Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунобиологическая характеристика бесклеточной коклюшной вакцины

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Иммунобиологическая характеристика бесклеточной коклюшной вакцины"

На правах руЙЬпиеи

УСТЮГОВ Яков Юрьевич

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БЕСКЛЕТОЧНОЙ КОКЛЮШНОЙ ВАКЦИНЫ

03 00 07 Микробиология 14.00 36 Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 2008

1 6 ОПТ 2008

003448811

Работа выполнена в лаборатории экологической иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь и в лаборатории комбинированных вакцин филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ «Пермское НПО «Биомед»

Научные руководители:

доктор биологических наук Николаева Алла Максимовна кандидат медицинских наук, доцент Шилов Юрий Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Маслов Юрий Николаевич

доктор биологических наук, профессор Ребров Анатолий Яковлевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-петербургская педиатрическая медицинская академия»

диссертационного coi ,, в Институте экологии и генетики

микроорганизмов УрО РАН по адресу 614081, г Пермь, ул Голева, 13 Факс (342) 244 67 11.

Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http /www iegm.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан "_"_2008 г

Защита состоится

2008 г, в часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета л

кандидат биологических наук ал/7 л лЛ Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Заболеваемость коклюшем остается серьезной проблемой не только российского, но и зарубежного здравоохранения Ежегодно в мире заболевает коклюшем около 60 млн человек, а умирает от него около 1 млн (Селезнева и др, 2002)

Многолетняя практика применения АКДС-вакцины, содержащей цельно-клеточный коклюшный компонент, доказала его профилактическую эффективность При достаточно высоком охвате вакцинацией, АКДС обеспечивает защиту более 85% привитых (Чупринина и др, 2005) Однако цельноклеточная коклюшная вакцина при всех ее положительных свойствах является одним из наиболее реактогенных препаратов, включенных в национальные календари прививок разных стран (Mattoo, Cherry, 2005) Накоплены данные о разнообразных проявлениях реактогенности АКДС-вакцины, обусловленных цельно-клеточным коклюшным компонентом (Медуницын, 2004, Сухинин, 2005) Потребность в менее реактогенном препарате послужила основанием для разработки вакцин нового поколения на основе протективных антигенов Bordetella pertussis Первая бесклеточная коклюшная вакцина была зарегистрирована в Японии в 1981 г В последующем в Европе и США было создано более 20 подобных препаратов, отличающихся по составу антигенов, методам очистки, методу инактивации токсина, адьювантам (Капио и др, 2005) Некоторые из них в виде монопрепарата или компонента комбинированных вакцин стали коммерческими, зарегистрированы и применяются на практике во многих странах, включая Россию Отечественные бесклеточные коклюшные компонеты вакцины АКДС (Захарова и др, 1998, Москаленко и др, 2001) пока не вышли из стадии научно-исследовательской разработки

Известные бесклеточные коклюшные вакцины содержат в своем составе от 1 до 5 и более протективных антигенов Тем не менее, вопрос об оптимальном составе бесклеточных коклюшных вакцин не решен, поскольку представляется неясным, какие именно составляющие являются ведущими в формировании противококлюшного иммунитета В связи с этим представляется необходимой максимально полная доклиническая оценка потенциальных кандидатов в вакцины календаря прививок в сравнении с цельноклеточным аналогом, эпидемиологическая эффективность которого подтверждена сорокалетней практикой В Пермском филиале ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» на основе базовых исследований ЛИ Райхера с сотрудниками (1970-1989 гг) разработана технология получения бесклеточного коклюшного препарата на основе комплекса соматических антигенов коклюшного микроба (патент РФ 2332231)

Целью настоящей работы явилось проведение лабораторио-экспериментального (доклинического) исследования иммунобиологических свойств разработанного бесклеточного коклюшного препарата

Основные задачи исследования

1 Оценить токсичность и аллергизирующее действие бесклеточного коклюшного препарата

2 Изучить иммуногенность бесклеточного коклюшного препарата на экспериментальных животных

3 Сконструировать комбинированную вакцину для профилактики дифтерии, столбняка и коклюша с использованием бесклеточного коклюшного компонента и оценить ее иммуногенность на экспериментальных животных

Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка токсичности и иммуногенной активности отечественного бесклеточного коклюшного препарата в сравнении с используемой цельноклеточной вакциной В экспериментах показано отсутствие у бесклеточной коклюшной вакцины токсичности, аллер-гизирующей, гистаминсенсибилизирующей и лейкоцитозстимулирующей активностей Новая бесклеточная коклюшная вакцина подобно цельноклеточной защищает мышей от интрацеребрального заражения вирулентным штаммом Bordetella pertussis 18323, вызывает образование специфических антител, повышает пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с коклюшной суспензией, обеспечивает протективную активность в тесте сингенного переноса спле-ноцитов Протективная активность и аффинность антител, образующихся в ответ на иммунизацию бесклеточным и цельноклеточным препаратами, оказались сходными Пролиферативный ответ лимфоцитов in vitro на фитогемагглютинин после иммунизации бесклеточной коклюшной вакциной выше, чем после иммунизации цельноклеточной Патоморфологические исследования показали значительно меньшую степень выраженности вторичной альтерации в тесте гиперчувствительности при введении бесклеточного препарата

Теоретическое и практическое значение работы.

Полученные результаты уточняют представления о природе приобретенной противококлюшной резистентности Принципиально важно, что новая бесклеточная коклюшная вакцина обладает сходной с традиционной цельноклеточной вакциной протективной активностью и иммуногенностью при меньшей токсичности

Проведенные исследования - существенная часть доклинических испытаний новых вакцин на пути их продвижения в практику, в частности, для представления в Государственный Институт стандартизации и контроля им JIИ Тарасевича Результаты исследований используются в лекционных курсах "Иммунология", "Экспериментальная иммунопатология и иммунотерапия" кафедры микробиологии и иммунологии ГОУ ВПО "Пермский государственный университет" (614600, г Пермь, ул Букирева, 15) В лекционном курсе «Биотехнология» кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии ГОУ ВПО "Пермская государственная фармацевтическая академия" (614990, г Пермь, ул Ленина, 48)

Основные положения, выносимые на защиту

1 Бесклеточный коклюшный препарат обладает более низкой токсичностью и аллергизирующей активностью в сравнении с цельноклеточной вакциной

2 Новая бесклеточная коклюшная вакцина подобно цельноклеточной защищает мышей от интрацеребрального заражения вирулентным штаммом Bordetella pertussis 18323 и формирует клетки иммунологической памяти, которые функционируют при сингенном переносе протективного иммунитета

3 Бесклеточная и традиционная цельноклеточная коклюшные вакцины обладают сопоставимой способностью к индукции иммунного ответа Стимулирующее влияние бесклеточного препарата на пролиферацию Т-лимфоцитов в культурах с фитогемагтлютинином более выражено, а проявления вторичной альтерации при реакции гиперчувствительности менее значительны

4 Замена в вакцине АКДС цельноклеточного коклюшного компонента на новый бесклеточный создает новую комбинированную вакцину, которая не уступает традиционной по иммуногенной активности

Апробация работы и публикации. Основные положения работы доложены на Межрегиональной конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 2002, Международной конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века», Пущино, 2004, Международной научной конференции «Студент и научно-технический прогресс», Новосибирск, 2005, Всероссийской научно-практической конференции «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», Пермь, 2008, Объединенном иммунологическом форуме, Санкт-Петербург, 2008 По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 118 стр машинописного текста, содержит 28 таблиц и 10 рисунков Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав экспериментальных исследований, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 149 источников литературы, из них 37 отечественных и 112 иностранных авторов

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с основным планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (номер госрегистрации темы 01 9 70 009928) и Филиала государственного унитарного предприятия «НПО «Микроген» Мин-здравсоцразвития РФ «Пермское НПО «Биомед»

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы.

Вакцинные препараты. В работе использовали бесклеточный и цельно-клеточный коклюшные препараты производства филиала ФГУП НПО «Микро-ген» «Пермское НПО «Биомед» (рис 1 )

Рис 1 Схема получения целыгоклеточного и бесклеточного коклюшных препаратов.

Кроме того, в работе использованы коммерческие комбинированные вакцины АКДС, содержащая цельноклеточный коклюшный компонент, и Инфан-рикс (ГласкоСмитКляйн, Бельгия) с бесклеточным коклюшным компонентом, а также экспериментальная вакцина аАКДС, в которой цельноклеточный коклюшный компонент был заменен на бесклеточный В работе были использованы следующие отраслевые стандарты ОСО-3 (иммуногенности коклюшной ва-кины), ОСО-5 (гистаминсенсибилизирующей активность коклюшной вакцины) Экспериментальные животные. Экспериментальные исследования в системе in vivo выполнены на 600 белых аутбредных мышах-самцах массой 1618 г (цех лабораторных животных филиала «Пермское НПО «Биомед»), 640 самцах-гибридах первого поколения мышей линий (CBAxC57BL/J6)Fi (Питомник РАМН «Столбовая») массой 10 - 12 г, 200 самцах мышей линии BALB/c (Питомник РАМН «Столбовая») массой 14 - 16 г, 150 нелинейных морских свинках массой 250 - 300 г Животных содержали в условиях лабораторного вивария на стандартной диете

Токсичность и аллергизирующая активность. Опыты по исследованию острой и хронической токсичности препарата проводили согласно основным положениям РД 42-28-8-89 «Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов» (М, 1989)

Исследование токсичности в тесте изменения массы мышей, определение гистаминсенсибилизирующей и лейкоцитозстимулирующей активности прово-

дили согласно «Инструкции по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий» (М , 1987)

Аллергизирующее действие препарата оценивали в тесте гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ) Мышам вводили внутрибрюшинно вакцинную дозу цельноклеточного (10 млрд) и бесклеточного препаратов (0,15 мг) Через 7 суток вводили удвоенную дозу препаратов, учет числа выживших животных вели через 24 ч после повторного введения

Протективную активность коклюшных препаратов определяли в тесте внутримозгового заражения иммунизированных мышей вирулентным штаммом В pertussis 18323 Заражающая доза вирулентного штамма составляла не менее 100 LDso

Гуморальный иммунный ответ оценивали в опытах на морских свинках и кроликах Титр коклюшных антител в сыворотках животных определяли в реакции агглютинации (РА) и с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем, разработанных в филиале ФГУП НПО «Микро-ген» «Пермское НПО «Биомед» (Николаева, 2003)

Протективную активность коклюшных антител оценивали в реакциях пассивной защиты и нейтрализации Тест пассивной защиты проводили на белых аутбредных мышах, которым предварительно вводили внутривенно различные разведения сывороток, определяя дозу сыворотки (ЕД50), защищающей 50% мышей от заражения 450-500 LD50 вирулентного штамма В pertussis 18323 Реакцию нейтрализации проводили по следующей схеме последовательные разведения вирулентного штамма В pertussis 18323 инкубировали с сыворотками в течение 30 мин, затем интрацеребрально вводили белым аутбредным мышам Рассчитывали число LD50 штамма В pertussis 18323, нейтрализуемого сывороткой Аффинность антител оценивали иммуноферментным методом, используя для отмывки 8М раствор мочевины (Kashanian et al, 2008) Индекс аффинности (ИА) рассчитывали по формуле ИА= (ОП2/ОП1) х 100%, где ОП1 -оптическая плотность лунок промытых буферным раствором, ОП2 - оптическая плотность лунок промытых раствором мочевины

Пролиферативный ответ лимфоцитов. Выраженность иммунного ответа по пролиферативной активности лимфоцитов крови оценивали в культуре клеток, содержащей 2x105 лейкоцитов/лунку, общий объем культуры - 0,2 мл В качестве антигена использовали коклюшную суспензию в концентрации 50 млрд/мл Через 72 ч учитывали включение 3Н-тимидина на счетчике Wallac 1414 WinSpectral DSA Guardian (США) в подразделении радиоизотопных исследований аналитической лаборатории ИЭГМ УрО РАН Для дополнительной оценки иммуномодулирующего действия вакцинных препаратов у тех же животных проводили оценку бласттрансформации лимфоцитов в культурах с фи-тогемагглютинином-П (ФГА, Sigma, L-9132, США в концентрациях 5, 10, 20 мкг/мл)

Адоптивный перенос иммунитета. Способность к накоплению клеток иммунологической памяти и эффекторных клеток характеризовали тесте адоптивного переноса иммунитета на мышах линии BALB/c Спленоциты мышей-доноров, полученные на 14-е сутки после однократного введения препаратов в вакцинной дозе, вводили мышам-реципиентам внутрибрюшинно в дозе ЗхЮ6 клеток На следующие сутки животных-реципиентов заражали вирулентной культурой В pertussis 18323 (100 LD50) Через 14 суток определяли процент выживаемости в группах животных

Гиперчувствительность замедленного типа. С учетом важной роли реакций Thl-типа в иммунитете при коклюше исследовали способность вакцинных препаратов к индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) При постановке ГЗТ вакцины вводили в подушечку стопы правой лапы в объеме 0,03 мл, в левую стопу вводили аналогичное количество изотонического раствора натрия хлорида Повторное введение осуществляли через 7 суток Учет результатов проводили через 24 ч по степени выраженности иммунного воспаления Рассчитывали индекс реакции по формуле (PD- Рк)/РкхЮ0%=ИР, где Ро - показатели массы и толщины в опытной конечности, Рк - то же в контрольной конечности Исследование патоморфологических изменений проводили совместно с зав кафедрой патологической анатомии ГОУ ВПО "Пермская государственная медицинская академия им акад Е А Вагнера", д м н, профессором Г Г Фрейнд и к м н , доцентом той же кафедры А Н Крючковым Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином Для дополнительной оценки возможности развития других типов реакций гиперчувствительности исследовали выраженность воспаления через 6 ч после разрешающей инъекции антигена

Статистический анализ результатов. Полученный материал обрабатывали с помощью методов вариационной статистики Результаты в большинстве таблиц и на рисунках представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±ш) Достоверность различий между двумя группами оценивали по непарному i-критерию Стьюдента При множественных сравнениях использовали критерий Ньюмена-Кейлса Различия или показатели связи считались значимыми при р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение токсичности и аллергизирующего действия бесклеточной коклюшной вакцины

При изучении бесклеточной коклюшной вакцины в тесте острой токсичности установлено, что при однократном внутрибрюшинном введении белым мышам и морским свинкам вакцинной дозы препарата не наблюдается снижения массы тела, образования воспалительных экссудатов, некробиотических

изменений Применение бесклеточной вакцины при ежедневном внутримышечном введении в течение 10 дней в суммарной дозе 5,46 мкг для белых мышей, 36,56 мкг для морских свинок не вызывает гибели животных, изменения поведенческой и двигательной активности, снижения массы тела, что свидетельствует об отсутствии токсического действия препарата

Согласно требованиям ВОЗ проведена сравнительная оценка токсичности бесклеточного и цельноклеточного коклюшных препаратов в тесте изменения массы мышей Полученные результаты показывают, что все изученные вакцины соответствуют требованиям, предъявляемым к препаратам данного класса прирост массы по отношению к контрольным животным составляет более 60% (табл 1) В группе животных, получавших бесклеточный препарат, прирост массы выше, чем в группе животных, в которой использовали цельноклеточный препарат, что позволяет сделать вывод о меньшей токсичности бесклеточного препарата (р<0,05)

Таблица 1

Характеристика токсических свойств бесклеточной вакцины в тестах изменения массы мышей и лейкоцитозстимулирующей активности

Относительный Число лейкоцитов х 103/мл

о о, прирост, %

С й 1 £ бескле- корпуску- бескле- корпус- 0,9%

Н £> & «» й С точная лярная точная кулярная рас- ОСО-

вакцина вакцина вакцина вакцина твор 3

ЫаС1

1 111,0 91,8 5,76 19,36 4,50 22,72

2 100,9 85,7 4,64 20,48 3,00 21,44

3 101,0 87,0 3,68 20,00 4,12 24,96

4 93,7 90,4 5,44 24,00 3,75 47,36

5 97,8 76,1 6,08 19,36 5,44 23,68

6 100,2 73,4 3,68 23,52 4,25 30,40,

7 95,7 72,1 4,48 19,20 3,70 22,40

8 110,0 69,3 4,16 12,16 4,52 21,76

9 - - 5,12 17,76 3,16 29,28

10 - - 7,84 23,52 4,86 30,88

М±ш 101,3 80,7± 5,1± 19,9±1,2 4,1 ±0,3 27,5±

±2,2 2,3 0,3 2,7

ЛСА* - - 0,19 0,73 0,15 -

Примечание * - лейкоцитозстимулирующая активность по отношению к от-

раслевому стандартному образцу (ОСО-3)

Одной из характеристик токсичности коклюшных вакцинных препаратов является их способность вызывать лейкоцитоз, что связано с наличием недо-обезвреженного коклюшного токсина Как видно из табл 1, введение бесклеточного препарата практически не вызывает увеличения количества лейкоцитов В сравнении с цельноклеточной вакциной и отраслевым стандартным образцом (ОСО-5), бесклеточная вакцина не проявляет фармакотоксическую гис-таминсенсибилизирующую активность, также обусловленную недообезврежен-ным коклюшным токсином

Из представленных данных видно (табл 2), что не одна из изученных доз бесклеточного препарата не вызывает сенсибилизации к действию гистамина

Таблица 2

Гистаминсеисибилизирующая активность исследуемых препаратов

Препарат Разведение Количество животных в опыте

взято выживших

20 МОЕ/мл 5 0

ОСО-5 5 МОЕ/мл 5 1

1 МОЕ/мл 5 3

Бесклеточный 1 мг/мл 0,2 мг/мл 5 5 5 5

0,04 мг/мл 5 5

20 МОЕ-1мл 5 2

Цельноклеточный 5 МОЕ - 1мл 5 4

1 МОЕ- 1мл 5 5

Применение вакцинных препаратов может приводить к развитию сенсибилизации и аллергических реакций немедленного типа Установлено, что сенсибилизирующий эффект бесклеточного препарата значимо меньше, в сравнении с цельноклеточной вакциной (табл 3)

Таблица 3

Аллергизирующее действие коклюшных препаратов

Препарат Выживаемость (%) в тесте ГНТ

Бесклеточный 100,0

Цельноклеточный 27,7*

Примечание *-р<0,01 по/-критерию Стьюдента для долей

Исследование иммуногеннон активности бесклеточного коклюшного препарата

Бесклеточная коклюшная вакцина проявляет стабильную протективную активность, которая, судя по доле выживших иммунизированных и зараженных в мозг мышей, не уступает активности целыюклеточного препарата (табл 4)

Таблица 4

Сравнительная оценка протективиой активности коклюшных вакцин

№ серии препарата Выживаемость, %

цельноклеточный препарат бесклеточный препарат

1 62,5 100,0

2 75,0 88,2

3 83,3 87,5

4 62,5 75,0

5 93,3 83,3

6 76,9 93,3

7 81,3 93,8

8 87,5 86,6

М±т 77,8±4,5 88,5±3,1

Примечание В каждой группе исходно 14 мышей При определении выживших исключали мышей, павших в течение первых 72 ч после заражения

Способность к накоплению клеток иммунологической памяти и эффек-торных клеток характеризовали в тесте адоптивного переноса иммунитета Адоптивный перенос противококлюшного иммунитета был воспроизведен как с цельноклеточной, так и с бесклеточной вакцинами (табл 5) Однако перенос спленоцитов от доноров, получивших гель алюминия гидроксида без вакцины, не вызывал у мышей-реципиентов резистентность к внутримозговому заражению коклюшными бактериями

Таблица 5

Показатель выживаемости в тесте адоптивного переноса иммунитета

Препарат Число реци- Число живот- Число вы- Процент вы-

пиентов ных павших живших жи- живае-

вследствие вотных мости

неспецифической гибели

Корпуску- 14 4 7 70

лярный Бес клеточ- 14 2 8 66,6

ный

Гель А1(ОН)з 14 4 0 0

Полученные данные указывают на то, что при иммунизации исследуемыми коклюшными препаратами формируется состояние иммунной резистентности, защищающее животных-реципиентов от интрацеребрального заражения вирулентной культурой В pertussis 18323

Иммунизация экспериментальных животных бесклеточной коклюшной вакциной вызывает образование антител, которое по титрам в РА и ИФА не отличается от ответа на цельноклеточную (табл 6)

Таблица 6

Уровень антител в сыворотках крови морских свинок, иммунизированных бесклеточным, цельиоклеточным препаратами и ОСО-3

Уровень антител (средняя геометрическая титра)

после первой прививки после второй прививки

я & РА* ИФА** РА* ИФА**

С <D бескле- корпус- бесклеточ- корпус-

О, С точныи кулярный ныи им- кулярный

иммуно- иммуно- муно- иммуно-

сорбент сорбент сорбент сорбент

Бескле- 174,5 92,9 47,8 1522,19 228,5 221,1

точный [71,1- [51,8- [21,3- [643,7- [166,6- [159,4-

428,3] 166,9] 107,3] 3599,4] 213,4] 306,6]

Корпус- 190,3 70,88 52,6 [15,5- 1522,19 216,6 206,1

куляр- [35,2- [19,2- 178,9] [725,3- [122,4- [123,5-

ный 1027,2] 261,2] 3194,5] 383,4] 343,9]

ОСО-3 439,1 47,7 46,5 [19,6- 1076,35 138,9 219,2

[85,2- [15,8- 110,7] [373,0- [77,2- [143,2-

2262,9] 143,8] 3105,81 150,1] 335,61

* - величина обратная разведению, ** - условные иммуноферментные единицы

Можно с уверенностью предполагать сходство репертуара специфично-стей образующихся антител Сыворотки кроликов, иммунизированных бесклеточной коклюшной вакциной пассивно защищают мышей также, как сыворотки кроликов, иммунизированных цельноклеточной (табл 7), однако уступают последним в опытах нейтрализации заражающей дозы В pertussis in vitro (табл 7) Как видно из табл 7, ЕД50 сывороток кроликов, иммунизированных как бесклеточной, так и цельноклеточной вакциной, равна 0,029 мл Максимальная доза (0,5 мл) сыворотки кроликов, иммунизированных бесклеточной вакциной нейтрализует in vitro 22,34 LD50 В pertussis, в то же время сыворотка кроликов, иммунизированных цельноклеточной вакциной нейтрализует in vitro 58,77 LD50 Установлено, что аффинность антител, вырабатываемых при использовании цельноклеточного и бесклеточного препарата, не отличается (табл 8)

Таблица 7

Характеристика протективных свойств противоколюшных сывороток в тестах пассивной защиты н реакции нейтрализации

Препарат Пассивная защита Реакция нейтрализации

объем сыворотки количество животных в опыте количество выживших животных ЕД5О, мл кол-во клеток количество животных в опыте количество выживших животных Кол-во 1Л>50"

Бесклеточная 1 10 8 0,029 100000 10 0

вакцина 0,2 10 5 20000 10 3

0,004 10 4 4000 10 8 22,34

0,0008 10 0 800 10 7

160 10 9

Корпускулярная 1 10 7 0,029 100000 10 3

вакцина 0,2 10 5 20000 10 5

0,004 10 3 4000 10 7 58,77

0,0008 10 2 800 10 8

160 10 10

Неиммунная 1 10 2 100000 10 0

сыворотка 0,2 10 1 20000 10 0

0,004 10 0 - 4000 10 1 -

0,0008 10 0 800 10 3

160 10 6

Таблица 8

Сравнительная оценка аффинности антител

Иммуносорбент Индекс аффинности, %

антитела к цельноклеточ- антитела к бесклеточному

ному препарату препарату

Цельноклеточный Бесклеточный 85,0±4,1 74,3±6,1 73,2±6,2 84,3±4,3

Учитывая важную роль клеточного звена иммунного ответа, в развитии противококлюшного иммунитета, провели оценку влияния коклюшных вакцин на пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с Т-кле точным митогеном на 14-е сутки после вакцинации Мононуклеарные клетки крови морских свинок культивировали в присутствии разных концентраций ФГА и без стимуляции Установлено, что уровень пролиферативного ответа животных, иммунизированных коклюшными препаратами, в культурах с внесением разных концентраций ФГА достоверно выше, чем в контроле Как видно из табл 9, иммуно-модулирующая активность бесклеточного препарата более выражена в культурах с концентрацией ФГА 20 мкг/мл Полученные результаты важны для обоснования используемых рядом авторов иммунотерапевтических подходов при неинфекционных заболеваниях с использованием вакцин В pertussis

Для дополнительной характеристики развивающегося иммунного ответа мононуклеарные клетки крови морских свинок, иммунизированных цельнокле-точным и бесклеточным препаратами, культивировали в присутствии взвеси клеток В pertussis

Таблица 9

Иммуномодулирующая активность коклюшных препаратов в реакции бласттрансформации лимфоцитов с Т-клеточным митогеном

Препарат Концент рация ФГА

20 мкг 10 мкг 5 мкг без митогена

Цельноклеточный 4,0757± 3,9083± 3,6912± 3,4134±

0,2720* 0,3424* 0,3005* 0,1200*

(11905) (8096) (4911) (2591)

Бесклеточный 4,4665± 4,2128± 3,7599± 3,6671±

0,0468** 0,0911* 0,1868* 0,0658*

(29275) (16325) (5754) (4646)

Контроль 2,9527± 3,2292± 3,2693± 2,3131±

0,0809 0,0555 0,0394 0,0352

(897) (1695) (1859) (205)

Примечание Приведены значения М±ш для показателей logi0 имп/мин, в скобках - средняя геометрическая имп/мин, * - р<0,05 по отношению к контролю, # -р<0,05 по отношению к цельноклеточному препарату

Показано, что уровень пролиферативного ответа в группах, иммунизированных коклюшными препаратами, отличается от контрольной группы При этом не отмечается достоверного отличия уровня пролиферативной активности в ответ на стимуляцию коклюшной суспензией у животных, иммунизированных цельноклеточным и бесклеточным препаратами (табл 10)

Таблица 10

Пролиферативный ответ лимфоцитов морских свинок, иммунизирован-иых коклюшными вакцииамн, на взвесь коклюшных бактерий in vitro

Антиген

Препарат иммунизации

цельноклеточный бесклеточный контроль

Коклюшная сус- 3,9906± 4,1624± 2,3131±

пензия 0,3238* 0,0672* 0,0435

(9787) (14535) (206)

Без антигена 3,4134± 3,6671± 2,3131±

0,1200* 0,0658* 0,0352

(2591) (4646) (205)

Примечание Приведены значения М±ш для показателей logio имп/мин, в скобках - средняя геометрическая имп/мин, * -р<0,05 по отношению к контролю

Отсутствие значимых отличий в уровне пролиферативной активности, вызванной бесклеточным и цельноклеточным препаратами, позволяет говорить об их сопоставимой иммуногенности Обращает на себя внимание повышение спонтанной пролиферации лимфоцитов в культурах без антигена, что, по-видимому, является отражением стимуляции лимфоцитов /я vivo

Выраженность клеточноопосредованного иммунного ответа оценивали в реакции ГЗТ Установлено, что использование цельноклеточной вакцины вызывает более выраженное иммунное воспаление в сравнении с бесклеточным препаратом (табл 11)

Таблица 11

Выраженность иммунного воспаления через 24 ч после разрешающей инъекции антигена

Препарат Индекс реакции (М±ш)

по толщине стопы по массе стопы

Бесклеточный 37,3±3,3 16,9±3,5

Цельноклеточный 46,9±2,9 33,0±5,0

Р <0,05 <0,05

Для интегральной характеристики процессов рекрутирования иммуно-компетентных клеток в регионарный лимфатический узел и их пролиферации т situ исследовали изменение клеточности и массы подколенных лимфатических узлов Установлено, что выраженность ответа со стороны периферических органов иммунной системы сопоставима в сравниваемых группах (табл 12)

Таблица 12

Выраженность изменения массы и клеточности регионарных лимфатических узлов

Препарат Индекс реакции (М±ш)

по массе лимфатических узлов по количеству ядросодер-жащих клеток

Бесклеточный 54,9±5,9 77,7±3,8

Цельноклеточный 56,0±2,9 82,91±1,3

Р >0,05 >0,05

Дополнительные исследования показали, что при использовании исследуемых препаратов существенно отличается временная динамика развития воспалительного ответа При введении цельноклеточной вакцины реакция достигает своего максимума через 6 ч, тогда как при использовании бесклеточной вакцины максимум ответа приходится на 24 ч Морфологическое изучение зоны воспаления показало, что через 6 ч после иммунизации цельноклеточной вакциной в мягких тканях наблюдается обильный клеточный воспалительный инфильтрат вокруг мелких единичных очагов некроза волокнистой ткани и скелетных мышц В центральных отделах инфильтрата преобладают нейтро-фильные гранулоциты, многие из которых находятся в состоянии распада, в периферических участках инфильтрата доминируют гистиоциты (макрофаги) Встречаются также равномерно рассеянные немногочисленные эозинофильные гранулоциты (рис 2) При иммунизации бесклеточным препаратом через 6 ч наблюдается очаговая обильная клеточная воспалительная инфильтрация смешанного характера. Индекс реакции по толщине стопы при использовании бесклеточной вакцины составляет 44,92±3,9, а корпускулярной - 56,9±8,1 Таким образом, выраженность в этот временной период воспалительного ответа, в ге-незе которого с учетом морфологической картины важная роль может принадлежать повреждению иммунными комплексами, ниже при использовании бесклеточной вакцины Через 24 ч после иммунизации цельноклеточной вакциной отмечаются обширные некрозы мягких тканей, стенок сосудов Центральные отделы инфильтрата образованы разрушающимися нейтрофильными грануло-

цитами (микроабсцессы) и макрофагами. В периферических отделах преобладают округлые и веретсновидные гистиоциты без признаков распада. Перифо-кальный отёк резко выражен (см. рис. 2).

Через 6 ч после разрешающей инъекции коклюшной суспензией, иммунизация тем же препаратом.

Гематоксилин и эозин, х80.

Через 24 ч после разрешающей инъекции коклюшной суспензией, иммунизация тем же препаратом.

Гематоксилин и эозин, х80.

Через 24 ч после разрешающей инъекции бесклеточным коклюшным препаратом, иммунизация тем же препаратом. Гематоксилин и эозин, х80.

Рис. 2. Зона воспаления в стопе после разрешающего введения исследуемых препаратов.

Для мышей, иммунизированных бесклеточной вакциной, характерно преобладание в центральных отделах инфильтрата нейтрофильных гранулоцитов, а по периферии - макрофагов. Степень выраженности перифокального очагового отека варьирует от незначительного до умеренного. Выявляется полнокровие сосудов, единичные очаги кровоизлияний (см. рис. 2). Таким образом, в отличие от бесклеточного препарата воспалительный ответ при разрешающем введении цельноклеточной вакцины характеризуется более выраженными явлениями вторичной альтерации.

Получение и оценка иммунобиологических свойств комбинированных вакцин с бесклеточным коклюшным компонентом

Новая бесклеточная коклюшная вакцина была включена как компонент в АКДС вместо цельноклеточной. Комбинированные вакцины аАКДС и АКДС

сравнивали между собой и с вакциной Инфанрикс, также содержащей бесклеточный коклюшный компонент Результаты оценки гуморального ответа морских свинок на иммунизацию тремя комбинированными вакцинами представлены в табл 13

В то же время при выявлении коклюшных антител в ИФА на подложке иммобилизованной взвесью коклюшных бактерий или бесклеточным препаратом в сыворотках крови свинок, иммунизированных вакциной Инфанрикс, определялись достоверно меньшие титры, чем у животных, иммунизированных АКДС и аАКДС (табл 13)

Содержание дифтерийных антител в сыворотках крови свинок, иммунизированных вакцинами аАКДС и Инфанрикс, было достоверно ниже, чем после иммунизации АКДС-вакциной, при этом обе вакцины с бесклеточным коклюшным компонентом не отличались по способности стимулировать образование антител к дифтерийному анатоксину Титр столбнячных антител при иммунизации вакциной Инфанрикс был значимо ниже титров, полученных в ответ на иммунизацию АКДС и аАКДС вакцинами Между средними титрами столбнячных антител в сыворотках крови свинок, иммунизированных вакцинами АКДС и аАКДС, достоверных отличий не обнаружено

Таблица 13

Уровень специфических антител в сыворотках морских свинок, иммунизированных комбинированными вакцинами, с различными коклюшными компонентами

Препарат Уровень антител (средняя геометрическая титра)

коклюшных дифтерийных столбнячных

РА ИФА

бесклеточный антиген коклюшная суспензия

аАКДС 861,38 228,5 206,01 1Д1 9,12

[380,62- [166,6-213,4] [131,80- [0,62-1,98]* [5,41-15,38]

1949,34] 322,02]

АКДС 1493 512,75 392,66 3,55 14,79

[745,38- [283,75- [210,08- [2,48-5,07] [10,04-21,80]

2991,11] 926,55] 733,92]

Инфанрикс 951,03 39,55 130,66 0,89 2,12

[674,83- [22,16- [91,29- [052-1,53]* [1,44-3,11]*#

1340,291 71,98]*# 187,061*

Примечание * -р < 0,05 в сравнении с группой, иммунизированной АКДС-вакциной, "-р < 0,05 в сравнении с группой, иммунизированной аАКДС-вакциной

Считается, что в дополнение к выработке антител необходимо формирование клеточного иммунитета для обеспечения невосприимчивости к коклюшной инфекции (Matoo, Cherry, 2005) Поэтому оценка специфического клеточного иммунитета в виде реакции ГЗТ представляется нам весьма важной как в плане характеристики иммунобиологических свойств комбинированных вакцин, так и в отношении возможного использования полученных данных для контроля эффективности вакцинации Установлено, что уровень иммунного воспаления при использовании АКДС-вакцины достоверно выше, в сравнении с вакцинами, содержащими бесклеточный коклюшный компонент (табл 14) При этом уровень ответа со стороны регионарных лимфатических узлов сопоставим по своей выраженности (табл 15)

Таблица 14

Выраженность иммунного воспаления через 24 ч после разрешающей инъекции антигена

Препарат Индекс реакции М±т

по величине отека по массе стопы

АКДС 32,62±7,51 27,90±3,18

аАКДС 14,45±1,55* 12,49±1,12*

Инфанрикс 16,55±2,13* 16,12±2,65*

Примечание * -р <0,05 в сравнении с группой АКДС

Таблица 15

Выраженность изменения массы и клеточности регионарного лимфатического узла через 24 ч после разрешающей инъекции антигена

Препарат Индекс реакции М±т

по массе лимф, узлов по количеству (ЯСК)

АКДС 53,7±8,64 75,5±2,46

аАКДС 59,2±7,42 81,1±1,13

Инфанрикс 54,3±8,35 84,5±1,55

Примечание * - р <0,05 в сравнении с группой АКДС.

В сравнительном экспериментально-лабораторном (доклиническом) исследовании новой бесклеточной коклюшной вакцины установлена ее безвредность и высокая протективная, а также иммуногенная активность Результаты исследования позволяют рассматривать препарат в качестве кандидата для клинических испытаний I фазы

ВЫВОДЫ

1 В экспериментах на животных установлено, что бесклеточная коклюшная вакцина нетоксична и не обладает сенсибилизирующими свойствами

2 Показано, что новая бесклеточная коклюшная вакцина подобно цель-ноклеточной защищает мышей от интрацеребрального заражения вирулентным штаммом В pertussis 18323, а также способна формировать клетки иммунологической памяти, которые функционируют при сингенном переносе протектив-ного иммунитета на модели внутримозговой коклюшной инфекции у мышей.

3. Установлено, что новая бесклеточная коклюшная вакцина не уступает цельноклелочной по способности стимулировать образование специфичных антител Показано, что аффинность антител, формирующихся в ответ на вакцинацию бесклеточным и цельноклеточным препаратами, не отличается

4. Показано, что уровень пролиферации лимфоцитов в культурах с коклюшной суспензией при иммунизации животных бесклеточным и цельноклеточным препаратами, повышается в одинаковой степени в сравнении с контролем Выраженность пролиферативного ответа лимфоцитов в культурах с оптимальной концентрацией фитогемагглютинина при иммунизации бесклеточной коклюшной вакциной выше, чем при введении цельноклеточного коклюшного препарата

5 Установлено, что разрешающее введение цельноклеточной коклюшной вакцины при сенсибилизации коклюшной суспензией или АКДС-вакциной в тесте гиперчувствительности вызывает более выраженные проявления вторичной альтерации в сравнении с бесклеточным препаратом.

6 Замена в вакцине АКДС цельноклеточного коклюшного компонента на новый бесклеточный создает новую комбинированную вакцину, которая не уступает традиционной по иммуногенной активности

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Устюгов Я Ю Локальные иммунные и морфологические изменения при введении компонентов вакцины «Бубо-Кок» / Я Ю Устюгов, А Н Крючков,

А Ю Увицкий, Л Е Увицкая // Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии. Материалы межрегион конф молодых ученых - Пермь, 2002 -С 105-106

2 Устюгов Я Ю Морфологические и гистологические изменения при введении вариантов клеточной и бесклеточной противококлюшных вакцин / Я Ю Устюгов, А Ю Увицкий // Биология - наука XXI века Материалы международной конф молодых ученых - Пущино, 2004 -С. 132

3 Увицкий А Ю. Изменения при введении комбинированных вакцин и их компонентов / А Ю Увицкий, Я Ю Устюгов, А М Николаева, В Д Семенова // Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке- разработка, про-

изводство, применение Материалы всерос научн конф с междунар участием - Уфа, 2005 - Часть 1 - С 82-84

4 Устюгоя Я Ю Локальные морфологические изменения при введении корпускулярной противококлюшной вакцины / Я Ю У слогов, А Ю У вицкий // Студент и научно-технический прогресс Материалы международной научной конференции серия биология НГУ - Новосибирск, 2005. - С 77-78

5 Николаева А М Опыт разработки и доклинической оценки бесклеточного варианта противококлюшной вакцины / А М Николаева, В Д Семенова, А Ю Увицкий, Я Ю Устюгов // Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества Материалы международной научно-практич конф - Минск-Нарочь, 2005 -С 155-156

6 Увицкий А 10 Изучение им?¡у.чогенности бесклеточного варианта коклюшной вакцины в опытах на животных / А Ю Увицкий, Я Ю Устюгов, В Н Сперанская // Современная вакцинопрофилактика Материалы научно-практич конф - Пермь, 2005 -С 113-117

7 Увицкий А Ю Взаимная иммуноадъювантность комбинированных вакцин, как причина усиления локальной реактогенности при повторном введении / А Ю Увицкий, Я Ю Устюгов, А М Николаева, В Д Семенова, А Н Крючков //Вестник уральской медицинской академической науки -2006 -№3-1 -С 245-248

8 Устюгов Я Ю Изучение иммунобиологической активности варианта бесклеточной коклюшной вакцины / Я Ю Устюгов, А Ю Увицкий, А М Николаева, В Д Семенова // Вестник уральской медицинской академической науки -2006 -№3-1 -С 248-251

9 Устюгов Я Ю Изучение иммуномодулирующего действия корпускулярного и ацеллюлярного коклюшных вакцинных препаратов в реакции бласт-трансформации лимфоцитов / Я Ю Устюгов, А М Николаева // Российский иммунологический журнал - 2008 - № 2-3. - С 339

10 Устюгов Я Ю Изучение влияния коклюшных вакцин на клеточный и гуморальный иммунный ответ у животных / Я Ю Устюгов, А М Николаева, Л Е Увицкая // Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов Материалы всерос научно-практич конф - Пермь, 2008 — С 21-22

11 Устюгов Я Ю Протективная активность бесклеточной коклюшной вакцины в тесте адоптивного переноса иммунитета / Я Ю Устюгов, А М Николаева, // Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов Материалы всерос научно-практич конф - Пермь, 2008 - С 23-24

Подписано в печать 01.10 2008 Усл. печ. л 1,0 Формат 90x60/16 Набор компьютерный Тираж 100 экз Заказ № 732/2006

Отпечатано в ИД «Пресстайм» Адрес. 614025, г Пермь, ул Героев Хасана, 105

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Устюгов, Яков Юрьевич

Список основных сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЯ И

ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА КОКЛЮША (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА, ТОКСИЧНОСТИ И АЛЛЕРГИЗИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ БЕСКЛЕТОЧНОГО

КОКЛЮШНОГО ПРЕПАРАТА

3.1 Исследование состава бесклеточного коклюшного препарата

3.1.1 Биохимическая характеристика бесклеточного коклюшного препарата

3.1.2 Гельхроматография

3.1.3 Электрофорез

3.1.4 Иммунохимическая характеристика бесклеточного коклюшного препарата

3.2 Исследование токсичности бесклеточного коклюшного 59 препарата

3.2.1 Оценка острой токсичности бесклеточного коклюшного 59 препарата

3.2.2 Оценка хронической токсичности бесклеточного коклюшного препарата

3.2.3 Оценка токсичности в тесте изменения массы мышей

3.2.4 Оценка гистаминсенсибилизирующей активности

3.2.5 Оценка лейкоцитозстимулирующей активности

3.3 Оценка аллергизирующих свойств бесклеточного 65 коклюшного препарата

Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ 67 БЕСКЛЕТОЧНОГО КОКЛЮШНОГО ПРЕПАРАТА

4.1. Исследование протективной активности

4.1.1 Оценка протективной активности по проценту выживаемости мышей

4. 1.2 Исследование возможности адоптивного переноса иммунитета в эксперименте с сингенной трансплантацией спленоцитов

4.2 Сравнительная оценка способности корпускулярного и 69 бесклеточного коклюшных препаратов к индукции гуморального иммунного ответа

4.3 Оценка активности кроличьих коклюшных сывороток

4.4 Получение аффинноочищенных коклюшных антител и 72 использование их для конструирования коагглютинационных реагентов

4.5 Исследование коклюшных сывороток в тестах пассивной 75 защиты и реакции нейтрализации на мышах

4.6 Определение аффинности коклюшных антител

4.7 Исследование возможности переноса клеток памяти на 80 мышах линии BALB/c

4.8 Сравнительная оценка иммуномодулирующей активности 81 коклюшных препаратов в реакции бласттрансформации лимфоцитов с Т-клеточным митогеном

4.9 Сравнительная оценка активности коклюшных препаратов в 82 реакции бласттрансформации лимфоцитов с клетками В. pertussis

4.10 Сравнительная оценка интенсивности воспаления при 83 реакции гиперчувствительности у животных, иммунизированных бесклеточным и корпускулярным коклюшными препаратами

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ КОМБИНИРОВАННЫХ ВАКЦИН С КОРПУСКУЛЯРНЫМ И БЕСКЛЕТОЧНЫМ КОКЛЮШНЫМ КОМПОНЕНТАМИ ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунобиологическая характеристика бесклеточной коклюшной вакцины"

Актуальность проблемы. Несмотря на несомненные успехи вакцинопрофилактики, проводимой на протяжении более 40 лет, коклюш остается серьезной проблемой здравоохранения не только России, но и мирового сообщества в целом [16, 60, 65, 119]. В мире ежегодно заболевает коклюшем около 60" млн. человек, а умирает около 1 млн. [27].

Многолетняя практика применения АКДС-вакцины, показала эффективность ее использования для специфической профилактики коклюша, дифтерии и столбняка. Тем не менее, немаловажной проблемой при применении этого препарата является его высокая реактогенность. По данным Н.В. Медуницына [15, 16, 29], в 1990-1997 гг именно на АКДС-вакцину приходилось свыше 60% всех неврологических поствакцинальных осложнений. Реактогенность комбинированного препарата в основном опосредована именно коклюшным компонентом, представленным суспензией клеток возбудителя коклюша Bordetella pertussis.

Успехи в области изучения структуры возбудителя, физиологической^ активности микробных продуцентов, выделения и фракционирования бактериальных антигенов, определяют перспективы создания новых более совершенных вакцинных препаратов. В этой связи важной проблемой в области специфической профилактики коклюша является поиск пути повышения эффективности и снижения реактогенности современных вакцин. Решением данной проблемы может стать разработка^ и внедрение в отечественную медицинскую практику вакцин на основе изолированных антигенов коклюшных бактерий (бесклеточных коклюшных вакцин).

Зарубежная практика применения бесклеточных коклюшных вакцин показывает значительное меньшую их реактогенность в сравнении, с корпускулярными [38, 56, 66, 87, 108, 139]. Это обстоятельство определяет высокую привлекательность для использования именно бесклеточных коклюшных вакцин, что позволит избежать таких побочных явлений как геморрагия, дегенеративные изменения в тканях печени, селезенки, почек, сопровождающих вакцинацию корпускулярной вакцинрй [62, 105]. Низкая реактогенность бесклеточных вакцин позволяет использовать их для бустерной вакцинации у подростков и взрослых [3, 98]. Последнее является немаловажным достоинством бесклеточных вакцин, в связи с тем, что в эпидемический процесс в современных условиях все чаще вовлекаются подростки и взрослые, среди которых заболевание протекает тяжело, нередко приводя к формированию осложнений (пневмонии, стойкие неврологические нарушения) и летальных исходов [20, 120, 145].

Существуют как монокомпонентные бесклеточные коклюшные вакцины, включающие в себя только коклюшный токсин, так и вакцины, содержащие до пяти компонентов: коклюшный токсин, филаментозный гемагглютинин, пертактин и фимбриальные гемагглютинины [122]. Недостаточная степень изученности влияния различных по своему составу бесклеточных коклюшных препаратов на уровень клинической защиты и различающиеся данные отдельных клинических исследований, не. представляющихся полностью сопоставимыми, вызывают дискуссию о том, какой из компонентов способен обеспечить иммунный* ответ, необходимый-для защиты. В связи с тем, что бесклеточные коклюшные вакцины весьма различаются по своему составу, оценка их протективной активности,. иммуногенности, безвредности представляется крайне важной.

Целью настоящей работы явилось проведение лабораторно-экспериментального (доклинического) исследования иммунобиологических свойств разработанного бесклеточного коклюшного препарата.

Основные задачи исследования

1. Оценить токсичность и аллергизирующее действие бесклеточного коклюшного препарата.

2. Изучить иммуногенность бесклеточного коклюшного препарата на экспериментальных животных.

3. Сконструировать комбинированную вакцину для профилактики дифтерии, столбняка и коклюша с использованием бесклеточного коклюшного компонента и оценить ее иммуногенность на экспериментальных животных.

Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка токсичности и иммуногенной активности отечественного бесклеточного . коклюшного препарата в сравнении с используемой цельноклеточной вакциной. В экспериментах показано отсутствие у бесклеточной коклюшной вакцины токсичности, аллергизирующей, гистаминсенсибилизирующей и лейкоцитозстимулирующей активностей. Новая бесклеточная коклюшная вакцина подобно цельноклеточной защищает мышей от интрацеребрального заражения вирулентным штаммом В. pertussis 18323, вызывает образование специфических антител, повышает пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с коклюшной суспензией, обеспечивает протективную активность в тесте сингенного переноса спленоцитов. Протективная активность и аффинность антител, образующихся в ответ на иммунизацию бесклеточным и цельноклеточным препаратами, оказались сходными. Пролиферативный ответ лимфоцитов in vitro на фитогемагглютинин после иммунизации'* бесклеточной коклюшной вакциной выше, чем после иммунизации цельноклеточной. Патоморфологические исследования показали значительно»1 меньшую степень выраженности вторичной альтерации в тесте гиперчувствительности при введении бесклеточного препарата.

Теоретическое и практическое значение работы;

Полученные результаты уточняют представления о природе приобретённой противококлюшной резистентности. Принципиально важно, что новая бесклеточная коклюшная вакцина обладает сходной с традиционной цельноклеточной вакциной протективной активностью и иммуногенностью при меньшей токсичности.

Проведенные исследования - существенная часть доклинических испытаний новых вакцин на пути их продвижения- в практику, в частности, для представления в Государственный Институт стандартизации и контроля им. Л.И. Тарасевича. Результаты исследований используются в лекционных курсах "Иммунология", "Экспериментальная иммунопатология и иммунотерапия" кафедры микробиологии и иммунологии ГОУ ВПО "Пермский государственный университет"

614600, г. Пермь, ул. Букирева, 15). В лекционном курсе «Биотехнология» кафедры- промышленной технологии лекарств* с курсом биотехнологии ГОУ ВПО "Пермская государственная фармацевтическая академия" (614990, г. Пермь, ул. Ленина, 48).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Бесклеточный коклюшный препарат обладает более низкой токсичностью и аллергизирующей активностью в сравнении с цельноклеточной вакциной.

2. Новая бесклеточная-коклюшная вакцина подобно цельноклеточной защищает мышей от интрацеребрального заражения вирулентным штаммом В. pertussis 18323 и формирует клетки иммунологической памяти; которые функционируют при сингенном переносе протективного иммунитета.

3. Бесклеточная и традиционная цельноклеточная коклюшные вакцины обладают сопоставимой способностью' к индукции иммунного^ ответа. Стимулирующее влияние бесклеточного препарата на пролиферацию> Т-лимфоцитов В/ культурах с фитогемагглютинином более выражено, а проявления вторичной альтерации при реакции гиперчувствительности менее значительны.

4. Замена в вакцине АКДС цельноклеточного коклюшного компонента на новый бесклеточный создает новую комбинированную вакцину, которая не уступает традиционной по иммуногенной активности.

Апробация работы и публикации. Основные положения работы доложены, на Межрегиональной« конференции* молодых ученых «Современные проблемы, экологии, микробиологии и» иммунологии», Пермь, 2002; Международной конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2004; Международной научной конференции «Студент и научно-технический прогресс», Новосибирск, 2005; Объединенном иммунологическом форуме, Санкт-Петербург, 2008. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ. Диссертационная работа апробирована на расширенном заседании научных проблемных комиссий по микробиологии, аллергологии и иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (Пермь, 2007) и рекомендована к защите.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 118 стр. машинописного текста, содержит 28 таблиц и 10 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав экспериментальных исследований, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 149 источников литературы, из них 37 отечественных и 112 иностранных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Устюгов, Яков Юрьевич

ВЫВОДЫ

1. В экспериментах на животных установлено, что бесклеточная коклюшная вакцина нетоксична и не обладает сенсибилизирующими свойствами.

2. Показано, что новая бесклеточная коклюшная вакцина подобно цельноклеточной защищает мышей от интрацеребрального заражения вирулентным штаммом В. pertussis 18323, а также способна формировать клетки иммунологической памяти, которые функционируют при сингенном переносе протективного иммунитета на модели внутримозговой коклюшной инфекции у мышей.

3. Установлено, что новая бесклеточная коклюшная вакцина не уступает цельноклеточной по способности стимулировать образование специфичных антител. Показано, что аффинность антител, формирующихся в ответ на вакцинацию бесклеточным и цельноклеточным препаратами, не отличается.

4. Показано, что уровень пролиферации лимфоцитов в культурах с коклюшной суспензией у животных, иммунизированных бесклеточным и цельноклеточным препаратами, повышается в одинаковой степени в сравнении с контролем. Выраженность пролиферативного ответа лимфоцитов в культурах с оптимальной концентрацией фитогемагглютинина при иммунизации бесклеточной коклюшной вакциной выше, чем при введении цельноклеточного коклюшного препарата.

5. Установлено, что разрешающее введение цельноклеточной коклюшной вакцины при сенсибилизации коклюшной суспензией или АКДС-вакциной в тесте гиперчувствительности вызывает более выраженные проявления вторичной альтерации в сравнении с бесклеточным препаратом.

6. Замена в вакцине АКДС цельноклеточного коклюшного компонента на новый бесклеточный создает новую комбинированную вакцину, которая не уступает традиционной по иммуногенной активности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Устюгов, Яков Юрьевич, Пермь

1. Брагинская, В.П. Характеристика коклюша периода последних лет / В.П. Брагинская. Педиатрия. - 1962. - №5. - 80 с.

2. Бурков, А.Н. Методология конструирования коммерческих тест-систем для диагностики инфекционных заболеваний / А.Н. Бурков // Автореф. Дис. докт. мед. наук. М., 2004. - 37 с.

3. Воробьев, A.A. Современные направления в разработке новых иммунобиологических препаратов / A.A. Воробьев. Микробиология. — 1999.5. — С. 16-21.

4. Галазка, А. Иммунологические основы вакцинации / А. Галазка //. Вып.

5. Коклюш. Женева: ВОЗ, 1993. - 34 с.

6. Гордон, А. Вакцины, вакцинация и иммунный ответ / А. Гордон, Р. Алистер. -М.: Медицина, 2002. 160 с.

7. Данилевич, М.Г. Вопросы коклюша/ М.Г. Данилнвич. — JL: Медицина, 1936.- 159 с.

8. Захарова, М.С. Влияние вакцинации на мировое распространение коклюша / М.С. Захарова // Материалы Всесоюзного симпозиума по иммунологии и эпидемиологии. Минск, 1977. - С. 3-5.

9. Захарова, М.С. Влияние вакцинации на эпидемиологию коклюша в СССР / М.С. Захарова // Эпидемиология и иммунопрофилактика коклюша в СССР, ВНР, НРБ, и ЧССР (сборник статей). М: ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР, 1985. - С. 3-36.

10. Захарова, Н.С. Протективная активность АК(б)ДС-вакцины с бесклеточным компонентом и полиоксидонием / Н.С. Захарова., М.В. Брицина, М.Н. Озерецковская, И.Г. Бажанова, Н.У. Мерцалова, A.B. Поддубиков, Е.М. Зайцев, Е.В. Ермолова // ЖМЭИ. 2006. - С. 46-49.

11. Иоффе, В.И Коклюш / В.И. Иоффе, П.В. Осипова. М: Медицина, 1964.- 283с.

12. Коза, Н.М. Эффективность многолетней вакцинопрофилактики коклюша и некоторые пути ее усовершенствования / Н.М. Коза // Автореф. дис. . д-ра мед. наук М., 1979. - 430 с.

13. Кузнецова, JI.C. Эпидемиология современного коклюша и вопросы рационализации его профилактики / JI.C. Кузнецова // Автореф. .дис. . д-ра. мед. наук. М., 1979. - 25 с.

14. Курова, H.H. Вакцинопрофилактика коклюша и поствакцинальный иммунитет / H.H. Курова, Г.Я. Ценева // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2006. — № 3. - С. 12-18.

15. Медуницын, Н.В. Вакцинология / Н.В. Медуницын. М.: Триада-Х, 1999.-272 с.

16. Медуницын, Н.В. Вакцинология / Н.В. Медуницын. М.: Триада-Х, 2004. - 448 с.

17. Нго, Т. Иммуноферментный анализ / Т. Нго, Г. Ленхофф. М.: Мир, 1988.-446 с.

18. Носов, С.Д. Учение о коклюше / С.Д. Носов, В.Д. Соболева. М.: Медгиз, 1962.-376 с.

19. Озерецковский, H.A. Вакцинопрофилактика коклюша- итоги и перспективы / H.A. Озерецковский, Р.П. Чупринина // Вакцинация. 2004. -№ 5(35). - С. 6-7.

20. Онищенко, Г.Г. Заболеваемость инфекциями, управляемыми средствами специфической профилактики, в Российской Федерации и задачи по их снижению и ликвидации / Г.Г. Онищенко // ЖМЭИ. 2003. - № 2. - С. 16-28.

21. Окиншевич, Е.А. Распространение коклюша в очагах среди детей с различными сроками после ревакцинации / Е.А. Окиншевич, Л.С.Кузнецова, Л. А. Сигаева // Материалы Всесоюзного симпозиума по иммунологии и эпидемиологии. — Минск, 1977. — С. 17-18.

22. Петрова, М.С. Коклюш: клинико-морфологические параллели / М.С. Петрова, О.П. Попова, И.Н. Лыткина // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2003. - № 4. - С. 38-42.

23. Покровский, В.И. Вакцинопрофилактика. Итоги XX века и перспективы следующего столетия / В.И. Покровский, Б.Ф.Семенов // Журн. микробиол. 1999. - № 5. - С. 6-8.

24. Поливода, З.М. Эпидемиология коклюша в БССР / З.М. Поливода, А.Ф. Бабин, А.Д. Соколовская // Материалы Всесоюзного симпозиума по иммунологии и эпидемиологии. Минск, 1977. - С. 25-26.

25. Райхер, Л.И. Экспериментальные материалы к проблеме специфической вакцинопрофилактики и серодиагностики коклюша / Л.И. Райхер // Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Пермь, 1970. - 38 с.

26. Селезнева, Т.Н. Влияние вакцинопрофилактики на эпидемический процесс управляемых инфекций в РФ / Т.Н. Селезнева, Н.С. Титова, А.И. Загарьянц // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. - № 2. - С. 810.

27. Сухинин, М.В. Коклюш. Требуется новая диагностика и вакциннопрофилактика / М.В. Сухинин // Эпидимиология и вакцинопрофилактика. 2005. - №6. - С. 17-21.

28. Учайкин, В.Ф. Вакцинопрофилактика в России: состояние и перспективы / В.Ф. Учайкин, О.В. Шамшева // Педиатрия. 2000. - № 2. — С. 4-8.

29. Учайкин, В.Ф. О.В. Вакцинопрофилактика: настоящее и будущее / В.Ф. Учайкин, О.В. Шамшева. М.: Гэотар-Мед. - 2001. - 400 с.

30. Хаитов, P.M. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов / P.M. Хаитов, И.С. Гущин, Б.В. Пинегин, А.И. Зебрев // Ведомости Фармакологического Комитета. 1999. — N 1. - С. 31-36.

31. Харрисон, Т.Р. Внутренние болезни / Т.Р. Харрисон. М.: Медицина, 1993.-Т.3.-347 с.

32. Ценева, Г.Я. Микробиологическая характеристика коклюша и лабораторная диагностика коклюша / Г.Я.Ценева, Н.Н. Курова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2003. - № 4. -С. 329-341.

33. Чупринина, Р.П. Профилактика коклюша: разработка и применение бесклеточной коклюшной вакцины / Р.П. Чупринина, И.А. Алексеева, Р.А. Озерецковский // ЖМЭИ. 2006. - № 1. - С. 99-105.

34. Шафеев, М.Ш. Организация и содержание эпидемиологического надзора при коклюше / М.Ш. Шафеев, Ф.Ф. Садеков, JI.M. Зорина. Казань: КГМУ, 1997.-С. 3, 12-21.

35. Ющук, Н.Д. Эпидемиология / Н.Д. Ющук, Ю.В. Мартынов. М.: Медицина, 2003. - 179 с.

36. Advani, A. Changes of the Swedish Bordetella pertussis population in incidence peaks during an acellular pertussis vaccine period between 1997 and 2004 / A. Advani, D. Donnelly, L. Gustafsson, И.О. Hallander // APMIS. 2007. -Vol. 115(4).-P. 299-310.

37. Andre, F.E. The way forward combined vaccines. / F.E. Andre // Abstr.iL

38. From the 9 Triennial International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease. Rome, 1996. - 287 p.

39. Arciniega, J.L. Contribution of the B oligomer to the protective activity of genetically attenuated pertussis toxin / J.L. Arciniega, R.D. Shanin, W.N. Burnette // Infect. Immun. 1991. - Vol. 59. - P. 3407-3410.

40. Arico, B. Evolutionary relationship the genus Bordetella / B. Arico, R. Gross, S. Smida, R. Rapoulli // Mol. Microbiol. 1987. - Vol. 1. - P. 301-308.

41. Arico, B. Bordetella parapertussis and Bordetella bronchiseptica contain transcriptionally silent pertussis toxin genes / B. Arico, R. Rappuoli // Bacteriol. — 1987.-Vol. 169.-P. 2847-2853.

42. Aventis Pasteur MSD 2000 Acellular pertussis vaccines: what the matter serology or clinical protection / Aventis Pasteur. Paris, 2000. - 20 pp.

43. Ayme, G. Biological activities of fragments derived from Bordetella pertussis endotoxin / G. Ayme, M. Caroff, R. Chaby et al. II Infect. Immun. 1980. -Vol. 49.-P. 739-745.

44. Bass, J.W. Return of epidemic pertussis in the United States / J.W. Bass, R.R. Wittier // Pediatr. Infect. J. 1994. - Vol. 13. - P. 343-345.

45. Betsou, F. C-terminal domain is essential for protective activity of the Bordetella pertussis adenilate cyclase-hemolysin / F. Betsou, P. Sebo, N. Guiso // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. - P. 3309-3315.

46. Bradley, L.M. T-cell memory: New perspectives / L.M. Bradley, M. Croft, S.L. Swain // Immunol. 1993. - Vol. 14. - P. 197-199.

47. Brennan, M.J., Shanin R.D. Pertussis antigens that abrogate bacterial adherence and elicit immunity / M.J. Brennan, R.D. Shanin // Respir. Crit. Care Med. 1996. - Vol. 154. - P. 145-149.

48. Canthaboo, C. Investigation of cellular and humoral immune responses to whole cell and acellular pertussis vaccines / C. Canthaboo, L. Wiliams, D.K. Xing, M.I. Corbel // Vaccine. 2000. - Vol. 19 (6). - P. 637-643.

49. Chase, A. A human and scientific account of the long and continuing struggle to eradicate infectious diseases by vaccination / A. Chase. New York: William and Morrow Co., 1982. - 263 p.

50. Cherry, J.D. The epidemiology of pertussis: a comparison of the epidemiology of the disease pertussis with the epidemiology of Bordetella pertussis infection / J.D. Cherry // Pediatrics. 2005. - Vol. 115(5). - P. 1422-1427.

51. Cherry, J. Report of the task force on pertussis and pertussis immunization / J. Cherry, P. Brunell, G. Golden, D. Karzon // Pediatrics. 1988. - Vol. 81. - P. 933-984.

52. Cherry, E. The past, present, and future of pertussis / J. Cherry, L. Baraff, E. Hewlett // West J. Med. 1989. - Vol. 150. - P. 319-328.

53. Cookson, B.T. Bacteria caused by a novel Bordetella species, B. hinzii / B.T. Cookson, P. Vandamme, L.C. Carlson, A.M. Larson, J.V.L. Sheffield, K. Kersters, D.H. Spach // J. Clin. Microbiol. 1994. -V. 32. - P. 2569-2571.

54. Cullinane, L.C. Bordetella parapertussis from labs / L.C. Cullinane, M.R. Alley, R.B. Marsal, B.W. Mankelow // N. Z. Vet. J. 1987. - Vol. 35. - P. 175.

55. De Serres, G. Effectiveness of a single dose of acellular pertussis vaccine to prevent pertussis in children primed with pertussis who e cell vaccinne / G. De Serres, R. Shadmani, N. Boulianne et al.il Vaccine. 2001. - Vol. 19. - P. 30043008.

56. Ditchburn, R.K. Whooping cough after stopping pertussis immunization / R.K. Ditchburn // Brit. Med. J. 1979. - Vol. 6178B. - P. 1601 -1603.

57. Edelman, K. Detection of Bordetella pertussis by polymerase chain reaction and culture in the nasopharynx of erythromycin-treated infants with pertussis/ K. Edelman, S. Nikkari, O. Ruuskanen et al. II Pediatr. Infect. Dis. J. 1996. - Vol. 15.-P. 54-57.

58. Edwards, K.M. Comparison of 13 acellular pertussis vaccines: Overview and serologic response / K.M. Edwards, B.D. Meade, M.D. Decker et al. I I Pediatrics. 1995. - Vol. 96. - P. 548-557.

59. Elomaa, A. Strain variation among Bordetella pertussis isolates in Finland, where the whole-cell pertussis vaccine has been used for 50 years / A. Elomaa, A. Advani, D. Donnelly et al. II J. Clin. Microbiol. -2005. Vol. 43(8). - P. 3681-3687.

60. Ewanovich, C.A. Invasion of HeLa 229 cells by virulent Bordetella pertussis / C.A. Ewanovich, A.R. Melton, A.A. Weiss, M.S. Peppier // Infect. Immun. 1993. - Vol. 57. - P. 2698-2704.

61. Farizo, K. Epidemiological features of pertussis in the US / K. Farizo, S. Cochi, E. Zell et al.H Clin. Infect. Dis. 1992. - Vol. 14. - P. 708-719.

62. Feery, B.J. Pertussis vaccine controversy: to vaccinate or not. / B.J. Feery // Austral. Pediatr.J. 1984. - Vol. 20. - P. 91-93.

63. Fenner, F. The effects of changing social organization on the infectious diseases of man / F. Fenner // Boyden SW, ed. The impact of civilization on the biology of man. Toronto: University of Toronto Press, 1970. - P. 48 - 68.

64. Fernandez, R.C. Cloning and sequencing of a Bordetella pertussis serum resistance locus / R.C. Fernandez, A.A. Weiss // Infect. Immun. 1994. — Vol. 62. -P. 727-738.

65. Fernandez, R.C. Serum resistance in bvg-regulated mutants of Bordetella pertussiss / R.C. Fernandez, A.A. Weiss // FEEMS Microbiol. Lett. 1998. - Vol. 163.-P. 57-63.

66. Fine, P. The recurrence of whooping cough / P. Fine, J. Clarkson // Lancet. 1982. - Vol. 1. - P. 666-669.

67. Friedman, R.L. Uptake and intracellular survival of Bordetella pertussis in human macrophages / R.L. Friedman, K. Nordenson, L. Wilson et al. II Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 4578-4585.

68. Fulginitl, V.A. A new pertussis vaccine: hope for the future / V.A. Fulginitl //J. Infect. Diseases. 1983. - Vol. 148. - P. 146-147.

69. General recommendations on immunization. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP) // MMWR Morb. Mortal Wkly. Rep. 1994. - Rep. 43 (RR-1). - P. 1-38.

70. Geuijen, C.A. The major fimbrial subunit of Bordetella pertussiss binds to sulfated sugars / C.A. Geuijen, R.J. Willems, F.R. Mooi // Infect. Immun. — 1996. -Vol. 64.-P. 2657-2665.

71. Geuijen, C.A. Identification and characterisation of heparin binding regions of the Fim 2 subunit of Bordetella pertussiss / C.A. Geuijen, R.J. Willems, P. Hoogerhout // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 2256-2263.

72. Goldman, W. Tracheal cytotoxin of B. pertussis / W. Goldmai. New-York, 1988.-P. 231-246.

73. Goldman, W. Tracheal cytotoxin of B. pertussis / W. Goldman, J. Collier, B. Cookson et al. II United States Public Health Service. 1990. - P. 5-10.

74. Goldsby, R. Kuby immunology / R. Goldsby, T. Kindt, B. Osborne. New York, etc., 2002. - 553 p.

75. Granstorm, M. Antitoxin response to acellular pertussis vaccines / M. Granstorm, M. Blennow, S. Hedenskog et al. II Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol., 1987 87th Annu. Meet., Atlanta, ga, 1-6 March, 1987. Washington, D.C. 1987. - P. 113-113.

76. Granstorm, G. Evaluating of serologic assays for diagnosis of whooping cough / G. Granstorm, B. Wretlind, C.R. Salenstedt, M. Granstorm // J. Clin. Microbiol. 1988. - Vol. 26 (9). - P. 1818-1826.

77. Greef, S. Pertussis incendence in the Netherlands after introduction of an acellular booster vaccination at 4 years of age / Greef de S., I. Schellerens, F. Mool et al. II Eurosurveillance weekly releases. 2004. - Vol. 8. - Issue 28.

78. Gueirard, P. Role of adenilate cyclase-hemolysin in alveolar macrophage appoptosis during Bordetella pertusis infection in vivo / P. Gueirard, A. Druilhe, M. Pretolani, N. Guiso // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 1718-1725.

79. Guiso, N. Bordetella pertussis adenilate cyclase / N. Guiso, M. Szatanic, M. Rocancourt // United States Public Health Service. 1990. - P. 207-231.

80. Hallander, H.O. Shifts of Bordetella pertussis variants in Sweden from 1970 to 2003, during three periods marked by different vaccination programs / H.O. Hallander, A. Advani, D. Donnelly et al. II J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43(6). -P. 2856-2865.

81. Halperin, S.A. Modulation of Bordetella pertussis infections with monoclonal antibodies to pertussis toxin / S.A. Halperin, T.B. Issekutz, A. Kasina //J. Infect. Dis.-1991.-Vol. 163.-P. 355-361.

82. Hamstra H.J. The purification and protective capacity of Bordetella pertusis outer membrane proteins / H.J. Hamstra, B. Kuipers, D. Shijf-Evers et al.ll — Vaccine. 1995. - Vol. 13. - P. 747-752.

83. Hardy A. Whooping cough / A. Hardy. New York: Cambridge University Press, 1993.-P. 1094-1096.

84. Hewlett E.L. Bordetellla species / E.L. Hewlett. New York, 1995. - P. 2078-2083.

85. He, Q. Antibodies to filamentous hemagglutinin of Bordetella pertussis and protection against whooping cough in schoolchildren / Q. He, M.K. Viljanen, R.M. Older et al. II J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 170. - P. 705-708.

86. Hill, A.B. Ir. genes, peripherial cross-tolerance and immunodominance in MHC class restricted T-cells responses: an old quagmire revisited / A.B. Hill, A. Mulbacher, R.V. Blanden // Immunol. Rev. 1993. - Vol. 133. - P. 75-92.

87. Hoiby, N. Crossed immunoelectrophoretic analysis of Bordetella pertussis antogens and of corresponding antibodies in human sera / N. Hoiby, J.B. Hertz, V. Anderson, P. Baekgaard / Pathol. Microbiol. Scand // 1976. - Vol. 84B. - P 386394.

88. Holmes W.H. Bacillary and rickettsial infections / W.H. Holmes. New York: The Macmilan Co., 1940. - 213 p.

89. Hsia, J.A. ADP-ribosylation of adenilate cyclase by pertussis toxin / J.A. Hsia, J. Moss, E.L. Hewlett, M. Waughan // J. Biol. Chem. 1984. - Vol. 259. - P. 1086-1090.

90. Kashanian, S. Structural and functional of rabbit polycklonal antibody for immunoassay purposes / S. Kashanian, H. Ravan, S. Ghobadi, S. Omidfar, S. Askari // Hybridoma. 2008. - Vol. 27(1). - P. 48-53.

91. Keitel, W.A. Cellular and acellular pertussis vaccines in adults / W.A. Keitel // Clin. Inf. Dis. 1999. - Vol. 28, Suppl. - P. 118-123.

92. Khattak, M.N. Genetic relatedness of Bordetella pertussis species as determined by macrorestriction digests resolved by pulsed-field gel electrophoresis / M.N. Khattak, R.C. Matthews // Syst. Bacterial. Vol. 43. - P. 659-664.

93. Khelef, N. Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis two immunologically distinct species / N. Khelef, B. Danve, M.J. Quentin-Millet, N. Guiso // Infect. Immunol. Vol. 61. - P. 486-490.

94. Kimura, M. Pertussis epidemiology and study of seropositive cases in Japan / M. Kimura, H. Kuno-Sakai, N. Kunita et al. II J. Jap. Assoc. Infect. Dis. 1996. -Vol. 70, № 1.-P. 319-328.

95. Kloos, W.E. Desoxyribonucleotide sequence relationship among Bordetella pertussis / W.E. Kloos, N. Mohapatra, W. Dobrogosz et al. II J. Syst. Bacteriol. -1981.-Vol. 31.-P. 173-176.

96. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680.

97. Mandre, R. Vaccination contre la coqueluche / R. Mandre // Vie med. -1979. Vol. 60, № 2. - P. 1793-1798.

98. Marchitto, K.S. Nucleotide sequence homology to pertussis toxin gene in Bordrtella parapertussis and Bordetella bronchiseptica / K.S. Marchitto, S.G. Smith, C. Locht, J.M. Keith // Infect. Immun. 1988. - Vol. 159. - P. 194-196.

99. Marmick, C. Pertussis vaccines: trials (and tribulations) / C. Marmick // JAMA. 1988. - Vol. 259, № 14. - P. 2054-2059.

100. Mattoo, S. Molecular Pathogenesis, Epidemiology, and Clinical Manifestations of Respiratory Infections Due to Bordetella pertussis and Other Bordetella Subspecies / S. Mattoo, J. D. Cherry // Clin Microbiol Rev. 2005. - # 18(2).-P. 326-382.

101. Mertsola, J. Serologic diagnosis of pertussis: evaluation of pertussis toxin and other antigens in enzyme-linked immunosorbent assay / J. Mertsola, O. Ruuskanen, T. Kuronen et al.// J. Infect. Dis. 1990. - Vol. 161. - P. 966-971.

102. Mills K.H.G. Immunity to Bordetella pertussis II Microbes and Infection. — 2001.-Vol.3.-P. 655-677.

103. Mink, C.M. Outbreak of pertussis in a fully immunized adolescent and adult population / C.M. Mink // Arch. Pediatr.Adolesc. Med. 1994. - Vol. 152, № 8. P. 153-157.

104. Munoz, J.J. Antigens of Bordetella pertussis III. The protective antigen. / JJ. Munoz, B.M. Hestekin // Proc. Soc. Epidimiol. Biol. Med. 1963. - Vol. 112. -P. 799-805.

105. Nencioni, L. Properties of the B oligomer of pertussis toxin / L. Nencioni, M.G. Pizza, G. Volpini et al. II Infect. Immun. 1991. - Vol. 59. - P. 4732-4734.

106. Nicosia, A. Promoter of the pertussis toxin operon and production of pertussis toxin. / A. Nicosia, R. Rappuoli // Bacteriol. 1987. — Vol. 169. - P. 2843-2846.

107. Oda, M. Protective activities of the filamentous hemagglutinin and the lymphocytosispromoting factor of Bordetella pertussis in mice / M. Oda, , J.L. Cowell, D.G. Burstyn, C.R. Manclark II J. Infect. Dis. 1984. - Vol. 150. - P. 823-833.

108. Olson, L.C. Pertussis / L.C. Olson II Medicin. 1975. - Vol. 54. - P. 427469.

109. Pichichero, M.E. Acellular pertussis vaccine booster combined with diphtheria and tetanus toxoids for adolescents / M.E. Pichichero, M.M. Blatter, W.A. Kennedy et al II Pediatrics. 2006. - Vol. 117 (4).- P. 1084-1093.

110. Pizza, M. Mutants of pertussis toxin suitable for vaccine development / M. Pizza, A. Covacci, A. Bartoloni et al. II Science. 1989. - Vol. 246. - P. 497-500.

111. Poolman, J.T. Acellular pertussis vaccines and the role of pertactin and fimbriae / J.T. Poolman, H.O. Hallander // Expert Rev. Vaccines. 2007. - Vol. 6(1). - P. 47-56.

112. Porter, J.F. Long-term survival of Bordetella bronchiseptica in lake water and in buffered saline without nutrients / J.F. Porter, A.C. Wardlaw // FEMS Mocrobiol. Lett. 1993. - Vol. 110. - P. 33-36.

113. Preston, N.W. Efficacy of pertussis vaccines / N.W. Preston, T.N. Stanbriidge // BMJ. 1972. - Vol. 3. - P. 448-451.

114. Preston, N.W. Components of acellular pertussis vaccines / N.W. Preston, R. Matthews // Lancet. 1996. - P. 347-764.

115. Parton, R. New perspectives on Bordetella pathogenicity / R. Parton // Med. Microbiol. 1996. - Vol. 44. - P. 233-235.

116. Rambow, A.A. Characterization of Brk A expression in Bordetella bronchiseptica / A.A. Rambow, R.C. Fernandez, A.A. Weiss // Infect. Immun. -1998. Vol. 66. - P. 3978-3980.

117. Sato, H. Relationship between structure and biological and protective activities of pertussis toxin / H. Sato, Y. Sato // Dev. Biol. Stand. 1991. - Vol. 73. -P. 121-132.

118. Sato, H. Experience with diphtheria toroid-tetans toxoid-acellular pertussis vaccine in Japan / H. Sato, Y. Sato // Clin. Inf. Dis. 1999. - Vol. 28, Suppl. - P. 124-130.

119. Shahin, R.D. Characterization of the protective capacity and immunogenicity of the 69-kD outer membrane protein of Bordetella pertussis /

120. R.D. Shahin, M.J. Brennan, Z.M. Li et al. II J. Exp. Med. 1990. - Vol. 171(1).-P. 63-73.

121. Sill, E.M. The vaccine treatment of whooping cough / E.M. Sill // J. Dis. Child. 1913. - Vol. 5. - P. 379-385.

122. Tamura, M. Subunit structure of islet-activating protein, pertussis toxin, in conformity with the A-B model / M. Tamura, K. Nogimori, S. Murai at al. II J. Biochem. 1982. - Vol. 21. - P. 5516-5522.

123. Tang, Y.W. Bordetella holmesii-\\ke organism associated with septicemia endocarditis and respiratory failure / Y.W. Tang, M.K. Hopkins, C.P. Colbert at al. II J. Clin. Infect. Dis. 1998. - Vol. 26. - P. 389-392.

124. Taranger, J. Crrelation between pertussis toxin IgG antibodies in postvaccination sera and subsequent protection against pertussis / J. Taranger, B. Trollfors, T. Lagergard et al. II J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181. - P. 1010-1013.

125. Tinnion, O.N. Acellular vaccines for preventing whooping cough in children / O.N. Tinnion, M. Hanlon // Cochrane Database Syst. Rev. 2000. - 2 CD 001478.

126. Tormans, G. Economic evaluation of pertussis prevention by whole-cell and acellular vaccine in Germany / G. Tormans, E. van Doorslaer, P. van Damme et al. //Eur. J. Pediatr. 1998. - Vol. 157. -P. 395-401.

127. Toumanen, E. Filamentous hemagglutinin and pertussis toxin promote adherence of Bordetella pertussis to cilia / E. Toumanen, A. Weiss, R. Rich et al. II J. Develop. Biol. Stand. 1985. - Vol. 61. - P. 197-204.

128. Wilder-Smith A. Seroepidemiology of pertussis in the adult population of Singapore / A. Wilder-Smith, S. Ng, A. Earnest // Ann. Acad. Med. Singapore. -2006. Vol. 35(11). - P. 780-782.

129. Wiliamson, N.W. Epitope mapping the FIM 2 and FIM 3 proteins of B. pertussiss with sera from patients infected with vaccinated against whoopig-cough / N.W. Wiliamson, R.C. Matthews 11FEEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. -Vol. 13.-P. 169-178.

130. Willem, J. Cost-effectiveness and cost-benefit analysis of vaccines / J. Willem, C. Sanders II J. Infect. Dis. 1981. - Vol. 144. - P 486-493.

131. Woolfrey, B.F. Human infections associated with Bordetella bronchiseptica / B.F. Woolfrey, A.G. Moody II Clin. Microbiol. 1991. - Vol. 4. - P. 243-255.