Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы блокады NMDA и АМРА рецепторов трициклическими соединениями

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы блокады NMDA и АМРА рецепторов трициклическими соединениями"

На правах рукописи

БАРЫГИН Олег Игоревич

МЕХАНИЗМЫ БЛОКАДЫ ^БА И АМРА РЕЦЕПТОРОВ ТРИЦИКЛИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ

03.03.01 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 4 М!910

Санкт-Петербург 2010

003493619

Работа выполнена в лаборатории биофизики синаптических процессов Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущее научное учреждение:

доктор биологических наук Тихонов Денис Борисович

доктор биологических наук Кривой Игорь Ильич

доктор биологических наук Антонов Сергей Михайлович

Учреждение Российской академии наук Институт биофизики клетки РАН

Защита диссертации состоится «9 марта» 2010 года в 11 часов на заседании диссертационного совета (Д 002.127.01) при Учреждении Российской академии наук Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44).

Автореферат разослан «_£__» 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор 1.Н. Маслова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Глутамат - это наиболее распространенный возбуждающий медиатор в центральной нервной системе позвоночных животных (Curtis et al., 1959). Свое быстрое постсинаптическое действие он опосредует через ионотропные глутаматные рецепторы, принадлежащие к суперсемейству лиганд-управляемых ионных каналов (Dingledine et al., 1999).

Чрезмерная активация ионотропных глутаматных рецепторов вовлечена во многие патологические состояния (Lipton & Rosenberg, 1994). К их числу относятся, например, болезни Паркинсона (Johnson et al., 2009) и Альцгеймера (Koutsilieri & Riederer, 2007), глаукома (Seki & Lipton, 2008). При шизофрении, напротив, наблюдается пониженная активность NMDA рецепторов (Stone, 2009). К настоящему моменту известно множество блокаторов этих ионных каналов, однако их применение в клинической практике затруднено из-за серьезных побочных эффектов у большинства соединений. Действие каналоблокаторов характеризуется не только величиной активности, но и рядом особенностей механизма взаимодействия с каналом-мишенью и внешними условиями, такими как ионный состав, pH среды, потенциал на мембране (Hille, 2001). Соответственно и поиск клинически толерантных препаратов отнюдь не сводится к поиску наиболее активных соединений. Например, единственный используемый в клинике блокатор NMDA рецепторов мемантин наиболее активным не является. Считается, что клиническая толерантность мемантина определяется такими особенностями его механизма действия, как быстрая кинетика и частичная ловушка (Chen & Lipton, 2006).

Известно, что блокада NMDA рецепторов 9-аминоакридином (9АА) осуществляется по механизму «foot-in-the-door». Закрытие ионного канала в этом случае может происходить только после диссоциации блокатора. К настоящему моменту остается до конца не выясненным вопрос о структурных детерминантах, определяющих такой характер взаимодействия 9АА с воротным механизмом NMDA рецепторов. Недавно было показано, что 9АА и его трициклические производные способны блокировать не только NMDA, но и АМРА рецепторы (Ким и др., 2007). При этом не наблюдались структурно-функциональные отношения, характерные для классических блокаторов АМРА рецепторов (Bolshakov et al., 2005). В работе было проведено подробное исследование механизмов действия 9АА и ряда его трициклических производных на АМРА и NMDA рецепторы.

Такое исследование представляется важным сразу с нескольких сторон. Во-первых, блокаторы являются ценным инструментом для исследования структуры и механизмов функционирования каналов-мишеней. Так, из сопоставления структурно-функциональных отношений в рядах блокаторов можно получить детальные сведения о строении участков их связывания в канале. Во-вторых, применение каналоблокаторов позволяет выявить роль конкретных каналов в различных процессах. Если же действие блокатора зависит от внешних условий, то его использование дает возможность определить те физиологические или патологические процессы, при которых эти условия реализуются. И, наконец, выявление фундаментальных связей между молекулярными механизмами блокады каналов и действием блокаторов в физиологических и патологических условиях может позволить предложить соединения-прототипы, которые наиболее перспективны для дальнейшей работы по созданию нейропротекторов.

Цель исследования. Изучить механизм действия трициклических соединений на ионотропные глутаматные рецепторы И\ГОА и АМРА подтипов.

Конкретные задачи исследования.

1. Разработать набор критериев, позволяющий определить характер взаимодействия блокаторов с воротным механизмом ЫМП)А рецепторов.

2. Выявить структурные детерминанты, определяющие принадлежность 9АА к «й>о\-т-&е-(1оог» блокаторам Ь'МЭА рецепторов.

3. Исследовать зависимость блокирующего действия трициклических соединений на Са2+-проницаемые и Са2+-непроницаемые АМРА рецепторы от потенциала.

4. Сравнить действие трициклических соединений на АМРА и ИМЛА рецепторы.

Научная новизна. В работе впервые был подробно проанализирован механизм действия ряда трициклических соединений, производных 9АА, на ИМБА рецепторы. Систематический анализ влияния внесенных в структуру исходной молекулы изменений на механизм действия позволил выявить одну из ключевых детерминант, определяющих принадлежность 9АА к группе «¡оойп-Ше-скюг» блокаторов. Было показано, что трициклические производные с плоской трехмерной структурой сохраняют «йэоЫп-Ле-скгаг» механизм действия 9АА, в то время как вещества с «V-образной» структурой начинают проявлять ловушку.

Также в работе было впервые показано, что 9АА и его производные с плоской трехмерной структурой взаимодействуют с особым сайтом в АМРА рецепторах. Блокирующее действие этих соединений носило потенциал-независимый характер и развивалось в отсутствие агониста, что отличает их от классических потециал-зависимых блокаторов открытого канала - дикатионных производных адамантана и фенилциклогексила. Еще одним отличием от классических блокаторов явилось отсутствие выраженной избирательности по отношению к Са2+ -проницаемым АМРА рецепторам.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. При блокаде Ы\ГОА рецепторов одной из ключевых детерминант «йэоЫп-Ле-скгаг» механизма действия 9АА является его плоская трехмерная структура.

2. Трициклические соединения с плоской структурой связываются с особым сайтом в АМРА рецепторах.

3. Сайт расположен вне поры канала и устроен похожим образом в Са2+ -проницаемых и Са2+-непроницаемых АМРА рецепторах. Для связывания антагонистов с этим сайтом открытие канала не требуется.

Теоретическая и практическая значимость. Одним из следствий «йэоЯп-Ле-сЬог» механизма действия является то, что активность таких блокаторов усиливается при увеличении концентрации агониста. То есть такие вещества могут более эффективно блокировать синаптическую передачу в патологических условиях, чем в нормальных. К сожалению, этот потенциально интересный эффект не может быть использован, поскольку 9АА обладает анти-холинэстеразным и мутагенным действием. Другие активные блокаторы КМОА рецепторов, действующие подобно 9АА, в настоящее время не известны. Мы показали, что одной из ключевых детерминант «ГооЫп-Ше-с1оог» механизма действия этого вещества является его плоская трехмерная структура. В дальнейшем это открытие может позволить направленно синтезировать новые «ЙюЬ т-йе-сЬог» блокаторы этих ионных каналов.

При исследовании действия 9АА и его производных на АМРА рецепторы было показано, что они связываются со специфическим сайтом. Обнаружение нового класса антагонистов, имеющих механизм действия, отличающийся от описанных ранее, имеет большое значение для физиологических исследований и может способствовать появлению клинически перспективных препаратов. Антагонисты, действие которых не

зависит от потенциала на мембране имеют то преимущество для защиты нейронов от повреждающего действия глутамата, что их эффект не ослабляется в том случае, когда нейрон деполяризован.

Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на 11-й и 12-й Всероссийских медико-биологических конференциях молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2008 и 2009), 11-й и 12-й Путинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - Наука XXI века» (Пущино, 2007 и 2008), Международной школе «Contemporary problems of neurobiology: molecular mechanisms of synaptic plasticity» (Казань, 2007) и Международной научной конференции «Ионные каналы: структура и функции» (Санкт-Петербург, 2009)

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи в реферируемых журналах и тезисы 6 докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 130 источников. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста, иллюстрирована 4 таблицами и 35 рисунками.

Методы исследования. Крыс линии Вистар (возраст 13-18 дней) декапитировали под уретановым наркозом. Мозг быстро извлекали и охлаждали до 2 - 4°С. Затем на вибратоме "Campden Instruments" (Великобритания) приготавливали поперечные срезы стриатума и гиппокампа толщиной 250 мкм, которые сохраняли в растворе (мМ): NaCl - 124, КС1 - 5, СаСЬ - 1.3, MgCl2 - 2, NaHCOj - 26, NaH2P04 - 1.24, D-ггаокоза - 10. Раствор аэрировали карбогеном (95% 02, 5% СОг), рН 7.4-7.5, при 24-26°С. Нейроны, экспрессирующие определенный вид глутаматных рецепторов, изолировали из срезов методом вибродиссоциации (Vorobjev, 1991) не ранее двух часов с момента их приготовления. Для исследования NMDA-каналов и Са2+-непроницаемых АМРА-рецепторов выбирали пирамидные нейроны, выделенные из поля СА1 гиппокампа, а для исследования Са2+-проницаемых АМРА-рецепторов - гигантские интернейроны стриатума. Для идентификации нейронов использовали морфологический и фармакологический критерии.

Регистрацию трансмембранных токов осуществляли методом локальной фиксации потенциала. Микропипетку заполняли раствором (мМ): CsF - 100, CsCl - 40, NaCl - 5, СаСЬ - 0.5, EGTA - 5, HEPES - 10 (рН доводили до 7.2 с помощью CsOH). Внеклеточный раствор содержал (мМ): NaCl - 143, КС1 - 5, СаСЬ - 2.5, D-глюкоза - 18,

HEPES - 10 (pH доводили до 7.4, добавляя HCl). При исследовании АМРА-рецепторов во внеклеточный раствор добавляли MgCb в концентрации 2 мМ. Рецепторы активировали аппликацией соответствующих агонистов глутамата: NMDA-рецепторы -NMDA (40 мкМ) в присутствии глицина (10 мкМ); АМРА-рецепторы - каипатом (100 мкМ). Для аппликации применяли систему быстрой замены растворов (Vorobjev et al., 1996). При изучении механизмов блокады АМРА рецепторов использовалась 8-канальная система быстрой замены растворов с электромагнитными клапанами и шаговым двигателем RSC-200 "BioLogic" (Франция). Время смены растворов составляет для этих систем примерно 10-15 мс. Регистрацию проводили в конфигурации "целая клетка" с помощью усилителя ЕРС-8 "НЕКА Elektronik" (Германия). Контроль мембранного потенциала, управление системой аппликации, регистрацию и анализ данных осуществляли с помощью компьютера. Использовались реактивы фирм "Sigma" (США), "Tocris" (США) и "BioVectra" (Канада). Трициклические производные 9АА были синтезированы в Институте Экспериментальной Медицины РАМН. Статистическая обработка проводилась с использованием программы Microcal(TM) Origin 6.0. Все результаты представлены как среднее ± стандартное отклонение в серии как минимум четырех экспериментов. Для определения значений ИК50 использовали уравнение: В = 100/(1+(С/ИК50)"),

где В - процент блокады, С - концентрация блокатора, ИК50 - концентрация блокатора, вызывающая 50% угнетение ответов, п - коэффициент Хилла.

Анализ потенциал-зависимости проводился с помощью формулы Вудхол (Woodhull, 1973) для непроникающих через канал частиц:

В = 100/(l+HK5o(0)*exp(VFz8/R/T)/C), где В - процент блокады, ИК5о(0) - расчетное значение ИК50, которая наблюдалась бы при потенциале 0 мВ, V - потенциал фиксации, z - заряд блокатора, 6 - доля падения потенциала в мембране, соответствующая глубине нахождения участка связывания блокатора, С - концентрация блокатора. R, Т и F имеют свои стандартные значения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Блокада NMDA рецепторов трициклическими соединениями.

Кинетическая схема блокады. Одной из важных особенностей механизма действия блокатора служит наличие или отсутствие эффекта ловушки. Наиболее общая схема блокады открытого канала может быть представлена следующим образом:

RD2A kalk,

kf 2kf ß 2A + R <-» A + RA <-► R2A«-» R*2A + В

кь 2кь а

k.Jk+ k-I k+ Схема 1

2kf kf a'

2A + RB <-> А + RAB R2AB <-> R*2AB kb 2kb P'

kdlkr

RDB2A

Здесь А - молекула агониста, R, R* и RD обозначают соответственно закрытое, открытое и десенситизированное состояния рецептора, В - молекула блокатора. Прямая и обратная константы скоростей связывания агониста обозначены соответственно как kf и кь; константы скоростей открытия и закрытия канала обозначены, соответственно, как ß и a; к+ и к. - константы скоростей ассоциации и диссоциации блокатора; kj и kr - константы скоростей десенситизации и выхода из десенситизированного состояния. Ловушкой называется ситуация, когда блокатор способен оставаться в закрытом канале, то есть возможно состояние RB. Диссоциация блокатора из ловушки, как правило, возможна только после повторной активации канала. В случае а'=0, канал не может закрыться в присутствии блокатора («foot-in-the-door»).

Следует отметить, что к настоящему моменту не существует универсального критерия, позволяющего однозначно определить механизм действия блокатора. Это связано с тем, что для веществ с разной кинетикой информативными оказываются разные протоколы. Для веществ с быстрой кинетикой действия «foot-in-the-door» механизм можно выявить по характеру переходных процессов, возникающих после окончания совместной аппликации агониста и блокатора. Для веществ с медленной кинетикой можно выявить ловушку в протоколе «последовательных аппликаций».

Для анализа структурных детерминант ловушки в Ы,\ЮЛ рецепторах был использован ряд трициклических соединений - производных классического «/ооЫп-Ле-(1оог» блокатора 9АА. Структурные формулы изучавшихся соединений приведены в таблице 1, а количественные характеристики блокирующего действия - в таблице 2.

Таблица 1. Химические формулы использованных в работе соединений.

1.9АА 2. ИЭМ-2120 М*НГ(СН2),-М*Н3

3. ИЭМ-2115 4. ИЭМ-2116

5. ИЭМ-2117 6. ИЭМ-2118 ^Н2-(СН2)5-М'Ме3

7. ИЭМ-1921 ы*н3 8. ИЭМ-1925 СХр^ М»Н2-(СН2)5-М>Н3

9. Гакрин Ос^О М*Н3 10. ИЭМ-2129 ссч0 Ы*И2Ме

11. ИЭМ-2130 М%Е1 12. ИЭМ-2128

Механизм действия производных 9АА с алкнльными заместителями у аминогруппы.

В экспериментах с 9АА мы наблюдали классические признаки «РэоЫп-Ле-сЪог» блокады: хвостовой ток при отмыве в отсутствие агониста (рис. 1А) и овершут при отмыве в его присутствии (рис. 1Б). ИЭМ-2129, ИЭМ-2130 и ИЭМ-2128 отличаются от

9АА наличием алкильных заместителей при аминогруппе. У ИЭМ-2129 этот заместитель метальный, у ИЭМ-2130 - этильный, а у ИЭМ-2128 - диэтильный. Активность этих веществ оказалась в 2-3 раза ниже, чем у 9АА.

алкильными заместителями у аминогруппы. А. Хвостовой ток при действии 9АА. Б. Овершут при действии 9АА. В. Хвостовой ток при действии ИЭМ-2129. Г. Овершут при действии ИЭМ-2129. Д. Хвостовой ток при действии ИЭМ-2130. Е. Отсутствие кумулятивного блока при действии ИЭМ-2128 в протоколе «последовательных аппликаций».

Кинетика отмыва ИЭМ-2129 (т =90 ± 20 мс) была даже чуть быстрее, чем у 9АА (т = 140 ± 20 мс). Сохранились и все признаки механизма действия исходного соединения: хвостовой ток (рис. 1В) и овершут (рис. 1Г). У ИЭМ-2130 кинетика уже была заметно медленнее (т = 650 ± 90 мс). Овершут при отмыве в присутствии агониста не наблюдался. Но наличие хвостового тока позволило сделать вывод, что ИЭМ-2130 также является «йзоНп-Шечкюг» блокатором (рис. 1Д). Действие ИЭМ-2128 было еще медленнее (т = 2600 ± 800 мс). Сооответственно, хвостовой ток и овершут отсутствовали. И для определения механизма действия потребовался протокол «последовательных аппликаций» (рис. 1Е). Развитие блокады наблюдалось в обеих аппликациях ИЭМ-2128, а форма ответа в тестирующей аппликации агониста не

отличалась от контроля. Это признаки «foot-in-the-door» блокаторов. Можно заключить, что добавление алкильных заместителей к структуре 9АА повлияло на активность и кинетику, но не привело к изменению механизма действия веществ.

Механизм действия производных 9АА с измененной структурой центрального цикла.

ИЭМ-2117 обладает 5-членным центральным циклом. В экспериментах с этим блокатором не наблюдались ни овершут, ни хвостовой ток. Из протокола «последовательных аппликаций» (рис. 2А) видно, что развитие блокады происходило как при первой, так и при второй аппликации ИЭМ-2117. Также видно, что форма ответов на контрольную и тестирующую аппликацию блокатора была одинаковой. Это позволило нам сделать вывод, что ИЭМ-2117 является «foot-in-the-door» блокатором.

ИЭМ-2115 - это другое вещество с измененной структурной центрального цикла. В этом случае атом азота также отсутствует, а сам цикл 7-членный. Из-за медленной кинетики диссоциации ИЭМ-2115 для определения механизма действия снова был использован протокол «последовательных аппликаций». Однако в этом случае мы увидели классическую феноменологию блокатора, способного оставаться в ловушке. Развитие блокады было заметно только при первой аппликации ИЭМ-2115 (10 ± 3% блокады пика). В начале второй уже наблюдалась существенная блокада (65 ± 5%). А при тестирующей аппликации агониста мы видели постепенный рост тока. Таким образом, ИЭМ 2115 является блокатором, способным оставаться в ловушке.

структурой центрального цикла. Протокол «последовательных аппликаций» для ИЭМ-2117 (А) и ИЭМ-2115 (Б).

Таблица 2. Количественные характеристики блокады КМОА рецепторов трициклическими соединениями.

Бпокатор ик50 мкМ Отмыв Протокол «последовательных аппликаций» Хвостовой ток Ловушка

Блок1 мкМ/% Кинетика6 мс Овершут Блок* мкМ/% Iй пикг (%) 2й пик" (%) отмыв6 (%) Блок' мкМ/% Ампл.в Рост МС Спад мс

Ампл." Спад мс

9АА 15 ± 2 200/>90 140 ±20 1.5±0.3 1230±210 30 / 72±7 65±4 67±6 4±3 50 /87±5 0.5±0.15 54±13 550±170 НЕТ

ИЭМ- 25 ±4 250 / >90 380 ±60 НЕТ НЕТ 50 / 66±10 26±4 20±3 3±2 100 / 81±8 НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ

2117

ИЭМ- 3± 1 40/>90 2500 ±600 НЕТ НЕТ 8/71 ±6 10±3 65±5 64±7 10 / 77±5 НЕТ НЕТ НЕТ ДА

2115

ИЭМ- 40 ±2 400/>90 90 ±20 1.6±0.3 240±60 75/66 ±8 78±5 78±6 5±2 100 / 79±10 1.3±0.2 16±8 62±18 НЕТ

2129

ИЭМ- 42 ±3 400/>90 650 ±90 НЕТ НЕТ 75 / 66±6 62±6 60±4 4±2 100 / 74±7 0.7±0.2 15±7 100±30 НЕТ

2130

ИЭМ- 28 ±2 200/>90 2600 ± 800 НЕТ НЕТ 50 / 65±7 9±4 14±6 5±3 100 / 87±6 НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ

2128

Признаки, имеющие решающее значение при определении механизма действия, показаны жирным шрифтом.

а - в колонке указана использованная концентрация блокатора и процент блокады стационарного тока б - взвешенная постоянная времени двухэкспоненциальной аппроксимации в - амплитуда относительно стационарного уровня контрольного ответа г - ингибирование пика ответа при первой коаппликации блокатора и ЫМОА д -ингибирование пика ответа при второй коаппликации блокатора и КМ ПА е - ингибирование пика ответа при тестирующей аппликации КМОА

При взгляде на химические структуры блокаторов причина разницы в механизме действия 9АА, ИЭМ-2117 и ИЭМ-2115 совершенно не очевидна. Это три монокатионных трициклических соединения, но 9АА и ИЭМ-2117 имеют «ГооЫп-Ле-с!оог» механизм действия, а ИЭМ-2115 проявляет ловушку. Для разрешения этого парадокса мы попробовали посмотреть на трехмерные структуры этих соединений, рассчитанные методом молекулярной механики. Мы обнаружили, что 9АА и ИЭМ-2117 не превосходят по размерам ИЭМ-2115. Но оказалось, что и 9АА, и ИЭМ-2117 обладают плоской структурой сопряженных ароматических циклов. А 7-членное кольцо ИЭМ-2115 подобную плоскую организацию нарушает (рис. 3). Это связано с появлением в структуре центрального цикла двух эрЗ-гибридизованных атомов углерода. В результате структура ИЭМ-2115 становится «У-образной» и приобретает заметное сходство с классическими ловушковыми блокаторами КМБА рецепторов, например, МК-801. Следует отметить, что добавление апкильных заместителей к аминогруппе 9АА (ИЭМ-2129, ИЭМ-2130, ИЭМ-2128) не вызывает нарушения плоской структуры трициклнческой группировки. Соответственно, добавление этих заместителей приводило к изменению активности и кинетики действия веществ, но не меняло механизма денемвия. Таким образом, можно сделать вывод, что плоская ароматическая структура является одной из основных детерминант «/оо(-т-Ле-йоог» механизма действия 9АА.

Рисунок 3. Трехмерные структуры блокаторов. Пространственное строение ИЭМ-2115 похоже на строение МК-801, классического блокатора НМБА рецепторов проявляющего ловушку. Оба имеют «У-образную» структуру с ароматическими «крыльями» и аминогруппой на вершине. ИЭМ-2117, как и 9АА, имеет плоп-пто структуру.

1ЕМ-2115

1ЕМ-2117

МК-801

т

V

9-АА

Блокада АМРА рецепторов трициклическими соединениями.

АМРА рецепторы являются близкими родственниками КМБА рецепторов. При исследовании действия трициклических соединений на КМБА рецепторы мы обнаружили серьезные различия в механизмах блокады между веществами с плоской и «У-образной» структурой. Была поставлена задача сравнить механизмы действия плоских и «У-образных» веществ на Са -проницаемые и Са2+ -непроницаемые АМРА рецепторы.

Активность и потенциал-зависимость действия трициклических соединений.

А 10. I о,,-0,01 "Плоские 2+ Са -проницаемые АМРА рецепторы HI. 1 5 2 6 3 7 4 8 ' MOHO- ди- "V" MOHO- ди- г- 2+ D 12-, Са -проницаемые АМРА рецепторы ш 1 5 2 6 3 7 4 8 "Плоские" моно- ди- "V" моно- ди-

В ю ¡és 0.1 0,01-"Плоские 2+ Са -непроницаемые АМРА рецепторы mil 1 5 2 6 3 7 4 8 ' moho- ди- "V" moho- ди- г 2+ | 12пСа -непроницаемые АМРА рецепторы LJ 1 5 2 6 3 7 4 8 "Плоские" моно- ди- "V" моно- ди-

Рисунок 4. Активности (А, В) и потенциал-зависимости (Б, Г) блокады Са2+-проницаемых (А, Б) и Са2+-непроницаемых (В, Г) АМРА рецепторов. Номера соединений соответствуют номерам в таблице 1.

На диаграммах вещества разбиты на 4 группы: плоские монокатионы, плоские дикатионы, «У-образные» монокатионы и «У-образные» дикатионы. 4 диаграммы

иллюстрируют полученные значения ИК5о(0) и гб для Са2+-проницаемых (А, Б) и Са2+-непроницаемых (В, Г) рецепторов. Из рисунка 4А видно, что максимальной активностью по отношению к Са2+ -проницаемым рецепторам обладают «У-образные» дикатионы ИЭМ-2116 и ИЭМ-1925. Для Са2+-непроницаемых рецепторов (рис. 4Б) ситуация оказалась качественно иной. Ни одно из веществ не обладало ИК5о(0) в диапазоне десятков мкМ, и активность веществ из разных групп не настолько сильно отличалась друг от друга.

Диаграммы 4В и 4Г отражают полученные значения г8 для Са2+-проницаемых и Са2+ -непроницаемых рецепторов. Наибольшие значения г8 демонстрировали на обоих типах рецепторов «У-образные» дикатионы ИЭМ-2116 и ИЭМ-1925. Напротив, действие плоских монокатионов 9АА и ИЭМ-2117, а также плоского дикатиона ИЭМ-2120, практически не зависело от потенциала (гб около 0.1). Для остальных веществ наблюдались промежуточные значения г5, причем для Са2+ -проницаемых рецепторов они были выше, чем для Са2+-непроницаемых рецепторов.

Полученные данные позволяют сделать вывод о существовании как минимум двух сайтов в АМРА рецепторах. Связывание с глубоким сайтом приводит к потенциал-зависимому блоку открытого канала с ловушкой, механизмы которого были подробно описаны ранее (Magazanik е! а1, 1997; ВоЫшко\> е1 а1., 2005). Присутствие в АМРА рецепторах поверхностного сайта описано впервые. В дальнейшем мы попробовали охарактеризовать механизмы, определяющие взаимодействие с этим сайтом.

Механизм действия веществ с плоской трехмерной структурой.

Чтобы определить, является ли открытие канала необходимым для связывания веществ с плоской трехмерной структурой, мы сравнили эффекты, которые возникают при преаппликации ИЭМ-2117 (1.5 мМ) без агониста и совместной аппликации ИЭМ-2117 и каината на Са2+-непроницаемых АМРА рецепторах. Примеры токов приведены на рисунке 5А. Ингибирование ответа происходило и в случае преаппликации ИЭМ-2117, и в случае совместной аппликации. Стоит отметить практически одинаковую кинетику медленной фазы отмыва. Похожие результаты были получены нами в экспериментах на Са2+ -проницаемых АМРА рецепторах. Основньм отличием в действии на 2 типа рецепторов оказалась более быстрая кинетика во втором случае. Мы показали, что, в отличие от блокаторов с «У-образной» трехмерной структурой, для развития эффекта ИЭМ-2117 присутствие агониста не является необходимым.

Естественно, на следующем этапе мы попробовали определить, может ли происходить отмыв ИЭМ-2117 в отсутствие агониста. Оказалось, что восстановление амплитуды ответа происходило и в присутствии (рис. 5В, кривая 1) и в отсутствие каината (рис. 5В, кривые 2 и 3). Не отличалась даже скорость отмыва ИЭМ-2117: амплитуда тока после односекундной (кривая 2) или трехсекундной (кривая 3) паузы в общем растворе быстро достигала того же уровня, что и при отмыве в постоянном присутствии каината. Таким образом, ИЭМ-2117 не способен оставаться в ловушке в закрытых каналах АМРА рецепторов.

на Са2+-непроницаемые (А) и Са2+-проницаемые (Б) рецепторы. В. Отмыв ИЭМ-2117 в отсутствие и в присутствии агониста. Г. Конкуренция между ИЭМ-2117 (1.5 мМ) и 9АА (1.5 мМ).

Чтобы определить, связывается ли быстрый потенциал-независимый блокатор 9АА с тем же сайтом, что и медленный потенциал-независимый блокатор ИЭМ-2117, мы использовали эксперименты на конкуренцию. Присутствие медленной компоненты при отмыве смеси блокаторов в присутствии каината может служить свидетельством

того, что значительная часть каналов заблокирована ИЭМ-2117. Мы обнаружили (рис. 5Г), что после совместной аппликации 9АА и ИЭМ-2117 (кривая 3) каинатный ответ восстанавливался также быстро, как после аппликации одного 9АА (кривая I). Из этого следует, что в присутствии избыточной концентрации 9АА связывания ИЭМ-2117 не происходит, т.е. блокаторы конкурируют за один и тот же участок связывания.

Взаимосвязь между связыванием потенциал-зависимых и потенциал-независимых блокаторов.

Нам удалось показать, что существуют как минимум два сайта связывания неконкурентных антагонистов АМРА рецепторов: глубокий и поверхностный. Для связывания блокаторов с глубоким сайтом необходимо предварительное открытие канала, связывание с поверхностным сайтом этого не требует. Но является ли связывание антагонистов с этими сайтами независимым? Чтобы ответить на этот вопрос мы исследовали влияние быстрого потенциал-независимого блокатора 9АА на действие медленного потенциал-зависимого блокатора ИЭМ-1925. Эксперименты проводились на Са2+-проницаемых АМРА рецепторах, что позволило использовать более низкие концентрации блокаторов. Концентрация быстрого блокатора 9АА (1.5 мМ, примерно 6 ИК50) снова была значительно эффективнее, чем концентрация медленного блокатора ИЭМ-1925 (1.5 мкМ, примерно ИК50).

ИЭМ-1925 из сайта связывания. Б. 9АА замедляет отмыв ИЭМ-1925.

Кривая 1 рисунка 6А демонстрирует медленный процесс отмыва блокатора ИЭМ-1925 (1.5 мкМ) в присутствии каината. Т составила 4.8 ± 0.8 с. Кривая 2 иллюстрирует отмыв смеси блокаторов 9АА и ИЭМ-1925. Видно, что медленная фаза отмыва сохраняется, однако ее амплитуда достоверна снижена по сравнению с экспериментом 1 (на 40 ± 10%). Бросается в глаза отличие от эксперимента с отмывом смеси блокаторов 9АА и ИЭМ-2117 (рис. 5Г), где медленная фаза отмыва ИЭМ-2117 в присутствии 9АА исчезала полностью. В эксперименте 3 мы сначала регистрировали ответ на совместную аппликацию ИЭМ-1925 и 9АА, наблюдалась практически полная блокада каинатного ответа. После чего мы убрали 9АА из раствора и наблюдали доразвитие блока ИЭМ-1925 до уровня в эксперименте 1. Поскольку ИЭМ-1925 постоянно находился в растворе, такое доразвитие блока можно объяснить только частичным отмывом ИЭМ-1925 в присутствии 9АА. Эти результаты позволяют сделать вывод, что связывание антагонистов с глубоким и поверхностным сайтами в AMP А рецепторах независимым не является.

Но что же лежит в основе взаимодействия между медленным потенциал-зависимым блокатором ИЭМ-1925 и быстрым потенциал-независимым блокатором 9АА? Прямая конкуренция выглядит не слишком правдоподобно из-за разницы в механизме действия. Одной из гипотез может быть аллостерический эффект, в результате которого при связывании 9АА снижается сродство ИЭМ-1925 к каналу. Если бы такое снижение сродства действительно происходило, ожидалось бы увеличение скорости отмыва ИЭМ-1925 в присутствии 9АА. Для проверки этой гипотезы и был проведен следующий эксперимент (рис. 6Б). Мы сравнили кинетику восстановления ответа после блокады ИЭМ-1925 (1.5 мкМ) в отсутствие (кривая 1) и в присутствии (кривые 2-4) 1.5 мМ 9АА. Время аппликации 9АА было равно 2, 5 и 10 секунд в экспериментах 2, 3 и 4, соответственно. Точки перегиба между быстрой и медленной фазами восстановления ответа на этих трех кривых отражают сохранившийся уровень блокады ИЭМ-1925. Очевидно, что аппликация 9АА во время отмыва ИЭМ-1925 в присутствии каината замедляет восстановление амплитуды ответа. В отсутствие 9АА т была равна 4.8 ± 0.8 с, а оценка по 3 точкам в присутствии 9АА дала значение 18 ± 2 с. Таким образом, замедление отмыва ИЭМ-1925 в присутствии 9АА свидетельствует против простой гипотезы об аллостерическом эффекте связывания 9АА на сродство ИЭМ-1925 к каналу.

Рисунок 7. Схема

расположения сайтов

связывания потенциал-

зависимых (1) и потенциал-независимых (2) блокаторов в АМРА рецепторах.

Полученные результаты позволили нам предложить следующую схему расположения сайтов связывания в канале АМРА рецепторов (рис. 7). Вероятно, потенциал-независимые блокаторы связываются в наружном вестибюле канала вне мембраны. Такое поверхностное расположение сайта связывания (выше, чем активационные ворота канала) приводит к отсутствию зависимости связывания и диссоциации блокатора от присутствия агониста. Близость глубокого и поверхностного сайта друг к другу объясняет эффект неполной конкуренции между блокаторами разных типов. Действительно, связывание ИЭМ-1925 только уменьшается, а не исчезает, в присутствии высокой концентрации 9АА, что говорит об отсутствии стерического перекрывания между двумя сайтами. С другой стороны, положительно заряженные лиганды, связывающиеся с близко расположенными сайтами, должны вытеснять друг друга, и связывание одного будет приводить к снижению связывания другого. Предложенная схема расположения сайтов связывания способна объяснить и обнаруженное нами в эксперименте (рис. 6Б) замедление отмыва ИЭМ-1925 в присутствии 9АА. В самом деле, при связывании 9АА с поверхностньм сайтом выход ИЭМ-1925 из глубокого сайта наружу становится затрудненным. Таким образом, связывание потенциал-независимого блокатора с поверхностным сайтом приводит к «запиранию» потенциал-зависимого блокатора внутри канала. Аналогичный эффект

был ранее обнаружен Антоновым с соавторами (апюпоу й а1., 1998) на ымпа рецепторах. Связывание внешних ионов натрия с поверхностным сайтом препятствовало диссоциации дикатионного блокатора ИЭМ-1754 из глубокого сайта. Таким образом, данная схема объясняет все основные феномены, наблюдаемые при блокаде амра каналов исследованными соединениями.

Безусловно стоит отметить, что одна и та же структурная детерминанта определяет принадлежность к группе «АэоЫп-Йге-ёоог» блокаторов в случае ИЬ/ГОЛ рецепторов и к потенциал-независимым блокаторам в случае АМРА рецепторов. Новосинтезированные соединения и экспериментальные протоколы, разработанные в рамках данной работы, могут служить для дальнейшего сравнения этих двух типов ионных каналов.

Выводы:

1. При регистрации интегральных токов клетки протоколы отмыва блокатора в присутствии и в отсутствие агониста информативны для выявления характера взаимодействия с воротным механизмом канала у блокаторов с быстрой кинетикой диссоциации. Протокол «последовательных аппликаций» позволяет обнаружить ловушку у блокаторов с медленной кинетикой диссоциации.

2. При блокаде ЫМБА рецепторов монокатионные трициклические соединения с плоской ароматической структурой демонстрируют «РэоЫп-Ле-сЬог» механизм действия, в то время как монокатионные трициклические соединения с «V-образной» структурой проявляют ловушку.

3. Трициклические соединения с плоской ароматической структурой блокируют Са2+-проницаемые и Са2+-непроницаемые АМРА рецепторы потенциал-независимым образом.

4. При действии на АМРА рецепторы связывание и отмыв блокаторов с плоской структурой может происходить как в присутствии, так и в отсутствие агониста.

5. При связывании антагонистов с плоской структурой с поверхностным сайтом в АМРА рецепторах происходит замедление отмыва блокатора, связавшегося с глубоким сайтом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах

1. Dorofeeva N.A., Tikhonov D.B., Barygin O.I., Tikhonova T.B., Salnikov Y.I., Magazanik L.G. Action of extracellular divalent cations on native alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate (AMPA) receptors// J. Neurochem. - 2005 -V. 95 - N. 6 - P. 1704-1712.

2. Tikhonova T.B., Barygin O.I., Gmiro V.E., Tikhonov D.B., Magazanik L.G. Organic blockers escape from trapping in the AMPA receptor channels by leaking into the cytoplasm// Neuropharmacology - 2008 - V. 54 - N.4 - P. 653-664.

3. Barygin O.I., Gmiro V.E., Kim K.Kh., Magazanik L.G., Tikhonov D.B. Blockade of NMDA receptor channels by 9-aminoacridine and its derivatives// Neurosci. Lett. -2009 - V. 451 - N. 1 - P. 29-33.

4. Барыгин О.И., Лучкина H.B., Гмиро B.E., Тихонов Д.Б. Различный механизм блокады 9-аминоакридином ионных каналов NMDA- и АМРА-рецепторов// Биол. Мембраны - 2009 - Т. 26 - N. 4 - С. 280-286.

Тезисы докладов

1. Барыгин О.И., Ким К.Х., Гмиро В.Е., Магазаник Л.Г., Тихонов Д.Б. Эффект ловушки при блокаде ионных каналов NMDA рецепторов трициклическими соединениями// Тезисы 11-й международной Пущинской школы конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» - Пущино - 2007 - С. 5-6.

2. Barygin O.I., Kim К.Н., Gmiro V.E., Magazanik L.G., Tikhonov D.B. Blockade of NMDA receptors with tricyclic compounds: paradoxes of trapping// Contemporary problems of neurobiology: molecular mechanisms of synaptic plasticity - Kazan -2007-P. 11-12.

3. Барыгин О.И. Эффект ловушки при блокаде ионных каналов NMDA рецепторов трициклическими соединениями// Тезисы 11-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» - Санкт-Петербург - 2008 - С. 27-28.

4. Барыгин О.И., Ким К.Х., Гмиро В.Е., Магазаник Л.Г., Тихонов Д.Б. Блокада NMDA рецепторов 9-аминоакридином и его производивши// Тезисы 12-й международной Путинской школы конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» - Пущино - 2008 - С. 167.

5. Барыгин О.И., Лучкина Н.В. Различные механизмы блокады NMDA и АМРА рецепторов трицикпическими соединениями// Тезисы 12-й Всероссийской медико-биологической конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина» - Санкт-Петербург - 2009 - С. 38-39.

6. Барыгин О.И., Лучкина Н.В., Тихонов Д.Б. Трициклические моно- и дикатионы - блокаторы каналов АМРА и NMDA рецепторов// Материалы научной конференции «Ионные каналы: структура и функции». Биол. Мембраны - 2009 -Т. 26-N.4-C. 306.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 05.01.2010. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 5538Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812)550-40-14 Тел./факс: (812)297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Барыгин, Олег Игоревич

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика ионотропных глутаматных рецепторов

1.1.1. Разнообразие и классификация

1.1.2. Трансмембранная топология и доменная организация субъединицы

1.1.3. Стехиометрия и эволюционное происхождение

1.2. Механизмы блокады ионных каналов

1.2.1. Потенциал-зависимость блокады

1.2.2. Взаимодействие с воротным механизмом канала

1.3. Блокаторы ионотропных глутаматных рецепторов

1.3.1. Органические блокаторы NMDА рецепторов

1.3.2. Органические блокаторы АМРА рецепторов

Глава 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Блокада NMDА рецепторов трициклическими соединениями

3.1.1. Воспроизведение классических результатов по блокаде NMDA рецепторов по механизмам «foot-in-the-door» и ловушки

3.1.2. Анализ механизма действия новых трициклических производных

3.1.3. Подробный анализ концентрационной зависимости действия 9-аминоакридина

3.1.4. Обсуждение

3.2. Блокада АМРА рецепторов трициклическими соединениями.

3.2.1. Активность и потенциал-зависимость действия трициклических соединений

3.2.2. Механизм действия потенциал-независимых блокаторов. Сравнение с классическими потенциал-зависимыми блокаторами

3.2.3. Взаимосвязь между связыванием потенциал-зависимых и потенциал-независимых блокаторов

3.2.4. Дополнительный компонент действия потенциал-зависимых блокаторов

3.2.5. Обсуждение выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы блокады NMDA и АМРА рецепторов трициклическими соединениями"

Глутамат - это наиболее распространенный возбуждающий медиатор в центральной нервной системе позвоночных животных. Первые гипотезы о возможной нейромедиаторной роли этого соединения появились в 50-е — 60-е годы прошлого столетия (Hayashi, 1954; Curtis et al., 1960). С этого момента стали накапливаться данные о том, что возбуждающее действие глутамата опосредуется несколькими подтипами рецепторов, отличающимися по своей чувствительности к агонистам. Кертису и Уоткинзу принадлежит первенство в открытии специфического агониста NMDA (Curtis & Watkins, 1961), в серии работ Шинозаки и Шибуя были показаны эффекты квисквалата (Shinozaki & Shibuya, 1974) и каината (Shinozaki & Shibuya, 1976), а Кросгард-Ларсен обнаружил активность кислоты АМРА (Krosgaard-Larsen et al., 1980). Параллельно с фармакологией специфических агонистов развивались представления об антагонистах глутаматных рецепторов. Именно использование антагонистов позволило сделать окончательный вывод о синаптической локализации глутаматных рецепторов (Biscoe et al., 1977). В 80-е годы стали появляться данные о том, что синоптические эффекты глутамата разнообразны, и что кроме быстрого постсинаптического возбуждения он может вызывать более длительные биохимические изменения в синапсах (Monaghan et al., 1989). Эти изменения не блокировались традиционными антагонистами глутаматных рецепторов. Парадокс был разрешен с использованием методов молекулярной биологии: были клонированы два типа глутаматных рецепторов: ионотропные и метаботропные (Boulter et al., 1990; Masu et al., 1991; Nakanishi, 1992; Hollmann & Heinemann, 1994). Первые являются лигандуправляемыми ионными каналами, в то время как вторые относятся к суперсемейству рецепторов, связанных с G-белками.

В дальнейшем мы остановимся на ионотропных глутаматных рецепторах. Сейчас традиционным является их деление на 3 подтипа: NMDA, АМРА и каинатные (Dingledine et al., 1999). В последние годы были достигнуты большие успехи в изучении структуры этих ионных каналов. Рентгенографические данные по строению отдельных доменов ионотропных глутаматных рецепторов появились ранее (Armstrong & Gouaux, 2000), а в прошлом году Соболевскому с соавторами удалось получить рентген полной структуры АМРА рецепторов с разрешением 3.6 A (Sobolevsky et al., 2009). Разные подтипы ионотропных глутаматных рецепторов достаточно сильно различаются по свойствам и выполняют в центральной нервной системе разные функции. К важным особенностям NMDA рецепторов можно отнести медленную кинетику активации и десенситизации

Lester et al., 1990), высокую кальциевую проницаемость (Lino et al., 1990) и потенциал-зависимую блокаду ионами магния (Nowak et al., 1984; Mayer et al., 1984). Эта блокада приводит к тому, что прохождение ионов через канал становится возможным только тогда, когда постсинаптическая деполяризация сопутствует выбросу медиатора (McBain & Mayer, 1994). Деполяризация может возникать или как результат активации АМРА рецепторов (Herron et al., 1985), которые часто колокализованы с NMDA рецепторами в пределах одного синапса (Bekkers & Stevens, 1989), или благодаря антидромному распространению потенциала действия (Markram et al., 1997). Из-за этих особенностей NMDA рецепторы могут служить детекторами совпадения и играют важную роль в таких формах синаптической пластичности, как долговременная потенциация и долговременная депрессия (Cotman et al., 1988; Ito, 1989). Считается, что эти формы пластичности связаны с процессами обучения и памяти (Bear, 1996; Malenka & Nicoll, 1997). Кроме того, вход ионов кальция через NMDA рецепторы необходим для правильного нейронального развития (Debski et al., 1990). В отличие от NMDA рецепторов, АМРА рецепторы обладают быстрой кинетикой активации и десенситизации. Они опосредуют большую часть быстрых возбуждающих ответов в центральной нервной системе. АМРА рецепторы также играют заметную роль в процессах синаптической пластичности. Например, встраивание новых АМРА рецепторов в постсинаптическую мембрану, приводящее к увеличению синаптических токов, происходит при многих формах долговременной потенциации (Kauer & Malenka, 2006). По сравнению с АМРА рецепторами, каинатные рецепторы гораздо реже встречаются в синаптических окончаниях. Предполагается, что их роль в центральной нервной системе скорее нейромодулирующая (Lerma et al., 2001).

Чрезмерная активация ионотропных глутаматных рецепторов вовлечена во многие патологии центральной нервной системы (Chen & Lipton, 2006; Bowie et al., 2008). К настоящему моменту известно множество блокаторов этих ионных каналов, однако их применение в клинической практике затруднено из-за серьезных побочных эффектов у большинства соединений. К числу органических блокаторов NMDA рецепторов, работающих в субмикро- и микромолярном диапазоне концентраций, относятся МК-801 (Huettner & Bean, 1988), фенциклидин (ffrench-Mullen & Rogawski, 1989), кетамин (Mac-Donald et al., 1987), аминоадамантановые производные мемантин и амантадин (Chen et al., 1992; Blanpied et al., 1997), трициклические соединения 9-аминоакридин (9AA) и такрин (Costa & Albuquerque, 1994). Список активных блокаторов АМРА рецепторов заметно более короткий. Это природные поликатионные токсины из ядов пауков и ос, такие как филантотоксины (Jones & Lodge, 1991; Brackley et al., 1993) и аргиотоксины (Brackley et al., 1993; Herlitze et al., 1993), а также синтетические дикатионные производные адамантана и фенилциклогексила (Magazanik et al., 1997). Следует отметить, что вышеупомянутые блокаторы эффективны только по отношению к Са2+-проницаемым АМРА рецепторам.

Действие каналоблокаторов характеризуется не только величиной активности, но и рядом особенностей механизма взаимодействия с каналом-мишенью. Среди этих особенностей можно выделить ряд основных:

- зависимость эффективности действия от потенциала на мембране (потенциал-зависимость)

- характер взаимодействия с воротным механизмом канала (эффект ловушки)

- зависимость действия от активации канала («use-dependence»)

Таким образом, действие блокаторов в физиологических и патологических условиях зависит от целого ряда факторов. Соответственно и поиск клинически толерантных препаратов отнюдь не сводится к поиску наиболее активных соединений. Например, единственный используемый в клинике блокатор NMDA рецепторов мемантин наиболее активным не является. Считается, что клиническая толерантность мемантина определяется такими особенностями его механизма действия, как быстрая кинетика и частичная ловушка (Chen & Lipton, 2006).

Для направленного синтеза антагонистов с определенным механизмом действия необходимо понимать, какие элементы химической структуры соединения такой механизм обеспечивают. К настоящему моменту остается до конца не выясненным вопрос о структурных детерминантах, определяющих характер взаимодействия блокаторов с воротным механизмом NMDA рецепторов. Предложенная Соболевским с соавторами (Sobolevsky et al., 1999) гипотеза о ключевой роли размера соединения не способна объяснить весь накопленный массив экспериментальных данных. Так, например, размер 9АА, самого активного «foot-in-the-door» блокатора NMDA рецепторов, не превосходит размеров некоторых соединений, проявляющих ловушку (Bolshakov et al., 2003). Для определения структурных детерминант, определяющих этот механизм действия 9АА, в работе планируется определить характер взаимодействия с воротным механизмом NMDA рецепторов у ряда трициклических производных этого вещества.

Недавно было показано, что 9-аминоакридин и его трициклические производные способны блокировать не только NMDA, но и АМРА рецепторы (Ким и др., 2007). При этом не наблюдались структурно-функциональные отношения, характерные для классических синтетических блокаторов АМРА рецепторов, производных адамантана и фенилциклогексила. Планируется более подробно исследовать механизм действия 9АА и его производных на АМРА рецепторы.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Барыгин, Олег Игоревич

выводы

1. При регистрации интегральных токов клетки протоколы отмыва блокатора в присутствии и в отсутствие агониста информативны для выявления характера взаимодействия с воротным механизмом канала у блокаторов с быстрой кинетикой диссоциации. Протокол «последовательных аппликаций» позволяет обнаружить ловушку у блокаторов с медленной кинетикой диссоциации.

2. При блокаде NMDA рецепторов монокатионные трициклические соединения с плоской ароматической структурой демонстрируют «foot-in-the-door» механизм действия, в то время как монокатионные трициклические соединения с «V-образной» структурой проявляют ловушку.

3. Трициклические соединения с плоской ароматической структурой блокируют Са2+-проницаемые и Са2+-непроницаемые АМРА рецепторы потенциал-независимым образом.

4. При действии на АМРА рецепторы связывание и отмыв блокаторов с плоской структурой может происходить как в присутствии, так и в отсутствие агониста.

5. При связывании антагонистов с плоской структурой с поверхностным сайтом в АМРА рецепторах происходит замедление отмыва блокатора, связавшегося с глубоким сайтом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Барыгин, Олег Игоревич, Санкт-Петербург

1. Ким К.Х., Гмиро В.Е., Тихонов Д.Б., Магазаник Л.Г. Механизмы блокады ионных каналов глутаматных рецепторов: парадокс 9-аминоакридина// Биол. Мембраны-2007-Т. 24-N. 1-С. 100-107.

2. Akabas М.Н., Stauffer D.A., Xu М., Karlin A. Acetylcholine receptor channel structure probed in cysteine-substitution mutants// Science 1992 - V. 258 - N. 5080 -P. 307-310.

3. Adams H.J., Blair M.R.J., Takman B.H. The local anaestetic activity of tetrodotoxin alone and in combination with vasoconstrictors and local anesthetics// Anesth Analg. -1976 V. 54 -N. 4 - P. 568-573.

4. Akaike N., Kawai N., Kiskin N.I., Kljuchko E.M., Krishtal O.A., Tsyndrenko A.Y. Spider toxin blocks excitatory amino acid responses in isolated hippocampal pyramidal neurons// Neurosci Lett. 1987 - V.79 - N. 3 - P. 326-330.

5. Antonov S.M., Johnson J.W. Voltage-dependent interaction of open-channel blocking molecules with gating of NMDA receptors in rat cortical neurons// J Physiol. 1996 -V. 493 - N.2 - P. 425-445.

6. Antonov S.M., Gmiro V.E., Johnson J.W. Binding sites for permeant ions in the channel of NMDA receptors and their effects on channel block// Nat Neurosci. 1998 -V. 1-N. 6-P. 451-461.

7. Antonov S.M., Johnson J.W. Permeant ion regulation of N-methyl-D-aspartate receptor channel block by Mg2+// Proc Natl Acad Sci USA. 1999 - V. 96 - P. 14571-14576.

8. Armstrong N.A., Gouaux E. Mechanisms for activation and antagonism of an AMPA-sensitive glutamate receptor: crystal structure of the GluR2 ligand binding core// Neuron 2000-V.28-P. 165-181.

9. Bahring R., Bowie D., Benveniste M., Mayer M.L. Permeation and block of rat GluR6 glutamate receptor channels by internal and external polyamines// J Physiol. 1997 -V. 502-N. 3 - P. 575-589.

10. Barry M.F., Ziff E.B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses// Curr Opin Neurobiol. 2002 - V. 12 - N. 3 - P. 279-286.

11. Bear M.F. A synaptic basis for memory storage in the cerebral cortex// Proc Natl Acad Sci USA. 1996 - V. 93 -N. 24 - P. 13453-13459.

12. Beckers J.M., Stevens C.F. NMDA and non-NMDA receptors are co-localized at individual excitatory synapses in cultured rat hippocampus// Nature 1989 — V. 341 — N. 6239-P. 230-233.

13. Bennett J.A., Dingledine R. Topology profile for a glutamate receptor: three transmembrane domains and a channel-lining reentrant membrane loop// Neuron 1995 V. 14-N. 2-P. 373-384.

14. Bernard V. Somogyi P., Bolam J.P. Cellular, subcellular, and subsynaptic distribution of AMPA-type glutamate receptor subunits in the neo-striatum of the rat// J Neurosci. 1997 - V. 17 - N. 2 - P. 819-833.

15. Benveniste M., Mayer M.L. Trapping of glutamate and glycine during open channel block of rat hippocampal neuron NMDA receptors by 9-aminoacridine// J Physiol. -1995 V. 483 - N. 2 - P. 367-384.

16. Biscoe T.J., Evans R.H., Francis A.A., Martin M.R., Watkins J.C., Davies J., Dray A. D-alpha-Aminoadipate as a selective antagonist of amino acid-induced and synaptic excitation of mammalian spinal neurons// Nature 1977 - V. 270 - N. 5639 - P. 743745.

17. Blanpied T.A., Boeckman F.A., Aizeman E., Johnson J.W. Trapping channel block of NMDA-mediated responses by amantadine and memantine// J Neurophysiol. 1997 -V. 77-P. 309-323.

18. Bolshakov K.V., Gmiro V.E. Tikhonov D.B., Magazanik L.G. Determinants of trapping block of N-methyl-d-aspartate receptor channels// J Neurochem. 2003 - V. 87 -N. 1 - P. 56-65.

19. Bolshakov K.V., Kim K.H. Potapjeva N.N., Gmiro V.E., Tikhonov D.B., Usherwood P.N., Mellor I.R., Magazanik L.G. Design of antagonists for NMDA and AMPA receptors// Neuropharmacology 2005 - V. 49 - P. 144-155.

20. Bormann J. Memantine is a potent blocker of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor channels// Eur J Pharmacol. 1989 - V. 166 -N. 3 - P. 591-592.

21. Boulter J., Hollmann M., O'Shea-Greenfield A., Hartley M., Deneris E., Maron C., Heinemann S. Molecular cloning and functional expression of glutamate receptor subunit genes// Science V. 249 -N. 4972 - P. 1033-1037.

22. Bowie D., Mayer M.L. Inward rectification of both AMPA and kainite subtype glutamate receptors generated by polyamine-mediated ion channel block// Neuron -1995-V. 15-N. 2-P. 453-462.

23. Bowie D., Lange G.D., Mayer M.L. Activity-dependent modulation of glutamate receptors by polyamines// J Neurosci. 1998 - V. 18 - N. 20 - P. 8175-8185.

24. Bowie D. Ionotropic glutamate receptors & CNS disorders// CNS Neurol Disord Drug Targets 2008 - V. 7 - N. 2 - P. 129-143.

25. Bresink I., Benke T.A., Collett V.J., Seal A.J., Parsons C.G., Henley J.M., Collingridge G.L. Effects of memantine on recombinant rat NMDA receptors expressed in HEK 293 cells// Br J Pharmacol. 1996 - V. 119 - N. 2 - P. 195-204.

26. Bumashev N., Villarroel A., Sackmann B. Dimensions and ion selectivity of recombinant AMPA and kainate receptor channels and their dependence on Q/R site residues// J Physiol. 1996 - V. 496 -N. 1 - P. 165-173.

27. Chen G.Q., Sun Y., Jin R., Gouaux E. Probing the ligand binding domain of the GluR2 receptor by proteolysis and deletion mutagenesis defines domain boundaries and yields a crystallizable construct// Protein Sci. 1998 - V. 7 - N. 12 - P. 26232630.

28. Chen G.Q., Cui C., Mayer M.L., Gouaux E. The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity// Nature — 1999 V. 402 - N. 6763 -P. 817-821.

29. Chen H.S., Lipton S.A. Mechanism of memantine block of NMDA-activated channels in rat retinal ganglion cells: uncompetitive antagonism// J Physiol. 1997 — V. 499 — N. 1 - P. 27-46.

30. Chen H.S., Lipton S.A. Pharmacological implications of two distinct mechanisms of interaction of memantine with N-methyl-D-aspartate-gated channels// J Pharmacol Exp Ther. 2005 - V. 314 -N. 3 - P. 961-971.

31. Chen H.S., Lipton S.A. The chemical biology of clinically tolerated NMDA receptor antagonists// J Neurochem. 2006 - V. 97 - N. 6 - P. 1611-1626.

32. Choi Y.B., Lipton S.A. Identification and mechanism of action of two histidine residues underlying high-affinity Zn2+ inhibition of the NMDA receptor// Neuron -1999-V. 23-N. 1 -P. 171-180.

33. Costa A.C., Albuquerque E.X. Dynamics of the actions of tetrahydro-9-aminoacridine and 9-aminoacridine on glutamatergic currents: concentration-jump studies in cultured rat hippocampal neurons// J Pharmacol Exp Ther. 1994 - Y. 268 - N. 1 - P. 503514.

34. Cotman C.W., Monaghan D.T., Ganong A.H. Excitatory amino acid neurotransmission: NMDA receptors and Hebb-type synaptic plasticity// Annu Rev Neurosci. 1988 - V. 11-P. 61-80.

35. Curtis D.R., Phillis J. W., Watkins J.C. The chemical excitation of spinal neurons by certain acidic amino acids// J Physiol. 1960 - V. 150 - P. 656-682.

36. Curtis D.R., Watkins J.C. Analogues of glutamic and gamma-amino-n-butyric acids having potent actions on mammalian neurons// Nature 1961 - V. 191 - P. 10101011.

37. Debski E.A., Cline H.T., Constantine-Paton M. Activity-dependent tuning and the NMDA receptor// J Neurobiol. V. 21 -N.l - P. 18-32.

38. Dingledine R., Borges K., Bowie D., Traynelis S. The Glutamate Receptor Ion Channels// Pharmacological reviews 1999 - V. 51 - P. 7-62.

39. Dingledine R., Conn P.J. Peripheral glutamate receptors: molecular biology and role in taste sensation// J Nutr. 2000 - V.130 - P. 1039-1042.

40. Donewan S.D., Rogawski M.A. Intracellular polyamines mediate inward rectification of Ca(2+)-permeable alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors// Proc Natl Acad Sci USA. 1995 - V. 92 -N. 20 - P. 9298-9302.

41. Doyle D.A., Morais Cabral J., Pfuetzner R.A., Kuo A., Gulbis J.M., Cohen S.L., Chait B.T., MacKinnon R. The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity// Science 1998 - V. 280 -N. 5360 - P. 69-77.

42. Fayyazuddin A., Villaroel A., Le Goff A., Lerma J., Neyton J. Four residues of the extracellular N-terminal domain of the NR2A subunit control high-affinity Zn2+ binding to NMDA receptors// Neuron 2000 - V. 25 - N. 3 - P. 683-694.

43. Ferrer-Montiel A.V., Montal M. Pentameric subunit stoichiometry of a neuronal glutamate receptor// Proc Natl Acad Sci USA. 1996 - V. 93 - N. 7 - P. 2741-2744.

44. Ffrench-Mullen J.M., Rogawski M.A. Interaction of phencyclidine with voltage-dependent potassium channels in cultured rat hippocampal neurons: comparison with block of the NMDA receptor-ionophore complex// J Neurosci. V. 9 - N. 11 - P. 4051-4061.

45. Grzesiek S., Otto H., Dencher N.A. Delta pH-induced fluorescence quenching of 9-aminoacridine in lipid vesicles is due to excimer formation at the membrane// Biophys J. 1989 -V. 55 — N. 6 —P. 1101-1109.

46. Hayashi, T. Effects of sodium glutamate on the nervous system// Keio J Med. 1954 -V.3-P. 192-193.

47. Herlitze S., Raditsch M., Ruppersberg J.P., Jahn W., Monyer H.5 Schoepfer R., Witzemann V. Argiotoxin detects molecular differences in AMPA receptor channels// Neuron- 1993-V. 10-N. 6-P. 1131-1140.

48. Herron C.E., Lester R.A., Coan E.J., Collingridge G.L. Intracellular demonstration of an N-methyl-D-aspartate receptor mediated component of synaptic transmission in the rat hippocampus// Neurosci Lett. 1985 - V. 60 -N. 1 - P. 19-23.

49. Hershkowitz N., Rogawski M.A. Tetrahydroaminoacridine block of N-methyl-D-aspartate-activated cation channels in cultured hippocampal neurons// Mol Pharmacol. 1991 -V. 39 -N. 5 - P. 592-598.

50. Hollmann M., Maron C., Heinemann S. N-glycosylation site tagging suggests a three transmembrane domain topology for the glutamate receptor GluRl// Neuron 1994 -V. 13-N.6-P. 1331-1343.

51. Hollmann M., Heinemann S. Cloned glutamate receptors// Annu Rev Neurosci. 1994 -V. 17-P. 31-108.

52. Huettner J.E., Bean B.P. Block of N-methyl-D-aspartate-activated current by the anticonvulsant MK-801: selective binding to open channels// Proc Natl Acad Sci USA.-1988-V. 85-N.4-P. 1307-1311.

53. Ito, M. Long-term depression// Annu Rev Neurosci. 1989 - V. 12 - P. 85-102.

54. Jiang Y., Lee A., Chen J., Cadene M., Chait B.T., MacKinnon R. The open pore conformation of potassium channels// Nature 2002 - V. 417 - N. 6888 - P. 523-526.

55. Jin R., Singh S.K., Gu S., Furukawa H., Sobolevsky A.I., Zhou J., Jin Y., Gouaux E. Crystal structure and association behaviour of the GluR2 amino-terminal domain// EMBO J. 2009 - V. 28 - N. 12-P. 1812-1823.

56. Johnson K.A., Conn P.J., Niswender C.M. Glutamate receptors as therapeutic targets for Parkinson's disease// CNS Neurol Disord Drug Targets. 2009 - V. 8 - N. 6 - P. 475-491.

57. Kamboj S.K., Swanson G.T., Cull-Candy S.G. Intracellular spermine confers rectification on rat calcium-permeable AMPA and kainate receptors// J Physiol. -1995 V. 486 - N.2 - P. 297-303.

58. Karakas E., Simorowski N., Furukawa H. Structure of the zinc-bound amino-terminal domain of the NMDA receptor NR2B subunit// EMBO J. 2009 - V. 28 - N. 24 - P. 3910-3920.

59. Kotermanski S.E., Wood J.T., Johnson J.W. Memantine binding to a superficial site on NMDA receptors contributes to partial trapping// J. Physiol. 2009 - V. 587 - N. 19-P. 4589-4604.

60. Koutsilieri E., Riederer P. Excitotoxicity and new antiglutamatergic strategies in Parkinson's disease and Alzheimer's disease// Parkinsonism Relat Disord. 2007 - V. 13-P. 329-331.

61. Krogsgaard-Larsen P., Honore Т., Hansen J.J., Curtis D.R., Lodge D. New class of glutamate agonist structurally related to ibotenic acid// Nature — 1980 — V. 284 N. 5751 -P. 64-66.

62. Kumar J., Schuck P., Jin R., Mayer M.L. The N-terminal domain of GluR6-subtype glutamate receptor ion channels// Nat Struct Mol Biol. V. 16 - N. 6 - P. 631-638.

63. Kuner Т., Wollmuth L.P., Karlin A., Seeburg P.H., Sackmann B. Structure of the NMDA receptor channel M2 segment inferred from the accessibility of substituted cysteines// Neuron 1996 - V. 17 - N. 2 - P. 343-352.

64. Kuner Т., Schoepfer R. Multiple structural elements determine subunit specificity of Mg2+ block in NMDA receptor channels// J. Neurosci. 1996 - V. 16 - N. 11 - P. 3549-3558.

65. Kuner Т., Beck С., Sackmann В., Seeburg P.H. Channel-lining residues of the AMPA receptor M2 segment: structural environment of the Q/R site and identification of the selectivity filter// J Neurosci. 2001 - V. 21 -N. 12 - P. 4162-4172.

66. Kuusinen A., Arvola M., Keinanen K. Molecular dissection of the agonist binding site of an AMPA receptor// EMBO J. V. 14 - N. 24 - P. 6327-6332.

67. Kwak S., Weiss J.H. Calcium-permeable AMPA channels in neurodegenerative disease and ischemia// Curr Opin Neurobiol. 2006 - V. 16 -N. 3 - P. 281-287.

68. Laube В., Kuhse J., Betz H. Evidence for a tetrameric structure of recombinant NMDA receptors// J Neurosci. 1998 - V. 18 -N. 8 - P. 2954-2961.

69. Lerma J., Paternain A.Y., Rodriguez-Moreno A., Lopez-Garcia J.C. Molecular physiology of kainate receptors// Physiol Rev. 2001 - V. 81 - N. 3 - P. 971-998.

70. Lester R.A., Clements J.D., Westbrook G.L., Jahr C.E. Channel kinetics determine the time course of NMDA receptor-mediated synaptic currents// Nature 1990 - V. 346 -N. 6284-P. 565-567.

71. Leuschner W.D., Hoch W. Subtype-specific assembly of alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptor subunits is mediated by their n-terminal domains// J Biol Chem. 1999 - V. 274 - N. 24 - P. 16907-16916.

72. Lingle C. Blockade of cholinergic channels by chlorisondamine on a crustacean muscle. // J Physiol. 1983 - V. 339 - P. 395-417.

73. Lino M., Ozawa S., Tsuzuki K. Permeation of calcium through excitatory amino acid receptor channels in cultured rat hippocampal neurons// J Physiol. 1990 — V. 424 -P. 151-165.

74. Lipton S.A., Rosenberg P.A. Excitatory amino acids as a final common pathway for neurologic disorders// N Engl J Med. 1994 - V. 331 - N. 4 - P. 274-275

75. Low C.M., Zheng F., Lyuboslavsky P., Traynelis S.F. Molecular determinants of coordinated proton and zinc inhibition of N-methyl-D-aspartate NR1/NR2A receptors// Proc Natl Acad Sci USA. 2000 - V.97 - P. 11062-11067.

76. MacDonald J.F., Miljkovic Z., Pennefather P. Use-dependent block of excitatory amino acid currents in cultured neurons by ketamine// J Neurophysiol. — 1987 — V. 58 -N. 2-P. 251-266.

77. Madden, D.R. The structure and function of glutamate receptor ion channels// Nature Neurosci Rev. 2002 - V.91 - P. 91 -102.

78. Magazanik L.G., Buldakova S.L., Samoilova M.Y., Gmiro V.E., Mellor I.R., Usherwood P.N. Block of open channels of recombinant AMPA receptors and native AMPA/kainate receptors by adamantane derivatives// J Physiol. 1997 - V. 505 - N. 3-P. 655-663.

79. Malenka R.C., Nicoll R.A. Learning and memory: never fear, LTP is hear// Nature -1997-V. 390-P. 552-553.

80. Malinow R., Malenka R.C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity// Annu Rev Neurosci. 2002 - V. 25 - P. 103-126.

81. Mano I., Teichberg V.I. A tetrameric subunit stoichiometry for a glutamatereceptor-channel complex// Neuroreport 1998 - V. 9 - N. 2 - 327-331.

82. Markram H., Ltibke J., Frotscher M., Sakmann B. Regulation of synaptic efficacy by coincidence of postsynaptic APs and EPSPs// Science 1997 - V. 275 - N. 5297 - P. 213-215.

83. Masu M., Tanabe Y., Tsuchida K., Shigemoto R., Nakanishi S. Sequence and expression of a metabotropic glutamate receptor//Nature 1991 - V. 349 — N. 6312 -P. 760-765.

84. Mayer M.L., Westbrook G.L., Guthrie P.B. Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones// Nature 1984 - V. 309 - N. 5965 - P. 261-263.

85. Mayer M.L. Glutamate receptors at atomic resolution// Nature 2006 - V. 440 - N. 7083-P. 456-462.

86. Mellor I.R., Usherwood P.N.R. Targeting ionotropic receptors with polyamine-containing toxins// Toxicon 2004 - V. 43 - N. 5 - P. 493-508.

87. Monyer H., Sprengel R., Schoepfer R., Herb A., Higuchi M., Lomeli H., Burnashev N., Sakmann В., Seeburg P.H. Heteromeric NMDA receptors: molecular and functional distinction of subtypes// Science 1992 - V. 256 - N. 5060 - P. 12171221.

88. Nakanishi N., Shneider N.A., Axel R. A family of glutamate receptor genes: evidence for the formation of heteromultimeric receptors with distinct channel properties// Neuron 1990-V. 5-N. 5-P. 569-581.

89. Nakanishi S. Molecular diversity of glutamate receptors and implications for brain function// Science 1992 - V. 258 -N. 5082 - P. 597-603.

90. Neher E., Steinbach J.H. Local anaesthetics transiently block currents through single acetylcholine-receptor channels// J Physiol. 1978 - V. 277 - P. 153-176.

91. Nowak L., Bregestovski P., Ascher P., Herbet A., Prochiantz A. Magnesium gates glutamate-activated channels in mouse central neurons// Nature — 1984 — V. 307 -N. 5950-P. 462-465.

92. Panchenko V.A., Glasser C.R., Partin K.M., Mayer M.L. Amino acid substitutions in the pore of rat glutamate receptors at sites influencing block by polyamines// J Physiol. 1999 - V. 520 -N. 2 - P. 337-357.

93. Premkumar L.S., Auerbach A. Stoichiometry of recombinant N-methyl-D-aspartate receptor channels inferred from single-channel current patterns// J Gen Physiol. 1997 - V. 110 — N. 5 - P. 485-502.

94. Prybylowski K., Chang K., Sans N., Kan L., Vicini S., Wenthold R.J. The synaptic localization of NR2B-containing NMDA receptors is controlled by interactions with PDZ proteins and AP-2// Neuron 2005 - V. 47 - N. 6 - P. 845-857.

95. Rosenmund C., Stem-Bach Y. and Stevens C.F. The tetrameric structure of a glutamate receptor channel// Science 1998 - V. 280 - P. 1596-1599.

96. Seki M., Lipton S.A. Targeting excitotoxic/free radical signaling pathways for therapeutic intervention in glaucoma// Prog Brain Res. 2008 - V. 173. - P. 495-510.

97. Shinozaki H, Shibuya I. A new potent excitant, quisqualic acid: effects on crayfish neuromuscular junction// Neuropharmacology 1974 - V. 13 -N. 7 - P. 665672.

98. Shinozaki H, Shibuya I. Effects of kainic acid analogues on crayfish opener muscles// Neuropharmacology 1976 - V. 15 - N. 2 - P. 145-147.

99. Sobolevskii A.I., Khodorov В. I. Blocker studies of the functional architecture of the NMDA receptor channel// Neuroscience and behavioral physiology 2002 - V. 32 -N. 2 - P. 157-171.

100. Sobolevsky A.I., Koshelev S.G., Khodorov B.I. Interaction of memantine and amantadine with agonist-unbound NMDA-receptor channels in acutely isolated rat hippocampal neurons// J. Physiol. 1998 - V. 512 -N. 1 - P. 47-60.

101. Sobolevsky A., Koshelev S. Two blocking sites of amino-adamantane derivatives in open N-methyl-D-aspartate channels// Biophys J. 1998 - V. 74 - N. 3 -P. 1305-1319.

102. Sobolevsky A.I., Koshelev S.G., Khodorov B.I. Probing of NMDA channels with fast blockers// J Neurosci. 1999 - V. 19 - N. 24 - P. 10611-10626.

103. Sobolevsky A.I. Two-komponent blocking kinetics of open NMDA channels by organic cations// Biochim Biophys Acta. 1999 - V. 1416 - N. 1-2 - P. 69-91.

104. Sobolevsky A.I., Rosconi M.P., Gouaux E. X-ray structure, symmetry and mechanism of an AMPA-subtype glutamate receptor// Nature 2009 - V. 462 - N. 7274-P. 745-756.

105. Soderling T.R., Derkach V.A. Postsynaptic protein phosphorylation and LTP// Trends Neurosci. 2000 - V. 23 - N. 2 - P. 75-80.

106. Stone J.M., Morrison P.D., Pilowsky L.S. Glutamate and dopamine dysregulation in schizophrenia a synthesis and selective review// J Psychopharmacol. - 2007 - V. 21 -N. 4. - P. 440-452.

107. Tikhonov D.B., Magazanik L.G. Voltage dependence of open channel blockade: onset and offset rates// J Membr Biol. 1998 - V. 161 -N. 1 - P. 1-8.

108. Tikhonov D.B., Zhorov B.S., Magazanik L.G. Intersegment hydrogen bonds as possible structural determinants of the N/Q/R site in glutamate receptors// Biophys J. -1999-V. 77-N. 4-P. 1914-1926.

109. Tikhonov D.B., Samoilova M.V., Buldakova S.L., Gmiro V.E., Magazanik L.G. Voltage-dependent block of native AMPA receptor channels by dicationic compounds// Br J Pharmacol. 2000 - V. 129 - N. 2 - P. 265-274.

110. Tikhonova T.B., Tikhonov D.B., Magazanik L.G. Common binding site for externally and internally applied AMPA receptor channel blockers// J Mol Neurosci. -2009-V. 39-N. 1-2-P. 169-174.

111. Vissel В., Krupp J.J., Heinemann S.F., Westbrook G.L. Intracellular domains of NR2 alter calcium-dependent inactivation of N-methyl-D-aspartate receptors// Mol Pharmacol. 2002 - V. 61 - N. 3 - P. 595-605.

112. Vorobjev V.S. Vibrodissociation of sliced mammalian nervous tissue// Neurosci Meth. 1991 - V. 68 - P. 303-307.

113. Vorobjev V.S., Sharonova I.N. Tetrahydroaminoacridine blocks and prolongs NMDA receptor mediated responses in a voltage dependent manner// J Pharmacol. -1994-V. 253-P. 1-8.

114. Washburn M.S., Dingledine R. Block of alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors by polyamines and polyamine toxins// J Pharmacol Exp Ther. 1996 - V. 278 -N. 2 - P. 669-678.

115. Washburn M.S., Numberger M., Zhang S., Dingledine R. Differential expression on GluR2 expression and three characteristic features of AMPA receptors// J Neurosci. 1997 - V. 22 - P. 10209-10216.

116. Wo Z.G., Oswald R.E. Transmembrane topology of two kainate receptor subunits revealed by N-glycosylation// Proc Natl Acad Sci USA. 1994 - V. 91 - N. 15-P. 7154-7158.

117. Wollmuth L.P., Kuner Т., Sakmann B. Adjacent asparagines in the NR2-subunit of the NMDA receptor channel control the voltage-dependent block by extracellular Mg2+// J Physiol. 1998 - V. 506 - P. 13-32.

118. Wood M.W., VanDongen H.M.A., VanDongen A.M.J. Structural conservation of ion conduction pathways in К channel and glutamate receptors// Proc Natl Acad Sci USA. 1995 - V. 92 - P. 4882-4886.

119. Woodhull A.M. Ionic blockage of sodium channels in nerve// J Gen Physiol. -1973 V. 61 - N. 6 - P. 687-708.

120. Wyllie D.J., Behe P., Colquhoun D. Single-channel activations and concentration jumps: comparison of recombinant NRla/NR2A and NRla/NR2D NMDA receptors// J Physiol. 1998 -V. 510 - P. 1-18.