Разработка методики генотипирования бифидобактерий на основе двухлокусного секвенирования с целью видовой идентификации штаммов

Субботина, Марина Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка методики генотипирования бифидобактерий на основе двухлокусного секвенирования с целью видовой идентификации штаммов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методики генотипирования бифидобактерий на основе двухлокусного секвенирования с целью видовой идентификации штаммов"

Г/11С^о

На правах рукописи

0034В7и4и

СУББОТИНА Марина Евгеньевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ БИФИДОБАКТЕРИЙ НА ОСНОВЕ ДВУХЛОКУСНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ С ЦЕЛЬЮ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ

03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 2009

003467040

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Воронина Ольга Львовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Комбарова Светлана Юрьевна

доктор биологических наук Малик Нина Ивановна

Ведущая организация:

ФГУП ГНЦ РФ «ГосНИИгенетика»

Защита состоится в ..[(..час. на заседании диссертационного совета

Д.006.027.01 при ВНИИСБ РАСХН по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, д.42, факс (495) 977-09-47, e-mail: vvvvw.iab@iab.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИСБ РАСХН по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, д.42

Автореферат разослан «Jy>> 0 ^ 2009 года

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Бактерии рода Bifidobacterium являются важным компонентом индигенпой микрофлоры кишечника человека и теплокровных животных. Они обеспечивают колонизационную резистентность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, обладают иммуномодулирующим действием, синтезируют аминокислоты, витамины (К, РР и группы В), биотин, летучие жирные кислоты, ферменты, участвующие в процессах пищеварения и обмена веществ.

В связи с широким спектром положительных свойств Bifidobacterium spp. часто используются в качестве пробиотиков при коррекции дисбиотических нарушений ЖКТ. Их применение особо значимо для современных детей раннего возраста ввиду дефицита или полного отсутствия кишечной бифидофлоры и изменения ее видового состава по сравнению с данными 60-80-х годов XX века даже при исключительно грудном вскармливании. Поэтому достоверная идентификация наиболее физиологичных для человека 5 видов бифидобактерий: Bifidobacterium adolescentis, В. bifidum, В. breve, В. infantis и В. longum, являющихся основой большинства про- и синбиотических препаратов для человека и сельскохозяйственных животных, очень актуальна как для производителей такого рода препаратов, так и для ветеринарной и медицинской практики, в особенности для педиатрии и детской диетологии.

В настоящее время видовая идентификация бифидобактерий основывается на фенотипических критериях: морфологических и биохимических признаках, антагонистической активности и устойчивости к антибиотикам. Но эти признаки являются зачастую нестабильными, неоднозначными и очень сходными у представителей близкородственных видов. Поэтому в дополнение к традиционным культуральным методам крайне актуальной становится задача разработки методики генотипирования бифидобактерий на уровне вида, в особенности для различения видов Б. infantis и В. longum.

Филогения домена Bacteria построена на анализе последовательностей информационного гена 16S рибосомалыюй РНК (16S рРНК). Однако возможности данной мишени на уровне ниже рода ограничены, поскольку с ее помощью нельзя различить генетически близкородственные виды бактерий. Поэтому возникает

необходимость разработки альтернативных подходов, одним из которых является двухлокусное секвенирование - дополнение филогении на основе гена 16S рРНК анализом последовательностей одного из операционных генов (house-keeping genes), кодирующих наиболее значимые для исследуемого таксона белки клеточного метаболизма.

Двухлокусное секвенирование имеет множество преимуществ по сравнению с другими методами видовой идентификации. Во-первых, данный метод выявляет изменения в информационном и операционном генах, эволюционирующих медленно и, вероятно, являющихся нейтральными для отбора, что позволяет различать штаммы бактерий разных видов по длительно сохраняющимся изменениям в геноме. Во-вторых, результаты секвенирования являются однозначными, достоверными, воспроизводимыми и сопоставимыми в рамках разных лабораторий, что позволяет на основе секвенированных аллелей создавать глобальные, общемировые базы данных, анализировать их и передавать через Интернет исследователям разных стран. Таким образом, применение двухлокусного секвенирования, а в перспективе и мультилокусного секвенирования (MLST) на основе нескольких операционных генов, в анализе штаммов бактерий открывает новые перспективы в исследованиях как молекулярно-биологического, эволюционного, филогенетического, так и эпидемиологического, популяционно-генетического направления.

Цель н задачи работы. Целью настоящей работы является разработка методики видового типирования бифидобактерий на основе двухлокусного секвенирования фрагментов генов 16S рибосомальной РНК и трансальдолазы и ее апробация на коллекционных штаммах и изолятах бифидобактерий клинических здоровых детей раннего возраста при оценке видового разнообразия бифидофлоры кишечника.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методику видового типирования бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы, выбранных по результатам анализа литературы.

2. По разработанной методике провести генотипирование коллекционных штаммов бифидобактерий. Оценить дополнительные

возможности использования однокопииного гена трансальдолазы в идентификации штаммов бифидобактерий.

3. Применить методику для видовой идентификации изолятов бифидобактерий выборки клинически здоровых детей раннего возраста.

4. Оценить влияние синбиотичсского препарата «Бифидум-Мульти-1» на состояние бифидофлоры грудных детей, у которых при первичном обследовании культивируемые бифидобактерии не были выявлены.

Научная новнзна. Разработана методика генотипирования бифидобактерий на основе секвенирования двух локусов генома - фрагментов информационного гена 16S рРНК и операционного гена трансальдолазы (tal).

При анализе множественного выравнивания референсных последовательностей анализируемого фрагмента 16S рДНК бифидобактерий 25 видов, имеющихся в GenBank, выявлена вариабельная область вставки - делеции (с 450 по 480 основание по гену 16S рРНК Е. coli DH10B), однозначно характеризующая принадлежность штаммов бифидобактерий к видам В. bißdum, В. breve, В. animalis, выявляющая разнообразие внутри вида В. adolescentis, но не различающая представителей близкородственных видов В. infantis и В. longum. На основании сравнения последовательностей фрагмента гена tal (301 п.н.) 9 видов бифидобактерий, представленных в GenBank, определен критерий отнесения штаммов бифидобактерий к виду - менее 3% отличий на данном отрезке генома.

Применение разработанной методики для видовой идентификации коллекционных штаммов и изолятов бифидобактерий из кишечника детей раннего возраста позволило обнаружить коагрегированные, генетически неоднородные штаммы, а также штаммы, являющиеся природными рекомбинантами, сохраняющими эту особенность при длительном культивировании. Выявлены значительные изменения в видовом составе бифидофлоры клинически здоровых детей раннего возраста по сравнению с данными 1980-х гг. Прослежены этапы становления бифидофлоры кишечника после синбиотикотерапии и показано, что препарат «Бифидум-Мульти-1» стимулирует развитие собственной бифидофлоры грудных детей.

Научно-практическая значимость. Разработанная методика двухлокусного типирования на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и tal позволяет не только достоверно осуществлять идентификацию коллекционных, производственных и нововыделенных штаммов бифидобактерий пяти видов: В. adolescentis, В. bifidum, В. breve и трудноразличимых по фенотипическим признакам В. infantis и В. longum, но и выявлять коагрегированные, генетически неоднородные штаммы и штаммы, являющиеся природными рекомбинантами.

Разработанная методика двухлокусного генотипирования может использоваться для идентификации штаммов бифидобактерий при формировании и систематизации музейных коллекций, создании стартерных культур и заквасок прямого внесения при производстве продуктов функционального питания в пищевой промышленности, оценке состояния микрофлоры кишечника и при подборе консорциума штаммов лечебно-профилактических про- и синбиотических препаратов для человека и сельскохозяйственных животных.

Создан банк плазмид, содержащих целевые вставки фрагментов генов 16S рРНК и tal коллекционных штаммов. Плазмиды могут быть использованы в качестве референтов при идентификации штаммов бифидобактерий экспресс-методами, а также контролей копийности при количественном определении бифидобактерий с помощью ПЦР в реальном времени.

Секвенированные последовательности фрагментов генов 16S рРНК (51 шт) и tal (49 шт) коллекционных штаммов и изолятов бифидобактерий пяти видов были введены в GenBank и существенно пополнили имеющуюся базу данных по исследуемым мишеням.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на международной школе - конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Пущино, 2006), в рамках которой работа победила на конкурсе молодых ученых, международном конгрессе "Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты" (в рамках 9-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро-2007»), международной конференции «Вычислительная филогенетика и геносистематика» (Москва, 2007),

международном междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, Украина, 2008), международной школе - конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Пущино, 2008), VI и VII молодежных научных конференциях «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва. 2006, 2007).

Объем и структура работы. Работа изложена на 122 страницах, содержит 9 рисунков и 17 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (3 главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (139 источников), в том числе на иностранных языках - 118.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Штаммы бифидобактерий. Чистые культуры 19 депонированных штаммов бифидобактерий из Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (Federal Human Host Microflora Bank, далее FHHMB) МНИИЭМ им. Г.П. Габричевского Роспотребнадзора, из которых 11 производственных, и 30 изолятов бифидобактерий из кишечника детей раннего возраста были любезно предоставлены с целью проведения генотипирования сотрудниками лаборатории биологии бифидобактерий МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Жиленковой О.Г. и Амерхановой А.М. Два коллекционных штамма бифидобактерий были приобретены во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Russian National Collection of Industrial Microorganisms, далее RNCIM) ГНЦ ГосНИИгенетика.

Бифидобактерии культивировали по стандартной методике. Видовое определение проводили на основе биохимических тестов АНАЭРОтест 23 (PLIVA-Lachema diagnostica s.r.o., Чехия), api 50 СН (bioMerieux, Франция).

Микробные культуры отмывали забуференным физиологическим раствором, по оптическому стандарту мутности (bioMerieux, Франция) доводили до концентрации 107-108 КОЕ/мл. замораживали при -20°С для хранения и транспортировки.

Характеристика выборки детей раннего возраста. Клинически здоровые дети в возрасте 1-18 месяцев с рождения находились на грудном вскармливании и далее на смешанном питании по возрасту. Из 11 детей при первичном бактериологическом обследовании культивируемая бифидофлора не была выявлена у 4 грудных детей. Этим пациентам был проведен двухнедельный курс синбиотикотерапии препаратом «Бифидум-Мульти-1» по 5 доз дважды в день. Через 10 дней и через 2 месяца после окончания терапии фекальные массы детей были вновь взяты на анализ.

Получение первичных изолятов. Образец фекальных масс в количестве 1 г растворяли в 10 мл физ. раствора, проводили серию десятикратных разведений в среде для выделения и культивирования бифидобактерий (НИИ Прикладной микробиологии, Оболенск). Посевы культивировали при температуре 37,0±1,0°С в течение 48 ч. Из пробирок с разведением Ю"8-10"10 отбирали единичные колонии, характерные для бифидобактерий. Дальнейшие десятикратные разведения отобранных колоний с одновременным контролем морфологии клеток посредством микроскопии проводили до получения чистых культур бифидобактерий. Определение антибиотикорезистентности. Индивидуальные характеристики выделенных штаммов дополняли исследованием антибиотикорезистентности к 32 антимикробным веществам, применяемым в медицинской практике. Изучение проводили диско-диффузионным методом в интерпретации, разработанной в лаборатории биологии бифидобактерий МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского с учетом рекомендаций МУК 4.2.1890-04.

Выделение ДНК. Тотальную ДНК бифидобактерий выделяли из 100 мкл суспензии клеток (106-108 КОЕ/мл) методом сорбции на силикагеле с помощью набора 1ЖА-Нх1га8огЬ по прилагаемой инструкции (лаборатория молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИСБ РАСХН, Москва). ПЦР. Амплификацию фрагмента гена 168 рРНК осуществляли с праймерами В168Р1, 5'-СССГООТААТОСССОАТС-3' (ЗаЮкап Л.М. е1 а1„ 2001), и В16811, 5'-АТТАСССССОСТССТСО-З' (М1уаке Т. й а1., 1998) по программе: 95°С - 10 мин, (95°С - 30 с, 57°С - 20 с, 72°С - 40 с) х 35, 72°С - 5 мин; а амплификацию фрагмента гена трансальдолазы - с праймерами В1аК'ог, 5'-СОТСОССТТСТТСГТСОТСТС-3', и В1а1Ке\\ 5'-СТТСТСССССАТОСТОТТ(;ЛС-3'

(Requena Т. et al., 2002), по программе: 95°С - 10 мин, (95°С - 30 с, 58°С - 30 с, 72°С - 30 с) х 35, 72°С - 5 мин - в амплификаторе «Терцик» (ДИК-Технология. Россия) с применением активного точного режима регулирования. PCR - DGGE. Амплификацию фрагмента гена 16S рРНК осуществляли с праймерами B16SR и B16SF1-GC, 5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGG-CACGGGGGGGGGTGGTAATGCCGGATG-3' (Satokari R.M. et al., 2001) по стандартной программе. Электрофоретическое разделение проводили на приборе HIS (Hoefer Scientific Instruments, USA) в 1х ТАЕ-буфере при 130 V и 65°С в течение 4,5 часов в полиакриламидном геле (6,5% акриламид-бисакриламид [37,5:1]) с градиентом 7 М мочевины от 45 до 65% и 40% формамида, увеличивающемся в направлении электрофореза. Стабильную температуру на уровне 65°С поддерживали с помощью термостата с системой циркуляции воды. По окончании электрофореза гель окрашивали серебром по стандартной методике.

Клонирование ПЦР-продуктов. Ампликоны клонировали в клетках Е. coli штаммов DH5a и XL-10 Gold с использованием векторных систем pGEM-T Easy (Promega, Madison, Wis., США) и pTZ57R/T (НПО "Fermentas", Литва) по предлагаемой методике. Плазмидную ДНК отобранных клонов выделяли методом щелочного лизиса по стандартной методике. Предварительную проверку плазмид осуществляли методами ПЦР и рестрикции эндонуклеазами EcoRI, Cfr 101, HindIII и Sali.

Секвенирование. Клонированные фрагменты генов 16S рРНК и tal 21 коллекционного штамма амплифицировали с использованием Су5 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (праймер T7, 5'-TAATACGACTCACTATAGGGC-3') по программе: 95°С - 10 мин; (95°С - 30 с, 54°С - 30 с, 72°С - 1 мин) х 40. Электрофоретический анализ проводили на приборе ALF Express II (Amersham Biosciences, США).

Секвенирование ПЦР-фрагментов генов 16S рРНК и tal 30 изолятов бифидобактерий из кишечника детей раннего возраста проводили на автоматическом секвенаторе 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems / Hitachi, США) с использованием программы и набора реактивов для секвенирования к прибору.

Идентификацию секвенированных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК и tal осуществляли с помощью BLAST 2.2.8 Search, выравнивание и анализ гомологии - с помощью ClustalW (1.83) Multiple Sequence Alignment. Анализ кривых плавления ПЦР-продуктов. Амплификацию фрагмента гена tal осуществляли на приборе для ПЦР в реальном времени IQ5 (BIO-RAD, США) с праймерами BtalFor и BtalRev по программе: 95°С - 10 мин, (95°С - 10 с, 58°С - 10 с, 72°С - 40 с) х 50 с, с последующим плавлением полученных ПЦР - продуктов путем постепенного нагревания от 72 до 105°С со скоростью 1°С/с с автоматической детекцией флуоресцентного сигнала. По каждому из 9 разведений плазмиды по 34 температурным точкам с помощью прикладной программы прибора строили кривую плавления, определяли температуру плавления исследуемого фрагмента ДНК по основному пику.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Разработка методики видового типирования бнфидобактерий на основе двухлокусного секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и tal 1.1. Разработка специфичных ПЦР - систем на основе фрагментов генов

16S рРНК и tal

После подробного анализа литературы по филогении и таксономии бифидобактерий в качестве мишеней для генотипирования были выбраны информационный ген 16S рРНК и операционный ген трансальдолазы (tal), представленный в геноме В. infantis АТСС 15702 в одной копии.

Следующим этапом работы стала разработка специфичных ПЦР - систем. По гену 16S рРНК для анализа был выбран участок длиной 351-356 п.н. (с 164 по 534 основание по гену 16S рРНК Е. coli DH10B), внутри которого находится область вариабельности V3 (по Stackebrandt Е. et al., 1997), наиболее изменчивая в пределах рода Bifidobacterium. По гену tal для анализа был взят фрагмент длиной 301 п.н. (с 588 по 889 основание по гену tal В. infantis АТСС 15702), выбранный группой Requena Т. et al. (2002). Далее были подобраны компоненты ПЦР - системы, оптимизированы программы амплификации, проведена проверка на специфичность.

При постановке ПЦР не было отмечено ни одной ложно-положительной перекрестной реакции. Специфический продукт расчетного размера с праймерами на мишени 16S рДНК и tal амплифицировался исключительно на ДНК Bifidobacterium spp., что показано на коллекционных штаммах бифидобактерий 12 видов. Постановка ПЦР с ДНК контрольных организмов, входящих в состав микрофлоры кишечника человека и сельскохозяйственных животных,-представителями других родов эубактерий (Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, L. plantarum) и дрожжеподобного грибка Candida albicans - дала отрицательные результаты.

Следующим этапом работы стал выбор метода анализа ПЦР - продуктов, позволяющего идентифицировать единичные замены в последовательностях ДНК и, таким образом, различать бифидобактерии на уровне вида. Метод PCR-DGGE не позволил однозначно различить по электрофоретической подвижности ампликоны 16S рДНК видов В. adolescentis, В. infantis и В. longum. К тому же, отсутствовали референсные фрагменты ДНК, по положению которых в геле можно было бы оценивать подвижность ПЦР - фрагментов анализируемых штаммов. Поэтому в качестве основного метода генотипирования было выбрано двухлокусное секвенирование на основе фрагментов генов 16S рРНК и tal.

1.2. Выработка критерия отнесения штамма бифидобактерий к виду Для выработки критерия отнесения к виду было проведено множественное выравнивание в ClustalW всех имеющихся в GenBank референсных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК и tal, методом попарных сравнений построены древа гомологии и проведен филогенетический анализ.

Анализ выравнивания имеющихся в GenBank 87 последовательностей фрагмента гена 16S рРНК референсных штаммов 25 видов бифидобактерий позволил выявить вариабельную по длине и нуклеотидному составу область вставки - делеции (с 450 по 480 основание по гену 16S рРНК Е. coli DH10B) (рис. 1), однозначно характеризующую принадлежность штаммов к видам В. bifidum, В. breve, В. animalis, но не различающую представителей близкородственных видов В. infantis и В. longum. Внутри вида В. adolescentis эта область вариабельна как по длине, так и по нуклеотидному составу.

31096. в. Ьгое Х'М 782 КАВ116128) ааасстсттттотт-оооаосаапос -ГТТ в Г то ао т^

р|097 В.кт<(Х'М7022<АВ1Ш27) ааасс тсттт то тт-оооаосаа:-ос -тттттт от тело г £¡(09) в.ьгт Х'М 7817 (АВ11(291) ааасстсттттотт»оооаосааос аттттт! опоаот £¡¡094 В.ЬтчХ'М7816(АВ116290) ааасстсттттотт-оооаосаа ос "ТТТТ Т1 о ' тоаот £¡¡090 В.кт(Х'М7816(АШ!!4) ааасстст т ттотт -оооаосаа'-ос -ттттт1 01 тоаот •¡¡¿180 В.ЬгеЫа-п1р(ЛГ49181?)ааасстсттттотт..оооаосаа'..ес ЛТТТТТ оттоаот £¡¡09? В. Ьтт ХМ 7828(АВН6291) ааасстсттттотт-оооаосаа ос лтттг 1«Т оттоаот £¿10101 В.Ьт^КМ л)2О(АН918)))ааасстсттттотт..0ооаосаа ос -ттттот о г тоаот £¡¡098 в.ктие ХМ70|9(АВ116292) ааасстсттттотт-оооаосаа.-ос -ттттот оттоаот ааасс тсттттотт'-оооаосаа-ос -тттю1 оттоаот 01091 В.ктгвшшшбо) ааасстсттттот7.сооаосаа ос ы тттот о.тоаот £¡¡099 В.ЬтгХ'М 127ИАВ116289) ааасстсттттотт-оооаосаа.-ос с т т Т о т о т то ао т •¡¡092 В, Ьгст'е вш (АУ715482) ааасстсттттотт-оооаосаа ос йСТТГОТ о' тоаот £¡¡¿>10! В.Ьго'гКВ90(АУ51171|) ааасстсттттотт .оооаосаа ос тттн1 61т1*а<'т ааасстсттттотт-оооаосаа-ос ¿стттот отоаот ааасстсттттотт~оооаосаа:-ос : тттвт оттоаот ааасстсттттотт.оооаосаа ос -:тттвт 01т0а0т/ «0284 В."*1аг1С'М11в9(АВ||41«)ааасстсттттоттьоооаос ааос от а ..отоаот .яс;1."1 в.1|«ч|" км 125л >ав111)28' ааас.(£1сттттоттооавсаа<>сс ттс ■ о оотоаотг^ |! I. Миш .1' М I? IИI!!»'.АААССТСТТТТОТТ ТОООАОСАА с С ТТС О ООТОАОТ АААССТСТТТТОТТ [ОООАОСАА.-'.С тТС О ООТОАОТ |1(мк1гчв.кМ1«1ННМВ5И' ' АААСС Т СТ Т ТТб Т Т ТОООАОСААС- С С ТТС- в ООТОАОТ

:>|041.'вчв к)И«»ПШМВ1<.п АААССТСТТТТОТТ ТОООАОСААС-сс ТТС О ООТОАОТ ■ емшчи ЫШт1Ш1< АЛЛССТСТТТТ«ГПМЛ«САЛ-СС ТТС о ООТОАОТ

5.1|»нм< мнингннмвпч )(> ! <1|«г' АААССТСТТТТОТТ тОООАОСАА'.сС тТС О ООТОАОТ ЙКЬ'И в.ыяаит ВЦ 1ЛЛ64)1181 АААССТСТТТТОТТТОООАОСАА.-СО ТТС О ООТОАОТ л ^¡минышикм 201:^ (я1621 АААССТСТТТТОТТ ТОООАОСАА'.-сс 1 ТС О ООТОАОТ В.кШшк("1(4202(1 АААССТСТТ ТТОТ Т ТОООАОСАА-г. С ПС О ООТОАОТ Н0"2 В.ЬШЛшьК'М 1а)1(ЛВЦ6286 АААССТСТТТТ6ТТТОООАОСАА..1С ТТС О ООТОАОТ :1;;1,'1 В Шши«ГШ:<АВН01| АААССТСТТТТОТТТОООАОСАА^С ТТС О ООТОАОТ .•¡,0~6 I) кШши.ИЛ1 1Ж|А1Ш62«1'ЯаАССТСТТТТОТТ ;ОООАвСАА-'С г ТС О ООТОАОТ £¡¡0215 II. ЫкитЯМ ИП:Т(ЛВ116101> АААСС:-СТТТ О-ТТОООАОС ААОС О »0 нОТОАОТ ¡>¡.021» В.|(11«1»(оП1»К'М?819Т(АВ11б:9',1АААСС"СТТТТОьТТООвАОС ААОС О -О яОТОАОТ »0212 В. пищим ДМ5«2|Т(АВ11<12в) АААСС СТТТТО-Т ТОООАОС ААОС О ■>» »ОТОАОТ »1511212 В. пишттеЛ'М*821Т(А1Ш61!»| АААСС-СТТТТОТТ ТОООАОСАА- СССТТСОО ООТОАОТ Й02О6 В. гшммлйшХМ8221 (АВ1161461 АААССС-СТТТТОТТ ТОООАОСАА-- СССТТСОО ООТОАОТ »¡¡056 В. лйоЫяЫкМПМ2(Ш162Ц) АА СС СГГТТОТГ ОООАОСАА ССТТСОО ООТОАОТ

840282 11.|11™орУип1П1)|Ч)лЛшшКВЦ"(1)у!Ю«"| АААСС-СТТТТОТТ ЮООАОСАА СССТТСОО ООТОАОТ арЬ22) В. иитЛ1иЬ1р.1иш\'П'4121(ЛВС"0П6.1| АААСС -СТТТТОТТ : - -ОСАА-ОСАСООТТТСООССОТОТТОАОТ^) И0224 В. штЫВ. ЬгА)1Ш 101« 11111 (Х89Я1) АААСС -СТТТТОТТ : --О-ОСАА -ОСАСООТТТСООССОТО т ТОАОТ I

АААСС-СТТТТОТТ.....0 ОСАА ОСАСООТТТСООССОТО ТОЛ Т Г

«Ц0222 В.иипч1и>в)»р. 1мн<АУ1М1Г| АААСС :-СТТТТОТТ с - --О ОСАА-ОСАСООТТТСООССОТО т ТОАОТ -И[! ЫМшКЧПМ! Л( 1:41(1' АААСС >СТТТТОТТС «йО-ОСАА -ОСАСбОТТТСООССОТО т ТОАОТ

£¡¡0289 В.^^.кпг1Ш11*П1.р1™1о11Ч1««ХМ,082(.У111»1-М|АААСС:'СТТТТОТТС^вС.вСАА' ОС -.-вТСТТСОО ССС9-ТОАОТ £110228 В.гЬптш)1.1<'М12!2Т(АВШ29б|АААСе -СТТТ ОТТс "»-ОСАА -ОС ',» IСТТСОО -СС ОТТОАОТ >40208 В.руиНоЬпгчпниЬ^.р^оЬпгвтК'кГвбКАВП«!») АААСС .СТТТТОТТС «-О гОСАА-ОСАСООТТТСООССОТОТ ТОАОТ Я021О В.р«-1ЙоЬпгШ|ии)|!р.«Ы|омт1('М"092(.АВ116Н4|АААСС'-СТТТТОТТС^О..ОСАА..вСАСООТТТСООССОТОТТОАОТ «021« Н. гиигик КМ12111 (А В1162981 АААСС -СТТТТОТТ' ОАОСАА ОСАЧ ■ ТТТСОО ОТО I ТОАОТ Й0214 В.т1»щ»К'М,128(АВ11«22) АААСС >СТТТТОТТС дС»АОСАА:-вСАТ т сТТТт ТО -ОТО" ТОАОТ £¿0216 • В. (Дп ХНШ (ЛВ НШI АЛАСГЛГТТТТПйТТЛТГ «О Г А А.-ОСтг гТТТГвЛ.',.. „ТОТ ТОАОТ

Рис. 1. Выравнивание фрагментов 16Б рДНК референсных и коллекционных штаммов. Область вставки-делеции (с 450 по 480 основание по гену 168 рРНК Е. соИ ОН 10В).

?1|0>55-¡р||Й?7 - Е

!. айо1к(наи ДМ7044(АВ1162,' РАААССС-СТ ТТ - вАС ТвООАвС

I. мЬкзсейи :ДМ1275Т (АВ116269) АААС СС- С т Т Т ТОА с т 060А« С В. ааоЬ<-еп&Е-981в74Тс1о1егт1-](АГ275881)АААССС-СТТТТОАС ТОООАОС $№51 • В. аЛоЫшщ Е 9Я1П74Тг1опр пг»5 (&1775Й2) АААССч» СТТТТФАС ТОООАОС гЩ б 1 - В. аЛоЬсеп!« Е.2-32 (А У305 384) А А А С С О С Т Т Т Т О а с т 0 в в Ав С

йжтар ГННМВ Ш ФОПТЧ» ^^Но^^^Ва г. Т О О С- »6 С ?1)0>217-В. йеШзшп <1СМ П95Т (АВ116299) АААС С1? СТТТТОАТСвООАОС §1^60 В. а<1о1«сепЙ5 гВ1 (АВ125904) АААССС- СТ ТТТОАС то 00 АО С о(У>52 - В. а<1о!всеп& лсмт048(а.в115274) ааасс<-стттта»тсв00а6с 54^)211 В. р*и1оса» гаЦалип ДМ 7041 1ШШ31>АААСС<:-СТТТТОАТС6вОАОС 21(26221 - В.гаКшЬпш ДМ1194Т(АВ116294»ААА с С с- С г т т те а т с о ее АО С 5^?3-В. а4о1кгепШ ДМ 7046 (АВ116273) аа N ее- С Т т Т ОАСТОООАОС ¿¡(¿Ь?4 В.а1ок5№пЙ! ДМ7845(АВ116272) ааассосттттоастоооаос - в. ааоЬгепй!:ДМ 1251 (АВ116268) ААА С С с- с Т т т Т в а с т в ее АО с £|||Ё)>21)-В. тетуггшпДМ8228(АВ116325) АААССС-сттттетсвОбвАОС £¡1^62 В. аЛоксеЩв В48 Ф0515912) АААСС<-СТ ТТТОАС ТОО® АО С ЙУ>41В. кярлп КГ1С1М 04»201 АС-1251 (IX? А А А с сс т т т т о а с т о о о АО с я||г)>59-В.а|Ыксеп& 2Ш(АВ12ЯМ| АААССС- СТТТТОа с ТОООАОС г^ЦеНКВЯВ.аЫж»1>ЕННМВ 00-И (ЕГ4»9К5)^^«И|ттеас твОвАОС

АААССТСТТТТАТСвбОйАбС АААССГСТТТ-»ТСООООАОС АААССТСТТТТАТСООООАОС АААССТСТТТТАТСвОООАОС АААССТСТТТТАТСООООАОС АААССТСТТТТОТСООООАОС ЛААССТСТТТТатсвбвеАвС АААССТСТТТТАТСООООАОС АААССТСТТТТАТСООООАОС АААССТСТТТТАТСООООАОС АААССТСТТТТАТСООООАОС АААССТСТТТТАТСвОООАОС я1*Ь4в9В$В Ьпрт ГННМВ !79Я)(ЗИ7<Я)АААССТСТТТТАТСООООАОС р1У>418В5В.ЬвгитГННМВУа-ЗФ088т559 ааа с с т с т т т т а т с ее о о ав с г^|гМ14В8 В.шЫагеяш ГННМВ МЯ-42 (Е АААССТСТТТТАТСООООАОС

АААССТСТТТТАТСООООАОС 1»пртЖНИВ8(ЕЕ4в99^2| ¡»ААС ТСТТТТАТСООООАОС о||гЬ418В8В.ГННМВ II 45(ЕЕ40991») АААССТСТТТТатсеееоАбС

АААССТСТТТТАТСООООАОС АААССТСТТТТАТСООООАОС АААССТСТТТТАТСвОООАОС АААССТСТТТТАТСООООАОС АААССТСТТТТАТСООООАОС рН^ИПВЯВ. Ьцгшп ЕННМВ 46 (1Е4899" АААССТСТТТТАТСввООАОС

5)ЙкадХВ.я1оЬгг111» ЕННМВ 15-И ГО0М755

р1в>4МВ8 В. Ыми ЕННМВ 71-15 ф<3«87 рЦМвВ.? В. т!э(Ш5 ГННМВ 312-87 0*088'

АААССТСТТТТАТ СО00ОАОС

АААССТСТТТТАТСООООАОС АААССТСТТТ■АТС0000А0С АААССТСТТТТАТС0600А0С АААССТСТТТТАТСвОООАОС АААССТСТТТТАТСООООАОС АААССТСТТТТаТСОввОАОС АААССТСТТТТАТСвОООАОС АААССТСТТТТАТСООООАОС р|^205 -В. иоиЬгг ЛСМ 8508 (АВ116!50||ААСС':-СТТТ1)А|СООООА6С г4£Ь207 -В.ри1Ьпт ДМ Ш4Т(АВШ345МААССС-сттттатсв660АОС Я1Й201- В.гаШмпЩ|Д'М6291 Ф86191.1) АААССС-СТТТТат сбвво АОС

ААОС

ААвС ААОС ААОС ААвС ААвС ААвС ААвС ААОС ААОС ААвС ААвС ААОС ААОС ААвС ААОС ААОС ААОС ААвС ААОС ААОС ААвС ААвС ААОС ААОС ААОС ААОС ААОС ААОС ААОС ААОС ААвС ААвС ААвС ААвС ААвС ААОС ААвС ААвС ААОС ААОС ААвС ААОС

ААвС

ААОС

ААвС

ААв

ААвС

ААОС

ССТТСОО

С-ТТСОв ССТТСвв ССТТСвв ССТТСвв С -ТТС66 ССТТСвв ссттсвв С Т Т с ■ в

етте-■в СТТС■•в ССТТСОО ССТТСвв ССТТСвв етте в

ССТТСОО ССТТСвв СС ТТСОв ТТСОв Ав

00 ТОАв Т

ОвТОАОТ 00С6А0Т ООТОАвТ ввТвАОТ

во ТОАв Т

ООТОАвТ ОвТвАвТ ОйТОАвТ 00 Тв Ав Т ОвТвАвТ

ввТвАвТ

ОвТОАОТ

ОвТвАвТ

вОТОАОТ

вв ТвАвТ

вв Т6А0 тУ

АвТОАОГу

- а

АвТвАОТ

АвТОАОТ

Ав Тв Ав Т

АвТвАвТ

АвТвАОТ

АО ТОАв Т

АвТвАвТ

АвТОАОТ АвТвАвТ АвТОАОТ АвТвАОТ АвТвАвТ АвТОАОТ АвТОАОТ АвТОАОТ АвТвАвТ АО ТО АО Т АвТвАвТ АвТвАвТ АвТвАОТ

АвТвАвТ

АвТвАвТ АвТОАОТ АвТвАвТ АвТвАвТ АвТА- ОТ АОТОА6Т ТО Ав Т А 6 Тв Ав Т АвТвАОТ АвТвАОТ АвТвАвТ

Рис. 1 (продолжение). Выравнивание фрагментов 16Б рДНК референсных и коллекционных штаммов. Область вставки-делеции (с 450 по 480 основание по гену 168 рРНКЕ соП ИН10В).

Анализ сходства последовательностей фрагмента гена tal 11 референсных штаммов 9 видов бифидобактерий, представленных в GenBank, позволил выявить критерий принадлежности к виду - менее 3% отличий на данном отрезке генома.

Типирование по фрагменту операционного гена tal не только позволяет различать близкородственные виды В. infantis и В. longum, В. catenulatum и В. pseudocatenulatum в отличие от консервативного информационного гена 16S рРНК, но и выявлять внутривидовые различия для штаммов В. adolescentis, В. breve, В. longum. Но данная мишень не позволяет дифференцировать виды В. angulatum и В. catenulatum, различимые по анализируемому фрагменту 16S рДНК.

1.3. Оптимизация этапов методики генотипирования по двум мишеням

Далее были отработаны этапы элюирования ПЦР - фрагментов из геля и их клонирования, осуществлены методические доработки ПЦР - систем по обеим мишеням для проведения секвенирования: подобраны компоненты, оптимизированы программы амплификации и этапы пробоподготовки, отработан этап заливки геля, нанесения проб в гель, работа с полученными последовательностями.

Итогом первого этапа работы стала разработка методики видового типирования бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов информационного гена 16S рРНК и операционного гена tal, включающей этапы выделения ДНК из чистой культуры, постановки ПЦР, элюирования целевых ампликонов из агарозного геля и их клонирования, секвенирования целевых локусов генома и идентификации полученных последовательностей. Разработанная методика генотипирования по двум локусам позволяет достоверно различать штаммы бифидобактерий интересующих пяти видов - В. adolescentis, В. bifldum, В. breve, В. infantis, В. longum, а также видов группы В. adolescentis (В. catenulatum, В. pseudocatenulatum, В. angulatum) и вида В. animalis.

2. Применение разработанной методики двухлокусного секвенирования для видовой идентификации 21 коллекционного штамма бифидобактерий

Следующим этапом работы стало клонирование ПЦР - фрагментов генов 16S рРНК и tal 21 коллекционного штамма бифидобактерий и секвенирование в 2 повторностях целевой вставки плазмид, выделенных из 3-5 клонов-трансформантов Е. coli.

По обеим мишеням было проведено сравнение между собой последовательностей целевых фрагментов одного коллекционного штамма из разных клонов. По фрагменту гена 16S рРНК отличий по клонам не было обнаружено ни по одному коллекционному штамму. По фрагменту однокопийного гена tal были обнаружены отличия по последовательностям двух клонов у пяти коллекционных штаммов: В. adolescentis FHHMB MS-42, В. bifidum FHHMB 1, В. bifidum FHHMB 35, В. bifidum FHHMB LVA-3 и В. longum FHHMB 8. Для этих штаммов бифидобактерий проводили идентификацию обеих последовательностей фрагмента гена tal. Подобные различия в последовательностях клонированных фрагментов однокопийного гена tal одного штамма могут служить хорошим ориентиром на начавшуюся дифференциацию штамма, не всегда выявляемую морфологически, но проявляющуюся в варьировании размеров колоний при последующих пассированиях.

Итак, посредством сравнения с данными BLAST была идентифицирована 21 последовательность фрагмента гена 16S рРНК (GenBank DQ887549-DQ887560, EF409964-EF409972) и 26 последовательностей фрагмента гена tal (GenBank DQ887899-DQ887909, EF417557-EF417571) коллекционных штаммов бифидобактерий. Результаты видовой идентификации представлены в таблице 1.

По результатам генотипирования 21 коллекционного штамма бифидобактерий по мишеням 16S рРНК и tal восемь штаммов подтвердили видовую принадлежность, установленную на основании фенотипических критериев, четыре штамма по обеим мишеням идентифицированы иначе, чем по фенотипическим признакам. Семь коллекционных штаммов могут быть охарактеризованы как природные рекомбинанты, а два штамма - как генетически неоднородные.

Таблица 1

Результаты идентификации штаммов бифидобактерий по последовательностям фрагментов генов 16S рРНК и tal

№ Характеристика исходного штамма Результаты идентификации секвенированных последовательностей с помощью BLAST

16S рДНК tal

Штаммы, подтвердившие видовое определение

1 Bifidobacterium adolescentis, strain: FHHMB GO-13 В. adolescentis В. adolescentis

2 Bifidobacterium bifidum, strain: FHHMB 536 В. bifidum В. bifidum

3 Bifidobacterium bifidum, strain: FHHMB 791 В. bifidum В. bifidum

4 Bifidobacterium breve, strain: FHHMB 79-88 В. breve В. breve

5 Bifidobacterium breve, strain: FHHMB 79-119 В. breve В. breve

6 Bifidobacterium infantis, strain: FHHMB 73-15 В. infantis В. infantis

7 Bifidobacterium infantis, strain: FHHMB 11 -45 В. infantis В. infantis

8 Bifidobacterium longum, strain: FHHMB 379 В. longum В. longum

Штаммы, типированные иначе, чем по фенотипическим признакам

9 Bifidobacterium longum strain: RNCIM AC-1251, D4a200 В. adolescentis В. adolescentis

10 Bifidobacterium longum, strain: FHHMB 46 В. infantis В. infantis

11 Bifidobacterium adolescentis, strain: FHHMB 75-13 В. longum В. longum

12 Bifidobacterium bifidum, strain: RNCIM AC-1248, 83 В. animalis В. animalis

Штаммы - природные рекомбинанты

13 Bifidobacterium adolescentis, strain: FHHMB 40 В. adolescentis В. animalis

14 Bifidobacterium bifidum, strain: FHHMB 35 5. bifidum В. breve

15 Bifidobacterium bifidum, strain: FHHMB LVA-3 В. bifidum В. breve

16 Bifidobacterium breve, strain: FHHMB 23 В. breve В. animalis

17 Bifidobacterium infantis, strain: FHHMB 302-87 В. infantis В. animalis

18 Bifidobacterium longum, strain: FHHMB Ya-3 В. longum В. adolescentis

19 Bifidobacterium adolescentis, strain: FHHMB MS-42 В. longum В. breve

Генетически неоднородные штаммы

20 Bifidobacterium bifidum, strain: FHHMB 1 В. bifidum Clone 1 В. bifidum Clone 2 В. breve

21 Bifidobacterium longum, strain: FHHMB 8 В. longum Clone 1 B. breve Clone 2 B. animalis

Tuipeidije feiuj

i'J!

4Ú0

1 150 1ÜÚ 50 0'

100

Рисунок 2. Кривые плавления ПЦР-фрагментов гена tal (301 п.н.) коллекционных штаммов 5. longum FHHMB 379 и 5. longum FHHMB Ya-3.

Для исследования штамма - природного рекомбинанта В. longum FHHMB Ya-З был использован также метод анализа кривых плавления. Были сделаны последовательные разведения 109-10' плазмид, амплифицирована в ПЦР целевая вставка фрагмента гена tal коллекционных штамммов В. longum FHHMB Ya-З и В. longum FHHMB 379, проведено плавление полученных ПЦР - продуктов. Показано, что для фрагментов гена tal штаммов В. longum FHHMB Ya-З и В. longum FHHMB 379 температура плавления отличается на 1 градус (см. рис. 2),

Me* Peáí Cíwrt

что свидетельствует о значительных отличиях в пределах анализируемых фрагментов ДНК этих двух штаммов.

3. Применение разработанной методики для видового типирования 30 изолятов бифидобактерий из кишечника 11 детей раннего возраста

Следующим этапом работы стало применение разработанной методики двухлокусного типирования бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и tal для оценки видового состава кишечной бифидофлоры российских детей раннего возраста. Особенное внимание уделялось поиску вида В. infantis, наиболее физиологичного для детей этой возрастной группы.

При первичном анализе молекулярно-генетическими методами несколько изолятов были признаны негомогенными. Выделенные бифидобактерии имели очень высокую способность к авто - и коагрегации, поэтому разделить штаммы, отличающиеся морфологически и по видовой принадлежности, удалось только после многократного пересева клеток. Например, рассев изолята OV-4 привел к выделению трех штаммов бифидобактерий: двух штаммов вида В. ruminantium и одного - В. breve.

Далее были проведено секвенирование и идентификация с использованием данных BLAST тридцати последовательностей ПЦР - фрагментов генов 16S рРНК (EU-272010-EU272014, EU334365, FJ169922-FJ169944, FJ357032) и tal (EU272016-EU272021, EU334366, FJ357016-FJ357031) изолятов бифидобактерий из кишечника детей раннего возраста.

Результаты генотипирования вновь выделенных штаммов представлены в таблице 2. Из 30 проанализированных изолятов 28 показали одинаковую видовую принадлежность по обеим мишеням, а для двух штаммов OV-1 и OV-13, выделенных у детей после синбиотикотерапии, результаты видового типирования по фрагментам генов 16S рРНК и tal оказались различными.

В первой группе детей, имевших первичную бифидофлору, у троих детей бифидобактерии представлены тремя и более штаммами, принадлежащими к 2-3 видам бифидобактерий, у четырех детей были выделены бифидобактерии одного вида. Следует отметить, что штаммы, отнесенные к одному виду, например, В. adolescentis, были четко различимы по морфологии. В целом у детей, имевших

первичную микрофлору, присутствовали бифидобактерии следующих видов: В. bifldum (36%), В. pseudocatenulatum (29%), В. adolescentis (21%), В. angulaíum (7%), В. longum (7%). Наиболее физиологичные для детей раннего возраста виды В. infantis и В. breve не обнаружены.

Во второй группе детей, в фекалиях которых первоначально отсутствовали культивируемые бифидобактерии, после стимуляции синбиотиком «Бифидум-Мульти-1» наблюдался следующий состав бифидофлоры: В. ruminantium (50%), В. breve (19%), В. ¡ongum/B, pseudocatenulatum (13%), В. bifldum (6%), В. adolescentis (6%), В. pseudocatenulatum (6%).

Бифидофлору детей второй группы отличал высокий процент В. ruminantium, присутствие бактерий вида В. breve и наличие рекомбинанатных штаммов В. longum'B. pseudocatenulatum. Следует отметить, что после 10 дней с окончания курса приема синбиотика у большинства детей стимулировались бактерии вида В. ruminantium. По истечении двух месяцев анализ не выявил бифидобактерий В. ruminantium, но показал закрепление бактерий вида В. breve и появление рекомбинантного штамма В. longum/B. pseudocatenulatum.

Вид бифидобактерий В. ruminantium ранее связывали только с пищеварительным трактом животных. До сих пор в спорных вопросах при различении В. ruminantium и В. adolescentis, близких по составу 16S рДНК, исследователи часто склоняются к традиционной точке зрения. Однако анализ данных литературы показал, что при изучении микрофлоры, ассоциированной с мукозным слоем ободочной кишки, Nielsen D.S. et al. была выявлена ДНК, тестированная по 16S рДНК, как ДНК В. ruminantium. При анализе фекальной микробиоты Vanhoutte Т. et al также выявляли ДНК, которую можно отнести к В. ruminantium или В. adolescentis, однако посредством PCR-DGGE короткую область V3 16S рДНК невозможно различить по подвижности при минимальном числе замен, отличающих ДНК указанных видов.

При скрининге микробиома пищеварительного тракта человека (Gill S. R. et al) и при изучении популяции бактерий, характерной для городского аэрозоля (Brodie E.L. et al), исследователи выделяли ДНК, близкую по последовательности к фрагменту 16S рДНК В. ruminantium. Последовательности таких ДНК представлены в GenBank как ДНК некультивируемых бактерий. Таким образом,

этот вид бифидобактерий постоянно тестируется в кишечнике современного человека и в окружающей среде. Однако его биологическая роль еще нуждается в изучении.

Таблица 2

Видовое разнообразие штаммов бифидобактерий обследованных групп детей

Ребенок | Штамм | Видовая принадлежность

Контрольная группа здоровых детей

1 OV19 OV20 OV21 В. bifidum В. longum В. pseudocatemdatum

2 OV5 OV22 OV23 OV24 В. adolescentis В. adolescentis В. bifidum В. adolescentis

3 OV2 OV8 OV9 В. pseudocatenulatum В. bifidum В. pseudocatenulatum

4 OV7 В. bifidum

5 OV15 В. angulatum

6 OV18 В. bifidum

7 OV17 В. pseudocatenulatum

Дети после синбиотикотерапии Срок после проведения синбиотикотерапии, дни

8 OV1 OVlO-1 OVIO-З OVlO-4 OVlO-5 В. lortgum/ В. pseudocatenulatum В. bifidum В. ruminantium В. ruminantium В. ruminantium 10

9 OV6-1 OV6-3 OV6-3k OV14-1 В. ruminantium В. ruminantium В. ruminantium В. breve 10

OV12 OV13 В. breve В. longum/ В. pseudocatemdatum 60

10 OV16 В. adolescentis 10

11 OV3 OV4-1 OV4-2 OV4-3 В. pseudocatenulatum В. ruminantium В. breve В. ruminantium 10

Последовательность событий в развитии кишечной бифидофлоры после приема синбиотика, включающая элиминацию бифидобактерий В. гиттапИит

через 2 месяца после окончания приема «Бифидум-Мульти 1», сохранение бактерий В. breve и появление нового вида В. longiim/B. pseudocalenulalum, напоминает процесс становления бифидофлоры грудного ребенка. Если обратиться к публикации Mevissen-Verhage Е.А.Е. et al, то можно заметить, что с 3-ей по 12-ю недели жизни в составе бифидобактерий ребенка на грудном вскармливании количество представителей вида В. adolescentis сокращается более чем в 2 раза, количество бактерий вида В. breve остается неизменно высоким, а бактерий вида В. longum увеличивается в 1,6 раза.

Таблица 3

Сравнение антибиотикочувствительноста производственного штамма В. breve FHHMB 79-88 и детского изолята В. breve OV-12

№ Название антибиотика Интерпретация зон Содержание препарата в диске, мкг Диаметр зоны имитирования роста, мм

Устойчив Промежуточно устойчив Чувствиителен В. breve FHHMB 79-88 В. breve OV12

1 Оксациллин <10 11-13 > 14 10 20±2 35±0

2 Стрептомицин < 16 17-19 >20 - 30 ¡0±0 18±2

3 Гентамицин <12 13-14 > 15 10 30±0 0±0

4 Амикацин <14 15-16 > 17 30 12±0 0±0

5 Тетрациклин <16 17-21 >22 30 8±0 37±2

6 Ципрофлоксацин < 15 16-20 >21 5 0±0 16±2

7 Пефлоксацин <14 15-21 >22 10 6±2 0±0

8 Ломефлоксацин <18 19-21 >22 10 0±0 20±0

Сравнение детского штамма В. breve с производственным, привнесенным с применяемым синбиотиком, показало их существенное различие по чувствительности к восьми из 32 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике (см. таблицу 3). Из таблицы видно, что штамм В. breve OV12 в отличие от производственного В. breve FHHMB 79-88 чувствителен к

оксациллину и тетрациклину, но устойчив к гентамицину. Различие штаммов по приведенным характеристикам может свидетельствовать о стимуляции синбиотиком собственной бифидофлоры ребенка, а обнаружение штамма вида В. breve и после 60 дней с отмены «Бифидум-Мульти 1» подтверждает закрепление бифидобактерий этого вида в толстом отделе кишечника.

Следует отметить, что штамм В. longumJB. pseudocatenulatum, не имел аналогов по видовой принадлежности среди штаммов синбиотического препарата. Этот факт наряду с высокой способностью вновь выделенных штаммов к авто- и коагрегации служит подтверждением возможности стимуляции собственной бифидофлоры ребенка с помощью «Бифидум-Мульти 1».

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика двухлокусного видового типирования бактерий рода Bifidobacterium на основе секвенирования фрагментов генов 16S рибосомальной РНК и трансальдолазы (tal). Методика может быть использована при видовой идентификации коллекционных и производственных штаммов, а также изолятов бифидобактерий в ветеринарных и медицинских целях.

2. В результате генотипирования 21 коллекционного штамма бифидобактерий подтверждена видовая принадлежность восьми штаммов. Четыре штамма по обеим мишеням идентифицированы иначе, чем по фенотипическим признакам. Семь штаммов охарактеризованы как природные рекомбинанты, сохранившие эту особенность при длительном культивировании, два штамма -как генетически неоднородные.

3. Использование в типировании бифидобактерий однокопийного гена tal с применением метода клонирования амплифицированных фрагментов ДНК позволило выявить природные рекомбинанты и штаммы, начавшие дифференцировку.

4. Показано, что у клинически здоровых детей раннего возраста бифидофлора представлена видами В. bifidum (36%), В. pseudocatenulatum (29%), В. adolescentis (21%), В. angulatum (7%), В. longum (7%). У детей, не имевших собственной культивируемой бифидофлоры, после стимуляции

синбиотиком «Бифидум-Мульти-1» идентифицированы следующие виды бифидобактерий: В. ruminant ¡um (50%), В. breve (19%), В. longum/B. pseudocatenulatum (13%), В. bifidum (6%), В. adolescentis (6%), В. pseudocatenulatum (6%).

5. Установлено, что препарат «Бифидум-Мульти-1» стимулирует развитие собственной бифидофлоры грудных детей, ранее не имевших культивируемой бифидофлоры. Прослежена смена первично стимулированного вида В. ruminantium видом В. longum/B. pseudocatenulatum и закрепление вида В. breve в кишечной микрофлоре в течение двух месяцев после окончания синбио гикотерапии.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Миннауки ЖС-

13.4/002. «Ферменты для молекулярной биологии и генетической инженерии»

№02.435.11.3007 от 20.04.05.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Карзанова М.Е. (Субботина М.Е.), Воронина O.JL, Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы // Доклады РАСХН.- 2006.- № 5.- С. 9-12.

2. Воронина О.Л., Кунда М.С., Субботина М.Е., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. Анализ видового разнообразия бифидофлоры и влияние синбиотика «Бифидум-Мульти-1» на становление и развитие бифидобактерий у детей раннего возраста // Вопросы детской диетологии,- 2008,- Том 6,- № 5,- С. 59-64.

3. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы // Материалы Международного конгресса "Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты" (в рамках 9-го Международного Славяно-Балтийского научного

форума «Санкт-Петербург - Гастро-2007»).- СПб.- 2007,- Клиническое питание.- № 1-2.- С. A31.

4. Субботина М.Е. Генотипирование бифидобактерий // Тез. докл. Российской школы - конф. «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения С. И. Алшаняна, - Пущино,- 2006.- С. 209-211.

5. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г. Выбор мишеней для генотипирования бифидобактерий // Тез. докл. междунар. конф. Вычислительная филогенетика и геносистематика «ВФГС' 2007», к 50-летию становлении отечественной филогенетики и геносистематики,- М.: Товарищество научных изданий КМК.- 2007.- С. 38-43.

6. Воронина О.Л., Кунда М.С., Субботина М.Е., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. Бифидофлора детского кишечника - индикатор изменения экологической обстановки // Международный междисциплинарный симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине»,- Судак, Украина.- 2008.- С. 32-34.

7. Субботина М.Е., Кунда М.С., Воронина О.Л. Использование схемы двухлокусного типирования для идентификации штаммов бифидобактерий, изолированных у детей раннего возраста // Тез. докл. Международной школы - конф. «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 40-летию ГосННИгенетика,- Пущино.- 2008,- С. 173-174.

Заявки на патенты

1. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин A.B., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. № 2008128539 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium breve OV-12, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств».

2. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин A.B., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. № 2008128540 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium bifidum OV-19...».

3. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №2008128541 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium bifidum OV-7...».

4. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. № 2008128542 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium longum OV-20...».

5. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. № 2008128543 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium pseudocatenulatum OV-17...».

6. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. № 2008128544 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium angulation OV-15...».

7. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. № 2008128545 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium pseudocatenulatum OV-2...».

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

PCR-DGGE - полимеразная цепная реакция - денатурирующий градиентный гель-электрофорез (polymerase chain reaction - denaturing gradient gel electrophoresis)

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Субботина, Марина Евгеньевна

Введение 3

Список сокращений

Глава 1. Обзор литературы 6

Раздел 1.1. Характеристика объекта: бифидобактерии, их 6-20 свойства и значимость для нормальной жизнедеятельности человека

Раздел 1.2. История генотипирования. Эволюционная 21систематика. Таксономия бактерий

Раздел 1.3. Становление бифидофлоры кишечника у детей 42-50 раннего возраста

Цель и задачи исследования. '

Глава 2. Материалы и методы исследования 52

Раздел 2.1. Материалы 52

Раздел 2.2. Методы исследования 59

Глава 3. Результаты и обсуждение 70

Раздел 3.1 Разработка методики видового типироваиия 70-84 бифидобактерий на основе двухлокусного секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и tal.

Раздел 3.2 Применение разработанной методики двухлокусного 84-92 секвенирования для видовой идентификации 21 коллекционного штамма бифидобактерий.

Раздел 3.3 Применение разработанной методики для видового 92-100 типироваиия 30 изолятов бифидобактерий из кишечника 11 детей раннего возраста.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методики генотипирования бифидобактерий на основе двухлокусного секвенирования с целью видовой идентификации штаммов"

Бактерии рода Bifidobacterium являются важным компонентом индигенной микрофлоры кишечника человека и теплокровных животных. Они обеспечивают колонизационную резистентность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, обладают иммуномодулирующим действием, синтезируют аминокислоты, витамины (К, РР и группы В), биотин, летучие жирные кислоты, ферменты, участвующие в процессах пищеварения и обмена веществ.

В связи с широким спектром положительных свойств Bifidobacterium spp. часто используются в качестве пробиотиков при коррекции дисбиотических нарушений ЖКТ. Их применение особо значимо для современных детей раннего возраста ввиду дефицита или полного отсутствия кишечной бифидофлоры и изменения ее видового состава по сравнению с данными 60-80-х годов XX века даже при исключительно грудном вскармливании. Поэтому достоверная идентификация наиболее физиологичных для человека 5 видов бифидобактерий: В. adolescentis, В. bifidum, В. breve, В. infantis и В. longum, являющихся основой большинства про- и синбиотических препаратов для человека и сельскохозяйственных животных, очень актуальна как для производителей такого рода препаратов, так и для ветеринарной и медицинской практики, в особенности для педиатрии и детской диетологии.

Филогения домена Bacteria построена на анализе последовательностей информационного гена 16S рибосомальной РНК (16S рРНК). Однако возможности данной мишени на уровне ниже рода ограничены, поскольку с ее помощью нельзя различить генетически близкородственные виды бактерий. Поэтому возникает необходимость разработки альтернативных подходов, одним из которых является двухлокусное секвенирование - дополнение филогении на основе гена 16S рРНК анализом последовательностей одного из операционных генов (house-keeping genes), кодирующих наиболее значимые для исследуемого таксона белки клеточного метаболизма.

Список сокращений, используемых в тексте

16S рРНК - 16S рибосомальная РНК tal -трансальдолаза (transaldolase)

FHHMB - Federal Human Host Microflora Bank - Государственная коллекция микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

RNCIM - Russian National Collection of Industrial Microorganisms -Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов Государственного научного центра ГосНИИгенетика

АТСС (American Type Culture Collection) - американская коллекция типовых культур

DSM (Deutsche Sammlung von Microorganismen and Zellkulturen) - немецкая коллекция микроорганизмов

JCM (Japan Culture Collection of Microorganism) - японская коллекция микроорганизмов

PCR - DGGE (polymerase chain reaction - denaturing gradient gel -electrophoresis) - ПЦР - денатурирующий градиентный гель - электрофорез. dNTP - дезоксирибонуклеозидтрифосфаты ddNTP — дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты . ЖКТ - желудочно-кишечный тракт ПЦР - полимеразная цепная реакция ПААГ - полиакриламидный гель ЭФ - электрофорез

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Субботина, Марина Евгеньевна

выводы

1. Разработана методика двухлокусного видового типирования бактерий рода Bifidobacterium на основе секвенирования фрагментов генов 16S рибосомальной РНК и трансальдолазы (tal). Методика может быть использована при видовой идентификации коллекционных и производственных штаммов, а также в ветеринарных и медицинских целях.

2. В результате генотипирования 21 коллекционного штамма бифидобактерий подтверждена видовая принадлежность восьми штаммов. Четыре штамма по обеим мишеням идентифицированы иначе, чем по фенотипическим признакам. Семь штаммов охарактеризованы как природные рекомбинанты, сохранившие эту особенность при длительном культивировании, два штамма - как генетически неоднородные.

4. Показано, что у клинически здоровых детей раннего возраста бифидофлора представлена видами В. bifidum (36%), В. pseudocatenulatum (29%), В. adolescentis (21%), В. angidatum (7%), В. longum (7%). У детей, не имевших собственной культивируемой бифидофлоры, после стимуляции синбиотиком Бифидум-Мульти-1 идентифицированы следующие виды бифидобактерий: В. ruminantium (50%), В. breve (19%), В. longum/B. pseudocatenulatum (13%), В. bifidum (6%), В. adolescentis (6%), В. pseudocatenulatum (6%).

5. Установлено, что препарат Бифидум-Мульти-1 стимулирует развитие собственной бифидофлоры грудных детей, ранее не имевших культивируемой бифидофлоры. Прослежена смена первично стимулированного вида В. ruminantium видом В. longum/B. pseudocatenulatum и закрепление вида В. breve в кишечной микрофлоре в течение двух месяцев после окончания синбиотикотерапии.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Миннауки ЖС-13.4/002. «Ферменты для молекулярной биологии и генетической инженерии» №02.435.11.3007 от 20.04.05.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Карзанова М.Е., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы // Доклады РАСХН.- 2006.- № 5.- С. 9-12.

Статья в сборнике:

1. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г. и др. Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы // Материалы Международного конгресса "Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты" (в рамках 9-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро-2007).- СПб.- 2007.- Клиническое питание.- № 1-2.- С. А31.

Тезисы докладов:

Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро-2007).- СПб.- 2007.- Клиническое питание.- № 1-2.- С. А31.

2. Субботина М.Е. Генотипирование бифидобактерий // Тез. докл. Российской школы — конф. «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения С. И. Алиханяна.- Пущино.- 2006.- С. 209-211.

3. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г. Выбор мишеней для генотипирования бифидобактерий // Тез. докл. междунар. конф. Вычислительная филогенетика и геносистематика «ВФГС' 2007», к 50-летию становлении отечественной филогенетики и геносистематики.- М.: Товарищество научных изданий КМК.- 2007.- С. 38-43.

4. Воронина О.Л., Кунда М.С., Субботина М.Е., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. Бифидофлора детского кишечника - индикатор изменения экологической обстановки // Международный междисциплинарный симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине».- Судак, Украина.- 2008.- С. 32-34.

5. Субботина М.Е., Кунда М.С., Воронина О.Л. Использование схемы двухлокусного типирования для идентификации штаммов бифидобактерий, изолированных у детей раннего возраста // Тез. докл. Международной школы — конф. «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвящённой 40-летию ГосНИИгенетика,- Пущино.- 2008,- С. 173-174.

6. Карзанова М.Е. Генотипирование бифидобактерий // Тез. докл. VI молодежной научн. конф. «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии».- М.- 2006.- С. 9-10.

7. Субботина М.Е. Сопоставление результатов идентификации штаммов бифидобактерий на основе анализа фрагментов последовательностей операционного и информационного генов // Тез. докл. VII молодежной научн. конф. «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии».- М.- 2007,- С. 48-50.

Заявки на патенты:

1. Жиленкова О.Г., Воронина O.JL, Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин A.B., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №

2008128539 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium breve OV-12, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств».

2. Жиленкова О.Г., Воронина O.JL, Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин A.B., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №

2008128540 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium bifidum OV-19.».

3. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин A.B., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №

2008128541 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium bifidum OV-7.».

4. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин A.B. Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №

2008128542 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium longum OV-20.».

5. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин A.B., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №

2008128543 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium pseiidocatenulatum OV-17.».

6. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин A.B., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №

2008128544 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium angulation OV-15.».

7. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин A.B., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №

2008128545 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium pseiidocatenulatum OV-2.».

Благодарности

Работа была выполнена совместно с сотрудниками лаборатории биологии бифидобактерий Аделаидой Михайловной Амерхановой (зав. лаб.) и Ольгой Геннадьевной Жиленковой (н.с.), которыми были проведены все этапы работы с чистыми культурами коллекционных штаммов бифидобактерий и получения изолятов бифидобактерий, выделенных из кишечника детей раннего возраста.

Секвенирование последовательностей фрагментов генов 16S рРНК и tal изолятов бифидобактерий из кишечника детей раннего возраста было выполнено при участии м.н.с. лаборатории биологически активных наноструктур ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН Кунда Марины Сергеевны.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Субботина, Марина Евгеньевна, Москва

1. Белозерский А.Н. Нуклеиновые кислоты и их связь с эволюцией, филогенией и систематикой организмов: Пленарная лекция // Второй всесоюзный биохимический съезд.- Ташкент, 1969.- С. 38.

2. Ботина С.Г., Цыганков Ю.Д. Суходолец В.В. Идентификация промышленных штаммов молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типнрования // Генетика, 2006.- Т. 42.- № 12.- С. 1621-1635.

3. Гуринович Г.В., Кудряшов Л.С., Патракова И.С. Пробиотики и пробиотические продукты. М.: ВНИИ мясной промышленности им. В.М. Горбатова, 2002.

4. К 100-летию со дня рождения академика А.Н. Белозерского // Успехи биологической химии.- 2005.- Т. 45.- С. 455-462.

5. Кафарская Л.И., Ефимов Б.А., Постникова Е.А., Донских Е.Е. Особенности становления микрофлоры у детей раннего возраста // Детские инфекции.-2006.-№1.-С. 6-11.

6. КольманЯ., Рем К.-Г. Наглядная биохимия.- М.: Мир, 2004.- С. 256-259.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование.- М.: Мир, 1984,- С. 84,333-334.

8. Миндлин С.З., Петрова М.А., Басс И.А., Горленко Ж.М. Происхождение, эволюция и миграция генов лекарственной устойчивости // Генетика.- 2006.Т. 42.-№ 11.- С. 1495-1511.

9. МУК 4.2.577-96. Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов.- М.: МЗ РФ.- 1998.

10. МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.- М.: МЗ РФ.- 2004.

11. Осипов Г. Невидимый орган микрофлора человека // http://www.rusmedserv.eom/microbdiag/invisibleorgan.htm#bl

12. Примроуз С., Тваймен Р. Геномика. Роль в медицине.- М.: БИНОМ. Лаборатория знаний.- 2008.- С. 58-59.

13. Рыбальченко О.В. Бифидобактерии, их значение и использование. Учебное пособие // СПбГУ 2003.

14. Современная микробиология: Прокариоты / Под ред. Й. Ленглера, Г. Древса, Г. Шлегеля.- М.: Мир, 2005.- Т. 2.- С. 148-205.

15. Чем грозит нарушение микрофлоры кишечника // http://www.jogurt.well24.lv/ru/doctor.html

16. П.Чемерис А.В., Ахунов Э.Д., Вахитов В.А. Секвенирование ДНК // http ://www. anrb. га/molgen/ chemeri s .html

17. Шендеров Б.А. Микробиоценозы человека и функциональное питание // http://www.disbak.ru/php/contentphp?id=1052

18. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека // http://www.gastroportal.ru/php/content.php?id=l 880

19. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А. Володин Н.Н., Кафарская Л.И. Бифидобактерии: традиционный взгляд и современные генетические исследования // Вопросы практической педиатрии.- 2007.-Т.2 № 5,- С. 7679.

20. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия.- Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2004. С. 36-55.

21. Abbad Andaloussi S., Talbaoni H., Marczak R., Bonaly R. Isolation and characterization of exocellular polysaccharides produced by Bifidobacterium longum II Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1995.-V. 43.- P. 995-1000.

22. Adams M.R. and Hall C.J. Growth inhibition of foodborne pathogens by lactic and acetic acids and their mixtures // Int. J. Food Sci. Technol.- 1988.- V. 23.- P. 287292.

23. Ahn J.B. Hwang H.J. and Park J.H. Physiological responses of oxygen-tolerant anaerobic Bifidobacterium longum under oxygen // J. Microbiol. Biotechnol.-2001.- V. 11.-P. 443-451.

24. Backhed F., Hornef M. Toll-like receptor 4-mediated signaling by epithelial surfaces: necessity of threat? // Microbes Infect. 2003.- V. 5(11).- 951-959.

25. Begley M., Hill C., Gahan C. G. M. Bile salt hydrolase activity in probiotics // Appl. Environ. Microbiol.- 2006,- V. 72 (3).- P. 1729-1738.

26. Belozersky A.N., Spirin A.S. A correlation between the composition of deoxyribonucleic and ribonucleic acids //Nature.- 1958.- 182 (4628).- P. 132-133.

27. Benno Y., Sawada K., Mitsuoka T. The intestinal microflora of infants: composition of fecal flora in breast-fed and bottle-fed infants // Microbiol. Immunol.- 1984.- V. 28.- P. 975-986.

28. Berg R.D. The indigenous gastrointestinal microflora // Trends Microbiol.- 1996.-V. 4.- P. 430-445.

29. Biavati B., Castagnoli P., Crociani F., Trovatelli L.D. Species of the Bifidobacterium in the feces of infants // Microbiologica.- 1984.- V. 7 (4).- P. 341345.

30. Biavati B., Castagnoli P., Trovatelli L.D. Species of the genus Bifidobacterium in the feces of human adults // Microbiologica.- 1986.- V. 9 (1).- P. 39-45.

31. Biavati B. and Mattarelli P. Bifidobacterium ruminantium sp. nov. and Bifidobacterium merycicum sp. nov. from the rumens of cattle // Int. J. Syst. Bacteriol.- 1991.-V. 41.-P. 163-168.

32. Biavati B., Mattarelli P. and Crociani F. Bifidobacterium saeculare a new species isolated from faeces of rabbit // Syst Appl Microbiol.- 1991.- V. 14.- P. 389-392.

33. Biavati B., Scardovi V. and Moore W.E.C. Electrophoretic patterns of proteins in the genus Bifidobacterium and proposal of four new species // Int. J. Syst. Bacteriol.-1982.- V. 32.- P. 358-373.

34. Biavati B., Vescovo M., Torriani S., Bottazzi V. Bifidobacteria: history, ecology, physiology and applications //Ann. Microbiol.- 2000.- 50.- P. 117-131.

35. Breed R.S., Murray E.G.D., Smith N.R., eds. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th edn., Williams & Wilkins, Baltimore.- 1957.

36. Brodie E.L., DeSantis T.Z., Moberg Parker J.P. et al. // PNAS.- 2007.- V. 104 (1).-P. 299-304.

37. Candela M., Vitali B., Matteuzzi D., Brigidi P. Evaluation of the rrn operon copy number in Bifidobacterium using real-time PCR // Lett. Appl. Microbiol.- 2004.-V. 38.-P. 229-232.

38. Charteris W.P., Kelly P.M., Morelli L., Collins J.K. Antibiotic susceptibility of potentially probiotic Bifidobacterium isolates from the human intestinal tract // Lett. Appl. Microbiol.- 1998.- V. 26.- P. 333-337.

39. Crociani F., Matteizzi D., Ghazvinizadeh H. Species of the genus Bifidobacterium found in human vagina // Zentralbl. Bacteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. 1 Orig. Reihe A.- 1973.- V. 223.- P. 298-302.

40. Crociani F., Biavati B. Alessandrini A. et al. Bifidobacterium inopinatum sp. nov. and Bifidobacterium denticolens sp. nov., two new species isolated from human dental caries // Int. J. Syst. Bacteriol.- 1996.- V. 46.- P. 564-571.

41. Dehnart J. Untersuchungen über die gram positive Stuhlflora des Brustmilchkinder // Zentrabi. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. I. Orig. Reihe A.- 1957.- Y. 169.- P. 66-79.

42. De Simone C., Ciardi A., Grassi A. et al. Effect of Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus acidophilus on gut mucosa and peripheral blood B lymphocytes // Immunopharmacol. Immunotoxicol.- 1992.- V. 14(1-2).- P. 331-340.

43. De Vries W., Gerbrandy S.J., Stouthamer A.H. Carbohydrate metabolism in Bifidobacterium bifidum II Biochim. Biophys. Acta.- 1967.- 136.- 415-425.

44. Dong X., Xin Y., Jian W. et al. Bifidobacterium thermacidophilum sp. nov., isolated from an anaerobic digester // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.- 2000.- V. 50.-P. 119-125.

45. Fanaro S, Chierici R, Guerrini P, Vigi V. Intestinal microflora in early infancy: composition and development // Acta Paediatr. Suppl. 2003.- V 91 (441).- P. 4855.

46. Fox G. E., Wisotzkey J. D., Jurtshuk P. How close is close: 16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity // Int. J. Syst. Bacteriol.- 1992.- V 42.- P. 166-170.

47. Gavini F., Pourcher A-M., Neut C. et al. Phenotypic differentiation of bifidobacteria of human and animal origin // Int. J. Syst. Bacteriol.- 1991.- V 4.- P. 548-557.

48. Gibson G.R., Wang X. Regulatory effects of bifidobacteria on the growth of other colonic bacteria // J. Appl. Bacteriol.- 1994.- V 77.- P. 412-420.

49. Gill S. R., Pop M., DeBoy R.T. et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome // Science.- 2006.- V 312.- P. 1355-1359.

50. Gomes A.M.P. and Malcata F.X. Bifidobacterium spp. and Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics // Trends Food Sei. Technol.- 1999.- V 10.- P. 139— 157.

51. Goodfellow M., O'Donnel A.G. Handbook of new bacterial systematics / Eds Goodfellow M., O'Donnel A.G. L.: Acad. Press Ltd.- 1993.- P. 3-54.

52. Gootlieb M., Chavko M. Silver staining of native and denatured eucaryotic DNA in agarose gels // Analytical Biochemistry.- 1987.- V 165.- P. 33-37.

53. Gore C., Munro K., Lay C. et al. Bifidobacterium pseudocatenulatum is associated with atopic eczema: a nested case-control study investigating the fecal microbiota of infants // J. Allergy. Clin. Immunol.- 2008.- V 121 (1).- P. 135-40.

54. Grill J.P., Perrin S., Schmeider F. Bile salt toxicity to some bifidobacterial strains: role of conjugated bile salt hydrolase and pH // Edge J. Microbiol.- 2000.- V 46 (10).-P. 878-884.

55. Gurtler V„ Mayall B.C. Genomic approaches to typing, taxonomy and evolution of bacterial isolates // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.- 2001.- V 51.- P. 3-16.

56. Hadadji M., Behama R., Saidi N. et al. Identification of cultivable Bifidobacterium species isolated from breast-fed infant feces in West-Algeria // African Journal of Biotechnology.- 2005.- V 4 (5).- P. 422-430.

57. Holland D.F. Generic index of the commoner forms of bacteria // J. Bacteriol.-1920.-V 5.-P. 191-229.

58. Hoyles L., Inganäs E., Falsen E., Drancourt M., Weiss N., McCartney A.L. and Collins M.D. Bifidobacterium scardovii sp. nov., from human sources // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.- 2002.- V 52.- P. 995-999.

59. InsT/Aclone™ PCR Product Cloning Kit. Technical Manual. Fermentas.- 2004.l.Jian W., Zhu L., Dong X. New approach to phylogenetic analysis of the genus

60. Bifidobacterium based on partial HSP60 gene sequences // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.- 2001.- V 51.- P. 1633-1638.

61. KuIlen M.J., Brady L.J., O'SulIivan D.J. Evaluation of using a short region of the recA gene for rapid and sensitive speciation of dominant bifidobacteria in the human large intestine // FEMS Microbiol. Lett.- 1997.- V 154.- P. 377-383.

62. Lauer E. Bifidobacterium gallicum sp. nov. isolated from human faeces // Int. J. Syst. Bacterid.- 1990.-V 40,-P. 100-102.

63. Lauer E. and Kandler O. DNA-DNA homology, murein types and enzyme patterns in the type strains of the genus Bifidobacterium II Syst. Appl. Microbiol.-1983,-V 4,- P. 42-64.

64. Leahy S.C., Higgins D.G., Fitzgerald G.F., van Sinderen N. Getting better with bifidobacteria // J. Appl. Microbiol.- 2005.- V 98.- P. 1303-1315.

65. Leblond-Bounget N., Philippe H., Mangin L, Decaris B. 16S rRNA and 16S to 23S internal transcribed spacer sequence analyses reveal inter- and intraspecific Bifidobacterium phylogeny // Int. J. Syst. Bacteriol.- 1996.- V 46.- P. 102-111.

66. Lee J.H., Yoon Y.H. Characteristics of cell wall hydrolyzing enzyme of Lactobacillus spp and Bifidobacterium spp. // Korean J. Anal. Sci.- 1998.- V 40.-P. 43-50.

67. Maiden M. C. J., Bygraves J.A., Feil E. et al. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms // Proc. Natl. Acad. Sci. USA (Microbiology).- 1998.- V 95.- P. 3140-3145.

68. Matsumoto M., Ohishi H. and Benno Y. H+jATPase activity in Bifidobacterium with special reference to acid tolerance // Int. J. Food Microbiol.- 2004.- V 93.- P. 109-113.

69. Matteuzzi D., Crociani F., Zani G. and Trovatelli L.D. Bifidobacterium suis n. sp.: a new species of the genus Bifidobacterium isolated from pigs feces // Z. Allg. Mikrobiol.- 1971.- V 11.- P. 387-395.

70. Mattö J., Malinen E., Suihko M.L., Alander M., Palva A., Saarela M. Genetic heterogeneity and functional properties of intestinal bifidobacteria // J. Appl. Microbiol.- 2004.- V 97.- P. 459-470.

71. McCartney A.L. Application of molecular biological methods for studying probiotics and the gut flora // British J.of Nutrition.- 2002.- V 88 (1).- P. 29-37.

72. Meile L., Ludwig W., Rueger U. et al. Bifidobacterium lactis sp. nov., a moderately oxygen tolerant species isolated from fermented milk // Syst. Appl. Microbiol.- 1997.- V 20.- P. 57-64.

73. Mevissen-Verhage E.A.E., Marcelis J. H./De Vos M. N. et al. Bifidobacterium, Bacteroides and Clostridium spp. in fecal samples from breast fed and bottle-fed infants with and without iron supplement // J. Clin. Microbiol.- 1987.- V 25.- P. 285-289.

74. Misra A.K., Kuila R.K. Antimicrobial substances from Bifidobacterium bifidum // Indian J. Dairy Sei.- 1995.- V 48.- P. 612-614.

75. SO.Mitsuoka T. Bifidobacteria and their role in human health // J. Ind. Microbiol.-1990.- V 6.- P. 263-268.

76. Mitsuoka T., Hayakawa K., Kimura N.The fecal flora of man. II. Communication: the composition of bifidobacterium flora of different age groups. Zbl. Bakt. Mikrobiol. Hyg. I. Abt. Orig. A.- 1974.- V 226,- P. 469-478.

77. Miyake T., Watanabe K., Watanabe T., Oyaizu H. Phylogenetic analysis of the genus Bifidobacterium and related genera based on 16S rDNA sequences // Microbiol. Immunol.- 1998.- V 42 (10).- P. 661-667.

78. Op den Camp H.J.M., Oosterhof A., Veerkamp J.H. Cell surface hydrophobicity of Bifidobacterium bifidum subsp. pennsylvanicum II Antonie Van Leeuwenhoek.-1985.-V 51.-P. 303-312.

79. Rasic' J.L., Kurmann J.A. Bifidobacteria and their role. Microbiological, nutritional-physiological, medical and technological aspects and bibliography // Experientia Suppl.- 1983.- V 39.- P. 1-295.

80. Reddy B.S., Rivenson A. Inhibitory effect of Bifidobacterium longum on colon, mammary and liver carcinogenesis induced be 2-amino-3-methylimidazo4,5-fjquinoline, a food mutagen // Cancer Res.- 1993.- V 53(17).- P. 3914-3918.

81. Requena T., Burton J., Matsuki T. et al. Identification, detection, and enumeration of human Bifidobacterium species by PCR targeting the transaldolase gene // Appl. Environ. Microbiol.- 2002.- V 68 (5).- P. 2420-2427.

82. Reuter G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology.-2001.-V 2 (2).- P. 43-53.

83. Reuter G. Vergleichende Untersuchungen über die Bifídus-Flora im Sauglingsund Erwachsenensthul. Zentralbl. 1-14. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. I. Abt. Orig. 1963.-V 191.-P. 486-507.

84. Rogosa M. Genus III, Bifidobacterium Orla-Jensen // Buchanan R.E., Gibbons N.E., eds, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edn., Williams & Wilkins, Baltimore.- 1974.- P. 669-676.

85. Roy D., Sirois S. Molecular differentiation of Bifidobacterium species with amplified ribosomal DNA restriction analysis and alignment of short regions of the Idh gene // FEMS Microbiol. Lett.- 2000.- V 191 (1).- P. 17-24.

86. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol.Evol.- 1987.- V 4,- P. 406-425.

87. Sakata S., Kitahara M., Sakamoto M., Hayashi H., Fukuyama M. and Benno Y. Unification of Bifidobacterium infantis and Bifidobacterium suis as Bifidobacterium longum II Int. J. Syst. Evol. Microbiol.- 2002.- V 52.- P. 19451951.

88. Sakata S., Ryu C.S., Kitahara M., Sakamoto M., Hayashi H., Fukuyama M., Benno Y. Characterization of the genus Bifidobacterium by automated ribotyping and 16S rRNA gene sequences // Microbiol. Immunol.- 2006.- V 50 (1).- P. 1-10.

89. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1977.- V 74.- P. 5463-5467.

90. Satokari R.M., Vaughan E.E., Akkermans A.D.L. et al. Bifidobacterial diversity in human feces detected by genus-specific PCR and denaturing gradient gel electrophoresis // Appl. Environ. Microbiol.- 2001.- V 67 (2).- P. 504-513.

91. Satokari R.M., Vaughan E.E., Smidt H. et al. Molecular approaches for the detection and identification of Bifidobacteria and Lactobacilli in the human gastrointestinal tract // System. Appl. Microbiol.- 2003.- V 26.- P. 572-584.

92. Scardovi V. Genus Bifidobacterium Orla-Jensen // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology.- 1984.- V. 1. ed. Kreig, N.R. and Holt, J.G. Baltimore, MD: Williams and Wilkins.- P. 1418-1434.

93. Scardovi V. Genus Bifidobacterium Orla-Jensen 1924, 472dl // Sneath P.H.A., Mair N.S., Sharpe M.E., Holt J.G., eds, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Williams and Wilkins MD, Baltimore.- 1986.-V.2.- P. 1418-1434.

94. Scardovi V. and Crociani F. Bifidobacterium catenidatum, Bifidobacterium dentium, and Bifidobacterium angidatum: three new species and their deoxyribonucleic acid homology relationships // Int. J. Syst. Bacterial.- 1974.- V 24.- P. 21-28.

95. Scardovi V. and Trovatelli L.D. The fructose-6-phosphate shunt as peculiar pattern of hexose degradation in the genus Bifidobacterium II Ann. Microbiol.-1965.-V 15.-P. 19-29.

96. Scardovi V. and Trovatelli L.D. Bifidobacterium animalis (Mitsuoka) comb. nov. and the "minimum" and "subtile"' groups of new bifidobacteria found in sewage II Int. J. Syst. Bacterid.- 1974.- V 24,- P. 21-28.

97. Scardovi V. and Zani G. Bifidobacterium magnum sp. nov., a large, acidophilic Bifidobacterium isolated from rabbit faeces // Int. J. Syst. Bacterid.-1974.-V 24.-P. 29-34.

98. Scardovi V., Zani G., Trovatelli L.D. Deoxyribonucleic acid homology among the species of the genus Bifidobacterium isolated from animals // Arch. Microbiol.- 1970.- V 72.-318-325.

99. Shimamura S., Abe F., Ishibashi N. et al. Relationship between oxygen sensitivity and oxygen metabolism of Bifidobacterium species // J. Dairy Sci.-1992,-V75.-P. 3296-3306.

100. Simpson P.J., Ross, R.P., Fitzgerald, G.F. and Stanton, C. Bifidobacterium psychraerophilum sp. nov and Aeriscardovia aeriphila gen. nov., sp. nov. isolated from a porcine caecum // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.- 2004.- V 54.- P. 401-406.

101. Smehilova M., Vilkova E., Nevoral J. Comparison of intestinal microflora in healthy infants and infants with allergic colitis // Folia Microbiol. (Praha) 2008.-V 53 (3).-P. 255-258.

102. Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: a place of DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology // Int. J. Syst. Bacterid.- 1994.- V 44 (4).- P. 846-849.

103. Stackebrandt E., Rainey F.A., Ward-Rainey N.L. Proposal for a new hierarchic classification system, Actinobacteria classis nov. // Int. J. Syst. Bacterid.- 1997.- V 47.- P. 479-491.

104. Talwalkar A. and Kailasapathy K. Metabolic and biochemical responses of probiotic bacteria to oxygen // J. Dairy Sci.- 2003.- V 86.- P. 2537-2546.

105. Tissier H. "Recherches sur la flore intestinale des nourrissons (Etat normal et pathologique") // Thesis, ed. Georges Carre' et C. Maud, University of Paris.-1900.- Paris, France.- P. 253.

106. Trovatelli L.D., Crociani F., Pedinotti M. and Scardovi V. Bifidobacterium pullorum sp. nov. A new species isolated from chicken faeces and a related groupof bifidobacteria isolated from rabbit faeces // Arch. Microbiol.- 1974.- V 98.- P. 187-198.

107. Vanhoutte T., De Preter V., De Brandt E. et al. Molecular monitoring of fecal microboiota of healthy human subjects during administration of lactulose and Saccharomyces boulardii II Appl. Environ. Microbiol.- 2006.- V 72 (9).- P. 5990-5997.

108. Vaugien L., Prevots F., Roques C. Bifidobacteria identification based on 16S rRNA and pyruvate kinase partial gene sequence analysis // Anaerobe.- 2002.1. V 8 (6).- P. 341-344.

109. Ventura M. and Zink R. Rapid identification, differentiation, and proposed new taxonomic classification of Bifidobacterium lactis II Appl. Environ. Microbiol.- 2002.- V 68 (12).- P. 6429-6434.

110. Vilkova E., Nevoral J., Jencikova B. et al. Detection of infant faecal bifidobacteria by enzymatic methods // J. Microbiol. Methods.- 2005.- V 60 (3).-P. 365-373.

111. Vlkova E, Rada V, Bujnakova D, Kmet V.Enumeration, isolation, and identification of bifidobacteria from infant feces // Folia Microbiol. (Praha). 2004.1. V 49 (2).- P. 209-12.

112. Ward P., Roy D. Review of molecular methods for identification, characterization and detection of bifidobacteria// Lait.- 2005.- V 85.- P.23-32.

113. Watabe J., Benno Y. and Mitsuoka T. Bifidobacterium gallinarium sp. nov.: a new species isolated from the ceca of chickens // Int. J. Syst. Bacterid.- 1983.-V33.-P. 127-132.

114. Woese C.R. Bacterial Evolution // Microbiological Reviews.- 1987.- V 51 (2).-P. 221-271.

115. Woodcock D.M., Crowther PJ, Doherty J, et al. // Nucleic Acids Res.-1989.- V 17.- P. 3469-3478.

116. XLIO-Gold® Ultracompetent Cells for Large and Ligated DNA // http://www.stratagene.com/products/displayProduct.aspx?pid=282

117. Yildirim Z., Johnson M.G. Characterization and antimicrobial spectrum of bifidocin B, a bacteriocin produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454 // J. Food Prot.- 1998.-V 61.-P. 47-51.

118. Zhu L., Li W. and Dong X. Species identification of genus Bifidobacterium based on partial HSP60 gene sequences and proposal of Bifidobacterium thermacidophilum subsp. porcinum subsp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.-2003.-V 53.-P. 1619-1623.

Информация о работе

Субботина, Марина Евгеньевна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка методики генотипирования бифидобактерий на основе двухлокусного секвенирования с целью видовой идентификации штаммов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Разработка методики генотипирования бифидобактерий на основе двухлокусного секвенирования с целью видовой идентификации штаммов - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы