Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы взаимодействия коклюшных препаратов с клетками системы мононуклеарных фагоцитов и их роль в формировании противококлюшного иммунитета

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы взаимодействия коклюшных препаратов с клетками системы мононуклеарных фагоцитов и их роль в формировании противококлюшного иммунитета"

3 Г Б ОД

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ

ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОСТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ТЮКЛВКИНА Светлана Юрьенна

МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КОКЛЮШНЫХ ПРЕПАРАТОВ С КЛЕТКАМИ СИСТЕМЫ МОНОНУКЛЕАРИЫХ ФАГОЦИТОВ И ИХ РОЛЬ В ФОРМИРОВАНИИ ПРОТИВОКОКЛЮШНОГО ИММУНИТЕТА

0j.00.07.- Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Доиу

1994

Работа выполнена в Ростовском государственном медицинском университете.

Научный руководитель: 'доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Х.П.Гамлешко,

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Э.А.Яговкин

Ведущая организация - Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской Академии наук.

на заседании диссертационного совета Д,084.53.01 при Ростовском государственном медицинском университете (34402!:, г.Ростов-на-Дону, пер.Нахичеванский, 29).'

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке,Ростовского государственного медицинского университета. .

Е.П. Москаленко.

Защита состоится

часор

Ученый секретарь

диссертационного совета

доиент

Н.й.Корганов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Специфическая профилактика коклюша продолжает оставаться актуальной проблемой (Flne.1988). Уровень заболеваемости коклюшем в последние 10-15 лет практически не имеет тенденции к снижению (М.П.Дубровина и др.,1991). Одной из основных причин сложившейся ситуации является сокращение иммунной прослойки из-sa негативного отношения педиатров и .родителей к корпускулярной коклюшной вакцине (ККВ), что обусловлено ее реактогенностью, являющейся источником тяжелейших поствакцинальных местных и общих реакций (В.П.Брагинская, А.Ф.Соколова, 1990; Turner-Lo*e. 1991). В связи с этим усовершенствование коклюшного компонента АКДС-вакцины и создание новых вакцинных коклюшных препаратов с максимально сниженными рёактогенными свойствами при сохранении высокой иммуногенности является одной из актуальных задач профилактической медицины (Н.С.Захарова и др..1992). В настоящее время во многих странах проводятся интенсивные исследования по конструированию вакцинных препаратов нового типа, содержащих отдельные антигены и токсические компоненты коклюшного микроба, лишенные Ловреждающих эффектов, но обладающие выраженными протективными свойствами (Р.П.Чупрынина и др.,1990; Р.М.Волга-рева и др., 1992; Munoz, Peacock,1989; P-reston е. а. ,1990; Savage е.а. ,1990). В этом плане большой интерес представляет коклюшный диализатный антиген (КДА), содержащий иммуногенные компоненты Bordetella pertussis (филаментозный гемагглютинин, агглютиногены, коклюшный токсин) (Е.П.Москаленко и др.,1980-1992). . Совершенствование существующих и создание новых коклюшных препаратов требует разработки надежных стандартов оценки их иммунологической'.эффективности и безопасности, что в свою очередь предполагает детальное изучение механизмов взаимодействия коклюшных препаратов с иммунокомпетентными клетками и выяснение роли такого взаимодействия в формировании резистентности к коЮюшу. Известно, что напряженность иммунитета во многом зависит от реактивности сйстемы моионуклеарных фагоцитов (СМФ), клетки которой благодаря антигенпредставляю-щей, иммуномодулирующей и эффекторной функциям участвуют во всех формах иммунного ответа, являясь одновременно участниками и регуляторами любой иммунной реакции (И.С.Фрейдлин, 1Й84;

В.А.Козлов,1980; В,М.Земсков,1989). В связи с этим представляг ет интерес изучение и характеристика коклюшных препаратов на модели клеток СМФ. Несмотря на имеющиеся в настоящее время литературные данные о модулирующем действии ККВ и КДА на перито-неальные макрофаги в процессе формирования- противококлюшного иммунитета (И.А.Андреева, 1990), расшифрованы далеко не все механизмы взаимодействия коклюшных препаратов с клетками СМФ и их роль в формировании противококлюшного иммунитета и иммунопатологических реакций, обусловливающих поствакцинальные осложнения. Отсутствуют, в частности, данные о дифференцировке и перераспределении клеток CMS в процессе формирования противококлюшного иммунитета. Ограничены и противоречивы сведения об активации макрофагов, предшествующей усилению их киллерной способности и об иммунорегуляторной функции этих клеток. Отсутствуют данные о возможном цитотоксическом действии коклюшных препаратов на клетки CMS, а также по ряду других вопросов. Кроме того,ранее не проводился корреляционный анализ взаимо-• связи между способностью различных коклюшных препаратов модулировать свойства клеток CMS и другими особенностями этих препаратов. Вместе с тем решение перечисленных вопросов позволит выяснить значение отдельных механизмов взаимодействия коклюшных препаратов с клетками CMS .в "формировании противококлюшного иммунитета и даст возможность разработать адекватные экспериментальные модели с использованием- культуры макрофагов для оценки их иммунологической эффективности и безопасности.

Цель настоящего исследования - изучение механизмов взаимодействия коклюшных, препаратов с клетками CMS In vitro и In vivo, выяснение роли отдельных механизмов такого взаимодействия в формировании противококлюшного иммунитета и иммунопатологических процессов, а также создание адекватных экспериментальных моделей для ускоренной оценки иммунологической эффективности и безопасности вакцинных коклюшных препаратов.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Получить очищенный препарат КДА с высокой протективной активностью и изучить его биологические свойства в сравнении с исходным КДА и ККВ.

2. Определить влияние исследуемых коклюшных препаратов на макрофагальную трансформацию моноцитов периферической крови в процессе формирования противококлюшного иммунитета.

3. Исследовать динамику изменения композиции субполулнций перитонеальных макрофагов мышей, иммунизированных коклюшными препаратами.

4. Определить влияние ютслюшных препаратов на активность 5'-нуклеотидазы и с:сид:пивных процессов в макрофагах.

5. Изучить способность коклюшных препаратов индуцировать синтез ФНО-а и фактора, активирующего хемотаксис нейтрофилов.

6. Выявить возможность КДА и фракции 2 КДА вызывать реакцию исчезновения макрофагов и исследовать ее дк!:;лмку при формировании противококлюшного иммунитета.

7. Определить цитотоксическое действии коклюшных ¡¡ропара тов на первичную культуру перитонеальных макрофагов и перепиваемую моноцитоподоОную линию клеток человека и 937.

8. Провести корреляционный анализ взаимозависимости между изменениями свойств клеток С'МФ под влиянием когак.чвных препаратов и способностью этих препаратов вызывать формирование противококлюшного иммунитета и индуцировать иммунопатологические реакции. •

9. Разработать экспериментальные модели с использованием клеток СМФ для характеристики иммунологической эффективности и безопасности коклюшных препаратов.

1) а у ч н а я новизна:

- Получеца фракция кдд, в которой концентрируются биологически активные компоненты исходного препарата, обеспечивающие ее высокую проективную активность.

- Установлена способность коклюшных препаратов модулировать показатель макрофагальной трансформации моноцит-.ь периферической крови, активность Ь'-нуклоотидазы и оксш;ати$ных процессов в макрофагах. Ьишяона динамика этих показателей н процессе формирования протипокооюшного иммунитета ь зависимости от характера и дозы препаратов.

• Показано, что иммунизация коклюшными препаратами вквд-■ вает перераспределение суСпо.т/ляций перитонеальни/. макрофагов.

интенсивность которого коррелирует с резистентностью экспериментальных животных к коклюшу.

- Выявлена способность коклюшных препаратов индуцировать синтез и секрецию ФНО-а и фактора, активирующего хемотаксис нейтрофилов, и зависимость этих процессов от характера и дозы препарата.

- Показана динамика реакции исчезновения макрофагов в процессе формирования противококлюшного иммунитета и ее корреляция с протективной активностью коклюшных препаратов.

- Обнаружено цитотоксичёское действие ККВ на первичную культуру перитонеальных макрофагов и перевиваемую моноцитопо-добную линию клеток человека U 937 in vitro, носящее дозоза-висимый характер и коррелирующее с токсическими свойствами ККВ, выявляемыми в тестах in vivo. Показано отсутствие цито-токсического эффекта на клетки CNffi у КДА и фр.2 КДА.

Теоретическая и практическая значимость работы.:

Установлено значение отдельных механизмов взаимодействия коклюшных препаратов с клетками СМФ в формировании противококлюшного иммдаитета и в развитии иммунопатологических процессов поствакцинального периода. '■

Выявлен однотипный характер влияния коклюшных препаратов, на те свойства макрофагов, модуляция которых опосредует их участие в формировании резистентности к возбудителю коклюша,. и разнонаправленный - в отношении свойств этих клеток, опосредующих их значение в развитии иммунопатологических процессов поствакцинального периода.

Разработаны и внедрены в практику • научных исследований новые патогенетически обоснованные экспериментальные модели, использующие культуру макрофагов для ускоренной оценки иммунологической эффективности и безопасности коклюшных препаратов.

Разработанные модели могут также применяться в производстве коклюшных препаратов для оценки их иммуногенности и токсичности. С помощью предложенных тестов подтверждена целесообразность использования КДА при конструировании коклюшных вакцин нового типа и установлена перспективность дальнейшего изучения фр.2 КДА как потенциального компонента тагах препаратов

Материалы исследований легли в основу методических рекомендаций по оценке протективной активности "коклюшных препаратов с помощью индекса перераспределения субпопуляций макрофагов (утверждены Ученым Советом РМИ, 1994) и заявки на предполагаемое изобретение "Способ оценки токсичности коклюшных препаратов".

Основные научные положения» выносимые на защиту:

1. В процессе формирования противококлюшного иммунитета под влиянием ККВ и бесклеточных коклюшных препаратов усиливается макрофагальная трансформация моноцитов крови, происходит перераспределение субпопуляций в суммарном пуле перитонеальных макрофагов, снижается уровень 5'-нуклеотидазы и активируется кислородзависимый метаболизм в этих клетках.

2. Коклюшные антигенные препараты стимулируют синтез ФНО-oí и фактора, активирующего хемотаксис "нейтрофилов, интенсивность которого зависит от характера и дозы препарата.

3. ККВ, в отличие от КДА и фр.2 КДА, обладает цитотокси-ческим эффектом при взаимодействии In vitro с первичной культурой перитонеальных макрофагов и перевиваемой моноцитоподобной линйей клеток человека U 937, носящим дозозависимый характер и коррелирующим с токсическими свойствами этого препарата, выявляемыми в тестах In vivo.

4. Модуляция свойств макрофагов, опосредующих их участие в формировании резистентности к возбудителю коклюша, носит однотипный характер ' для всех изученных коклюшных препаратов, а изменение свойств этих клеток, определяющих их значение в развитии иммунопатологических процессов, - разнонаправленный. КДА и фр.2 КДА, в отличие от ККВ, не индуцируют участие макрофагов в побочных реакциях.

5. Новые экспериментальные модели с использованием клеток СМФ, разработанные на основе выявленных корреляционных связей между отдельными свойствами штюишик препаратов, могут применяться для . характеристики иммунологической эффективности и безопасности коклюшных антигенов.

Апробация работы;

Материалы, изложенные в диссертации, доложены и обсуждены

Т 8 -

на конференциях молодых ученых и специалистов РМИ (Ростов-на-Дону,1989,1990,1994), на юбилейной конференции РСЩНМИ (1990), на областной научной конференции "Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций" (Ростов-на-Дону,1989), на VI Всесоюзном съезде микробиологов , эпидемиологов и паразитологов (Нижний Новгород, 1991), IV Путинском Совещании "Культивирование клеток животных и человека"(1994).

Публикации: Основные материалы диссертации опубликованы в 9 научных работах.

Структура и объем диссертации Работа изложена на 162 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 16 таблицами и 14 рисунками. Библиография включает 243 источника, в том числе 153 зарубежных.

» ' Содержание работы Материалы и методы исследования.

Работа выполнена на 2440 мышах линий CBWA, СВА и Balb/c и беспородных в возрасте 3-4 месяцев, массой 14-16Г, доставляемых из питомника АМН "Рапполово". ' "

В качестве исходного материала для получения исследуемых коклюшных препаратов использовали культуру В.pertussis, штамм. 305 (1,2,0), выращенную на казеиново-угольном агаре в течение 48 часов. ККВ получали в соответствии с МРТУ-42 N 263-68. КДА выделяли по методике Е.П.Москаленко с соавт.(1987). Фракционировании КДА осуществляли методом гель-хроматографии на колонке с TSK-gel "Toyopearl HW-60 F" (фирма TSK, Япония).

В коклюшных препаратах определяли содержание белка (Lowry е.а.,1951), углеводов (Dubois,1956), .нуклеиновых кислот (А. А.Спирин,1958).

Антигенные свойства и серологическую активность коклюшных препаратов исследовали в системе общепринятых тестов РИГА, РНАт с использованием антительных и антигенных, эритроцйтарных

диагностикумов и гипериммунных сывороток к КДА и его фракциям.

Гемагглгатинирующую и лейкоцитозстимулирующую активность коклюшных препаратов, а также их протективные свойства в тесте интрацеребрального заражения определяли в соответствии с "Инструкцией по отбору и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий"(М.,1987). Параллельно для каждой дозы коклюшных препаратов определяли индекс иммунологической эффективности (Л.В.Самойлова,1972).

При изучении взаимодействия коклюшных препаратов с клетками СМФ определяли показатель макрофагальной трансформации моноцитов периферической крови (ПМТМ) (Т.А.Демченко и др.. 1982); активность 5'-нуклеотидазы (И.Д.Мансурова, Р.З.Стосман, 1973) и уровень люминол-опосредованной хемилюминесценции (XJI) макрофагов (Б.Д.Рублёв и др.,1980), композицию их субпопуляций (В.М.Земсков,1985) и индекс ичезновения макрофагов (ИИМ) (Г.И:Васильева,1991). Монокин-индуцирующую активность коклюшных препаратов оценивали по синтезу, макрофагами ФНО-« (А.Л.Рахмилевич и др.,1989) и фактора активации хемотаксиса нейтрофилов (Г.И.Васильева,1993).

Цитотоксические свойства коклюшных препаратов изучали на первичной культуре перитоиеальных макрофагов и на перевиваемой линии моноцитоподобных клеток U. 937, происходящих из гистиоци-тарной лимфомы человека. Определяли процент поврежденных клеток через б часов их инкубации совместно с коклюшными препаратами.

При- изучении взаимодействия коклюшных препаратов с макрофагами ln vivo животных, иммунизировали однократно внутрибрю-иинно разными дозами препаратов согласно РД 42-48-10-90 "Порядок и методы контроля безопасности вакцин", которые составляли для ККВ: 0,25; 0,7; 1,75 МОЕ/ а для КДА И фр.2 КДА: 2,5; 7,0; 17,5 мкг по белку на мышь. Контрольным животным вводили 0,5 мл 0,15 М апирогешгого раствора хлорида натрия. Для изучения динамики изменений свойств макрофагов под влиянием коклюшных препаратов на разных этапах формирования противококлюшного иммунитета поритонеальние, макрофаги получали общепринятым- способом (М. Р.Короткова,1971) на 1, ■ 3;, 7, 14 и 21-е сутки и исследовали их в вышеперечисленных, тестах в сравнении с контролем.

При изучении взаимодействия коклюшных препаратов с макрофагами In vitro использовали следующие дозы препаратов; ККВ -0,01; 0.1; 1,0; 10 МОЕ; КДА И фр.2 КДА - 0,1; 1.0; 10,0 И 100 мкг/мл.

Статистический анализ цифрового материала осуществляли преимущественно с помощью статистических таблиц для экспресс- обработки экспериментального и клинического материала (Р.Б.Стрелков,1980): определяли значения доверительных интервалов (L) среднего арифметического (М) для уровня достоверности (Р) 99Х. Для статистической обработки значений ЕДбо определили min и щах величины этого показателя. Корреляционный анализ проездили с помощью коэффициента корреляции рангов Спирмена (Е.В.Гублер, А.А.Генкин,1973).

Результаты исследований и их обсуждение.

Одной из задач, решение которой было . необходимо для достижения поставленной цели, являлось получение очищенного, препарата КДА, сохранившего спою протективную активность, и изучение его биологических свойств в сравнении с ККВ и исходным КДА. • •

Проведенное фракционирование кда методом гель-хроматографии на TSK- gel "Toyopearl HW-60 'F" позволило добиться его разделения на б фракций, различающихся между собой'по физико-х; мическим свойствам, антигенному составу, гемагглотинирующей и лейко-лимфоцитозстимулирующсй активностям и протективным свойствам. При этом было установлено, что по всем изученным параметрам ближе всего к исходному кда фракция 2. Можно предположить, что именно в этой фракции происходит концентрация биологически активных компонентов кда, что и обусловливает ее высокую протективную активность на уровне кда и даже несколько превосходящую ее. Поэтому в своих исследованиях при изучении механизмов взаимодействия коклюшных препаратов с клетками СМФ были использованы кда и фр.2 кда в сравнении с.ккв.

Изучено влияние указанных коклюшных препаратов на диФФе-ренцировку и перераспределение клеток CMS, ' их иммунорегуля-торпую фуикщпо и процосс активации, в частности, интенсивность кислородзанисимого метаболизма и синтеза 5'тнуклеотидазы. а

тагане их способность индуцировать реакцию исчезновения макрофагов и оказывать цитотоксическое действие.

Анализ полученных данных показал, что иммунизация мышей коклюшными Препаратами вызывала резкое усиление дифференциров-1си моноцитов периферической крови в клетки макрофагального типа. Показатель макрофагальной трансформации моноцитов (ПМТМ) возрастал уже через сутки после иммунизации, достигая максимальных величин к 21-м суткзм. Сравнительный анализ разных К01СЛЮШНЫХ препаратов в сопоставимых дозах по их способности модулировать ПМТМ по!сазал однонаправленный характер воздействия изучаемых препаратов на дифференцировку моноцитов. По своей иммунологической активности, выявляемой в тесте макрофагальной трансформации моноцитов кроЕИ, КДА и фр.2 КДА не уступали ККВ, а в ранние сроки после иммунизации (1-7-е сутки) даже несколько превосходили ККВ (рис.1). Представленные данные позволили предположить, что одним из механизмов. формирования противококтошного иммунитета является способность коклюшных препаратов ускорять естественный процесс, трансформации моноцитов крови в макрофаги, которые, являясь наиболее дифференцированными клет|сами СШ-, обладают самой высокой киллерной и секреторной активностями.

. В последние годы появились сообщения о перераспределении субпопуляций суммарного пула клеток СМФ под влиянием иммуномо-дуляторов и вакцинных ■ препаратов (В.М.Земсков,1985; Г.И.Васильева,1990). Указанный эффект, по нашим данным, имеет место и при иммунизации коклюшными препаратами. Выявленное изменение композиции субпопуляций перитонеалышх макрофагов под влиянием котслюшных препаратов было обусловлено, главным образом, перераспределением субпопуляций А и Д, которые, по данным ряда исследователей (С.В.Родионов и др.,1985), существенно отличаются по своей активности. Перераспределение этих субпопуляций оценивали с помощью индекса перераспределения субпопуляций, увеличение которого указывает на преобладание в суммарном пуле, субпопуляции Д с высоким микробицидным. потенциалом. Анализ дииамшз! индекса перераспределения субпопуляций А и Д выявил двухфазный характер , его модуляции, однотипный для всех препаратов, с двумя пиками максимальных величин, приходящимися на 3-й и 14-е сутки после иммунизации (рис.2).

Рис. 1 Сравнительная оценка динамики показателя макрофагальной трансформации моноцитов периферической крови (ШГМ) в процессе формирования противококлюшного иммунитета. Пэ оси ординат - ПШМ; по оси абсцисс - сутки после иммунизации. Иммунизирующие дозы: I- ККВ - 0,2 МОЕ. КДА и фр.2 КДА - 2,0 мкг; П- ККВ -0,7 МОЕ, КДА и фр.2 КДА -7.С мкг; Ш- ККВ -1,75 МОЕ, КДА и 4р. 2 - 17,5 мкг; ааштрихс ванная полоса - значения ПШМ (X) у интактных животяых.

Рис. 2 Динамика индекса перераспределения субпопуляций перт неальных макрофагов в процессе формирования противокс лгашого иммунитета.

lio оси ординат - индекс перераспределения субпопуляци! по оси абсцисс - сутки после иммунизации.

-- 13 -

- Известно, что ведущим механизмом формирования приобретенной резистентности к большинству инфекционных агентов является активация макрофагов, индикаторами которой служат, в частности, снижение интенсивности синтеза эктоэнзима 5'-нуклеотидазы и усиление оксидативных процессов в макрофагах (Г.Б.Кирилличе-ва и др.,1987; Hashimoto е.а.,1984).

Проведенные исследования показали однонаправленный характер воздействия коклюшных препаратов на активность 5'-нуклео-тидазы - снижение ее уровня после иммунизации, пик которого приходится на 7-14-е сутки после их введения (рис.3).

Изучение другого индикатора активации макрофагов - "респираторного взрыва "методом люминол-зависимой хемилюминесценции выявило усиление кислородзависимых метаболических процессов под влиянием коклюшных препаратов, более интенсивное в клетках иммунных животных, чем интактных (рис.4). Следует отметить, что при первичном контакте ККВ в высоких дозах с перитоне-альными макрофагами имел место феномен "гашения" ХЛ-ответа (ХЛ-ответ ниже контрольного уровня), что, по-видимому, объясняется цитотоксическим действием высоких доз ККВ на макрофаги. КДА и фр.2 КДА таким эффектом не обладали. Иммунизация мышей коклюшными препаратами резко активировала оксидативные процессы в макрофагах при повторном контакте со всеми дозами изученных препаратов и аффект "гашения," ХЛ высокими дозами ККВ не наблюдался. Таким образом, по своей способности индуцировать "респираторный взрыв" КДА и фр.2 КДА не только не уступали ККВ, но и существенно'превосходили ее, особенно при первичном контакте с макрофагами. •

Известно, что активированные макрофаги более интенсивно синтезируют мснокины, опосредующие взаимодействие иммунокомпе-тентных клеток, что определяет иммунорегуляторную функцию CMS.

Проведенные Исследования показали, что изученные препараты практически не различались между собой по способности индуцировать синтез Фактора, активирующего хемотаксис нейтрофилов.

Вместе с тем, ФИО-индуцирующая активность изученных препаратов оказалась разной (рис.5). Если ККВ является достаточно сильным индуктором синтеза ФНО-« уже в небольших дозах (0,01

1 7 14 2|

Рис. 3 Сравнительная оценка динамики изменения активности фермента 5'-нуклеотидазы в процессе формирования противококлюшного иммунитета.

По оси ординат - активность фермента Б'-нуклеотидазы, X; по оси абсцисс - сутки после иммунизации. Иммунизирующие дозы: I- ККВ- 0,25 МОЕ, КДА и фр. 2 КДА- 2,5 мкг; П- ККВ-0,75 МОЕ, КДА и фр.2 КДА - 7.0 мкг; Ш - ККВ - 1,75 МОЕ. КДА И фр.2 КДА - 1,7,5 мкг по белку.

фр.2

Рис. 4 Сравнительный анализ ХЛ-ответа перитонеальных макрофагов интактных и иммунных животных на коклюшные препараты. По оси ординат - уровень ХЛ, %; по оси абсцисс -доза препаратов; сплошная и прерывистая линии -интактные и иммунные животные соответственно.

М0Е/4Х106 1сл.), то КДА и фр.2 КЛА даже в высоких концентрациях (10 мкг/4х10б кл.) обладают очень слабой ФНО-индуцирующей активностью. По нашим данным, доминирующая роль в реализации способности ККВ активировать синтез ФИО-« принадлежит ЛПС. Отсутствие . последнего у КДА и фр.2 КДА и объясняет слабую ФИО-индуцирующую активность этих препаратов. Однако можно предположить, что уровень ФИО-индуцирующей активности фр.2 КДА и КДА достаточен для запуска каскада регуляторных взаимодействий различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих формирование иммунного ответа, так как известно, что именно невысокие концентрации ФНО-сх стимулируют этот процесс, тогда,как высокие дозы могут вызывать повреждение тканей, в том числе мозга, сепсис, шок и даже летальный исход, обусловливая побочные эффекты вакцинных препаратов (ЮапеЬо. 1989).

Одним из проявлений активации макрофагов является также феномен их ."исчезновения" из перитонеального экссудата сенсибилизированных животных при внутрибрюшинном введении специфического антигена иокау,1973). В результате проведенных исследований установлена высокая чувствительность и специфичность реакции исчезновения макрофагов, которая появляется уже через сутки после иммунизации.мышей фр.2 КДА, КДА и ККВ и достигает максимальных величин на 14-21-е сутки - после примироьания их коклюшными препаратами. По своей иммунологической активности в .реакции исчезновения макрофагов КДА и фр.2 не уступали ККВ (рис.6). .

Анализ динамики изменения свойств клеток СМФ у экспериментальных животных, иммунизированных коклюшными препаратами, по сравнен.чю с контрольными, показал, что увеличение показателя макрофагальной трансформации моноцитов и индекса перераспределения субпопуйяций,усиление реакции исчезновения макрофагов, снижение активности 5'-нуклеотидазы, а также повышение интенсивности оксидативных процессов и синтеза фактора, активирующего хемотаксис нейтрофилов, отражают иммунобиологическую перестройку организма в ответ на введение этих препаратов. Выявлена прямая строгая корреляция между индексом иммунологической пффективности и индексами перераспределения субпопуля-

-лпс

0.001

0,1

0,01

0.1

1,0

10.0 мхгА"

Рис 5. ФНО-активность супернатантов перитонеальных макрофагов, индуцированных коклюшными препаратами. По оси ординат - цитотоксический индекс, Я; по оси абсцисс - доза препаратов. Заштрихованная полоса - ФЮ-активность супернатантов непримированных макрофагов.

I 3 1 Н 81

I 1 т. И 21

Рис 6. Динамика реакции исчезновения макрофагов в процессе формирования противококлюшного »иммунитета По оси ординат - индекс исчезновения макрофагов, X; по оси абсцисс сутки после иммунизации. 1,2,3 - разные доаы препаратов: 1 - ККВ - 0,25 МОЕ, КДА и фр.2 ИДА -2.5 ^^ КДА И фр.2 КДА - 7.0 МСГ; 3 -ККВ

- 1,75 МОЕ, КДА и фр.2 КДА - 17,5 мкгпо белку,

ций и исчезновения макрофагов (рис.7), что позволяет рекомендовать- применение этих двух показателей для оценки протектив-ной активности коклюшных препаратов. Предлагаемые модели экономичнее, существенно упрощают и сокращают - сроки исследования, а также исключают необходимость работы с вирулентным штаммом коклюшного микроба.

Таким образом, установлена роль отдельных механизмов взаимодействия коклюшных препаратов с клетками СМФ в формировании противококлюшного, иммунитета и разработаны экспериментальные модели оценки иммунобиологических свойств этих препаратов.

Известно, что иммуногенез может осложняться иммунопатологическими реакциями,- обусловливающими нежелательнее эффекты. Так, применяемая в настоящее время. ККВ обладает реактоген-ностью,. вызывает развитие побочных местных и общих реакций, различных осложнений (Cherry,1988). Многие из них обусловлены присутствием в ККВ'биологически активных компонентов коклюшного, микроба, в том числе токсических субстанций (Muñoz,1987). Возможно, одним из механизмов развития иммунопатологических реакций при иммунизации ККВ является ее цитотоксическое действие, в частности, на Клетки СМФ. Сравнительный анализ влияния различных коклюшных' препаратов на первичную культуру перитоне-альних макрофагов мышей и перевиваемую моноцитоподобную линию клеток человека U 937 подтвердил данное предположение: ККВ обладала цитотоксическим действием на эти клетки, резко выраженным в дозе 10 МОЕ, достаточно высоким - в дозе 1 МОЕ и слабым - в дозе 0,1 М0Е/4х106.кл.(рис.8). При ¡этом"перевиваемая линия моноцитоподобных -клеток человека U 937 оказалась несколько чувствительнее, чём леритонеальные макрофаги мышей. В то же •время КДА и фр.2 КДА, ' лишенные побочных эффектов, практически не оказывали цитотоксического действия на клетки СМФ. Отмеченные различия в ■ действии кошюшных препаратов на макрофаги, возможно, связаны с отсутствием в составе КДА и фр.2 КДА токсических' компонентов, присутствующих в ККВ, или с их малыми концентрациями, при которых, не проявляется их иоирс-адающий эффект на клетки СМФ. Это предположение сило пидтдерхдмю пройденным корреляционным анализом'взаимосвязи мозду цитэтсксичс-с-ким, действием коклюшных препаратов на кл»л'ки c\tt и их токсичностью, виявляс-шй в-других тестах, и частности, способнсси-»

12 3 1 Ь 6 7

Рис 7. Корреляционная связь индекса иммунологической эффективности (ИЮ) с индексом перераспределения субпопуляций (ИШ) и индексом исчезновения макрофагов (ИИМ). I: по оси абсцисс - ИПС; По оси. ординат - ИЙЭ. II: по оси абсцисс - ИИЗ; по оси ординат - ИШ

ш,*

3.)

'А

ЛСЛ.ЕД

«1>2

Т~ и ■ |Бо 1 I 15

Рис 8. Корреляция между цитотоксическим действием коклюшных препаратов на перевиваемую линию моноцитоподобных клеток человека и 937 (1) и первичную культуру перитонеальных макрофагов (2) и лейкоцитозстимулирующей активностью этих препаратов (3).

ГЬ оси абсцисс - дозы препаратов; по оси ординат - процент поврежденных макрофагов (ПМД), лейкоцитозстимули-руюшдя активность (ЛСА, ЕД).

индуцировать лейко-лимфоцитов; установлена строгая прямая корреляция между ними.

Выявленная закономерность позволяет рекомендовать применение первичной культуры перитонеальных макрофагов и перевиваемой линии моноцитоподобных клеток и 937 для более полной оценки токсичности коклюшных препаратов и прогнозирования потенциальной возможности побочных эффектов этих препаратов. Достоинством предлагаемых, тестов является большая информативность, сокращение сроков исследования, простота, вькхисая чувствительность и хорошая воспроизводимость.

Таким образом, установлено, что одним из механизмов формирования нежелательных эффектов, обусловленных коклюшными препаратами, может являться повреждение ими макрофагов. Другим возможным механизмом участия макрофагов в формировании иммунопатологических реакций может служить способность препаратов индуцировать синтез ФИО-« в высоких концентрациях, так как известно, что в высоких дозах последний обладает токсическим действием и является мощным эндогенным иммуномодулятором, участвующим не только, в реализации иммунных процессов, но и в развитии поствакцинальных осложнений.

Резюмируя представленные материалы исследований, следует подчеркнуть существенную роль клеток СМФ не только в иммуногенезе противококлюшного иммунитета, но, и в формировании сопровождающих его иммунопатологических реакций. Проведенный корреляционный анализ взаимосвязи между модулирующим действием коклюшных препаратов на свойства макрофагов и другими особенностями этих препаратов дозволил выявить'значимость отдельных механизмов их взаимодействия с клетками СМФ в указанных процессах.

Представленные в . работе данные свидетельствуют о чрезвычайной сложности событий, развивающихся в макроорганизме после введения коклюшных препаратов: наряду с дифференцировкой и активацией клеток СМФ происходит перераспределение их субпопуляций, а также гибель отдельных клеток. При этом особенности развивающихся изменений зависят от характера препарата, срав нительный анализ фр.2 КДА, исходного КДА и ККВ выявил при небольших различиях однотипный характер их слияния на к;

свойства макрофагов, модуляция которых опосредует участие последних в формировании резистентности к возбудителю коклюша. В то же время эти препараты (ККВ с одной стороны и КДА и фр.2 КДА - с другой) отличаются между собой по механизмам их взаимодействия с клетками СМФ, обусловливающим развитие иммунопатологических реакций. Гак, они различаются по цитотоксическому действию на эти клетки, что позволяет объяснить, почему КДА и фр.2 КДА, не уступая ККВ по протективной активности, лишены присущих ей побочных эффектов.

ВЫВОДЫ

1. Фракционирование КДА методом гель-хрсматографии на Т5К-^е! "Гоуорёаг1 НШ-60 Г" позволяет выделить Ь фра;сций, различающихся между собой по физико-химическим свойствам, антигенному составу, гемагглютинирующей и лейкоцитозстиму-лирующей активностям и протективности. По всем изученным параметрам ближе всего к исходному КДА фракция 2.

2. ККВ, КДА и фр.2 КДА усиливают процесс дифференцировки моноцитов периферической крови в макрофаги и вызывают перераспределение субпопуляций перитонеальних макрофагов в суммарном пуле^ что обусловливает повышение удельного веса функционально более активных клеток СМФ. Изменение показателя макрофагальной трансформации моноцитов и индекса перерас-

. пределения субпопуляций макрофагов носит однотипный характер для всех препаратов.

3. Коклюшные препараты воздействуют на иммунорегуляторную функцию макрофагов, опосредованную монокинами. Способность стимулировать синтез фактора, активирующего хемотаксис нейтрофилов, выражена у всех изученных препаратов одинаково, в то время как ФИО-индуцирующая активность у ККВ существенно выше, чем у КДА и фр.2 КДА.

4. Изученные коклюшные препараты изменяют уровень 5'-нуклеоти-дази и интенсивность оксидативных процессов в макрофагах, отражающие их. активацию. КДА и фр.2 КДА в высоких дозах по своей способности индуцировать "респираторный взрыв" существенно превосходят ККВ, особенно при первичном контакте с макрофагами.

П. КДА и Фр.2 КДА индуцируют, как и ККВ, феномен "исчезноЕе-

ния" макрофагов - один из показателей формирования ГЗТ. Иммунологическая активность всех изученных препаратов в реакции исчезновения макрофагов одинакова.

6. Существует строгая корреляция между индексом иммунологической эффективности коклюшных препаратов и характерными для них индексами перераспределения субпопуляций и исчезновения макрофагов.

7. ККВ, в отличие от КДА и фр.2 КДА, обладает выраженным цито-токсическим действием на первичную культуру перитонеальных макрофагов мышей и перевиваемую линию клеток человека U 937. Строгая корреляция между токсичностью препаратов, установленной с помошью этого теста, и лейкоцитозстимулирующей активностью, позволяет рекомендовать его для оценки токсичности коклюшных препаратов и прогнозирования потенциальной возможности побочных эффектов этих препаратов.

8. Влияние коклюшных препаратов на свойства макрофагов, определяющие их участие в формировании резистентности к возбудителю коклюша, носит однотипный характер для всех изученных препаратов.

9. Модуляция под влиянием коклюшных препаратов свойств макрофагов, определяющих их участие в развитии иммунопатологических процессов, имеет разнонаправленный характер: КДА и Фр.2 КДА, в отличие от ККВ, не индуцируют участие макрофагов в побочных реакциях. -

10.Новые экспериментальные,модели с использованием клеток СМЬ, разработанные на основе выявленных корреляционных связей между отдельными свойствами , коклюшных препаратов, могут применяться для характеристики их. иммунологической эффек-

. тивности и безопасности.

СПИСОК РАЁОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иммунобиологические свойства коклюшного диализатного антигена (Балахнова В.В.) - // "Эпидемиология, микробиология и иммунология, бактериальных и вирусных инфекций"..-Ростов-на-Дону, 1989.-С.102-103.

2. Характеристика фракций коклюшного протективного антигена, полученных на TSK-gel "Toyopearl HW-55 F" (Балахнова В.В.)-Программа и аннотация докладов "Дня науки" студентов, моло-

дых ученых и специалистов РОДНМИ. - Ростов- на,-Дону, 1989.-С.75.

3. Исследование фракций коклюшного диализатного антигена в серологических реакциях с антифракционными сыворотками // Программа и аннотация докладов "Дня науки" студентов, моло-* дых ученых и специалистов РОДНМИ.-Ростов-на-Дону,1990.-С.81.

А. Исследование коклюшного диализатного антигена методом имму- . ноблотинга //Научно-практ.конф..посвященная 60-летию РОДНМИ. -Ростов-'на-Дону, 1990. -С. 280-281. !

5. Применение клеток СМФ для биологической характеристики фракций коклюшного диализатного антигена // Медицинский реферативный журнал.-1991.-раздел Ш.-М 4-6. публ.1417.

6. Иммуногенная и лейкоцитозстимулирующая активность фракций коклюшного диализатного антигена (Москаленко Е.П.)-// VI Всероссийский съезд микробиологов, эпидемиологов и паразитологов. -Нижний Новгород.1991.-С.192-193.

' 7. Использование культуры моноцитоподооных клеток человека и 937 для характеристики коклюшных препаратов // цитология. -1994.- N 6.-С.583.

- 8. Динамика показателя макрофагалыюй трансформации моноцитов периферической, крови в процессе формирования противококлюш-ного иммунитета (Москаленко Е.П.)- //Иммунология.-1994.-И 5

9. Применение первичной культуры перитонеальных макрофагов для оценки токсичности коклюшных препаратов (Вилибин В.А.)-// Программа и аннотация докладов "Дня науки" студентов, моло,-дых ученых и специалистов РМИ.-Ростов-на-Дону, 1994.'-С. 14.