сериями: 8,4-17,3 в 2005 г., 8,2-19,7 в 2006-2007 гг. Неучтенные предостерегающие сигналы, отме-

ценные в 2004-авг.2007 гг., привели к тому, что в определенный период времени в конце 2007-2008 гг. имел место статистически неуправляемый технологический процесс. На него указывает критерий 2: 9 точек подряд по одну сторону от центральной ли-

Рисунок 5. Х-карты показателей иммуногенной активности коклюшной вакцины за 2002 - 2008 гг. на предприятии ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова. Ось абсцисс - порядковый номер серии: ось ординат - иммуногенная активность МЕ/мл

нии. Средняя арифметическая показателя иммуногенной активности снизилась до 11,4 МЕ, но 29.1 % был выпущен с активностью от 13.1 до 17,8 МЕ. Таким образом, по дан-

ным семи лет технологический процесс протекал как стабильный (статистически управляемый) непрерывно в течение пяти лет. Ретроспективный анализ показал, что в неблагополучный период имелись объективные причины, повлиявшие на условия технологического процесса: смена производителей и поставщиков сырья и материалов.

Средняя арифметическая величина показателя иммуногенной активности на уфимском предприятии ФГУГТ «НПО «Микроген» была ниже, чем на ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова и составляла в разные годы от 9,6 до 10,9 МЕ/мл. Анализируя течение технологического процесса на уфимском предприятии, можно отметить, что на картах в 2002 г. отсутствуют тренды: это характеризует технологический процесс как стабильный. Но имеются предостерегающие сигналы: две точки вплотную подошли к предупреждающей границе +2б (рис. 6). 58 % выпущенных серий по иммуногенной активности находились ниже средней арифметической величины. В 2003 I". технологический процесс характеризовался как нестабильный (статистически неуправляемый). Выявлен тренд, соответствующий критерию 2 и показатели иммуногенной активности двух серий (точек) препарата вышли за «предупреждающую» границу ± 2б. Качество вакцины значительно понизилось: 75 % серий выпущены с активностью ниже среднеарифметического значения 9,9 МЕ/мл. Анализ данных за период 2004 - 2006 гг. свидетельствует, что за этот промежуток времени технологический процесс не всегда проходил стабильно. Так, в 2004-март 2005 гг. выявлен критерий для особых причин 1 (одна точка вне зоны Зб). Сотрудников производства должны насторожить большое количество попеременно возрастающих и убывающих точек (приближение к критерию 4) и значительный разброс между двумя значениями показателя - 9,5 и 18,5 МЕ/мл. В апреле 2005-2006 гг. имели место критерии 1 и 2 (одна точка вне зоны Зб и 9 точек подряд по одну сторону от центральной линии).

Из пяти анализируемых лет на предприятии ФГУП «НПО «Микроген» в г. Уфа производство коклюшной вакцины было стабильным только один год. Нестабильность технологического процесса означает, что в определенный период времени возрастал риск возникновения внутрипроизводственного брака. Ряд серий выпущено с нижним лимитом иммуногенной активности (данные за 2003-2005 гг.). В процессе инспекционного обследования выявлено, что на предприятии на участке коклюшной вакцины за этот период произошла смена персонала; из-за отсутствия диализных мешков с определенным размером пор, используемых на операции диализа дрожжей, имелась проблема изготов-

ления качественной питательной среды КУА, проблема с качеством лабораторных животных (мышей), используемых для контроля качества препарата.

2002 г. 2003 г.

ЗООФмарг 2005 г. апрель 2005-20М г.

Рисунок 6. Х-карты показателей иммуногенной активности коклюшной вакцины за 2002 — 2006 гг. на предприятии «Иммунопрепарат». Ось абсцисс - порядковый номер серии; ось ординат - иммуногенная активность МЕ/мл

Метод статистического управления производством внедрен на всех предприятиях, изготавливающих коклюшную вакцину. Использование статистических методов управления процессом показало, что с помощью карт Шухарта производитель в реальном времени сможет выявить внеплановую ситуацию (появление на графике трендов), выяснить причины отрицательного влияния на процесс и устранить их.

Таким образом, разработанный метод селективной подготовки посевных серий В. pertussis, установленные критерии количественного содержания агглютиногенов в посевных сериях и коклюшной суспензии, прогнозирующие регламентированную и высо-

кую иммуногенную активность вакцины, введение в технологический процесс стадии определения содержания агглютиногенов в коклюшной вакцине до ее сведения с дифтерийным и столбнячным анатоксинами, проведение ежегодного контроля посевных серий позволили усовершенствовать систему надзора за производством коклюшного компонента комбинированных вакцин. Внедрение этапов усовершенствования дало возможность решить важную проблему вакцинопрофилактики - повысить качество и стабильность коклюшного компонента, в результате чего увеличен срок годности АКДС и Бубо-Кок вакцин с 1,5 до 2,5 лет. На способ повышения иммуногенной активности коклюшного компонента получен патент № 2540014.

Внедрение адаптированного метода статистического управления технологическим процессом с помощью карт Шухарта позволит предприятиям повысить стабильность процесса изготовления коклюшной вакцины путем постоянного статистического анализа результатов внутрипроизводственного контроля ее качества и своевременного принятия мер в случае обнаружения нерегламентированных отклонений.

Целесообразно продолжить дальнейшие исследования по надзору за качеством и, особенно, стабильностью коклюшного компонента, для увеличения срока годности АКДС вакцин, выпускаемых всеми предприятиями страны.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствован надзор за иммунобиологическими свойствами производственных штаммов В. pertussis, посевных серий, качеством коклюшного компонента отечественных комбинированных вакцин, стабильностью технологического процесса его изготовления, что позволяет своевременно выявить и устранить нерегламентированные отклонения, влияющие на качество коклюшного компонента.

2. Доказана важность показателя количественного содержания агглютиногенов в посевных сериях и коклюшной суспензии для характеристики состояния иммуногенных свойств посевных серий В. pertussis и коклюшного компонента АКДС и Бубо-Кок вакцин.

3. Разработан и внедрен метод повышения иммуногенной активности коклюшной вакцины путём селекции культуры В. pertussis по признаку количественного содержания в популяции агглютиногенов 1, 2 и 3.

4. Установлен минимальный показатель количественного содержания агглютиногенов 1, 2 и 3 в посевных сериях В. pertussis и коклюшной суспензии - 1:1280, свидетельствующий о выпуске вакцины с регламентируемой (не менее 8 ME/мл) и стабильной на протяжении 1,5 лет иммуногенной активностью.

5. Показатель количественного содержания агглютиногенов 1, 2 и 3 в посевных сериях В. pertussis и коклюшной суспензии - 1:3200 свидетельствует о выпуске вакцины с высокой (> 10 ME/мл) и стабильной на протяжении 2,5 лет иммуногенной активностью.

6. Подтверждена стабильность аттестуемых характеристик ОСО 42-28-89 «Иммуноген-ности коклюшной вакцины» на протяжении 35 лет при калибровке с тремя сериями международного стандарта коклюшной вакцины. Применение стабильного ОСО 42-2889 для калибрования иммуногенной активности отечественных коклюшных вакцин позволяет заключить, что регламентируемый метод и полученные результаты достоверны и информативны.

7. При лабораторных испытаниях показано, что отечественная цельноклеточная коклюшная вакцина стимулирует выработку антител против протективных антигенов -коклюшного токсина, пертактина, филаментозного гемагглютинина, включенных в состав зарубежных бесклеточных коклюшных вакцин. Уровень антител аналогичен уровню, формируемому бесклеточными коклюшными вакцинами. Полученные данные дополнительно характеризуют качество отечественной коклюшной вакцины.

8. Установлено, что производственные и свежевыделенные штаммы в большей или меньшей степени различаются по структуре генов коклюшного токсина (ptxA), пертактина {рт) и фимбрий fiml и firril. Использование для изготовления отечественной коклюшной вакцины рекомендованных нами штаммов В. pertussis, имеющих некоторые различия в структуре указанных генов с циркулирующими штаммами, в настоящее время не отразилось на формировании адекватного поствакцинального иммунитета, о чем свидетельствуют данные Роспотребнадзора по заболеваемости коклюшем за последние годы.

9. Адаптирован и внедрен метод статистического управления процессом изготовления коклюшной вакцины с использованием контрольных карт Шухарта, позволяющий оценивать стабильность технологического процесса Применение его позволяет своевременно обнаружить возникшие нарушения технологического процесса, влияющие на качество коклюшной вакцины, и принять меры для их устранения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Бажанова, И.Г. Исследование безвредности и протективных свойств новой бесклеточной коклюшной вакцины в опытах на животных / И.Г. Бажанова, Т.Н. Ремова, М.Н. Озерецковская, Е.И. Шмелева, Л.У. Мерцалова, Е.Е. Сухинова, Р.П. Чупринина, В.Ф. Булк, H.A. Алексеева, Н.С. Захарова // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1994. - № 1. - С. 40-45.

2. Фельдблюм, И.В. Оценка реактогенности и иммуногенности новой отечественной комбинированной вакцины Бубо-Кок при иммунизации детей против дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В / И.В. Фельдблюм, A.M. Николаева, A.B. Казьянин, В.Н. Борисова, В.А. Мельников, Р.П. Чупринина, О.В. Перелыгина, Н.В. Шалунова, И.А. Алексеева, O.A. Коноплева // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2004,-№5.-С. 58-62.

3. Алексеева, И.А. Оценка стабильности национального стандарта коклюшной вакцины ОСО-3 / И.А. Алексеева, Р.П. Чупринина // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2004. — № 5. - С. 68-71.

4. Чупринина, Р.П. Профилактика коклюша: разработка и применение бесклеточной коклюшной вакцины / Р.П. Чупринина, И.А. Алексеева, H.A. Озерецковский / Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии—2006.-№ 1.-С. 99-105.

5. Казьянин, A.B. О возможности использования комбинированной вакцины Бубо-Кок в рамках национального календаря профилактических прививок/ A.B. Казьянин, И.В. Фельдблюм, O.A. Коноплева, A.M. Николаева, O.A. Перминова, В.Н. Борисова, И.А. Алексеева//Эпидемиология и Вакцинопрофилактика.-2004. - № 5(18). — С. 11-13.

6. Алексеева, И.А. Оценка стабильности технологического процесса с помощью карт Шухарта на примере анализа информации о иммуногенной активности коклюшного компонента АКДС вакцины / И.А. Алексеева, Р.П. Чупринина, Д.С. Давыдов // Журн. микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. — 2009. - № 6. — С. 70-75.

7. Чупринина, Р.П. К вопросу о преимуществах и недостатках цельноклеточных и бесклеточных коклюшных вакцин / Р.П. Чупринина, И.А. Алексеева // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. - 2012. - № 2 (63). - С. 62-69.

8. Алексеева, И.А. Сравнительный анализ безопасности и эффективности отечественных и зарубежных комплексных вакцин, содержащих цельноклеточную коклюшную

вакцину / H.A. Алексеева, Р.П. Чупринина, В.Н. Борисова// Эпидемиология и Вакци-нопрофилактика. - 2012. -№ 3 (64). - С. 48-54.

9. Алексеева, ILA. Молекулярно-генетическая характеристика производственных штаммов коклюшных бактерий / ILA. Алексеева, Р.П. Чупринина, И.В. Борисевич, H.H. Курова, Г.Я. Ценева, Ю.В. Останкова, A.B. Семенов // Эпидемиология и Вакцино-профилактика. - 2013. - № 3 (70). - С. 63-70.

10. Алексеева, II.A. Сравнительная характеристика отечественных стандартных образцов иммуногенной активности коклюшной вакцины / ILA. Алексеева, Р.П. Чупринина // Стандартные образцы. - 2013. - № 3. - С. 31-36.

11. Чупринина, Р.П. Оценка иммуногенной активности цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин в ИФА / Р.П. Чупринина, ILA. Алексеева, А.П. Тарасов, В.Н. Борисова, И.В. Фельдблюм, М.В. Абрамцева// Эпидемиология и Вакцино-профилактика. - 2013. - № 5 (72). - С. 60-65.

12. Чупринина, Р.П. Возможность повышения иммуногенной активности и стабильности цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин / Р.П. Чупринина, H.A. Алексеева // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. - 2014. - № 2 (75). -С. 89-95.

13. Чупринина Р.П. Иммунопрофилактика и заболеваемость коклюшем. Настоящее и будущее / Р.П. Чупринина, H.A. Озерецковский, H.A. Алексеева // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. - 2014. - № 6 (79). - С. 89-99.

Публикации в других изданиях

14. Чупринина Р.П. Способ получения коклюшного компонента комплексных вакцин / Р.П. Чупринина, ILA. Алексеева // Бюллетень «Изобретения. Полезные модели». 2015. -№ 3 (27.01.15). - патент № 2540014.

15. Алексеева, H.A. О возможности изменения иммуногенных свойств коклюшного микроба при облучении электромагнитными волнами / И.А. Алексеева, Р.П. Чупринина, Ю.К. Алексеев, A.B. Козарь, В.И. Лобышев, В.А., Твердислов, О.В. Фадейкина// Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики». - Пермь, 1993 г. - С. 21.

16. Чупринина, Р.П. Препараты для диагностики коклюша / Р.П. Чупринина, И.А. Алексеева // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Состояние

и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики»-Пермь, 1993 г.-С. 131-133.

17. Алексеева, H.A. Исследование воздействия миллиметрового электромагнитного излучения на иммуногенные свойства коклюшного микроба / И.А. Алексеева, Р.П. Чупринина, Ю.К. Алексеев, A.B. Козарь, В.И. Лобышев, В.А. Твердислов, О.В. Фадейкина // Сборник докладов Всероссийской школы-семинара «Физика и применение микроволн (миллиметровые и субмиллиметровые волны)» - Москва, МГУ, 1993 г. - С. 17-23.

18. Алексеева, H.A. Изучение влияния электромагнитных волн мм диапазона на иммуногенные свойства коклюшного микроба / Алексеева И.А., Чупринина Р.П., Алексеев Ю.К., Козарь A.B., Лобышев В.И., Фадейкина О.В. // Сборник, докладов 10-ого Российского симпозиума с международным участием «Мм волны в медицине и биологии». -Москва, 1995 г. - С. 97-98.

19. Чупринина, Р.П. Бесклеточная коклюшная вакцина. Новый этап вакцинопрофилак-тики коклюша / Р.П. Чупринина, H.A. Озерецковский, И.А. Алексеева // Биопрепараты. - 2001.-№ 3. - С. 19-22.

20. Казьянин, A.B. Стратегия использования новых отечественных комбинированных вакцин для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В (Бубо-М и Бубо-Кок) в рамках национального календаря профилактических прививок / A.B. Казьянин, О.В. Коноплева, H.A. Алексеева // Материалы II-ого конгресса педиатров-инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей». — Санкт-Петербург, 2003 г. - С. 76-77.

21. Чупринина, Р.П. Новые поколения вакцин для вакцинопрофилактики коклюша / Чупринина Р.П., Алексеева И.А. // Материалы IX Конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии». — Москва, 2004 г. - С. 7-11.

22. Чупринина, Р.П. К вопросу о качестве коклюшного компонента АКДС вакцины / Р.П. Чупринина, И.А. Алексеева // Сборник тезисов Первой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций». — Москва, 2004. - С. 77.

23. Перелыгина, О.В. Сравнительная характеристика отечественных и зарубежных вакцин для профилактики коклюша, дифтерии и столбняка / О.В. Перелыгина, Р.П. Чупринина, H.A. Алексеева // Сборник тезисов Всероссийской научно-практической конфе-

ренции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - Москва, 2006. - С. 76.

24. Чупринина, Р.П. Сравнительная характеристика остаточной токсичности коклюшного компонента отечественных и зарубежных ассоциированных вакцин / Р.П. Чупринина, II.A. Алексеева, H.A. Озерецковский, С.Г. Алексина // Сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - Москва, 2006. - С. 104.

25. Чупринина, Р.П. Сравнительная характеристика отечественных и зарубежных вакцин для профилактики коклюша, дифтерии и столбняка /Р.П. Чупринина, О.В. Перелы-гина, H.A. Алексеева, H.A. Озерецковский//Биопрепараты. -2006. - № 4 (24). - С. 27-30.

26. Фельдблюм, И.В. Использование комбинированной вакцины против коклюша, дифтерии, столбняка и гепатита В, бестиомерсальной вакцины гепатита В и иммуноглобулина «Антигеп» в педиатрической практике / И.В. Фельдблюм, A.B. Казьянин, O.A. Ко-ноплева, H.A. Алексеева, Н.И. Маркович // Методические рекомендации. - Пермь,

2007.

27. Чупринина, Р.П. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий / Р.П. Чупринина, H.A. Алексеева // Методические указания МУК 4.2.2317-08. - Москва, 2009.

28. Алексеева, H.A. Сравнительная характеристика стабильности технологического процесса АКДС вакцины с помощью карт Шухарта / H.A. Алексеева, Р.П. Чупринина // Сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология

2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». — Москва, 2008. — С. 15.

29. Чупринина, Р.П. К вопросу оценки иммуногенной активности коклюшного компонента (корпускулярного и бесклеточного) в комплексных препаратах / Р.П. Чупринина, H.A. Алексеева // Сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» - Москва, 2008. - С. 123.

30. Алексеева, H.A. Оценка стабильности технологического процесса производства медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) с помощью контрольных карт

Шухарта / И.А. Алексеева, Р.П. Чупришша // Методические рекомендации. - Москва, 2011.

31. Родионова, O.A. Определение мутности коклюшной суспензии спектрофотометри-ческим методом / Родионова O.A., Чупринина Р.П., Алексеева U.A. // Сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» - Москва, 2010. - С. 100.

32. Алексеева, H.A. Новый стандартный образец коклюшной вакцины / H.A. Алексеева, Р.П Чупринина, А.М Николаева, В.Д. Семенова // Сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» - Москва, 2010. - С. 18.

33. Алексеева, И.А. Система надзора за качеством коклюшного компонента комплексных вакцин / И.А. Алексеева, Р.П. Чупринина, C.B. Кузнецова // Сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» - Москва, 2010. - С. 19.

34. Чупринина, Р.П. Оценка специфической активности корпускулярного и бесклеточного коклюшного компонентов комбинированных вакцин / Р.П. Чупринина, И.А. Алексеева, А.П. Тарасов, М.В. Абрамцева // Сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» - Москва, 2010.-С. 123.

35. Алексеева, И.А. Система надзора за качеством коклюшного компонента комплексных вакцин / И.А. Алексеева, Р.П. Чупринина, C.B. Кузнецова // Биопрепараты. - 2010. -№3(39). -С. 38.

36. Чупринина, Р.П. Исследование бактериальных вакцин и анатоксинов / Р.П. Чупринина, О.В. Перелыгина, И.А. Алексеева // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты). Ч. 2. - Москва, 2013. - С. 134-139.

37. Чупринина, Р.П. Доклинические исследования коклюшных вакцин и анатоксинов / Р.П. Чупринина, И.А. Алексеева, О.В. Перелыгина // Руководство по проведению

доклинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты). Ч. 2. - Москва, 2013. - С.. 444-456.

38. Алексеева, И.А. Гармонизация требований к АКДС вакцине в проекте ФС Вакцина коклюшно-дифтерийно-столбнячная адсорбированная / И.А. Алексеева, Р.П. Чупринина, О.В. Перелыгина, А.Н. Миронов//Биопрепараты.-2013.-№ 1 (45). - С. 36-40.

39. Чупринина Р.П. Эффективность иммунопрофилактики коклюша комбинированными вакцинами, содержащими цельноклеточную или бесклеточную коклюшную вакцину / Р.П. Чупринина, И.А Алексеева, Ю.И Обухов, Е.А Соловьев // Биопрепараты. -2014.-№4(52).-С.4-13.

Список используемых сокращений

АКДС вакцина - адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина Бубо-Кок - вакцина против коклюша, дифтерии, столбняка и гепатита В адсорбированная жидкая

ЦКВ - цельноклеточная коклюшная вакцина (20 млрд бактериальных кл/мл)

КК - коклюшный компонент — ЦКВ в составе комбинированных вакцин

КС - взвесь обезвреженных коклюшных клеток, полупродукт, содержащий

60-80 млрд бактериальных кл/мл

БКВ - бесклеточная коклюшная вакцина

ПР - промышленный регламент

ФСП - Фармакопейная статья предприятия

КС - коклюшная суспензия

БЖ - среда Борде-Жангу

КУА - казеиново-угольный агар

АГГ - агглютиногены

КТ - коклюшный токсин

КаТ - коклюшный анатоксин

ПРИ - белок пертактин

ФИМ - фимбрии

ФГА - филаментозный гемагглютинин ОСО - отраслевой стандартный образец МС - международный стандарт МЕ/мл — международные единицы/мл RD (Regions of Difference) - регионы различий ЭФПП - электрофорез в пульсирующем поле ptxA - аллель гена коклюшного токсина prnl - аллель гена пертактина fim2-l fim3A - аллели гена фимбрий

БЛАГОДАРНОСТИ. Выражаю глубокую благодарность моему научному консультанту, доктору медицинских наук Чуприниной Раисе Павловне, рецензентам доктору медицинских наук, профессору Бондареву Владимиру Петровичу, доктору медицинских наук, профессору Леви Диане Тимофеевне, доктору медицинских наук Саяпиной Лидии Васильевне, а также доктору медицинских наук, профессору Борисевичу Игорю Владимировичу за конструктивное обсуждение материалов и помощь в работе. Искренне благодарю кандидата медицинских наук Перелыгину Ольгу Викторовну за предоставление возможности оформления данной диссертационной работы; кандидата медицинских наук Озерецковского Николая Аркадьевича за ценные советы в работе. Выражаю искреннюю благодарность доктору биологических наук Каратаеву Геннадию Ивановичу за ценные советы и рекомендации; кандидату медицинских наук Синяшиной Людмиле Николаевне за советы при обсуждении материалов диссертации.

Выражаю свою глубокую признательность ученому секретарю диссертационного совета доктору медицинских наук, профессору Русаковой Екатерине Владимировне и председателю проблемной комиссии Заслуженному деятелю науки, профессору Костюковой Наталье Николаевне, оппонентам Заслуженному деятелю науки, профессору Егоровой Надежде Борисовне, доктору медицинских наук, профессору Шамшевой Ольге Васильевне, доктору медицинских наук, профессору Маслову Юрию Николаевичу за помощь в подготовке материала диссертации к защите.

Информация о работе

Алексеева, Ирина Андреевна
доктора медицинских наук
Москва, 2015
ВАК 03.02.03

Автореферат

Похожие работы