Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние коклюшных антигенов на функциональные свойства иммунокомпетентных клеток животных

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние коклюшных антигенов на функциональные свойства иммунокомпетентных клеток животных"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОСТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Р Г Б ОД

На правах рукописи

ТАГИРОВ Загир Тагирович

ВЛИЯНИЕ КОКЛЮШНЫХ АНТИГЕНОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ

03.00.07. - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинский наук

Ростов-на-Дону 1994

Работа выполнена в Ростовском государственном медицинском университете

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Москаленко Е.П.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии Терновская Л.Н.

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Чернавская Л.Н.

Ведущая организация:

Ростовский государственный научно-исследовательский противочумный институт.

Защита состоитсв " 1994 г. в УЛ.ИО час(

на заседании диссертационного совета Д 084.53.01 при Ростовсхс государственном медицинском университете (344022, г.Ростов-н Дону, пер. Нахичеванскнй, 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовско государственного медицинского университета.

Автореферат разослан " № " <994 г.

Ученый секретарь специализированного совета доцент

Н.Я.Коргано

Актуальность проблемы. Несмотря на успехи иммунопрофи-гактики инфекционные болезни, в том числе н коклюш, продолжает играть существенную роль в общей патология детского возраста.^

Эффективность специфической профилактики з условиях по-зышекного риска развития поствакцинальных вторичных пммукоде-*>пцитных состояний или аутоиммунных процессов может быть збеспечена применением препаратов нового поколения, лишенных, токсического балласта, не способных вызывать "возмущение" иммунной системы и обладающих выраженной протектпвной активностью (Лопатина Т.Г., Николаенко В.Н., Гуторова Н.М. с соазт., 1989; Камалова М.Н., Нуриддннова Н.Р., 1989; Волгареза P.M. п др., 1992; Preston N., е.а. 1990; Savage Y. е.а. 1990). Тенденция к сокращению объемов профилактических прививок и расширению противопоказаний к вакцинация, имевшая место з последние годы, привела к существенному уменьшению иммунной прослойки населения, повлекшему за собой вспышки этой инфекции (Ferry В., 1984; Bass J.W., Stephenson S.R., 1987).

АКДС-закцина относится к наиболее широко используемым з практике прививочным препаратам. Однако ее применение значительно осложнено высокой реактогенностыо, обусловленной, как считает большинство исследователей, корпускулярным коклюшным компонентом (Manclark СЛ., Cowell J.L., 1984; Ress Е.М., 1983). Постпрнвнвочные осложнения, связанные с наличием а составе бактериальной клетки коклюшного микроба различных биологически активных субстанций (коклюшный токсин, липополисахарид я др.), проявляются в виде местных и общих реакций макроорганизма: гиперемии, уплотнения, лихорадки, шока, коллапса, острой энцефалопатии и т.д. (Покровская Н.Я. и др. 1981; Мюллер А.С., Леувенбург И., Пратт Д.С., 1986; Соколова А.Ф. и др., 1986; Брагинская В.П., Соколова А.Ф., 1990; Murphy J.V., е.а., 1984; Hinman A.R. Onorato J.M., 1987; Parker CJ., Armstrong S.K., 1988, Pittman V., 1990; Turner-Lowe S., 1991).

Наличие выраженных ответных реакций макроорганнзма при введении коклюшной вакцины обусловлено ее сильным стрессорным воздействием, связанным с наличием у B.pertussis множества антигенных и реактогенных детерминант, большинство из которых не участвуют в формировании иммунного ответа. Кроме этого стало очевидным, что различные микроорганизмы, в том числе и кок-

люшные бактерии, способны неспецифическн изменять иммунный ответ зараженного козяина на последующее или одновременное введение неродственных антигенов (Првлепин Н.А., Семенов Б.Ф., 1980).

В связи с изложенным вопрос о влиянии профилактических прививок на изменение гомеостаза вакцинированного организма в последние годы приобретает все большее значение и широко изучается, а создание ареактогенной бесклеточной коклюшной вакцины является актуальной проблемой.

Опыт японских ученых, предложивших препараты JNIH-7, JNIH-6 на основе детоксицированного КТ и ФГ, обусловил утвердившееся в литературе мнение о том, что основным компонентом вакцинного комплекса должен быть экзотоксин коклюшного микроба (КТ) (Санин А.В., Лапаева И.А., 1988; Sato Y. е.а., 1984).

Поэтому немалый интерес в плане использования для иммунопрофилактики коклюшных вакцин представляет всестороннее изучение иммунобиологической активности бссклеточного препарата, названного коклюшным диализатным антигеном (КДА), который содержит лишь незначительные количества КТ, но обладает протективными свойствами (Москаленко Е.П. с соавт., 1987., Ягов-кина В.В., 1987).

Цель работы. Целью настоящего исследования явилось изучение иммунологической эффективности бесклеточной коклюшной вакцины (КДА) в сравнении с корпускулярной (ККВ), а также определение ее иммунологической безвредности для обоснования возможности использования КДА в качестве профилактического препарата.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Оценить на этапах иммунизации количественные изменения и функциональную активность лимфоидных клеток селезенок вакцинированных животных при воздействии митогенов и коклюшных антигенов.

2. Изучить участие интерлейкинов 1, 2 и 4 в регуляции иммунного ответа на коклюшные антигены.

3. Исследоьать кинетику образования perуляторных клеток при иммунизации мышей ККВ н КДА.

4. Изучить некоторые характеристики гуморального звена иммунитета при воздействии коклюшных препаратов.

5. Оценить особенности формирования местного иммунитета, при вакцинации ККВ и КДА.

6. Изучить функциональную активность и рецепторный аппарат альвеолярных и перитонеальных макрофагов в динамике поствакцинального процесса.

Научная новизна.-

1. Впервые проведено комплексное сравнительное изучение поствакцпаального иммунитета в результате иммунизации бесклеточным коклюшным препаратом и корпускулярной вакциной с оценкой функциональной активности основных популяций иммуно-компетентных клеток (ИКК).

2. В результате проведенного исследования определены некоторые механизмы формирования иммуносупрессии при коклк>шной инфекции.

3. Получены данные, свидетельствующие о том, что введение ККВ или инокуляция живых микробных клеток В.рег1и5з1з приводят к выраженному дисбалансу в лимфокиновой системе, не наблюдающемуся при использовании КДА. При этом впервые показана роль ИЛ-4 в развивающемся поствакциналыюм Т-иммунодефиците.

4. Показано, что при введении экспериментальным животным КДА наблюдается образование антител с высокой аффинностью, в то время как ККВ индуцирует существенные количества низкоаффинных антител, что свидетельствует о формировании иммунодефицита.

5. Получены новые экспериментальные данные, свидетельствующие об отсутствии отрицательного влияния КДА на местные защитные механизмы слизистой трахеобронхиального дерева, свойственные ККВ.

6. Отработана методика формирования экспериментального вторичного иммунодефицита у животных.

Практическая ценность. Полученные данные об иммунологических сдвигах организма экспериментальных животных позволили обосновать рациональность использования КДА в качестве нового профилактического препарата. Обоснована возможность использования КДА, обладающего сравнимыми с корпускулярной вакциной

адыогантньшн свойствами, а качестве иммуностимулятора. Существенная активация механизмов местного иммунитета и отсутствие их подавленна в раннем пес-вакцинальном периоде под влиянием бесклеточного коклюшного препарата дает основание длз разработки технических аспектов аэрогенной иммунизации КДА. Высокая антиадгезивная активность антител, индуцируемых при иммунизации диалнзатным антигеном, открывает перспективы для пассивной иммунопрофилактики коклюша. Разработанная методика формирования вторичного аммунодефицнтного состояния может быть применена для расшифровки механизмов поствакцинального иммунитета.

По результатам проведенных исследований на защиту выносится следующие основные положения:

- КДА, как и ККВ, вызывает повышение функциональной активности трех основных популяций ИКК и обеспечивает формирование напряженного противококлюшного иммунитета у экспериментальных животных;

- КДА не вызывает существенных изменений в популяцион-ном составе лимфоцитов, которые сопровождают глубокие нарушения иммуногсмеостаза при иммунизации животных ККВ;

- вакцинация диализатным антигеном обеспечивает в процессе иммуногенеза индукцию значительного количества коммитиро-санных клеток и клеток иммунологической памяти. Введение диализатиого антигена а отличие от корпускулярной вакцины не приводит к существенному повышению количества В-супрессоров и неспецифических Т-супрессоров и не сопровождается индукцией ЛПС-специфических Т-супрессорных клеток;

- КДА отличается от ККВ и живых микробных клеток S.pertussis тем, что не вызывает глубокою подавления в раннем поствакцинальном периоде синтеза основных Т-ростовых факторов - ИЛ-2 и ИЛ-4 и не нарушает продукцию ИЛ-1 перитонеальными (ПМ) н альвеолярными (AM) макрофагами;

- исследуемый коклюшный препарат (КДА) индуцирует сравнимый с ККВ уровень сывороточных иммуноглобулинов, обеспечивая синтез значительных, количеств высокоаффинных антител. Введение ККВ сопровождается существенным накоплением низкоаффинных антител, способствующих формированию иммунодефи-цатного состояние;

- иммунизация диализатным антигеном вызывает активацию факторов местного иммунитета слизистой респираторного тракта, включающую увеличение продукции иммуноглобулинов класса А и накопление лимфоцитов, несущих мембранный IgA. Введение ККВ обусловливает в раннем поствакцинальном периоде угнетение местной неспецифической защиты слизистой оболочки верхних дыхательных путей;

- иммунизация.КДА в отличие от ККВ в большей степени обеспечивает увеличение защищенности фагоцитов от цитотоксиче-ского действия В.pertussis, процента клеток, вступающих в активный фагоцитоз, поглотительной и переваривающей способности AM и ГШ;

- КДА обеспечивает более высокий в сравнении с ККВ уровень вторичного иммунного ответа и не способствует в ходе его формирования индукции супрессируемых клопов лимфоцитов-нон-респондеров.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференциях молодых ученых и специалистов РОДН-МИ (1991, 1992, 1994), XI научной конференции (Челябинск, 1992), Республиканской научно-практической конференции (Пермь, 1992), Российской научной конференции (Саратов, 1993), I Международном конгрессе по иммунореабилитлцин (Сочи, 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, имеется положительное решение на изобретение.

Структура и объем диссертации: Работа изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы. Материал иллюстрирован 25 таблицами и 22 рисунками. Библиография содержит 235 источников, в том числе 155 зарубежных.

Материал и методы исследования

В.pertussis вакцинный штамм 305 (коллекция ГИСК им. J1.A. Тарасовича) выращивали на срсде КУА в течение 48 часов. ККВ готовили в соответствии с МРТУ N263-68. Получение ультразвукового коклюшного дивлизатного антигена проводили согласно методике, описанной Москаленко Е.П. с соавт. (1987).

Для изучения цитотохсмческнх компонентов возбудителя коклюша использовали перевиваемую линию оваркальных клеток китайского хомячка СНО-К1, растущих в виде прнкрспленногс монослоя. Клетки CHO-KI получены из коллекции клеточные культур института вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР.

Клетки мышиной тимомы EL-4 были получены из институт; цитологии АН СССР и культивированы в виде стационарной суспензии в ростовой среде RPMI 1640 с 10% ЭТС, 2 мМ L-глутами-на, 4 г/л глюкозы, 10 мМ HEPES. С целью накопления i супернатанте клеток EL-4 максимального количества ИЛ-4 и ИЛ-i тимомиые клетки стимулировали форболмиркстацетатом б дозе i нг/мл s течение 24 часов.

С целью исследования влияния индуцируемых ККВ и КД£ антител на адгезию бордетелл к клеткам слизистой бронхов использовали первичную культуру цилиарных клеток интакных мышей СБА, которые получали путем лаважа трахеобронхиальногс дерева с помощью версена (3 раза по 1,5 мл в течение 1 минуты)

Изучение интенсивности фагоцитоза макрофагами (МФ) j индекса завершенности фагоцитоза (ИЗФ) (Васильева Г.И. с соавт. 1983) осуществляли с помощью резидентных культур ПМ и AM полученных с помощью адгезии на пластике.

ДЛЯ ПОЛучеНИЯ ИММУННЫХ СЫВОРОТОК, СПЛеНОЦИТОВ, ТИМ0ЦПТ01

и МФ использовали инбредных мышей линии СВА весом 16-18 г i возрасте 14-14 недель, полученных из питомника лабораторные животных "Столбовая" АМН СССР.

Количество Т- « В-лимфоцитов в селезенках иммунизирован пых животных определяли цитотокснческим тестом с использованием диагностических сывороток против Т- и В-лимфоцитов (ЛФЦ! мыши в соответствии с РД 42-28-10-90 "Порядок и методы контро ля иммунологической безопасности вакцил. Методические принци пы" (М..1989). Определение поликлональной активации В-ЛФ1 проводили в соответствии с РД 42-28-10-90, определяя число анти тслообразующих клеток (АОК), спонтанно продуцирующих антите ла к эритроцитам барана ОБ) (Cunningham A.J., 1968).

Функциональную активность Т-хелперов (Тх) гуморальной иммунного ответа под воздействием коклюшных антигенов исследо вали на модели кооперативного взаимодействия Т- и В-ЛФЦ npi гуморальном иммунном ответе на тимусзависимый антиген, б качс

стве которого использовали ЭБ (Mitchell G.F., Miller J.F.F.P., 1968).

Постановку реакции бласттрансформацин ЛФЦ <РБТЛ> иммунизированных коклюшными препаратами мышей осуществляли в микромодификации, используя э качестве антигенов ККВ и КДА, а в качестве митогепов - конканазалин А (Кон А), декстрзнсульфат (ДС), фитогемагглютинин-М (ФГА-М), л и по полисахарид Е. coli О В:4 (ЛПС), очищенный белковый дериват туберкулина Ликипковсй (ППД-Л) и S.aureus Cowan I (SAC).

Определение индуцирозанных ККВ и КДА иммунорегулятор-ных клеток проводили с помощью модифицированного метода (Порядим Г.В. и др., 1982).

Активность ИЛ-2 тестировали, используя 96 - часовне Т-кле-точные бласты, активированные 5 мкг/мл Кои А в течение 24 часов (Martensen е.а., 1987).

Оценку продукции ИЛ-I проводили, культивируя ПМ и AM иммунизированных и контрольных мышей в концентрации 10 /мл в условиях клеточного инкубатора (Phillips R е.а., 1983).

Определение наличия неспецифических п специфических Т-супрессоров (Тс) в тимусе проводили согласно методу, з основу которого положена способность супрессориых тимоцитоз оседать па пластике, который предварительно не обработан ила обработав антигенами (Чередеев А.Н., 1984;Taniguchi M., Miller I., 1977).

Определение количества ЛФЦ, несущих мембранный IgA в смывах трахеобронхиального дерева мышей, иммунизированных КДА и ККВ, осуществляли с помощью метода непрямой иммуксф-люоресценции, используя кроличьи антитела протиз мышиных иммуноглобулинов типа A (Calbiochem) и ослиные антикролячья иммуноглобулины, меченные ФИТЦ (НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР).

Иммунофермснтный анализ проводили общепринятым методом (Ticsen Р., 1985).

Статистическую обработку материалов исследования проводили путем вычисления средней арифметической (М), ее ошибки (m) и определения t-критерия Стыодента.

Результаты и обсуждение

В работе представлены результаты сравнительного изучения функциональной активности ¡слеток Т-, В-систем иммунитета и системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ), некоторых параметров формирующегося гуморального и местного иммунитета при вакцинации мышей ККВ и КДА.

Иммунизация КДА обусловливала увеличение количества Т-ЛФЦ среди селезеночных клеток только на 5-7 сутки поствакцинального периода. Введение ККВ сопровождалось двумя пиками подъемов количества селезеночных Т-клеток: на 3-5 и 14 сутки поствакцинального периода. Это свидетельствовало об активации Тс, поскольку известно, что Тс индуцируются не всеми вакцинами, а лишь теми, в ответ на введение которых отмечается выраженный сдвиг в популяционном составе ЛФЦ.

ККВ в сравнении с КДА вызывала более ранние изменения количества В-клеток, хотя общая тенденция колебаний этого параметра иммунного ответа была однотипной.

Влияние коклюшных препаратов на функциональную активность различных популяций лимфоидных клеток сопровождалось изменениями количества АОК, спонтанно продуцирующих ^М к ЭБ, причем интенсивность этого процесса, индуцированного ККВ, была значительно выше в сравнении с КДА (рис.1).Последнее, вероятно, связано с наличием в ККВ ЛПС, который обладает выраженной митогенной активностью в отношении В-клеток (Амелина И.П., 1987). В дальнейшем роль ЛПС, вероятно, снижается, к на первый план выступают другие механизмы адъювантного действия коклюшной вакцины, чем объясняется наличие активирующей ак-пниостя у КДА, лишенного ЛПС (Яговкииа В.В., 1987).

В опытах на животных установлено, что КДА и ККВ обладают собственной митогенной активностью в отношении интактных ЛФЦ мышей. Однако наличие нсспецифической стимулирующей активности в отношении ИКК не может служить полноценной характеристикой процессов, происходящих ■ макроорганизме под влиянием коклюшных антигенов. Важным представляется тот путь, по которому вдет стимуляция, какие функциональные характеристики приобретают ИКК в процессе активации хелперные или супрессор-яые.

Рис. 1. Динамика изменения индекса поликлональной стимуляции (ИПС) В - лимфоцитов селезенок под влиянием КДА(1) и ККВ(2). По оси абсцисс - сутки, по оси ординат - ИПС

При оценке индекса индуцированной гшмукорегуляцшг, проведенной с использованием интактных ЛФЦ в сннгенной системе in viiro, выявлено существенное ингибирующее воздействие ККВ-ик-дуцированных регуляторных клеток в качестве неепепифических супрессорог. па митогенстимулируемую бллсттрансформацшо как Т, так и В-ЛФЦ-респоядеров. Проявляя незначительную супрессор-ную активность з отношении пролиферации Т-клето::, КДА -индуцированные регуляторные клетки не только не оказали педаз-ляющего действия на вызываемую ЛПС пролиферацию отвечающие В-ЛФЦ, но и обеспечили костимулирующее влияние из этот процесс.

Используя митогены и коклюшные антигены, удалось показать, что процесс иммуногенеза у животных, вакцинированных ККВ, отличался скачкообразным развитием (рнс. 2). В динамике поствакцинального периода определяли шпрохоамшштудные колебания з уровне отсечаемссти примнрозанных ЛФЦ ка гомологичный антиген, которые завершались к 21 дню после иммунизации, сопровождаясь образованием клеток памяти. Невысокие показатели пролнферативной активности спленоцитов, определяющиеся з анти-генспецифической РБТЛ, превышали таковые в реахции спленоцитов неиммунных мышей на ту же стимулирующую дозу ККВ in vitro. Иммунологическая перестройка вакцинированных КДА животных отличалась более плавным подъемом кривой показателей ан-тнгенспецифической РБТЛ в процессе иммунизации. Падение уровня пролнферативной активности в ответ на гомологичный ан-

тиген происходило из 5 сутки в отлачие от аналогичного процесса, наблюдающегося 3 сутки при вакцинации ККВ. При этом про-лнферативная активность ЛФЦ иммунизированных ККВ животных была ниже уровня отвечаемосги ЛФЦ интактных животных. Выход по графику на плато между 21 и 28 сутками свидетельствовал о завершении в этот период активных процессов иммуногенеза. Разница в величине индексов стимуляции (ИС) у ЛФЦ вакцинированных животных позволила предположить накопление существенно большего количества клеток иммунологической памяти в результате иммунизации КДА, чем ККВ. Возможно это свидетельствует о супрессии части клонов антигенспецифических ЛФЦ, полученных в результате первичной ККВ иммунизации и не отвечающих при вторичной антигенной стимуляции в результате активации популяции супрессорных клеток.

Рис. 2. Показатели антигснспецифической бласттрансфор-мации спленоцитов мышей, иммунизированных коклюшными антигенами - ККВ(1) и КДА(2). А - ККВ е качестве стимулятора. Б - КДА в качестве стимулятора.

В связи с изложенным представляется оправданным использование препарата КДА не только для граупд-иммунизации, но и в качестве эффективного стимулятора при ревакцинации.

Воздействие ККВ обусловливало глубокое угнетение способности аримнровашшх Т-ЛФЦ отвечать пролиферацией на Кон А на 3, 5 сутки после аппликации антигенов, свидетельствуя о нарушении функционирования популяции зрелых Т-ЛФЦ. Учитывая индуцирование супрессорной активности Т-клеток и снижение ответа спленоцитов на этот лсктин в результате вакцинации ККВ, можно думать, что ККВ обусловливает достаточно мощное стимулирующее

воздействие именно на супрессорнне Т-клеткп мышей, теряющие возможность адекватного реагирования на мнтоген. В результате происходящих событий к концу поствакцинального пе^ода при воздействии ККВ формируется иммунодефнцитное состояние по Т-клеточной системе иммунитета, связанное с Кон А - чувствительной субпопуляцией зрелых Т-ЛФЦ при нарасгании незрелых форм Т-клеток. КДА в отличие от ККВ не вызывал нарушения функционирования Т-клеток в первые трое суток, что, учитывая зышеизло-1. женное, можно расценить как отсутствие генерации или гиперактивации Тс.

Механизм обнаруженной супрессии мнтогеннндуцированной пролиферации стимулируемых хоклюшиьши антигенами ИКК, принадлежащих к Л ПС-чувствительной субпопуляции В-ЛФЦ, вероятно, также сзязан с активацией Тс, избирательно подавляющих пролиферацию именно этой субпопуляции В-ЛФЦ, поскольку реактивность В-клеток, перекрывающих по чувствительности к мкто-генным стимулам друг друга, и отношении других В-хлеточных :.п!тогсков не только не была подавлена, но н з значительной степени активирована.

Полученные данные о формировании в ранние сроки введения КДА и ККВ вторичного иммунодефицита по Т-спстеме, сопровождающегося б разной степени выраженным угнетением прелифератипного ответа Т-ЛФЦ, индуцированного Коп А, может быть связано с недостаточным синтезом рсстозых факторов, обеспечивающих полноценный пролиферативный ответ Т-ЛФЦ. В результате проведенных исследований обнаружены значительные изменения уровня ИЛ-2 после введения живых микробных клеток В.регхибЗ!» и ККВ. Степень повреждающего воздействия КДА на этот процесс была выражена меньше (рис.3). 3 опытах т г! г го было установлено, что з эти сроки нарушалась не только продукция ИЛ-2, но н изменялся баланс второго по значимости ростопого фактора Т-клеток - ИЛ-4. Введение з отвечающую систему экзогенных медиаторов приводило к полному восстановлению прелифе-ратизного ответа на Кон А сплсноцитов зараженных и иммунизированных коклюшными антигенами мышей. Нарушение продукции ИЛ-2 Т-хёлперамн может быть связано с функционированием активированной популяции супрсссорных Т-клеток.

Рис. 3. Пролиферация Кон А (Пластов при действии супер-патантов стимулированных лимфоцитов интактных (2), иммунизированных КДА (3), ККВ (4) и зараженных живыми (5) бордетеллами мышей о сравнении с рИЛ-2 (I). По оси ординат -индекс стимуляции. По абсцисс - показатель разведения суперна-танта и количество ед/мл рИЛ-2.

Проведенные исследования показали, что аппликация ККВ приводила к накоплению в тимусе в среднем в 5,3 раза большего количества супрессорных тимоцитов, чем у интактных животных, получивших плацебо. КДА-вакцинация обеспечивала увеличение количества клеток тимуса с супрессорной активностью лишь в 1,43 раза b сравнении с контролем. Максимальные количества супрессо-ров накапливались в тимусе в первые 5 дней после иммунизации. Если в результате воздействия КДА увеличение супрессорной активности тимоцитов, тестируемое по подавлению ими вторично-индуцированного in vitro антителообразования, было связано с накоплением иеспецифических Тс, то ККВ выбывала не только значительное увеличение числа последних, но и индуцировала зиачвдше количества антигенспецифических супрзссорных Т-кле-ток. В отличие от ККВ бесклеточный препарат приводил лишь к некоторому увеличению содержания б тимусе нсспецифических Тс при незначительной индукции антигенспецифических Тс. Исследование роли основных антигенов коклюшного микроба (КТ и ЛПС) в индукции супрессорных клеток, наблюдаемой при вакцинации, показало, что ответственность за столь существенное увеличение количества антигенспецифических Тс несет ЛПС.

Причиной нарушения продукции факторов роста Т-клеток может быть нарушение синтеза МФ ИЛ-1, необходимого для активации Т-ЛФЦ и синтеза ими ИЛ-2. В результате проведенных исследований не обнаружено изменения синтетической активности АМ и ПМ под влиянием КДА. Аппликация ККВ оказывала повреждающее действие на АМ и ингибирующее воздействие на ПМ иммунизированных мышей, снижая способность продуцировать монокин в ответ на стимуляцию ЛПС (рис.4).

г.е

■> Ель

Рис. 4. Активность ИЛ-1 в супсрнатантах альвеолярных и перитонеальных макрофагов иммунизированных коклюшными антигенами мышей. По оси ординат - активность ИЛ-1 в супернан-тах (в индексах влияния). По оси абсцисс - различные популяции макрофагов от иммунизированных животных: I - ПМ, 2 - АМ; а - спонтанная продукция ИЛ-1; б - стимулированная ЛПС продукция ИЛ-1. PI - плацебо, Ер - живые микробные клетки В.pertussis

Исследование функциональной активности Тх гуморального иммунного ответа, индуцируемых ККВ и КДА, показало, что оба коклюшных препарата обеспечивали усиление хелперной активности тимичсских Т-клеток на 7-14 сутки после вакцинации со статистически неотличимой интенсивностью. Однако на 3, 5 и 21 сутки КДА не влиял в сравнении с контролем на активность хел-перных клеток, в то время как ККВ существенным образом инги-бировала активность этой субпопуляции тимоцитов на 3-5 сутки

поствакцинального периода. Этот феномен является, по-видимому, следствием усиленного индуцирования ККВ клеток, обладающих супрессорной активностью, которые или инактивируют Тх или прямо подавляют антигензависимую дифференцировку В-клеток в ан-титслопродуценты.

Проведенные исследования с переносом Т- и В-клеток иммунизированных мышей интактным сингенным животным с последующей иммунизацией последних исследуемыми препаратами показали, что ККВ-вакцинация в отличие от КДА индуцирует значимые количества Тс, ингибнрующих иммунный ответ реципиентов во г.сс сроки ппгл" лппликации. Введение КДА вызывало увеличе-.............. специфических розеткообразующих клеток (на 7-21 сутки), свидетельствуя как об индуцировании хелперной активности Т-клсток, так и о формировании в эти сроки значительно большего числа антигенрсактиБных ¡слеток. Оба коклюшных антигенных препарата вызывали прогрессивное нарастание популяция В-клеток, способных осуществлять супрессивный эффект. 'При этом аппликация ККВ обусловливала активность Во-во все сроки после иммунизации с максимальными ее значениями с 7 по 21 сутки, а КДА а меньшей степени и лишь в поздние сроки поствакциналыюго периода. Формирование Вс происходило при иммунизации животных КДА как в оптимальной, так и б супраоптимальной дезе. Формирование -кс Тс происходит при введении оптимальной дозы ККВ н только супраоптимальной дозы КДА, что позволяет считать его более рациональным препаратом для создания противококлюшиого иммунитета.

„зучении гуморального звена иммунитета обнаружено, что титры протнвококлюшных антител, индуцируемых исследуемыми препаратами на этапах поствакцинального периода, практически не отличались друг от друга. Однако при титровании сывороток крови мышей, полученных на 21 сутки после вакцинации КДА, в присутствии гуанндин хлорида показано наличие в полнклональном иммуноглобулиновом пуле незначительного количества низкоаффинных антител. Введение ККВ вызывало в этот период накопление значительно больших количеств низкоаффинных антител (рис.5).

Образование низкоаффинных антител в процессе иммуногенеза является неоспоримым проявлением иммунодефицита (Вегек С.,

Рис 5. Кривые титрования сывороток крови мышей, иммунизированных КДА, ККВ, и зараженных живыми микробными клетками В.pertussis. По оси ординат - оптическая плотность. По оси абсцисс - титры антител * 10 . 1 - сыворотка крови мышей, зараженных живыми микробами Б.pertussis; 2 - то же + гуа-нидин хлорид; 3 - сыворотка крови мышей, иммунизированных КДА; 4 - то же + гуанидин хлорид; 5 - сыворотка крови мышей, иммунизированных ККВ; 6 - то же + гуанидин хлорид.

Ziegner V., 1993). В связи с изложенным правомерно заключить, что для "созревания" иммунного ответа большую ценность представляет КДА в сравнении с ККВ.

Коклюшные антигенные препараты при иммунизации животных вызывали появление в секрете слизистой оболочки верхних дыхательных путей повышенного количества как общих, так и ан-тнгенспецифических slgA ,а также накопление ЛФЦ, несущих мембранный lgA. Однако введение КДА в меньшей степени, чем ККВ, активирует механизмы местного иммунитета. Число mlgA -ЛФЦ, индуцированных КДА, было в 3 раза меньше на 14-21-28 сутки, чем при воздействии ККВ. С другой стороны, при введении КДА депрессивное влияние на иммунную систему макроорганизма в ранний поствакцинальнын период, проявляющееся при использовании ККВ в уменьшении как общего числа ЛФЦ бронхоальвео-ляркой лаважной жидкости и mlgA - клеток, так и титров общих ("фоновых") slgA, значительно снижено. Кроме этого, выраженное накопление в последующем лимфондных клеток в секрете слизистой оболочки верхних дыхательных путей, индуцируемое ККВ в отличие от КДА, можно расценивать как пшерстимуляцию и пере-

раздражение иммунной системы, что также моясет быть неблагоприятным фактором, поскольку дисбалансирует гомеостатические системы макроорганизма (супрессия - гиперактивация).

При оценке функциональной активности клеток СМФ показано, что AM в сравнении с ПМ интактных мышей обладали большей чувствительностью к агрессивным субстанциям коклюшного микроба. Способность МФ противостоять цитотоксическому действию живых бордетелл в большей степени усиливалась в результате воздействия КДА, чем ККВ. КДА индуцировал более высокий про-иент активных МФ перитонеального происхождения, вступивших в фагоцитоз через час г.осле контакта с живыми микробами. В отношении AM отмечена однотипная тенденция в обоих случаях иммунизации при более выраженной и ранней стимулирующей активности КДА, сопровождающаяся постепенным нарастанием числа активных фагоцитирующих клеток.

При исследовании поглотительной способности МФ двух типов обнаружено большее стимулирующее влияние КДА на способность фагоцитов захватывать микробные клетки. Количество виутриклеточно расположенных микроорганизмов на 28 сутки поствакцинального периода в ПМ б 1,8 раза, а в AM в 1,75 раза было больше, чек г. контроле. При этом у фагоцитов, активироигнш«: ККВ, превышение составило 1,5 и 1,4 раза, соответствен по. Более того, ККВ на 7 сутки после иммунизации снижала п ¡,3 раза поглотительную способность AM по сравнению с контрольным уровнем интактных животных.

Исследование переваривающей активности МФ показало, что AM интактных мышей в значительной степени не способны противостоять атаке живых микробных клеток В.pertussis, поскольку количество инутриклеточпо расположенных микроорганизмов через $ часов инкубации щ .1,5 рдзл превышало показатель одночасозого взаимодействия.

Выраженное активирующее воздействие оказывал КДА на ис-реваривающуи) способность ПМ, интенсивность которой превышала результирующее слияние ККВ. Фагоцитоз приобретал завершенный характер уже на 7 сутки после аппликации КДА, а в случае ККВ - лишь через 14 дней. Переваривающая способность AM увеличивалась в результате вакцинации обоими препаратами, однако в этом случае эффективность влияния КДА была выше. Повышение функ-

иональной активности МФ, выражавшееся в увеличении как их иллерной, так и поглотительной активности, свидетельствовало не элько об определенных метаболических, но и структурных изме-ениях фагоцитов.

Иммунизация мышей коклюшными антигенами приводила к ктивации FcyR и C3bR как ПМ, так и AM, свидетельствуя о сти-улирующем влиянии вакцинных препаратов на процесс активации леток СМФ (рис.6). Поскольку повышение экспрессии FcyR отно-ится к числу универсальных изменений в активируемых клетках, синтез этих рецепторов находится в прямой корреляционной свя-и со степенью фагоцитарной активности (Ляшенко В.А. и др., 987; Hernandes C.J. е.а., 1987) особый интерес представляло исс-едование экспрессии рецепторов фагоцитирующими клетками, олученными в разные сроки поствакцинального периода, при их онтакте с живыми м. кл. В.pertussis 305. Анализируя результаты роведенного исследования, можно констатировать, что ККВ-вакци-ация обусловливала повышение уровня экспрессии FcyR обеими юпуляциями МФ с 7 до 28 суток поствакцинального периода за чет увеличения числа Fcy - клеток. При этом на 21 сутки после акцинации наблюдали значимое увеличение авидности Fc}tt при юследующем взаимодействии ПМ с живыми м.кл. вакцинного лтамма коклюшного микроба. В отношении AM ККВ оказывала бо-ice выраженное (кроме 14 суток) стимулирующее влияние, заклю-ающееся как в значительном увеличении числа Fe)' - клеток, так I авидности Fc}4R. Последующий контакт с живыми бордетеллами опровождался еще большей степенью повышения активности Fcjft 7 до 21 суток после аппликации антигена и понижением ее на 28 утки до уровня, определяемого у AM иммунизированных живо-ных, не инкубированных предварительно с микробами. При введе-1ии ККВ ответная реакция C3bR ПМ как до, так и после их ;онтакта с живыми коклюшными микробами заключалась в посте-ichhom снижении активности C3bR с 7 до 28 суток. У AM, не кон-актировавшнх с м.кл. B.pertussis 305, снижение активности C3bR I ходе иммунного ответа налюдали лишь в период с 21 по 28 утки. После предварительной инкуации AM с живыми бордетелла-ли во все сроки поствакцинального периода отмечалось гущественное снижение активности C3bR практически до уровня «нтактных животных.

MI 1U ISO

» M >1 I»

I -Ii --« ••• «i -- J ---4

l

» ' *

ма гя / * ' ' г / ^ \

/ N

J —I* --i •••• t« —I —4

II

1« II tl

l —1> --t --г» —> —«

I

ги

tts it « с .....

----

l —Ii - -t —-Ja •- » —в

II

Рис 6. Активность FcyR(A) и C3bR(B) на поверхности макрофагов KKB (I) - и К ДА (II) - иммунизированных мышей до и после взаимодействия с живыми клетками В.pertussis в динамике поствакцинального периода. По оси ординат - А - ЕА/100, В -ЕАС/100. По оси абсцисс - сутки. 1 - ПМ до контакта с живыми клетками В.pertussis; 1а - ПМ после контакта; 2 - AM до контакта с живыми клетками ß.pertussis; 2а - AM после контакта; 3 - контроль FcyR ПМ; 4 - контроль FcfyR AM; 5 - контроль C3bR ПМ; 6 - контроль C3bR AM.

КДА-иммунизация сопровождалась аналогичной, но более выраженной в количественном отношении картиной повышения in vivo числа Fe у' - клеток как перитонеальногс, так и альвеолярного происхождения, процент которых на 21-28 сутки был одинаковым в обеих популяциях. Этот процесс сопровождался одновременным повышением авидности FcJ-'R за исключением 14 суток поствакцинального периода, когда ее уровень снижался в сравнении с 7 сутками после антигенного воздействия. После предварительного контакта с живыми бордетеллами авидность FcJ'R повышалась линейно с 7 до 21 суток, не уменьшаясь у МФ обеих популяций нз 14 сутки после аппликации антигена, но снижаясь на 28 сутки ниже уровня, определяемого у клеток СМФ до контакта с микробами. Активность C3fcR ПМ, определяемая числом СЗЬ - клеток и авид-ностыо C3bR, в результате воздействия КДА снижалась к концу поствакцинального периода, а экспрессия рецептора к комплементу у АМ линейно возрастала до конца наблюдения, значительно превышая по уровню результат воздействия ККВ. При этом существенно возрастала авидность C3bR. Предварительный контакт с микробами приводил к значительному снижению активности C3bR у МФ обеих популяций, свидетельствуя, возможно, об их активной роли в рецепции микроорганизмов (Ofer J. Iharon N., 1988).

Совокупность полученных результатов сравнительного исследования формирующегося иммунного ответа у мышей при воздействии ККВ и КДА свидетельствуют о наличии у последнего ряда преимуществ:

- отсутствие существенного стрессорного и токсического влияния на вакцинируемый организм;

- обеспечение адекватного "созревания" иммунного ответа, не сопровождающегося развитием вторичного иммунодефицита;

- обеспечение адекватного функционирования ИКК без нарушения нммуногомсостаза;

- наличие выраженного активирующего влияния на механизмы местного иммунитета слизистой респираторного ,-ракта и накопление антител с антиадгезивной активностью;

- повышение функциональной активности АМ, карающих роль в защите входных ворот инфекции, и их способности противостоять цитотоксическому действию живых бордетелл;

- наличие более выраженного иммунизирующего эффекта при ревакцинации.

Индуцированные КДА сывороточные антитела, благодаря совокупности их эффекторных свойств, позволяют рекомендовать продолжить исследования иммуноглобулиновых препаратов для серопрофилактики коклюша. Отсутствие повреждающего действия на иммунную систему макроорганизма и наличие выраженной адъго-вантной активности у диализатного антигена открывают перспективы его использования в качестве вакцинного препарата.

' Выводы

1. Корпускулярный (ККВ) и бесклеточный (КДА) коклюшные антигснны; препараты обеспечивают в организме животных формирование выраженного иммунного ответа, сопровождающегося активацией трек популяций иммунокомпетентных клеток.

2. Коклюшный диализатный антиген в отличие от корпускулярной коклюшной вакцины не обладает стрессорным и токсическим действием и не вызывает существенных нарушений функциональной активности иммунокомпетентных клеток. Под слиянием коклюшных антигенных препаратов наблюдаются количественные изменения в попул:;цноппом составе клеток селезенки, причем увеличение числа Т- и В-лимфоцитов более выражено и проявляется в более ранние сроки при введении корпускулярной коклюшной вакцины.

3. Саг.цинация коклюшным диализатным антигеном не приводит ¡; отличие от корпускулярной коклюшной вакцины к существенному повышению количества В-супрессоров и неспецифических Т-суирессороа и не сопровождается индукцией НПО-специфических Г-суп•>"!х>!х клеток, но обеспечивает в процессе иммуногенеза значительное увеличение лнтигенреактивных клеток и клеток иммунологической памяти.

4. Воздействие на макроорганизм коклюшных антигенных препарате!?, как и живых бордетелл, сопровождается дисбалансом янторлснкикоЕой системы по уроинга ИД-2 и ИЛ-4. При этом по-!)пс;хддющее воздействие на иммуную систему наименее выражено у коклюшного диализатного антигена. В отличие от цельноклеточ-пой вакцины коклюшный диализатный антиген не нарушает продукцию макрофагами ИЛ-1 в ранние сроки после иммунизации.

5. Коклюшные антигены индуцируют сравнимые уровни сывороточных антител. При этом коклюшный диализатный антиген способствует накоплению значительного количества высокоаффинных антител, обеспечивая адекватное "созревание" иммунного ответа, а корпускулярная коклюшная вакцина, индуцируя существенные количества низкоаффинных антител, обусловливает проявление поствакцинального иммунодефицита.

6. Иммунизация коклюшным диалнзатным антигеном вызывает существенные изменения со стороны местного иммунитета слизистой респираторного тракта, включающие увеличение продукции IgA и накопление лимфоцитов, несущих mlgA, минуя свойственную корпускулярной вакцине фазу подавления в раннем поствакцинальном периоде местной неспецифической зашиты слизистой зерхних дыхательных путей.

7. Введение животным коклюшного диализатного знтигена в отличие от корпускулярной коклюшной вакцины в большей степени сказывается на изменении функциональной активности клеток СМФ, обеспечивая увеличение защищенности фагоцитов от цито-токснческого действия B.pertussis, проценте клеток, вступающих в активный фагоцитоз, поглотительной и переваривающей способности альвеолярных и перитонеальных макрофагов.

8. Коклюшный диализатный антиген обеспечивает в отличие от корпускулярной коклюшной вакцины более высокий уровень вторичного иммунного ответа и не способствует в ходе его формирования индукции супрессируемых клонов лимфоцитов-нонреспон-деров.

9. Проведенные исследования свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения воздействия коклюшного диализатного антигена на иммунную систему вакцинируемого макроорганизма в составе ассоциированных вакцин или в качестве препарата для ревакцинации.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Влияние коклюшных антигенов на поликлональную активность В-лимфоцитов // Программа и аннотация докладов "Дня науки" студентов, молодых ученых и специалистов РОДНМИ. -Ростов-на-Дону, 1991. - с.51.

2. Влияние корпускулярной коклюшной вакцины и коклюшного диализатного антигена на экспрессию Fc-рецепторов лимфоид-ных клеток // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Тез. докл. XI науч. конф. - Челябинск, 1992. - с.102.

3. Функциональная активность Т-хелперов гуморального иммунного ответа под всздействием корпускулярной коклюшной вакцины и коклюшного диализатного антигена /Москаленко Е.П./. -// Эпидемиологический надзор за аэрозольными антропонозами: Тез. науч.-практ. конф. - Пермь, 1992. - с.29-30.

4. Влияние коклюшных антигенных препаратов на функциональную активность ре^улиторных Т-лимфоцитов // Программа и аннотация докладов "Дня науки" студентов, молодых ученых и специалистов РОДНМИ. - Ростов-на-Дону, 1992. - с.52.

5. Иммуномодулиругсщсе действие коклюшных антигенов при иммунизации мышей живой туляремийной вакциной /Козловский В.Н./. - // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций: Матер. Российской науч. конф. - Саратов. -1993.- rOS-o?.

6. Условия бласттрансформации фракционированной суспензии лимфоцитов /Козловский В.Н./. - // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций: Матер. Российской науч. конф.- Саратов. - 1993. - с.131-132.

7. Аффинитет антител и эффективность прогивококлюшной иммунизации /Козловский В.Н./. - // Программа и аннотация докладов "Дня науки" студентов, молодых ученых и специалистов РМИ. - Ростов-на-Дону, 1994. - с.12.

8. Влияние коклюшной вакцины на состояние местного иммунитета респираторного тракта /Козловский В.Н./. - // Программа и аннотация докладсв "Дня науки" студентов, молодых ученых и специалистов РМИ. - Ростов-на-Дону, 1994. - с.13.

9. Влияние противококлюшной иммунизации на функциональную активность регуляторных клеток /Козловский В.Н./. - // Программа и аннотация докладов "Дня науки" студентов, молодых ученых и специалистов РМИ. - Ростов-на-Дону, 1994. - с.13.

10. Disbalance of intcrleukin production in the development of the early postvaccinal immunodeficiency /Moskalenko E.P., Kozlovsky

V.N./. - // Inernational Journal of Immunoreabilitation. - - Moskow, 1994. - N1. -p.244.

11. Роль лимфокинов в иммуносупрессии, индуцируемой коклюшными антигенами /Москаленко Е.П., Козловский В.Н./. - Ростов-на-Дону, 1994. - Юс. - Деп. в ВИНИТИ 8.07.1994, N1703.

12. Способ моделирования вторичного иммунодефицитного состояния /Москаленко Е.П., Ильина С.И., Уразовский С.Ф./. - Заявка N 9200164/14, зарегистрирована в Роспатенте 16.10.92