Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эффективность новых иммунологических методов выявления Bordetella Pertussis и секреторных антител

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Эффективность новых иммунологических методов выявления Bordetella Pertussis и секреторных антител"

КАЗАНСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени В. И. УЛЬЯНОВА-ЛЕНИНА

На правах рукописи

САВИНОВА Альфия Николаевна

ЭФФЕКТИВНОСТЬ НОВЫХ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ BORDETELLA PERTUSSIS И СЕКРЕТОРНЫХ АНТИТЕЛ

ОЗ. 00. 07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ - 1991

Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского ордена Трудового Красного Знамени государственного медицинского института им.С.В.Курашова.

доктор медицинских наук, профессор Н.Ф.Амфитеатрова

доктор медицинских наук, профессор Н.А.Семина

кандидат биологических наук В.И.Вершинина

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского Минздрава РСФСР

Защита диссертации состоится '¿^ " 1991

в /'¿Р часов на заседании специализированного совета К 053.29.19 в Казанском ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственном университете им.В.И.Ульянова-Ленина по адресу: 420008,г.Казань, ул.Ленина, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им.Н.И.Лобачевского Казанского государственного университета им.В.И.Ульянова-Ленина.

Автореферат разослан " 199х г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

V_x.CZ V А&Ьъ. Ю.Котляр

Актуальность проблемы. В последние годы во многих странах отмечается рост заболеваемости коклюшем (Пигаева I.A. и соавт., IS86;Lawrence A.j. et ai., 1987). Это связано с сокращением национальных программ иммунизации из-за высокой реактогенности АКДС вакцины (Hill J.с. et ai., 1979; 1итвинов O.K. и соавт., 1988). В нашей стране все больше детей остаются'невакцинярован-ными благодаря медицинским отводам (Сергиев В.П. и соавт.,1984). Кроме того, отмечаются случаи заболевания коклюшем привитых детей и взрослых, у которых инфекция протекает в легкой или атипичной формах (Петрова М.С., 1978; Hansman D.J. , 1987). В таких случаях коклюш монет оставаться нераспознанным, что способствует его распространению вследствие высокой контагиозное™. По этой причине, а также для рационального лечения больных, необходима ранняя и точная диагностика коклюша.

Бактериологический метод, хотя и является наиболее доказательным, трудоемок, длителен и малоэффективен (Мамаева Е.А., 1983; Ross P.W. et al., 1987).

Из серологических методов для выявления нрогивококлюшных антител в сыворотке крови применяются реакция агглютинации, иммуноферментный анализ (viljanen м.к. et al., 1982;' Цветкова H.B. и соавт., 1983) и непрямой иммунофлюоресцентный метод (Bertrand J.L. et al, 1975;йарр I. et al., 1988). Эти способы используются для поздней диагностики коклюша, так как антитела к возбудителям инфекционных болезней выявляются в крови только со второй недели болезни, а у привитых необходимо 2-3 кратное исследование образцов сыворотки крови с интервалом в 1-2 недели. К тому'же эти способы имеют недостатки, 'связанные с негативными моментами при заборе крови.

В связи с этим разработка высокочувствительных и специфичных методов ранней диагностики коклюша весьма актуальна.

Поскольку при коклюше наряду с системным иммунным ответом проявляется и местный иммунитет, отдельными исследователями с помощью иммуноферментного метода были обнаружены в слюне больных коклюшем IgA К КОКЛШНЫМ бактериям (Goodman Y.E.et al. , [981). Поэтому представляет интерес разработка различных методов выявления секреторных противококлюшных антител в слюне и эценка их диагностической значимости.

Ранняя диагностика коклша может быть также осуществлена

1утем выявления коклюшных микробов или их антигенов в мате-

3

риале из носоглотки обследуемых или в первичных посевах этого материала. С этой целью разрабатываются методы генных проб (ДНК-проба) и выявления аденилат циклазы коклюшного микроба в носоглоточных секретах ( Onoratо I.M.et ai., 1987).

Наиболее перспективными и доступными являются методы имму-ноферментного анализа и реакции'иммунофлюоресценции (Захарова М.С., 1982; Hoppe j.e. et al., 1986). Для обнаружения коклюшных микробов предложена прямая иммувофлюоресцентная реакция (Захарова М.С. И соавт., I968;Hökansson S. et al., I984;Larchet M. et al. , 1986). Находится в стадии разработки метод иммунофер-ментного анализа (Борисенко Ю.В., 1986; Титова Е.И. и соавт., 1987; Смирнов В.Д. и соавт., 1988). Однако эти методы, как отмечают авторы, характеризуются недостаточно высокой чувствительностью и специфичностью. Вследствие этого необходима разработка высокочувствительного и специфичного непрямого иммуно-флюоресцентного метода выявления возбудителя коклюша.

Целью настоящего исследования явилось усовершенствование лабораторной диагностики коклюша для более полного выявления больных.

В з а д а ч и исследования входило :

1. Разработать метод выявления противококлюшных антител в слюне по реакции агглютинации.

2. Изучить возможность использования диагностической тест-системы, разработанной с целью выявления антител к B.pertussi в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, для обнаружения противококлюшных антител в слюне обследуемых.

3. Разработать высокочувствительный непрямой иммунофлкь оресцентный метод выявления коклюшных микробов в патологическом материале для экспресс-диагностики коклша.

4. Изучить эффективность выявления больных коклюшем при использовании вновь разработанных методов в сравнения с традиционными методами диагностики коклюша.

5. Разработать оптимальный комплекс методов и схему обсле дования,обеспечивающих наиболее эффективную диагностику коклюша.

Научная новизна исследований. Впервые разработан метод выявления противококлюшных антител в слюне по реакции агглютинации. Установлено, что поствакцинальные антитела обнаружи-

4

ваются б слюне в течение 2 месяцев после завершения иммунизации. У больных коклюшем секреторные антитела.по реакции агглютинации обнаруживаются с I по 14 недели болезни. Показана воз-монность использования иммуноферментной диагностической тест-системы для выявления противококлюшных антител в слюне. При исследовании методом иммуноферментного анализа слюны детей, больных коклюшем, наиболее информативным является выявление антител и липополисахаридному антигену коклюшного микроба.Впервые разработан непрямой иммунофлюоресцентный метод обнаружения коклюшных микробов в материале от больных для экспресс-диагностики "коклюша.

Практическая значимость. Разработанные методы определения противококлюшных антител по реакции агглютинации и с помощью иммуноферментной диагностической тест-системы предлагаются в качестве дополнительных способов диагностики коклюша, как на ранних, так и на поздних сроках болезни. Разработанный непрямой иммунофлюоресцентный метод рекомендуется для экспресс-диагностики коклюша по выявлению коклшных .микробов в материале с задней стенки глотки обследуемых. Он может использоваться также для идентификации выделенных культур в процессе бактериологического анализа и для исследования смывов 5-7 суточных первичных посевов материала от обследуемых при отрицательных результатах бактериологического обследования. Непрямой иммунофлюоресцентный метод позволяет выявить возбудителя коклюша с измененными биологическими свойствами у лиц, лечившихся антибиотиками, привитых и на поздних сроках болезни. По результатам исследований была разработана схема эффективного комплексного обследования на коклюш, включающая непрямой иммунофлюоресцентный и бактериологический методы выявления коклшных микробов в материале с задней стенки глотки обследуемых и способы обнаружения антител в слюне по реакции агглютинации и с помощью пммуноферментного анализа.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту :

1. Разработанный непрямой иммунофлюоресцентный метод выявления коклюшных микробов, в материале с задней стенки глотки обследуемых позволяет проводить экспресс-диагностику коклюша и является более эффективным по сравнению с бактериологическим.

2. Выявление противококлюшных антител в слюне по реакции

5

агглютинации является дополнительным методом лабораторной диагностики коклюша.

3. Диагностическая тест-система для определения антител к B.pertussis методом иммуноферментного анализа позволяет выявить антитела не только в крови, но и в слюне обследуемых с подозрением на коклш.

Внедрение результатов работы. Подготовлены и направлены для утверждения в МЗ РСФСР методические рекомендации "Новые методы ранней и экспресс-диагностики коклюша". Непрямой имму-нофлюоресцентный метод выявления коклюшных микробов был использован при диагностических исследованиях на коклюш в бактериологической лаборатории ГорСЭС г.Казани; в инфекционной больнице tö I г.Казани и в работе предприятия МНИЛ и кафедры микробиологии Владивостокского медицинского института. Предложения, касающиеся ранних методов диагностики коклюша, использованы в преподавании на кафедре микробиологии Казанского медицинского института, кафедре эпидемиологии Казанского медицинского института , кафедре детских инфекций- Казанского медицинского института, кафедре микробиологии Горьковского медицинского института. Подана заявка на изобретение "Способ диагностики коклюша" J6 4736011/14 «получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства от 28.03.91. Признаны и внедрены 4 рационализаторских предложения: "Способ хранения культуры коклюшного микроба" № 667/28 от 20.05.88 ; "Непрямой метод иммунофлюорес-ценции для определения коклюшного антигена" № 669/30 от 20.05.88; "Усовершенствованный метод непрямой иымунофлюорес-ценции для определения коклюшного антигена" № 668/29 от 4.II.88; "Метод определения противококлюшных агглютининов в слюне" К 781/39 от 20.11.89 .

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых Казанского государственного медицинского института (1984 г.); УШ научно-практической конференции молодых специалистов НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Пасгера (Ленинград, 1986 г.); республиканской научной конференции "Биология возбудителей инфекционных заболеваний и их экспресс-диагностика" (Горький, 1986 г.); заседании Казанского филиала Всесоюзного общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов им.И.И.Мечникова (Казань, 1987 г.); заседании предметно-

6

проблемной комиссии по научным основам профилактики и методов диагностики инфекционных заболеваний при Казанском медицинском институте (1991 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи.

Структура и объем диссертации.. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 8 глав собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций в практику и указателя литературы, включающего 237 источников, из которых 139 иностранных. Работа изложена на 217 страницах, содержит 14 рисунков и 63 таблищ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Проведено комплексное обследование 332 человек, среди которых было 263 ребенка (средний возраст 5 лет 3 месяца) и II взрослых, больных коклюшем и контактировавиих с больными коклюшем; 13 здоровых добровольцев, привитых коклюшной вакциной (средний возраст 32 года) и 45 здоровых детей (средний возраст 4 года 5 месяцев). Все дети, за исключением 22 человек, посещали детские сады или школы. Объектами изучения были образцы слюны и крови, а также материал, забранный тампоном с задней стенки глотки обследуемых.

В работе было исследовано 138 штаммов микроорганизмов. Из'-них 37 музейных и 16 свежёвыделенных штаммов Bordetella pertussis ; 4 музейных и I свеяеввделешшй штамм Bordetella parapertussis ; 3 музеЙНЫХ штамма Bordetella bronchiseptica; 40 атипичных штаммов микроорганизмов, напоминавших по ряду свойств микробы рода бордетелла; 30 шяаммов staphylococcus aureus ■и ПО I штамму Staphylococcus epidermidis, Neisseria flavescens, Escherihia coli, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Corinebacterium xerosis, Coryrisbaeterium pseudodlphtericum, Branhamella catarrhalis ( из КОЛЛ0КЦИЙ

ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи, ГНИИСК им.JI.А.Тарасовича, МНИИЭМ имени Г.Н.Габричевского).

Для получения иммунной коклюшной сыворотки использовали II кроликов породы Шиншилла.

Всего проделано 5359 анализов.

Здоровые добровольцы были привиты двукратно коклюшной вак-

7

циной с интервалом в 15 дней. Забор слюны и крови производили 9 раз: в день первой вакцинации, в день второй вакцинации, через 15, 27, 34, 54, 158, 242 и 359 дней после второй иммунизации. У лиц, обследованных с диагностической целью или по эпидемическим показаниям, парные образцы слюны и сыворотки крови забирали с интервалом в 2 недели; материал из зева -двукратно, через I день. У здоровых детей забор слюны и материала из зева производили однократно.

Выявление противококлюашых антител в слюне проводили по разработанным нами методам: реакции агглютинации (РА) и непрямым методом иммуноферментного анализа (ИФА) с адсорбцией антигена на носителе. Для каждой реакции слюну забирали-в объеме 2-2,5 мл, центрифугировали в течение 20 минут при 3000 об/мин и в надосадочной жидкости определяли уровень антител.

При постановке РА делали двукратные разведения слюны 0,85$ раствором хлорвда натрия, начиная с 1:2 до Ï:I024 в объеме 0,25 мл. Затем в каждую пробирку добавляли по 0,25 мл жидкого коклюшного диагностикума в рабочем разведении ( 10 млрд коклюшных микробов в I мл) производства ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи. В качестве положительного контроля ставили РА коклюшного диагностикума в рабочем разведении с агглютинирующей коклюшной сывороткой в" разведении 1:100 (ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи). Кроме того, ставили контрольные реакции для выявления самоагглютинации используемых в реакции ингредиентов: I) коклюшный диаг-ностикум в.рабочем разведении с 0,85$ раствором хлорида натрия; 2) коклюшная сыворотка в разведении 1:100 с 0,85$ раствором хлорида натрия; 3) испытуемая слюна в двукратных разведениях от 1:2 до 1:32 с 0,85$ раствором хлорида натрия в объеме 0,5 мл.

Все пробирки встряхивали и оставляли при комнатной температуре на 24 часа. Результаты РА учитывали с помощью агглюти-носкопа по четырехкрестовой системе. Тигром антител в слюне считали разведение, в котором отмечалась агглютинация на дна креста при наличии в предыдущих пробирках агглютинации на -три или четыре креста. При выявлении самоагглютинации в контрольных пробирках с исследуемой слюной результат реакции агглютинации считали положительным, если титр антител в опытных пробирках был выше, чем последнее разведение слюны контроль-

8

ного ряда, в котором еще обнаруживались хлопья на три креста.

Метод ИФА ставили с применением диагностической тест-системы, предназначенной для выявления антител к липополисаха-ридному антигену, белковому антигену и дезинтеграту .коклюшного микроба в крови обследуемых (производства. ЦНИИВС имени И.И.Мечникова). Отценгрифугированную слюну разводили двукратно и вносили по 0,2 мл в лунки планшета. Постановку реакции осуществляли согласно инструкции к диагностической тест-системе. Учет реакции проводили с помощь» многоканального фотометра " мшизкап " при длине волны 450 нм. В качестве отрицательного контроля были использованы образцы слюны, не содержащие коклюшных антител, обеспечивающие поглощение окрашенного субстрата не более 0,05. Положительной считали реакцию с образцами слюны в лунках, где показатели оптической плотности окрашенного субстрата были на 0,1 и более выше, чем в лунках с тем же разведением отрицательной контрольной слюны. Учет результатов иммуноферментной реакции производили 2 способами: I) путем определения титров антител за счет-выявления предельных разведений материала, обеспечивающих положительный результат; 2) в единицах оптической плотности - путем определения спектрофотометрических показателей в лунках с начальным разведением исследуемого-материала.

Прогивококлгошные антитела в крови выявляли по реакции агглютинации в соответствии с общепринятой методикой, а также методом ИФА согласно инструкции к диагностической тест-системе.

Материал с задней стенки глотки обследуемых, а также культуры микроорганизмов исследовали разработанным нами непрямым иммунофлюоресцентным методом. Забор материала с задней стенки глотки производили тампоном, смоченным в стерильном 0,85$ растворе хлорида натрия. В пробирку с тампоном добавляли 3-4 стеклянные бусинки диаметром 6,0 мм и 0,15 мл стерильной дистиллированной воды; содержимое пробирки встряхивали в течение I минуты. Готовили 3 препарата: I опытный и 2 для контроля имг.тунологической специфичности, используемые в качестве отрицательного и гологительного контроле!. ■ Для приготовления двух первых препаратов на 2 предметных ¿текла наносили по капле исследуемого субстрата из пробирки. Для приго-

9

товления мазка, используемого в качестве положительного контроля, на предметном стекле готовили мазок из 2-3 суточной культуры музейного штамма B.pertussis в капле дистиллированной воды или из жидкого коклюшного диагностикума в разведении 1:1 0,85$ раствором хлорида натрия (ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи). При постановке I этапа реакции на все препараты наслаивали иммунную коклюшную кроличью сыворотку в разведении 1:100. На 2 этапе два препарата (опытный и положительный контроль) обрабатывала люминвсцирукхцей сывороткой против глобулинов кролика в разведении 1:10 (ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи), а препарат, используемый в качестве отрицательного контроля - люминесцирующей сывороткой против глобулинов лошади в разведении 1:10 (ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи). Для разведения сывороток и промывания црепаратов использовали 0,85$раствор хлорида натрия, забуференный фосфатами (pH 7,2-7,4).

Опытный;препарат просматривали в люминесцентном микроскопе не менее, чем в 50 полях зрения,и при наличии 3-4 и более коккобактерий с ярким изумрудно-зеленым свечением по периферии результат считали положительным. При обнаружении аналогично светящихся микробных клеток в препарате, использованном в качестве отрицательного контроля, результат считали отрицательным.

При постановке' непрямой иммунофлюоресцентной реакции вместо кроличьей иммунной коклюшной сыворотки можно использовать на I этапе-коммерческую коклюшную агглютинирующую ослиную сыворотку, а на 2 - люминесцирующую сыворотку против глобулинов осла, выпускаемые ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи.

Бактериологический анализ проводили в соответствии с "Инструкцией по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклкше" (Москва, 1983).

Статистическую обработку результатов проводили методом критерия знаков и точным методом Фишера (Гублер E.B., 1978), среднюю геометрическую титров антител и среднюю ошибку подсчитывали на микро-ЭВМ "Электроника ДЗ-28".

Результаты исследований

Разработка метода выявления противококлюшных антител по реакции агглютинации (РА) проведена на здоровых добровольцах,

10

привитых коклюшной вакциной. В день первой вакцинации агглютинины в слюне не были обнаружены. В результате иммунизации происходило образование антител, титры которых на различных сроках исследования колебались в пределах от 1:2 до 1:256. На 15 день после первой вакцинации отмечалось существенное накопление агглютининов в слюне, средняя геометрическая обратных величин титров антител составила. 12,9+1,8. Затем наблюдалось постепенное снижение уровня антител и на 54 день после второй вакцинации он достоверно не отличался от исходного, а со 158 дня антитела в слюне по РА не обнаруживались. Таким образом, выявление коклюшных агглютининов в слюне непривитых или привитых на сроках 5 и более месяцев после вакцинации, вероятно, может свидетельствовать о свежем заражении коклюшем.

При обследовании контрольной группы здоровых детей коклюшные агглютинины в слюне не были обнаружены. Поэтому в дальнейших исследованиях положительным результатом у непривитых детей считали обнаружение противококлюшных антител в слюне по РА в любых титрах. У привитых детей результат считали положительным при выявлении динамики титров антител при исследовании гарных образцов слюны или (при однократном обследовании) выявление агглютининов в любых титрах, на сроках, превышающих 5 месяцев от последней прививки АКДС вакциной.

Разработанный метод определения противококлюшных антител в слюне по РА был использован при обследовании 34 больных коклюшем и 39 детей, контактировавших с больными коклюшорл. Про-тивококлюшные агглютинины были обнаружены у 85,3 % больны* п образцах слюны, взятой с I по 14 недели болезни. Титры антител колебались в пределах от 1:4 до 1:256. На 1-2 неделях болезни агглютинины в слюне обнаруживались в 71,4 - 75,0 % случаев. С 3 по 10 недели от начала заболевания - в 80 - 100 % . На более поздних сроках исследования с II по 15 недели болезни (срок наблюдения) антитела были выявлены лишь в I случае (25 %). На первой неделе болезни средняя геометрическая обратных величин титров антител в слюне больных составляла 2,83+ 1,56, .на 2, 3 и 4 неделях наблюдалась тенденция к повышению титров (4,42+1,67; 8,00+1,63; 13,12+1,56, соответственно), максимальное значение титров агглютининов в слюне было отмечено на шестой неделе болезни (45,26+1,82).

II

При параллельном выявлении противококлюшных агглютининов в сыворотке крови больных оказалось, что положительные результаты (динамика тигров антител или титр не ниже 1:80) были отмечены в 85,3 % случаев. Совпадение положительных результатрв исследования обоими методами наблюдалось со 2 по 10 недели болезни и составило 70 %.

Среди детей, контактировавших с больными, противококлюшные агглютинины в слюне были обнаружены у 87,2 % обследованных на сроках от 3 до 13 недели, прошедших после контакта. Титры антител колебались в пределах от 1:2 до 1:256. Средний уровень гит-ров антител в слюне детей, контактировавших с больными, на 3 неделе после контакта был равен 4,00+2,23, на 6' неделе было отмечено максимальное значение (13,46±1,53). При параллельном исследовании сыворотки крови лиц, контактировавших с больными коклшем, агглютинины были обнаружены у всех обследованных (100 %), как у привитых, так и у непривитых детей.

Не обнаружено существенной разницы в количестве положительных результатов выявления антител в слюне по РА у больных и лиц, контактировавших с больными коклюшем, в том числе у привитых и непривитых лиц. Это может косвенно свидетельствовать о весьма интенсивной циркуляции возбудителя коклюша.в организованных детских коллективах, где проводилось обследование, а также о том, что у контактировавших лиц в организме происходит интенсивная иммунологическая перестройка, обеспечивающая в некоторых случаях бессимптомное течение инфекции.

При сравнении метода выявления противококлюшных антител в слюне по РА с традиционными методами диагностики оказалось, что он эффективнее бактериологического (рщф< 0,001) и не уступает по эффективности методу выявления противококлюшных агглютининов в сыворотке крови (Р>0,05). В то же время данный метод обладает существенными преимуществами: он прост в исполнении, не травмирует ребенка, исключает возможность инфицирования вирусами гепатита В и иммунодефицита человека, связанную с нарушением режима стерилизации при многократном , использовании инструментария для забора крови.

Исследования по разработке непрямого иммуноферментного метода выявления антител в слюне к 3 различным антигенным фракциям коклюшного микроба также были проведены на здоровых

12

добровольцах, привитых коклюшной вакциной. Параллельно у данных лиц методом ИФА исследовали содержание противококлюпных антител в крови. Ейло установлено, что как в слюне, так и в сыворотке крови, титры антител к липополисахаридному (ЛПС) антигену коклюшного микроба были существенно ниже, чем к двум' другим антигенным фракциям. При исследовании слюны 36 больных коклюшем протявококлюшные антитела были обнаружены у 75,0 % больных на сроках с I по 14 недели болезни. Титры антител в слюне к ЛПС антигену колебались в пределах от 1:2 до 1:32 ; к белковому антигену и дезинтеграту коклюшного микроба - от 1:2 до 1:256.

При исследовании сыворотки крови тех же больных, методом ИФА во всех образцах были обнаружены антитела ко всем 3 компонентам коклюшного микроба, но юлько в 83,3 % случаев были выявлены антитела к ЛПС антигену в титрах, равных" или превышающих диагностический, установленный Н.В.Цветковой'и др. (1987). Динамика содержания антител как в слюне, так и в крови больных к 3 антигенам была, в основном, однотипной, существенной разницы в содержании антител к ЛПС, белковому антигену и дезинтеграту коклюшного микроба на кавдом сроке болезни не было обнаружено.

Сравнение средних геометрических титров антител на различных сроках исследования в течение 2 месяцев с момента вакцинации или от начала заболевания показало, что в слюне у привитых здоровых добровольцев уровни антител к ЛПС антигену на всех сроках после вакцинации были ниже, чем у больных коклюшем во время болезни (Р<0,025). Содержание антител к двум другим антигенам не различалось. Таким образом, при исследовании слюны методом ИФА у детей, больных коклюшем, наиболее информативным является выявление антител к ЛПС антигену.

При исследовании методом ИФА образцов слюны и крови 39 детей, контактировавших с больными коклюшем, оказалось, что в слюне антитела к 3 антигенам коклюшного микроба были обнаружены, в 79,5 % случаев, а в крови - в 82,0 % случаев титры антител к ЛПС антигену были равны или выше диагностического. Существенных различий в уровнях антител на всех сроках исследования к 3 различным компонентам коклюшного микроба как в слюне, так и в сыворотке крови детей, контактировавших с больными, не

13

наблюдалось.

Сопоставление содержания антител, выявленных по РА и методом ИФА, в слюне у детей, контактировавших с больными коклюшем, но не имевших клинических симптомов заболевания, и у больных с клинически выраженным коклюшем позволило установить, запаздывание в накоплении противококлюшных антител в слюне у больных, что, вероятно, свидетельствует о недостаточности местной защиты тканей дыхательных путей у заболевших детей.

Содержание антител, выявляемых методом ИФА в слюне и сыворотке крови здоровых привитых ладей, больных коклюшем и лиц, контактировавших с больными, определяли также по спектрофото-метрическим показаниям в лунках с исходным разведением исследуемого материала. Сравнение двух способов оценки содержания антител ¡показало, что динамика накопления антител в слюне и сыворотке крови, выраженная в титрах и в единицах оптической плотности, была аналогичной.. Концентрация антител к отдельным антигенам- коклюшного микроба,- выраженная в титрах, на всех сроках исследования соответствовала спектру антител, измеренных в показателях оптической плотности.

В то же время, способ оценки результатов ИФА по спектро-фотометрическим показаниям в лунках с исходным разведением исследуемого материала обладает рядом преимуществ: он позволяет уменьшить расход реактивов и в 8 раз увеличивает количество анализов в. расчете на один планшет диагностической тест-системы для выявления антител к в.pertussis ; уменьшает трудоемкость и сокращает время постановки реакции.

При разработке непрямого иммунофлюоресцентного (НИФ) метода выявления возбудителя коклша было исследовано 52 штамма бордеталл и 38 штаммов других видов микроорганизмов. Микробные клетки 81,8 % штаммов в.pertussis специфически светились на 4+, остальных штаммов - на 3+. Специфическая флюоресценция наблюдалась также при исследовании I штамма в.parapertussis и I штамма B.bronchiseptica , что связано с наличием общих антигенов с в.pertussis , а также 2 штаммов s.aureus. Для дифференцировки микробных клеток в.pertussis и s.aureus наиболее информативной оказалась контрольная реакция с использованием на П этапе гетерологичной люминесцирутощей сыворотки

14

(против глобулинов лошади).

НИФ методом было исследовано также 40 музейных и свежевы-деленных при обследовании на коклюш штаммов, отличающихся по некоторым свойствам от B.pertussis .Установлено, что микробы, отличающиеся от возбудителя коклюша по культуральным свойствам, но сходные по морфологическим и антигенным, в основном, идентифицируются, как B.pertussis . Микробы, дащие положительную реакцию с агглютинирующими коклюшной и паракоклюшной сыворотками, но не способные агглютинироваться диагностическими адсорбированными коклюшной и паракоклюшной сыворотками к аггяю-тиногенам (факторам) 1,2,3 и 14 с помощью НИФ метода не были идентифицированы как возбудители коклюша. Штаммы, дававшие спонтанную агглютинацию с 0,85$раствором хлорида натрия, по результатам НИФ метода также не были отнесены к B.pertussis.

Шли исследованы также НИФ методом 9 вариантов различных штаммов B.pertussis , полученных путем длительного культивирования (25-30 пассажей) исходных штаммов на среде КУА с субтоксическими дозами антибиотиков,и 3 варианта, полученных при длительном пассировании на среде КУА с добавлением иммунных коклюшной и паракоклюшной сывороток. Несмотря на то, что некоторые варианты отличались по морфологическим, культуральным, антигенным, патогенным свойствам от'возбудителя коклша, все они были идентифицированы как B.pertussis.

Шло проделано несколько серий опытов с использованием различных вариантов постановки НИФ метода.

При проведении исследований, в которых НИФ реакция ставилась со смывом 5-суточной культуры первичного посева на среде КУА материала с задней стенки глотки больных коклюшем и лиц, контактировавших с ними, выявлена существенная разница в количестве положительных результатов НИФ и бактериологического методов (34,0 % и 17,0 %, соответственно, Р<0,025).

В следующей серии опытов выявление коклюшных бактерий НИФ методом проводили в накопительных культурах после подращивания материала с задней стенки глотки в жидкой полусинтетической среде, содержащей ионообменные смолы, а также в смывах со среды КУА посевов накопительных культур после дополнительного подращивания. Коклюшные микробы были выявлены у 100 % обследованных больных (на 1-5 неделях болезни) и 72,2 % детей, кон-

15

тактировавших с больным коклюшем за 31 день до обследования.

Наиболее высокая выявляемость возбудителя коклюша у больных наблюдалась при подращивании исследуемого материала в жидкой питательной среде в течение 48 часов с дополнительным подращиванием на среде КУА в течение 24 часов, а у контактировавших с больным - при подращивании на жидкой питательной среде влечение 24 часов, обнаружены статистически достоверные различия в количестве положительных результатов по сравнению с исследованием смывов первичных посевов патологического материала со среды КУА после .5-7 суточного культивирования (Р<0,05) и бактериологическим обследованием (Р<0,05).

Поскольку для практического здравоохранения большое значение имеет экспресс-диагностика коклюша, разрабатывался НИФ метод выявления коклюшных микробов непосредственно в материале с задней стенки глотки обследуемых.

В модельных опытах с музейными штаммами в.pertussis и при обследовании 106 больных и лиц, контактировавших с больными, был отработан оптимальный режим забора материала, приготовления микропрепаратов и постановки НИФ метода. При исследовании разработанным НИФ методом здоровых детей в 10,3 % случаев в материале из зева был обнаружен возбудитель коклюша, что согласуется с данными других исследователей о наличии"здорового бактерионосительства или бессимптомно протекающей инфекции.

Коклюшные бактерии были выявлены с помощью НИФ метода в 66,1$ случаев при обследовании 59 больных на сроках с I по 10 надели болезни и в 56,8 % случаев - у 44 детей, исследованных на 3-II неделях, прошедших со дня контакта.'Не обнаружено существенной разницы в количестве положительных результатов у больных и лиц, контактировавших с ними, а также у непривитых и привитых АКДС вакциной детей, что свидетельствует о широком распространении возбудителя коклюша в организованных детских коллективах, где проводилось обследование.

При комплексном параллельном обследовании больных коклюшем 7 методами (НИФ, бактериологическим, обнаружения антител в слюне по РА и ИФА, обнаружения антител в крови по РА и ИФА, выявления клинических симптомов) оказалось, что все положительные результаты исследования НИФ методом подтверждены ре-

16

зультагами 3-6 других методов (прячем в 70,8 % случаев - 5-6 методов); отрицательные - результатами 1-4 методов. При комплексном обследовании детей, контактировавших с больными коклюшем, как положительные, так и отрицательные результаты НИФ метода во всех случаях подтверждены результатами 1-6 других методов.

Сравнение результатов исследования НИ® и другими методами показало, что НИФ метод чувствительнее бактериологического, как при обследовании больных (66,1 % и 13,6 %, соответственно, Р<0,01), так и при обследовании детей, контактировавших с больными (59,1 % и 9,1 %, соответственно, Р<0,01) и не уступает по эффективности методам выявления антител в слюне больных по РА (78,7 %) и ИФА (75,0 %). Чувствительность НИФ метода ниже, чем метода выявления антител в крови по РА и ИФА на поздних сроках болезни или контакта (более 3 недель).

В результате проведенных исследований рекомендована схема комплексного обследования на коклюш, обеспечивающая наиболее эффективную диагностику заболевания.

Схема комплексного обследования на коклюш

1-е сутки. I. Забор материала с задней стенки глотки и исследование его НИФ методом. Выдача положительного ответа.

2. Забор слюны и постановка реакции агглютинации и ИФА. Выдача результата исследования йетодом ИФА. 3. Забор материала для бактериологического исследования. .Посев его на среды выращивания и инкубирование при 35-37 °С.

2-е сутки. I. Учет результатов реакции агглютинации со слюной. Выдача положительного результата.

,х 3-й сутки. I. Изучение колоний на средах выращивания с помощью стереоскопического микроскопа и отсев подозрительных колоний для получения чистой культуры. 2. При наличии большого количества подозрительных.колоний на среде выращивания : а) исследование колоний НИФ методом. Выдача положительного ответа ; б) продолжение бактериологического исследования согласно инструкции.

4-е сутки. I. Исследование НИФ методом выделенной чистой культуры. Выдача положительного ответа. 2. Продолжение бактериологического исследования согласно инструкции,

5-е сутки. I. Продолжение бактериологического исследования. 2. В .случае отрицательного ответа бактериологического

17

исследования производится исследование НИФ методом смыва Ъсех колоний со среды выращивания. Выдача ответа.

Серологическое исследование (выявление антител по реакции агглютинации в сыворотке крови) производится согласно инструкции.

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработан метод обнаружения противококлюшных антител в слюне по реакции агглютинации. Коклюшные агглютинины в слюне привитых обнаруживаются в течение 2 месяцев после завершения иммунизации. У больных коклюшем они определяются на сроках с I по 14 недели болезни, а у лиц, контактировавших с больными коклюшем, с 3 по 13 недели с момента контакта (срок исследования). Метод может быть использован в качестве дополнительного способа диагностики коклюша.

2. Показано отсутствие существенных различий в содержании коклюшных агглютининов как в слюне, так и сыворотке крови больных и детей, контактировавших с больными, что свидетельствует

о весьма интенсивной циркуляции возбудителя коклюша в организованных детских коллективах, а также о том, что у контактировавших лиц в организме происходит интенсивная иммунологическая перестройка, которая в ряде случаев обеспечивает бессимптомное течение инфекции.

3. Метод выявления противококлюшных антител в слюне больных коклюшем по реакции агглютинации более эффективен, чем бактериологический на всех сроках болезни или контакта и не отличается по эффективности от серологического метода (реакции агглютинации в сыворотке крови). В то же время данный метод позволяет избегать негативных моментов, связанных с забором крови.

4. Разработан непрямой иммуноферментный метод выявления противококлюшных антител в слюне обследуемых с помощью диагностической тест-системы, предназначенной для обнаружения противококлюшных антител в сыворотке крови, который может быть использован в качестве дополнительного при диагностике коклюша. При исследовании методом ИФА слюны больных коклюшем наиболее информативным является выявление антител к ЛПС антигену коклюшного микроба. Учет результатов иммуноферментной реакции

целесообразно проводить путем определения спектрофотометриче-ских показателей в лунках с начальным разведением слюны.

5. Выявление антител по реакции агглютинации и методом ИФА позволило установить запаздывание в накоплении противококлюш-ных антител в слюне больных по сравнению с детьми, контактировавшими с больными, но не имеющими клинических симптомов болезни, что, по-видимому, является проявлением недостаточности местного иммунитета, обусловливающей развитие острой инфекции.

6. Впервые разработан высокочувствительный и специфичный непрямой иммунофлюоресцентный метод для экспресс-диагностики коклюша, по выявлению коклюшных микробов в препаратах, приготовленных из материала, взятого тампоном с задней стенки глотки, как на ранних, так и на поздних сроках болезни.

7. Разработанный непрямой иммунофлюоресцентный метод может быть использован для идентификации выделенных культур в процессе бактериологического исследования на коклюш; при наделении-атипичных штаммбв у больных, лечившихся антибиотиками, привитых и на поздних сроках болезни;, а также для исследования смывов 5-7 суточных первичных посевов со среды КУА при отрицательных результатах бактериологического обследования.

8. Предварительное подращивание материала с задней стенки глотки обследуемых на жидкой -питательной среде с ионообменными смолами обеспечивает большую выявляемость- коклюшных бактерий непрямым иммунофлюоресцентным методом по сравнению с исследованием смывов первичных посевов со среды КУА без дополнительного подращивания.

9. При исследовании материала от больных и лиц, контактировавших с больными, НИФ метод чувствительнее-бактериологического и не уступает по эффективности методам выявления антител в слюне больных по реакции агглютинации и методом ИФА. На поздних сроках обследования чувствительность непрямого иммуно-флюоресцентного метода ниже, чем метода выявления антител в крови по реакции агглютинации и ИФА.

РЕКОМЕНДАЦИИ В ПРАКТИКУ

I. Разработанный метод выявления противококлшных антител в слюне по реакции агглютинации рекомендуется использовать э качестве дополнительного способа диагностики коклюша как на ранних, так я на поздних сроках исследования.

19

2. Диагностическая иммуноферментная тест-система, разработанная для выявления антител к B.pertussis в крови, может быть использована для выявления противококлюшных антител в слюне обследуемых при-диагностике коклюша. Учет результатов иммуноферментной реакции целесообразно проводить путем определения спектрофотометрических показателей в лунках с начальным разведением исследуемого материала.

3. Разработанный непрямой иммунофлюоресцентный метод выявления коклюшных микробов в материале с задней стенки глотки обследуемых рекомендуется.использовать для экспресс-диагностики коклюша, а также для идентификации выделенных культур в процессе бактериологического исследования, при выделении атипичных штаммов и для исследования смывов 5-7 суточных первичных посевов со среды КУА при отрицательных результатах бактериологического обследования.

4. Для диагностики коклюша рекомендуется схема комплексного обследования, включающая непрямой иммунофлюоресцентный и бактериологический методы выявления коклюшных микробов в материале" с задней стенки глотки обследуемых и способы обнаружения антител в слюне по реакции агглютинации и с помощью ИФА.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Амфитеатрова Н.Ф..Булатов Н.М..Савинова А.II., Низамова Н.Ю..Борисенко Ю.В. Динамика противококлюшных антител в слюне и сыворотке крови вакцинированных доноров // Казан, мед. журн - 1987. -14. - С.308-311.

2. Амфитеатрова Н.Ф..Савинова А.Н..Амерханова H.H. Разработка непрямого иммунофлюоресцентного метода для выявления во будителя коклюша // Казан.мед.ин-т. Казань,1989.- II е.- Деп. в ВИНИТИ 19.01.90, й 399-В90 (РЖ, 1990, 04,№ 5,- реф. 5Ц397).

3. Амфитеатрова Н.Ф..Савинова А.Н. Исследование непрямым иммунофлюорэсцентным методом музейных и свежевыделенных атипичных штаммов B.pertussis // Казан.мед.ин-т. Казань, 1989.9 е.- Деп. в ВИНИТИ 19.01.90, Ji 400-В90 (PS, 1990, 04, Л 5, реф. 5Ц37 ).

4. Амфитеатрова Н.Ф..Савинова А.Н..Амерханова Н.Н; Применение непрямого иммунофлюоресцентного метода для выявления B.pertussis при диагностике коклюша // Казан, мед.ин-т. Казань, 1990.- 14 с. - Деи. в ВИНИТИ 10.05.90, Jfc I942-B90 (PK, 1990, 04, № 9, реф. 8Ц339).

Сдано в набор 08.08.91 г. 'Подписано в печать 01.08.91 г. Форл.бум. 60 х 84 1/16. Печ.л. I. Тираж 100. Заказ 450.

Бесплатно.

Лаборатория оперативной полиграфии КГУ 420008 Казань, Ленина, 4/5