Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление и характеристика легионелл, циркулирующих в водных системах охлаждения промышленных предприятий

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выявление и характеристика легионелл, циркулирующих в водных системах охлаждения промышленных предприятий"

005534002

На щзавахоукописн

Новокшонова Ирнна Владимировна

Выявление п характеристика легнонелл, циркулирующих в водных системах охлаждения промышленных предприятий.

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

З ОКТ 2013

Москва 2013

005534002

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательскнй институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Тартаковский Игорь Семенович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, заведующая лабораторией мпкоплазм и 1_-форм бактерий ФГБУ "НИИЭМ им.Н.Ф. Гамалеи" МЗ РФ Раковская Ирнна Валентиновна

Доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией микробиологических гаггательных сред ФГБУ "НИИВС им.И.И. Мечникова" РАМН Блннкова Лариса Петровна

Ведушая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образованіи "Российская медицинская академия последипломного образования" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится "18" октября 2013 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранешія РФ по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения РФ

Автореферат разослан "18" сентября 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета.

доктор медицинских наук, профессор

Русакова Е.В.

Обшая характеристика работы

Актуальность проблемы. Легнонеллез (болезнь легионеров) - сапронозная инфекция, протекающая с поражением органов дыхания, часто в форме тяжелых пневмоний, обусловленных Legionella pneumophila. Факторами передачи инфекшш являются мелкодисперсный водный аэрозоль и вода, контаминированные легионеллами.

Впервые грамогрнцательная п&чочка, отнесённая к роду Legionella, была выделена из легочной тканн умерших и охарактеризована известными американскими риккетспологами J.E. McDade и С.С.. Shepard спустя полгода после первой эпидемической вспышки легионеллеза летом 1976 г. в Филадельфии (США), когда из 4400 участников конгресса ветеранской организации "Американский легион" у 221 (5%) развилась тяжелая пневмония, для 34 (15,4%) завершившаяся летальным исходом.

Болезнь легионеров выявляют в различных странах Европы, Америки, Азии и Австралии. Первые достоверные случаи заболевания в Poccmi зарегистрировали в 1980 году. В нашей стране исследования неизвестного ранее возбудителя и вызываемой им инфекции возглавил академик РАМН C.B. Прозоровский. Под его руководством были изучены основные биологические свойства штаммов лепюнелл, выделенных из разных источников, разработаны эффективные лабораторные методы диагностики болезни легионеров, изучены эпидемиологические особенности лепюнеллезов в России (C.B. Прозоровский C.B.,1979; В.И. Васильева с соавт.,1986; В.И.Покровский с соавт.,1995: И .С. Тартаковсюш, 2001).

Вода пресных водоемов является основной средой обитания лепюнелл. Но наличия природных хозяев - свободноживуших в воде и почве амеб и простейших, в которых легионеллы паразитируют при благоприятных температурных условиях (выше 25°С) недостаточно для достижения возбудителем высоких концентраций, представляющих угрозу человеку. Размножиться до опасной для человека концентрации возбудитель может только в определенных типах искусственных водных систем.

Наиболее часто эпидемические вспышки легионеллеза связаны с контаминацией легионеллами водных систем охлаждения (градирен). Водные системы охлаждения являются обязательным элементом производственных циклов промышленных предприятшТ и централизованных систем кондиционирования воздуха. Для обозначения данных систем в мировой литературе используется термин - «cooling tower» (охладительная башня, градирня). Системы данного типа, а не только «пресловутые бытовые кондиционеры» или прпточно-вытяжная вентиляция являются реальными источниками распространения лепюнелл, при определенных обстоятельствах способных вызвать эпидемические вспышки и спорадические случал болезни лепюнеров.

В водном контуре систем охлаждения циркулирует несколько десятков тысяч литров воды при температуре 30-35°С. В процессе циркуляции в зависимости от конструкции системы 0,1-2% воды распространяется из

охладительной башни в виде водного аэрозоля с размером капель 1-100 мкм. Капли диаметром менее 5 мкм легко попадают в альвеолы легких человека, где вирулентные штаммы лепюнелл проникают в альвеолярные макрофаги и начинают размножаться. В зависимости от высоты башни и метеорологических условий аэрозоль может распространяться на значительное расстояние и вызывать инфекцию у людей. По данным Европейской рабочей группы по легнонеллезу (Е\УОП) с 2002 по 2007 годы в европейских странах зарегистрированы 44 эпидемические вспышки, связанные с контаминацией градирен (ИлскеЮ К.Б., .ТоьерЬ С.Хее 1.,\Уеиа1ка

0.. 2008).

В Российской Федерации до настоящего времени отсутствовала необходимая методическая база и исследования по анализу уровня контаминации легпонеллами водных систем охлаждения не проводились.

Сложность количественной оценки лепюнелл в сочетании с высокой устойчивостью к дезпрепаратам создают существенные трудности в оценке уровня контаминации и потенциальной опасности водных систем охлаждеши. В этом отношении, мошгторинг лепюнелл в водных системах охлаждения промышленных предприятий и определение частоты и количественного уровня их контаминации легпонеллами, является одннм из наиболее перспективных подходов. Выбор в качестве объекта исследования водных систем охлаждения промышленных предприятий важен с учетом особенностей эксплуатации данных потеншюльно опасных водных систем в России. Для централизованных системы кондишюннровання с водным охлаждением в России характерна сезонная эксплуатация (отключены в зимний период), в отличие от США и Европейских стран, где данные системы эксплуатируют круглогодично. В то же время водные системы охлаждения промышленных предприятий в России, как и за рубежом, эксплуатируют круглогодично, что создает благоприятные условия для накопления высоких концентрации лепюнелл. По этой причине именно данный объект представлял наибольший интерес для изучения.

Цель работы: изучить особенности колонизашш легпонеллами водных систем охлаждения промышленных предприятий, определить частоту и уровень их контаминации легпонеллами.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Разработать методику количественного мониторинга лепюнелл в водных системах охлаждения промышленных предприятий на основе бактериологического метода и ПЦР в реальном времени.

2. Установить частоту и уровень контаминации лепюнеллами водных систем охлаждения промышленных предприятий.

3. Охарактеризовать серологаческое разнообразие лепюнелл, циркулирующих в водных системах охлаждения промышленных предприятии с помощью международной панели моноююнальных антител.

4. Изучить морфологические особенности природных бнопленок лешонелл в ассоциации с другими микроорганизмами в водных системах охлаждения промышленных предприятии.

5. Изучить активность биоцидов, применяемых в водных системах охлаждения промышленных предприятий, на биопленки легиопелл. Научная новизна.

Впервые установлена частота и уровень контамннацнн легионелламн водных систем охлаждения промышленных предприятий в Российской Федерации. Показано, что частота колонизации градирен составляла от 73% до 80% от общего числа обследованных градирен (43градирни). Уровень колонизации градирен колебался в диапазоне от 1.0x102 до 3,6x105 КОЕ на литр воды.

Впервые охарактеризовано серологическое разнообразие штаммов легионелл, циркулирующих в водных системах охлаждения промышленных предприятий. Показано, что в водных системах данного типа преобладают штаммы Legionella pneumophila серогруппы 1 - наиболее значимые в этнолопш эпидемических вспышек внебольнпчных легнонеллезных пневмоннй. В 56% исследованных образцов воды градирен выделены изоляты 2х и более различных серогрупп L.pneumophila,4To свидетельствует о выраженном серологическом разнообразии легионелл в потенциально опасных водных системах данного типа.

Показано, что присутствие природных биопленок, содержащих лепюнеллы, на поверхности градирни является маркером эпидемически значимого уровня контаминации воды градирни легионелламп. Впервые изучены морфологические особенности природных биопленок легионелл в ассоциации с другими микроорганизмами в водных системах охлаждения промышленных предприятий.

Изучена активность ряда биоцидов, применяемых в водных системах охлаждения промышленных предприятии, на моновидовые биопленки легионелл и в градирнях промышленных предприятий.

Научно-практическая значимость работы.

Анализ действия на лепюнеллы хлор и бром содержащих биоцидов Nalco Stabrex ST40 и Ferrocid 8580 на модели моновидовых бпопленок и на работающей градирне, показал их высокую эффективность, что позволяет рекомендовать данные препараты для применення на соответствующих объектах для профилактики легнонеллеза.

Современные принципы и методы мониторинга легионелл в водных системах охлаждения промышленных предприятий внедрены в систему государственного саннтарно-гигненического нормирования. По результатам работы в практику здравоохранения внедрены Санитарно-эпидемиологические правіша СП 3.1.2.2626-10 «Профилактика легнонеллеза», 2010 г. и Методические рекомендаціпі MP 02.039-09 «Выявление и количественное определение лепюнелл в водных образцах

внешней среды методом полимеразной цепной реакции в реальном времени», 2009 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработан порядок обследования, позволяющий выявлять контаминнрованные легнонеллами участки и зоны потенциально опасных водных объектов в водных системах охлаждения промышленных предприятий на основе скрининга с помощью ПЦР-РВ. с последующим бактериологическим подтверждением.

2. Установлены частота и уровень контаминации легнонеллами водных систем охлаждения промышленных предприятий.

3. Охарактеризовано серологическое разнообразие легпонелл, циркулирующих в водных системах охлаждения промышленных предприятий с помощью международной панели моноклональных антнтел.

4. Изучение с помощью электронно-микроскопических методов исследования природных ассоциативных бпопленок в водных системах охлаждения промышленных предприятий показало, что их присутствие является маркером эпидемически значимого уровня контаминации воды градирен легнонеллами.

5. Изучение эффективности хлор- и бромсодержаших биоцидов против легпонелл на модели бнопленок и в действующей градирне позволило рекомендовать данную группу дезннфектантов для профилактики легнонеллеза в потенциально опасных водных системах.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Международной конференции «Legionella 2009» (Paris, 2009), на Пленуме Научного совета по эколопш и гнгнене окружающей среды РАМН (Москва, 2009), 25 конференции Европейской рабочей группы по лепгонеллезу (Copenhagen, 2010), 26 конференции Европейской рабочей группы по легаонеллезу (Wienna, Austria, 2011), на X съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва. 2012), Abstracts 1st meeting of the ESCMID study group of Legionella infection (Dresden, Germany, 2012).

Апробация диссертации состоялась 29 мая 2013 г. на научной конференции отдела медицинской микробиологии ФГБУ "НИИЭМ пм.Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России.

Публикации. По теме днссертащш опубликовано 11 работ, из них 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста н включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты собственных исследований и их обсуждения, выводы и список литературы, содержащий ссылки на 12 отечественных и 105 иностранных источников. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 9 рисунками, из которых 7 - электроно1раммы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе исследовали образцы воды н бнопленок, полученные из градирен. Все штаммы легионелл выращивали на плотной агарпзованной среде буферный угольно-дрожжевой агар (БУДРАГ, BCYEa) с ростовой и селективной добавкой («Oxoid») при 37°С в течение 72ч., также в качестве ростовых добавок применяли L-цистеин 400мг/л (Япония) и пнрофосфат железа растворимый 250 мг/л («Sigma»), приготовленные в условиях лаборатории.

Для определения количества легионелл в исследуемой пробе воды

использовали формулу:

„ а*Ь 1

А =-*-

с s ,

где: X - количество легионелл на литр в исследуемой пробе,

а - количество легионелл, выросших на чашке,

b - объем концентрата в мл,

с - объем, высеянный на чашку в im,

s - объем исходной пробы в л.

Определение легионелл методом ПЦР-РВ в воде п биопленках.

Для проведения ПЦР в реальном времени были выбраны следующие праймеры и флуоресцентные зонды: для выявления Legionella spp. - из последовательности гена, кодирующего 16S рРНК (GenBank СР00675): Lg 15'-AGTGGGGAGGAGGGTTGATAGGTTA:

Lg25TCTCTACGCATTTCACCGCTACACC; Pb_Lg5'-ROX-

AAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCA-RTQ2, для выявления Legionella pneumophila - из последовательности гена mip (GenBank AJ496381): mip 15'-TATAGCATTGGTGCCGATTTGG;mip25'GCTTTGCCATCAAATCTTTCTGA A;Pb_Lmip5'-R6GACCCGGAAGCAATGGCTAAAGGCATGC-BHQ2. Выбранные флюоресцентные зонды были линейными и содержали флюорофоры на 5'-конце н соответствующие im гасители на 3'-конце.

Тест система АМПЛИ-ЛЕГ+-РВ позволяет одновременно в одной пробирке провести три независимые реакции: реакцию на наличие специфического фрагмента ДНК гена 16S рРНК Legionella spp., реакцию на наличие специфического фрагмента ДНК гена mip Legionella pneumophila н реакцию внутреннего положительного контроля, позволяющую исключить недостоверные результаты. Для количественного определения Legionella pneumophila использовали калибровочные образцы плазмпды pGEM, содержащей фрагмент гена mip Legionella pneumophila с известными концентрациями.

Для проверки родо- и видоспецифпчности системы в работе использовали ДНК бактерий S.typhimuriitm, E.coli. Ps.aeruginosa н различных видов легионелл.

Тыпирование легионелл с помощью панели моноклоиальных антител. Проведено обследование водных систем охлаждения промышленных предприятий с целью установлен™ частоты и

количественного уровня их контаминацнн Legionella pneumophila. Для таксономической характеристики н оценки эпидемической значимости выделенных штаммов Legionella pneumophila в данной работе была использована Дрезденская панель моноклональных антител, разработанная К.Люком и Ю. Хельбнгом. Данная панель позволяет оценить практически все пммунологическн значимые антигенные структуры ЛПС L.pneumophila. Панель насчитывает 98 моноклонов. Нами были использованы 24 моноклона данной панели, что позволило дифференцировать на подгруппы штаммы L.pneumophila серогруппы 1 и определить принадлежность штаммов к другим серогруппам L.pneumophila.

Изучение бнопленок легионелл методами электронной микроскопии. С этой целью были взяты соскобы из градирен промышленных предприятий Московской области. Предварительно проведенные бактериологические исследования соскобов показали присутствие в них легионелл.

Образцы были фиксированы по методу Ito - Kamovski для проведения исследовании в трансмиссионном электронном микроскопе и 10% водным раствором формалина для исследования в сканирующем режиме. Для анализа ультратонких срезов бнопленки препараты были подготовлены по общепринятой методике заливки в метакрилатную смолу LR White. Ультратонкие срезы получали с помощью ультрамикротома LKB - 3, окрашивали по методу Reynolds и изучали в электронном микроскопе JEOL 100 В (Japan).

Пробоподготовка для исследования образцов в сканирующем режиме заключалась только в фиксации и напылении образца нанослоем золота толщиной 5 nm. Такой способ пробоподготовки позволяет изучать практически натнвную структуру образцов, содержащих большое количество воды, в частности, бнопленок. Следует отметить, что недегидратированные образцы можно исследовать только в микроскопах нового поколения.

В настоящем исследовании образцы природных биопленок были изучены с помощью сканирующего микроскопа нового поколения Quanta 200 3D (FEI Company USA). '

В работе также был проведен рентгеновский мнкроструктурный анализ образцов с помощью приставки EDAX (EDAX Inc. USA) к сканирующему электронному микроскопу Quanta 200 3 D. С помощью этого метода исследования возможно проводить анализ микроэлементного состава объекта.

Определение чувствительности легионелл к действию дезинфицирующих препаратов. В работе были использованы культуры Legionella pneumophila-, референс-штамм Philadelphia 1 и штамм, выделенный из градирни промышленного предприятия Pyshma-5. В качестве дезинфицирующих средств использовали хлор п бромсодержащий биоцид NALCO STABREX ST40, биоцид на основе N-гетероциклических соединений - FERROCID 8583 и бром содержащий биоцид FERROCID 8580.

Тестирование штаммов легпонелл на способность формировать бнопленкн проводили по методу Т.И. Карповой с соавторами.

Для определения концентрации дезпнфектантов, бактеришшнон для культуры легионелл, полученной на агаровой среде, использовали метод серийных разведений.

Статистические методы обработки результатов. Для обработки результатов использовали программный пакет статистической обработки результатов 81а1Р1ш 2009.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Разработка порядка обследования градирен.

Важное значение при обследовании крупных технических объектов, в которых циркулируют большие объемы воды, имеет порядок обследования II выбор мест забора проб. Наші была разработана методика обследования градирен для оценки уровня их контамннацпн лепюнедламн (Схема 1).

Обследованию подвергались все градирни, задействованные в производственном процессе.

Схема 1. Алгоритм обследования градирни на наличие легионелл.

1. Перед началом отбора проб воды проводился визуальный осмотр мест забора проб с целью выбора точек отбора, по возможности ближе к источнику тепла. Отбор проб воды осуществлялся из нескольких точек. В зависимости от конструкции ірадирен и наличия доступа образцы воды отбирались из чаш, насосов, отстойников, форсунок, ванн и резервуаров градпрнн. При обследовании градирен исследовалось не менее 2-х образцов воды объемом 1 литр.

По возможности образцы воды подвергались быстрой обработке для сохранения жизнеспособности лепюнелл. Хранение образцов допускатось не более 1 суток при комнатной температуре в защищенном от прямых солнечных лучей месте.

Для отбора проб воды использовалась стерильная лабораторная посуда емкостью до 1 литра с добавлением 200 мг тиосульфата натрия (На^Оз) для нейтрализации имеющихся в воде окислительных дезинфектантов.

Образцы воды объемом до 1 литра, полученные из систем промышленного охлаждения (градирен), взбатгывати и подвергали концентрации путем центрнфупгровання. Полученные образцы использоваш для посева на среды с предварительной их деконтамннацией.

2. При визуальном обнаружении бнопленок на поверхностях чаш, поддонов, бетонных колонн, стенках отстойников дня исследования отбирали не менее 2х проб с помощью стерильного скальпеля или шпателя размером 5x5см.

Образцы биопленок и отложеннй суспендировали в солевом буфере или дистиллированной воде в соотношениях 1:10 или 1:100. Плотные образцы суспендировали в солевом буфере или дпстилтнрованной воде в соотношении 1:10 с добавлением 1 см3 стеклянных бус для обеспечения наиболее эффективного суспендпровання. Подготовленные таким образом образцы использоваш для посева с предварительной их деконтамннацпей.

2. Определение частоты и уровня контамннацип легионелламп водных систем охлаждения промышленных предприятий.

Сравнительная характеристика уровня контамннацип градирен промышленных предприятий лепюнелламн в Московском и Уральском регионах. Наші проведено скрннннговое обследование 33 граднрен 12 предприятий пищевого (2), химического (І).строительного (4) п научно-

технологического (5) профиля с целью определения количественного уровня их контаминации Legionella pneumophila в Московском регионе.

Контаминаши Legionella pneumophila выявлена на 11 in 12 объектах, в 24 из 33 обследованных градирен (73%) (Таблица 1). Концентрация возбудителя колебалась в диапазоне от 1.2х102 до 1х106 КОЕ (геномных копий) на лптр воды. Среди выделенных изолятов 52 % принадлежали к 1ой серогруппе L.pneumophila. 48% к другим серогруппам возбудителя. В 14% положительных образцов были выделены изоляты нескольких серогрупп L.pneumophila, в том числе первой. По уровню контаминации все обследованные объекты можно разделить на 3 группы:

1) на объекте отсутствуют легнонеллы, при визуальном осмотре не обнаружены биопленки (3 объекта, 4 градпрнн):

2) на объекте выявлены легнонеллы в низкой концентрации (менее 10 ' КОЕ на литр), бнопленкн не обнаружены (2 объекта, 4 градирни);

3) на объекте выявлены легнонеллы в концентрации превышающий уровень 103 КОЕ на литр; обнаружены биопленки, содержащие Legionella pneumophila на орошаемой поверхности чаши градирен (5 объектов, 14 градирен).

В бнопленках помимо лепюнелл, как правило, присутствовали диатомовые водоросли, бактерш! Pseudomonas spp. При превышешш концентрации лепюнелл в воде градирен уровня 104 КОЕ на литр в биопленках и воде выявлено присутствие Staphylococcus spp. Таблица 1. Уровень контаминации Legionella pneumophila градирен промышленных предприятий Московского региона.

Обь С KT Количество обследован ПЫ1 градирен Количество контамини-рованных градирен Концентрация L.pneumophila (КОЕ/л) Присутствие биопленок, содержащих L.pneumophila Кол-во точек отбора, в которых была превышена норма

минимальная максимальная

1. 4 3 6.0x10" 2.4x10" + 1

-> 3 2 1.2x10- 8.4x10"

3. 4 2 1,2x10" 1.5x10"

4. 2

5. 8 6 8,4x10" 3,6x10' + 2

6. 2 2 1,2 хЮ4 9.6 хЮ' + 1

7. 1 1 3 xl0J 4.5 x 10J +

8. 1 1 50 1 xlO' +

9. 1 1 6 xl0J 1 xlO" + 1

10. 1 1 1.8x10' 1.9 xl0J

11. 1 1 5 xlO1

12. 5 4 1,6 xl0J 2x10' + 3

В Урапьском регионе изучена контаминация 10 градирен на 5 предприятиях преимущественно металлургического профиля (Таблица 2).

Таблица 2. Уровень контаминации Legionella pneumophila градирен промышленных предприятий в Уральском регионе.

Объект Количество обследованных градирен Количество контами-нирован-II ых градирен Концентрация L.pneumophila (КОЕ/л) Присутствие биопленок, содержащих L.pneumophila Количество проб, превышающих норму

минимальная максимальная

1. 3 3 1,6x10' 3.6 xlO3 + 3

2. 1 1 1 xlOJ 5,2 xlOJ + 0

3. 2 1 1,2x10" 1.5 xlO2 _ 0

4. 2 1 S,4xl0* 9.6 xlO4 + 1

5. 2 2 1,2 xlO' 5.4 xlOJ + 0

В Московском регионе 73% градирен оказались контамишгрованы L.pneumohila, причем в 30% случаев были превышены допустимые значения концентрации легнонелл. В Уральском регионе из обследованных градирен в 80°о объектов выделены культуры легнонелл, а в половине градирен превышена допустимая концентрация возбудителя. В данном случае столь высокий процент достигнут за счет одного предприятия, град1грни которого находятся в эксплуатации более 25 лет. В Московском регионе градирни с высоким процентом выявленных легнонелл распределены по предприятиям более равномерно. Практически во всех случаях превышению концентрации легнонелл в пробах сопутствовало визуальное выявление бнопленок, содержащих легпонеллы на поверхности чаши градирни, охарактеризовано серологическое разнообразие штаммов L.pneumophila, присутствующих в градирнях и представлены данные о морфологических особенностях бнопленок градирен, содержащих лепюнеллы.

Оценка \т>стня контаминащпт градирен с помощью ПИР в реальном времени. На каждой градирне для исследования отбирали не менее Зх проб. Образцы воды, биопленок, смывов исследовали в соответствии с МУК 4.2.2217-07 «Выявление бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды» с помощью ПЦР в реальном времени с использованием тест-системы для количественного выявления Legionella pneumophila АМПЛИ-ЛЕГ-РВ (ЗАО «Спнтол») на приборе АНК-32. Параллельно образцы исследовали с помощью бактериологического метода на среде BCYE и набора для латекс-агглютинации (Oxoid,

Великобритания).

Полученные результаты свидетельствуют о достаточно высоком уровне контаминащш Legionella pneumophila водных систем всех Зх групп обследованных объектов и удовлетворительном уровне корреляции результатов исследований бактериологическим методом и ПЦР в реальном времени (Таблица 3). Концентрация легнонелл, определенная с помощью ПЦР-РВ (число геномных копии на литр) в большинстве образцов

превышала концентрацию легнонелл, выявленную бактериологически (число КОЕ на лнтр) на 1-2 порядка. Данный феномен может быть обьяснен естественным содержанием в соответствующих экосистемах планктонных форм легнонелл, выявленных как с помощью ПЦР-РВ, так и бактериологически, и некультпвируемых форм легнонелл, выявленных только с помощью ПЦР-РВ. В 45% образцов воды из градирен наряду с L.pneumophila с помощью ПЦР-РВ была обнаружена Legionella spp. Уровень контаминации L.pneumophila в градирнях промышленных предприятий соответствует уровню контаминации аналогичных объектов за рубежом.

Таблица 3. Концентрация Legionella pneumophila в градирнях предприятий.

Объект Метод

бактериологический (КОЕ/л) ПЦР-РВ (геномных копий/литр)

1 1.2- 9.6 х 104 1.2х 103 -2,9x10"

2 3.0- 4.5 х 10' 1,0-3.2 х 10"

3 1.5- 1.8 х 10J 5,4 - 9.2х 10'

4 5.0- 7.4 х 101 3,7х 10* - 1,7 х 105

5 1,6 х 101 -2,0х 10' 1,3 -8,8х 10'

Активное внедрение ПЦР-РВ в систему количественного мониторинга легнонелл в потенциально опасных объектах окружающей среды обусловлено, прежде всего, сокращением сроков исследования по сравнению с бактериологическим методом с 7-8 до 1 дня. При количественном профилактическом мониторинге водных образцов число геномных копий легнонелл в большинстве образцов на 1-2 порядка превосходило число КОЕ на литр воды, определявшееся бактериологически. Равновесие между планктонными и некультнвнруемымн формами легнонелл в водных системах является логичным объяснением выявленной закономерности, но не позволяет оценить риск эпидемической ситуации без последующего бактериологического подтверждения. Не менее важным фактором лимитирующим применение ПЦР-РВ является пробоподготовка образцов воды н биопленок, исключающая большие потери ДНК и ингибншно реакции. В процессе разработки тест-системы АМПЛИ-ЛЕГ+РВ наряду с отработкой чувствительности и специфичности тест-системы были оптимизированы условия пробоподготовки, о чем свидетельствует хорошая корреляция с результатами бактериологических исследований.

3. Изучение серологического разнообразия штаммов легнонелл, циркулирующих в воде градирен промышленных предприятии.

В работе типировачн 84 штамма Legionella pneumophila, выделенных в градирнях промышленных предприятий. По полученным результатам выделенные штаммы принадлежат ко всем 14 серогруппам L.pneumophila и к б из 9 подгрупп 1-ой серогруппы L.pneumophila (Таблица 4).

Таблица 4. Результаты тнпнрования штаммов Legionella pneumophila, выделенных из градирен промышленных предприятий Московского региона

\под группа водный объект Philadel phia Beni-donn France/ Alleut OLDA Oxford Belling ham Hey sham Cam- реї down

Градирни промышле ИНЫХ предпрнят ИЙ 4 2 1 2 20 1 10 -

В граднрнях промышленных предприятий наблюдалось преобладание штаммов первой серогруппы L.pneumophilci (40%), которые являются основным возбудителем внебольннчных пневмоний легионеллезной этиологии. Вместе с тем штаммов L.pneumophila серогруппы 1, типируемых моноклоном МАЬ 3/1, (ассоциированный с ЛПС эпнтоп, выявляемый только у наиболее вирулентных штаммов легаонелл) выделено б. Средн штаммов первой серогруппы преобладают представители подгрупп Oxford и Heysham. Средн серогрупп L.pneumophila. наряду со штаммами серогруппы 1. широко представлена серогруппа б (26%). а также штаммы серогрупп 3 (14%) и 2 (7%) (Рис.1).

Рис.1 Распределение серотипов среди штаммов L.pneumophila выделенных из градирен

Распределение серотипов среди штаммов L.pneumophila выделенных н$ градирен.

Sgl 5.« б

■ s«3

a 5g 2 » другие

Для воды градирен характерен высокий уровень серологического разнообразия выделенных штаммов легионелл - в 30% проб выделены штаммы 2х и более серотнпов возбудителя, 26% - 3 и более серотипов (Диаграмма Г).

Диаграмма 1. Серологическое разнообразие штаммов L.pneumophila, циркулирующих в водных системах охлаждения промышленных предприятий.

Анализ контаминации градирен промышленных предприятий Ь.рпечторМ1а в Московском и Уральском регионах показал высокий уровень контаминации их легионеллами. Исследования, проведенные с применением международной панели моноклональных антител, подтверждают ее важную роль для характеристики и оценки эпидемической значимости штаммов, циркулирующих в потенциально опасных водных объектах.

4. Изучение морфологических особенностей формирования природных биопленок легионелл в ассоциации с другими микроорганизмами в водных системах охлаждения промышленных предприятий.

Анализ ультратонких срезов образцов соскобов из градирен показал, что в их состав входили микроорганизмы различных систематических групп (бактерии, грибы, сине-зеленые водоросли, диатомовые водоросли). Эти микроорганизмы формировали сложноорганизованную биопленку, в состав которой входили грамположительные и грамотрицательные бактерии, грибы и сине-зеленые водоросли, объединенные общим экзоклеточным матриксом. (рис. 2 А, Б. В, Г).

биопленка

бактерии

гопбы

включения

А - х15 ООО Б - х50 ООО В-х15 000 Г - х50 ООО

Рис. 2 А, Б, В, Г Смешанная бактериалыю-грнбкопая биопленка из градирни

А - объединение грибов посредством наружных поверхностей клеточных стенок

Б - объединение грамотрицательных бактерий между собой посредством наружной мембраны клеточной стенки

В - образование зрелой биопленки, в составе которой некультнвируемые формы бактерий. В экзоклеточном матриксе электронноплотное включение Г - мелкие зернистые включения в экзоклеточном матриксе.

Грамотрииательные бактерии, идентичные по ультраструктурной организации лепгонеллам, объединялись между собой посредством наружной мембраны клеточной стенки, вокруг них визуализировался экзоклеточный магрикс (рис. 2Б). посредством которого осуществлялся тесный контакт с клеточными стенкаш1 грибов и сине-зеленых водорослей (рис. 2А). В препаратах также были обнаружены особые структурные образования, плотный метрике которых формировал округлые структуры в виде «пчелиных сот», внутри которых находились бактерии с электронно-плотным матрпксом. п дефектными поверхностными структурными компонентами - клеточной стенкой, иитоплазматпческой мембраной (рис. 2В). Подобного рода субмикроскопическая организация характерна для некультивируемых форм бактерий. Обнаруженная сложноорганнзованная структура соответствует строению зрелой биопленки. В экзоклеточном матриксе выявлялись включения высокой (металлической)

электронной плотности, в виде округлых с четкими контурами образований (рис. 2В) и мелкозернистых, объединенных в хлопьевидные структуры (рис. 2Г).

Анализ_препаратов соскобов из градирен в сканирующем

электронном микроскопе позволил детализировать строение сложного микробного сообщества, формирующегося в градирнях. При исследовании в препаратах выявлялись длинные переплетающиеся волокнистые структуры, по всей видимости, гифы грибов, которые образовывали своеобразный

сетчатый каркас. На них были видны аморфные массы и геометрически правильные объемные структуры (рис. 3).

Рис. 3 Волокнистые структуры Т. аморфные массы, геометрически правильные фигуры Ц

При большем увеличении оказалось, что аморфные массы есть ни что иное как биопленки, на поверхности которых можно было видеть контуры бактериальных клеток. Геометрически правильные образования представляли собой диатомовые водоросли (рис. 4)

Рис. 4 Биопленка в градирне в виде аморфных масс, на поверхности биопленки видны контуры единичных бактериальных клеток 1, диатомовые водоросли [=>

Диатомовые водоросли можно рассматривать как прочный элемент сложной конструкции, которые формируют микроорганизмы в условиях существования в градирне. Прочный скелет днатомов, состоящий, в основном, из кальция и кремния, обеспечивает механическую прочность этой конструкции, к которой прикрепляются гифы грибов. Кроме этого, на поверхности диатомовых водорослей можно было наблюдать адгезию бактерий и формирующиеся биопленки.

Показано, что в диятомовых водорослях присутствуют химические элементы Ся, ^ 1. Ге, >а, Р, К, А!, >1п

Проведенный рентгеновский мнкроэлементнып анализ диатомовых водорослей показал, что в их составе помимо основных структурных элементов кальция, фосфора и кремния, выявлялись такие как железо, натрий, калий, алюминий и марганец (рис. 5).

Рис. 5 Рентгеновский мнкроструктурный анализ диатомовой водоросли в препарате соскоба из градирни

Проведение рентгеновского мнкроструктурного анализа соксобя с градирни с аомошью приставки к двулучевому сканирующему электронному микроскопу С?иата 200 ЗГ>

Микроэлементный анализ бпопленок показал наличие в их составе углерода, кислорода, азота, серы, а также включений разных металлов, например, титана, железа, натрия, магния и других (рис. 6).

Рис. 6 Данные рентгеновского микроструктурного анализа биопленки

Выявлено присутствие включений микроэлементов - Ті. На. АІ.Бі. С1, Са в составе биопленки. Обнаружение высокой электронной (металлической) плотности частичек при ультраструктурном анализе срезов бнопленки, а также данные рентгеновского микроструктурного анализа бпопленок при изучении в сканирующем режиме может свидетельствовать о вовлечении в метаболические процессы, протекающие в биопленке, металлов, из которых состоит поверхность оборудования на котором образуется биопленка, то есть указывать на биокоррозионные процессы.

Таким образом, природные биопленки представляют собой совокупность микроорганизмов, относящихся к представителям разных систематических групп. Совместное сосуществование разных микроорганизмов в одной экологической нише обеспечивается трофілескнми цепями - продукты метаболизма одних сочленов сообщества служат питательным субстратом для других. Эффективная защита от неблагоприятных факторов внешней среды в таком организованном сообществе достигается интегральным синтезом экзополнсахаридного матрикса. Диатомовые водоросли, входящие в состав

сложноорганнзованного сообщества, формігрующегося в градирнях, следует рассматривать как неблагоприятный фактор, способствующий бактериальному загрязнению систем водоснабжения и концентратором различных микроэлементов.

5. Изучение активности биоцидов, применяемых в водных системах охлаждения промышленных предприятий, на биопленкц лепюнелл. Анализ эффективности ряда биоцидов на лепюнеллы в условиях эксперимента и градирни промышленного предприятия. Изучена активность ряда дезинфицирующих веществ с различным механизмом действия используемых доя дезинфекции градирен промышленных предприятии для оценки их эффективности против лепюнелл. В эксперименте использовали 3 бноцпда: хлор н бромсодержащпй биоцид NALCO STABREX ST40, биоцид на основе N-гетероцшслических соединений - FERROCID 8583 и бром содержащий биоцид FERROCID 8580. Задачей исследования было сравнение эффективности действия препаратов на суспензию клеток и сформированную моновндовую бпопленку лепюнелл.

Полученные результаты свидетельствуют о заметных различиях в концентрациях препаратов, необходимых для гибели планктонных форм клеток в зависимости от исходного разведения культуры (Таблица 5,7,9).

Показано, что выделенный в России штамм Pyshma 5 обладает более высокой устойчивостью к действию биоцидов по сравнению с музейным штаммом Philadelphia 1. По результатам исследований можно сделать вывод о способности препаратов FERROCID 8580 и Nalco Stabrex 40 полностью подавлять способность лепюнелл к репродукции прн различных формах существования (планктонные формы лепюнелл и моновидовые бпопленки лепюнелл) в условиях эксперимента (Таблица 5.6,7,8).

Таблица 5. Действие препарата Nalko ST-40 на планктонные формы лепюнелл.

Штамм Legionella рв««шорЬПа Время контакта

IS ммнут 30 икнут 60 минут 7 дней

7.5 иг/л 15 мг/л 30 мг/л 7.5 мг/л 1S мг/л 30 мг/л 7,5 кг/л 1S мг/л 30 иг/л тл мг/л 15 мг/л 30 мг/л

Philadelphia! 107 КОЕ/кл ♦ * + + - + - - - - -

10* КОЕ/кл + + ♦

10і КОЕ/ил + ,

Pyshiua-5 10? КОЕ/мл ♦ * * + - - * - - -

10s КОЕ/кл ♦ ♦

10J КОЕ/мл _ _ _

«+» - наличие роста культуры, «-»- отсутствие роста культуры

Таблица 6. Действие препарата Nalko ST-40 на моновндовые биопленкн легпонелл.

Штамм Legiouelta pneumophila Время контакта

1 час 24 часа 72 часа 7 суток

15 мг/л 30 мг/л 15 мг/л 30 мг/л 15 мг/л 30 мг/л 15 мг/л 30 мг/л

Philadelphia! + +

Pyshma-5 + + +

«+»- наличие роста культуры, «-»- отсутствие роста культуры

Таблица 7. Действие препарата FERROCID 8580 на планктонные формы легпонелл.

Штамм Legionella pneumophila Время контакта

1S минут 30 мняут 60 минут 7 дней

10 мг/л 20 мг/.i 30 мг/л 40 мг/л 10 мг'л 20 МГ'Л до 40 ЧГ/.1 10 мг'л 20 мг'л 30 мг/л 40 мг/л 10 мг/л 20 мг/л 30 мг/л 40 МГ'Л

Fbiladelphial Ю'КОЕ/мл - + - - - - - - + - - - - - - -

105К0Е/мл ♦

Ю'КОЕ/мл

Pyslinia-5 Ю'КОБ'мл * ♦ - + + - - + - - - - - -

10*К0Е/мл ♦ +

КЯКОЕ/мл -

«+» - наличие роста культуры, «-» - отсутствие роста культуры

Таблица 8. Действие препарата FERROCID 8580 на моновидовые биопленкн легпонелл. _

Штамм Legionella pneumophila Время контакта

1 час 24 часа 72 часа 7 суток

30 мг/л 40 мг/л 30 мг/л 40 мг/л ЗОмг/л 40 мг/л 30 мг/л 40 мг/л

Philadelphia! + + _ _ _ _ _ —

Ру$Ьта-5 + + + - - - - -

«+» - наличне роста кулылры, «-» - отсутствие роста культуры

Таблица 9. Действие препарата ЕЕМЮСГО 8583 на планктонные формы легнонелл.

Штамм Ье^оаеНя риеишорЬіІя Время контакта

15 минут 30 минут 60 минут 7 дней

25 мгл 50 мгл 75 мгл 100 мг'л 25 мг'л 50 мг'л 75 мгл 100 мг/л мг'л 50 мг'л 75 мг'л 100 мг.'л >5 мг'л 50 мг'л 75 мгл 100 мг'.

РЬіІясІеІрЬіяІ 107 КОЕ/мл - - - -

105 КОЕ/мл _ _ _ _

103КОЕ/мл + ♦ + + + ♦ _ _

Ру$Ьта-5 Ю7 КОЕ/мл - - - -

105 КОЕ/мл _ _ _

10* КОЕ/мл ♦ ♦ + * + - - -

«+» - наличие роста культуры, «-» - отсутствие роста культуры

Таблица 10. Действие препарата РЕШЮСШ 8583 на моновидовые биопленки лепюнелл.

Штямм І^іопеІІя рпеиторЬЦя Время КОНТЯКТЯ

1 час 24 чяся 72 часа 7 суток

75м г/л 100 мг/л 75 мг/л 100 мг/л 75 мг/л 100 мг/л 75 мг/л 100 мг/л

РЬіІжІеІрІияІ + + + +

Ру*Ьшя-5 + -і- + + +

«+» - наличие роста культуры. «-» - отсутствие роста культуры

Действие наиболее активного в отношении легпонелл в условиях эксперимента биоцида РЕКЯОСГО 8580 изучено непосредственно в градирне промышленного предприятия (Таблица 11,12). Анализ эффективности препарата проводили в промышленной водной охлаждающей установке

предприятия «Криогеимаш» г. Балашиха Московской области. Ранее в данной системе охлаждения какие-либо дезннфектанты не применялись.

Таблица 11. Результаты микробиологического исследования градирни на предприятии «Крногенмаш», г. Балашиха до применения препарата ЕЕЫЮСГО 8580.

Место отбора пробы количество микроорга шпмов

лепюнелл, КОЕ /л общее число микроорганизмов, КОЕ/мл

1. 4x10 7x10

2. 2x10" 4x10

3. і 10 8x10*

4. 3x10 1,2x10

После добавления в воду градирни препарата БЕЮЮСГО 8580 в воде определяли концентрацию лепюнелл и общее число микроорганизмов. Через 7 дней после применения препарата РЕШЮСГО 8580 в образцах воды лепюнеллы не обнаружены, а обшее число микроорганизмов снизилось на несколько порядков, что свидетельствует о положительном эффекте применения препарата. Очевидно, что применение препарата приводит к подавлению способности лепюнелл к репродукции при различных формах существования микроорганизмов.

Таблица 12. Результаты мнкробполопгаеского исследования образцов воды градирни на предприятии «Крногенмаш», г. Балашиха через неделю после применения препарата РЕШЮСГО 8580.

Место отбора пробы количество микроорганизмов

лепюнелл, КОЕ/л обшее чпсло микроорганизмов, КОЕ/мл

1. не обнаружены 3x10

2 не обнаружены 1,4x10"

3. не обнаружены 5x10

4. не обнаружены 2x10

ВЫВОДЫ

1. На основе разработанной методики с использованием вндоспеипфнческой ПЦР в реальном времени и бактериологического метода впервые охарактеризованы частота и уровень колоннзацтт лепюнелламп градирен промышленных предприятий Московского и Уральского регионов

Российской Федерации. Показано, что частота колонизации градирен составляла от 73% до 80% от общего числа обследованных градирен (43градирнн). Уровень колонизации градирен колебался в диапазоне от 1,0x102 до 3,6x105 КОЕ на литр воды.

2. Анализ серологического разнообразия лепгонелл, циркулирующих в водных системах охлаждения промышленных предприятий показал, что в водных системах данного типа преобладают штаммы Legionella pneumophila серогруппы 1 (40%) - наиболее значимые в этиологии эпидемических вспышек внебольничных легионеллезных пневмоний. Выделение изолятов 2х и более различных серогрупп L.pneumophila в 56% исследованных образцов воды градирен свидетельствует о выраженном серологическом разнообразии лепгонелл в потенциально опасных водных системах данного типа.

3. Показано, что присутствие природных биопленок, содержащих лепюнеллы, на поверхности градирни является маркером эпидемически значимого уровня контачннашш воды градирни легионелламп.

4. Анализ морфологических особенностей природных ассоциативных биопленок легионелл с друтими микроорганизмами в водных системах охлаждения промышленных предприятий с помощью электронно-микроскопических методов исследования показал, что природные биопленки градирен представляют собой сообщества легионелл, грибов и водорослей, причем диатомовые водоросли являются основным каркасным элементом природной биопленки. С помощью рентгеновского мнкроструктурного анализа показано наличие в бпопленках включений различных метатаов, в том числе, тнтана и железа, что указывает на взаимосвязь формирования природных биопленок с процессами коррозии градирни.

5. Анализ действия на лепюнеллы хлор и бром содержащих биоцидов Nalco Stabrex ST40 и Ferrocid 8580 на модели моновидовых биопленок показал их высокую эффективность. Применение препарата Ferrocid 8580 на работающей градирне, контамннированной лепюнелламн. позволило полностью элиминировать лепюнеллы из потенциально опасной водной системы в течение 7 дней.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Новокшонова И.В., Тартаковскин И.С. // Лепюнеллы в градирнях промышленных предприятий: особенности колонизации и серологическое разнообразие. ЗНиСО, 2012, 10: 38 -41.

2. Новокшонова И В. Тартаковский И.С. // Выявление и характеристика лепгонелл. циркулирующих в водных системах охлаждения промышленных

предприятий. Инфекция и иммунитет. Материалы X съезда ВНПОЭМП, Москва, 2012, 2(1-2):306.

3. Тартаковскнн И.С., Новокшонова И.В., Садретдннова О.В., Груздева О.А., Аляпкина Ю.С., Карпова Т.И., Дронина Ю.Е., Фокина В.Г., Шустрова Н.М//Изучение частоты и уровня контаминации Legionella pneumophila потенциально опасных водных объектов в Московском регноне. Журн. мпкробпол. 2010,6: 21-26.

4. Тартаковскнн И.С., Пантелеева Л.Г., Демина Ю.В.,. Карпова Т.И, Дронина Ю.Е., Новокшонова И.В., Гннцбург АЛ., Шандала М.Г. // Опыт применения в градирнях промышленного предприятия дезинфицирующих средств для профилактики легпонеллеза. Журн. Дез. дело, 2010, 1: 50-53.

5. Дронина Ю.Е., Люк К., Хельбиг Ю„ Тартаковсиш И.С., Садретдннова О.В., Карпова Т.И., Каражас Н.В.. Рыбалкпна Т.Н., Новокшонова И.В., Груздева О.А., Смирнова С.С., Кочеровская Е.Ю. // Моноклональные антитела к липополисахариду легионелл и их значение для тнпнрованпя возбудителя. Жизнь без опасностей, Москва, 2010, 4:122-125.

6. Диденко Л.В., Садретдннова О.В., Шевлягпна Н.В., Автандилов Г.А., Новокшонова И.В., Карпова Т.Н., Груздева О.А., Тартаковскнн И.С. // Морфологические особенности биопленок в потенциально опасных водных системах. Эпидемиология и инфекционные болезни, 2012, 1:1014.

7. Дронина Ю.Е., Тартаковскнн И.С., Садретдннова О.В., Карпова Т.Н., Новокшонова И.В., Груздева О.А., Каражас Н.В., Рыбалкина Т.Н. // Серологическая характеристика штаммов Legionella pneumophila, выделенных из иотенннально опасных водных систем в Российской Федерации в 2007-2011 годах. Журн. мпкробиол.2012, 2:23-27.

8. Alyapkina Y„ Tartakovskiy I., Karpova Т., Sadretdiniva О., Alexeev J., Novokshonova I. // Quality and quanty detection of Legionella in environmental water samples. Abstracts of international conference Legionella 2009, Paris, 2009: 212.

9. Tartakovskiy I., Sadretdinova O., Karpova T. Dronina Y., Alyapkina Y„ Novokshonova I.. Grusdeva O. // Evaluation of Legionella pneumophila contamination of potentially dangerous water systems in Moscow region. Abstracts of 25th EWGLI meeting, September. Copenhagen, 2010:74.

10. Tartakovskiy I., Demina Y.. Grusdeva O.. Novokshonova I. // Harmonization of the surveillance and prevention of legionellosis in the Russian Federation in accordance to international standards, Abstract book of 26th meeting European working group on Legionella infection, Wienna, Austria, 2011:27-28.

11. Tartakovskiy I.. Didenko L.. Dronina Y., Grusdeva O., Novokshonova I., Karpova T.// Legionella pneumophila associated biofilms from potential dangerous water systems: morphological aspects and serological diversity. Abstracts 1st meeting of the ESCMID study group of Legionella infection., Dresden, Germany, September, 2012:35-36.

Список сокращений

КОЕ - колоннеобразующая единица

ПЦР-РВ - полнмеразная цепная реакция в режиме реального времени

БЛАГОДАРНОСТИ

Считаю своим приятным долгом выразить глубокую благодарность н признательность научному руководителю д.м.н., проф.. И.С. Тартаковско.чу за постоянное внимание и поддержку, полученные знания и опыт.

Отдельно благодарю сотрудников лаборатории лешонеллеза к.б.н. Т.И. Карпову и к.м.н. Ю.Е. Дронину за всестороннюю помошь в работе.

За предоставленный эксклюзивный материал о морфологических особенностях природных биопленок лепюнелл методами электронной микроскопии и рентгеновского мнкроструктурного анализа искренне признательна руководителю лаборатории анатомии микроорганизмов ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России д.м.н. Л.В. Диденко.

Глубокую благодарность выражаю администрации ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России за предоставленную возможность заниматься научной работой и содействие в проведении научных исследований.

Выражаю признательность ученому секретарю диссертационного совета ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России д.м.н., проф. Е.В. Русаковой н к.б.н. Л.К. Кожевниковой за помощь при подготовке диссертации к защите.

Подписано в печать: 13.09.2013 Объем: 1,6усл.п.л. Тираж: 80 экз. Заказ № 912 Отпечатано в типографии «Реглет» 101000, г. Москва, Пл. Мясницкие Ворота д. 1, стр.3 (495) 971-22-77 www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Новокшонова, Ирина Владимировна, Москва

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ имени ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф. ГАМАЛЕИ

На правах рукописи

04201361487

Новокшонова Ирина Владимировна

Выявление и характеристика легионелл, циркулирующих в водных системах охлаждения промышленных предприятий.

03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: профессор, доктор биологических наук И.С.Тартаковский

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................9

1.1. Легионеллезная инфекция и её возбудитель.............................................9

1.1.1. Характеристика легионеллезной инфекции...........................................9

1.1.2. Биология и таксономия легионелл.......................................... 15

1.1.3. Методы выявления и идентификации легионелл в клиническом материале и объектах окружающей среды........................................19

1.1.3.1.-1.1.3.2. Методы выделения и идентификации легионелл из объектов окружающей среды................................................ 19, 22

1.1.3.3. Методы исследования клинических образцов на наличие легионелл.................................................................................23

1.2. Особенности экологии легионелл, значение в распространении легионеллеза......................................................................................................24

1.2.1. Взаимодействие легионелл с простейшими и другими микроорганизмами..........................................................................................26

1.2.2. Биопленки легионелл..............................................................................26

1.2.3. Особенности колонизации потенциально опасных водных систем...28

1.2.4. Методы профилактики легионеллеза, используемые в потенциально опасных водных системах различного типа...........................................30

_Тос215476315ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ МЕТОДЫ.............................................33

2.1. Штаммы легионелл...................................................................................33

2.2. Методы культивирования легионелл......................................................38

2.3. Бактериологическое выделение легионелл из воды и биоплёнок........40

2.4. Определеление легионелл методом ГТЦР-РВ в воде и биопленках.....42

2.5.Типирование легионелл с помощью панели моноклональных АТ...... 44

2.6. Изучение биопленок легионелл методами электронной микроскопии............................................................................ 45

2.7. Определение чувствительности легионелл к действию дезинфицирующих препаратов..................................................... 46

2.8. Статистические методы обработки результатов....................................48

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.........................................49

3.1. Разработка порядка обследования градирен..................................49

3.2. Предварительная оценка уровня контаминации легионеллами градирен промышленных предприятий........................................................53

3.3. Сравнительная характеристика уровня контаминации градирен легионеллами в Московском и Уральском регионах...........................54

3.4. Оценка уровня контаминации градирен с помощью ПЦР в реальном времени..................................................................................56

3.5. Изучение серологического разнообразия штаммов легионелл, циркулирующих в воде градирен промышленных предприятий............58

3.6. Анализ морфологических особенностей формирования природных биопленок легионелл в ассоциации с другими микроорганизмами в водных системах охлаждения промышленных предприятий.........................60

3.7. Анализ эффективности ряда биоцидов на легионеллы в условиях эксперимента и градирни промышленного предприятия.......................70

ОБСУЖДЕНИЕ..............................................................................................77

ВЫВОДЫ..........................................................................................................86

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................88

ВВЕДЕНИЕ

Хотя легионеллезная инфекция известна уже более 30 лет, достаточно хорошо разработаны методы её диагностики и лечения, возбудитель, по-прежнему, представляет существенную угрозу общественному здоровью.

Эпидемические вспышки и спорадические случаи легионеллеза выявляют повсеместно.Среди наиболее заметных эпидемических вспышек легионеллеза в 21 веке, например в Испании 2002 г. (470 случаев/9 летальных), во Франции в 2004 г. (86/16), в Норвегиии в 2005 г. (55/10), в Германиии в 2010 г. (64/5), в Шотландиии в 2012 г. (90/3). Эпидемическая вспышка легионеллеза в Российской Федерации - г. Верхняя Пышма в 2007 г., во время которой заболели более 100 человек, при этом зарегистрировано 5 летальных исходов (7).

Первые достоверные случаи заболевания в России зарегистрировали в 1980 году. В нашей стране исследования неизвестного ранее возбудителя и вызываемой им инфекции возглавил академик РАМН C.B. Прозоровский. Под его руководством были изучены основные биологические свойства штаммов легионелл, выделенных из разных источников, разработаны эффективные лабораторные методы диагностики болезни легионеров, изучены

эпидемиологические особенности легионеллезов в России (C.B. Прозоровский C.B., 1979; В.И. Васильева с соавт.,1986; В.И.Покровский с соавт.,1995; И.С. Тартаковский, 2001).

Вода пресных водоемов является основной средой обитания легионелл. Но наличия природных хозяев - свободноживущих в воде и почве амеб и простейших, в которых легионеллы паразитируют при благоприятных температурных условиях (выше 25 °С) недостаточно для достижения возбудителем высоких концентраций, представляющих угрозу человеку. Если бы концентрация легионелл в природных пресноводных водоемах представляла опасность для человека и заболевание было бы контагиозным, то легионеллез давно занял бы место среди наиболее распространенных инфекций человека. К

счастью, этого не происходит поскольку размножиться до опасной для человека концентрации возбудитель может только в определенных типах искусственных водных систем.

Наиболее часто эпидемические вспышки легионеллеза связаны с контаминацией легионеллами водных систем охлаждения (градирен) (5,15). Водные системы охлаждения являются обязательным элементом как централизованных систем кондиционирования воздуха так и производственных циклов промышленных предприятий. Для обозначения данных систем в мировой литературе используется термин - «cooling tower» (охладительная башня, градирня). Системы данного типа, а не «пресловутые бытовые кондиционеры» или приточно-вытяжная вентиляция являются реальными источниками распространения легионелл, при определенных обстоятельствах способных вызвать эпидемические вспышки и спорадические случаи болезни легионеров.

В водном контуре систем охлаждения циркулирует несколько десятков тысяч литров воды при температуре 30-35 °С. В процессе циркуляции в зависимости от конструкции системы 0,1-2 % воды распространяется из охладительной башни в виде водного аэрозоля с размером капель 1-100 мкм. Капли диаметром менее 5 мкм могут легко попадать в альвеолы легких человека, где вирулентные штаммы легионелл проникают в альвеолярные макрофаги и начинают размножаться. В зависимости от высоты башни и метеорологических условий аэрозоль может распространяться на значительное расстояние и вызывать инфекцию у людей. По данным Европейской рабочей группы по легионеллезу (EWGLI) с 2002 по 2007 годы в европейских странах зарегистрированы 44 эпидемические вспышки, связанные с контаминацией градирен (15, 97).

В Российской Федерации до настоящего времени отсутствовала необходимая методическая база и исследования по анализу уровня контаминации легионеллами водных систем охлаждения не проводились.

Сложность количественной оценки легионелл в сочетании с высокой устойчивостью к дезпрепаратам создают существенные трудности в оценке уровня контаминации и потенциальной опасности водных систем охлаждения. Мониторинг легионелл в водных системах охлаждения промышленных предприятий и определение частоты и количественного уровня их контаминации легионеллами, является одним из наиболее перспективных подходов. Выбор в качестве объекта исследования водных систем охлаждения промышленных предприятий важен с учетом особенностей эксплуатации данных потенциально опасных водных систем в России. Для централизованных систем кондиционирования с водным охлаждением в России характерна сезонная эксплуатация (отключены в зимний период), в отличие от США и Европейских стран, где данные системы эксплуатируют круглогодично. В то же время водные системы охлаждения промышленных предприятий в России, как и за рубежом, эксплуатируют круглогодично, что создает благоприятные условия для накопления в высоких концентрациях легионелл. По этой причине именно данный объект представлял наибольший интерес для изучения в качестве экологической ниши.

Цель и задачи исследования

Цель работы: изучить особенности колонизации легионеллами водных систем охлаждения промышленных предприятий, определить частоту и количественный уровень их контаминации легионеллами.

Задачи исследования:

1. Разработать методику количественного мониторинга легионелл в водных системах охлаждения промышленных предприятий на основе бактериологического метода и ПЦР в реальном времени.

2. Установить частоту и уровень контаминации легионеллами водных систем охлаждения промышленных предприятий.

3. Охарактеризовать серологическое разнообразие легионелл, циркулирующих в водных системах охлаждения промышленных предприятий с помощью международной панели моноклональных антител.

4. Изучить особенности природных биопленок легионелл в ассоциации с другими микроорганизмами в водных системах охлаждения промышленных предприятий.

5. Изучить активность биоцидов, применяемых в водных системах охлаждения промышленных предприятий, на биопленки легионелл.

6. Внедрить современные принципы и методы мониторинга легионелл в водных системах охлаждения промышленных предприятий в систему государственного санитарно-гигиенического нормирования.

Научная новизна работы:

- Впервые установлена частота и уровень контаминации легионеллами водных системах охлаждения промышленных предприятий в Российской Федерации.

- Впервые охарактеризовано серологическое разнообразие штаммов легионелл, циркулирующих в водных системах охлаждения промышленных предприятий. Показано, что в водных системах данного типа преобладают штаммы Legionella pneumophila серогруппы 1 - наиболее значимые в этиологии эпидемических вспышек внебольничных легионеллезных пневмоний.

Показано, что присутствие природных биопленок, содержащих легионеллы на поверхности градирни, является маркером эпидемически значимого уровня контаминации воды градирни легионеллами.

- Впервые изучены морфологические особенности природных биопленок легионелл в ассоциации с другими микроорганизмами в водных системах охлаждения промышленных предприятий.

- Изучена активность ряда биоцидов, применяемых в водных системах охлаждения промышленных предприятий, на моновидовые биопленки легионелл и в градирнях промышленных предприятий.

Практическая значимость работы:

• Разработан порядок обследования, позволяющий выявлять контаминированные легионеллами участки и зоны потенциально опасных водных объектов в водных системах охлаждения промышленных предприятий на основе скрининга с помощью ПЦР-РВ, с последующим бактериологическим подтверждением.

• Разработанный порядок обследования водных систем охлаждения промышленных предприятий включен в комплекс профилактических мероприятий за соблюдением требований санитарного законодательства, направленный на предупреждение контаминации легионеллами до эпидемически значимых концентраций потенциально опасных водных объектов - Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.2.2626 - 2010 «Профилактика легионеллеза».

Материалы диссертации доложены на X съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, апрель 2012), на Пленуме Научного совета по экологии и гигиене окружающей среды РАМН (Москва, 2009), на международной конференции «Legionella 2009» (Париж, 2009), 25 и 26. конференциях Европейской рабочей группы по легионеллезу (Копенгаген, 2010; Вена, 2011).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Легионеллезная инфекция и её возбудитель

1.1.1. Характеристика легионеллезной инфекции

С момента первой официально зарегистрированной вспышки легионеллеза был достигнут значительный прогресс в изучении многих аспектов биологии и экологии возбудителя. Разработаны новые способы диагностики и профилактики легионеллеза. Тем не менее, интерес к проблеме легионеллеза постоянно растет во всем мире, так как возбудитель представляет значительную опасность для населения.

Эпидемические вспышки, спорадические и групповые случаи регулярно выявляют в различных странах мира. Наиболее серьезные эпидемические вспышки легионеллеза в 21 веке произошли в Испании 2002 г. (470 случаев/9 летальных), во Франции в 2004 г. (86/16), в Норвегиии в 2005 г. (55/10), в Германиии в 2010 г. (64/5), в Шотландиии в 2012 г. (90/3), свое место заняла и эпидемическая вспышка легионеллеза в Российской Федерации - г. Верхняя Пышма в 2007 г., во время которой заболели более 100 человек, при этом зарегистрировано 5 летальных исходов (7).

Возбудитель легионеллеза - Legionella pneumophila, относится к семейству Legionellaceae, включающему свыше 50 видов, большая часть из них -сапрофиты, не представляющие опасности для людей. Легионеллы широко распростронены в различных пресноводных водоемах, паразитируя в амебах и простейших (13,28). Легионеллы размножаются в водных условиях при температуре 20- 45 0 С, однако они часто выделяют из холодной воды. Так, легионеллы распространены не только в естественной среде, но и колонизуют резиновые и синтетические поверхности промышленного, водопроводного, медицинского оборудования. Их часто обнаруживают в виде биопленок, придающих значительную устойчивость к действию неблагоприятных для них

действий дезинфицирующих веществ по сравнению с планктонными клетками (28,42,114). Легионеллы колонизируют системы горячего и холодного водоснабжения, централизованные воздушные кондиционеры с водным охлаждением, градирни, джакузи и вихревые бассейны в аквапарках и спортивных центрах, увлажнители воздуха и фонтаны.

В 2003 - 2004 гг. в Европе при эпидемиологическом расследовании 49 внебольничных вспышек легионеллеза установлено, что 16 случаев произошли из-за контаминации легионеллами градирен, 4 - систем горячего и холодного водоснабжения, 3 - контаминации джакузи и в 26 случаях источник инфекции не установлен.

Наиболее опасен для передачи легионеллезной инфекции -мелкодисперсный аэрозоль (капли водного аэрозоля диаметром менее 5 микрон), контаминированный легионеллами. Аэрозоль легко проникает в нижнюю часть дыхательного тракта и в альвеолы легких, где в альвеолярных макрофагах возбудитель легионеллеза активно размножается, вызывая острую тяжелую пневмонию.

Еще одним путем передачи также является вдыхание зараженной легионеллами водопроводной воды. Поскольку, температура воды в системе горячего водоснабжения, как правило, в Европейских странах и США не превосходит 50 °С и крайне благоприятна для размножения возбудителя. Причиной ряда групповых и спорадических случаев легионеллезной инфекции считают вдыхание водопроводной воды (37,112).

Известно, что болезнь легионеров (легионеллезная пневмония) возникала у 5-10% лиц, оказавшихся в зоне образования водного аэрозоля. Другая клиническая форма легионеллеза - лихорадка Понтиак (острое респираторное заболевание) обнаружена у 80 - 100 % лиц, подвергавшихся воздействию такого аэрозоля.

Легионеллезная инфекция выявляется чаще у лиц пожилого и среднего возраста и, как правило, связана с действием таких факторов риска, как злоупотребление алкоголем и курение, а также с такими заболевания, как сердечно-сосудистые и диабет; иммуносупрессивная терапия, первичные и вторичные иммунодефициты. В то же время легионеллез, может возникать у совершенно здоровых людей. Дети заболевают легионеллезом редко, как правило, на фоне сопутствующих заболеваниях. Легионеллезная инфекция возникает чаще у мужчин, чем женщин при соотношении два-три к одному (11,31).

Считается, что особенностью эпидемиологии легионеллезной инфекции является выделение трех основных групп, по характеру приобретения, заболевания: внебольничная пневмония, внутрибольничная (нозокомиальная) инфекция и легионеллез, связанный с поездками, путешествиями (travel-associated legionellosis) (7).

Условия приобретения легионеллезной инфекции обязательно указываются при статистическом анализе выявленных случаев в США и Европейских странах. Например, из 4452 случаев зарегистрированных в 2003 г. Европейской рабочей группой по легионеллезу: 2106 отнесены к группе внебольничой пневмонии, 347 - к нозокомиальной инфекции, 927 - к легионеллезу, связанному с путешествиями, поездками. В 1072 случаях группа не была выявлена. Часто случаи легио�