Новый подход к молекулярной диагностике бифидобактерий

Пиксасова, Ольга Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новый подход к молекулярной диагностике бифидобактерий
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Новый подход к молекулярной диагностике бифидобактерий"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В. Ломоносова _Биологический факультет_

на правах рукописи

ПИКСАСОВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

( ;

новый подход

К МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ БИФИДОБАКТЕРИЙ

03.00.07 - микробиология

□03485987

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2009 г.

003485987

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факульте Московского государственного университета имени М.ВЛомоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессс Нетрусов Александр Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессс Даниленко Валерий Николаевич

кандидат медицинских наук Мельников Вячеслав Геннадьевич

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К.Скрябина РАН Пущино, Московская область

Защита диссертации состоится 11 декабря 2009 г. в 15:30 на заседай диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государствен университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленине! горы, дом 1, МГУ, корп.12, Биологический факультет, ауд. 557.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 10 ноября 2009 г.

Ученый секретарь J.

диссертационного совета, к.б.н. J/Пискункова Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Бифидобактерии являются одними из наиболее широко известных и используемых в производстве пробиотиков. Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) человека представляет собой комплексную экосистему, которая содержит представителей трех доменов живого: эукариоты, бактерии и археи. В норме в кишечнике преобладают бактероиды, молочнокислая микробиота (бифидобактерии и лакгобактерии), анаэробные стрептококки, кишечная палочка, энтерококки и другие микроорганизмы. Концентрация микроорганизмов в толстом кишечнике человека достигает 10"-1012 клеток на 1 г содержимого (Huys et al., 2008). Самые многочисленные и представители полезной микрофлоры - это бифидобактерии. Вырабатывая молочную и уксусную кислоту, они препятствуют размножению патогенных микроорганизмов. Молочная кислота создает идеальную среду для работы кишечника. Бифидобактерии стимулируют перистальтику, предупреждая запоры и поносы, повышают иммунитет организма, разлагают некоторые канцерогены и вырабатывают витамины. Колонизация микробами ЖКТ человека начинается немедленно с появлением ребенка на свет и протекает под влиянием таких факторов, как питание ребенка (грудное или искусственное кормление), гигиенические условия. Одними из первых микробных колонизаторов, заселяющих кишечник ребенка, являются бифидобактерии. Однако в течение жизни численность бифидобактерии постепенно сокращается под воздействием процессов старения, стрессов и неправильного питания (Huys et al., 2008).

Согласно современной систематике известно 29 видов бифидобактерий. Большинство из описанных к настоящему времени видов бифидобактерий были выделены из ЖКТ млекопитающих, насекомых и птиц. Некоторые виды бифидобактерий, как, например, Bifidobacterium bifidum, В.breve и B.longum subsp. longum, считается, относятся к видам истинно «человеческого» происхождения. Другие - B.gallinarum, B.angulatum и B.cuniculi - описаны как виды «животного» происхождения (Felis and Dellaglio, 2007). Некоторые виды чрезвычайно близки между собой, как например, B.pullorum и B.gallinarum (Yin et al., 2005), другие были реклассифицированы до подвидов, как например, B.longum subsp. infantis (German et al., 2008) или B.animalis subsp. lactis (Ventura et al., 2004). Представители бифидобактерий обладают разными свойствами. Многие считают, что бифидобактерии хорошо растут и развиваются в йогуртах. На самом же деле только три вида, B.bifidum, B.longum subsp. infantis и B.animalis, обладают доказанной способностью расти в молочной среде (Храмцов и др., 2003).

и вирусной диареи), облегчение течения хронических воспалительных заболеваний (в том числе, паучита и язвенного колита), улучшение различных аспектов физиологического состояния (в том числе, снижение уровня холестерола в крови и коррекция непереносимости лактозы) и, наконец, снижение вероятности развития зубного кариеса, аллергии, астмы и даже рака. Благодаря столь важному и разнообразному спектру лечебно-профилактического действия бифидобактерий, на выделение из естественных природных источников и анализ новых штаммов отпущены значительные ресурсы, как со стороны коммерческих, так и научных организаций. Важно не только понять и изучить пробиотическое действие бифидобактерий, но также и накопить библиотеку штаммов, которые бы обладали этими свойствами. Поэтому работы по выделению и накоплению штаммов, обладающих пробиотическим потенциалом, важны и требуют приложения надёжных и быстрых методов их обнаружения и идентификации. Идентификация любого штамма всегда начинается с описания его физиолого-биохимических характеристик. Однако не всегда среди этих признаков есть такой, который позволит с уверенностью определить систематическое положение культуры хотя бы на уровне рода. Широко известен полиморфизм бифидобактерий. Далеко не так много штаммов демонстрируют образование клеток классической вилочковидной «бифидо»-формы, как это принято считать. Они часто похожи на прямые палочки, коккобациллы, образуют скопления и даже цепочки клеток. Невысокая скорость роста и неустойчивость ко многим факторам стресса, среди которых низкая кислотность среды и контакт с кислородом воздуха, затрудняет культивирование бифидобактерий в лабораторных условиях и выделение их в чистую культуру. Поэтому необходим метод анализа, позволяющий установить наличие или отсутствие бифидобактерий в образце. Высокочувствительные молекулярные методы, такие как, например, ПЦР, позволяют определять бифидобактерии в образце исходного субстрата, в накопительной и, конечно, в чистой культуре. В последние годы активно развивается область молекулярных методов в идентификации микроорганизмов. Большинство методов молекулярного анализа, как показывает опыт, пока основывается на гене малой субъединицы рибосомальной РНК бактерий, 16S рРНК, но не всегда этого оказывается достаточно. Различные исследования предлагают новые альтернативные генетические мишени для идентификации бифидобактерий, такие как гены atpD (Ventura et al, 2004), tuf (Ventura and Zink, 2003), recA (Kullen et al, 1997; Ventura and Zink, 2003), groEL (Jian et al, 2001; Ventura et al, 2006), dnaJ (Ventura et al, 2006), purF (Ventura et al, 2006), rpoC (Ventura et al, 2006), dnaB (Ventura et al, 2006), xfp (Ventura et al, 2006; Yin et al., 2005) и clpC (Ventura et al, 2005; Ventura et al, 2006) или межгенные области, используемые для видовой идентификации или мониторинга штаммов бифидобактерий, выделяемых из различных природных источников. Совокупность различных тестов, а также использование нескольких генетических мишеней, позволяет получить

достоверную информацию о систематическом положении штамма, и даже о его эволюционном пути внутри группы подобных культур. Однако мультипараметрические исследования всегда лимитированы стоимостью проведения анализов. Таким образом, разработка, с одной стороны, простого, а с другой - быстрого, достоверного и недорогого метода идентификации штаммов является одним из приоритетных направлений прикладной микробиологии.

Цель исследования: разработка нового подхода к обнаружению и идентификации штаммов бифидобактерий на уровне рода и вида с использованием в качестве молекулярной мишени гена фруктозо-6-фосфат-фосфокетолазы бифидобактерий, являющимся уникальным ферментом для данной группы микроорганизмов. В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:

1. На основе полимеразной цепной реакции с парой праймеров в области гена xfp разработать родоспецифический тест к Bifidobacterium spp.

2. Определить специфичность данного теста в отношении бифидобактерий и показать отсутствие ложных положительных результатов с ДНК бактерий других родов.

3. Разработать метод видовой идентификации бифидобактерий на основе рестрикционного анализа фрагментов амплификации гена xfp.

4. Оценить степень вариабельности амплифицируемого участка гена xfp, с точки зрения его потенциального использования в качестве генетической мишени для идентификации изолятов бифидобактерий на основании сравнения последовательности данного участка.

5. Подобрать технологию длительного хранения штаммов бифидобактерий с сохранением жизнеспособности культуры.

Научная новизна: выделены новые штаммы бифидобактерий, относящиеся к видам B.bifidum, BJongum, B.animalis subsp. lactis, B.adolescenlis, B.pullorum, B.pseudolongum из фекалий животных. Идентификацию изолятов на уровне рода проводили с использованием ПЦР-анализа гена xfp, кодирующего Фр-6-Ф-фосфокетолазу бифидобактерий. Впервые использован метод рестрикционного анализа фрагментов амплификации в приложении к гену xfp с целью видовой идентификации штаммов. Впервые идентификацию штаммов бифидобактерий проводили на основе сравнения последовательности вновь выделенных штаммов с типовыми на участке с 576 по 1279 нуклеотид гена xfp. Проведена оценка достоверности данного вида анализа для идентификации изолятов.

В ходе выполнения экспериментальных исследований получены новые данные об особенностях лабораторного культивирования бифидобактерий. Проведен анализ и

модификация состава накопительных и селективных питательных сред. Определен спектр природных источников бифидобактерий с целью выделения наиболее стабильных штаммов. Проведен анализ нескольких вариантов родоспецифической ПЦР с праймерами, опубликованными в литературе. Доказана специфичность и высокая чувствительность новой ПЦР на ген xjp. Разработан метод видовой идентификации бифидобактерий с использованием двух эндонуклеаз рестрикции, Ата87/ и Bspl9/, в приложении к амплифицируемому участку гена xfp в данной ПЦР с родоспецифическими праймерами.

Практическая значимость: разработанные при выполнении диссертационного исследования методические подходы могут быть использованы для анализа как накопительных, так и чистых культур, содержащих бифидобактерии. В случае чистой культуры или смеси двух или более культур, одна из которых относится к роду Bifidobacterium, возможно использование продукта родоспецифической ПЦР для рестрикционного анализа и/или непосредственного нуклеотидного секвенирования с целью точной идентификации штамма. Полученные данные могут найти применение при чтении курсов по промышленной микробиологии, биотехнологии и экологии микроорганизмов, а использованные в данной работе методы анализа, такие как, например, тест на определение активности Фр-6-Ф-фосфокетолазы бифидобактерий может быть включен в курс практических занятий для студентов-микробиологов ВУЗов.

Апробация работы: основные результаты работы были доложены и обсуждены на международной конференции по пробиотикам «Enteric Bacteria and Inflammatory Bowel Disease» (Цахкадзор, Республика Армения, 2008), международной конференции по пробиотикам «EUPROBIO 2008» (Краков, Польша, 2008) и на 3-м международном конгрессе ФЕМО (Гётеборг, Швеция, 2009).

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 8 научных работ (3 статьи, из них 1 в рецензируемом журнале, из рекомендованных ВАК, тезисы докладов на 5 конференциях).

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 155 страницах, содержит 22 таблицы и 11 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (129 литературных источников, из которых 10 отечественных и 119 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Был о проанализировано 115 образцов, 108 из которых были представлены культурами бифидобактерий и еще 7 были предоставлены нам в виде образцов тотальной ДНК бифидобактерий из лаборатории микробиологии факультета фармацевтических наук и биологии Университета Париж Декарт (Париж, Франция) для анализа молекулярными методами. Из 108 культур бифидобактерий 32 были выделены из фекалий животных на кафедре микробиологии МГУ, 3 штамма были выделены из фекалий домашнего скота и предоставлены нам Институтом инженерной иммунологии (Любучаны, Россия), еще 59 штаммов были выделены из фекалий взрослых людей и предоставлены нам Государственным научным центром Институтом медико-биологических проблем РАН (Москва, Россия). В качестве контрольной группы были взяты 12 типовых штаммов и 2 штамма бифидобактерий, разрешенных к промышленному использованию на территории Российской Федерации, которые были приобретены нами в аптеке в виде препаратов пробиотического назначения и служили сравнительными в данной работе. В дальнейшем данные 14 образцов именовались референсными или типовыми (только для типовых штаммов). Типовые штаммы включали представителей следующих видов — B.adolescentis, B.animalis subsp. animalis, B.bifidum, В.breve, B.infantis, B.animalis subsp. lactis, B.longum, и были предоставлены из коллекции КМ МГУ.

Специфичность работы праймеров исследовали с использованием ДНК 58 культур бактерий из коллекции КМ МГУ, не относящихся к роду Bifidobacterium. Среди последних присутствовали представители следующих родов и видов - 16 видов рода Lactobacillus, Lactococcus lactis, Sporolactobacillus spp., Bacteroides galacturonicus, Leuconostoc mesenteroides., Bacillus spp., E.coli, Gardnerella vaginalis.

При подборе оптимального состава питательной среды для культивирования бифидобактерий использовали большое количество сред, как коммерческого состава, так и подобранных нами. В качестве коммерческих сред использовали следующие: среда Вилкинса-Чальгрена для бифидобактерий (WCB broth, Oxoid), среда TOS (Yakult Pharmaceutical, Япония), «Бифидум-среда» (Государственный научный центр прикладной микробиологии, Оболенск).

Проверку селективности ципрофлоксацина и мупироцина в отношении микроорганизмов, не относящихся к группе бифидобактерий, проводили с добавлением антибиотика в «бифидум-среду» до конечной концентрации 50 и 100 мкг/мл.

Лиофилизацию культур бифидобактерий производили с использованием оборудования для лиофильного высушивания Labconco (США) при глубине вакуума в 4,9 Па, температуре конденсора минус 25°С.

Тест на Фр-6-Ф-фосфокетолазу проводили согласно предложенному методу (Scardovi, 1986). Перед разрушением ультразвуком клетки обрабатывали яизоцимом.

Ацетат измеряли с помощью газожидкостпой хроматографии на приборе Crystal 2000М (ЗАО СКБ "Хроматэк", г. Йошкар-Ола), оснащённым микрокапиллярной колонкой FFIP (15000 х 0,5 мм), газ носитель - аргон, расход 15 мл/мин, детектор - ПИД, температура детектора - 200°С, температурный градиент в термостате от 70 до 160°С. Анализы проводили на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ. Результаты хроматографии были обработаны программным обеспечением Chromatec Analytic 2.5 (ЗАО СКБ "Хроматэк", г. Йошкар-Ола). Концентрацию лактата измеряли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Образцы вносили в проточную электрохимическую ячейку (wall-jet ячейка) с лактатным биосенсором. Биосенсоры для определения лактата и проточная ячейка были любезно предоставлены компанией ООО "РУСЕНС" (Россия, Москва).

Препараты тотальной ДНК получали с использованием коммерческих наборов для выделения ДНК из клинического материала «ДНК-сорб-АМ», согласно рекомендованной производителем методике.

ПЦР с целью специфического определения бифидобактерий на уровне рода проводили с использованием праймеров, специально подобранных к гену малой субъединицы 16S рибосомальной РНК и гену х/р бифидобактерий, представленные в таблице 1. Праймеры были синтезированы в компании Синтол (Москва, Россия) и в компании Eurogenetic S.A. (Бельгия).

Таблица 1. Родоспсцифические олиговуклеотидные праймеры для идентификации Bifidobacterium spp. прн помощи ПЦР.

Мишень Ген Название Последовательность (S'-3J Длина прайиера (по.) ПЦР-продукт (п.о.) Ссылка

Bifidobacterium spp. reHl6S pPHK Lm2tf GATTCTGGCTCAGGATGAACG 21 1343 Kaufmann et а/., 1997

Lm3r CGGGTGCTTCCCACTTTCATG 21

Bifidobacterium spp. reHl6S pPHK g-Bifid-F CTCCTGGAAACGGGTGG 17 557 Matsuki et at., 2002

g-Brfid-R GGTGTTCTTCCCGATATCTACA 22

Bifidobacterium spp. reHl6S pPHK ВИ164 GGGTGGTMTGCCGGATG 18 523 Kok etal., 1996

BH662 CCACCGTTACACCGGGAA 18

Bifidobacterium spp. ген xfp xfp-F CGGCTGGCAGTCCAACAA 18 704 Данная работа

xfp-R GGTTGTTCTTGATGATGTCGC 21

С целью специфического определения бифидобактерий на уровне вида проводили анализ с использованием мультиплексной ПЦР, позволяющей определять несколько видов бифидобактерий в одной пробирке. Использованные в данном тесте олигонуклеотидные праймеры, подобранные к гену малой субъединицы рибосомальной РНК, представлены в таблице 2.

Таблица 2. Видоспецифические олигонуклеотидные праймеры для идентификации Bifidobacterium spp. при помощи мультиплексной ПЦР.

Мишень Ген Название Последовательность (5'-3) Длина прайиерг (П.О.) ПЦР-продукт (P.O.) Лит. источник

ПЦР-1

B.bifidum reHl6S pPHK BiBIF-F CCACATGATCGCATGTGATTG 21 278 Matsuki et at.. 1998

BiBIF-R CCGAAGGCTTGCTCCCAAA 19

B.breve reHl6S pPHK BiBRE-F GGGAGCAAGGCACTTTGTGT 20 568 Matsuki et al„ 1998

Brelnf-R GAAACCCCATCTCTGGGATC 20

B.infantis reHl6S pPHK BilNF-F TTCCAGTTGATCGCATGGTC 20 826 Mullie et al„ 2003

Brelnf-R GAAACCCCATCTCTGGGATC 20

ПЦР-2

B.adolescentis reHl6S pPHK BiADO-F CTCCAGTTGGATGCATGTC 19 278 Matsuki et at., 1999

BiADO-R CGAAGGCTTGCTCCCAGT 18

B. longum reHl6S pPHK BiLON-F TTCCAGTTGATCGCATGGTC 20 831 Matsuki ef a/., 1999

BiLON-R GGGAAGCCGTATCTCTACGA 20

Для температурного циклирования использовался ДНК амплификатор GeneAmp 9700 (Applied BioSystems, США).

Анализ длин фрагментов рестрикции амплифицированного участка геномой ДНК осуществляли с использованием двух различных эндонуклеаз рестрикции Ата87/

(аналогичной Aval и Есо88/, сайт узнавания - CjYCGRG) и Bspl97 (аналогичной of Neo/, сайт узнавания - CJCATGG, СибЭнзим, Россия) в конечной концентрации 1-2 единицы на реакцию, общий объем реакционной смеси составлял 15 мкл. В качестве матрицы действия ферментов рестрикции использовали ПЦР продукт - амплифицированный участок гена xfp бифидобактерий длиной 704 п.о., полученный в результате проведения ПЦР с лраймерами xfp-F и xfp-R.

Секвенирование проводили с использованием набора реактивов и согласно инструкции к прибору, 4-капиллярному генетичекому анализатору ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США).

Сравнительный анализ и поиск гомологичных последовательностей проводили по базе NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Анализ результатов секвенирования, построение нуклеотидных выравниваний и расчёт генетических дистанций между сравниваемыми штаммами осуществляли с помощью компьютерных программ AlignX и VectorNTI vi0.3.0 (Invitrogen Corporation, США); ABI 2 FASTA Converter vi.0.0.14 beta (HeracleSoftware, Германия); ChromasPro vi.5 (Technelysium Pty Ltd, Австрия); программного обеспечения генетического анализатора ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США). Множественные выравнивания последовательностей проводили, используя программы, доступные в Интернете: ClustalX (www.clustal.org) и Mega2 v4.0.2 (www.megasoftware.net). Для построения филогенетического дерева использовали метод Neighbour-Joining (NJ) и модель - Nucleotide: p-distance.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1 Выделение штаммов бифидобактерий в анализ устойчивого их роста 1.1. Подбор состава накопительных и селективных питательных сред

В процессе работы были рассмотрены различные варианты наиболее широко используемых сред для культивирования бифидобактерий, проведен анализ основных компонентов и попытка подбора универсального состава основной питательной среды с учетом поставленных задач, а именно выделением диких штаммов бифидобактерий из природных источников, эффективного поддержания их жизнеспособности и накопления биомассы для лиофильного высушивания культур, с целью дальнейшего использования и внесения в коллекцию кафедры микробиологии биологического факультета МГУ.

Был проведен анализ состава коммерческих питательных сред, а также состава сред, рекомендуемых для культивирования бифидобактерий в опубликованных научных статьях. Рост бифидобактерий анализировали на 8 вариантах накопительных питательных сред различного состава. В результате было показано, что наибольшей стабильностью обладали культуры при выращивании их на среде, получившей рабочее название

«обогащенной бифидум-среды», которая была создана нами на основе «Бифидум-среды» производства Государственного научного центра прикладной микробиологии (Оболенск) следующего состава (г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки - 8,0; пептон ферментативный - 8,0; ЫаС1 - 4,0. Состав обогащенной бифидум-среды следующий (г/л): сухая смесь «Бифидум-среды» (Оболенск) - 30,0; панкреатический гидролизат рыбной муки - 50,0; твин-80 - 1 мл; гемин - 25 мл исходного раствора (конечная концентрация гемина в среде составляет 5 мкг/мл); 50%-ный раствор лактулозы - 2,5 мл; агар - 2%. Исходный раствор гемина содержит 200 мкг чистого вещества на 1 мл раствора. Готовую среду стерилизовали в автоклаве при 0,5 ати 20-30 минут. Раствор гемина рекомендуют вносить после стерилизации.

Как известно по данным предыдущих исследований, к естественными местообитаниям бифидобактерий относятся: человек (желудочно-кишечный тракт, влагалище, кариальные полости), ЖКТ млекопитающих животных, кишечник медоносных пчел, кисломолочные пищевые продукты и сточные воды. Однако два последних источника правильнее считать вторичными. Таким образом, в качестве источников выделения новых штаммов бифидобактерий мы использовали фекалии диких и домашних животных и самоквасные кисломолочные продукты различного географического происхождения. Всего было собрано образцов фекалий от 59 домашних и диких птиц. В результате данной работы коллекция КМ МГУ пополнилась 32 штаммами бифидобактерий, которые были выделены из одного кабана, 15 коз, двух свиней, четырех куриц, трех коров, одного кролика, одной крысы. Штаммы, помещенные в коллекцию КМ МГУ, обладали наиболее высокими показателями стабильного роста и выживаемости. Было протестировано 50 образцов кисломолочных продуктов, а также проба сычуга, используемая для производства сыра. Ни одного изолята бифидобактерий из данных источников выделено не было. Таким образом, можно с уверенностью утверждать, что фекалии коз являются наиболее перспективным природным источником устойчивых к культивированию форм бифидобактерий.

При выращивании смешанных культур на среде с ципрофлоксацином не происходило подавление лактобацилл, которые со временем полностью преобладали над бифидобактериями, не давая им развиваться.

При выращивании разведений накопительных культур на среде с добавлением мупироцина отмечался следующий эффект: наиболее крупные колонии при микроскопировании оказалась представителями бифидобактерий, что далее было доказано при помощи методов молекулярного анализа. Не происходило полного ингибирования роста кокковых форм или лактобацилл на чашках с мупироцином, однако

образуемые ими колонии были по размеру значительно меньше тех, которые формировали бифидобактерии, что значительно облегчало процесс выделения последних в чистую культуру.

При использовании различных по составу питательных сред для культивирования бифидобактерий, не наблюдали зависимости формы клеток или их полиморфизма в зависимости от состава среды культивирования или отдельных компонентов среды. Однако для некоторых штаммов отмечали формирование более ветвящихся форм при старении культуры. Под старением культуры в данном случае понимается более длительное культивирование штаммов - 4-6 дней. Однако, данный эффект имел место только для представителей тех видов бифидобактерий, для которых характерно образование ветвящихся клеток и клеток с вздутиями и выпуклостями. А именно, мы наблюдали данные различия в форме клеток для следующих штаммов: B.longum М.379.В, B.bifidum и13, B.bifidum и14, штамм ибб, штамм и49, B.pullorum/gallinarum МГУ 391, B.animalis subsp. /actis МГУ 398.

Культуры бифидобактерий сохранялись в лиофильно высушенном состоянии. Мы показали, что при лиофилизации в обогащенной бифидум-среде без добавления криопротекторных веществ бифидобактерии хорошо переносят высушивание и не показывают снижения активности роста по сравнению с лиофилизацией в присутствии глицерола в качестве криопротектора.

1.2. Проверка аэротолерантности штаммов бифидобактерий

Устойчивость бифидобактерий к кислороду воздуха исследована для 14 штаммов коллекции КМ МГУ, которые показывали устойчивый рост при пассировании на плотных питательных средах. Для сравнения использовали типовые штаммы бифидобактерий -B.lactis DSM 10140т; B.bifidum ATСС 29521т; B.breve NCFB 2257т. Опытную культуру каждого штамма выдерживали в аэробных условиях, контрольную - только в анаэробных условиях.

Штаммы, вошедшие в экспериментальное определение устойчивости бифидобактерий к кислороду, были довольно стабильны при пересевах на плотной питательной среде, равно как и на жидкой. Таким образом, мы ожидали увидеть у них ту самую невосприимчивость к недолгим контактам с кислородсодержащей средой. Однако, не все из них показали такое свойство. А именно, из четырнадцати исследованных штаммов, только 7 росли на плотной среде после похождения испытания их кислородом. Снижение общей численности КОЕ составило 1-2 порядка. Наибольшую устойчивость показали штаммы B.bifidum К5В МГУ и B.longum К7В МГУ, выделенные нами из фекалий домашних коз. Можно говорить об их микроаэрофильности. Наиболее

стабильным оказался штамм B.animalis subsp. ¡aclis 398 МГУ, показавший практически идентичное количество - 6,2 х 105 и 6,9 х I05 - жизнеспособных клеток на 1 мл опытной и контрольной культур.

Таким образом, мы подтвердили предположение о низкой степени устойчивости штаммов бифидобактерий к кислороду воздуха. Данный признак довольно просто проверить без необходимости привлечения сложного и дорогостоящего оборудования, однако он может служить одним из первых критериев при отборе промышленно ценных штаммов.

13. Тест на фруктозо-б-фосфат-фосфокетолазу и определение продуктов метаболизма бифидобактерий.

Концентрацию основных продуктов метаболизма бифидобактерий - ацетата и лактата, измеренную в молях на литр, использовали для расчета молярного соотношения этих продуктов в результате жизнедеятельности микроорганизма.

Принято считать, что бифидобактерии образуют уксусную и молочную кислоты в молярном соотношении 3:2. Было предложено использовать данное свойство бифидобактерий в качестве признака при идентификации штаммов. Однако по данным некоторых исследователей это соотношение соблюдается не всегда. Согласно полученным нами данным, соотношение продуктов метаболизма бифидобактерий действительно далеко от теоретического значения, как представлено в таблице 3 и на рисунке 1.

Таблица 3. Определение молярного соотношения продуктов метаболизма бифидобактерий.

Вид Штамм Концентрация лактата, моль/л Концентрация ацетата, моль/л Молярное соотношение ацетат:лактат

B.animalis DN-173010 0,065284779 0,036114 0,6

B.animalis NCFB 2242T 0,046100609 0,026002 0,6

B.animalis ssp. lactis DSM 10U0T 0,079488317 0,022321 0,3

B.bifidum AT CC 29521T 0,05771547 0,023621 0,4

B. breve NCFB 2257T 0,042371762 0,018326 0,4

B.bifidum К1ВМГУ 0,045255418 0,024737 0,5

B.bifidum К4ВМГУ 0,017555113 0,028479 1,6

B.bifidum К5ВМГУ 0,045273144 0,009673 0,2

B.bifidum K6B МГУ 0,053149227 0,028767 0,5

B.longum K7B МГУ 0,017719709 0,009944 0,6

B.pseudolongum 347.1 МГУ 0,029809753 0,02277 0,8

Bifidobacterium sp. 347.2 МГУ 0,008876781 0,012682 1,4

Bifidobacterium sp. 360.2 МГУ 0,043961646 0,009365 0,2

Bifidobacterium sp. 362.3 МГУ 0,032137821 0,015921 0,5

B.animalis ssp. lactis 380.2 МГУ 0,025292107 0,006305 0,2

B.animalis ssp. lactis 382.1 МГУ 0,027857624 0,00923 0,3

B.animalis ssp. lactis 384 МГУ 0,032747134 0,025459 0,8

B.pullorum/galiinarum 391 МГУ 0,024098278 0,01187 0,5

B.pseudolongum 393 МГУ 0,032592319 0,010397 0.3

Bifidobacterium sp. 8(6) Л 0,00250094 0,014771 5,9

Bifidobacterium sp. 7(7) Л 0,012504702 0,022134 1.8

B.lonqum M1.2 МГУ 0,024613303 0,02365 1.0

B.pullorum/gallinarum М4 МГУ 0,04411531 0,022275 0,5

B.pullorum/gallinarum М5 МГУ 0,004085831 0,010033 2,5

B.bifidum Мб МГУ 0,005254718 0,010783 2,1

Bifidobacterium sp. М7 МГУ 6.88678Е-05 0,019693 286,0

Bifidobacterium sp. Mr МГУ 0,036893663 0,023621 0,6

Bifidobacterium sp. М8 МГУ 0,050556619 0,024021 0,5

> >* >. >> >, >.

I_i_ t_ I— I— [_ 1— I— (_ (_ ,___I—. L_ l_ I—

S 5 2 s 2 S S S 2 S (O N- 5 SS5 2 2

со ш ш со m ,— CM CM CO CM CO OO f- eg U)(£> f— CO

-г- -ч- in СО г— r— CD CM CD CM oo cn СГ) 2 s 2 2 2 2

к: -Ч- CO CO OO OO CO CO CO 2

co CO CO CO CO CO

Рисунок 1. Молярное соотношение продуктов метаболизма бифидобактерий.

Из исследованных нами 28 штаммов бифидобактерий только три образуют ацетат и лактат в соотношении, близком к 1,5. Это штаммы B.bifidum К4В МГУ, Bifidobacterium sp. 347.2 МГУ и Bifidobacterium sp. 7(7) JI, молярное соотношение продуктов для которых составило 1,6, 1,4 и 1,8, соответственно. Для 21 штамма данное соотношение составило значение от 0,2 до 1,0, то есть они преимущественно образуют лактат, что является хорошим признаком для использования их в пищевом производстве. Два штамма -B.pullorum/gallinarum М5 МГУ и B.bifidum Мб МГУ, образуют в 2,5 и 2,1 раза больше ацетата, чем лактата. Штамм Bifidobacterium sp. 8(6) Л образовывал в 5,9 раз больше ацетата, чем лактата. Один штамм, Bifidobacterium sp. М7 МГУ, показал образование следовых количеств лактата, поэтому значение отношения ацетат:лактат составило в его

случае чрезвычайно высокое значение - 286. Таким образом, мы видим широкую вариабельность метаболизма бифидобактерий, что с одной стороны, подтверждает заявления тех исследователей, которые обращают внимание на несоблюдение этого теоретического равновесия, а с другой, свидетельствует о невозможности использования данного критерия в качестве диагностического при определении бифидобактерий. 2 Создание родоспецифического ПЦР теста, анализ его чувствительности и

специфичности.

2.1. Проверка пар праймеров из литературных источников.

На основании данных других исследований были выбраны праймеры в области гена 16S рРНК для проведения родоспецифической ПЦР бифидобактерий (Kok et al., 1996; Kaufmann et al., 1997; Matsuki et al., 2002). Праймеры тестировали на 44 образцах тотальной бактериальной ДНК, 22 из которых пренадлежали бифидобактериям видов B.adolescentis, B.angulatum, B.animalis, B.bifidum, В.breve, B.infantis, B.longum, 15 -лактобациллам видов Lactobacillus kefiri, L.acidophilus, L.brevis, L.casei, L.caucasicus, L.delbrueckii, L.delbrueckii subsp. bulgaricus, L.fermentum, L.lindneri, L.paracasei, L.plantarum, L.pentosus, L.rhamnosus, а также представителям родов Lactococcus, Leuconostoc, Sporolactobacillus, Bacteroides, Escherichia, Gardnerella. Результаты анализа оказались неудовлетворительными с парами праймеров Lm26f и Lm3r, g-Bifid-F и g-Bifid-R. Пара Lm26f и Lm3r показала наличие ложноотрицательных результатов с 8 из 22 протестированных образцов ДНК бифидобактерий, ложноположительных результатов получено не было. Пара g-Bifid-F и g-Bifid-R показала наличие ложноотрицательных результатов с 3 из 22 протестированных образцов ДНК бифидобактерий, ложноположительные результаты были получены с двумя образцами ДНК лактобацилл, а именно L.keftri и L.acidophilus. Пара праймеров Bif662 и Bifl64 не показала ложных результатов, и была использована в дальнейшей работе как референтные для проверки качества результатов родоспецифического определения бифидобактерий в ПЦР с праймерами на ген xfp (см. рисунок 2).

[noj

Рисунок 2. Результаты родоснецифической ПЦР некоторых штаммов бифидобактерий, полученные с парой праймеров Bifl64-PCR и Bif662-PCR (Kok et al., 1996) в области гена 16S рРНК (рис. 2А) и парой праймеров xfp-F и x/p-R в области гена xfp (Рис.2Б). Дорожка 1, B.adolescentis АТСС 15703т; дорожка 2, B.animalis subsp. animaiis NCFB 2242т; дорожка 3, B.bifldum АТСС 295211"; дорожка 4, В. breve NCFB 2257т; дорожка 5, B.infantis АТСС 15697т; дорожка 6, B.longum АТСС 15707х; дорожка 7, B.animalis subsp. lactis DSM 10140т; дорожка 7, B.longum subsp. infantis и1; дорожка 8, B.adolescentis и7.1; дорожка 9, B.longum и16; дорожка 10, B.longum К5В МГУ; Дорожка 11, B.longum К7В МГУ; дорожка 12, Lactobacillus acidophilus NK-1 - отрицательный контроль; дорожка 13, MassRuLer™ DNA Ladder Mix #SM0403 (Fermentas, Литва).

2.2. Подбор праймеров в области гена фруктозо-6-фосфат-фосфокетолазы бифидобактерий.

Столь ненадежные результаты идентификации бифидобактерий при помощи ПЦР в области гена 16S рРНК привели нас к идее разработки более достоверного родоспецифического теста на основе полимеразной цепной реакции. Использование уникального гена для исследуемой группы бактерий служит дополнительной гарантией отсутствия перекрестных реакций с ДНК представителей других родов микроорганизмов. Наличие специфического метаболического пути бифидобактерий - это потенциальная возможность обнаружения такой уникальной генетической мишени. Выбор мишени был остановлен на xfp гене, кодирующем двусубстратный фермент - фруктозо-6-фосфат-фосфокетолазу бифидобактерий, так как по данным предыдущих исследований разных

авторов, данный белок обладает ферментативными свойствами, отличающими его от аналогичных фосфокетолаз других бактерий. Сравнительный анализ последовательности хfp гена представителей разных видов бифидобактерий показал наличие в нем большого количества консервативных областей (по литературным данным достигающих 73% длины всего гена, Yin et al., 2005), что свидетельствовало в пользу возможности использования гена xfp в качестве универсальной мишени для создания диагностических тестов для детекции и идентификации бифидобактерий на уровне рода. Сравнение последовательности xfp гена бифидобактерий с генами, кодирующими фосфокетолазы бактерий других родов показал их явное несоответствие друг другу, а следовательно подтверждал идею об уникальности данной последовательности в отношении группы бифидобактерий.

Праймеры подбирали в консервативных областях гена, расположенных в районе 576-594 и 1259-1280 нуклеотидов, считая с 5'-конца гена. Длина амплификата составляет 704 п.о. Уровень вариабельности амплифицируемой области по нашим оценкам находится в пределах 25-35%. Основное количество замен локализовано в области 150 нуклеотидов с З'-конца амплифицирумой области. Вставок или делеций в данной области, превышающих 1-2 нуклеотида обнаружено не было, что должно было привести к отсутствию различий в длинах получаемых продуктов ПЦР гена xfp.

Проверка родовой специфичности ПЦР с праймерами xfp-F и xfp-R осуществляли с использованием ДНК микроорганизмов, относящихся к роду Bifidobacterium, также занимающих отличное филогенетическое положение. Суммарно количество штаммов бифидобактерий, использованных в проверке специфичности работы праймеров достигало 115. Количество штаммов, не принадлежащих к роду Bifidobacterium и использованных для проверки специфичности работы праймеров xfp-V и xfp-R было 58. Они принадлежали к 8 родам: Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Sporolactobacillus spp., Bacteroides spp., Leuconostoc spp., Bacillus spp., E.coli, Gardnerella vaginalis.

Всего было протестировано ДНК 115 штаммов бифидобактерий, 14 из которых были референтными, 69 - выделены из фекалий человека, 32 - из фекалий животных. Разработанный родоспецифический тест обладает 100%-ной специфичностью в отношении, по крайней мере, 10 видов бифидобактерий. Из штаммов с известным или определенным в ходе данного исследования систематическим положением в дальнейший анализ были включены следующие (см. таблицу Таблица 4).

Таблица 4. Результаты ПЦР с праймерами xfp-F и x/p-R с бифидобактериами определенной видовой принадлежности.

Вид Количество протестированных штаммов Из них референтных Результаты ПЦР с праймерами Bif662 / Bif164 Результаты ПЦР с праймерами xfp-FIxfp-R

B.adolescentis 13 2 Полож. Полож.

B.animalis 3 3 Полож. Полож.

B.animalis subsp. lactis 6 1 Полож. Полож.

B.bifidum 11 2 Полож. Полож.

B.breve 1 1 Полож. Полож.

B.longum subsp. infantis 4 1 Полож. Полож.

B.longum 16 3 Полож. Полож.

B.pseudocatenulatum 2 0 Полож. Полож.

B.pseudolongum 6 0 Полож. Полож.

B. gallinarum/pullorum 3 0 Полож. Полож.

Чувствительность ПЦР теста с праймерами xfp-F и xfp-R измеряли количественно с использованием десяти и двукратных разведений культур бифидобактерий. Чувствительность теста составляет около 200 клеток/мл.

3 Результаты рестрикциопного анализа (ARDRA) и сравнение данных с результатами мультиплексной видоспеаифической ПЦР.

В области гена xfp расположено большое количество специфических сайтов узнавания различных эндонуклеаз рестрикции, которые варьируют в широких пределах по величине и количеству образуемых фрагментов. Согласно предъявляемых нами требований, были выбраны и проведены испытания двух эндонуклеаз рестрикции -Ата87/ (аналогичной Ava/ и Есо88/, сайт узнавания - CjYCGRG) и Bspl9/ (аналогичной Neo/, сайт узнавания - CJ.CATGG). Ожидаемые результаты после обработки эндонуклеазой Ата87/ амплифицированного участка xfp гена были такими, как это представлено на рисунке 3.

При обработке ПЦР продуктов эндонуклеазой Ата87/ наблюдали образование от 1 до 3 полос на электрофорезе, соответствующих фрагментам длиной от 704 до 50 п.о. Таким образом, при анализе всех 12 штаммов, 10 идентифицированных по результатам мультиплексной ПЦР как B.adolescentis и 2 типовых, образовывались фрагменты величиной в 446, 204 и 50 п.о. (см. таблицу 5). Анализ 13 штаммов В. longum - 9 опытных

B.adoíescentis B.animalís subsp .animafis B.animaüs subsp.tócto BMitium B. breva B.pseucíoíongum B.sfi (1)

446

204

634

704

Нет данных

590

114

590

44 70

B.dentium | 450 I 150 54 50 3Ama87í

.gallinarum Г~ 446 51 137 Í 54 | 3 Ama87/ 1 Bsp19/

t 3Ama87í 1 Bsp13í

B.longum I 410 I 87 137 Y 54 |

B.pultorum | 446 I 51 153 54 | 3Ama87/

B.sp(2) Г 446 I 154 50 54 | 3 Ama87/

2 Ama87f 1 9sp19/

1 Ama87/ 1 Bsp13í

Рисунок 3. Локализация сайтов специфического разрезания ДНК эидоиуклеазами рестрикции Ата87/ и Ввр19/ в пределах 704 п.о. продукта ПЦР на ген х/р. Звездочками на рисунке отмечены сайты рестрикции В$р19/, все остальные полосы - расположение сайтов рестрикции Аша87/.

и 2 референсных - на электрофорезе наблюдали одну полосу, соответствующую фрагменту ДНК длиной в 446 п.о. Интересно, что все исследованные штаммы B.longum эиЬзр. т/апИв - 1 типовой и 3 опытных - показывали образование двух фрагментов при рестрикции Аша87/, длиной в 650 и 446 п.о. Таким образом, рестрикция с использованием эндонуклеазы позволяет идентифицировать два подвида - ВЛоп^ит эиЬзр. 1оп^т и ВЛоп^ит эиЬзр. ифтИз.

Таблица 5. Результаты рестрикциониого анализа амплифицированного по гену х/р участка ДНК штаммов бифидобактерий с использованием эндонуклеазы рестрикции Ата87/.

Вид Количество протестированных штаммов Из них референсных Фрагменты рестрикции Ата87/ (п.о.) Результаты видоспецифи- ческого определения в мультиплексной ПЦР

B.adolescent/s 12 2 446, 204 B.adolescentis

B.animalís 3 3 704 (нет рестрикции) Отриц.

B.animalis subsp. lactis 12 1 704 (нет рестрикции) Отриц.

B.bifidum 11 2 -650 B.bifidum

B.breve 1 1 704 (нет рестрикции) B.breve

B.longum subsp. infantis 3 1 -650, 446 B.longum subsp. Infantis

B.longum 13 4 446 B.longum

B.pseudolongum 5 0 -590, 114 Отриц.

Штамм и28 1 0 446, 270-290 Отриц.

Штамм 391 МГУ 1 0 446, 154 Отриц.

Штамм 395 МГУ 1 0 704 (нет рестрикции) Отриц.

После рестрикционного анализа штаммов с использованием эндонуклеазы Аша87/ 21 из них не показала рестрикции и была подвергнута обработке эндонуклеазой Bsp 19/ для выявления среди них представителей B.animalis subsp. animalis.

Среди этой 21 культуры только 3 показали образование фрагмента длиной в 634 п.о. в результате действия эндонуклеазы Bsp 19/ и были идентифицированы как В. animalis subsp. animalis. Остальные 18 не показали рестрикции после обработки эндонуклеазой Bspl9/. Среди них один штамм был заведомо известен - типовой цггамм В.breve NCFB 2257. Таким образом, можно производить дифференциацию подвидов В. animalis subsp. animalis и B.animalis subsp. lactis с использованием эндонуклеаз Ama87/ и Bspl9/. По всей видимости, В.breve, также не имеет сайтов рестрикции эндонуклеаз Ата87/ и Bsp 19/ в пределах данной области генома, что, однако, трудно подтвердить, имея в распоряжении один штамм. Поэтому для выдвижения более достоверных выводов в случае идентификации вида В.breve предложенным рестрикционным методом необходимо накопить больше данных.

Результаты рестрикционного фингерпринтинга подтверждены при помощи нуклеотидного секвенирования по гену xfp и мультиплексной ПЦР.

4 Секвенирование и филогенетический авалю последовательностей генов 16S рРНКи xfp.

Были получены последовательности амплифицируемой области гена xfp для 21 культур бифидобактерий из опытных штаммов, а также для двух типовых штаммов -В.breve NCFB 2257 и B.infantis АТСС 15697.

Для проведения сравнительного анализа было построено молекулярное выравнивание, куда вошло 43 последовательностей, 21 - штаммов нашей коллекции и 22 - представленные в GeneBank. Из них 3 - B.adolescentis (все типовые), 4 - B.animalis subsp. animalis (все типовые), 8 - B.animalis subsp. lactis (1 типовой и 7 опытных), 3 - B.bifidum (1 типовой и 2 опытные), 1 типовой штамм B.breve, 1 типовой штамм B.longum subsp. infantis. B.longum (4 референсные и 3 опытные), B.pseudolongum (1 типовой и 6 опытных), 2 типовых штамма B.pullorum, 1 типовой штамм B.gallinarum и 3 опытных культуры, дифференциация которых между B.pullorum и B.gallinarum не была определена. Как

отмечено в обзоре литературы к диссертации, данные два вида очень близки между собой и межвидовая дифференциация штаммов в данном случае является не простой задачей. Видовая принадлежность двух цггамма из коллекции МГУ осталась неопределенной, а штамм и28, не смотря на особенности рестрикции Ama87I, был условно идентифицирован как B.adolescentis на основании сравнения последовательности амплифицируемой области гена xfp.

В результате сравнительного анализа последовательности гена фр-6-ф-фосфокетолазы бифидобактерий с праймерами xfp-F и xfp-R мы нашли, что данная область обладает высоким консерватизмом. Наибольшая вариабельность последовательности приходится на последние 30% амплифицируемого участка, в котором наблюдается высокая концентрация одно-, двух- и трехнуклеотидных замен. Таким образом, данная зона может быть определяющей при подборе диагностических критериев для идентификации штаммов на уровне вида.

Особенно ценными оказались последовательности исследуемой области гена xfp видов В. breve, B.bifidum и B.pseudolongum, для которых не было возможности оценить вероятные результаты рестрикции, и соответственно, возможность использования предложенного в настоящей работе рестрикционного метода идентификации данных видов в силу отсутствия соответствующих последовательностей в международных базах данных.

Анализ единственной последовательности В. breve не выявил у него видимых отличий от остальных видов бифидобактерий в пределах амплифицируемой области гена xfp, откуда следует, что данная область не подходит для идентификации изолятов вида В. breve. Это подтверждено и результатами рестрикционного анализа, где было показано отсутствие продуктов расщепления амплификата гена xfp при обработке его эндонуклеазами Ата87/ и Bspl9/.

По результатам проведенного сравнительного анализа штаммы коллекции МГУ были идентифицированы следующим образом:

■ К4В МГУ и Мб МГУ - В. bifidum;

• 347.1 МГУ, 378 МГУ, 379 МГУ, 381 МГУ, 393 МГУ - B.pseudolongum;

■ 1(5) L, 380 МГУ, 382 МГУ, 384 МГУ, 396.2 МГУ, 398.2 МГУ - B.lactis;

■ 7 st М МГУ, К7В МГУ, М1.2 - B.longum;

• 391 МГУ, М4 МГУ, Мб МГУ - B.pullorum / B.gallinarum;

• Mr МГУ - Bifidobacterium sp.;

■ 395 МГУ - Bifidobacterium sp.;

■ и 28- B.adolescentis (?)

При компьютерной обработке результатов секвенирования участка гена xfp и сравнительном анализе полученных нами последовательностей с последовательностями того же гена референтных штаммов было построено филогенетическое дерево. Результаты сравнительного анализа представлены на рисунке 4. Дендрограммы на основании последовательностей исследуемой области с использованием схем статистического анализа в целом подтверждают наши предположения о систематическом положении выделенных штаммов. Было показано, что область гена xfp, амплифицируемая в ПЦР с праймерами xfp-F и xfp-R обладает достаточным потенциалом для идентификации по крайней мере пяти видов бифидобактерий. На построенном на основании сравнения последовательностей филогенетическом дереве видно, что виды B.animalis, B.pseudolongum, B.adolescentis, B.bifidum и B.longum образуют отдельные кластеры. А вот штаммы, идентифицированные как B.pullorum/gallinarum, заняли неопределенное положение в дереве. Штамм В.breve попал в кластер с представителями вида B.animalis. Последние данные свидетельствуют о возможно недостаточной универсальности данной области генома для идентификции видов B.pullorum/gallinarum и В. breve.

Рисунок 4. Филогенетическое дерево штаммов бнфидобактерий, использованных в данной работе, основанное на сходстве последовательности нуклеотидов участка гена xfp протяженностью в 704 нуклеотидов, амплнфицировапного при помощи пары праймеров xfp-F и xfp-R. Масштаб - 2 нуклеотидные замены на 100 оснований.

B.lactis 1(5)L B.Iactis 396.2 MSU B.laciis 384 MSU B.lactis DSM 10140 B.lactis AJ293946 B.animalis AB264557 B.bre\e NCFB 2257 B.animalis АУ518213

- Bifidobacterium sp. AY518219 ■ B.lactis 398.2 MSU B.pseudolongum 381 MSU B.lactis 380 MSU B.lactis 382 MSU B.pseudolongum 347.1 MSU B.pseudolongum 393 MSU B.pseudolongum AY518216 B.pseudolongum 378 MSU B.pseudolongum 379 MSU

- Bifidobacterium sp. Mr MSU i B.adolescentis i 28

, B.adolescentis AY518212 1 B.adolescentis ATCC 15703

-B.pullorum/gallinarum 391 MSU

B.bifidum K4B MSU B.bilidum M6 MSU B.longum K7B MSU B.longum M7st MSU B.longum ATCC 15707 B.longum AY518215 B.longum M1.2 MSU 1 B.pullomm/gallinrum M4 MSU Bifidobacterium sp. 395 MSU Bifidobacterium sp. AY518218 B.gallinarum AY518214 B.pullorum/gallinarum M5 MSU -B.pullorum AY518217

0.2

выводы

1. Подобрана оптимальная питательная среда для устойчивого культивирования бифидобактерий. В качестве селективного компонента наиболее эффективно использование антибиотика мупироцина в конечной концентрации его 100 мкг/мл.

2. На основе родоспецифической ПЦР с праймерами в области гена х/р разработан молекулярный тест для идентификации бифидобактерий, и была доказана его высокая специфичность.

3. На основе рестрикции амплифицируемого участка гена х/р был разработан видоспецифический тест для идентификации бифидобактерий, который позволяет идентифицировать виды В.ас1о\е$сепИ$, В. 1оп%ит, В.Ы/1с1ит, В.аттаШ и подвиды ВЛопцит виЬэр. 1оп%ит и B.longum вчЬвр. ¡п/апШ, В.аттаНз виЬзр. аттаНз и В.аттаИз виЬэр. /асгй.

4. На основании секвенирования участка гена х/р, амплифицируемого в новой родоспецифической ПЦР, был проведен сравнительный анализ путем построения молекулярного выравнивания и филогенетического дерева.

5. Установлено, что бифидобактерии хорошо переносят лиофильное высушивание без внесения дополнительных криопротекторных веществ, так как разработанная обогащенная бифидум-среда сама выступает в качестве криопротектора.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Пиксасова О. Функциональное питание: мода или необходимость? // Экология и жизнь, 2009, № 3, стр. 80-84.

Статьи в верецензируемых журналах:

2. Piksasova O.V.. Kornienko М.А., Tsygankov Yu.D., Netrusov A.I. Methods of Molecular Identification as Important Tools for Control and Certification in Microbiology // Electronic Journal of Natural Sciences, Jan 2009, Vol. 2009, Issue 1, pp. 35-49.

3. Piksasova O.V.. Cherdintseva T.A., Kotova I.B., Netrusov A.I. Novel tool for genus-specific identification and species determination of Bifidobacterium sp. // Applied and Environmental Microbiology (submitted).

Тезнсы докладов:

1. Piksasova O.V.. Kornienko M.A., Tsygankov Yu.D., Netrusov A.I. Methods of Molecular Identification as Important Tools for Control and Certification in Microbiology // Proceedings of the International Probiotic Conference "Enteric Bacteria and Inflammatory Bowel Disease", Republic of Armenia, Tsakhkadzor, October 2- 4, 2008, page 57.

2. Piksasova O.V.. Cherdintseva T.A., Kotova I.B., Ulumdjiev A.N., Netrusov A.I. Collection of Potential Strains of Probiotic Lactic Acid Bacteria from Natural Sources // Proceedings of the International Probiotic Conference "EUPROBIO 2008", Poland, Krarow, October 15-17, 2008. Krakow: Polskie Towarzystwo Probiotyczne i Prebiotyczne, page 72.

3. Piksasova Q„ Aires J., Cherdintseva T.A., Kotova I.B., Netrusov A. Novel Tool for Genus-Specific Identification of Bifidobacteria II Proceedings of the 3rd Congress of European Microbiologists FEMS, Gothenburg, Sweden, June 28 - July 2, 2009. № 2532.

4. Сидорук K.B., Левитин Е.И., Пиксасова O B. Универсальный метод выделения высокомолекулярной ДНК из микроорганизмов, основанный на предварительной обработке биомассы раствором ацетата аммония. // Актуальные вопросы генетики, радиобиологии и радиоэкологии: Вторые чтения, посвященные памяти В.И. Корогодина и В.А. Шевченко (Дубна - Москва, 12-13 января 2009 г.): Материалы, тезисы докладов. - Дубна: ОИЯИ, 2008. - С. 100.

5. Пиксасова О.В., Чердынцева Т.А., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Новый метод идентификации бифидобактерий на уровне рода и вида // Применение современных биотехнологий в пищевой промышленности: Семинар-выставка на базе Российского центра науки и культуры в г. Ханое (Вьетнам, 14-20 ноября 2009 г.): Материалы, тезисы докладов (в печати).

Подписано в печать 05.11.09 Формат 60x88 1/16. Объем 1.75 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 876 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пиксасова, Ольга Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Морфология бифидобактерий.

1.2. Физиолого-биохимические характеристики бифидобактерий.

1.2.1. Отношение к кислороду.

1.2.2. Оптимум температур.

1.2.3. Оптимум кислотности.

1.2.4. Содержание Сахаров в среде и метаболизм бифидобактерий.

1.2.5. Амилазы бифидобактерий.

1.2.6. Протеазы бифидобактерий.

1.2.7. Состав клеточной стенки.

1.2.8. Образование экзополисахаридов.

1.2.9. Поверхностные протеины.

1.2.10. Образование бактериоцинов.

1.2.11. Устойчивость к желудочно-кишечному стрессу.

1.3. Таксономия бифидобактерий.

1.4. Экология и использование бифидобактерий.

1.5. Бифидобактерий как пробиотики и их использование в медицине.

1.5.1. Болезни желудочно-кишечного тракта и их профилактика с использованием бифидобактерий.

1.5.1.1. Воспалительные заболевания кишечника и синдромы ЖКТ.

1.5.1.2. Превентивная терапия диареи.

1.5.1.3. Инфекция, вызванная Helicobacter pylori, и возможные осложнения.32'

1.5.2. Пробиотики и лечение холестеролемии.

1.5.3. Рак.

1.5.4. Использование пробиотиков при коррекции атопических заболеваний.

1.5.5. Пробиотики и иммунитет слизистых оболочек.

1.6. Выделение штаммов.

1.6.1. Накопительные среды для бифидобактерий.

1.6.2. Селективные среды для бифидобактерий и используемые антибиотики.

1.6.2.1. Мупироцин.

1.6.2.2. Ципрофлоксацин.

1.7. Идентификация бифидобактерий.

1.7.1. Информация, используемая в бактериальной таксономии.

1.7.2. Методы типирования ДНК.

1.7.3. Методы, основанные на рестрикции ДНК.~.

1.7.4. Методы, основанные на полимеразной цепной реакции.

1.7.5. Секвенирование ДНК.

1.7.6. Сравнительная характеристика некоторых молекулярных методов типирования бактерий.

1.7.7. Методы видового типирования бифидобактерий.

1.7.8. Ген фруктозо-6-фосфат-фосфокетолазы бифидобактерий как молекулярная мишень.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Культуры бактерий, использованные в данном исследовании.

2.2. Питательные среды.

2.2.1. Подбор состава питательной среды.

2.2.2. Проверка селективности ципрофлоксацина в отношении микроорганизмов, не относящихся к группе бифидобактерий.

2.2.3. Проверка селективности мупироцина в отношении микроорганизмов, не относящихся к группе бифидобактерий.

2.2.4. Определение наиболее перспективного природного источника устойчивых форм бифидобактерий.

2.2.5. Приготовление растворов и красителей.

2.3. Выделение чистых культур бифидобактерий.

2.4. Хранение штаммов.

2.5. Анализ устойчивости бифидобактерий к кислороду (тест на аэротолерантность)

2.6. Определение активности фруктозо-6-фосфат-фосфокетолазы бифидобактерий.

2.7. Определение продуктов метаболизма бифидобактерий при помощи газовой хроматографии.

2.8. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH).

2.9. Молекулярные методы идентификации бифидобактерий.

2.9.1. Выделение ДНК.

2.9.2. Родоспецифическая полимеразная цепная реакция.

2.9.3. Видоспецифическая мультиплексная полимеразная цепная реакция.

2.9.4. Рестрикционный анализ.

2.9.5. Секвенирование ДНК.-.

2.9.6. Учет результатов секвенирования и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖЕНИЕ.

3.1 Питательные среды, использованные при подборе условий культивирования.

3.1.1 Проверка сред.

3.1.2 Изменение морфологии клеток и колоний.

3.2 Аэротолерантность.

3.3 Тест на фруктозо-6-фосфат-фосфокетолазу и определение продуктов метаболизма бифидобактерий.

3.4 Результаты проведения флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) для штаммов бифидобактерий.-.-.

3.5 Молекулярные методы.

3.5.1 Родоспецифическая ПЦР.

3.5.2 Результаты рестрикционного анализа (ARDRA) и сравнение данных с результатами мультиплексной видоспецифическойПЦР.

3:5.3 Секвенирование и филогенетический анализ последовательностей генов 16S рРНК и xfp.

ВЬШОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новый подход к молекулярной диагностике бифидобактерий"

Бифидобактерии являются одними из наиболее широко используемых в производстве пробиотиков. Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) человека представляет собой комплексную экосистему, которая содержит представителей трех доменов живого: эукариоты, бактерии и археи. В норме в кишечнике преобладают бактероиды, молочнокислая микробиота (бифидобактерии и лактобактерии), анаэробные стрептококки, кишечная палочка, энтерококки и другие микроорганизмы. Концентрация микроорганизмов в толстом кишечнике человека достигает 10п

1 л

10 клеток на 1 г содержимого (Huys et al., 2008). Самые многочисленные и представители полезной микробиоты - это бифидобактерии. Вырабатывая молочную и уксусную кислоту, они препятствуют размножению патогенных микроорганизмов. Молочная кислота создает идеальную среду для работы кишечника. Бифидобактерии стимулируют перистальтику, предупреждая запоры и поносы, повышают иммунитет организма, разлагают некоторые канцерогены и вырабатывают витамины. Колонизация микробами ЖКТ человека начинается немедленно с появлением ребенка на свет и протекает под влиянием таких факторов, как питание ребенка (грудное или искусственное кормление), гигиенические условия. Одними из первых микробных колонизаторов, заселяющих кишечник ребенка, являются бифидобактерии. Однако в течение жизни численность бифидобактерии постепенно сокращается под воздействием процессов старения, стрессов и неправильного питания (Huys et al., 2008).

B.animalis subsp. lactis (Ventura et ai, 2004). Представители бифидобактерий обладают разными свойствами. Многие считают, что бифидобактерии хорошо растут и развиваются в кисломолочных продуктах. На самом же деле только три вида, B.bifidum, B.Iongtim subsp. infantis и B.animalis, обладают доказанной способностью расти в молочной среде (Храмцов и др., 2003).

Бифидобактерии используются как добавка к пищевым продуктам в качестве важного компонента «функционального питания». Пробиотическое действие бифидобактерий включает в себя снижение риска возникновения инфекционных заболеваний (в том числе, бактериальной и вирусной диареи), облегчение течения хронических воспалительных заболеваний (в том числе, паучита и язвенного колита), улучшение различных аспектов физиологического состояния (в том числе, снижение уровня холестерола в крови и коррекция непереносимости лактозы) и, наконец, снижение вероятности развития зубного кариеса, аллергии, астмы и даже рака. Благодаря столь разнообразному спектру лечебно-профилактического действия бифидобактерий, на выделение из естественных природных источников и анализ новых штаммов отпущены значительные ресурсы, как со стороны коммерческих, так и научных организаций. Важно не только понять и изучить пробиотическое действие бифидобактерий, но также и накопить библиотеку штаммов, которые бы обладали этими свойствами. Поэтому работы по выделению и накоплению культур, обладающих пробиотическим потенциалом, важны и требуют приложения надёжных и быстрых методов их обнаружения и идентификации. Идентификация любого штамма всегда начинается с описания его физиолого-биохимических характеристик. Однако не всегда среди этих признаков есть такой, который позволит с уверенностью определить систематическое положение культуры хотя бы на уровне рода. Широко известен полиморфизм бифидобактерий. Далеко не так много штаммов демонстрируют образование клеток классической вилочковидной «бифидо»-формы, как это принято считать. Они часто похожи на прямые палочки, коккобациллы, образуют скопления и даже цепочки клеток. Невысокая скорость роста и неустойчивость ко многим факторам стресса, среди которых низкая кислотность среды и контакт с кислородом воздуха, затрудняет культивирование бифидобактерий в лабораторных условиях и выделение их в чистую культуру. Поэтому необходим метод анализа, позволяющий установить наличие или отсутствие бифидобактерий в образце. Высокочувствительные молекулярные методы, такие как, например, ПЦР, позволяют определять бифидобактерии в образце исходного субстрата, в накопительной и, конечно, в чистой культуре. В последние годы активно развивается область молекулярных методов в идентификация микроорганизмов. Большинство методов молекулярного анализа, как показывает опыт, пока основывается на гене малой субъединицы рибосомальной РНК бактерий, 16S рРНК, но не всегда этого оказывается достаточно. Различные исследования предлагают новые альтернативные генетические мишени для идентификации бифидобактерий, такие как гены atpD

Ventura et al, 2004), tuf (Ventura and Zink, 2003), recA (Kullen et al., 1997; Ventura and Zink, 2003), groEL (Jian et al., 2001; Ventura et al., 2006), dnaJ (Ventura et al., 2006), purF (Ventura et al., 2006), rpoC (Ventura et al., 2006), dnaB (Ventura et al., 2006), xfp (Ventura et al., 2006; Yin et al., 2005) и clpC (Ventura et al., 2005; Ventura et al., 2006) или межгенные области, используемые для видовой идентификации или мониторинга штаммов бифидобактерий, выделяемых из различных природных источников. Совокупность различных тестов, а также использование нескольких генетических мишеней, позволяет получить достоверную информацию о систематическом положении штамма, и даже о его эволюционном пути внутри группы подобных культур. Однако мультипараметрические исследования всегда лимитированы стоимостью проведения анализов. Таким образом, разработка, с одной стороны, простого, а с другой — быстрого, достоверного и недорогого метода идентификации штаммов является одним из приоритетных направлений прикладной микробиологии.

Цель и задачи исследования. Целью работы стало разработка нового подхода к детекции и идентификации штаммов бифидобактерий на уровне рода и вида с использованием в качестве молекулярной мишени гена фруктозо-б-фосфат-фосфокетолазы бифидобактерий, являющимся уникальным ферментом данной группы микроорганизмов.

В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:

5. Подобрать технологию длительного хранения штаммов бифидобактерий с сохранением активности культуры.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Пиксасова, Ольга Владимировна

ВЫВОДЫ

2. Установлено, что бифидобактерии хорошо переносят лиофильное высушивание без внесения дополнительных криопротекторных веществ, так как разработанная обогащенная бифидум-среда сама выступает в качестве криопротектора.

3. Пара праймеров Bifl64 и Bif662 к гену 16S рРНК бифидобактерий обладает специфичностью к бифидобакгериями на уровне рода и может быть использована для анализа.

4. На основе родоспецифической ПЦР с праймерами в области гена xfp , был разработан молекулярный тест для идентификации бифидобактерий, и была доказана его высокая специфичность.

5. На основе рестрикции амплифицируемого участка гена xfp был разработан видоспецифический тест для идентификации бифидобактерий, который позволяет идентифицировать виды B.adolescentis, B.longum, B.bifidum, B.animalis и подвиды B.longum subsp. longum и B.longum subsp. infantis, B.animalis subsp. animalis и B.animalis subsp. lactis.

6. На основании секвенирования участка гена xfp, амплифицируемого в новой родоспецифической ПЦР, был проведен сравнительный анализ путем построения молекулярного выравнивания и филогенетического дерева.

БЛАГОДАРНОСТИ

Прежде всего автор выражает глубочайшую признательность своему научному руководителю д.б.н., профессору А.И. Нетрусову, без участия которого эта работа не могла быть выполнена. Я благодарна коллективу лаборатории физиологии и биохимии микроорганизмов кафедры микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова за всестороннюю поддержку и лично Т.А. Чердынцевой, И.Б. Котовой, М.Д. Пименовой. Я чрезвычайно признательна коллективу Государственного научного центра Института медико-биологических проблем РАН, Институту инженерной иммунологии (Любучаны), лаборатории микробиологии факультета фармацевтических наук и биологии, университета Париж Декарт (Париж, Франция) за предоставление культур и образцов ДНК культур бифидобактерий, без которых нам бы не удалось изучить такое разнообразие видов. Я также благодарна моему коллеге А.Л. Брюханову за моральную и профессиональную поддержку. Выражаю сердечную признательность всем своим друзьям и родным за поддержку во время выполнения и написания диссертационной работы, за своевременную помощь и критику.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пиксасова, Ольга Владимировна, Москва

1. Богданович Т.М. и Страчунский Л.С. Мупироцин: уникальный антибиотик для местного применения //КМАХ 1999, Том 1, N1, стр. 57-65.

2. Гудков А.В. Биологическая активность бифидобактерий в молоке / А.В. Гудков и др. //Молочная промышленность. 1984. -№ 1. - С. 21-23.

3. Дедыш С.Н. Исследование экологии метанотрофных бактерий с использованием молекулярных подходов // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Т. 13. М.: Наука, 2006. С. 192-224.

4. Коршунов В.М., Буш Б., Ильченко АА и др. Влияние ципрофлоксацина на микробиоту желудочно-кишечного тракта в эксперименте и клинике. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1991. N5. С. 14-17.

5. Нетрусов АИ., Егорова М.А, Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии. Уч. пособие для вузов. М., Академия, 2005, 610 с.

6. Самарцев А.А. Протеолитические ферменты пробиотических микроорганизмов микробные // Биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты. Сборник научных трудов. Минск: изд. И.П. Логинов, 2007. Т.1, стр. 65-77.

7. Субботина М.Е. Разработки методики генотипирования бифидобактерий на основе двухлокусного секвенирования с целью видовой идентификации штаммов. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, 2009.

8. Храмцов АГ., Евдокимов И. А, Рябцева С.А., Половянова АВ., Мажуга Д В. 2003. Бифидофлора в продуктах питания // Вестник СевКавГТУ, серия «Продовольствие». 1: 1-9.

9. Abbad AS., Talbaoui Н., Marczak R. and Bonaly R. 1995. Isolation and characterization of exocellular polysaccharides produced by Bifidobacterium longum И Appl. Microbiol. Biotechnol. 43: 995-1000.

10. Abd El-Gawad I. A, El-Sayed E. M., Hafez S. A, El-Zeini H.M., and Saleh F.A. 2005. The hypocholesterolaemic effect of milk yoghurt and soy-yoghurt containing bifidobacteria in rats fed on a cholesterol-enriched diet // Int. Dairy J. 15: 37—44.

11. Ahn Y.T., Kim G.B., Lim K.S., Baek Y.J. and Kim H.U. 2003. Deconjugation of bile salts by Lactobacillus acidophilus isolates // Int. Dairy J. 13: 303-311.

12. Aso Y., Akaza H., Kotake Т., Tsukamoto Т., Imai K., and Naito S. 1995. Preventive effect of a Lactobacillus casei preparation on the recurrence of superficial bladder cancer in a double-blind trial // The BLP Study Group. Eur. Urol. 27:104-109.

13. Barrett E., Ross R. P., Fitzgerald G. F., and Stanton C. 2007. Rapid screening method for analysing the conjugated linoleic acid production capabilities of bacterial cultures // Appl. Environ. Microbiol. 73: 2333-2337.

14. Berthoud H., Chavagnat F., Haueter M. and Casey M.G. 2005. Comparison of partial gene sequences encoding a phosphoketolase for the identification of bifidobacteria // Lebensm. Wiss. Technol. 38: 101-105.

15. Biavati В., Sgorbati В., Scardovi V. 1992. The genus Bifidobacterium. In: Barlows, A., Truper, H.G., Dworkin, M., Harder, W. (Eds.), The Procaryotes. A Handbook on the Biology of Bacteria, Vol. 1. Springer, New York, pp. 816-833.

16. Biavati B. and Mattarelli P. 2006. The family Bifidobacteriaceae. In M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K.-H. Schleifer, and E. Stackebrandt (Eds.), The Prokaryotes (3: 322-382). New York, USA: Springer.

17. Candela M., Vitali В., Matteuzzi D., and Brigidi P. 2004. Evaluation of the rrn operon copy in Bifidobacterium using real-time PCR // Lett. Appl. Microbiol. 38: 229-232.

18. Carey С. M., Kirk J. L., Ojha S., and Kostrzynska M. 2007. Current and future uses of real-time polymerase chain reaction and microarrays in the study of intestinal microbiota, and probiotic use and effectiveness // Can. J. Microbiol. 53: 537—550.

19. Charteris W.P., Kelly P.M., Morelli L. and Collins J.K. 1998. Antibiotic susceptibility of potentially probiotic Bifidobacterium isolates from the human gastrointestinal tract // Lett. Appl. Microbiol. 26: 333-337.

20. Chevalier P., Roy D. and Ward P. 1990. Detection of Bifidobacterium species by enzymatic methods //J. Appl. Bacterid. 68: 619-624.s

21. Chung H.S., Kim Y.B., Chun S. L., and Ji G.E. 1999. Screening and selection of acid and bile resistant bifidobacteria // Int. J. Food Microbiol. 47: 25-32.

22. Cotter P. D., and Hill C. 2003. Surviving the acid test: responses of grampositive bacteria to low pH // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67: 429-453.

23. Creagh S., and Lucey B. 2007. Interpretive criteria for mupirocin susceptibility testing of Staphylococcus spp. using CLSI guidelines // Br. J. Biomed. Sci. 64: 1-5.

24. Cummins C.S., and Harris H. 1956. The chemical composition of the cell wall in some gram positive bacteria and its possible value as a taxonomic character // J. Gen. Microbiol. 14: 583-600.

25. Dittmann J., Mayer J. В., and Huber P. 1967. Zum Stoffwechsel des Bacterium bifidum H X. Bildung van Athanol. Z. Kinderheilk. 99: 115-118.

26. Doncheva N.I., Antov G.P., Softova E.B., and Nyagolov Y.P. 2002. Experimental and clinical study on the hypolipidemic and antisclerotic effect of Lactobacillus bulgaricus strain GB N 1 (48) //Nutr. Res. 22: 393^103.

27. Dong X., Xin Y., Jian W., Liu X., and Ling D. 2000. Bifidobacterium thermacidophilum sp. nov., isolated from an anaerobic digester//Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 119-125.

28. Eggerth A. H. 1935. The gram-positive nonspore-bearing anaerobic bacilli of human feces//J. Bacteriol. 30: 277-299.

29. El-Nezami H., Mykkanen H., Kankaanpaa P., Salminen S., and Ahokas J. 2000. Ability of Lactobacillus and Propionibacterium strains to remove aflatoxin B, from the chicken duodenum // J. Food Prot. 63: 549-552.

30. Felis G.E. and Dellaglio F. 2007. Taxonomy of lactobacilli and bifidobacteria // Curr. Iss. Intest. Microbiol. 8: 44-61.

31. Garrity G.M., Bell J.A., and Lilburn T.G. 2004. Taxonomic outline of the procaryotes. Bergey's manual of systematic bacteriology, 2nd edition, Release 5.0, Springer-Verlag, New York. DOI: http.//dx.doi.org/10 1007/bergeysoutline200405.

32. German J.B., Freeman S.L., Lebrilla C.B., Mills D A. 2008. Human milk oligosaccharides: evolution, structures and bioselectivity as substrates for intestinal bacteria //Nestle Nutritional Workshop Ser Pediatr Program, 62: 205-222.

33. Gill H.S. and Guarner F. 2004. Probiotics and human health: a clinical perspective // Postgrad Med J 80 516-526

34. Glockner F О , Amann R, Alfreider A., Pemthaler J., Psenner R., Trebesius K., Schleifer K.-H 1996 An in situ hybridization protocol for detection and identification of planctonic bacteria // Syst Appl. Microbiol. 19: 403-406.

35. Gueimonde M, Tolkko S., Korpimaki Т., and Salminen S. 2004. New real-time quantitative PCR procedure for quantification of bifidobacteria in human fecal samples // Appl. Environ. Microbiol. 70: 4165-4169.

36. Hamilton-Miller J.M.T. 2004. Probiotics and prebiotics in the elderly // Postgrad. Med. J. 80- 447-451.

37. Hartemink R., Кок В .J., Weenk G.H., Rombouts F.-M. 1996. RB agar, a new selective medium for bifidobacteria // J. Microbiol. Meth. 27: 33-43.

38. Hassinen J. В., Durbin G. Т., Tomarelli R. M., and Bemhart F. W. 1951. The minimal nutritional requirements of Lactobacillus bifidus II J. Bacteriol. 62: 771-777.

39. Hosoda M., Hashimoto H., He F., Morita HL, and Hosono A. 1996. Effect of administration- of milk fermented with Lactobacillus acidophilus LA-2 on fecal mutagenicity and microflora in the human intestine // J. Dairy Sci. 79: 745-749.

40. Hurwitz J. 1958. Pentose phosphate cleavage by Leuconostoc mesenteroides И Biochim. Biophys. Acta 28: 599-602.

41. Jett B.D., Huycke M.M., Gilmore M.S. 1994. Virulence of enterococci // Clin. Microbiol. Rev. 7: 462-478.

42. Jian W., Zhu L., and Dong X. 2001. New approach to phylogenetic analysis of the genus Bifidobacterium based on partial HSP60 gene sequences // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 633-1638.

43. Kalliomaki M., Salminen S., Arvilommt H., Kero P., Koskinen P., and Isolauri E. 2001. Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomized placebo-controlled trial //Lancet 357: 1076-1079.

44. Kandler O. 1970. Amino acid sequence of the murein and taxonomy of the genera Lactobacillus, Bifidobacterium, Leuconostoc and Pediococcus // Int. J. Syst. Bacterid. 20: 491-507.

45. Kim G.B., Miyamoto C.M., Meighen E.A., and Lee B.H. 2004. Cloning and characterization of the bile salt hydrolase genes (bsh) from Bifidobacterium bifidum strains // Appl. Environ. Microbiol. 70: 5603-5612.

46. Kitts C.L. 2001. Terminal restriction fragment patterns', a tool for comparing microbial communities and assessing community dynamics // Curr. Iss. Intest. Microbiol. 2: 17-25.

47. Klijn A., Mercenier A., Arigoni F. 2005. Lessons from the genomes of bifidobacteria // FEMS Microbiol. Rev. 29: 491-509.

48. Kullen M. J., Brady L.J., and O'Sullivan DJ. 1997. Evaluation of using a short region of the recA gene for rapid and sensitive speciation of dominant bifidobacteria in the human large intestine//FEMS Microbiol. Lett. 154: 377-383.

49. Lee D.-H., Zo Y.-G., and Kim S.-J. 1996. Nonradioactive method to study genetic profiles of natural bacterial communities by PCR-single-strand-conformation polymorphism// Appl. Environ. Microbiol. 62: 3112-3120.

50. Ljungh A., and T. Wadstrom. 2006. Lactic Acid Bacteria as Probiotics // Curr. Iss. Intest. Microbiol. 7: 73-90.

51. Malyoth G., and Bauer A. 1950. Beobachtungen am Bacterium bifidum II Z. Kinderheilkd. 68: 358-367.

52. Masco L., Huys G., De Brandt E., Temmerman R., and Swings J. 2005. Culture dependent and culture independent qualitative analysis of probiotic products claimed to contain bifidobacteria // Int. J. Food Microbiol. 102: 221- 230.

53. Masco L., Van Hoord K., De Brandt E., Swings J., and Huys G. 2006. Antimicrobial susceptibility of Bifidobacterium strains from humans, animals and probiotic products // J. Antimicrob. Chemother. 58: 85-94.

54. Matsuki Т., Watanabe K., and Tanaka R. 2003. Genus- and species-specific PCR primers for the detection and identification of bifidobacteria // Curr. Issues Intest. Microbiol. 4:61.69.

55. Miyake Т., Wanatabe K., Wanatabe Т., and Oyaizu H. 1998. Phylogenetic analysis of the Genus Bifidobacterium and related genera based on 16S rDNA sequences // Microbiol. Immunol. 42: 661-667.

56. Meile L., Rohr L.M., Geissmann T.A., Herensperger M. and Teuber M. 2001. Characterization of the D-xylulose 5-phosphate/D-fructose 6-phosphate phosphoketolase gene (xfp) from Bifidobacterium lactis II J. Bacterid. 183:2929-2936.

57. Nebra Y. and A.R. Blanch. 1999. A new selective medium for Bifidobacterium spp. // Appl. Environ. Microbiol. 65 (11): 5173-5176.

58. Nicholas R.O., Вепу V., Hunter P.A., Kelly J.A. 1999. The antifungal activity of mupirocin // J. Antimicrob. Chemother. 43(4): 579 -582.

59. Norris R. F., Flanders Т., Tomarelli R.M., and Gyorgy P. 1950. The isolation and cultivation of Lactobacillus bifidus. A comparison of branched and unbranched strains // J. Bacterid. 60: 681-696.

60. Nyren, P. 2007. The history of pyrosequencing // Methods Mol Biology, 373: 1-14.

61. Oatley J.T., Rarick M.D., Ji G.E., and Linz J.E. 2000. Binding of aflatoxin B1 to bifidobacteria in vitro // J Food Prat. 63: 1133-1136.

62. O'Brien P J., Glick M.C., and Zilliken F. 1960. Acidic amino-sugars from bacterial. Incorporation of l-14C.-a, P-methyl-N-acetyl-D-glucosaminide into muramic acid // Biochim. Biophys Acta 37: 357-360.

63. Ott S.J., Musfeldt M., Wenderoth D.F., HampeJ., Brant O., FolschU.R., Timmis K.N., Schreiber S. 2004. Reduction in diversity of the colonic mucosa associated bacterial microflora in patients with active inflammatory bowel disease // Gut 53- 685-693.

64. Pacher В., and Kneifel W. 1996. Development of a culture medium for detection and enumeration of bifidobacteria in fermented milk products // Int. Dairy J. 6: 43-64.

65. Payne W. J. 1973. Reduction of nitrogenous oxides by microorganisms // Bacterid. Rev. 37: 409-452.

66. Poupard J. A., Husain I., Norris R.F. 1973. Biology of the bifidobacteria // Bacterid. Rev. 37: 136-165.

67. Prasad J., Gill H., Smart J., and Gopal P.K. 1998. Selection and characterization of Lactobacillus and Bifidobacterium strains for use as probiotics // Int Dairy J. 8:9931002.

68. Rachman M., Noble W.C., Cookson B.D. 1987. Mupirocin resistant Staphylococcus aureus П Lancet 2: 387.

69. Rada V., and Petr J. 2000. A new selective medium for the isolation of glucose nonfermenting bifidobacteria from hen caeca// J. Microbiol. Meth. 43: 127-132.

70. Reid G., J. Jass, T. Sebulsky., J.K. McCormick. 2003. Potential Uses of Probiotics in Clinical Practice // Clin. Microbiol. Rev. 16: 658-672.

71. Reid G. 2006. Probiotics to prevent the need for, and augment the use of, antibiotics // Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 17: 291-295.

72. Rolfs A., Schuller I., Finckh U., and Weber-Rolfs I. Detection of single base changes using PCR//in PCR: Clinical Diagnostics and Research, A. Rolfs, I. Schuller, U. Finckh, and I. Weber-Rolfs, Eds., Springer, Berlin, Germany, 1992.

73. Ronaghi M., Karamohamed S., Pettersson В., Uhlen M., Nyren P. 1996. Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release// Analyt. Biochem. 242: 84.

74. Ryan S.M., Fitzgerald G.F., and van Sinderen D. 2006. Screening for and identification of starch- amylopectin-, and pullulan-degrading Activities in bifidobacterial strains // Appl. Environ. Microbiol. 72: 5289-5296.

75. Sakata S., Kitahara M., Sakamoto M., Hayashi H., Fukuyamam M., and Benno, Y. 2002. Unification of Bifidobacterium infantis and Bifidobacterium suis as Bifidobacterium longumf/Ш. J. Syst. Evol. Microbiol. 52: 1945-1951.

76. Sakata S., Ryu C.S., Kitahara M., Sakamoto M, Hayashi M., Fukuyama M., and Benno Y. 2006. Characterization of the genus Bifidobacterium by automated ribotyping and 16S rRNAgene sequences//Microbiol. Immunol. 50: 1—10.

77. Scardovi V. and Trovatelli L.D. 1965. The fructose-6-phosphate shunt as peculiar pattern of hexose degradation in the genus Bifidobacterium II Annali di Microbiologia ed Enzymologie 15: 19-29.

78. Scardovi V., Sgorbati В., and Zani G. 1971. Starch gel electrophoresis of fructose-6-phosphate phosphoketolase in the genus Bifidobacterium // J. Bacterid. 106: 1036-1039.

79. Scardovi V. 1986. Genus Bifidobacterium, p. 1418-1434. In P. H. A. Sneath, N. S. Mair, M. E. Sharpe, and J. G. Holt (ed.), Bergey's manual of systematic bacteriology, vol. 2. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md.

80. Schramm M., Klybal V., and Racker E. 1958. Phosphorolytic cleavage of fructose-6-phosphate by fructose-6-phosphate phosphoketolase from Acetobacter xylinum II J. Biol. Chem. 233: 1283-1288.

81. Sgorbati В., Lenaz G. and Casalicchio F. 1976. Purification and properties of two fructose-6-phosphate phosphoketolases in Bifidobacterium II Antonie van Leeuwenhoek 42: 49-57.

82. Solano-Aguilar G., Dawson H., Restrepo M., Andrews K., Vinyard В., Joseph F. 2008. Urban detection of Bifidobacterium animalis subsp. lactis (ВЫ2) in the intestine after feeding of sows and their piglets // Appl. Environ. Microbiol. 74: 6338-6347.

83. Shu Q., Lin H., Rutherford K.J., Fenwick S.G., Prasad J., Gopal PK, Gill H.S. 2000. Dietary Bifidobacterium lactis HN019 enhances resistance to oral Salmonella typhimurium infection in mice // Microbiol. Immunol. 44: 213 — 222.

84. Talwalkar A, and Kailasapathy K. 2004. The role of oxygen in the viability of probiotic bacteria with reference to L.acidophilus and Bifidobacterium spp. // Curr. Issues Intest. Microbiol. 5: 1-8.

85. Thitaram S.N., Siragusa G.R., Hinton A.Jr. 2005. Bifidobacterium-selective isolation and enumeration from chicken caeca by a modified oligosaccharide antibiotic-selective agar medium // Lett. Appl. Microbiol., 41: 355.

86. Twomey D., Ross R.P., Ryan M., Meaney В., and Hill C. 2005. Lantibiotics produced by lactic acid bacteria: structure, function and applications // Antimicrob. Agents Chemother. 49: 2606-2611.

87. Veerkamp J. H., Lambert R., and Saito Y. 1965. The composition of the cell wall of Lactobacillus bifidus var. pennsylvanicus II Arch. Biochem. Biophys. 112:120-125.

88. Veerkamp J. H. 1969. Uptake and metabolism of derivatives of 2-deoxy-2-amino-D-glucose in Bifidobacterium bifidum var. pennsylvanicus // Arch. Biochem. Biophys. 129: 248-256.

89. Ventura M., and Zink R. 2002. Rapid identification, differentiation and proposed new taxonomic classification of Bifidobacterium lactis // Appl. Environ. Microbiol. 68: 6429-6434.

90. Ventura M., Fitzgerald G.F., and van Sinderen D. 2005 (1). Genetic and transcriptional organization of the clpC locus in Bifidobacterium breve UCC 2003 // Appl. Environ. Microbiol. 71: 6282-6291.

91. Ventura M., Canchaya C., Del Casale A., Dellaglio F., Neviani E., Fitzgerald G.F. and van Sinderen D. 2006. Analysis of bifidobacterial evolution using a multilocus approach // Int. J. Sys. Evol. Microbiol. 56: 2783-2792.

92. Ventura, M., Canchaya C., Tauch A., Chandra G., Fitzgerald G.F., Chater K.F., and van Sinderen D. 2007. Genomics of Actinobacteria: Tracing the evolutionary history of an ancient phylum // Microbiol. Molecular Biol. Rev. 71: 495—548.

93. Watson J. L., and McKay D.M. 2006. The immunophysiological impact of bacterial CpGDNA on the gut // Clin. Chim. Acta 364: 1-11.

94. Woese C. R. 1987. Bacterial evolution // Microbiol. Rev. 51: 221-271.

95. Wolin M. J. 1964. Fructose-l,6-diphosphate requirement of streptococcal lactic dehydrogenases // Science 146: 775-777.

96. Yamazaki S., Kaneko Т., Taketomo N., Kano K.and Ikeda T. 2002. 2-Amino-3-carboxy-l,4-naphthoquinone affects the end-product profile of bifidobacteria through the mediated oxidation of NAD(P)H // Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 72-78.

97. Youn S. Y., Seo J.M., and Ji G.E. 2008. Evaluation of the PCR method for identification of Bifidobacterium species//Lett. Appl. Microbiol. 46: 7-13.

98. Zhu L., Li W.and Dong X. 2003. Species identification of genus Bifidobacterium based on partial HSP60 gene sequences and proposal of Bifidobacterium thermacidophilum subsp.porcinum subsp. nov. //Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 16191623.

Информация о работе

Пиксасова, Ольга Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Новый подход к молекулярной диагностике бифидобактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы