Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы блокады каналов глутаматных ионотропных рецепторов AMPA и NMDA типов органическими катионами

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы блокады каналов глутаматных ионотропных рецепторов AMPA и NMDA типов органическими катионами"

на правах рукописи

ТИХОНОВА Татьяна Борисовна

МЕХАНИЗМЫ БЛОКАДЫ КАНАЛОВ ГЛУТАМАТНЫХ ИОНОТРОПНЫХ РЕЦЕПТОРОВ АМРА И КМБА ТИПОВ ОРГАНИЧЕСКИМИ КАТИОНАМИ

03.03.01 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2010

2 5 мдр 20?0

003494576

Работа выполнена в лаборатории биофизики синаптических процессов Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Научный руководитель:

Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Магазаник Лев Гиршевич Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Виктор Исаевич Говардовский доктор биологических наук Елена Валентиновна Казначеева

Ведущее учревдение:

Учреждение Российской Академии Наук Институт Биофизики Клетки РАН

Защита диссертации состоится 13 апреля 2010 г. в Д часов на заседании диссертационного совета (Д 002.127.01) по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук

в Учреждении Российской академии наук Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44).

Автореферат разослан у/) марта 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Глутамат является основным возбуждающим медиатором в центральной нервной системе позвоночных (Collingridge & Singer, 1990; Nakanishi, 1992). После высвобождения из пресинаптических терминалей глутамат активирует три типа ионотропных рецепторов: NMDA, АМРА и каинатные. Такая классификация основана на избирательной чувствительности к соответствующим агонистам, однако эти типы отличаются и по многим другим фармакологическим и биохимическим свойствам; в то же время общая организация каналов этих типов рецепторов предполагается сходной (Dingledine, 1999).

Изменение экспрессии ионотропных рецепторов глутамата является одним из механизмов, регулирующих эффективность синаптической передачи, что лежит в основе процессов памяти и обучения (Bliss & Collingridge, 1993). Нарушение нормальной экспрессии глутаматных ионотропных рецепторов наблюдается при различных патологиях нервной системы: АМРА-рецепторов - при умственной отсталости, вызванной синдромом ломкой Х-хромосомы, каинатных рецепторов - при болезни Хантингтона. Изменение субъединичного состава АМРА-рецепторов при ишемии приводит к увеличению входа кальция в клетку, вызывающего ее гибель (Doble, 1999; Lee et al., 1999; Bowie, 2008). Некоторые заболевания сопровождаются повышенным выбросом глутамата, поэтому вещества, способные блокировать глутаматные рецепторы, рассматриваются как нейропротективные агенты. Так, например, блокатор каналов NMDA-рецепторов - мемантин - активно используется в клинической практике при лечении болезни Альцгеймера (Lipton, 2004).

Вовлеченность глутаматных рецепторов в такое разнообразие физиологически значимых процессов обуславливает актуальность изучения их структуры и способов модуляции. Одним из способов ингибирования является блокада каналов. Учитывая, что каналоблокаторами могут выступать соединения со сравнительно простой и, следовательно, предсказуемой структурой, данные о механизме их действия используются и для изучения структурных детерминант самих каналов (Sobolevsky et al., 1999; Bolshakov et al., 2000; Bolshakov et al, 2003; Tikhonov, 2007). Изучению механизмов блокады каналов NMDA-рецепторов посвящено достаточно большое число работ (Sobolevsky et al., 1999; Соболевский и Ходоров, 2000; Bolshakov et al, 2003), в то время как анализ механизмов блокады каналов АМРА-рецепторов носит фрагментарный характер. В настоящее время нет

достаточных данных для сравнения механизмов блокады каналов АМРА- и NMDA-рецепторов.

Цель исследования: изучение механизмов блокады каналов Са2+ -проницаемых АМРА-рецепторов органическими катионами (производивши адамантана, фенилциклогексила, дифенила) и сравнение механизмов действия блокаторов этого класса на каналы NMDA- и Са2+ -проницаемых АМРА-рецепторов. Задачи исследования:

1. Провести сравнение особенностей механизмов блокады каналов NMDA- и АМРА-рецепторов на примере дикатионного производного фенилциклогексила ИЭМ-1925.

2. Исследовать потенциалозависимость действия дикатионных органических блокаторов (производных адамантана, фенилциклогексила, дифенила) на каналы АМРА-рецепторов, возможность существования «ловушки» блокаторов этого класса в закрытых каналах АМРА-рецепторов и стабильность этого состояния.

3. Проверить возможность действия блокаторов на каналы АМРА-рецепторов изнутри клетки.

4. Проверить влияние концентрации внеклеточного натрия на параметры блокады каналов АМРА-рецепторов.

Научная новизна. В работе всесторонне проанализирован механизм действия органических блокаторов - дикатионных производных адамантана, фенилциклогексила и др. гидрофобных группировок - на каналы Са2+-проницаемых АМРА-рецепторов. Впервые показано, что даже сравнительно крупные блокаторы, содержащие дифенильную или фенилциклогексильную группировку, размеры которых превыщают 10 Á, способны проникать внутрь клетки через открытые каналы АМРА-рецепторов. Впервые показано, что блокатор, оставшийся в канале АМРА-рецепторов после его закрытия, с течением времени покидает канал, проникая внутрь клетки. Постоянное присутствие блокатора во внеклеточном растворе не восполняет уход блокатора из закрытых каналов, что может приводить к зависимости блокады от частоты стимуляции in vivo. Впервые показано, что сайт связывания в канале доступен для внеклеточных блокаторов этого класса только после активации АМРА-рецептора, а для внутриклеточных - и в открытых, и в закрытых каналах. Проникающие ионы внеклеточного натрия ослабляют блокаду каналов АМРА-рецепторов этими соединениями, по-видимому, за счет конкуренции за сайт связывания.

Кроме того, на примере дикатионного производного фенилциклогексила ИЭМ-1925 впервые было проведено сравнение механизмов блокады каналов NMDA- и Са2+-

проницаемых АМРА-рецепторов. Показано, что механизмы блокады каналов этих типов рецепторов различны. Так, проникновения блокатора внутрь клетки ни из открытых, ни из закрытых каналов NMDA-рецепторов не наблюдалось. Потенциалозависимость эффекта «ловушки» в каналах NMDA-рецепторов указывает на существование двух сайтов связывания для ИЭМ-1925 (Bolshakov et al., 2003). Оснований для того, чтобы предположить существование второго сайта в каналах АМРА-рецепторов, не выявлено. Теоретическая и практическая значимость работы. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что структура воротного механизма каналов Са2+-проницаемых АМРА-рецепторов расположена выше сайта связывания дикатионных блокаторов, производных адамантана, фенилциклогексила, дифенила, и при закрытии канала стерического перекрывания в области селективного фильтра не происходит. Вопрос о локализации воротного механизма АМРА-рецепторов широко обсуждается в литературе (Qian & Johnson, 2002; Kuner et al., 2003; Wollmuth & Sobolevsky, 2004) и имеет значение для фундаментального исследования строения и функционирования ионных каналов.

Помимо новой информации о структуре канала и воротного механизма, полученные результаты важны для исследований, нацеленных на создание новых нейропротективных средств. Различия в потенциалозависимости и в скоростях проникновения внутрь клетки могут определять эффекты, наблюдаемые в экспериментах с этими блокаторами на более сложных системах: в срезах мозга и в условиях целого организма. В частности, обнаруженный в работе эффект «самоотмыва» должен приводить к зависимости угнетения глутаматергической синаптической передачи от частоты стимуляции. Можно предположить, что в результате этого более выраженная блокада возбуждения и губительного входа ионов Са2+ внутрь клетки будет достигаться при избыточной активации Са2+-проницаемых АМРА-рецепторов в условиях патологии, и в меньшей степени затрагивать нормальную синаптическую передачу. Положения, выносимые на защиту:

1. Механизмы блокады дикатионньми производными адамантана, фенилциклогексила, дифенила каналов NMDA- и Ca -проницаемых АМРА-рецепторов отличны.

2. Дикатионные производные адамантана, фенилциклогексила, дифенила могут проникать внутрь клетки как через открытые, так и через закрытые каналы Са2+-проницаемых АМРА-рецепторов.

3. Сайт связывания блокаторов расположен ниже воротного механизма канала Са2+-проницаемого АМРА- рецептора.

4. Молекулы блокаторов конкурируют за сайт связывания с проникающими ионами натрия

в каналах Са2+-проницаемых АМРА-рецепторов. Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на 7-ой, 8-ой и 10-ой Всероссийских медико-биологических конференциях молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2004 г., 2005 г. и 2007 г.), межвузовской научно-технической конференции «XXXII неделя науки СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2004), политехническом симпозиуме «Молодые ученые - промышленности северо-западного региона» (Санкт-Петербург, 2004), XIX и XX Съездах физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004, Москва, 2007), 11-ой Пущинской международной школе-конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007), научной конференции «Ионные каналы: структура и функции» (Санкт-Петербург, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 7 статей в реферируемых журналах и тезисы 9 докладов.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах и состоит из введения, обзора литературы, обобщения обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, заключения, списка литературы, включающего 231 источник. Диссертация иллюстрирована 4 таблицами и 40 рисунками.

Материалы и методы исследования. Крыс линии Вистар (возраст 13 - 18 дней) декапитировали под уретановым наркозом. Мозг быстро извлекали и охлаждали до 2 - 4°С. Затем на вибратоме «Campden Instruments» (Великобритания) приготавливали поперечные срезы стриатума и гиппокампа толщиной 250 мкм, которые сохраняли в растворе (мМ): NaCl

- 124, КС1 - 5, СаС12 - 1.3, MgCl2 - 2, NaHC03 - 26, NaH2P04 - 1.24, D-глюкоза- 10. Раствор аэрировали карбогеном (95% 02, 5% С02), рН 7.4-7.5, при 24-26°С. Нейроны, экспрессирующие определенный вид глутаматных рецепторов, изолировали из срезов методом вибродиссоциации (Vorobjev, 1991). Для исследования NMDA-рецепторов выбирали пирамидные нейроны поля CAI гиппокампа, а для исследования Са2+-проницаемых АМРА-рецепторов - гигантские интернейроны стриатума. Для идентификации нейронов использовали морфологический и фармакологический критерии.

Регистрацию трансмембранных токов осуществляли методом локальной фиксации потенциала. Микропипетку заполняли раствором (мМ): CsF - 100, CsCl - 40, NaCl - 5, СаС12

- 0.5, EGTA - 5, HEPES - 10 (рН доводили до 7.2 с помощью CsOH). Внеклеточный раствор содержал (мМ): NaCl - 143, КС1 - 5, СаС12 - 2.5, D-глюкоза - 18, HEPES - 10 (рН доводили

до 7.4, добавляя HCl). При исследовании АМРА-рецепторов во внеклеточный раствор добавляли MgCb в концентрации 2 мМ. NMDA-рецепторы активировали аппликацией NMDA (40 мкМ) в присутствии глицина (10 мкМ), АМРА-рецепторы - каинатом (100 мкМ). Для аппликации использовалась система быстрой замены растворов (Vorobjev et al., 1996) или 8-канальная система замены растворов с электромагнитными клапанами и шаговым двигателем RSC-200 «BioLogic» (Франция). Время смены растворов составляет для этих систем примерно 10-15 мс. Регистрацию проводили в конфигурации "целая клетка" с помощью усилителя ЕРС-8 «НЕКА Elektronik» (Германия). Контроль мембранного потенциала, управление системой аппликации, регистрацию и анализ данных осуществляли с помощью компьютера. Использовались реактивы фирм «Sigma» (США), «Tocris» (США). Использованные блокаторы были синтезированы в Институте Экспериментальной Медицины РАМН. Статистическая обработка проводилась с использованием программы Microcal(TM) Origin 6.0. Все результаты представлены как среднее ± стандартное отклонение в серии как минимум четырех экспериментов.

Потенциалозависимость действия блокаторов анализировалась с помощью модели Вудхол (Woodhull, 1973) для непроникающих (1) и поникающих (2) блокаторов:

100% (1)

С Я ЯГ J

_100%_ (2)

, KD (zdmVF\ кр f-zSpVF}

1 + —-exp —-— + —-exp ---

С \ RT ) С { RT

где В - процент равновесной блокады, KD и Кр - константа диссоциации и константа проникновения блокатора внутрь клетки; 8т и 5Р - параметр потенциалозависимости, отражающий глубину залегания сайта связывания в мембранном поле канала, и параметр потенциалозависимости отмыва блокатора внутрь клетки, соответственно. С - концентрация блокатора. R, Т и F имеют свои стандартные значения.

Потенциалозависимость отмыва из закрытых каналов определялась по формуле (3)

( f-zs kfYI (3)

Т = 100 expj^- Xr.iexpj^—^—J

Где Т - процент «ловушки», - константа скорости отмыва из закрытых каналов при 0 мВ, о_, - параметр, характеризующий потенциалозависимость отмыва из закрытых каналов, t -межстимульный интервал, У - мембранный потенциал, z - заряд молекулы блокатора.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сравнение механизмов блокады каналов NMDA- и Са2+-проницаемых АМРА-рецепторов. Для сравнения механизмов блокады каналов AMP А- и NMDA-рецепторов было выбрано дикатионное производное фенилциклогексила ИЭМ-1925. При потенциале на мембране -80 мВ блокирующая активность и кинетика отмыва ИЭМ-1925 в присутствии агониста сходны на этих подтипах рецепторов (Bolshakov et al., 2000; Tikhonov et al., 2002), поэтому оно является удобным инструментом для такого сравнения.

Проведенные исследования показали, что степень угнетения токов через открытые каналы АМРА- и NMDA-рецепторов, вызываемая 3 мкМ ИЭМ-1925, зависела от потенциала на мембране (рис. 1), что типично для заряженных молекул, связывающихся в канале. В случае NMDA-рецепторов потенциалозависимость действия ИЭМ-1925 согласовывалась с простейшей теорией блокады каналов: блокада монотонно нарастала при гиперполяризации, достигая 100% (рис.1); кинетика отмыва ИЭМ-1925 монотонно замедлялалась при гиперполяризации (данные не показаны). В случае АМРА-рецепторов блокада тоже возрастала в диапазоне потенциалов от 0 до -100 мВ, однако при дальнейшей гиперполяризации блокада выходила на плато (около 80% блока). Кинетика отмыва блокатора из открытых каналов при этом начинала ускоряться (данные не показаны).

Рис. 1. Зависимость равновесной блокады каналов ЫМОА- и АМРА-рецепторов, вызванная 3 мкМ ИЭМ-1925, от потенциала на мембране. Даже при сильной гиперполяризации не достигается 100% блокада каналов АМРА-рецепторов.

Вторая серия экспериментов была посвящена исследованию взаимодействия блокатора с закрытыми каналами. Внеклеточная аппликация даже высоких концентраций (1 мМ) ИЭМ-1925 не вызывала блокады закрытых каналов ни в случае АМРА-, ни в случае КМОА-рецепторов (данные не показаны), т.е. молекула блокатора может связываться, только когда канал открыт. При этом ИЭМ-1925 был способен оставаться в каналах как АМРА-, так и КМОА-рецепторов после их закрытия (эффект «ловушки»). Эффект «ловушки» исследовался с помощью протокола, проиллюстрированного на рисунке 2. Согласно этому протоколу

ИЭМ-1925 70 мкМ

щ

Ч/г i

25 с 150 с

NMDA

liib Wi

150 ПА

10 с

Каинат

25 с

1. W4

I

150 с

Каинат

150 ПА|_

Рис. 2. ИЭМ-1925 вымывается из «ловушки» в закрытых каналах в случае АМРА-, но не в случае NMDA-рецепторов. А «Ловушка» в каналах NMDA-рецепторов. Проиллюстрирован экспериментальный протокол. Тестовый ответ на агонист регистрировался через 25 или 150 с после удаления агониста и блокатора из раствора. Тестовый ответ отличается от контрольного благодаря тому, что каналы после закрытия остались заблокированными (подробнее см. в тексте). В случае NMDA-рецепторов формы тестовых ответов после 25- и 150-секундного интервала были одинаковыми, свидетельствуя о том, что вымывания ИЭМ-1925 из закрытых каналов NMDA-рецепторов не наблюдалось. Б-В «Ловушка» в каналах АМРА-рецепторов. Приведено наложение контрольного и тестового ответов на агонист через 25 (Б) и 150 с (В). Стрелками обозначены точки излома тестовых ответов. Уменьшение амплитуды медленной фазы нарастания тестового ответа при большем временном интервале свидетельствует о том, что из каналов АМРА-рецепторов в отсутствие агониста происходит постепенное вымывание блокатора.

сначала регистрировался контрольный ответ на агонист, затем следовала коаппликация агониста с блокатором для развития блокады открытых каналов. После окончания этой аппликации каналы закрывались, и молекулы блокатора могли остаться внутри поры канала. Через фиксированный промежуток времени (межстимульный интервал) регистрировался тестовый ответ на агонист. Нарастание тестового ответа было двухфазным: быстрая фаза отражала активацию агонистом неблокированных рецепторов, а медленная - отмыв блокатора после открытия каналов. Таким образом, относительная амплитуда медленной фазы нарастания тестового ответа соответствовала доле рецепторов, оставшихся заблокированными, т.е. проценту «ловушки». При увеличении межстимульного интервала

было обнаружено, что в случае АМРА-рецепторов блокатор постепенно вымывался из закрытых каналов (рис. 2). В случае КМОА-рецепторов такого вымывания не наблюдалось.

Исследование потенциалозависимости эффекта «ловушки» показало, что в соответствии с данными, полученными ранее (ВоЬЬакоу е1 а1., 2003), процент «ловушки», измеренный после 25-секундного межстимульного интервала в случае ЫМОА-рсцепторов уменьшался при деполяризации: при -80 мВ он составлял 55±6% (п=6), а при -40 мВ - 26±9% (п=7). Это, по-видимому, объясняется существованием двух сайтов связывания для молекулы блокатора в канале ИМСА-рецсптора. В случае АМРА-рецепторов процент «ловушки» при 25-секундном межстимульном интервале от потенциала не зависел.

Таким образом, мы показали, что характеристики механизма блокады каналов ЫМОА и Са2+-проницаемых АМРА-рецепторов дикатионпым производным фенилциклогексила ИЭМ-1925 (потенциалозависимость блокады, потенциалозависимость и временная зависимость эффекта «ловушки») не идентичны.

Исследование механизма блокады каналов Са2+-проницаемых АМРА-рецепторов производными адамантана, фенилциклогексила и дифенила.

При сравнении особенностей механизмов действия дикатионного производного

фенилциклогексила ИЭМ-1925 на каналы NMDA-и Са2+-пронидаемых АМРА-рецепторов был обнаружен ряд особенностей, которые были проанализированы более подробно. Для этого был расширен круг блокаторов (рис 3).

Для анализа потенциалозависимости равновесной блокады оценивалось угнетение стационарных токов при действии одной концентрации блокатора в диапазоне потенциалов от -140 до +40 мВ. Для каждого блокатора выбиралась концентрация, вызывающая 20-30% блок при потенциале -40 мВ. Такой выбор равноэффективных концентраций позволил сравнить потенциалозависимость блокаторов с

различными активностями. Результаты представлены на рисунке 4. При положительных потенциалах ни однин из шести исследованных блокаторов не вызывал угнетения токов. Это означает, что потенциалонезависимый компонент блокады отсутствует или очень мал. Для всех шести исследованных блокаторов потенциалозависимость блокады не соответствовала классическим представлениям, согласно которым блокада должна монотонно нарастать при гиперполяризации, достигая 100%. Блокада производными адамантана (ИЭМ-1676 и ИЭМ-1755) возрастала в диапазоне потенциалов от 0 до -60 мВ, а при дальнейшей гиперполяризации уменьшалась. При действии производных фенилциклогексила (ИЭМ-1925 и ИЭМ-2063) и диметиладамантана (ИЭМ-2121) блокада увеличивалась с гиперполяризацией, однако при -100 мВ достигала насыщения на уровне 65 - 80% блока, и при дальнейшем уменьшении потенциала не возрастала. В ряде экспериментов наблюдалась тенденция к уменьшению блока, однако эти изменения не были статистически достоверны. Блокада производным дифенила ИЭМ-2008 обладала сходной потенциалозависимостью, но

ИЭМ-1755, 6 мкМ

4с -40 мВ

4 с -80 мВ

"-120 мВ

ИЭМ-2121, 2 шМ

200 пА |

2с

80

70

60

50

40

о 30

с;

ш 20

10

0

-10

ИЭМ-2008 6 мкМ ИЭМ-1925 3 мкМ ИЭМ-2063 6 мкМ ИЭМ-1755 6 мкМ ИЭМ-1676 1.4 мкМ ИЭМ-2121 2 мкМ

-120 -80 -40 0 40 Мембранный потенциал, мВ

Рис. 4 Потенциалозависимость блокады каналов АМРА-рецепторов дикатионньми соединениями. А и Б - примеры ответов на 100 мкМ каината в отсутствие/присутствии блокаторов при -40, -80 и -120 мВ. С - усредненные кривые потенциалозависимости блокады. При положительных потенциалах блокирующий эффект пренебрежимо мал. При гиперполяризации наблюдается либо насыщение блокады на уровне менее 100%, либо постепенное уменьшение блокады. Кривые аппроксимации получены при использовании формулы (2), где 2=2, 5т=0.7, 5Р=0.15

достигала максимума при меньших по абсолютной величине потенциалах, и тенденция к уменьшению блокады при сильной гиперполяризации была более очевидна. Такая потенциалозависимость не может быть описана уравнением (1) (смотри материалы и методы), применяемой при классической блокаде. Однако приведенные данные успешно аппроксимировались уравнением (2), описывающим блокаду с возможностью проникновения блокатора внутрь клетки, увеличивающейся при сильной гиперполяризации. Причем, все кривые могли быть аппроксимированы при одних и тех же параметрах 5т=0.70 и 5Р=0.15, задающими положение энергетического минимума (сайта связывания) и относительного положения энергетических барьеров для блокатора в электрическом поле канала, соответственно. Таким образом, различия кривых потенциалозависимости блокады, вызываемой исследованными соединениями, могут определяться изменением только констант связывания и констант проникновения внутрь клетки при неизменных значениях 5т и 5Р.

Кинетика отмыва блокаторов в присутствии каината анализировалась при трех значениях потенциала на мембране: -40, -80, -120 мВ. Если блокатор не может проникать через канал внутрь клетки, то кинетика его отмыва должна замедляться с гиперполяризацией. Однако в случае ИЭМ-1925 отмыв переставал замедляться при гиперполяризации от -80 до -120 мВ, отмыв ИЭМ-1676 и ИЭМ-2008 ускорялся с гиперполяризацией, а кинетика отмыва ИЭМ-2121 и ИЭМ-2063 обладала немонотонной потенциалозависимостью (данные не показаны). Полученные результаты исследования кинетики отмыва дикатионных блокаторов согласовались с возможностью проникновения блокаторов внутрь клетки после связывания внутри поры канала.

Таким образом, совокупность данных о потенциалозависимости кинетики и потенциалозависимости равновесной блокады свидетельствует о том, что дикатионные блокаторы, производные адамантана, фенилциклогексила, дифенила, способны проникать внутрь клетки через открытые каналы Са ' -проницаемых АМРА-рецепторов.

Исследование эффекта «ловушки» в закрытых каналах АМРА-рецепторов, проводившееся с помощью протокола, приведенного на рисунке 2, показало, что все исследованные соединения были способны оставаться в каналах после их закрытия. Для исследования кинетики вымывания блокаторов варьировался межстимульный интервал, т.е. время между окончанием коаппликации блокатора с агонистом, приводящее к «ловушке» блокатора внутри закрытого канала, и следующей, тестирующей, аппликацией агониста. Концентрации блокаторов были следующие: ИЭМ-1925, ИЭМ-1676, ИЭМ-2121-70 мкМ,

межстимульный интервал, с

Рис. 5. Зависимость «ловушки» блокаторов в каналах АМРА-рецепторов от длительности межстимульного интервала. А - пример наложения регистрируемых токов для ИЭМ-2008. Тестовая аппликация каината (100 мкМ) производилась через 5 - 55 с после удаления блокатора и каината из раствора. Процент «ловушки» уменьшался с увеличением межстимульного интервала. Б - усредненные зависимости процента «ловушки» от длительности межстимульного интервала. Несмотря на различные скорости уменьшения процента «ловушки», этот эффект был характерен для всех исследованных блокаторов.

ИЭМ-2008, ИЭМ-1755, ИЭМ-2063 - 140 мкМ. При коротком межстимульном интервале (0.5 с) доля каналов, в которых остался блокатор, была близка к 100% для всех соединений. При увеличении межстимульного интервала для всех шести блокаторов процент «ловушки» экспоненциально уменьшался.

Для исследования потенциалозависимости вымывания блокатора из закрытых каналов АМРА-рецепторов протокол для изучения «ловушки» был модифицирован, как показано на рисунке 6. Мембранный потенциал скачкообразно меняли только на время межстимульного интервала, т.е. того времени, когда каналы находились в закрытом состоянии. Контрольный и тестовый ответ на агонист регистрировали при потенциале -80 мВ. Для ИЭМ-1925 и ИЭМ-2063 был выбран межстимульный интервал 150 с, для ИЭМ-2008 - 10 с, ИЭМ-1755 - 5 с, для ИЭМ-1676 - 20 с, для ИЭМ-2121 - 250 с. Зависимость процента «ловушки» от потенциала оценивалась при помощи формулы (3). Полученные данные показаны на рисунке 6. Для всех соединений скорость отмыва в отсутствие агониста монотонно увеличивалась с гиперполяризацией, свидетельствуя о том, что вымывание осуществляется за счет ухода блокатора внутрь клетки. Параметр потенциалозависимости <5_, был сходным для всех блокаторов: 0.12-0.18.

V = -80 мВ 1У"Ух[ 150 мкМ ИЭМ-2063

V = -80 иВ

КА щ

200

■Р^Иг т

150 с

-160 -120 -80 -40 0 40

Мембранный потенциал, мВ

Рис. 6. Потенциалозависимость ухода блокаторов из «ловушки» в каналах АМРА-рецепторов. А - пример наложения регистрируемых токов для ИЭМ-2063 иллюстрирует используемый протокол. Контрольную и тестирующую аппликации каината и блокаду каналов осуществляли при мембранном потенциале -80 мВ. На время межстимулыюго интервала потенциал скачкообразно меняли на определенную величину. Процент «ловушки» уменьшался при гиперполяризации. Б - усредненные зависимости ухода из «ловушки» от потенциала. Данные аппроксимированы при помощи уравнения (3). Несмотря на различия в скоростях ухода блокаторов из «ловушки» все они проявляют сходную потенциалозависимость.

Таким образом, молекулы блокаторов постепенно покидали закрытые каналы Са2+-проницаемых АМРА-рецепторов. Потенциалозависимость этого процесса указывает на то, что вымывание осуществляется во внутриклеточную среду. Данный эффект позволяет сделать вывод о том, что активационные ворота канала расположены выше сайта связывания блокатора.

«Самоотмыв» блокаторов из каналов АМРА-рецепторов.

При внеклеточной аппликации блокаторы не достигают сайта связывания внутри канала в отсутствие агониста. С другой стороны, блокатор, находящийся в «ловушке» внутри канала, в отсутствие агониста способен покидать канал АМРА-рецептора. Комбинация этих двух эффектов была продемонстрирована в протоколе, предусматривающем постоянное присутствие 5 мкМ ИЭМ-1925 или 15 мкМ ИЭМ-1676 во внеклеточной среде (рис. 7). Во время первой коаппликации агониста с блокатором регистрируется развитие блокады. После

KA

ИЭМ-1676,15 мкМ

м

150 с

100 пА^ \

5с

Кд ИЭМ-1925, 5 мкМ

ñ м rt т

JW'ám

R ими

5 мин 75 па|

4«

7 с

Рис. 7. «Самоотмыв» из каналов АМРА-рецепторов в постоянном присутствии блокатора в окружающем растворе. Примеры «самоотмыва» ИЭМ-1676 (А) и ИЭМ-1925 (Б). (Пояснения смотри в тексте).

короткого межстимульного интервала развития блокады нет благодаря «ловушке» блокатора в закрытых каналах. Однако за длительный межстимульный интервал молекулы блокатора покидают закрытые каналы, в результате чего при следующей коаппликации блокатора с агонистом снова регистрируется развитие блокады.

Таким образом, вымывание га закрытых каналов АМРА-рецепторов наблюдается даже в постоянном присутствии блокатора во внешнем растворе. Данный эффект может приводить к зависимости блокады соединениями этого класса от частоты стимуляции т vivo.

Блокада каналов АМРА рецепторов изнутри клетки.

Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что все исследованные блокаторы способны проникать внутрь клетки через каналы АМРА-рецепторов. Если это так, то можно предположить и возможность обратного эффекта - блокады каналов АМРА-рецепторов изнутри.

Для исследования возможности блокады открытых каналов АМРА-рецепторов изнутри регистрировалась зависимость стационарного тока, вызываемого каинатом (100 мкМ), от поддерживаемого на мембране потенциала (вольт-амперная характеристика). Как показано на рисунке 8, добавление блокатора ИЭМ-1676 в раствор для заполнения пипетки приводило к концентрационно- и потенциалозависимой блокаде открытых каналов АМРА-рецепторов. В контроле зависимость имела линейный характер. 1 мМ ИЭМ-1676 не вызывал

0,4

| 0.2 1 I- 0,0-

Е и

(О з -0,2-

I 2 ^

га я -0,6-

Ш

О в>

«аз -0,8.1Л:

- контроль -ИЭМ-1676, 1 мМ

- ИЭМ-1676,10 мМ

У

и

г

-160

-120 -80 -40 0

Потенциал, мВ

Рис. 8. Блокада открытых каналов АМРА-рецепторов, вызываемая

блокатором ИЭМ-1676 изнутри клетки.

изменений при отрицательных потенциалах, однако приводил к появлению входящего выпрямления. Увеличение концентрации ИЭМ-1676 до 10 мМ приводило к отклонению кривой от контрольной и при отрицательных потенциалах.

ИЭМ-1676 блокировал изнутри и закрытые каналы АМРА-рецепторов (рис. 9). Потенциалозависимость блокады как открытых, так и закрытых каналов АМРА-рецепторов,

КА

60 СГ/ 15 с

1 с'

У

100 пА

1 с

□ ИЭМ-1676,0 мВ ■ ИЭМ-1676, -80 мВ Д ИЭМ-1676, -140 мВ

0 20 40 60 80 100 120 140 межстамульный интервал, с

Рис. 9. Блокада закрыть« каналов внутриклеточным ИЭМ-1676 (0.5 мМ). А -экспериментальный протокол. Медленная фаза нарастания ответа на каинат отражает блок закрытых каналов. Относительная амплитуда медленной фазы увеличивалась с увеличением промежутка времени между аппликациями каината (межстимульного интервала), отражая кинетику развития блока закрытых каналов. Б - потенциалозависимость блокады закрытых каналов изнутри. Деполяризация приводила к более выраженному блоку и к более медленному его развитию. При -140 мВ блокада достигала равновесного значения в течение Юс.

вызываемой внутриклеточной аппликацией ИЭМ-1676, согласовывалась с исходным предположением о том, что блокатор может достигать того же сайта связывания в канале, что и при блокаде, вызываемой внеклеточной аппликацией блокатора. Этот вывод подтверждает и ряд других данных:

1) Согласованность потенциалозависимости блокады открытых каналов, вызываемой вне- и внутриклеточным блокатором.

2) Конкурентноподобные отношения при действии вне- и внутриклеточного блокатора.

3) Корреляция между чувствительностью к внутри- и внеклеточному блокатору. Для Са2+-непроницаемых АМРА-рецепторов, нечувствительных к внеклеточной аппликации блокаторов этого класса, не наблюдалось действия блокаторов и изнутри клетки.

4) Сходство кинетики отмыва блокатора, оказавшегося внутри поры канала в результате блокады закрытого канала изнутри и в результате «ловушки» внеклеточного блокатора. Таким образом, дикатионные блокаторы способны блокировать как открытые, так и

закрытые каналы АМРА-рецепторов изнутри клетки. Причем вне- и внутриклеточный блокатор взаимодействуют с одним и тем же сайтом связывания в канале.

Влияние концентрации внеклеточного натрия на параметры блокады каналов АМРА-рецепторов

Фактором, существенно влияющим на активность каналоблокаторов, является их взаимодействие с токонесущими ионами. В данной части работы исследовалось влияние снижения концентрации внеклеточного Na+ со 155 до 65 мМ на блокаду Са2+-проницаемых каналов АМРА-рецепторов дикатионным производным фенилциклогексила ИЭМ-1925. Изменение осмолярности компенсировались добавлением сахарозы.

Характер кривой потенциалозависимости равновесной блокады, вызываемой 1 мкМ

80

Рис. 10. Потенциалозависимость блокады ответов на каинат 1 мкМ ИЭМ-1925. При гиперполяризации мембраны блокирующее действие при низкой концентрации внеклеточного натрия достоверно увеличивается.

о

-» 155 мМ Na*—^65 мМ Na'~~|

-120 -80 -40

Потенциал, мВ

ИЭМ-1925, при снижении концентрации внеклеточного натрия качественно не менялся (рис. 10): блокада нарастала при гиперполяризации в диапазоне от -40 до -100 мВ, а затем выходила на плато. При -40 мВ процент блокады в низком и нормальном натрии практически совпадал, однако при более отрицательных потенциалах блокада в низком натрии была более эффективна.

Одна из возможных причин такого усиления блокады при понижении концентрации внеклеточного натрия состоит в том, что ион натрия и блокатор конкурируют за сайт связывания в канале. Если это так, то при уменьшении концентрации натрия должна возрастать константа скорости связывания блокатора с каналом, т.е. ускоряться кинетика развития блокады. Другим вариантом является связывание иона и блокатора в разных, но взаимодействующих сайтах. В этом случае присутствие иона в своем специфическом сайте должно уменьшать сродство блокатора к его сайту. Этот эффект должен проявляться в том, что при уменьшении концентрации натрия замедлится кинетика отмыва. Поэтому для выяснения причин усиления блокады при понижении концентрации внеклеточного натрия необходимо было сравнить кинетику взаимодействия ИЭМ-1925 с каналами АМРА-рецепторов при нормальном и сниженном натрии. Результат представлен на Рис. 11. Очевидно, что скорость отмыва блокатора остается постоянной, то есть не зависит от концентрации внеклеточного натрия. Напротив, развитие блокирующего эффекта несколько ускоряется при снижении натрия. При потенциале-120 мВ средне-взвешенная постоянная

А ИЭМ-1925 Б ИЭМ-1925 - каинат

155 мМ №* \ V 155 мМ N8* 65 мМ

Рис. 11. Кинетика развития блока (А) и отмыва ИЭМ-1925 (Б) в присутствии каината. Кинетика развития блока ускоряется при снижении внеклеточной концентрации натрия, в то время как кинетика отмыва остается неизменной. Поскольку токи в нормальном и сниженном натрии отличаются по амплитуде, на рисунке величины токов нормированы для наглядного сравнения кинетики. На рисунке (Б) кривые сдвинуты по горизонтали.

времени спада тока уменьшается с 0.49±0.05 до 0.38±0.04 с. Это позволяет заключить, что антагонистические отношения между ионом натрия и блокирующим ионом носят конкурентный характер.

Исследование эффекта «ловушки» ИЭМ-1925 в растворах с нормальной и сниженной концентрацией натрия показало, что внеклеточный натрий не оказывал влияния ни на возможность блокатора оставаться в каналах АМРА-рецепторов после их закрытия, ни на скорость вымывания блокатора из закрытых каналов. Такой результат был вполне ожидаем, т.к. если активационные ворота канала расположены с внеклеточной стороны от сайта связывания блокатора, то при закрытом состоянии канала ионы натрия внешней среды не оказывают влияния на «ловушку» блокатора и кинетику выхода блокатора из «ловушки» внутрь клетки.

Таким образом, токонесущие ионы натрия ослабляют блокирующее действие

катионом ИЭМ-1925 за счет конкуренции за место связывания в канале.

Выводы:

1. Совокупность данных по потенциалозависимости кинетики и потенциалозависимости равновесной блокады свидетельствует о том, что производные адамантана, фенилциклогексила, дифенила способны проникать внутрь клетки через открытые каналы Са2+ -проницаемых АМРА-рецепторов, но не NMDA-рецепторов.

2. Производные адамантана, фенилциклогексила, дифенила способны оставаться в каналах как Са2+-проницаемых АМРА-рецепторов, так и NMDA-рецепторов после закрытия. Однако после этого молекулы блокаторов способны покидать каналы АМРА-, но не NMDA-рецепторов. Потенциалозависимость этого процесса указывает на то, что вымывание осуществляется во внутриклеточную среду.

3. Постоянное присутствие блокатора во внеклеточной среде не препятствует вымыванию блокаторов из закрытых каналов АМРА-рецепторов («эффект самоотмыва»). Это может приводить к зависимости блокады синаптических токов от частоты стимуляции in vivo.

4. Производные адамантана, фенилциклогексила, дифенила способны блокировать как открытые, так и закрытые каналы Са2+-проницаемых АМРА-рецепторов изнутри клетки. Причем и вне- и внутриклеточный блокатор взаимодействуют с одним и тем же сайтом связывания в канале.

5. Токонесущие ионы натрия ослабляют блокирующее действие катионом ИЭМ-1925 за счет конкуренции за место связывания в канале Са2+-проницаемого АМРА-рецептора.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННАХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1. Тихонова Т.Б., Тихонов Д.Б., Магазаник Л.Г. Особенности блокады ионных каналов глутаматных рецепторов NMDA и АМРА подтипов дикатионным производным фенилциклогексила// Биологические мембраны - 2005. - Т. 22. - № 4. - С. 290-299.

2. Dorofeeva N.A., Tikhonov D.B., Baiygin O.I., Tikhonova T.B.. Salnikov Y.I., Magazanik L.G. Action of extracellular divalent cations on native alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate (AMPA) receptors// J. Neurochem. - 2005 - V. 95 - N. 6 - P. 1704-1712.

3. Лукомская Н.Я., Лаврентьева B.B., Старшинова Л.А., Жабко Е.П., Горбунова Л.В., Тихонова Т.Б., Гмиро В.Е., Магазаник Л.Г. Влияние блокаторов каналов ионотропных глутаматных рецепторов на развитие пентилентетразолового киндлинга у мышей// Росс.физиол.журн. им. И.М. Сеченова-2005-Т. 91-N. 11 - С. 1241-51.

4. Магазаник Л.Г., Тихонов Д.Б., Тихонова Т.Б.. Лукомская Н.Я. Механизмы блокады каналов глутаматных рецепторов: значение для структурных и физиологических исследований// Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 2006. - Т. 92. - № 1. - С. 27-38.

5. Tikhonova Т.В.. Baiygin O.I., Gmiro V.E., Tikhonov D.B., Magazanik L.G. Organic blockers escape from trapping in the AMPA receptor channels by leaking into the cytoplasm// Neuropharmacology - 2008 - V. 54 - N.4 - P. 653-664.

6. Tikhonova T.B.. Tikhonov D.B., Magazanik L.G. Common binding site for externally and internally applied AMPA receptor channel blockers// J. Mol Neurosci. - 2009 - V. 39 - N. 1-2 -P. 169-74.

7. Тихонова Т.Б., Магазаник Л.Г., Тихонов Д.Б. (принята к печати в Росс.физиол.журн. им. И.М. Сеченова). Влияние ионного состава внешней среды на блокаду ионных каналов АМРА рецепторов.

Тезисы докладов

1. Тихонова Т.Б.. Дорофеева Н.А. Особенности блокады подтипов глутаматных ионотропных рецепторов органическими катионами// Материалы межвузовской научно-технической конференции «XXXII неделя науки СПбГПУ» - Санкт-Петербург - 2004 - С. 45-46.

2. Тихонова Т.Б., Дорофеева H.A. Особенности блокады NMDA и АМРА рецепторов органическими катионами// Материалы семинаров политехнического симпозиума «Молодые ученые - промышленности северо-западного региона» - Санкт-Петербург -2004 - С. 75.

3. Лукомская Н.Я., Рукояткина Н.И., Горбунова Л.В., Гмиро D.E., Жабко Е.П., Лаврентьева В.В., Старшинова Л.А., Тихонова Т.Б.. Магазаник Л.Г. (2004) Исследование участия различных подтипов глутаматных рецепторов в механизме судорожного синдрома, вызываемого у мышей введением коразола// Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. Тезисы докладов XIX Съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. -Екатеринбург - 2004 - Часть 1. Т. 90 - № 8 - С. 260.

4. Тихонова Т.Б. Особенности блокады подтипов глутаматных ионотропных рецепторов органическими катионами// Тезисы докладов VII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей "Человек и его здоровье" - Санкт-Петербург -2004-С. 293-294.

5. Тихонова Т.Б. Механизмы блокады глутаматных рецепторов NMDA и АМРА типов//. Материалы VIII всероссийской конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье». Вестник молодых ученых - Санкт-Петербург - 2005 - С. 120.

6. Тихонова Т.Б., Барыгин О.И. Проникновение органических блокаторов через селективный фильтр открытых и закрытых каналов глутаматных рецепторов АМРА типа// Тезисы докладов десятой всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей "Человек и его здоровье" - Санкт-Петербург - 2007 - С. 449450.

7. Тихонова Т.Б.. Барыгин О.И. Проникновение органических блокаторов через селективный фильтр открытых и закрытых каналов глутаматных рецепторов АМРА типа// Тезисы 11-ой пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» - Пущино - 2007 - С. 21.

8. Тихонова Т.Б.. Барыгин О.И., Гмиро В.Е., Тихонов Д.Б. Проникновение органических блокаторов через ионные каналы АМРА рецепторов// Тезисы докладов XX съезда физиологического общества имени И.П. Павлова - Москва - 2007 - С. 444.

9. Тихонова Т.Б.. Тихонов Д.Б., Магазаник Л.Г. Особенности строения и механизмов функционирования ионных каналов АМРА-рецепторов, выявляемые при помощи

каналоблокаторов// Материалы научной конференции «Ионные каналы: структура и функции». Биологические мембраны - Санкт-Петербург - 2009 - Т. 26 - N. 4 - С. 331.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 03.03.2010. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 5683Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тихонова, Татьяна Борисовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ 6 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Развитие представлений об ионотропных рецепторах глутамата

1.2 Субъединичный состав ионтропных глутаматных рецепторов

1.3 Доменная организация глутаматных ионотропных рецепторов

1.3.1 Аминотерминальный домен

1.3.2 Глутамат-связывающий домен

1.3.3. Каналообразующий домен

1.3.4. С-терминальный домен

1.4 Функциональные свойства глутаматных ионотропных рецепторов

1.4.1 Активация глутаматных ионотропных рецепторов

1.4.2 Проводимость и селективность каналов глутаматных 27 рецепторов

1.4.3 Десенситизация

1.5 Блокада каналов глутаматных ионотропных рецепторов

1.5.1 Механизмы блокады

1.5.1.1 Потенциалозависимость блокады

1.5.1.2 Взаимодействие блокаторов с токонесущими ионами

1.5.1.3 Взаимодействие блокаторов с воротным 35 механизмом ионного канала. Эффект «ловушки».

1.5.1.4 Кинетика взаимодействия блокаторов с каналами

1.5.2 Важность изучения блокады каналов глутаматных 39 ионотропных рецепторов

1.5.2.1 Структурные особенности ионотропных 40 глутаматных рецепторов, выявляемые блокадой каналов

1.5.2.2 Физиологическая значимость блокаторов каналов 42 глутаматных рецепторов.

ОБОБЩЕНИЕ ПРИВЕДЕННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ,

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Блокада открытых каналов NMDA и AMP А рецепторов дикатионными органическими блокаторами.

3.1.1 Сравнение стационарной блокады открытых каналов NMDA и АМРА рецепторов

3.1.1.1 Выбор вещества для сравнения механизмов 54 блокады NMDA и АМРА рецепторов.

3.1.1.2 Зависимость стационарной блокады от 56 мембранного потенциала

3.1.2. Исследование потенциалозависимости блокады открытых каналов АМРА рецепторов дикатионными производными адамантана, фенилциклогексила, дифенила

3.1.2.1 Характеристика используемых соединений

3.1.2.2 Потенциалозависимость равновесной блокады 59 3.1.3 Сравнение потенциалозависимости кинетики взаимодействия б локаторов с каналами АМРА и NMDA рецепторов

3.1.4. Анализ кинетики взаимодействия блокаторов с каналами АМРА рецепторов

3.1.5. Сопоставление потенциалозависимости кинетики отмыва блокатора и потенциалозависимости равновесной блокады открытых каналов АМРА рецепторов

3.2 Взаимодействие с закрытыми каналами

3.2.1 .Сравнение взаимодействия с закрытыми каналами NMDA 67 и АМРА рецепторов

3.2.1.1 Возможность «ловушки» блокаторов в закрытых каналах NMDA и АМРА рецепторов

3.2.1.2 Зависимость «ловушки» от времени

3.2.2 Анализ взаимодействия с закрытыми каналами АМРА рецепторов

3.2.2.1 Отмыв блокатора из закрытых каналов АМРА рецепторов. 71 Кинетика

3.2.2.2 Потенциалозависимость вымывания блокаторов из 72 закрытых каналов АМРА рецепторов.

3.2.3 Исследование блокады закрытого канала внеклеточным блокатором

3.3.«Самоотмыв» блокаторов из каналов АМРА рецепторов

3.4 Кинетическое моделирование

3.5 Блокада каналов АМРА рецепторов изнутри клетки

3.5.1 Блокада открытых каналов АМРА рецепторов, вызываемая 83 блокаторами МЭМ-1676 и ИЭМ-1925 с внутриклеточной стороны мембраны.

3.5.2 Сравнение потенциалозависимости блокады открытых 85 каналов АМРА рецепторов с вне- и внутриклеточной стороны мембраны.

3.5.3. Конкурентноподобные отношения между внутри- и внеклеточным 87 блокатором.

3.5.4 Блок закрытых каналов АМРА рецептров изнутри.

3.5.5 Общность сайта связывания для внутри- и внеклеточного 92 блокатора

3.5.6 Действие ИЭМ-1676 на открытые и закрытые каналы

Са2+-непроницаемых АМРА рецепторов изнутри клетки.

3.6 Влияние ионного состава среды на параметры блокады каналов 97 АМРА рецепторов

3.6.1. Вольтамперная характеристика каинат-вызванных токов

3.6.2 Влияние снижения внеклеточной концентрации ионов натрия 98 на равновесную блокаду каналов АМРА рецепторов

3.6.3 Влияние снижения внеклеточной концентрации натрия на 100 кинетику взаимодействия блокатора с открытыми каналами

АМРА рецепторов.

3.6.4 Влияние снижения внеклеточной концентрации натрия на 101 взаимодействие блокатора с закрытыми каналами АМРА рецепторов ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 104 ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ 112 ВЫВОДЫ 115 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЦНС - центральная нервная система

АМРА - а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазол пропионовая кислота ИМЭА - ТчГ-метил-О-аспартат АТД - аминотерминальный домен

ИК50 - концентрация вещества, при которой наблюдается 50% ингибирование

1Ж<ЗХ - 6,7-динитроквиноксалин-2,3-Дион

1-У - зависимость тока от напряжения

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы блокады каналов глутаматных ионотропных рецепторов AMPA и NMDA типов органическими катионами"

Глутамат является основным возбуждающим медиатором в центральной нервной системе позвоночных (Collingridge & Singer, 1990; Nakanishi, 1992). После высвобождения из пресинаптических терминалей глутамат активирует два негомологичных класса рецепторов: ионотропные (лигапд-управляемые ионные каналы) и метаботропные (рецепторы, связанные с G-белками) глутаматные рецепторы. Как правило, метаботропные рецепторы глутамата выполняют модулирующую функцию, в то время как ионотропные глутаматные рецепторы опосредуют быстрое проведение сигналов.

Ионотропные рецепторы глутамата разделяют на три типа: NMDA, АМРА и каинатные. Такая классификация основана на избирательной чувствительности к соответствующим агонистам, однако эти типы отличаются и по многим другим фармакологическим и биохимическим свойствам (Dingledine, 1999). Так, АМРА рецепторы обладают быстрой кинетикой активации-деактивации каналов, глубокой десенситизацией и, в зависимости от субъединичного состава, либо непроницаемы для кальция, либо обладают сравнительно слабой, но функционально значимой, кальциевой проводимостью. NMDA рецепторы активируются значительно более медленно, причем для этого требуется связывание коагониста глицина, слабо десенситизируются, проницаемы для кальция и потенциалозависимо блокируются внеклеточным магнием. Последний факт позволяет рассматривать NMDA рецепторы как кодетекторы одновременной стимуляции и деполяризации нейрона. При потенциале покоя нейрона эндогенный магний эффективно блокирует каналы NMDA рецепторов, и их активация не приводит к заметному результату. Однако блокада магнием сильно зависит от мембранного потенциала. При деполяризации мембраны сродство магния к NMDA каналам падает, что приводит к входу кальция в клетку, который запускает каскад внутриклеточных процессов, в том числе изменение экспрессии рецепторов АМРА типа (Malenka & Nicoll, 1999; Malinow & Malenka, 2002; Song and Huganir, 2002; Bredt & Nicol, 2003; Derkach et al., 2007). Такой процесс лежит в основе так называемой NMDA-зависимой синаптической пластичности.

Изменение экспрессии ионотропных рецепторов глутамата может быть вызвано не только NMDA-зависимым способом, но и посредством других факторов (Citri & Malenka, 2008), и является одним из механизмов, регулирующих эффективность синаптической передачи, что лежит в основе процессов памяти и обучения, развития и поддержания межклеточных контактов и восприятия боли (Bliss & Collingridge, 1993; Woolf & Salter, 2000). Нарушение нормальной экспрессии глутаматных ионотропных рецепторов наблюдается при различных патологиях нервной системы: АМРА рецепторов - при 6 умственной отсталости, вызванной синдромом ломкой Х-хромосомы, каинатных рецепторов - при болезни Хантингтона. Изменение субъединичного состава АМРА рецепторов, вызванное ишемией приводит к увеличению входа кальция в клетку и ее последующей гибели (Doble, 1999; Lee et al., 1999; Bowie, 2008). Некоторые заболевания сопровождаются повышенным выбросом глутамата в тканевую жидкость, поэтому вещества, способные блокировать глутаматные рецепторы, рассматриваются как нейропротекторные агенты. Так, например, блокатор каналов NMDA рецепторов -мемантин - активно используется в клинической практике при лечении болезни Альцгеймера (Lipton, 2004).

Глутаматные рецепторы разных типов по-разному распределены в ЦНС. Более того, даже отдельный нейрон, получающий афферентные входы из различных источников, может иметь в этих синапсах глутаматные рецепторы с различным набором субъединиц (Toth & McBain, 1998). Глутаматные ионотропные рецепторы экспрессируются и некоторыми клетками, расположенными вне ЦНС: клетками островков Лангерганса поджелудочной железы, остеобластами и остеокластами костей, некоторыми клетками кишечника и желудка (Moriyama & Yamamoto, 2004).

Вовлеченность глутаматных рецепторов в такое разнообразие физиологически значимых процессов обуславливает актуальность изучения их структуры и способов модуляции. Одним из способов ингибирования является блокада каналов. Учитывая, что каналоблокаторами могут выступать соединения со сравнительно простой и, следовательно, предсказуемой структурой, данные о механизме их действия используются и для изучения структурных детерминант самих каналов (Sobolevsky et al., 1999; Bolshakov et al., 2000; Bolshakov et al, 2003; Tikhonov, 2007).

Таким образом, исследование механизмов блокады каналов различных подтипов глутаматных рецепторов актуально как для выяснения строения и функции рецепторов, так и с точки зрения возможного применения соединений такого класса для лечения заболеваний нервной системы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Тихонова, Татьяна Борисовна

выводы.

1) Совокупность данных по потенцналозависимости кинетики и потенциалозависимости равновесной блокады свидетельствует о том, что производные адамантана, фенилциклогексила, дифенила способны проникать внутрь клетки через открытые каналы Са -проницаемых АМРА рецепторов, но не NMDA рецепторов.

2) Производные адамантана, фенилциклогексила, дифенила способны оставаться в каналах как Са2+-проницаемых АМРА рецепторов, так и NMDA рецепторов после закрытия. Однако после этого молекулы блокаторов способны покидать каналы АМРА, но не NMDA рецепторов. Потенциалозависимость этого процесса указывает на то, что вымывание осуществляется во внутриклеточную среду.

3) Постоянное присутствие блокатора во внеклеточной среде не препятствует вымыванию блокаторов из закрытых каналов АМРА рецепторов («эффект самоотмыва»). Это может приводить к зависимости блокады синаптических токов от частоты стимуляции in vivo.

4)Производные адамантана, фенилциклогексила, дифенила способны блокировать как открытые, так и закрытые каналы Са2+-проницаемых АМРА рецепторов изнутри клетки. Причем и вне- и внутриклеточный блокатор взаимодействуют с одним и тем же сайтом связывания в канале.

5) Токонесущие ионы натрия ослабляют блокирующее действие катионом ИЭМ-1925 за

2+ счет конкуренции за место связывания в канале Са -проницаемого АМРА рецептора.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Прогресс в понимании молекулярной структуры глутаматных рецепторов, механизмов их активации и функционального назначения во многом зависит от использования избирательно действующих фармакологических инструментов. Среди них важное место занимают вещества, способные блокировать каналы этих рецепторов. Побудительные причины поиска и синтеза блокаторов каналов ионотропных рецепторов объясняются стремлением применить их для исследования строения и функции рецепторов и естественным желанием создать новый класс веществ для лечения заболеваний нервной системы.

Известными каналоблокаторами NMDA и АМРА рецепторов являются органические катионы, производные адамантана, фенилциклогексила и др. (Magazanik et al., 1997; Магазаник и др., 2000). Структурные детерминанты блокады соединениями этого класса каналов NMDA и АМРА рецепторов были подробно изучены в экспериментах по определению уровня равновесной блокады (Магазаник и др., 2000; Bolshakov et al., 2000; Магазаник и др., 2001). Предположительно, такие блокаторы связываются в области селективного фильтра, но организация сайта связывания различна в каналах АМРА и NMDA рецепторов. На основании экспериментальных данных были предложены молекулярные модели участков связывания блокаторов в каналах NMDA и АМРА рецепторов (Tikhonov et al., 1999; Tikhonov et al., 2002).

Однако взаимодействие блокатора с каналом характеризуется не только величиной блокирующей активности, но и рядом важных особенностей. К ним относятся зависимость равновесной блокады pi кинетики блокирующего действия от мембранного потенциала, способность молекулы блокатора оставаться в канале после его закрытия (эффект «ловушки») и пр. Указанные особенности могут являться важными характеристиками блокаторов как лекарственных препаратов (Parsons et al., 1999; Rogawsky, 2000), и позволяют получать дополнительную информацию о строении каналов.

Исследованию механизмов действия органических катионов на каналы NMDA рецепторов посвящено сравнительно большое число работ (Antonov et al., 1998; Sobolevsky et al., 1998; Sobolevsky, 1999; Bolshakov et al., 2003). Напротив, сведения об особенностях механизмов блокады каналов АМРА рецепторов немногочисленны. Количественные оценки, характеризующие эффект «ловушки» блокаторов в каналах АМРА рецепторов отсутствовали. Тем более не существовало подробного сравнения особенностей блокады каналов NMDA и АМРА рецепторов.

Задавшись целью восполнить эти пробелы, мы провели сравнение механизмов блокады АМРА и NMDA рецепторов на примере дикатионного производного фенилциклогексила ИЭМ-1925 и подробно проанализировали механизм действия дикатионных блокаторов на каналы АМРА рецепторов.

Полученные результаты позволяют предположить, что механизмы взаимодействия блокаторов с каналами NMDA и АМРА рецепторов, так же как и участки их связывания, определяющие активность, различны. Так, в каналах NMDA рецепторов предполагается существование двух сайтов связывания для органических блокаторов (Antonov et al., 1998; Sobolevsky et al., 1998; Sobolevsky, 1999; Bolshakov et al., 2003). В случае ИЭМ-1925 такое предположение было основано на потенциалозависимости выраженности эффекта «ловушки» и характера кинетики отмыва (Bolshakov, 2003). Для АМРА рецепторов такие экспериментальные эффекты не наблюдались, что, соответственно, не дает оснований предполагать существование дополнительного сайта связывания в каналах этого подтипа рецепторов для дикатионных блокаторов. Вторым существенным отличием является способность блокаторов проникать внутрь клетки как из открытых, так и закрытых каналов АМРА, но не NMDA рецепторов. Эти эффекты были проанализированы более подробно.

Ранее уже было показано, что некоторые блокаторы способны проникать внутрь клетки через открытые каналы АМРА рецепторов (Bahring et al., 1997; Bahring & Mayer, 1998; Tikhonov et al., 2000). Однако это было показано для блокаторов сравнительно маленьких размеров. В ходе настоящей работе было обнаружено, что проникновение внутрь клетки возможно и для более крупных молекул, содержащих дифенильную или фенилциклогексильную группировку, размеры которых превышают 10 A (Bolshakov et al., 2003). Это приводит к выводу о том, что эффективный диаметр каналов АМРА рецепторов превышает существующие к настоящему времени оценки в 7.5 A (Bumashev et al., 1996). В то же время полученные результаты подтверждают, что NMDA рецепторы имеют более узкий канал, чем АМРА рецепторы.

Уход блокаторов из закрытых каналов АМРА рецепторов внутрь клетки был описан впервые. При изучении блокады каналов АМРА рецепторов изнутри клетки подтвердилась и возможность обратного процесса. Ряд данных указывает на то, что внутриклеточный блокатор достигает того же сайта связывания, что и внеклеточный, как в открытых, так и в закрытых каналах АМРА рецепторов. Эти результаты свидетельствуют о том, что закрытие воротного механизма каналов АМРА рецепторов, расположенного во внешнем вестибюле, не связано с перекрыванием канала в области селективного фильтра. Такой вывод имеет непосредственное отношение к дискуссии о структуре и локализации

113 воротного механизма в каналах глутаматных рецепторов (Qian & Johnson, 2002; Kuner et al., 2003; Wollmuth & Sobolevsky, 2004).

Еще одним фактором, влияющим на блокаду каналов, является взаимодействие с проникающими ионами. Проведенное исследование показывает, что проникающие ионы внеклеточного натрия, по всей видимости, конкурируют за сайт связывания с дикатионным блокатором ИЭМ-1925 в каналах АМРА рецепторов. Такой вывод отличается от того, который был сделан при исследовании каналов NMDA рецепторов (Antonov et al., 1998). Согласно этой работе, ионы натрия внеклеточной среды связываются с поверхностным (непотенциалозависимым) сайтом, а не с тем же сайтом, что и дикатионные каналоблокаторы.

Полученные результаты не только дают информацию о структуре канала и воротного механизма, но и могут иметь важные физиологические следствия. В частности, эффект «самоотмыва» должен приводить к зависимости угнетения глутаматергической

2+ синаптической передачи, опосредуемой Ca -приницаемыми АМРА рецепторами, от частоты стимуляции. Различия в потенциалозависимости и в скоростях проникновения внутрь клетки могут определять эффекты, наблюдаемые в экспериментах на более сложных системах: в срезах мозга и в условиях целого организма.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тихонова, Татьяна Борисовна, Санкт-Петербург

1. Василевский A.A., Козлов С.А., Гришин Е.В. Молекулярное разнообразие яда пауков// Успехи биологической химии 2009 - Т. 49 - С. 211- 274.

2. Магазаник Л.Г, Тихонов Д.Б., Большаков К.В., Гмиро В.Е., Булдакова СЛ., Самойлова М.В. Исследование строения ионных каналов рецепторов глутамата и механизмов их блокады органическими катионами // Росс. Фозиол. Журнал. 2001. Т. 87. №8. С. 1026-1039.

3. Магазаник Л.Г. Блокада ионного канала как подход к исследованию подтипов АМПА-рецепторов// Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова 1998 - Т. 84 - С. 994 -1005.

4. Магазаник Л.Г., Антонов С.М., Федорова И.М. Волкова Т.М., Гришин Е.В. Действие яда паука Argiope lobata и его низкомолекулярного компонента -аргиопина на постсинаптические мембраны. Биол. Мембраны 1986 - Т. 3 - С. 1204- 1219.

5. Рукояткина Н.И., Горбунова Л.В., Гмиро В.Е., Лукомекая Н.Я. Способность антагонистов глутаматных рецепторов ослаблять экспериментальную каталепсию у крыс// Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова 2000 - Т. 86 - С. 626-634.

6. Рукояткина Н.И., Горбунова Л.В., Гмиро В.Е., Лукомекая Н.Я. Способность новых неконкурентных блокаторов глутаматных рецепторов ослаблять двигательные нарушения у животных// Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова 2001 - Т. 87 - С. 1260 - 1267.

7. Abderhalden Е., Weil A.Z. Comparative studies оп the content of the various components of the nervous system of amino acids. Communication II: the amino acids of the gray and white metter of the brain// Physiol.Chem. 1913 - V. 83 - P. 425 - 440.

8. Adams H.J., Blair M.R.J., Takman B.H. The local anaestetic activity of tetrodotoxin alone and in combination with vasoconstrictors and local anesthetics// Anesth Analg. -1976-V. 54 N. 4 - P. 568-573.

9. Akaike N., Kawai N., Kiskin N.I., Kljuchko E.M., Krishtal O.A., Tsyndrenko A.Y. Spider toxin blocks excitatory amino acid responses in isolated hippocampal pyramidal neurons// Neurosci Lett. 1987 - V.79 - N. 3 - P. 326-330.

10. Antonov S.M., Gmiro V.E., Johnson J.W. Binding sites for permeant ions in the channel of NMD A receptors and their effects on channel block//Nat. Neurosci. 1998 - V. 1 - N. 6-P. 451-461.

11. Antonov S.M., Johnson J.W. Permeant ion regulation of N-methyl-D-aspartate receptor channel block by Mg2+// Proc. Nat.I Acad. Sci. USA. 1999 - V. 96 - P. 14571-14576.

12. Antonov S.M., Johnson J.W. Voltage-dependent interaction of open-channel blocking molecules with gating of NMD A receptors in rat cortical neurons// J. Physiol. 1996 - V. 493 -N.2-P. 425-445.

13. Antonov S.M., Johnson J.W., Lukomskaya N.Y., Potapyeva N.N., Gmiro V.E., Magazanik L.G. Novel adamantine derivatives act as blockers of open ligand-gated channels and as anticonvulsants// Mol. Pharmacol. 1995 - V.47 - N.3 - P. 558-67.

14. Araki K, Meguro H, Kushiya E, Takayama C, Inoue Y, Mishina M. Selective expression of the glutamate receptor channel delta 2 subunit in cerebellar Purkinje cells// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993 - V. 197-N.3-P. 1267- 1276.

15. Arinaminpathy Y., Sansom M.S., Biggin P.C. Molecular dynamics simulations of the ligand-binding domain of the ionotropic glutamate receptor GluR2. // Biophys J. -2002 -V. 82-N.-2-P. 676 -683.

16. Armstrong N., Mayer M., Gouaux E. Tuning activation of the AMPA-sensitive GluR2 ion channel by gcnetic adjustment of agonist-induced conformational changes// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003 - V. 100 P. 5736 - 5741.

17. Armstrong N., Sun Y., Chen G., Gouaux E. Structure of glutamate-receptor ligand-binding core in complex with kainate// Nature 1998 - V. 395 - P. 913 - 917.

18. Armstrong N.A., Gouaux E. Mechanisms for activation and antagonism of an AMPA-sensitive glutamate receptor: crystal structure of the GluR2 ligand binding core// Neuron 2000 - V.28 - P. 165-181.

19. Ayalon G. & Stern-Bach Y. Functional assembly of AMPA and kainite receptors is mediated by several discrete protein-protein interactions//Neuron 2001 - V. 31 - N. 1 -P. 103 - 113.

20. Bahring R. & Mayer M.L. An analysis pf philantotoxin block for recombinant rat GluR6(Q) glutamate receptor channels// J. Physiol. 1998 - V. 509 - P. 635 - 650.

21. Bahring R., Bowie D., Benveniste M., Mayer M.L. Permeation and block of rat GluR6 glutamate receptor channels by internal and external polyamines// J. Physiol. 1997 - V. 502-N. 3 - P. 575-589.

22. Banke T. and Trainelis S. control of GluRl activation by cAMP-dependent protein kinase// Abstr. Soc. Neurosci. 1998 - V. 24 - P. 1272.

23. Banke T.G. & Traynelis S.F. Activation of NR1/NR2B NMDA receptors//Nat. Neurosci. -2003 -V. 6-P. 144 152.

24. Bateman A., Boden P., Del J.R., Quicke D.L.J., Usherwood P.N.R. Postsynaptic block of glutamergic synaps by low molecular weight fractions of spider venom// Brain Res. -1985 -V. 339-P. 237- 244.

25. Beck C., Wollmuth L.P., Seeburg P.H., Sakmann B., Kuner T. NMDAR channel segments forming the extracellular vestibule inferred from the accessibility of substituted cysteines //Neuron 1999 - V. 22 - P.559-570.

26. Bedoukian M., Weeks A., Partin K. Different domains of AMPA receptor direct stargazing-mediated trafficking and stargazing-mediated modulation of kinetics// J. Biol. Chem. — 2006 V. 281 - P. 23908- 23921.

27. Bennett J.A., Dingledine R. Topology profile for a glutamate receptor: three transmembrane domains and a channel-lining reentrant membrane loop// Neuron 1995 -V. 14 - N. 2 - P. 373-384.

28. Benveniste M., Clements J., Vyklicky L.J., Mayer M.L. A kinetic analysis of the modulation of N-methyl-D-aspartic acid receptors by glycine in mouse cultured hippocampal neurons// J. Physiol. 1990 - V. 428 - P. 333 - 357.

29. Berncche S & Roux B. A gate in the selectivity filter of potassium channels. // Structure -2005 -V. 13 P. 591-600.

30. Blanpied T.A., Boeckman F.A., Aizeman E., Johnson J.W. Trapping channel block of NMDA-mediated responses by amantadine and memantine// J. Neurophysiol. 1997 - V. 77 - P. 309-323.

31. Bliss T.V.P & Collingridge G.L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in hippocampus//Nature 1993 - V. 361 - P. 31-39.

32. Bolshakov K.V., Gmiro V.E., Tikhonov D.B., Magazanik L.G. Determinants of trapping block of N-methyl-d-aspartate receptor channels// J Neurochem. 2003 - V. 87 - N. 1 - P. 56-65.

33. Bolshakov K.V. Kim K.H. Potapjeva N.N., Gmiro V.E., Tikhonov D.B., Usherwood P.N., Mellor I.R., Magazanik L.G. Design of antagonists for NMDA and AMPA receptors// Neuropharmacology 2005 - V. 49 - P. 144-155.

34. Bowie D. Ionotropic glutamate receptors & CNS disorders// CNS Neurol Disord Drug Targets 2008 - V. 7 - N. 2 - P. 129-143.

35. Bowie D., Lange G.D., Mayer M.L. Activity-dependent modulation of glutamate receptors by polyamines// J Neurosci. 1998 - V. 18 - N. 20 - P. 8175-8185.

36. Bowie D., Mayer M.L. Inward rectification of both AMPA and kainite subtype glutamate receptors generated by polyamine-mediated ion channel block// Neuron 1995 - V. 15 -N. 2 - P. 453-462.

37. Bredt D.S. & Nicol R.A. AMPA receptor trafficking at cxcitatory synapses// Neuron -2003 -V.40-N.2-P. 361 -379.

38. Buldakova S.L., Vorobjev V.S., Sharonova I.N., Samoilova M.V., Magazanik L.G. Characterization of AMPA receptor populations in rat brain cells by use of subunit-specific open channel blocking drug, IEM-1460// Brain Research 1999 - V. 846 - P.5258.

39. Burnashev N., Sakmann B., Seeburg P.H. Divalent ion permeability of AMPA receptor channels is dominatedby the edited form of single subunit// Neuron 1992 - V. 8 - P. 775- 785.

40. Burnashev N., Villarroel A., Sackmann B. Dimensions and ion selectivity of recombinant AMPA and kainate receptor channels and their dependence on Q/R site residues// J Physiol. 1996 - V. 496 - N. 1 - P. 165-173.

41. Burnashev N., Zhou Z., Neher E., Sackmann B. Fractional calcium currents throught recombinant GluR channels of the AMPA, NMD A, and kainite types// J. Physiol. (Lond.)- 1995 -V. 485 -P. 403 -418.

42. Casado M., Lopez-Guajardo A., Mellstom B., Naranjo J.R., Lerma J. Functional N-methyl-D-aspartate receptors in clonal rat phaeochromocytoma cells// J. Physiol 1996 -V. 490-P. 391 -404.

43. Cecchi X., Wolff D., Alvarez O., Latorre R. Mechanisms of Cs+ blockade in Ca2+-activated K+ channel from smooth muscle// Biophys. J. 1987 - V. 52 - P. 707 - 716.

44. Chen G. Q. & Gouaux E. Overexpression of a glutamate receptor (GluR2) ligand binding domain in Escherichia coli: application of a novel protein folding screen// Proc.Natl. Acad. Sci. USA 1997-V. 94-N. 25 - P. 13431 - 13436.

45. Chen G.Q., Cui C., Mayer M.L., Gouaux E. Functional characterization of a potassium-selective procariotic glutamate receptor//Nature 1999 - V. 402 - N. 6763 - P. 817-821.

46. Chiu J., DeSalle R., Lam H. M., Mcisel L. Coruzzi G. Molecular evolution of glutamate receptors: a primitive signaling mechanism that existed before plants and animals diverged// Mol. Biol. Evol. 1999 - V. 16 - P. 826 - 838.

47. Citri A. & Malenka R.C. Synaptic plasticity: multiple forms, functions, and mechanisms// Neuropharmacology 2008 - V. 33 - N. 1 - P. 254 - 263.

48. Collingridge G.L., Singer W. Excitatory amino acids receptors and synaptic plasticity// Trends Pharmacol. Sci. 1990. V. 11. P. 290-296.

49. Collingridge G.L. & Lester R.A. Excitatory amino acid receptors in the vertebrate central nervous system// Pharmacol. Rev. 1989 - V. 41 - N. 2 - P. 143 - 210.

50. Cotman C.W., Monaghan D.T., Ganong A.H. Excitory amino acid neurotransmission: NMDA receptors and Hebb-type synaptic plasticity// Annu Rev Neurosci 1988 - V. 11 -P. 61 -80.

51. Curtis D.R., Phillis J. W., Watkins J.C. The chemical excitation of spinal neurons by certain acidic amino acids// J. Physiol. 1960 - V. 150 - P. 656-682.

52. Curtis D.R., Phillis J.W., Watkins J.C. Chemical excitation of spinal neurons// Nature -1959-V. 183 -N. 4661 P. 611-612.

53. Davies J. & Watkins J.C. Effect of magnesium ions on the responses of spinal neurons to excitatory amino acids and acetylcholine// Brain Res. 1977 - V. 130 - N. 2 - P. 364 -368.

54. Derkach V.A., Oh M.C., Guire E.S., Soderling T.R. Regulatory mechanisms of AMPA receptors in synaptic plasticity//Nat. Rev. Neurosci. 2007 - V.8-N.2-P. 101-113.

55. Dingledine R., Borges K., Bowie D., Traynelis S. The Glutamate Rcceptor Ion Channels// Pharmacological reviews 1999 - V. 51 - P. 7-62.

56. Dingledine R., Hume R.I., Heinemann S.F. Structural determinants of barium permeation and rectufucation in non-NMDA glutamate receptor channels// J. Neurosci. 1992 - V. 12-P. 4080-4087.

57. Doble A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy// Pharmacol. Ther. 1999 - V. 81 - N. 3 - P. 163 - 221.

58. Donewan S.D., Rogawski M.A. Intracellular polyamines mediate inward rectification of Ca(2+)-permeable alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors// Proc. Nat.I Acad. Sci. USA. 1995 - V. 92 - N. 20 - P. 9298-9302.

59. Doyle D.A., Morais Cabral J., Pfuetzner R.A., Kuo A., Gulbis J.M., Cohen S.L., Chait B.T., MacKinnon R. The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity// Science 1998 - V. 280 - P. 69 - 77.

60. Dravid S.M., Prakash A., Traynelis F. Activation of recombinant NR1/NR2C NMDA receptors// J. Physiol. 2008 - V. 586 - P. 4425 - 4439.

61. Ehlers M. D., Zhang S., Bernhadt J.P., Huganir R.L. Inactivation of NMDA receptors by direct interaction of calmodulin with the NR1 subunit// Cell 1996 - V. 84 - N. 5 - P. 745 - 755.

62. Erreger K., Dravid S.M., Banke T.G., Wyllie D.J. Traynelis S.F. Subunit specific gating controls rat NR1/NR2A and NR1/NR2B NMDA channel kinetics and synaptic signaling profiles// J. Physiol. 2005 - V. 563 - P. 345 - 358.

63. Evans R.H., Francis A.A., Watkins J.C. Selective antagonism by Mg2+ of amino acid-induced depolarization of spinal neurons// Experientia. 1977 - V. 33 - N. 4 - P. 489 -491.

64. Fagg G.E., Foster A.C. Amino acid neurotransmitters and their pathways in mammalian central nervous system//Neurosci. 1983 - V. 9 - N. 4 - P. 701 -719.

65. Farrant M., Feldmeyer D., Takahashi T., Cull-Candy S.G. NMDA-receptor channel diversity in the developing brain// Nature 1994 - V. 368 - P. 335 - 339.

66. Fayyazuddin A., Villarocl A., Le Goff A., Lerma J., Neyton J. Four residues of the extracellular N-terminal domain of the NR2A subunit control high-affinity Zn2+ binding to NMDA receptors// Neuron 2000 - V. 25 - N. 3 - P. 683-694.

67. Ferrer-Montiel A.V., Merino J.M., Planells-Cases R., Sun W., Montal M. Structural determinants of the blocker binding site in glutamate and NMDA receptor channels// Neuropharmocology 1998 - V. 37. - P. 139-147.

68. Foster A.C., Fagg G.E. Acidic amino acid binding sites in mammalian neuronal membranes: their characteristics and relationship to synaptic receptors. //Brain Res. -1984-V. 319-N. 2 P. 103 -164.

69. Furukawa H., Singh S.K., Mancusso R., Gouaux E. Subunit arrangement and function in NMDA receptors// Nature 2005 - V. 438 - N. 7065 - P. 589 - 620.

70. Furukawa, H., Gouaux, E. Mcchanisms of activation, inhibition and specificity: crystal structures of the NMDA receptor NR1 ligand-binding core// EMBO J.- 2003 V. 22 - P.124873.2885.

71. Gibb A,J. & Colquhoun D. Glutamate activation of a single NMDA receptor-channel produces a cluster of channel openings// Proc. Biol. Sci. 1991 - V. 243 - P. 108 - 112.

72. Hammond C. Cellular and molecular neurobiology// New York Academic Press 1996 -P. 1 -453.

73. Hayashi. T. Effects of sodium glutamate on the nervous system// Keio J. Med. 1954 - V. 3 - P. 192-193.

74. Hille B. Ion channels of excitable membranes// Sinauer associated inc., Sanderland -1992-P. 1-232.

75. Hollmann M., Hartley M., Heinemann S. Ca2+ permeability of KA/AMPA gated glutamate receptor channels depends on subunit composition. // Science - 1991 - V. 252 -P.851-853.

76. Hollmann M., Heinemann S. Cloned glutamate receptors// Annu. Rev. Neurosci. 1994 -V. 17-P. 31-108.

77. Ito M. Long-term depression.//Annu. Rev. Neurosci. 1989 - V. 12 - P. 85 -102.

78. Jatzke C., Hernandez M., Wollmuth L.P. Extracellular vestibule determinants of Ca2+ influx in Ca2+-permeable AMP A receptor channels// J. Physiol. 2003 - V. 549 - P. 439 -452.

79. Jayaraman V. Channel-opening mechanism of kainite-activated glutamate receptor: kinetic investigations using a laser-pulse photolysis technique// Biochemistry 1998 - V. 37-P. 16735 - 16740.

80. Jiang Y., Lee A., Chen J., Ruta V., Cadene M., Chait B.T., MacKinnon R. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel.//Nature 2003 - V. 423 - P. 33-41.

81. Jiang Y. Lee A. Chen J., Cadene M., Chait B.T., MacKinnon R. The open pore conformation of potassium channels//Nature 2002 - V. 417 - N. 6888 - P. 523-526.

82. Jin R., Banke T.G., Mayer M.L., Traynelis S.F., Gouaux E. Structural Basis for partial agonist action at ionotropic glutamate receptors// Nat. Neurosci. 2003 - V. 6 - P. 803 -810.

83. Jonas P. & Burnashev N. Molucular mechanisms controlling calcium entry through AMPA-type glutamate receptor channels// Neuron 1995 - V. 15 - P. 987 - 990.

84. Jones K.S., VanDongen H.M., VanDongen A.M. The NMDA receptor M3 segment is a conserved transduction element coupling ligand binding to channel opening.// J. Neurosci. 2002 - V. 22 - P. 2044-2053.

85. Kamboj S.K., Swanson G.T., Cull-Candy S.G. Intracellular spermine confers rectification on rat calcium-permeable AMPA and kainate receptors// J. Physiol. 1995 - V. 486 - N.2 - P. 297-303.

86. Kennedy M.B. Signal-processing machinas at the postsynaptic density// Science 2000 -V. 290 - P. 750 - 754.

87. Kohda K., Wang Y., Yuzaki M. Mutation of a glutamate receptor motif reveals its role in gating and delta2 receptor channel properties. //Nat. Neurosci. 2000 - V. 3 - P. 315-322.

88. Koike M., Tsukada S., Tsuzuki K., Kijima H., Ozawa S.Regulation of kinetic properties of GluR2 AMPA receptor by alternative splicing// J. Neurochem 2000 - V. 24 - P. 11416-11420.

89. Krnjevic K. Chemical nature of synaptic transmission in vertebrates// Phys. Rev. 1974 -V. 54-P. 418 - 540.

90. Krnjevic K.& Phillis J.W. Action of certan amines on cerebral cortical neurons. // Br. J. Pharmacol. Chemother. 1963 - V. 20 - P. 471 - 490.

91. Krnjevic K.& Phillis J.W. Iontophoretic studies in mammalian cerebral cortex// J. Physiol. -1963 V. 165 - P. 274 --304.

92. Krupp J. J., Vissel B., Heinemann S. F., Westbrook G.L. N-terminal domain in the NR2 subunit control desensitization of NMD A receptors// Neuron 1998 - V. 20 - P. 317 -327.

93. Kuner T., Seeburg P.H., Guy H.R. A common architecture for K+ channels and ionotropic glutamate receptors? // Trends Neurosci. 2003 -V. 26 - P. 27-32.

94. Kuner T., Beck C., Sackmann B., Seeburg P.H. Channel-lining residues of the AMPA receptor M2 segment: structural environment of the Q/R site and identification of the selectivity filter// J.Neurosci. 2001 - V. 21 - N. 12 - P. 4162-4172.

95. Kuner T., Schoepfer R. Multiple structural elements determine subunit specificity of Mg2+ block in NMDA receptor channels// J. Neurosci. 1996 - V. 16 - N. 11 - P. 35493558.

96. Kuusinen A., Abele R., Madden D.R., Keinanen K. J. Oligomerization and ligand-binding properties of the ectodomain of the alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptor subunit GliRD// Biol. Chem. 1999 - V. 274 - P. 28937 - 28943.

97. Lee J.M. et al., (1999) The changing landscape of ischaemic brain injury mechanisms. Nature 399 (Suppl.) A7-A14.

98. Lenaeus M.J., Vamvouka M., Focia P.J., Gross A. Structural basis of TEA blockade in a model potassium channel. //Nat. Struct. Biol. 2005 - V. 12 - P. 454-459.

99. Leuschner W.D., Hoch W. Subtype-specific assembly of alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptor subunits is mediated by their n-terminal domains// J. Biol. Chem. 1999 - V. 274 - N. 24 - P. 16907-16916.

100. Lingle C. Blockade of cholinergic channels by chlorisondamine on a crustacean muscle. //J. Physiol. 1983 - V. 339 - P. 395-417.

101. Lipton S.A. Prospects for clinically tolerated NMDA antagonists: open-channel blockers and alternative redox states of nitric oxide// Trends. Neurosci. 1993 - V. 16 - P. 527 -532.

102. Lomeli H„ Sprengel R., Laurie D.J., Khr G., Herb A., Seeburg P.H., Wisden W. The rat delta-1 and delta-2 subunits extend the excitatory amino acid receptor family// FEBS Lett.- 1993 -V. 315 -N. 3 P. 318 -322.

103. Luque I. & Freire E. Structural stability of binding sites: consequences for binding affinity and allosteric effects// Proteins, Suppl. 2000 - P. 63 -71.

104. Magazanik L.G., Buldakova S.L., Samoilova M.V., Gmiro V.E., Mellor I.R., Usherwood P.N. Block of open channels of recombinant AMPA receptors and native AMPA/kainate receptors by adamantane derivatives// J Physiol. 1997 - V. 505 - N. 3 - P. 655-663.

105. Malenka R.C. & Nicoll R.A. Long-term potentiation a decade of progress?// Science -1999 -V. 285-N. 5435 - P. 1870 - 1874.

106. Malinow R., Malenka R.C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity// Annu Rev Neurosci. 2002 - V. 25 - P. 103-126.

107. Mansour M., Nagarajan N., Nehring R.B., Clements J.D., Rosenmund C. Heteromeric AMPA receptors assemble with a preferred subunit stoichiometry and spatial arrangement// Neuron 2001 - V. 32 - N. 5 - P. 841 - 853.129

108. Margot K.C. Single channel characterization of a human GluR3-type glutamate receptor channel. MS dissertation, Cornell University Publication 1998.

109. Matsuda S, Yuzaki M. Eur. Mutation in hotfoot-4J mice results in retention of delta2 glutamate receptors in ER.// J. Neurosci. 2002 - V. 16 - N. 8 - P. 1507 - 16.

110. Mayer M.L. & Westbrook G.L. The physiology of excitatory amino acids in the vertebrate central nervous system// Prog Neurobiol. 1987 - V. 28 - N. 3 - P. 197 - 276.

111. Mayer M.L. Crystal structures of GluR5 and GluR6 ligand binding cores: molecular mechanism underlying kainite receptor selectivity// Neuron 2005 - V. 45 - P. 539 - 552.

112. Mayer M.L., Ghosal A., Dolman N.P., Jane D.E. Crystal structutes of the kainite receptor GluR5 ligand binding core dimcr with novel GluR5-selective antagonists// J. Neurosci. -2006-V. 26-P. 2852 -2861.

113. Mayer M.L., Olson R., Gouaux E. Mechanisms for ligand binding to GluRO ion channels: crystal structure of the glutamate and serine complexes and a closed apo state// J. Mol. Biol 2001 - V.311 - P. 815 - 836.

114. McFeeters R.L. & Oswald R.E. Emerging structural explanations of ionotropic glutamate receptor function// FASEB 2004 - V. 18 - N. 3 - P. 428 - 438.

115. McFeeters, R. L., Oswald, R. E. Structural mobility of the extracellular ligand-binding core of an ionotropic glutamate receptor. Analysis of NMR relaxation dynamics// Biochemistry 2002 - V. 41 - P. 10472-10481.

116. Mellor I.R., Usherwood P.N.R. Targeting ionotropic receptors with polyamine-containing toxins// Toxicon 2004 - V. 43 - N. 5 - P. 493-508.

117. Moriyama Y. & Yamamoto A. Glutamatergic chemical transmission: look! Here, there, and anywhere// J. Biochem. 2004 - V. 53 - N. 7 - P. 1743 - 1753.

118. Mosbacher J., Schoepfer, R., Monyer H., Burnashev N., Seeburg P.H., Ruppersberg J.P. A molecular determinant for submillisecond desensitization in glutamate receptors// Science 1994 - V. 266 - P. 1059-1062.

119. Nakagawa T., Cheng Y., Rannn E., Sheng M., Walz T. Structure and different conformational states of native AMPA receptor complexes// Nature 2005 - V. 433 - P. 545 -549.

120. Nakanishi N., Shneider N.A., Axel R. A family of glutamate receptor genes: evidence for the formation of heteromultimeric receptors with distinct channel properties// Neuron -1990-V. 5 -N. 5 P. 569-581.

121. Nakanishi S, Masu M. Molecular diversity and functions of glutamate receptors.// Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1994 - V. 23 - P. 319 -348.

122. Nakanishi S. Molecular diversity of glutamate receptors and implications for brain function// Science 1992 - V. 258 - N. 5082 - P. 597-603.

123. Nanao M.H., Green T., Stern-Bach Y., Heinemann S.F., Choe S. Structure of the kainite receptor subunit GluR6 agonist-binding domain complex with domoic acid// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005 - V. 102 - N. 5 - P. 1708 - 1713.

124. Naur P., Vestergaard B., Skov L.K., Egebjerg J., Gajhede M., Kastrup J.S. Crystal structure of the kainite receptor GluR5 ligand-binding core in complex with (S)-glutamate// FEBS Lett. 2005 - V. 579 - N. 5 - P. 1154 - 1160.

125. Neyton J. & Miller C. Discrete Ba2+ block as a probe of ion occupancy and pore structure in the high-conductance Ca2+-activated K+ channel//JJen. Physiol. 1988 -V.92 - P. 569 - 586.

126. Nicol R.A., Kauer J.A., Malenka R.C. The current excitement in long-term potentiation// Neuron 1988 -V. 1 - N. 2 - P. 97 - 103.

127. Nishi M., Hinds H., Lu H.P., Kawata M., Hayashi Y. Motoneuron-specific expression of NR3B, a novel NMDA-type glutamate receptor subunit that works in dominant-negative manner//J. Neurosci. 2001 - V. 21 - N. 23 - RC185.

128. Nowak L., Bregestovski P., Ascher P., Herbet A., Prochiantz A. Magnesium gates glutamate-activated channels in mouse central neurons//Nature 1984 - V. 307 - N. 5950 - P. 462-465.

129. O'Brien R. J., Xu D., Petralia R.S., Steward O., Huganir R.L., Worley P. Synaptic clustering of AMPA receptors by extracellular immediate-early gene product Narp// Neuron 1999 - V. 23 - P. 309 - 323.

130. Oswald R.E., Ahmed A., Fenwick M.K., Loh A.P. Structure of glutamate receptors// Curr. Drug. Targets 2007 - V. 8 - P. 573 0 582.

131. Panchenko V.A., Glasser C.R., Mayer M.L. Structural similarities between glutamate receptor channels and K(+) channels examined by scanning mutagenesis.// J. Gen. Physiol. 2001 - V. 117 - P. 345-360.

132. Parsons C.G., Danysz W., Quack G. Glutamate in CNS disorders as target for drug development: an update// Drug News Perspect. 1998 - V. 11 - N. 9 - P. 523 - 569.

133. Parsons C.G., Danysz W., Quack G. Memantine is a clinically well tolerated N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist a review of preclinical data// Neuropharmacol. - 1999 - V. 38 - P. 735 - 767.

134. Passafaro M., Nakagawa T., Sala C., Sheng M. Induction of dendritic spines by an extracellular domain of AMP A receptor subunit GluR2// Nature 2003 - V. 424 - P. 677 - 681.

135. Pei W., Huang Z., Congzhou W., Han Y., Park J.S., Nui L. Flip and flop: a molecular determinant for AMPA receptor channel opening// Biochemistry 2009 - V. 48 - P. 3767 - 3777.

136. Pei W., Ritz M., McCarthy M., Huang Z., Niu L. Receptor occupancy and channel-opening kinetics: a study of GluRl L497Y AMPA receptor // J.Biol.Chem. -2007 V. 282-P. 22731-22736.

137. Qian A & Johnson JW. Channel gating of NMDA receptors. // Physiol Behav. 2002 - V. 77 - P. 577-582.

138. Qian A. & Johnson J.W. Permeant ion effects on external Mg(2+) block of NR1/2D receptors// J. Neurosci. 2006 - V. 26 - N. 42 - P. 10899 - 10910.

139. Ramanoudjame G., Du M., Mankiewicz K.A., Jayaraman V. Allosteric mechanism in AMPA receptors: a FRET-based investigation of conformational changes// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006 - V. 103 -N. 27 - P. 10473 - 10478.

140. Ren H., House Y., Karp B.J., Lipsky R.H., Peoples R.W. A site in the fourth membrane-associated domain of the N-methyl-D-aspartate receptor regulates desensitization and ion channel gating// J. Biol. Chem 2003 - V. 278 - P. 276 - 283.

141. Ritthausen H.J. Prakt. Chem. 1866 - V. 99 - P. 454 - 462.

142. Robert A., Armstrong N., Goiaux J.E., Howe J.R. AMPA receptor binding cleft mutations that alter affinity, efficacy, and recovery from desensitization// J. Neurosci. -2005 V. 25 - N. 15 - P. 3752 - 3762.

143. Rogawski M. Therapeutic potential of excitatory amino acid antagonists: channel blockers and 2,3-benzodiazepines// Trends Pharmacol. Sci. 1993 - V. 14 - P. 325 - 331.

144. Rogawski M.A. Low affinity channel blocking (uncompetitive) NMDA receptor antagonists as therapeutic agents—toward an understanding of their favorable tolerability// Amino Acids. 2000 - V. 19 - P. 133 -49.

145. Rosenmund C., Stern-Bach Y. and Stevens C.F. The tetrameric structure of a glutamate receptor channel// Science 1998 - V. 280 - P. 1596-1599.

146. Rozov A., Zelberter Y., Wollmuth L.P., Burnashev N. Facilitation of currents through rat Ca(2+)-permeable AMPA receptor channels by activity-dependent relief from polyamine block// J. Physiol. 1998 - V. 511 - P. 361 - 377.

147. Sager C., Tapken D., Kott S., Hollmann M. Functional modulation of AMPA receptors by transmembrane AMPA receptor regulatory proteins// Neuroscience 2009 - V. 158 -P. 45-54.

148. Schneggenburger R. Altered voltage dependence of fractional Ca2+ current in N-methyl-D-aspartate channel pore mutants with a decreased Ca2+ permeability// Biophys. J. -1998 -V. 74-P. 1790 1794.

149. Schneggenburger R. Simultaneous measurement of Ca2+ influx and reversal potentials in recombinant N-methyl-D-aspartate receptor channels// Biophys. J. 1996 - V. 70 - P. 2165 -2174.

150. Schorge S. & Colquhoun D. Studies of NMDA receptor function and stoichiometry with truncated and tandem subunits// J. Neurosci. 2003 - V. 23 - N. 4 - P. 1151 - 1158.

151. Seeburg P.H. The molecular biology of mammalian glutamate receptor channels//Trends Neurosci.- 1993 V. 16 - N. 9 - P. 359 - 365.

152. Sharma G. & Stevens C.F. Interactions between two divalent ion binding sites in N-methyl-D-aspartate receptor channels// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 - V. 93 - P. 14170 - 14175.

153. Sheng M. & Kim M.J. Postsynaptic signaling and plasticity mechanisms// Science 2002 - V. 298 - P. 776 - 780.

154. Sheng M. & Pak D.T. Ligand-gated ion channcl interactions with cytoskeletal and signaling proteins// Annu. Rev. Physiol. 2000 - V. 62 - P. 755 - 778.

155. Sobolevsky A., Koshelev S. Two blocking sites of amino-adamantane derivatives in open N-methyl-D-aspartate channels// Biophys J. 1998 - V. 74 -N. 3 - P. 1305-1319.

156. Sobolevsky A.I., Beck C., Wollmuth L.P. Molecular rearrangements of the extracellular vestibule in NMDAR channels during gating//Neuron 2002 - V.33 - P. 75 - 85.

157. Sobolevsky A.I. Two-komponent blocking kinetics of open NMDA channels by organic cations// Biochim Biophys Acta. 1999 - V. 1416 - N. 1-2 - P. 69-91.

158. Sobolevsky A.I., Koshelev S.G., Khodorov B.I. Interaction of memantine and amantadine with agonist-unbound NMDA-receptor channels in acutely isolated rat hippocampal neurons// J. Physiol. 1998 - V. 512 - N. 1 - P. 47-60.

159. Sobolevsky A.I., Koshelev S.G., Khodorov B.I. Probing of NMDA channels with fast blockers//J Neurosci. 1999-V. 19-N. 24-P. 10611-10626.

160. Sobolevsky A.I., Posconi M.P., Gouaux E. X-ray structure, symmetry and mechanism of an AMPA-subtype glutamate receptor// Nature 2009 - V. 462 - P. 745 - 756.

161. Sobolevsky A.I. Yelshansky M.V., Wollmuth L.P. Different gating mechanisms in glutamate receptor and K+ channels.// J. Neurosci -2003 V. 23 - P. 7559-7568.

162. Song I. & Huganir R.L. Regulation of AMPA receptors during synaptic plasticity// Trends Neurosci. 2002 - V. 25 - N. 11 - P. 578 -588.

163. Stern P., Behe P., Schoepfer R., Colquhoun D. Single-channel conductance of NMDA receptors expressed from cloned cDNAs: comparison with native receptors// Proc. R. Soc. Lond. 1992 - V. 250 - P. 271 - 277.

164. Sun Y., Olson R., Horning M., Armstrong N., Mayer M., Gouaux E. Mechanism of glutamate receptor desensitization// Nature 2002 - V. 417 - P. 245 - 253.

165. Sun Y., Rose J., Wang B.C., Hsiao C.D. The structure of glutamine-binding protein complexed with glutamine at 1.94 A resolution: comparison with other amino acid binding proteins// J. Mol. Biol. 1998 - V. 278 - P. 219 - 229.

166. Sutcliffe M.J., Smeeton A.H., Wo Z.G., Oswald R.E. Molecular modeling of ligand-gated ion channels// Method. Enzymol. 1998 - V. 293 - P. 589 - 620.

167. Swanson G.T., Feldmeyer D., Kaneda M., Cull-Candy S.G. Effect of RNA editing and subunit co-assembly single channels properties of recombinant kainite receptors// J. Physiol. 1996 - V. 492 - P. 129 - 142.

168. Swanson G.T., Kamboj S.K., Cull-Candy S.G. Single-channel properties of recombinant AMPA receptors depend on RNA editing, splice variation, and subunit composition. // J. Neurosci. 1997 - V. 17 - N. 1 - P. 58-69.

169. Takemoto T., Koike K., Nakajima T., Arihara S. Studies on the constituents of Quisqualis fructus. III. synthesis of quisqualic acid and the related compounds //Yakugaku Zasshi. 1975 - V. 95 - N. 4 - P. 448 - 452.

170. Tikhonov D.B. Ion channels of glutamate receptors: structural modeling. // Mol. Membr. Biol. 2007 - V. 24 - P.135-147.

171. Tikhonov D.B., Samoilova M.V., Buldakova S.L., Gmiro V.E., Magazanik L.G. Voltage-dependent block of native AMPA receptor channels by dicationic compounds// Br. J. Pharmacol. 2000 - V. 129 - N. 2 - P. 265-274.

172. Tikhonov D.B., Zhorov B.S., Magazanik L.G. Intersegment hydrogen bonds as possible structural determinants of the N/Q/R site in glutamate receptors// Biophys J. 1999 - V. 77 - N. 4 - P. 1914-1926.

173. Toth K. & McBain CJ. Afferent-specific innervations of two distinct AMPA receptor subtypes on single hippocampal interneurons// J. Physiol. 1998 - V. 1 - N. 7 - P. 1-2.

174. Traynelis S.F. & Cull-Candy S.G. Pharmacological properties and H+ sensitivity of excitatory amino acid receptor channels in rat cerebellar granule neurons// J. Physiol. -1991 -V. 433 -P. 727 763.

175. Traynelis S.F. & Wahl P. Control of rat GluR6 glutamate receptor open probability by protein kinase A and calcineurin// J. Physiol. (Lond) 1997 - V. 503 - P. 513 - 531.

176. Ueno Y., Nama H., Ueganagi J., Morimoto H., Nakamori R., Matsuoka T.// J. Pharmac. Soc. Japan. 1955 - V. 75 - P. 807.

177. Villarroel A., Burnashev N., Sakmann B. 1995. Dimensions of the narrow portion of a recombinant NMD A receptor channel.// Biophys. J. 1995 - V. 68 - P. 866-875.

178. Vorobjev V.S. Vibrodissociation of sliced mammalian nervous tissue. // J. Neurosci. Meth. 1991 - V. 68 - P. 303-307.

179. Vorobjev V.S., Sharonova I.N. Tetrahydroaminoacridine blocks and prolongs NMDA receptor mediated responses in a voltage dependent manner// J. Pharmacol. 1994 - V. 253 - P. 1-8.

180. Vorobjev V.S., Sharonova I.N., Haas H. L. A simple perfusion system for patch-clamp studies//J. Neurisci. Methods 1996 - P.303 - 307.

181. Washburn M.S. & Dingledine R. Block of alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors by polyamines and polyamine toxins// J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996 - V. 278 - N. 2 - P. 669-678.

182. Watanabe J., Beck C., Kuner T., Premkumar L., Wollmuth L.P. DRPEER: A motif in the extracellular vestibule conferring high Ca2+ flux rates in NMDA receptor channels// J. Neurosci. 2002 - V. 22 - P. 10209 - 10216.

183. Watkins J.C. & Evans R.H. Excitatory amino acid transmitters//Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1981 - V.21 - P. 165 - 204.

184. Watkins J.C. The synthesis of some acidic amino acids possessing neuropharmacological activity// J. Med. Pharm. Chem. 1962 - V. 91 - P. 1187 - 99.

185. Weston M.C., Gertler C., Mayer M.L., Rosenmund C. Interdomain interactions in AMPA and kainite receptors regulate affinity for glutamate// J. Neurosci. 2006 - V. 26 - N. 29 -P. 7650 - 7658.

186. Wo Z.G. & Oswald R.E. Transmembrane topology of two kainate receptor subunits revealed by N-glycosylation// Proc. Nat. I. Acad. Sci. USA. 1994 - V. 91 - N. 15 - P. 7154-7158.

187. Wollmuth L.P. & Sakmann B. Different mechanisms of Ca2+ transport in NMDA and Ca2+-penneable AMPA glutamate receptor channels. // J. Gen. Physiol. 1998 - V. 112 -P. 623-636.

188. Wollmuth L.P., Kuner T., Sakmann B. Adjacent asparagines in the NR2-subunit of the NMDA receptor channel control the voltage-dependent block by extracellular Mg2+// J. Physiol. 1998 - V. 506 - P. 13-32.

189. Wollmuth LP & Sobolevsky AI. Structure and gating of the glutamate receptor ion channel.// Trends Neurosci. 2004 -V.21 - P. 321-328.

190. Wollmuth LP, Kuner T, Seeburg PH, Sakmann B. Differential contribution of the NR1-and NR2A-subunits to the selectivity filter of recombinant NMDA receptor channels.// J. Physiol. 1996 - V. 491 - P. 779-797.

191. Wong A.Y., Fay A.M., Bowie D. External ions are coactivators of kainite receptors// J. Neurosci. 2006 - V. 26 - P. 5750 - 5755.

192. Wood M.W., VanDongen H.M.A., VanDongen A.M.J. Structural conservation of ion conduction pathways in K channel and glutamate receptors// Proc. Nat. I. Acad. Sci. USA. 1995 - V. 92 - P. 4882-4886.

193. Woodhull A.M. Ionic blockage of sodium channels in nerve// J Gen Physiol. 1973 - V. 61 -N. 6-P. 687-708.

194. Woolf C.J. & Salter M.W. Neuronal plasticity: increasing the gain in pain. // Science -2000-V. 288 -P. 1765-1769.

195. Wright J. M. & Nowak L.M. Effects of low doses of bicuculline on N-methyl-D-aspartate single-channel kinetics are not evident in whole-cell currents// Mol. Pharmacol. 1992 -V. 41 - P. 900-907.

196. Wyllie D.J., Behe P., Colquhoun D. Single-channel activations and concentration jumps: comparison of recombinant NRla/NR2A and NRla/NR2D NMDA receptors// J. Physiol.- 1998 -V. 510-P. 1-18.

197. Yellen G. The voltage-gated potassium channels and their relatives// Nature 2002 - V. 419-P. 35 -42.

198. Yelshansky M. V., Sobolevsky A.I., Jatzke C., Wolmuth L.P. Block of AMPA receptor desensitization by point mutation outside the ligand-binding domain// J. Neurosci. 2004- V.24-N. 20 P. 4728 - 4736.

199. Zarei M.M. & Dani J.A. Ionic permeability characteristics of N-methyl-D-aspartate receptor channel// J. Gen. Physiol. 1994 - V. 103 - N. 2 - P. 231 - 248.

200. Zheng F., Erreger K., Low C., Banke T., Lcc C.J., Conn P.J., Traynelis S.F. Allosteric interaction between the amino terminal domain and ligand binding domain of NR2A// Nat. Neurosci. 2001 - V. 4 - P. 894 - 901.

201. Zhu Y. & Auerbach A. K(+) occupancy of the N-methyl-d-aspartatc receptor channel probed by Mg(2+) block// J. Gen. Physiol. 2001 - V. 117 - N. 3 - P. 287 - 298.

202. Zhu Y. & Auerbach A. Na(+) occupancy and Mg(2+) block of the N-methyl-d-aspartatc receptor channel // J. Gen. Physiol. 2001 - V. 117 - N. 3 - P. 275 - 286.